JPH04504801A - システイン付加ポリペプチド変異体及びそれらの化学修飾物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 システィン付加ポリペプチド変異体及びそれらの化学修飾物技術分野 本発明は一般に、スルフヒドリル反応基を持つ化合物の付加によって修飾された ポリペプチド、そのような修飾されたポリペプチド産生のための改良された方法 及び、れそらを含む改良された組成物に関する０本発明はとりわけ、３種類の修 飾されたポリペプチド（ＩＬ−３，Ｇ−Ｃ３Ｆおよび、ＥＰＯ）に関しており、 これらのポリペプチドに対して、重合体を含むスルフヒドリル反応性化合物が、 システィン残基の挿入によって、または、システィン残基がその他の残基と置換 することによって修飾されているポリペプチドの選択された位置において付加で きる。

１東技術 修飾された生物学的に活性のあり、そして、治療の面で役にたつ、その薬理作用 促進のために親水性の重合体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような様々な 化合物が付加されたポリペプチドが望ましいことは注目されてきた０例えば、Ｐ ＣＴ出願公開ＷＯ３７１０００５６，米国特許Ｎｏ、４，１７９，３３７　（酵 素及びインシュリンのような水溶性ポリペプチドのＰＥＧまたはＰＰＧへの結合 を開示している）及び米国特許Ｎｏ、４，７６６．１０６　（通常、非水溶性ベ ーターインターフェロン、インターロイキン−２または、イムノトキシンの、ホ モ重合体ＰＥＧまたはポリオキシエチル化グリセロールへの結合を開示している ）におけるポリペプチド修飾のこの分野での先行技術に関する議論参照されたい 。

このような修飾は、ポリペプチドに対する有害な免疫応答を減少させ、薬物の調 製時に利用する場合の溶解性を増加させ、治療効率の面でそのようなポリペプチ ドを、望ましい環境レベルに保つことができる。

この分野における先行技術によって焦点をあてられていない一つの課題には、ポ リペプチドが、その特定のアミノ酸残基に共有結合するような反応基を持った化 合物の付加によって修飾することができるという範囲を含んでいる０例えばＰＥ Ｇまたは類似した重き体によるポリペプチドの修飾によれば、ポリペプチドの末 端のアミン基への、及び／またはタンパク質のアミノ酸配列中の一つまたはそれ 以上のりジン残基への重合体の不規則な付加を生じることがある。一つ以上のＰ ＥＧ基がポリペプチドに付加できるため、その結果生じる化合物はｒＰＥＧ化さ れた」ポリペプチドの不均質な混合物を含むこともある。すなわち、あるものは 、たった一つのＰＥＧ化された部位を持つポリペプチドとなり、そのほかのもの は一つ以上のＰＥＧ化された部位を持つ、そのように化合物が不均質になること は薬物利用の面で望ましくない、さらに、ＰＥＧがポリペプチドに付加するよう な、化合物の付加位置に関する非特異性は、生物学的活性に必要なポリペプチド 部位への望ましくない付加に起因するポリペプチドの生物活性の消失を引き起こ すことがある。米国特許４，９０４，５８４はリジンの挿入、除去、及び／また は置き換えによる、ポリペプチドの部位特異的共有結合修飾の為の物質と方法を 提供することで前記の点に注意を払っている。しかしながら、我々は修飾、例え ばＰＥＧ化、の付加サイトとしてリジンを利用すると、不利なこともあることが 判明している。なぜなら全ての修飾が生物学的に活性のあ化合物を生じるわけで はなく、Ｎ−末端のＰＥＧ化が望まれない場合にはＮ−末端のＰＥＧ化を阻害す るステップを取り入れなければならないからである。

凡咀Ｏ概整 本発明はポリペプチド、更に詳細にはそして好ましくは、ヒトＩＬ−３．顆粒球 コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ）及びエリトロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド 、均質にＣｙｓ修飾されたＩＬ−３類、Ｇ−Ｃ３Ｆ類およびＥＰＯ類を含む組成 物及びそれらを含む薬物組成物の製造ができる、ポリペプチドの部位特異的共有 結合修飾のための物質と方法を提供する。ここで用いられている用語としての“ 均質にＣｙｓ修飾された”とは、実質的に一貫して特異的な、挿入され、置換さ れたシスティン残基を意味する９例えば均質に修飾されたＩＬ−３は実質的に一 貫して６位（成熟タンパク質のＮ−末端から数える慣習による）に、自然状態の ＩＬ−３のスレオニンの位置にシスティンを挿入することによる修飾を受けてお り、それ以外の位置には受けでいないＩＬ−３組成物である。

