ES2063350T5

ES2063350T5 - Nuevas proteinas con efecto inhibidor del tnf y su obtencion.

Info

Publication number: ES2063350T5
Application number: ES90906924T
Authority: ES
Inventors: Hans-Georg Lemaire; Heinz Hillen; Achim Moeller; Lothar Daum; Thomas Doerper; Thomas Subkowski
Original assignee: Abbott GmbH and Co KG
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG
Priority date: 1989-05-09
Filing date: 1990-05-04
Publication date: 2007-09-16
Anticipated expiration: 2010-05-04
Also published as: US5344915A; DE10075019I1; DE3922089A1; ATE113063T1; AU5532490A; JP4001604B2; NL300013I2; JP3290651B2; NL300013I1; WO1990013575A1; HU208162B; JP2004043502A; EP0471701B2; DE59007517D1; CA2425101A1; JPH04505014A; AU633913B2; JP2002302500A; HUT58352A; JP2007084554A

Abstract

Proteínas, que en su forma glicosilada original tienen un peso molecular de aproximadamente 42.000 dalton y en el término N presentan la secuencia de aminoácidos Xaa Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu en la cual Xaa representa un átomo de hidrógeno, un resto de fenilalanina (Phe) o las secuencias de aminoácidos Ala Phe, Val Ala Phe, Gln Val Ala Phe, Ala Gln Val Ala Phe, Pro Ala Gln Val Ala Phe o Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe, y sus muteínas, que se forman por intercambio, deleción o adición apropiadas de aminoácidos o péptidos o por variación del resto glicosídico, sin que con ello disminuya acusadamente el efecto de las proteínas.

Description

Nuevas proteínas con efecto inhibidor del TNF y su obtención.

La presente invención se refiere a nuevas proteínas y su obtención.

El TNF\alpha (factor de necrosis tumoral) es una proteína conocida, que posee un amplio espectro de actividades biológicas. Este ejerce influencia sobre diferentes tipos de células malignas y no malignas, juega un papel en el caso del choque séptico y en las lesiones tisulares así como en los rechazos de riñón, en los trasplantes, en el pulmón colapsado y en la malaria cerebral (Lymphokines 1987, Vol. 14; Pharmaceutical Res. 5, 129 (1988); Science 234, 470 (1986), Nature 330, 662 (1987); J. Exp. Med. 166, 1132 (1987), Science 237, 1210 (1987); J. Exp. Med. 166, 1280 (1987)).

Se sabe, que el efecto del TNF\alpha se puede neutralizar con anticuerpos (EP 260 610). Sin embargo, estos anticuerpos no son substancias humanas, de manera éstas pueden provocar reacciones inmunes en el caso de ser empleadas en los seres humanos.

Se han encontrado ahora proteínas, que son de origen humano y que pueden neutralizar la acción del TNF\alpha.

El objeto de la invención está constituido por proteínas, que tienen un peso molecular de aproximadamente 42.000 daltons, determinado por electrofóresis en gel de SDS, y sus muteínas, que se forman por adición adecuada de aminoácidos o péptidos o mediante la variación del resto glicosídico, sin que con disminuya acusadamente el efecto inhibidor del TNF\alpha de las proteínas; presentando estas en el extremo N la secuencia de aminoácidos Xaa Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu, en la cual Xaa representa las secuencias de aminoácidos Gln Val Ala Phe, Ala Gln Val Ala Phe, Pro Ala Gln Val Ala Phe o Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe.

Las nuevas proteínas, aquí descritas, tienen propiedades ácidas, encontrándose su punto isoeléctrico entre pH 2 y pH 5. Éstas se enlazan específicamente sobre el TNF\alpha y son difícilmente digeribles por tripsina o no lo son en absoluto.

Las nuevas proteínas se pueden aislar, por ejemplo, a partir de la orina de pacientes que presentan fiebre, es decir cuya temperatura corporal es, por ejemplo, de 38ºC o se encuentra por encima de este valor. Para ello se concentra, en primer lugar, la orina, lo cual puede realizarse, por ejemplo, por medio de osmosis inversa o por ultrafiltración. El retentato, obtenido de este modo, se purifica, a continuación, por medio de intercambio iónico y mediante cromatografía de afinidad.

