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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen reine Protein-Polymer-Konjugate.
Insbesondere betrifft die Erfindung Histidin-gebundene Protein-Polymer-Konjugate
und Verfahren, um diese herzustellen.
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2. BESCHREIBUNG VON VERWANDTEM
STAND DER TECHNIK
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Eine
Konjugation biologisch aktiver Proteine an Polymere wurde vorgeschlagen,
um ein oder mehr Eigenschaften, wie Zirkulationslebenszeit, Wasserlöslichkeit
oder Antigenität
in vivo zu verbessern. Einige der anfänglichen Konzepte der Kupplung
von Peptiden oder Polypeptiden an Polyethylenglycol (PEG) und ähnliche
wasserlösliche
Polymere werden beispielsweise im US-Patent Nr. 4,179,337 offenbart.
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Insulin
und Hämoglobin
befanden sich unter den ersten konjugierten Therapeutika. Diese
relativ großen
Polypeptide enthalten etliche freie Lysin-ε-Aminoanbindungsstellen. Etliche
Polymere konnten ohne signifikanten Verlust der biologischen Aktivität angebunden
werden.
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Für viele
biologisch aktive Materialien ist das Konjugationsverfahren jedoch
nicht ohne Komplikationen. Das Konjugationsverfahren ist im Hinblick
auf die Anbindungsstellen nicht spezifisch. Man muss sehr sorgfältig sein,
um den Verlust der biologischen Aktivität, der durch die Konjugationsreaktion
ausgelöst
wird, zu begrenzen. Wenn beispielsweise zuviel des aktivierten Polymers
an das Zielprotein oder -polypeptid angebunden wird, kann die biologische
Aktivität
deutlich reduziert werden oder verloren gehen. Wenn weiterhin ein falscher
Linker, der das Polymer an das Protein bindet, verwendet wird, oder
wenn eine unzureichende Polymermenge an das Ziel angebunden wird,
ist der therapeutische Wert des resultierenden Konjugats recht begrenzt.
Häufig
demonstrieren solche Konjugate keinen ausreichenden Anstieg der
Zirkulationslebenszeit, um den Verlust der Bioaktivität zu kompensieren.
Probleme können
sich auch ergeben, wenn die aktive Stelle eines therapeutischen
Bestandteils (d.h., wo Gruppen, die mit einer Bioaktivität assoziiert
sind, angetroffen werden) als Ergebnis der Polymeranbindung blockiert
wird. Dieses Problem kann schwierig zu vermeiden sein, da das Polymer
und das Protein typischerweise in auf Lösung basierenden Reaktionen miteinander
verbunden werden und der Polymerkonjugationsprozess im Hinblick
auf die Anbindungsstellen nicht spezifisch ist. Eine vorherige Blockierung
der aktiven Stellen mit Materialien, wie Pyridoxalphosphat, wurde
vorgeschlagen, jedoch sind die Ergebnisse nicht konsistent. Lysin-depletierte
Varianten von Proteine wurde auch als Weg zur Kontrolle der Polymeranhaftung
vorgeschlagen. Diese Technik ist jedoch häufig unpraktisch, da sie deutlich
zu den Kosten des Endprodukts beiträgt. Diese Probleme sind insbesondere
bei niedermolekularen Proteinen und Peptiden akut. Diese bioaktiven
Materialien haben häufiger
weniger Anbindungsstellen, die nicht mit einer Bioaktivität assoziiert
sind.
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In
einem anderen Versuch, um den Verlust der Bioaktivität folgend
auf die Polymerkonjugation zu vermeiden, wurde Granulocytenkolonie-stimulierender
Faktor ("G-CSF") an einen mPEG-Carboxymethyl-N-hydroxysuccinimidylester
konjugiert, dann mit zwei molar Hydroxylamin (pH 7,3) behandelt,
um "instabile" Linker zu entfernen,
gefolgt von einer pH-Reduktion auf 3,5. Kinstler et al., 1996, Pharmaceutical
Res. 13(7): 996–1002.
Es wurde keine Beschreibung und kein Vorschlag zum Erhalt von verbesserten
G-CSF noch eine Anleitung betreff die Behandlung irgendwelcher anderer
Proteinkonjugate bereitgestellt.
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Interferone,
die hiernach als auch IFN's
bezeichnet werden, sind ein besonderes Beispiel von Proteinen, die
aus einer verbesserten Polymerkonjugationstechnik Nutzen ziehen
könnten.
Siehe beispielsweise US-Patent Nrn. 4,766,106 und 4,917,888, die
inter alia beta-Interferon beschreiben, das mit aktivierten Polymeren,
einschließlich
mPEG-2,3,6-Trichlor-S-triazin, mPEG-N-Succinimidylglutarat oder
mPEG-N-Succinimidylsuccinat konjugiert ist. Die Patentinhaber offenbaren,
dass eine kovalente Modifikation des Proteins bei einem pH von 5
bis 9 durchgeführt
wird und dass, wenn das Protein über
seine Lysinreste umgesetzt wird, eine kovalente Modifikation des
Proteins bei einem pH von 8 bis 9 durchgeführt wird. Außerdem wird
auch ein relativ hoher molarer Überschuss
(10-, 20- und 50-fach) des aktivierten Polymers verwendet.
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Eine
europäische
Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr.
0 236 987 beschreibt die Umsetzung von alpha- und gamma-Interferonen
mit hohen molekularen Überschüssen von
Alkylimidoester-aktivierten Polyethylenglycolen unter Bedingungen,
die vorzugsweise einen pH von ungefähr 7 bis 9 beinhalten. Die
europäische
Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr.
0 510 356 beschreibt die Konjugation von alpha-Interferon mit Pyridinylcarbonyl-
und Thiocarbonyl-aktiviertem PEG bei einem pH von 7 bis 9. In diesen
Offenbarungen findet sich keine Erwähnung, dass andere Aminosäuren als
Ly sin an der Konjugation beteiligt waren oder dass es vorteilhaft
wäre, dies
durchzuführen.
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Die
WO96/11953 berichtet, dass Konjugate durch Umsetzung eines Proteins,
beispielhaft dargestellt durch Konsensus IFN, mit einem Polymer
bei einem sauren pH (pH 4) unter Verwendung einer reduktiven Alkylierungsreaktion
für die
selektive Anhaftung eines Polymers, z.B. PEG, an das N-terminale
Ende hergestellt wurden. Die WO96/11953 stellt fest, dass diese
Reaktion selektiv eine Bindung an Lysin-epsilon-Aminogruppen verhindert,
während
eine Bindung an die N-terminale alpha-Aminogruppe begünstigt wird.
Die WO96/11953 beschreibt auch ein zweistufiges pH-Behandlungsverfahren,
worin G-CSF mit einem PEG bei pH 8,0 umgesetzt wird, gefolgt von
einer Reduktion des pHs auf pH 4,0, einfach als Vorstufe, um das
Produkt auf eine Trennsäule
zu beladen. Die WO96/11953 lehrt nicht die Vorteile einer Acylierungsreaktion,
um selektiv Polymere an IFN-Reste, außer über das N-terminale Ende oder
Lysine, anzuhaften oder schlägt
dies vor.
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Die
WO95/00162 betrifft ein Verfahren für eine Synthese eines Polypeptids,
enthaltend ein im wesentlichen nicht-antigenes Polymer an einer
bestimmten Stelle, wobei die Synthese eines Peptids initiiert wird
und das Polymer an einem Punkt in der Synthese eingeführt wird,
der zu der vorher bestimmten Stelle korrespondiert. Das Verfahren
verwendet eine Polymer-konjugierte Aminosäure für die Einführung des Polymers an einem
bestimmten Synthesepunkt. Es wird erwähnt, dass die Aminosäure aus
Arginin, Glutaminsäure,
Lysin, Asparaginsäure,
Cystein, Histidin, Tryptophan, Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Serin
und Threonin gewählt
werden kann. Die tatsächliche
Offenbarung ist jedoch auf Lysin als Anhaftungsstelle begrenzt.
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Die
am 19. November 1998 veröffentlichte
WO98/51784, die die Prioritätsdaten
12. Mai 1997 und 13. Februar 1998 beansprucht, betrifft eine Arginindeiminase
(ADI), kovalent über
eine Bindungsgruppe an ein Polyethylenglycol (PEG) gebunden, mit
einem gesamten gewichtsgemittelten Molekulargewicht zwischen 12.000 und
40.000. Die Bindungsgruppe kann aus vielen Gruppen gewählt werden,
insbesondere einer Maleimidgruppe, einer Amidgruppe, einer Imidgruppe,
einer Carbamatgruppe, einer Estergruppe, einer Epoxygruppe, einer Carboxylgruppe,
einer Hydroxylgruppe, einem Kohlenhydrat, einer Tyrosingruppe, einer
Cysteingruppe und einer Histidingruppe. Allgemein ist PEG an ein
primäres
Amin von ADI, insbesondere die verschiedenen Lysine in ADI gebunden.
Eine spezifische Anhaftung an ein Histidin von ADI ist nicht offenbart.
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Die
WO95/13090 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer lang wirkenden
alpha-Interferon-haltigen Zusammensetzung, umfassend eine Konju gationsreaktion
von alpha-Interferon mit einem Polymer in Gegenwart eines Tensids.
Die in diesem Prozess gebildeten Konjugate weisen das Polymer im
wesentlichen an die ε-Aminogruppen
von Lysinen angebunden auf.
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Gotoh
et al., Bioconjugate Chem. Bd. 9, Nr. 6, 1993, 554–559, analysiert
die Reaktionsstelle von Seidenfibrin (SF), wenn dieses mit Cyanursäurechlorid-aktiviertem
Poly(ethylenglycol) umgesetzt wird durch 1H-NMR-Spektroskopie. Es
wird gelehrt, dass mehr als 3,3 mol% der Reste in SF durch die Reaktion
modifiziert wurden und dass die Lysin- (0,32 mol%), die Histidin-
(0,18 mol%) und Tyrosinreste (5 mol%) mit dem aktivierten PEG reagierten.
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Im
Hinblick auf die oben beschriebenen Offenbarungen wird angenommen,
dass zusätzliche
Verbesserungen bei Interferon-Polymer-Konjugaten wünschenswert
sind, um die verschiedenen Nachteile zu überwinden. Die vorliegende
Erfindung stellt zusätzliche
Verbesserungen für
das Gebiet bereit und richtet sich so auf diese Nachteile.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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In
einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung im wesentlichen
reine Zusammensetzungen von His-gebundenen Protein-Polymer-Konjugaten.