従って、本発明は最初にＩＬ−３，Ｇ−Ｃ３Ｆ、およびＥＰＯのシスティン付加 変異体群（“ＣＡＶｓ”）を提供する０本発明のＣＡＶｓは、対応する自然状態 の、あるいは既知のＩＬ−３，Ｇ−Ｃ８ＦおよびＥＰＯに比べて少なくとも一つ の追加のシスティン残基を含むＩＬ−３，Ｇ−Ｃ３ＦおよびＥＰＯ修飾体を包含 する。１または２以上のシスティン残基は、天然のあるいは既知の目的ＣＡＶ中 の一つまたはそれ以上のアミノ酸位置に、ＣＡＶｓのポリペプチド構造中に導入 される。

ヒトＩＬ−３の場き、１６位及び８４位に天然に生じるシスティン残基はジスル フィド架橋を形成し、これは、ポリペプチドの望ましい生物活性を保つのに不可 欠であること、を見出した。新しいシスティンの付加のためには、ポリペプチド 中のいくつかの位置、位置１５及び５１のような位置は不適当である；このよう な位置に導入されたシスティンは実質的に生物活性の低下しているヒトＩＬ−３ ポリペプチドを生じさせる。しかしながら位置１−１４の適当な置換または欠失 はＩＬ−３の望まれる生物活性を顕著に消失させることはない。従って、新しい システィンのポリペプチドへの導入領域は位置１−１４までとなることが望まれ 、現在のところ位置６−１２てはとりわけシスティン導入には望ましい部位とな っている。新しくこの領域中の選択された位置に加えられたシスティンへの、以 下に議論するように、重合体を含むスルフヒドリル反応性化合物を引き続いて付 加することは、生物活性のいかなる顕著な低下も招かない。

ここで用いられている“システィン付加変異体”という用語は、天然のまたは既 知の相当物についてアミノ酸構造が修飾されたＩＬ−３，Ｇ−Ｃ３ＦおよびＥＰ Ｏの変異体を意味し、その修飾は少なくとも一つのシスティン残基が天然の物質 または既知の配列中に挿入され及び／またはそれらの配列中の異なったアミノ酸 を置換するのに用いられているようなものである。

さらに、ＩＬ−３に関しては、ネイティブすなわち“天然の”ＩＬ−３配列は、 細菌内での発現用にイニシエーターのメチオニンが付加されているが、最初のア ラニンが成熟ポリペプチドのＮ−末端で除去され、アミン末端配列がＭＥＴ＊Ａ ＬＡ＊ＰＲＯからＭＥＴ＊ＰＲＯに変化（”ｍｐ”ミューティン）するようにさ らに修飾されることらある二既に知られているように細菌内発現系ではＮ−末端 メチオニンにおける切断が起こる。同様に天然ＥＰＯのＮ−末端配列（ＭＥＴ付 加されている）は、ＭＥＴ＊ＡＬＡ＊ＰＲＯから開始し、ｍ　ｐ　Ｅ　Ｐ　Ｏミ ューティンを得るために最初のアラニンを欠失させる利点を証明することができ る。Ｇ−Ｃ３Ｆに関しては天然ヒトＮ−末端配列はＭＥＴ＊ＴＨＲ＊ＰＲＯ（細 菌的生産のためにＭＥＴが付加されている）で開始し、ｍｐＧ−Ｃ３Ｆミユーテ インを都合良く得るためにはこのＮ−末端スレオニンを欠失させることが望まし いであろう。

別法として、天然ＩＬ−３配列は、成熟ポリペプチドのＮ−末端最初の２個のア ミノ酸が欠失され、ＭＥＴ＊ＴＨＲ＊ＧＬＮ＊ＴＨＲ＊で始まる末端を残したく “ｍ３”ミューティン）のようなさらなる修飾を受けることがある。′ｍ３“ミ ューティンのためにそのようなＮ−末端修飾があると、天然ヒトＩＬ−３分子の 位置３のメチオニンを開始メチオニンとして利用するという有利な点もある。