Las proteínas se pueden obtener, también, a partir de líquido humano de ascitis, procedente de pacientes con carcinomas ováricos.

La purificación de las proteínas llevarse a cabo según métodos conocidos, tales como la cromatografía de afinidad o la cromatografía con intercambio de iones.

Las proteínas, obtenidas de este modo, son heterogéneas en la secuencia de aminoácidos del extremo N. Tales heterogeneidades no son inusuales en las proteínas endógenas y se presentan también, por ejemplo, en el interferón \gamma.

La proteína modifica su comportamiento al desplazamiento, mediante tratamiento con una endoglicosidasa, en la electrofóresis en gel de poliacrilamida SDA, lo que debe relacionarse con la disociación de restos sacáricos.

Las proteínas, aquí descritas, se encuentran en la orina y en el líquido de ascitis en concentraciones comprendidas entre 1 y 100 \mug/litro. Para producir la proteína, para fines farmacéuticos, en mayores cantidades, puede recurrirse a métodos de ingeniería genética conocidos (véase la publicación de Maniatis, T. et al: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1982). Con esta finalidad, debe identificarse, en primer lugar, la información genética para la nueva proteína y aislarse el ácido nucleico correspondiente. Con este objeto se reduce la proteína pura con ditiotreitol, a continuación se añade yodoacetamida para la derivatización de los grupos SH libres y, a continuación, se disocia en pequeños péptidos la proteína, tratada de este modo, con bromuro de cianógeno y, a continuación, con tripsina. La separación de los péptidos se lleva a cabo por medio de cromatografía en fase inversa. La secuenciación del extremo N de uno de estos péptidos, purificados, proporcionó la secuencia Val Phe Cys Thr Lys. La proteína contiene, además, las otras tres secuencias peptídicas siguientes: Gly Val Tyr Thr Ser, Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr y Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Xab Thr Thr Ser Ser Asp Ile Cys Arg Pro, donde Xab es un aminoácido todavía desconocido, que, posiblemente, está glicosilado.

Las secuencias peptídicas presentes permiten ahora, por medio de la síntesis de los oligonucleótidos correspondientes, una identificación inequívoca del gen procedente del genoma humano o procedente de bancos correspondientes de c-ADN por medio de hibridación por filtración, específica de la secuencia.

La información genética para la proteína, obtenida de este modo, puede expresarse, a continuación, según métodos conocidos, en diversas células hospedadoras, tales como las células eucariotas, las levaduras, el Bacillus subtilis o el E. coli, y de este modo, puede obtenerse la proteína. En este caso, la proteína se encuentra en la forma glicosilada en las células eucariotas.

Las muteínas, que se derivan de las nuevas proteínas por adición de aminoácidos o de péptidos, se obtienen preferiblemente por métodos de ingeniería genética.

Las nuevas proteínas muestran buenos efectos inhibidores del TNF\alpha y, por lo tanto, pueden emplearse para el tratamiento de enfermedades, en las cuales aparezca acrecentada la concentración del TNF\alpha en los fluidos corporales, tal como, por ejemplo, en el choque séptico. Además, pueden ser empleadas en las siguientes enfermedades: en las alergias, en las enfermedades autoinmunes, en las enfermedades de etiología reumática, en el caso del pulmón colapsado, en las enfermedades óseas inflamatorias, en los trastornos de la coagulación de la sangre, en las quemaduras, así como en las complicaciones posteriores a trasplantes.

Ejemplo 1 Determinación del efecto inhibidor del TNF\alpha

La actividad biológica del TNF\alpha se determinó por lisis de la línea de células de ratón L929 (J. Biol. Chem. 260, 2345 (1985)) y de la línea de células humanas MCF7. En los ensayos, destinados a la determinación del efecto inhibidor del TNF\alpha, se seleccionó una concentración de TNF\alpha tal, que se lisara, como mínimo, el 50% de las células.