Die Konjugate beinhalten ein Protein, wie z.B. alpha-Interferon, kovalent
an ein Polymer konjugiert, wie z.B. ein Polyethylenglycol, an einem
Histidin (His)-Rest des Proteins. Im Fall eines alpha-Interferons
ist das Histidin vorzugsweise ein Histidin 34. Vorzugsweise ist
das alpha-Interferon Interferon-α2b
und die Konjugate enthalten ungefähr einen Polyerstrang pro alpha-Interferonmolekül. Histidin-gebundene
Monopolymerkonjugate anderer Proteine, wie z.B. IL-10, sind ebenfalls
als Teil der Erfindung beinhaltet. Zusammensetzungen, die die bevorzugten
Monopolymer-His-gebundenen Konjugate enthalten, können auch
geringere Mengen anderer Mono-PEG-Proteinspezies enthalten, falls
gewünscht.
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In
einer weitern Ausführungsform
der Erfindung werden Verfahren zur Herstellung der im wesentlichen reinen
Zusammensetzungen von His-gebundenen Protein-Polymer-Konjugaten
bereitgestellt. Insbesondere betreffen diese Verfahren die Herstellung
der Protein-Histidinrest-gebundenen Polymerkonjugate. Die Verfahren
beinhalten die Bildung einer Vielzahl von Protein-Polymer-Konjugatarten
oder Positionsisomeren durch Umsetzung eines Proteins, wie beispielsweise
alpha-Interferon mit einer ausreichend Menge eines geeignet aktivierten
Polymers unter ausreichenden Bedingungen, um die kovalente Anbindung
von Proteinmolekülen an
aktivierte Polymerstränge
und danach die substantielle Isolation der konjugierten Arten oder
Positionsisomeren zu erleichtern, worin die His-Bindung zwischen
dem Protein und Poly mer aus der verbleibenden Konjugatart etabliert
wird. Gemäß einem
bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform
ist das aktivierte Polymer Benzotriazolcarbonat-aktiviertes Polymer.
In einem alternativen Aspekt ist das aktiviertes Polymer ein Oxycarbonyloxy-N-dicarboximid-aktiviertes
Polymer, wie z.B. Succinimidylcarbonat (SC-PEG). Diese aktivierten
Polymere erlauben es dem Fachmann, einen Reaktionspool zu bilden,
worin ein substantieller Anteil der Konjugate den Polymerstrang
beinhaltet, kovalent gebunden an einen Histidinrest am alpha-Interferon
anstelle eines Lysinrests oder dem N-Terminus.
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Einige
der Bedingungen, die es erlauben, dass das Protein His-Positionsisomer,
wie z.B. das αIFN-His34-Isomer,
in relativ hohen Menge vis-à-vis
den anderen Positionsisomeren gebildet werden kann, beinhalten die
Durchführung
der acylierenden Polymerkonjugationsreaktionen in einem bestimmten
pH-Bereich, d.h., bei vorzugsweise weniger als ungefähr 7 und
noch bevorzugter bei ungefähr
4,5 bis ungefähr
6,8. Dies erleichtert die bevorzugte kovalente Anbindung von mindestens
einem Teil der Polymerstänge
an die Histidinrestaminogruppen des Proteins. Die gewünschten
im wesentlichen reinen Proteinkonjugate werden dann vorzugsweise
aus den verbleibenden Proteinkonjugaten in dem Reaktionspool unter
Verwendung von Chromatographiesäulen,
wie z.B. einer Gelfiltration, gefolgt von einem Kationen- oder Anionenaustausch,
gefolgt von einem Kationenaustausch, isoliert.
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Geeignete
alpha-Interferone beinhalten rekombinante und nicht-rekombinante
alpha-Interferone, isoliert von Säugern. Der Polymeranteil des
Konjugats ist vorzugsweise ein Polyalkylenoxid (PAO), wie z.B. ein Monomethoxypolyethylenglycol
(mPEG). In alternativen Ausführungsformen
können
auch andere im wesentlichen nicht-antigene Polymere verwendet werden.
Die Polymere haben vorzugsweise ein Molekulargewicht von ungefähr 200 bis
ungefähr
35.000.
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Die
Zusammensetzung der Erfindung ist bei Behandlungsverfahren verschiedener
medizinischer Zustände,
wie z.B. alpha-Interferon-zugänglichen
Zuständen
bei Säugern,
geeignet. In diesem Aspekt beinhaltet die Behandlung die Verabreichung
einer effektiven Menge einer Zusammensetzung, enthaltend die hier
beschriebenen Proteinkonjugate an Säuger, die einer solchen Therapie
bedürfen.
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Für die Zwecke
der Erfindung soll die Bezeichnung "Positionsisomer" so verstanden werden, dass sie allgemein
ein Konjugat beschreibt, das einen Polymerstrang aufweist, der an
einen der zur Verfügung
stehenden Aminosäurereste
angebunden ist. Spezifische Positionsisomere werden hier im Hinblick
auf den Aminosäurerestanbindungspunkt
beschrieben. Beispielsweise be zeichnet das Protein-Lys3l-Polymer-Positionsisomer
ein Monopolymerkonjugat eines Proteins, wobei das Polymer an Lys31
angebunden ist. Andere Positionsisomere, d.h., diejenigen Konjugate,
bei denen das Polymer woanders an dem Protein angebunden ist, würden ähnlich bezeichnet
werden.
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Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung soll die Bezeichnung "im wesentlichen rein" so verstanden werden, dass sie das
Niveau oder den Grad der Reinheit einer Zusammensetzung, enthaltend
ein gewünschtes
Positionsisomer eines Protein-Polymer-Konjugats bezeichnet. Abhängig von
dem konjugierten Protein und dem verwendeten Konjugat-Trennverfahren
werden die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden
Erfindung als im wesentlichen rein angesehen werden, wenn sie eine
Mehrheit des gewünschten
Positionsisomers enthalten. Vorzugsweise enthalten die Zusammensetzungen
mindestens ungefähr
60% und noch bevorzugter mindestens ungefähr 80% des gewünschten
Positionsisomers.
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Die
Bezeichnung "im
wesentlichen abtrennen" soll
für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung so verstanden werden, dass sie
einen Teil des erfinderischen Verfahrens beschreibt, worin ein gewünschtes
Positionsisomer aus dem Spektrum von Positionsisomeren als Ergebnis
der Verwendung von (vorzugsweise) Hochleistungsflüssigchromatographie
gewonnen wird. Die resultierenden Isolate enthalten im wesentlichen
reine Isolate des gewünschten
Positionsisomers und möglicherweise
geringere Mengen, z.B. weniger als 15%, anderer Positionsisomere.
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Als
Ergebnis der vorliegenden Erfindung wurde unerwartet festgestellt,
dass zusätzliche
Verbesserungen bei Protein-Polymer-Konjugatzusammensetzungen möglich sind.
Beispielsweise ist es nun möglich
im wesentlichen reine Positionsisomere zu erhalten, einschließlich denjenigen
mit relativ hohen Niveaus einer Bioaktivität in relativ hohen Erträgen. Im
Fall von αIFN
demonstrieren die bevorzugten Positionsisomere, d.h., Monopolymer-His34-gebundenen
IFNα-2b-Konjugate
unerwartet hohe Niveaus der Bioaktivität relativ zu nicht nur nativen
alpha-Interferon sondern auch im Vergleich zu anderen Positionsisomeren.
Die anderen Positionsisomere, d.h. diejenigen Konjugate, bei denen
das Polymer an anderer Stelle am Interferon gebunden ist, wie z.B. am
N-Terminus oder einer Lysinaminogruppe, demonstrieren häufig niedrigere,
jedoch nichtsdestotrotz nützliche
Mengen einer Bioaktivität
und können
in einigen erfinderischen Zusammensetzungen in geringen Mengen beinhaltet
sein.
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Es
wurde auch überraschend
festgestellt, dass wenn die Konjugationsreaktion bestimmte aktivierte Polymere
beinhaltet, wie z.B. Benzotriazol carbonat (BTC) aktivierte Polymere,
unerwartet hohe Mengen an Histidin-gebundenen Positionsisomeren
gebildet werden.
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Für ein besseres
Verständnis
der vorliegenden Erfindung wird nun Bezug auf die folgende Beschreibung
und die Zeichnungen genommen.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein Chromatogramm, in Bezug genommen in Beispiel 1.
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2 ist
ein Chromatogramm, in Bezug genommen in Beispiel 2.
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3 ist
eine Grafik, in Bezug genommen in Beispiel 7, und illustriert die
biologische Aktivität
verschiedener Positionsisomere in normalem menschlichem Serum.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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1. PROTEINE
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Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung soll die Bezeichnung "Protein" so verstanden werden, dass sie nicht
nur Proteine, sondern auch Polypeptide, Enzyme, Peptide und ähnliches
mit mindestens einem zur Verfügung
stehenden Histidin für
die Polymeranhaftung umfasst. Weiterhin sind die hier für die Verwendung betrachteten
Proteine nicht auf diejenigen mit physiologischen oder pharmakologischen
Aktivitäten
begrenzt. Es sind beispielsweise auch Enzymkonjugate beinhaltet,
die Reaktionen in organischen Lösungsmitteln
katalysieren können. Ähnlich sind
einige erfinderische Polymerkonjugate auch als Labordiagnostika
nützlich.
Zwei Schlüsselmerkmale
aller Konjugate sind diejenigen, dass sie vorzugsweise über His-Reste
gebunden werden und dass sie sich mindestens einen Teil der Aktivität erhalten,
der mit dem nicht-modifizierten Protein assoziiert ist.
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Proteine,
Polypeptide und Peptide von Interesse beinhalten Hämoglobin,
Serumproteine, wie Blutfaktoren, einschließlich die Faktoren VII, VIII
und IX; Immunglobuline, Cytokine, wie beispielsweise Interleukine, d.h.,
IL-1 bis IL-13, α-, β- und γ-Interferone,
vorzugsweise α-Interferon,
wie im größeren Detail
unten beschrieben, Kolonie-stimulierende Faktoren, einschließlich Granulocytenkolonie-stimulierende
Faktoren, von Blutblättchen
abstammende Wachstumsfaktoren und Phospholipase-aktivierendes Protein
(PLAP), sind jedoch nicht hierauf begrenzt. Andere Proteine von
allgemeinem biologischen oder therapeutischen Interesse beinhalten
Insulin, Pflanzenproteine, wie beispielsweise Lectine und Ricine,
Tumornekrosefaktoren und verwandte Proteine, Wachstumsfaktoren,
wie z.B. transformierende Wachstumsfaktoren, wie z.B. TGFα's oder TGFβ's und epidermale
Wachstumsfaktoren, Hormone, Somatomedine, Erythropoeietin, Pigmenthormone,
Hypothalamus-freisetzende Faktoren, Antidiuresehormone, Prolactin,
Choriongonadotropin, Follikel-stimulierendes Hormon, Thyroid-stimulierendes
Hormon, Gewebeplasmi nogenaktivator und ähnliche. Immunglobuline von
Interesse beinhalten IgG, IgE, IgM, IgA, IgD und Fragmente davon.