本発明のＣＡＶｓによれば、スルフヒドリル反応性化合物（以下に述べる）で実 質的、特異的に、そして−貫して、選択された位置が修飾された均質な生物活性 のあるＩＬ−３，Ｇ−Ｃ３ＦおよびＥＰＯ組成物を産生ずることが可能になる。

本発明を実施するに当って、スルフヒドリル反応性化合物による修飾が必要なＩ Ｌ−３，Ｇ−Ｃ３ＦまたはＥＰＯポリペプチドの一部に少なくとも一つのシステ ィン残基が導入される。一つまたは複数のシスティン残基は従って、以下に述べ るような遺伝子工学的方法で導入される。新しいシスティン残基は、例えばＤＮ Ａ分子中の望む部位にシスティンのコドンを単純に挿入することによって、ある いは、望む部位に位置するアスパラギンまたはその他のアミノ酸コドンをシステ ィンのコドンに転換することによってポリペプチド中に導入し得る。所望のＣＡ ＶをコードするＤＮＡ分子を産生するための、部位特異的変異導入またはＤＮＡ 合成の便利な方法、そのように産生されるＤ−Ｎ　Ａ分子の原核あるいは真核宿 主細胞内での発現及び、そのような発現によって産生されたＣＡＶもまた。開示 されている。

本発明のＣＡＶは、天然または、既知のタンパク質の役にたつ生物活性を保持し ており、従って、非修飾原体と同様の応用に用いることができる。しかしながら 、このようなスルフヒドリル反応性化合物による修飾は好ましい、そのような生 物学的に活性のある、修飾されたＣＡＶは、原体ポリペプチドと比較して、優れ た薬理作用特性、免疫原性特性、及び／または、溶解特性を与えると考えられて いる均質な組成物として産生できる。さらに、ＣＡＶは、優れた特性を持ってい るが、通常−量体のポリペプチドから成る多量体型への生成を可能にすることが できる。多量体ＣＡＶｓは、また、゛ヘテロ複合体”−一すなわち、付加したシ スティン部位のスルフヒドリル基を通じてふたつまたはそれ以上の異なったポリ ペプチドの連結物、例えばＩＬ−３がＥＰＯに連結したり、ＩＬ−３がＧ−Ｃ３ Ｆに連結したものを構築することができる。

スルフヒドリル反応性化合物による修飾前と後のＣＡＶｓの生物活性は従来の原 体ポリペプチドの活性測定である標準１旦　ｖｉｔｒｏまたは１旦　ｖｉｖ。

分析で決定できる。別法としてここで、ｃｙｓ修飾及びスルフヒドリル反応性化 合物の付加が成功したがどうかが試験できる“小スゲール”のスクリーニング法 を提供する。

スルフヒドリル反応性化合物によるＣＡＶｓの選択的かつ均質な修飾は可能であ る。何故ならば、そのような化合物が、ＣＡＶ中のシスティン残基のみに第一に 共有結合するためである。スルフヒドリル反応基の選択に依存してＨｉｓ、Ｌｙ ｓおよびＴｙｒ残基への第二次的反応も観察され得るが、その割合は顕著に低い 、そのようにして産生された修飾されたＣＡＶｓは、それから回収され、必要で あれば、さらに精製され慣用の方法で医薬組成物に製剤される。

スルフヒドリル反応性化合物は、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリエチ レングリコールおよびポリプロピレングリコール；更に、例えば、チオール、ト リフレイト、トリフレイト、アジリジン、またはオキシレンまたは好ましくはＳ −ピリジルまたは、マレイミド部分のある、カップリングあるいは活性化部分に よる誘導体化またはカップリング剤により又はよらないそれら（ポリアルキレン グリコール）の誘導体を含む、Ｓ−ピリジルモノメトキシＰＥＧ及びマレイミド モノメトキシＰＥＧのような化き物が典型的である。さらにスルフヒドリル反応 性化合物は、それらに限定されないが、荷電しているが又は中性の、次のような タイプの重合体を包含する。すなわち、デキストラン、コロミニン酸、またはそ の他の炭水化物ベースの重合体、アミノ酸の重合体及び、しばしば抗体をペース とする分析に用いられるビオチンという周知の親和性試薬で修飾されたタンパク 質を生じるビオチン誘導体。