Las proteínas sobrenadantes, enlazantes del TNF\alpha, se diluyeron en la relación 1:2 en placas de microtitulación. Se añadieron a esta solución (0,05 ml), en cada caso, 0,05 ml del TNF\alpha humano o de ratón (120 pg/ml). A continuación, se llevó a cabo la adición de 50.000 células L929 en 0,1 ml de medio, que contenía 2 \mug/ml de actinomicina D. Al cabo de un tiempo de incubación de 20-24 horas, a 37ºC, en un armario de incubación, se fijaron las células y se tiñeron con violeta cristal. En ausencia de proteína, enlazada con el TNF\alpha, las células fueron lisadas por el TNF\alpha y por la LT (linfotoxina). Éstas se separaron por flotación durante la tinción. El efecto protector de las proteínas sobrenadantes, enlazantes del TNF\alpha, se demostró por medio de la susceptibilidad a la tinción de las células intactas, que habían quedado remanentes.

Se observó una inhibición del efecto citotóxico tanto con respecto al TNF\alpha humano, así como, también, con respecto a la LT humana, con menor intensidad pero, sin embargo, no se observó en el caso del TNF\alpha de ratón.

Ejemplo 2 Aislamiento de proteínas a partir de la orina

Se filtraron 40 litros de orina acumulada de pacientes con fiebre (\geqq 38ºC) por medio de un cartucho Hemoflow® F60 (de la firma Fresenius), hasta que el volumen de la corriente del retentato se había concentrado hasta 2,5 litros.

El retentato se sometió, a continuación, a un lavado, 4 veces con 2,5 litros, cada vez, de tampón de fosfato de sodio 20 mM, a pH 4,0, y la filtración se prosiguió en cada caso hasta un volumen final de 2,5 litros.

El retentato rico en proteínas, obtenido de este modo, de color pardo, se cromatografió a través de S-Sepharose® de la firma Pharmacia (columna: \diameter = 5 cm, longitud = 17 cm). La columna se equilibró, como paso previo al comienzo de la operación, con 10 volúmenes de columna (SV) del tampón de fosfato de sodio 20 mM, a pH 5,5 (= tampón I) y se cargó el retentato. El retentato se lavó ulteriormente con 3 SV del tampón I y se obtuvo el producto valorizable por elución con 3 SV de un tampón de fosfato de sodio 20 mM, a pH 6,5 (tampón II).

Para la purificación adicional, se cargó esta fracción sobre una columna de afinidad de TNF (ejemplo 4) (\diameter = 1,5 cm, longitud = 10 cm), que había sido equilibrada con 10 SV del tampón III (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,2). Tras la carga, se lavó ulteriormente con 3 SV del tampón III y se lavó la fracción de proteínas, enlazantes del TNF, por elución de la columna con 40 ml de un tampón IV, constituido por ácido acético al 0,58% y por NaCl
140 mM.

Para el aislamiento de la proteína pura, se separó el eluato de la columna de afinidad de TNF a través de una columna Mono Q HR 5/5 de la firma Pharmacia. Con esta finalidad se ajustó, en primer lugar, el eluato con NaOH 0,1 n a pH 12,0.

La columna se equilibró con 11 SV de tampón de fosfato de sodio 20 mM, a pH 12,0 (tampón V). Se cargaron 10 ml del eluato de la columna de afinidad de TNF, ajustada en su pH, y se lavaron con 4,4 SV del tampón V. A continuación, se eluyó con fosfato de sodio 20 mM, a pH 7,5.

Para el empobrecimiento adicional de las impurezas, se enjuagó la columna Mono Q con 7 SV de tampón de ácido acético 20 mM, que se había ajustado a pH 2,0 con HCl 0,1 N (tampón VI).

A continuación, se continuó eluyendo la columna con 5-6 SV del ácido acético 20 mM, tampón de NH_{4}Cl 20 mM, pH 2,0 (ajustado con HCl 0,1 n, tampón VII). Al cabo de 1-2 SV, se eluyó una banda activa en el ultravioleta a 280 nm, que contenía impurezas, al cabo de otros 1-2 SV, se eluyó la nueva proteína. Puede conseguirse una cantidad adicional de proteína pura mediante la elución final con 1-2 SV de un tampón VII, ajustado a NaCl 100 mM.