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Einige
Proteine, wie z.B. die Interleukine, Interferone und Koloniestimulierenden
Faktoren existieren auch in nicht-glycolsylierter Form, in der Regel
als Ergebnis einer Verwendung von rekombinanten Techniken. Die nicht-glycosylierten
Versionen befinden sich auch unter den Proteinen der vorliegenden
Erfindung.
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Enzyme
von Interesse beinhalten Kohlenhydrat-spezifische Enzyme, proteolytische
Enzyme, Oxidoreductasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen
und Ligasen. Ohne auf bestimmte Enzyme begrenzt sein zu wollen,
beinhalten Beispiele für
Enzyme von Interesse Asparaginase, Arginase, Arginindeaminase, Adenosindeaminase,
Superoxiddismutase, Endotoxinasen, Catalasen, Chymotrypsin, Lipasen,
Uricasen, Adenosindiphosphatase, Tyrosinasen und Bilirubinoxidase.
Kohlenhydrat-spezifische Enzyme von Interesse beinhalten Glucoseoxidasen,
Glucosidasen, Galactosidasen, Glucocerebrosidasen, Glucuronidasen, usw.
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Ebenfalls
hier beinhaltet ist jeder Teil eines Polypeptids, der eine in vivo
Bioaktivität
demonstriert. Dies beinhaltet Histidin-haltige Aminosäuresequenzen,
Antikörperfragmente,
einzelkettige Antigenbindungsproteine, siehe beispielsweise US-Patent
Nr. 4,946,778, bindende Moleküle,
einschließlich
Fusionen von Antikörpern
oder Fragmenten, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper und
katalytische Antikörper.
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Die
Proteine oder Teile davon können
unter Verwendung von dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten Verfahren
hergestellt oder isoliert werden, beispielsweise durch Gewebskultur,
Extraktion aus tierischen Quellen oder durch rekombinante DNA-Methoden.
Transgene Quellen der Proteine, Polypeptide, Aminosäuresequenzen
und ähnlichen
werden ebenfalls betrachtet. Solche Materialien werden von transgenen
Tieren erhalten, d.h., Mäusen,
Schweinen, Kühen,
usw. worin die Proteine in der Milch, dem Blut oder dem Gewebe exprimiert
werden. Transgene Insekten und Baculovirus-Expressionssysteme werden
auch als Quellen betrachtet. Weiterhin liegen mutierte Versionen
von Proteinen, wie z.B. mutierte Interferone auch im Umfang der Erfindung.
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Andere
Proteine von Interesse sind Allergenproteine, wie z.B. Ragweed,
Antigen E, Bienengift, Milbenallergen und ähnliche.
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Ein
bevorzugtes Protein ist alpha-Interferon, wie im Detail unten beschrieben.
Das Vorstehende ist illustrativ für die Proteine, die für die vorliegende
Erfindung geeignet sind. Es sollte verstanden werden, dass diejenigen
Proteine, wie hier definiert und die nicht spezifisch erwähnt wur den,
jedoch eine zur Verfügung
stehende Histidingruppe aufweisen, ebenfalls im Umfang der vorliegenden
Erfindung liegen sollen und liegen.
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Der
Fachmann auf dem Gebiet wird ebenfalls verstehen, dass die Erfindung
Proteine, wie hier definiert, beinhaltet, die spezifisch genetisch
manipuliert wurden, um ein Histidin, zur Verwendung als Polymeranbindungsstelle
zu beinhalten.
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2. INTERFERONE
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In
denjenigen Aspekten der Erfindung, in denen das Protein ein Interferon
(IFN) ist, sollte verstanden werden, dass das Protein von einer
Vielzahl von Quellen hergestellt oder erhalten werden kann, einschließlich rekombinanter
Verfahren, wie z.B. diejenigen, die synthetische Gene verwenden,
die in E. coli exprimiert werden. Siehe auch Pestka, "Interferon a" in Human Cytokines,
Blackwell Scientific Publications 1–16 (1992). Zusätzlich ist
das IFN vorzugsweise ein αIFN
und kann auch ein Extrakt aus einer Säugerquelle sein, wie z.B. von
einem Menschen, einem Wiederkäuer
oder ein Rinder-αIFN.
Ein bevorzugtes IFN ist IFNα-2b,
ein rekombinant hergestelltes Produkt der Schering Corp., Kenilworth,
NJ.
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Die
Bezeichnung "Interferon" oder "IFN", wie hier verwendet,
bedeutet die Familie hoch homologer Proteine, die eine virale Replikation
und zelluläre
Proliferation inhibiert und die Immunreaktion moduliert. Menschliche
Interferone werden in drei Klassen, basierend auf ihrem zellulären Ursprung
und ihrer Antigenizität
gruppiert: α-Interferon
(Leukocyten), β-Interferon
(Fibroblasten) und γ-Interferon
(B-Zellen). Rekombinante Formen jeder Gruppe wurden entwickelt und
stehen kommerziell zur Verfügung.
Subtypen in jeder Gruppe basieren auf antigenen/Struktureigenschaften.
Mindestens 24 Interferon-alphas (gruppiert in die Subtypen A bis H)
weisen distinkte Aminosäuresequenzen
auf und wurden durch Isolation und Sequenzierung von DNA, die diese
Peptide kodiert, identifiziert. Siehe auch Viscomi, 1996 Biotherapy
10:59-86. Die Bezeichnungen "α-Interferon", "alpha-Interferon", "Interferon-alpha" und "menschliches Leukocyten-Interferon" werden in dieser Anmeldung
austauschbar verwendet, um Mitglieder dieser Gruppe zu beschreiben.
Sowohl natürlich
auftretende als auch rekombinante α-Interferone, einschließlich Consensus
Interferon, wie z.B. das im US-Patent Nr. 4,897,471 beschriebene,
können
bei der Durchführung
der Erfindung verwendet werden.
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Die
Reinigung von Interferon-alpha aus menschlichen Leukocyten, isoliert
aus der "buffy coat"-Fraktion von Gesamtblut,
wird im US-Patent Nr. 4,503,035 beschrieben. Menschliches Leukocyten-Interferon,
das auf diese Weise hergestellt wurde, enthält eine Mischung aus menschlichen
Leukocyten- Interferonen
mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen.
Gereinigte, natürliche,
menschliche α-Interferone
und Mischungen davon können
bei der Praxis der Erfindung verwendet werden und beinhalten Sumiferon® Interferon
alpha-n1, erhältlich von
Sumitomo, Japan, Wellferon® Interferon alpha-n1 (Ins),
erhältlich
von Glaxo-Wellcome Ltd., London, Großbritannien, und Alferon® Interferon
alpha-n3, erhältlich
von Purdue Frederick Co., Norwalk, CT, sind jedoch nicht hierauf
begrenzt.
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Das
Aufkommen der rekombinanten DNA-Technologie, angewandt auf die Interferonproduktion
hat es ermöglicht,
dass etliche menschliche Interferone erfolgreich synthetisiert wurden,
wodurch eine Fermentation, Produktion, Isolation und Reinigung verschiedener
Interferone bis zur Homogenität
im großen
Umfang ermöglicht
wurde. Rekombinant erzeugtes Interferon erhältlich eine in vitro und in
vivo antivirale und immunmodulatorische Aktivitäten. Es sollte auch verstanden
werden, dass die rekombinanten Techniken auch eine Glycosylierungsstelle
für eine
Addition eines Kohlendratbestandteils an dem rekombinant abstammenden
Polypeptid beinhalten können.
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Die
Konstruktion von rekombinanten DNA-Plasmiden, enthaltend Sequenzen,
die mindestens einen Teil von menschlichem Leukocyten-Interferon
kodieren und die Expression in E. coli eines Polypeptids mit immunologischer
oder biologischer Aktivität
von menschlichem Leukocyten-Interferon werden im US-Patent Nr. 9,530,901
und europäischen
Patent Nr.
EP 0 032 134 offenbart.
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Die
Konstruktion von Hybrid-α-Interferongenen,
enthaltend Kombinationen unterschiedlicher Subtypsequenzen (z.B.
A und D, A und B, A und F) wird im US-Patent Nr. 4,414,150, 4,456,748
und 4,678,751 offenbart. Typische geeignete rekombinante α-Interferone,
die in der Praxis der Erfindung verwendet werden können, beinhalten
Interferon-alpha-2b, wie z.B. Intron® A,
erhältlich
von Schering Corporation, Kenilworth, N.J., Interferon-alpha-2a,
wie Roferon® A,
erhältlich
von Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J. und Intergen®, erhältlich bei
Amgen, Thousand Oaks, CA, sind jedoch nicht hierauf begrenzt.
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Alternative
Ausführungsformen,
worin das Fremd-α-IFN
nicht vollständig
autolog ist, können
ebenfalls verwendet werden, falls gewünscht. Ein Schlüsselmerkmal
ist jedoch, dass das nicht-autologe αIFN eine ausreichende Bioaktivität oder αIFN-Wirkung
aufweist, wie z.B. eine antivirale Aktivität im Zielsäuger. Andere Substanzen, einschließlich α-IFN-Fraktionen
oder Vorläuferpolypeptiden
können
auch in den Konjugaten der vorliegenden Erfindung beinhaltet sein.
Wie hier verwendet bedeutet "αIFN-Wirkung
in Säugern" eine in vivo Aktivität, korrespondierend
zu derjenigen, die bei αIFN
beobachtet wird. Diese Substanzen werden unter Verwendung von Techniken,
die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt, wie z.B.
Gewebekultur, Extraktion aus tierischen Quellen oder durch rekombinante
DNA-Methoden. Transgene Quellen von αIFN und verwandten Bestandteilen
werden auch betrachtet. Solche Materialien werden von transgenen
Tieren erhalten, z.B. Mäusen,
Schweinen, Kühen,
usw., worin das αIFN-Protein
in Milch, Blut oder anderen Geweben exprimiert wird. Das Verfahren,
durch das das αIFN
für die
Konjugate der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, ist nicht
auf die hier beschriebenen begrenzt. Für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung werden die αIFN's aufgrund ihrer
chemischen und serologischen Eigenschaften bevorzugt. Insbesondere
hat αIFN
dokumentierte antivirale Eigenschaften und diffundiert effektiver
in den Blutstrom als andere Interferone.