簡単に述べると本性は適切な条件下で、好才しくは非変性条件下で、スルフヒド リル反応性化合物が、ＣＡＶのポリペプチド主鎖中に存在する導入されたシステ ィン残基に共有結合し得るだけの十分な量を用いて、ＣＡＶとスルフヒドリル反 応性化合物を反応させることから成る０本反応は、還元性または非還元性である ；そして一般にスルフヒドリル反応性化合物の量は少なくとも誘導されるシステ ィンの数と等モルでなければならないが、反応速度促進のため、及び、全ての反 応部位の一貫した修飾のための両方の理由で、過剰のスルフヒドリル反応性化合 物の使用が好ましい、生産された修飾されたＣＡＶは、それから回収され、精製 され、そして従来法で製剤される０例えばＷＯ３７１０００５６及びそこで引用 されている参考文献参照。

本発明はその他の側面は、治療法及び、本発明の修飾されたＣＡＶｓを単独で、 または、その他のリンホカイン、ヘマトボエチン、および／または、顆粒球マク ロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）　、マクロファージコロニー刺激 因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ）、ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６及び 、ＩＬ−１０と共に用いた治療構成を含む、これらの方法及び構成は、これら修 飾されたＣＡＶｓの、治療に当たっての改良された薬理作用特性、例えば、少量 のポリペプチドを、少ない投与回数で、用いればよく、免疫原性が低く、より望 ましい分布をする、といった天然のポリペプチドに対して治療における指示薬と して要求される特性を持つことを利点とする。

本発明のその他の側面および利点はそれらの実行における実例を伴う以下に示す 詳細な説明を考慮する事で明白となるであろう。

区厘Ω皿巣皇説朋 図１はＥ、ｃｏｌｉ発現用ヒトＩＬ−３遺伝子構築物で、天然（野生型）ヒトＩ Ｌ−３のポリペプチド配列をもち、さらにＥ、ｃｏｌｉでの発現用に開始メチオ ニンをもち、ここで議論されるミューティンにおけるようにＮ一端から番号を振 られたアミノ酸となるものである。

図２はＥ、ｃｏｌｉ発現用ζトＧ−Ｃ８Ｆ遺伝子構築物で、天然（野生型）ヒト Ｇ−ＣＳＦのポリペプチド配列をもち、さらにＥ、ｃｏｌｉでの発現用に開始メ チオニンをもち、ここで議論されるミューティンにおけるようにＮ一端から番号 を振られたアミノ酸となるものである。

天然（野生型）ヒトＥＰＯのポリペプチド配列をもち、さらにＥ、ｃｏｌｉでの 発現用に開始メチオニンをもち、ここで議論されるミューティンにおけるように Ｎ一端から番号を振られたアミノ酸となるものである。

見呵例詳農な説明 本発明は、薬理作用特性促進のため、そして臨床における使用のための均質な構 成物の提供のため、薬物用ＩＬ−３，Ｇ−ＣＳＦおよびＥＰＯの選択的修飾を包 含している。ＩＬ−３に関しては本発明における出発点として、ヒトＩＬ−３、 ＤＮＡ及びペプチド配列が好まれるが、例えばヒトとテナガザル類のタンパク質 とＤＮＡの間のように顕著なホモロジーを与える場合は、どんな霊長類のＩＬ− ３も本発明の方法での使用が許される。Ｌｅａｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｌｏｏｄ （１９８２）ヱ旦：１３４３−１３４８讐照、１！択的に修飾されたＩＬ−３， Ｇ−Ｃ３Ｆ及びＥＰＯの為の方法はポリペプチド配列中のスルフヒドリル反応性 化合物の付加部位の選択的配置を含む、このステップは、システィン残基を選択 部位に挿入する事または、選択された内部残基をシスティン残基に転換する事に よって、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることで達成できる１例えば、 リジンをコードするコドンＡＡＡまたはＡＡＧはシスティンをコードするコドン ＴＧＣまたはＴＧＴに変化させることができる。

本発明に合致したＣＡＶｓはまたタンパク質配列中の対立遺伝子変異を含む、す なわち、個体間における天然のばらつきによる、または、他のアミノ酸との置換 または欠失による配列変異で、原体の望ましい生物活性をいまだ保っているもの を含む。