De este modo, la proteína se obtuvo, por electroforesis en gel, con una pureza > 90%. A partir de 1 litro de orina se pueden obtener aproximadamente 1 a 10 \mug de proteína.

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Ejemplo 3 Aislamiento de proteína a partir de líquido de ascitis humano

Se centrifugaron 2,5 litros de líquido de ascitis muy fluido, ligeramente turbio, que se obtuvo como producto de punción de una paciente con carcinoma de ovario, durante 30 minutos a 3.000 g. El sobrenadante se ajustó a pH 7,2 con ácido fosfórico al 10% y se cargó sobre una columna de TNF-Sepharose® reticulada con glutarodialdehído (véase el ejemplo 4) (\diameter = 1,5 cm, longitud = 3 cm). La columna se equilibró con 50 ml del tampón III y se lavó finalmente con 150 ml del tampón III tras la carga. Las proteínas enlazantes del TNF se eluyeron con 30 ml del tampón IV.

Para la purificación adicional, se ajustó el aluato a pH 3,0 con HCl al 10% y se cargó en una columna de cromatografía, equilibrada con ácido acético 20 mM (pH 3,0) (Mono S HR 5/5, firma Pharmacia). Tras la carga, se lavó finalmente con 10 ml de ácido acético 20 mM (pH 3,0) y las proteínas enlazantes del TNF se separaron a continuación por elución con 4 ml de una mezcla tampón constituida por 6 partes de ácido acético 20 mM (pH 3,0) y 4 partes de tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 9,0). Se controló el valor de pH del eluato y, en caso necesario, se reajustó a pH 6,5.

El eluato se cargó sobre una columna de cromatografía Mono Q HR 5/5, equilibrada con tampón de fosfato de sodio a pH 6,0 (tampón VIII). Tras el lavado con 6 ml del tampón VIII y 6 ml de ácido acético 20 mM, NaCl 5 mM, a pH 2,2, se eluyó la proteína de la columna con 6 ml de ácido acético 20 mM, NaCl 150 mM, pH 2,0 (tampón IX).

La caracterización del último eluato indicó que - prescindiendo de la heterogeneidad de la secuencia del extremo N - se trataba de la misma proteína que se había obtenido de acuerdo con el ejemplo 2.

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Ejemplo 4 Preparación de la columna de afinidad de TNF a) Copulación de TNF sobre BrCN-Sepharose

Se suspendieron 7,5 g de BrCN-Sepharose® (firma Pharmacia) en 30 ml de agua. Al cabo de 30 minutos de tiempo de hinchamiento, se lavó la suspensión de gel de BrCN-Sepharose®, en primer lugar, con 500 ml de solución de HCl 1 mM y, a continuación, con NaHCO_{3} 0,1 M, NaCl 0,5 M, a pH 8,3.

Se añadieron 136 mg de TNF, disueltos en 41 ml de tampón (NaHCO_{3} 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3) a esta suspensión de gel. La mezcla de reacción se sometió a sacudidas por espacio de 2 horas, a la temperatura ambiente, y la TNF-Sepharose® se separó por centrifugación a 3.000 revoluciones por minuto. El material de gel se lavó con 40 ml de tampón.

A partir de la determinación de proteína del sobrenadante se calcula un rendimiento de copulación > 90%.