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3. NICHT-ANTIGENE
POLYMERE
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Um
das Protein an Polymere, wie Poly(alkylenoxide) zu konjugieren,
wird eine der Polymerhydroxyl-Endgruppen in eine reaktive funktionelle
Gruppe, die eine Konjugation zulässt,
umgewandelt. Dieses Verfahren wird häufig als "Aktivierung" bezeichnet und das Produkt wird als "aktiviertes" Polymer oder aktiviertes Poly(alkylenoxid)
bezeichnet. Andere im wesentlichen nicht antigene Polymere werden ähnlich "aktiviert" oder funktionalisiert.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden die aktivierten Polymere mit einem Protein, wie
z.B. αIFN, umgesetzt,
so dass die Polymeranhaftung vorzugsweise an Aminogruppen an Histidinen
und in geringerem Ausmaß an ε-Aminogruppen
von Lysinen und der N-terminalen Aminogruppe auftritt. Freie Carbonsäuregruppen,
geeignet aktivierte Carbonylgruppen, oxidierte Kohlenhydratbestandteile
und Mercaptogruppen, falls diese auf dem Protein zur Verfügung stehen,
können
auch als zusätzliche
Anbindungsstellen verwendet werden, falls dies gewünscht ist.
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Gemäß einem
bevorzugten Aspekt der Erfindung werden Urethan (Carbamat)-Bindungen
vorzugsweise zwischen einem Hystidinaminogruppenrest des Proteins
und dem aktivierten Polymer gebildet. In einem bevorzugten Aspekt
der Erfindung ist das aktivierte Polymer ein Benzotriazolcarbonat-aktiviertes
Polymer, wie z.B. diejenigen, die n US-Patent Nr. 5,560,234 beschrieben
werden. In einem alternativen Aspekt wird die Urethanbindung unter
Verwendung einer terminalen Oxycarbonyl-oxy-N-dicarboximidgruppe
gebildet, wie z.B. einer Succinimidylcarbonatgruppe. Alternative
aktivierende Gruppen beinhalten N-Succinimid, N-Phthalimid, N-Glutarimid,
N-Tetrahydrophthalimid und N-Norboren-2,3-dicarboxid. Diese urethanbildenden
Gruppen werden in US-Patent
Nr. 5,122,614 beschrieben.
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Wenn
sie als Teil der Erfindung verwendet werden, ermöglichen es diese bevorzugten
aktivierten Polymere dem Fachmann eine Vielzahl von Protein-Polymer-Konjugaten
zu bilden, die das gesamte Spektrum von Positionsisomeren beinhalten
können
oder auch nicht. Die Aggregatsammlung von Konjugaten, die in der auf
Lösung
basierenden Reaktion gebildet wird, wird jedoch einen signifikanten
Anteil derjenigen Konjugate enthalten, die den Polymerstrang kovalent
gebunden an einen Histidinrest am Zielprotein, d.h., alpha-Interferon,
beinhalten, mit geringeren Mengen Lysinrest- oder N-Terminus-gebundenen
Polymersträngen.
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Unter
den im wesentlichen nicht-antigenen Polymeren werden monoaktivierte,
Alkoxy-terminierte Polyalkylenoxide (PAO's), wie z.B. Monomethoxyterminierte
Polyethylenglycole (mPEG's)
bevorzugt; bis-aktivierte Polyethylenoxide (Glycole) werden für die Zwecke
einer Vernetzung von Proteinen oder zur Bereitstellung eines Mittels
zur Anbindung anderer Bestandteile, wie z.B. Zielmitteln für die Lokalisierung
des Protein-Polymer-Konjugats in einem bestimmten Bereich, wie z.B.
der Leber, ebenfalls mit betrachtet.
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Geeignete
Polymere werden substantiell pro Gewicht variieren. Polymere mit
zahlgemittelten Molekulargewichten von ungefähr 200 bis ungefähr 35.000
werden üblicherweise
für die
Zwecke der gegenwärtigen Erfindung
gewählt.
Molekulargewichte von ungefähr
1.000 bis ungefähr
25.000 werden bevorzugt und 2.000 bis ungefähr 20.000 werden besonders
bevorzugt.
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Die
beinhalteten polymeren Substanzen sind ebenfalls vorzugsweise bei
Raumtemperatur wasserlöslich.
Eine nicht-begrenzende Liste solcher Polymere beinhaltet Polyalkylenoxidhomopolymere,
wie z.B. Polyethylenglycol (PEG) oder Polypropylenglycole, polyoxyethylenierte
Polymere, Copolymere davon und Block-Copolymere davon, unter der
Voraussetzung, dass die Wasserlöslichkeit
der Block-Copolymere erhalten bleibt. Zusätzlich zu mPEG, sind auch C1-4-Alkyl-terminierte Polymere nützlich.
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Als
Alternative zu auf PAO basierenden Polymeren können effektiv nicht-antigene
Materialien, wie Dextran, Polyvinylpyrollidone, Polyacrylamide,
wie HPMA's-Hydroxypropylmethacrylamide,
Polyvinylalkohole, auf Kohlenhydraten basierende Polymere, Copolymere
der vorstehenden und ähnliche
verwendet werden. Der übliche
Fachmann auf dem Gebiet wird realisieren, dass die vorstehende Liste
nur illustrativ ist und dass alle Polymermaterialien mit den hier
beschriebenen Qualitäten
mit betrachtet werden. Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet "im wesentlichen oder effektiv nicht-antigen" alle Materialien,
die auf dem Gebiet als nichttoxisch und als nicht eine bemerkenswerte
immunogene Reaktion bei Säugern
hervorrufend, verstanden werden.
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4. REAKTIONSBEDINGUNGEN
-
Konjugationsreaktionen,
die manchmal als PEGylierungsreaktionen bezeichnet werden, werden
häufig
in Lösung
ohne Betrachtung, wo sich das Polymer an das Protein anhaften wird,
durchgeführt.
Solche Techniken werden üblicherweise
bei leicht alkalischem pH, d.h., pH 7+ bis ungefähr 9, zur Konjugation von αIFNs durchgeführt. Ein
Schlüsselmerkmal
für die
vorliegende Erfindung ist jedoch, dass in bestimmten Fällen, wie z.B.
bei αIFNs,
die erhaltene Protein-Bioaktivität
maximiert werden kann, wenn ein einzelner Polymerstrang an ein Histidin
statt an ein Lysin- oder den N-Terminus angehaftet wird. Im Fall
von αIFNs,
wie insbesondere αIFN-2b
ist der bevorzugte Anhaftungspunkt His34. Der Fachmann wird anerkennen,
dass obwohl verschiedene Arten von αIFN ein Histidin an Aminosäure 34 aufweisen
können
oder auch nicht, die Reaktionsbedingungen nichtsdestotrotz vorzugsweise
mindestens einige Positionsisomere bereitstellen werden, die ein
Polymer enthalten, das ein zur Verfügung stehendes Histidin angehaftet
ist. Der Fachmann wird auch erkennen, dass für andere Proteine als αIFN der optimale
Histidinrest für
die Polymeranhaftung ohne unzulässige
Experimente bestimmbar ist.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung beinhalten deshalb:
- 1) Umsetzung einer Lösung, enthaltend eine ausreichende
Menge eines Proteins, wie z.B. alpha-Interferon mit einer geeigneten
Menge eines geeignet aktivierten Polymers, wie z.B. den bevorzugten
Benzotriazolcarbonat-aktivierten oder Oxcarbonyl-oxy-N-dicarboximid-aktivierten
Polymeren unter ausreichenden Bedingungen, um eine kovalente Anhaftung
des Proteins an das aktivierte Polymer zu erleichtern und eine Vielzahl
von Protein-Polymer-Konjugaten zu bilden; und
- 2) im wesentlichen die Abtrennung der Protein-Polymer-Konjugate,
enthaltend ein Polymer, das einen Histidinrest des Proteins konjugiert
ist, aus einer Vielzahl verbleibender Protein-Polymer-Konjugate.
-
Bei
bevorzugten Aspekten, wenn das Protein αIFN-2b ist, enthält die im
wesentlichen reine Zusammensetzung im wesentlichen ein Polymer,
konjugiert an His 34 von αIFN-2b.
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Die
Reaktion wird bei einem pH durchgeführt, der ausreicht, um eine
kovalente Anbindung von mindestens einem Teil der Polymerstränge an ein
Histidin, das auf dem Zielprotein angetroffen wird, zu erleichtern. Insbesondere
ist der pH vorzugsweise leicht sauer, d.h. liegt bei weniger als
ungefähr
7,0; noch bevorzugter bei weniger als ungefähr 6,8 und besonders bevorzugt
im Bereich von ungefähr
4,5 bis ungefähr
6,8.
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Die
Reaktionsbedingungen für
die Bewirkung der Konjugation beinhalten weiterhin die Durchführung der
Anbindungsreaktion mit ungefähr äquimolarer
bis ungefähr
einem relativ geringen Überschuss
des aktivierten Polymers im Hinblick auf das Protein. In dieser
Hinsicht kann der Prozess mit ungefähr 1 bis 25-fachem molaren Überschuss
des Polymers durchgeführt
werden; vorzugsweise ungefähr
1,5- bis 7-fachem molaren Überschuss
des Polymers und besonders bevorzugt ungefähr 1,75- bis 5-fachem molaren Überschuss
des Polymers. Es wird verstanden werden, dass abhängig von
den Präferenzen
des Fachmanns das aktivierte Polymer als Feststoff oder in Lösung dem
Zielprotein zugefügt
werden kann. Die Konjugationsreaktion kann über einen relativ breiten Temperaturbereich,
z.B. ungefähr
0 bis 25°C,
durchgeführt
werden. Die Reaktionszeit wird auch nach Präferenz des Fachmanns variieren
und kann bei weniger als 1 Stunde bis zu 24 Stunden oder selbst
länger
liegen, abhängig
von dem gewählten
aktivierten Polymer. Ein Quentchen der Reaktion ist optional. Diese
Reaktionsbedingungen stellen eine Mischung aus Protein-Polymer-Positionsisomeren
bereit, die unerwartet relativ hohe Mengen an His-Positionsisomeren
enthalten. Vorzugsweise enthält
jedes Isomer einen einzelnen Polymerstrang, angehaftet an das Protein über einen
Aminosäurerest.
In alternativen Ausführungsformen
kann mehr als ein Polymerstrang als Ergebnis des Konjugationsverfahrens
angehaftet sein. Lösungen, enthaltend
diese vielsträngigen
Polymerkonjugate sind auch nützlich,
wie sie sind oder können
weiter verarbeitet werden, um die Konjugate auf der Basis des Molekulargewichts
zum Erhalt von Monopolymerkonjugaten abzutrennen.
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5. ISOLATION VON MONO-PEG-KONJUGATEN
-
Obwohl
das erfinderische Verfahren eine substantielle Menge an Konjugaten
mit einem einzelnen Polymerstrang erzeugt, werden auch Konjugate
mit variierenden Graden einer Polyalkylenoxid-Substitution und so
einem Molekulargewicht erzeugt. Restliche unkonjugierte PAO's und Proteine können auch
vorliegen. Diese Mischung ist typisch in einem Reaktionspuffer,
enthaltend ein oder mehr Phosphat-, Chlorid- und Bicarbonatanionen.