Para el bloqueo del exceso de grupos activos de la BrCN-Sepharose®, se combinó la suspensión de gel con 40 ml de tampón (NaHCO_{3} 0,1 M, NaCl 0,5 M, etanolamina 1 M, pH 8,3), a continuación se sometío a sacudidas por espacio de 1 hora, a la temperatura ambiente, y a continuación se eliminó por lavado la etanolamina con 3 x 40 ml de tampón (NaHCO_{3} 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3).

b) Reticulación de la TNF-Sepharose® con glutarodialdehído

Se lavaron 20 ml de suspensión de gel de TNF-Sepharose®, preparada según a) dos veces con 25 ml de tampón (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 140 mM, pH 8,0). La suspensión se recogió con 40 ml del mismo tampón y se combinó con 1,6 ml de solución de glutarodialdehído al 25%. Al cabo de 1 hora de aplicación de sacudidas, a la temperatura ambiente, se separó por centrifugación la suspensión y se combino con 25 ml de tampón (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 140 mM, etanolamina 1 M, pH 8,0). Se aplicaron sacudidas de nuevo por espacio de 1 hora y la suspensión de TNF-Sepharose® se cargó a continuación en una columna de cromatografía (\diameter = 1,5 cm, longitud = 10 cm).

La columna podía ser empleada para la cromatografía de afinidad tras lavado con 100 ml de tampón (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,2) y 50 ml de ácido acético al 0,58% + NaCl 140 mM,

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Ejemplo 5 Caracterización de la proteína a) Peso molecular y pureza

Para la determinación del peso molecular y de la pureza se sometieron 2 \mug de la proteína, obtenida según los ejemplos 2, respectivamente 3, a una electrofóresis en gel de poliacrilamida SDS al 15%, bajo condiciones reductoras y no reductoras (Nature 227, 680 (1970)). En comparación con una serie de proteínas para la calibración, conocidas, se reconoció la nueva proteína según ambos métodos, tras tinción con azul Coomassie como banda homogénea con un peso molecular de aproximadamente 42.000 daltons.

No se observaron otras bandas. Por lo tanto, puede darse una pureza de la proteína \geq 90%.

La proteína se da a conocer como banda teñida claramente en azul-violeta.

b) Secuenciación del extremo N

Se secuenciaron varias veces 10 \mug (\approx 250 pMol) de la proteína, obtenida conforme al ejemplo 2, con un secuenciador en fase gaseosa del extremo N.

El análisis secuencial del extremo N indica la falta de homogeneidad de la secuencia de aminoácidos del extremo N, debido a la presencia de secuencias secundarias emparentadas. Se determinaron las siguientes secuencias principales:

Secuencia 1a (que no corresponde a la invención)

: Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu

Además, pudo determinarse en la secuenciación en fase gaseosa, una secuencia 2a acrecentada en 6 aminoácidos N-terminales

Secuencia 2a

: Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu

y una secuencia 3a (que no corresponde a la invención) acortada en 1 aminoácido N-terminal

Secuencia 3a

: Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu

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De nabera análoga, se determinaron en la proteína, de acuerdo con el ejemplo 3, las secuencias principales siguientes:

Secuencia 1b

: Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser CyS Arg Leu Arg Glu

(aproximadamente 10%)

Secuencia 2b

: Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Arg Leu Arg Glu

(aproximadamente 45%)

Secuencia 3b

: Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Leu Arg Glu

(aproximadamente 45%)

d) Tratamiento con tripsina

Se trataron 20 \mug de las nuevas proteínas, a pH 8,5, de la manera siguiente:

1.: Adición de 0,5 \mug de tripsina, disueltos en tampón de NaHCO_{3} 0,1 M de pH 8,5; incubación durante 16 horas a 37ºC

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2.: Adición de 0,5 \mug de tripsina, disueltos en tampón de 0,1% de SDS - NaHCO_{3} 0,1 M, a pH 8,5; ajuste de la solución a 0,1% de contenido en SDS; incubación durante 16 horas a 37ºC.

Las proteínas, tratadas de este modo, se analizaron por electroforesis en SDS-poliacrilamida al 15% en comparación con la proteína de partida. No se pudo comprobar degradación de las proteínas.