PAO-, Protein- und Konjugatmischung wird vorzugsweise in einer Pufferlösung fraktioniert,
enthaltend ungefähr
1 bis ungefähr
10 mg/ml Proteinkonjugate. Geeignete Fraktionierungslösung haben
einen pH von ungefähr
7,0 bis ungefähr
9,0 und vorzugsweise ungefähr
7,5 bis ungefähr
8,5. Die Lösungen
enthalten vorzugsweise ein oder mehr Puffersalze, gewählt aus
KCl, NaCl, K2HPO4,
KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, (NH4)2CO3 und
Glycin-NaOH. Natriumphosphatpuffer werden bevorzugt.
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Abhängig von
dem Reaktionspuffer kann es möglich
sein, dass die Protein-Polymer-Konjugat-haltige Lösung zunächst eine
Pufferaustausch/U1tra filtration durchlaufen muss. Beispielsweise
können αIFN-Konjugatlösungen über eine
niedermolekulare Cut-Off (10.000 bis 30.000 Dalton)-Membran ultrafiltriert
werden, die auch die meisten Tenside entfernt, falls diese vorliegen.
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Die
Fraktionierung der Konjugate in gewünschte Arten, basierend auf
ihrem Gewicht, wird vorzugsweise unter Verwendung eines Anionenaustauschmediums
durchgeführt.
Solche Medien können
diejenigen Protein-Polymer-Konjugate mit vorher bestimmten, d.h.
ein oder mehr Polymersträngen, überschüssigem Polymer und
nicht-modifiziertem Protein, selektiv binden. Diese Fraktionierung
tritt auf, da die Proteinmoleküle
mit verschiedenen Substitutionsgraden isoelektrische Punkte aufweisen
werden, die in vorhersagbarer Weise variieren werden. Beispielsweise
wird der isoelektrische Punkt von Proteinen durch die Zahl an zur
Verfügung
stehenden Aminogruppen, die auf der Oberfläche des Proteins vorliegen,
bestimmt. Diese Aminogruppen diesen auch als Anhaftungspunkt für Polyalkylenoxidkonjugate.
Daher vermindert sich der isoelektrische Punkt, wenn der Grad der
Substitution des Polyalkylenoxids ansteigt und die Fähigkeit
des Konjugats zur Bindung an ein Anionenaustauschharz schwächt sich
ab. Eine Gelfiltrations-HPLC kann auch verwendet werden, um höher molekulare
(multisträngige)
Konjugate zu entfernen.
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Die
Verwendung von stark polaren Anionenaustauschharzen wird insbesondere
für das
Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Aus diesem Grund
werden quaternäre
Amin-beschichtete Austauschharze verwendet. Das quaternäre Aminharz
kann entweder auf eine polymere oder Silicamatrix geschichtet werden; polymere
Matrizes werden jedoch bevorzugt. Eine Anzahl an Tetramethylamin
oder quaternärem
Methylamin Anionenaustauschharzen sind kommerziell erhältlich,
beschichtet auf die Trägermatrizes.
Beinhaltet unter den kommerziell erhältlichen quaternären Anionenaustauschharzen,
die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind,
sind Q-HD, erhältlich
von BioSepra, QA TRISACRYL® und QMA-SPHEROSIL®,
quaternäre
Aminharze, geschichtet auf eine Polymermatrix, hergestellt von IBF
Garenne, France für
Sepracor, Inc. aus Marlborough, Massachusetts; TMAE650M®, ein
Tetramethylaminoethlyharz, beschichtet auf eine Polymermatrix, hergestellt
von EM-Separators aus Gibbstown, New Jersey; QAE550C® und
SUPERQC®,
jeweils ein quaternäres
Aminharz, geschichtet auf eine Polymermatrix und hergestellt von
TosoHaas aus Montgomeryville, PA. QMA Accell, hergestellt von Millipore
Millford, MA und PEI-Harze, hergestellt von JT Baker, Philipsburg,
NJ, können
ebenfalls verwendet werden.
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Das
Anionenaustauschharz wird in die Säule gepackt und über konventionelle
Mittel äquilibriert.
Ein Puffer mit demselben pH und derselben Osmo- 1alität, wie die konjugierte Proteinlösung, wird
verwendet. Die konjugathaltige Lösung
wird dann auf die Säule
adsorbiert. Nach Abschluss der Beladung wird ein Gradientenfluss
eines Elutionspuffers mit steigenden Salzkonzentrationen auf die
Säule aufgebracht,
um die gewünschten
Fraktionen des Polyalkylenoxid-konjugierten Proteins zu eluieren.
Die Fraktionen haben im wesentlichen ein einheitliches Molekulargewicht
und einen einheitlichen Substitutionsgrad. Die Trennung der verschiedenen
Positionsisomere wird während
dieses Trenntyps jedoch nicht bewirkt.
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Abhängig von
dem Protein haben bevorzugte Konjugatfraktionen 1 bis 4 Polymerstränge pro
Proteinmolekül.
Noch bevorzugter enthält
die Fraktion ungefähr
1 bis 2 und besonders bevorzugt ungefähr 1 Polymerstrang pro Proteinmolekül. Der Elutionspuffer
enthält
vorzugsweise ein oder mehr Salze, gewählt aus KCl, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, (NH4)2CO3. Diese Fraktionen sind im wesentlichen
frei von anderen Konjugaten. Alle nicht-konjugierten Arten können aus
der Säule
durch konventionelle Verfahren rückgewaschen
werden.
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Techniken
unter Verwendung von multiplen isokratischen Schritten einer ansteigenden
Konzentration können
auch verwendet werden. Multiple isokratische Elutionsschritte mit
steigender Konzentration werden zu einer sequentiellen Elution von
Protein-Polymer-Konjugaten führen.
Der Grad der Polymerkonjugation innerhalb jeder Fraktion wird im
wesentlichen einheitlich sein. Der Grad der Polymerkonjugation für jede Fraktion wird
jedoch mit der Elutionszeit abnehmen. Eine Ionenaustauschreinigung
der Konjugate kann auch mit beispielsweise einer Q-HD-Säule von
BioSepra, Inc. zusammen mit einer verdünnten Natriumphosphatlösung durchgeführt werden.
Beispielsweise werden Proben, enthaltend PEG-IFN-Proben, mit 10
mM NaPO4 gewaschen, um nicht-umgesetztes
PAO zu entfernen und danach wird ein Schritt einer Gradientenelution
mit NaCl verwendet. Die Elution mit 10 mM NaCl gewinnt Fraktionen,
enthaltend Konjugate mit mehr als 3 Polymersträngen PAO pro IFN; eine Elution
mit 50 mM NaCl gewinnt Konjugate, enthaltend 1 bis 2 Stränge; eine
Elution mit 150 mM NaCl gewinnt nicht-modifiziertes IFN.
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Der
Temperaturbereich für
die Elution liegt zwischen ungefähr
4 und ungefähr
25°C. Vorzugsweise wird
die Elution bei einer Temperatur von ungefähr 6 bis ungefähr 22°C durchgeführt. Die
Elution der PAO-αIFN-Fraktion
wird durch UV-Absorption bei 254 nm nachgewiesen. Das Sammeln der
Fraktion kann einfache Zeit-Elutionsprofile erreicht werden. Andere
Proteinkonjugate werden ähnlich
eluiert.
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6. TRENNUNG VON POSITIONSISOMEREN
-
Gemäß dem Verfahren
werden gewählte
Positionsisomere des Protein-Polymers im wesentlichen aus der Reaktionsmischung
abgetrennt, vorzugsweise nachdem die Monopolymer-Konjugate von den
anderen Reaktanten getrennt wurden. Aufgrund der Natur der auf Lösung basierenden
Konjugationsreaktion sind die Konjugate eine heterogene Mischung
von Arten, die den Polymerstrang (die -stränge), angehaftet an unterschiedlichen
Stellen auf dem Protein enthalten. In jeder Lösung oder einem Reaktionspool,
enthaltend die Konjugate, ist es wahrscheinlich, dass im wesentlichen
das gesamte Spektrum an Positionsisomeren vorliegen wird. Im Fall
von αIFN-2b
enthalten bevorzugte konjugathaltige Lösungen Konjugate, worin das
Polymer an einen von drei zur Verfügung stehenden Histidinresten,
wie z.B. His34 und optional an ein oder mehr von Cys1, Lys31, Lys49,
Lys83, Lys121, Lys131 und Lys134 des alpha-Interferons-2b angehaftet
ist. Wenn die Reaktionsbedingungen und die aktivierten Polymere,
wie hier beschrieben, verwendet werden, liegt die Anhaftung des
Polymers an einen His-Rest am alpha-Interferon-2b bei mindestens
ungefähr
50% des gesamten Reaktionspools, vorzugsweise bei mindestens ungefähr 75% und
besonders bevorzugt bei mindestens ungefähr 85% der Konjugate in dem
Reaktionspool. Wenn beispielsweise BTC-aktiviertes mPEG zur Bildung
von IFNα-2b-Konjugaten
verwendet wurde, waren ungefähr
90% der gebildeten Konjugate die IFN-His-PEG-Positionsisomere. Wenn
SC-PEG verwendet wurde, waren ungefähr 55% der gebildeten Konjugate IFN-His-PEG-Positionsisomere.
Geringere Mengen der anderen Positionsisomere werden auch angetroffen. Es
wird verstanden werden, dass alternative IFN's wie auch andere Proteine alternative
Verteilungen der Positionsisomere, abhängig von der Aminosäuresequenz
des Ausgangsmaterials, bereitstellen werden.
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Die
Anmelder haben bestimmt, dass innerhalb des Spektrums der Positionsisomere
für jedes
Proteinkonjugat die biologische Aktivität der individuellen Positionsisomere
differieren wird. Während
die Anmelder nicht an diese Theorie gebunden sein wollen wird angenommen,
dass die Unterschiede in der Aktivität für die verschiedenen Positionsisomere
nicht allgemein vorhersagbar sind. Im Hinblick auf diese Bestimmung
ermöglicht
es das Verfahren der vorliegenden Erfindung dem Fachmann zu bestimmen,
welche Isomere hohe Mengen bestimmter Positionsisomere bereitstellen
und Mittel zur Isolation der bestimmten Isolationsisomere aus dem
Reaktionspool sind hoch wünschenswert.
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Die
Trennung der gewünschten
His-Positionsinsomere oder anderer Positionsisomere aus dem Spektrum
von Konjugaten kann durch Verfahren, wie eine Ionenaustauschchromatographie
bewirkt werden. Für
die Zwecke der vorliegen den Erfindung beinhaltet ein Ionenaustausch
Kationen- und/oder Anionenaustausch. Das Konjugationsverfahren,
das zur Bildung der verschiedenen Positionsisomere führt, resultiert
in den individuellen Positionsisomeren, die mit unterschiedlichen
Ladungsverteilungen gebildet werden. Der Unterschied in den Ladungsverteilungen
kann dann verwendet werden, um jedes gewünschte Positionsisomer unter
Verwendung einer Ionenaustauschchromatographie (d.h., kationisch
und/oder anionisch) aufzulösen
(zu gewinnen). Beispielsweise wird vor der Abtrennung das Spektrum
der verschiedene Positionsisomere, die sich aus der Konjugationsreaktion
ergeben, in eine Pufferlösung
platziert, enthaltend von ungefähr
0,5 bis ungefähr 10%
Konjugate pro Gewicht. Die Pufferlösungen enthalten ein oder mehr
Puffersalze, gewählt
aus der nichtlimitierenden Liste von KCl1, NaCl, K2HPO4, KH2PO4,
Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, (NH4)2CO3 und Glycin-NaOH-Puffer
werden zur Verwendung ir. der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Die Elutionsbedingungen werden natürlich von dem Bedarf des Fachmanns
und dem gesuchten Positionsisomer abhangen.
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Allgemein
werden konventionelle Hochleistungsflüssigchromatographietechniken
befolgt. Ein solcher Apparat zur Bewirkung der gewünschten
Trennung ist ein HPLC-System, umfassend eine Mini-S-Kationenaustauschsäule, erhältlich von
Pharmacia Biotech. Es wird dem üblichen
Fachmann deutlich sein, dass ein alternativer Apparat und Säulen, wie
z.B. ein HPLC-System, umfassend eine SP-SPW-Säule, erhältlich von Toso Haas, ebenfalls
zum Erreichen der gewünschten
Trennung nützlich
sein wird. Eine nicht-limitierende Liste geeigneter Harze zur Durchführung der
Trennung beinhaltet Kationen- oder
Anionanaustauschharze, wie z.B. SP-, und CM-, Q- oder DEAE-Sepharose
(von Pharmacia) und CM-, Q-Hyper-D- von BioSepra.
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Als
illustratives Beispiel kann eine Zusammensetzung, enthaltend im
wesentlichen reine IFNα2b-His-Polymerkonjugate,
d.h., ≥ 90%,
von IFN-Polymerkonjugaten in einem Reaktionspool unter Verwendung
von Chromatographiesäulen,
wie z.B. einer Gelfiltration, gefolgt von einem Kationen- oder Anionenaustausch,
gefolgt von einem Kationenaustausch, isoliert werden. Solche Techniken
stellen eine Zusammensetzung bereit, enthaltend mindestens ungefähr 85% IFNα2b-His-34-Polymerkonjugate
und vorzugsweise mindestens ungefähr 90% IFNα2b-His34-Polymerkonjugate. Der
verbleibende Prozentsatz der Zusammensetzungen wird andere Positionsisomere
beinhalten, die nicht deutlich von der therapeutischen Wirkung des gewünschten
im wesentlichen reinen Positionsisomers ablenken. Andere Positionsisomere
von Interferon oder anderen Proteinen werden ähnlich isoliert. Für andere
Proteinkonjugate wird ein ähnliches
Abtrennungsverfahren verwendet. Es wird aus dem Vorstehenden verstanden
werden, dass lineare und/oder Stufengradienten-Trennverfahren ebenfalls
zum Erhalt der Konjugate, korrespondierend zu einem bestimmten Peak
nützlich sind.
Zusätzlich
können
die mit jedem Peak assoziierten Konjugate auf diese Weise, falls
gewünscht,
isoliert werden. Falls nötig
können
die gesammelten Fraktionen wiederum in den Chromatographieapparat
mit demselben Verhältnis
von Zufuhrvolumen zu Säulenbettvolumen
injiziert werden, um die Reinheit der gesammelten Fraktion zu erhöhen. Die
im wesentlichen reinen Positionsisomere können einem Peptidsequenzieren
unterworfen werden, um den modifizierten Aminosäurerest zu bestimmen.
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Als
weiteres Beispiel der oben beschriebenen Techniken können spezifische
IFNα-2b-Polymerkonjugate,
korrespondierend zu bestimmten Peaks, unter Verwendung eines Kationenaustauschharzes,
wie z.B. einer Mini-S in einem HPLC-System gewonnen werden. Jeder
Peak wird auf dem Kationanaustauschchromatographiesystem unter Verwendung
eines linearen Gradienten (A-40
mM Natriumacetat, B-90 mM Natriumacetat, 100 mM NaCl) bei pH 4,7
bis 5,3, Wellenlänge
214 nm gereinigt. Techniken unter Verwendung multipler isokratischer
Schritte mit ansteigender Konzentration des Elutionspuffers, wie
oben diskutiert, zum Zweck der Gewinnung der Monopolymerkonjugate
können
auch zur Gewinnung der gewünschten
Konjugate, korrespondierend zu einem bestimmten Peak, angepasst
werden.
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7. WIRKUNG DES REAKTIONS-PH'S AUF DIE POSITIONSISOMERVERTEILUNG
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung zieht einen Vorteil aus der
Entdeckung, dass die Stelle der Polymeranhaftung an den meisten
Proteinen zu einem großen
Ausmaß durch
den pH des Reaktionssystems beeinflusst wird. Wenn der pH der Reaktionslösung variiert
wird, wird die Reaktivität
zu spezifischen Formen der aktivierten Polymere der verschiedenen
funktionellen Gruppen, wie z.B. alpha-Aminen, Imidazolen und epsilon-Aminen,
variieren. Typischerweise werden Polymerkonjugationsreaktionen bei
basischen pHs durchgeführt,
um die Anhaftung an Lysin-epsilon-Aminogruppen zu maximieren. Beispielsweise
untersuchten Zalipsky et al., Biotech. & App. Biochem, Bd. 15, S. 100–114; (1992)
das SC-PEG-Reagens für
die PEGylierung und berichteten, dass die optimale Reaktivität bei ungefähr pH 9,3
lag. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung beinhaltet jedoch
die Durchführung
der Reaktion bei signifikant niedrigeren pH's um es zu ermöglichen, dass ein substantieller
Teil der aktivierten Polymerstränge
an die Histidinaminogruppen anbindet und Lysin und N-Terminusstellen
für die
Anbindung weniger stark zu betonen, jedoch nicht zu eliminieren.
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Es
wurde auch unerwartet bestimmt, dass die relative Verteilung der
Positionsisomere stark von dem pH abhängig ist, bei dem die Konjugationsre aktion
durchgeführt
wird. Beispielsweise begünstigt
die Verlagerung des pH's
von basisch zu leicht sauer (ungefähr 4,5 bis 6,8) die Bildung
von Konjugaten, gebunden an His34 am IFNα2b und in einem geringeren Ausmaß den N-Terminus
(Cysl) und Lysinreste. Die Verwendung von einem pH (8 bis 10) während der
Konjugationsreaktion begünstigt
andererseits die Bildung von Lysin-bezogenen Anbindungsstellen,
bestätigt
durch Kationenaustauschchromatographie. Wenn IFNα2b nicht beinhaltet ist, wird
natürlich
der His-Rest unterschiedlich sein. Die Reaktionsbedingungen ermöglichen
nichtsdestotrotz eine kovalente Anbindung eines aktivierten Polymers
an ein His.
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8. PHARMAKOKINETISCHE
PARAMETER
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Wie
oben ausgeführt,
enthalten bevorzugte Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
nicht eine heterogene Mischung von Polymer-IFN-Spezies, worin der
Polymerstrang (die -Stänge)
an unterschiedlichen Stellen am Interferonmolekül angehaftet ist/sind. So haben
die Zusammensetzungen vorhersagbare in vivo pharmakokinetische und
Bioaktivitätsprofile,
die die therapeutische Wirkung des konjugierten Proteins maximieren.
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Im
Fall von IFNα sind
einige bevorzugte Zusammensetzungen im wesentlichen reine PEG-His34-IFN-Positionsisomere.
Die Zusammensetzungen erhalten sich mindestens ca. 20%, vorzugsweise mindestens
ca. 35% und besonders bevorzugt mindestens ungefähr 50% der nicht-modifizierten
Proteinbioaktivität.
Es wird verstanden werden, dass die Menge der zurückgehaltenen
Aktivität
und die Länge
der Zirkulationslebenszeit abhängig
von etlichen Faktoren sein wird, einschließlich dem Protein und Zahl
und Gewicht der Polymerstränge,
angehaftet an das Protein.
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9. BEHANDLUNGSVERFAHREN
-
Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
Behandlungsverfahren für
verschiedene medizinische Zustände bei
Säugern,
vorzugsweise Menschen. Die Verfahren beinhalten die Verabreichung
einer effektiven Menge eines Protein-Polymer-Konjugats, das wie
hier beschrieben hergestellt wurde, an einen Säuger, der einer solchen Behandlung
bedarf. Die Konjugate sind für
u.a. Dingen die Behandlungen von Zuständen nützlich, die mit dem nichtmodifizierten
Protein behandelt werden. Beispielsweise können Säugern, die einer Enzymersatztherapie
oder Blutfaktoren bedürfen,
die im wesentlichen reinen Polymerkonjugate verabreicht werden,
die das gewünschte
Material enthalten. Im Fall von alpha-Interferon, Interferon-zugängliche
Zustände
oder Bedingungen, die positiv oder günstig, wie diese Begriffe auf
dem Gebiet der Medizin bekannt sind, auf eine auf Interferon-basierende
Therapie reagieren würden.
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Zustände, die
gemäß der vorliegenden
Erfindung behandelt werden können
sind allgemein diejenigen, die für
eine Behandlung mit Interferon-alpha zugänglich sind. Beispielsweise
beinhalten zugängliche
Zustände diejenigen
Zustände,
die positiv oder günstig,
wie diese Bezeichnungen auf dem Gebiet der Medizin bekannt sind,
auf eine Interferon-alpha basierende Therapie reagieren würden. Für die Zwecke
der Erfindung beinhalten Zustände,
die mit einer Interferon-alpha-Therapie behandelt werden können, diejenigen
Zustände,
worin eine Behandlung mit einem Interferon-alpha einige Wirksamkeit
zeigt, die jedoch mit Interferon-alpha nicht behandelbar sein könnten, da
die negativen Nebenwirkungen die Nutzen der Behandlung übersteigen.
Beispielsweise haben Nebenwirkungen, die eine alpha-Therapie begleiten
im wesentlichen eine Behandlung von Epstein-Barr-Virus unter Verwendung
von Interferon-alpha ausgeschlossen. Die Praxis der Erfindung führt zu im wesentlichen
reduzierten oder eliminierten Nebenwirkungen im Vergleich zu einer
konventionellen Interferon-alpha-Behandlung.