Ejemplo 6 Desglicosilación

Se ajustaron 0,1 ml del eluato de Mono Q, obtenido de acuerdo con el ejemplo 2 (\approx 0,1 mg/ml de proteína), a pH 7,2 con NaOH 1 M. A continuación, se añadieron 10 unidades de glicopeptidasa F (firma Boehringer Mannheim). Al cabo de 6 horas de incubación a 37ºC, se añadieron otras 10 unidades del enzima. Al cabo de un tiempo de reacción adicional de 16 horas, se liofilizaron 50 \mul de la mezcla de reacción y se analizaron en un gel de SDS al 15% en comparación con la proteína no tratada. En comparación con la muestra no tratada, la proteína tratada con el enzima mostró un peso molecular disminuido en, aproximadamente, 3 kD. Se ensayaron otros 25 \mul de la mezcla de reacción, como se ha descrito en el ejemplo 1, en cuanto al efecto inhibidor del TNF\alpha. El efecto inhibidor del TNF\alpha se mantenía en su totalidad incluso después de la disociación de la parte sacárica.

Ejemplo 7 Obtención de anticuerpos

Las proteínas, aisladas en los ejemplos 2 y 3, se inyectaron en conejos para la obtención de anticuerpos policlonales. La reactividad y la especificidad de los anticuerpos se comprobó por medio del ensayo ELISA. Con esta finalidad, se revistieron placas ELISA (firma Costar) con una solución de 1 \mug de proteína inhibidora o bien de proteína de control/ml de tampón de carbonato de sodio 0,05 M, a pH 9,6, se saturó la fijación inespecífica con BSA/PBS al 1% y se incubó con diluciones diferentes de suero. La detección de los anticuerpos enlazados se llevó a cabo con IgG anti-conejo biotinilado y con estreptavidina-peroxidasa, así como con substrato TMB. Entre las incubaciones individuales se efectuaron, respectivamente, 3 lavados con Tween-20®/PBS al 0,05%. Tras la interrupción con H_{2}SO_{4} 2 M, se determinó la densidad óptica a 450 nm.

Ejemplo 8 Identificación de las proteínas en líquidos corporales

Para la identificación de las proteínas enlazantes del TNF\alpha en diversos líquidos corporales, se utilizó un ensayo ELISA de tipo sándwich. Con esta finalidad, se revistieron placas ELISA (firma Costar) con TNF (5 \mug/ml de tampón de carbonato de sodio 0,05 M de pH 9,6). Tras la saturación con BSA/PBS al 1%, se incubaron con las muestras a se analizadas, por ejemplo líquidos sinoviales de enfermos reumáticos. La detección se llevó a cabo con los anticuerpos antiinhibidor, descritos en el ejemplo 7, y con IgG anti-conejo biotinilado/estreptavidina-peroxidasa/substrato TMB. Entre las incubaciones individuales se realizaron, respectivamente, 3 lavados con Tween-20®/PBS al 0,05%. Se determinó la extinción a 450 nm, tras adición de H_{2}SO_{4} 2 M.

Claims

1. Proteínas, que tienen un peso molecular de aproximadamente 42.000 daltons, determinado por electrofóresis de gel SDS, y cuyas muteínas, que se forman por adición adecuada de aminoácidos o de péptidos o por variación del resto glicosídico, sin que por ello disminuya acusadamente el efecto inhibidor del TNF\alpha de las proteínas y presentando éstas en el extremo N la secuencia de aminoácidos

: Xaa Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu

en la cual Xaa representa

las secuencias de aminoácidos

: Gln Val Ala Phe,

: Ala Gln Val Ala Phe,

: Pro Ala Gln Val Ala Phe o

: Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe.

2. Proteínas según la reivindicación 1 en forma desglicosilada.

3. Empleo de las proteínas según las reivindicaciones 1 o 2 para la obtención de medicamentos destinados al tratamiento de enfermedades, en las cuales se presenta acrecentada la concentración en TNF\alpha en los líquidos corporales.

4. Empleo según la reivindicación 3, caracterizado porque la enfermedad es una alergia, una enfermedad autoinmune, una enfermedad de etiología reumática, de pulmón colapsado, una enfermedad ósea inflamatoria, un trastorno de la coagulación de la sangre o una complicación posterior a trasplantes.

5. Empleo de las proteínas según las reivindicaciones 1 o 2 para la obtención de anticuerpos.