-
Beispielhafte
Bedingungen, die mit Interferon behandelt werden können, beinhalten,
sind jedoch nicht begrenzt, auf eine Zellproliferationsstörung, insbesondere
Krebs (z.B. Haarzellleukämie,
Kaposi-Sarkom, chronisch myelogene Leukämie, multiples Myelom, Basalzellkarzinom
und malignes Melanom, Ovarkrebs, kutanes T-Zelllymphom) und virale
Infektionen. Ohne Begrenzung kann die Behandlung mit Interferon
zur Behandlung von Zuständen
verwendet werden, die aus der Inhibition der Replikation von Interferonempfindlichen Viren
Nutzen ziehen würden.
Virale Infektionen, die gemäß der Erfindung
behandelt werden können,
beinhalten Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, oder Non-A/Non-B-Hepatitis,
Herpesvirus, Epstein-Barr-Virus (EBV), Cytomegalievirus (CMV), Herpes
simplex, menschlicher Herpesvirustyp 6 (HHV-6), Papilloma, Poxvirus,
Picornavirus, Adenovirus, Rhinovirus, menschlicher T-lymphotropischer
Virustyp 1 und 2 (HTLV-1/-2), menschliches Rotavirus, Tollwut, Retroviren
einschließlich
des menschlichen Immundefizienzvirus (HIV), Encephalitits und respiratorische
virale Infektionen. Das durch die Mittel der Erfindung implementierte
Verfahren kann auch verwendet werden, um verschiedene Immunreaktionen
zu modifizieren.
-
Varianten
von Interferon-alpha werden gegenwärtig in den Vereinigten Staaten
und auch in anderen Längern
für die
Behandlung der Haarzellleukämie,
Geschlechtswarzen, Kaposi-Sarkom und chronischer Non-A/Non-B-Hepatitis
anerkannt: Interferon-alpha-2b, vermarktet als Intron®A (Schering
Corp., Kenilworth, N.J.) und Interferon-alpha-2a, vermarktet unter
der Marke Roferon®A (Hoffmann-La Roche,
Nutley, N.J.) und Consensus-Interferon, vermarktet unter der Marke
InfergenTM (Amgen, Thousand Oaks, CA). Da
Interferon alpha-2b unter allen Interferonen die breiteste Anerkennung
in der Welt zur Behandlung von chronischer Hepatitis C-Infektion
besitzt, wird es besonders zur Verwendung bei der Behandlung von
chronischer Hepatitis C gemäß der Zusammensetzung
der Erfindung bevorzugt.
-
Die
Verabreichung der verschiedenen Dosierungen kann an jedem zweiten
Tag geschehen, jedoch vorzugsweise ein oder zweimal pro Woche. Die
Dosen werden üblicherweise über mindestens
eine 24-wöchige
Periode durch Injektion verabreicht.
-
Die
Verabreichung der Dosis kann intravenös, subkutan, intramuskulär oder durch
jedes andere akzeptable systemische Verfahren geschehen. Basierend
auf der Bewertung des begleitenden Arztes wird die Menge des verabreichten
Arzneimittels und die Behandlungsvorschrift natürlich abhängig von Alter, Geschlecht
und Anamnese des behandelten Patienten, der Neutrophilenzahl (z.B.,
der Schwere der Neutropenie), der Schwere des spezifischen Erkrankungszustandes
und der Toleranz des Patienten gegenüber der Behandlung, gezeigt
durch lokale Toxizität
und systemische Nebenwirkungen, variieren. Dosierungsmenge und Frequenz
kann während
anfänglichen
Screenings der Neutrophilenzahl bestimmt werden.
-
Konventionelle
pharmazeutische Formulierungen können
ebenfalls unter Verwendung der im wesentlichen reinen konjugathaltigen
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
Die Formulierungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge der
im wesentlichen reinen Interferon-Polymerkonjugatzusammenstezung
zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern. Beispielsweise können Adjuvantien,
Verdünnungsmittel,
Konservierungsmittel und/oder löslichmachende
Mittel, falls nötig,
verwendet werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen von Interferon,
einschließlich
derjenigen der vorliegenden Erfindung, können Verdünnungsmittel verschiedener
Puffer (z.B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat) mit einem pH-Bereich und
einer Ionenstärke,
Träger
(z.B. menschliches Serumalbumin), löslichmachende Mittel (z.B.
Tween, Polysorbat) und Konservierungsmittel (z.B. Thimerosol, Benzylalkohol)
beinhalten. Siehe beispielsweise US-Patent 4,496,537.
-
Die
Menge des im wesentlichen reinen verabreichten α-IFN-Polymerkonjugats zur Behandlung
der oben beschriebenen Zustände,
basiert auf der IFN-Aktivität des Polymerkonjugats.
Es ist eine Menge, die ausreicht, um signifikant eine positive klinische
Reaktion zu bewirken. Obwohl die klinische Dosis bei einigen Patienten
ein gewisses Niveau an Nebenwirkungen auslösen wird, ist die Maximaldosis
für Säuger, einschließlich dem
Menschen, die höchste
Dosis, die nicht zu nicht mehr behandlungsfähigen klinisch wichtigen Nebenwirkungen
führt.
Für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung sind solche klinisch wichtigen
Nebenwirkungen diejenigen, die den Abbruch einer Therapie aufgrund
schwerer, grippeähnlicher
Symptome, einer Depression des zentralen Nervensystems, schwerer
gastrointestinaler Störungen,
Alopecie, schwerem Pruritus oder Ausschlag führen würden. Substantielle weiße und/oder
rote Blutzell- und/oder Leberenzym-Abnormalitäten oder Anämie-ähnliche Zustände begrenzen
die Dosis ebenfalls.
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Natürlich werden
die Dosierungen der verschiedenen αIFN-Zusammensetzungen etwas
abhängig
von dem gewählten αIFN-Bestandteil
und dem gewählten
Polymer variieren. Im allgemeinen wird das Konjugat jedoch in Mengen
von ungefähr
100.000 bis ungefähr
einige Millionen IU/m2 pro Tag, basierend
auf den Zustand des Säugers,
verabreicht. Der oben dargestellte Bereich ist illustrativ und der
Fachmann auf dem Gebiet wird die optimale Dosis des gewählten Konjugats,
basierend auf seiner klinischen Erfahrung und der Behandlungsindikation
bestimmen.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form einer Lösung, Suspension,
einer Tablette, Kapsel, einem lyophilisierten Pulver oder ähnlichem,
hergestellt mit den wohl auf dem Gebiet bekannten Verfahren, vorliegen.
Es wird auch betrachtet, dass die Verabreichung solcher Zusammensetzungen
im wesentlichen auf dem parenteralen Weg geschieht, obwohl orale
oder Inhalationswege ebenfalls verwendet werden können, abhängig von
dem Bedarf des Fachmanns.
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BEISPIELE
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Die
folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung weiter und besser
erkennen zu können,
sollen jedoch den effektiven Umfang der Erfindung auf keine Weise
begrenzen.
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BEISPIEL 1
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In
diesem Beispiel wurde rekombinantes α-Interferon 2b (rαIFN), ein
Produkt der Schering Corporation, Kenilworth, New Jersey, mit aktiviertem
Polyethylenglycol-N-succinimidylcarbonat (SC-PEG), Molekulargewicht
12.000, das wie beschrieben im US-Patent Nr. 5,122,614 hergestellt
wurde, konjugiert. Die Konjugationreaktion wurde bei Raumtemperatur
und einem pH von ungefähr
6,5 durchgeführt.
Ein Verhältnis
von 2,6 g SC-PEG12.000 zu 1 g IFN wurde verwendet. Das SC-PEG wurde
als Feststoff zugefügt
und die Reaktion wurde bei einer Temperatur von ungefähr 4°C durchgeführt. Am
Ende der Reaktion wurde Glycin zugefügt, um jedes restliche PEGylierungsreagens
zu löschen.
Das Produkt aus der Reaktion wurde dann unter Verwendung eines Q-HyperD-Harzes bei
pH 8 mit einer Salzelution gereinigt, um nicht umgesetzte Bestandteile
und multi-PEGylierte Arten zu entfernen. Das von dem Q-HyperD-Harz gewonnene Mono-PEG-IFN
war ungefähr 55%
His34-gebundenes PEG-IFN, 20% N-Terminus, 12% Lysin121, wobei die
Balance Lysin131, Lys134, Lys49 und Lys83 war. Dieses Material,
enthaltend die etlichen Positionsisomere wurde dann gegen 20 mM Acetatpuffer
bei pH 4,9 dialysiert und auf eine Säule, gepackt mit einem SP-Sepharose-Hochleistungsäquilibrat
mit 10 mM Acetatpuffer bei pH 4,9 (ungefähr 4 mg des Materials für 4 ml Harz)
beladen. Das Material wurde unter Verwendung eines Natriumchloridgradienten
(0 bis 500 mM) in dem Acetatpuffer eluiert. 1 zeigt
das Elutionsprofil von der Säule.
Es zeigte sich, dass Peak 1 über
90% His34-gebundenes PEG-IFN
war.
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BEISPIEL 2
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In
diesem Beispiel wurde der Konjugationsprozess von Beispiel 1 etliche
Male wiederholt. Die Identifizierung der verschiedenen Positionsisomere
wurde jedoch unter Verwendung eines Anionenaustausches, gefolgt
von einem Kationenaustausch bestimmt.
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Eine
Mini-S-Kationenaustauschsäule
(Pharmacia Biotech) unter Verwendung von HPLC wurde verwendet, um
die Stellen der Polymeranhaftung zu bestimmen und die individuellen
Positionsisomere zu identifizieren. Die mobile Phase A beinhaltet
10 mM Natriumacetat-pH-5,3-Puffer und 25% 2-Propanol. Die mobile Phase
B enthielt 500 mM Natriumchlorid, gelöst in der mobilen Phase A.
Die Flussrate wurde auf 0,5 ml/min. eingestellt und das eluierte
Protein bei 214 nm nachgewiesen. Die individuellen PEG-IFN-Lösungen wurden mit
10 mM Natriumacetat, pH 5,3, enthaltend 2-Propanol (5%) auf eine
1 mg/ml Proteinkonzentration verdünnt. Die Injektionsvolumina
reichten von 10 bis 30 μl,
abhängig
von der Proteinkonzentration. Der folgende lineare Gradient wurde
verwendet:
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Die
Ergebnisse werden in Tabelle 1 unten bereitgestellt und in
2 grafisch
illustriert. Unter Bezugnahme auf die Figur kann beobachtet werden,
dass Peak 3 als Hauptkomponente bestimmt wurde. Weiterhin führte die
chromatografische Auftrennung zu der Gewinnung von Hauptpeaks mit
unter schiedlicher Intensität. Es
sollte jedoch festgehalten werden, dass die individuellen Arten,
d.h., die Positionsisomere, bei diesem System nicht vollständig voneinander
getrennt werden. Beispielsweise wurde bestimmt, dass die Fraktion,
inkorporierend Peak 3 ungefähr
90% His34-Positionsisomer und ungefähr 10% Lys31-Positionsisomer
enthielt. Die Isolation und Gewinnung dieser Fraktion führte zu
einer Zusammensetzungen, die im wesentlichen reines αIFN2b-His34-PEG
enthielt. Es gibt etwas Überlappung
in der Positionsisomerelution. Es kann jedoch beobachtet werden,
dass der Peak oder die Fraktion 3 ungefähr 50% der Gesamt-PEG-Interferon-Arten
repräsentierten. TABELLE
1 BEREICHSPROZENTQUANTIFIZIERUNG
VON PEG-IFN-CHARGEN DURCH KATIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
- Hauptpeakzuordnung: Peak 2: Lys-134-gebundenes
PEG-IFN; Peak 3/4:
His-34-gebundenes PEG-IFN; Peak 6: Lys-121-gebundenes
PEG-IFN und Lys-131-gebundenes
PEG-IFN; Peak 8: Cys-1-gebundenes PEG IFN.
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Diese
Ergebnisse illustrieren, dass eine Mehrzahl der Konjugate in den
Peaks 3 und 4 (His34-gebundenes PEG-IFN) angetroffen wurde. Die
Ergebnisse zeigen auch, dass entgegen der Erwartung die meisten Konjugate
durch Anhaftung des Polymers an ein Histidin anstatt an eine der
Lysinaminogruppen gebildet wurden.
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BEISPIEL 3
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In
diesem Beispiel wurden die verschiedenen in Beispiel 2 identifizierten
Positionsisomere unter Verwendung etlicher Zyklen eines Mono-S-Kationenaustausches
gewonnnen. Jede der gewonnenen chromatographischen Fraktionen wurde
dann durch einen CPE-Bioassay (antivirale Aktivität) getestet.
Tabelle 2 unten zeigt die Bioaktivität relativ zu nativem Interferon
(nativ = 100%).
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Tabelle
2: RELATIVE BIOAKTIVITÄT
(IFN)
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Es
kann aus Tabelle 2 abgelesen werden, dass die His34-Positionsisomerstelle
(die auch eine geringe Menge Lys31 beinhaltet) die höchste inhärente Bioaktivität im Vergleich
zu nativem Interferon besitzt (51%). So haben im wesentlichen reine
Zusammensetzungen, die nur diese Fraktion enthalten, wobei es sich
im wesentlichen um das His34-Positionsisomer handelt, Vorteile gegenüber Konjugaten,
die das Spektrum der Positionsisomere enthalten.
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Die
Fraktionen wurden dann unter Verwendung eines enzymatischen Verdau-Analyseschemas
unter Verwendung von Trypsin und V-8-Protease, gefolgt von einem
Größenausschlusschromatographieschritt
für das
Aufreinigen gekennzeichnet. Das Material wurde einer Proteinsequenzanalyse
unterworfen, wobei aus einer Vakanz in der Proteinsequenz auf die
Gegenwart eines PEGylierten Aminosäurerestes in dem Interferonpeptid
geschlossen werden kann. Die Charakterisierungsarbeit ergab, dass
das PEG an acht unterschiedlichen Stellen des α-Inteferon-2b-Moleküls angehaftet
ist: Cysl, Lys31, His34, Lys49, Lys83, Lys121, Lys131 und Lys134.
Die Details werden unten bereitgestellt.
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BEISPIEL 4
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In
diesem Beispiel wurde das Verfahren von Beispiel 1 unter Verwendung
von Benzotriazolcarbonat-aktiviertem PEG (BTC-PEG), erhalten von
Shearwater Polymers, Inc. (Molekulargewicht 12.000) wiederholt.
Insbesondere wurde IFNα-2b
mit BTC-PEG unter Verwendung eines Verhältnisses von 2,6 g BTC pro Gramm
IFN umgesetzt. Die Reaktion wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur mit
einer Konzentration von 2 mg Interferon/ml vor einem Löschen mit
Glycin durchgeführt.
Eine Gesamtmenge von 60 mg IFN wurde verwendet. Die Reaktionsmischung
wurde gegen einen Gelfiltrationspuffer, enthaltend 100 mM Natriumphosphatpuffer
und 150 mM Natriumchlorid, pH 5,0 dialysiert. 5 ml des dialysierten
Materials wurde auf eine 200 ml Superdex 200-Säule, äquilibriert mit dem Gelfiltrationspuffer,
geladen, um die Mono-PEG-Spezies von den vielsträngigen Spezien zu trennen.
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Vor
der Durchführung
der Charakterisierung der verschiedenen Positionsisomere wurde die
Mono-PEG-IFN-Reaktionsmischung einem Hydroxylamin-Empfindlichkeitstest
unterworfen, um den Prozentsatz der Konjugate zu bestimmen, die
an Histidinstellen PEGyliert waren, einschließlich IFN-His34. Es ist bekannt, das
Hydroxylamin PEG von IFN-Histidinresten selektiv spaltet. Ein Aliquot
von jeder der Proben (50 μl)
wurde mit 0,45 ml 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, verdünnt. Ein
Aliquot dieser Proteinlösung
(150 μl)
wurde mit 150 μl
0,5 M Hydroxylamin behandelt und 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Es wurde bestimmt, dass mehr als 90% der Konjugate Hydroxylamin-empfindlich
waren, was anzeigt, dass über
90% des Materials His-gebundenes PEG-Interferon ist. Eine weitere
Kennzeichnung der Reaktionsmischung bestätigte, dass His34 der einzige
konjugierte Histidinrest war. Eine HPLC-Chromatographie des Superdex
200-Pools zeigte an, dass His34 tatsächlich die Haupt-PEGylierungsstelle
war. Dies wurde weiter durch Kennzeichnung des Endprodukts unter
Verwendung eines enzymatischen Verdau-Ana lyseschemas, ähnlich dem
in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren bestätigt, was anzeigte, dass His34
die Hauptstelle der PEGylierung war. Die spezifische Aktivität dieses
Positionsisomer erwies sich als bei 89 MIU/mg liegend.
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Die
im wesentlichen reinen IFN-His34-PEG-Konjugate wurden auch aus der
BTC-PEG-IFN-Reaktionsmischung unter Verwendung von nur einem Zyklus
einer Kationenaustauschchromatographie gewonnen. Die Reaktionsmischung
wurde gegen 40 mM Natriumacetatpuffer bei pH 5,1 dialysiert. Ungefähr 3,2 ml
der dialysierten Reaktionsmischung wurden auf 4 ml einer SP-SPW-Säule geladen und der His34-PEG-IFN-Peak wurde
unter Verwendung eines NaCl-Gradienten
(0 bis 500 mM) bei pH 5,1 eluiert. Die His34-PEG-IFN-Reinheit des
Produktpools betrug mindestens 94%. Das di-PEG-IFN im Pool lag bei
ungefähr
3 bis 5%.
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BEISPIELE 5 BIS 6
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In
diesen Beispielen wurde das Verfahren von Beispiel 4 unter Verwendung
von BTC-PEG (Molekulargewicht 5.000, Beispiel 5, bzw. 20.000, Beispiel
6) wiederholt. Die Menge an His-PEG-Interferon für Beispiel 5 wurde durch die
Hydroxylaminreaktion bestimmt und lag bei ungefähr 90 bis 95%, während die
bestimmte Menge in Beispiel 6 bei ungefähr 91% lag. Die Isolierung
der verschiedenen Positionsisomere von PEG-IFN unter Verwendung
einer Gelfiltration wurde dann durchgeführt, um nicht-monosträngige Konjugate
zu entfernen. Die spezifische Aktivität der PEG5.000-Konjugate lag
gemäß Bestimmung
bei ungefähr
119 MIU/mg, während
die PEG20.000-His39-Positonsisomer-spezifische
Aktivität
89 MIU/ml betrug.
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BEISPIEL 7
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In
diesem Beispiel wurde die biologische Aktivität der individuellen Positionsisomere
(His34, Lys121 und N-Terminus), wie oben identifiziert, nach Inkubation
in normalem menschlichen Serum bei 37°C für bis zu 72 Stunden getestet
und mit nicht-PEGyliertem nativen Interferon verglichen. Die Ergebnisse
sind in 3 dargestellt.
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Unter
Bezugnahme auf 3 kann beobachtet werden, dass
unerwarteter Weise nur die Aktivität des His34-Positionsisomers über die
Zeit zunahm, während
die Aktivität
der anderen Positionsisomere relativ konstant blieb. Das native
Interferon demonstriert andererseits einen vorhersagbaren Aktivitätsabfall über die
Beobachtungszeitspanne. Obwohl die Anmelder nicht an diese Theorie
gebunden sein wollen, wird angenommen, dass der Aktivitätsanstieg
bei dem His34-gebundenen Material zu der relativ langsamen Hydrolyse
der His-PEG-Bindung und darauffolgenden Freisetzung von freiem IFN
in Beziehung steht. Diese Figur zeigt die einzigartigen Eigenschaften
der His-PEG-Bindung, darin dass sie unter bestimmten Bedingungen
schwächer ist
als die Lys-PEG-Bindungen und so ihr Zusammenbruch einen verlängerten
oder "Langsam-Freisetzungs"-Mechanismus bereitstellt.
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BEISPIELE 8 BIS 9
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IL-10-PEG-KONJUGATE
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In
diesen Bespielen wurde das Protein IL-10, ein nicht-kovalentes Homodimer
an BTC-PEG12.000 (Beispiel 8) oder SC-PEG12.000 (Beispiel 9) bei
pH 6,5 konjugiert, um den Grad der Histidin-gebundenen Positionsisomere
im resultierenden Reaktionspool zu bestimmen. IL-10 hat drei zu
Verfügung
stehende Histidine.
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Man
folgte den oben im Hinblick auf IFN beschriebenen PEGylierungsverfahren,
um die Konjugation durchzuführen.
Jedoch wurde insbesondere in jedem Fall ein 2- bis 3-facher molarer Überschuss
des aktivierten Polymers und eine Gelfiltration verwendet. Ein Hydroxylamin-Sensitivitätstest wurde
an jeder Charge durchgeführt,
um die Menge an His-haltigen Positionsisomeren zu bestimmen. Das
auf BTC-basierende Konjugat enthielt so ungefähr 50% mehr Hydroxylamin-labile
Konjugate als die auf SC-basierenden Konjugate. Es wurde bestimmt,
dass die spezifische Bioaktivität
der auf BTC-basierenden Konjugate bei ungefähr 84% lag, wobei der MC-9-Bioassay
verwendet wurde. Es erwies sich, dass die auf SC-PEG-basierenden
Konjugate eine spezifische Bioaktivität von ungefähr 49% besaßen.