本発明の全てのＣＡＶｓは、宿主細胞内でのぞまれる変異をコードした組み替え ＤＮＡ配列を発現することによって調整可能であり、たとえば旦、ｃｏｌｉのよ うな原核宿主細胞あるいは酵母のような真核宿主細胞または哺乳類宿主細胞を、 たとえば、ベクターのような従来技術の方法と物質を用いることができる。ＣＡ ＭをコードしたＤＮＡを含みこれを発現可能な宿主細胞は従って、本発明によっ て包含されている。変異体をコードするＤＮＡ配列は、合成することによってま たは、タンパク質またはポリペプチドまたはそれらのアナログをコードするＤＮ ドｐＡＬ−ｈＩＬ３−７８１に挿入された、そして、ＧＯ５８６のためにデザイ ンされた旦、ｃｏｌｉ　Ｋ１２株内で発現された、ヒトＩＬ−３遺伝子構築物を 示している。プラスミドを含むこの株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クション、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２　ＵＳＡ　ｏｎ　Ａｐｒｉｌ　１９，１９８９に 寄託され寄託番号６７９３２を与えられている。天然の霊長類ＩＬ−３のそのほ かのＤＮＡ配列は、クローン化され、ｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列及び、同一 物に対する特異的ペプチド配列は、ＰＣＴ出願Ｎｏ、ＵＳ８７１０１７０２．Ｗ ｏ　８８１００５９８　ｏｎ　Ｊａｎｕａｒｙ　２８，１９８８として公開され ており、従って先行技術として知られている。これらのＤＮＡ配列はアメリカン ・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ６７１５４ ゜６７３２６．６７３１９及びその置換６８０４２．および４０２４６を与えら れている。天然Ｇ−Ｃ３Ｆ及びＥＰＯに対するＤＮＡ配列はクローン化され、配 列およびその対応するペプチド配列は公開され、従って先行技術として知られて いる。

天然ヒトＩＬ−３ｓ、Ｇ−Ｃ８ＦｓおよびＥＰＯｓをコードするＤＮＡ分子は従 って、（ｉ）公開された方法に従ってクローニングすることによって、（ｉｉ） 寄託済の１ラスミドから、または（ｉｉｉ　）例えば望ましいコード領域を貫く 公開済み配列に基づく、重複する合成オリゴヌクレオチドを用いた合成によって 、得られる。そのような方法は先行技術に知られている。前述のＷＯ３８１００ ５９８として公開されたＰＣＴ出願およびＷＯ３８１０６１６１として公開され たＰＣＴ出願番号ＵＳ８８１００４０２１９照。

上述したように、本発明の独立したＣＡＶｓをコードするＤＮＡ配列は、合成に より、または、原体ポリペプチドあるいはそのアナログをコードするＤＮＡ配列 に対する慣用の部位特異的変異導入法によって、生産できる。そのような変異導 入法は、Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ 互、（１９８２）上０：６４８７−６５００；Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ 。

（１９８３）１旦旦：４６８−５００；のＭ１３系、および−重鎖ＤＮＡを用い た旦ＮΔ（１９８４＞３：４７９−４８８．およびヘテロ重複したＤＮＡを用い たＭｏｒｉｎａｇａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ　ｔｅｃｈｎｏｌｏ　（Ｊｕｌｙ１ ９８４）６３６−６３９の方法を含む、そのような方法に従って用いられる典型 的オリゴヌクレオチドが以下に述べられている０本発明の各々のＣＡＶｓをコー ドするＤＮＡは、適切に選択されたオリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異 導入法による当業者によって類似の方法で生産され得るということは、もちろん 、理解されていなければならない。

本発明のＣＡＶｓをコードする新しいＤＮＡ配列は、原核または真核の望ましい 宿主細胞における異程発現用の適当なベクター中に導入可能である。一時的にト ランスフェクトされた、または安定にトランスフオームされた宿主細胞（または その子孫）によって産生される活性は、原体タンパク質に用いられる慣用の標準 測定法を用いて測定可能である。宿主細胞が細菌の場合、ＤＮＡにはイントロン が存在してはならない、例えばｃＤＮＡまたはき成りＮＡとなる。そして、如何 なる分泌リーダー配列も含まないこともできる。真核細胞内での発現においては イントロンは存在し、またはしないことがあり、分泌リーダー配列は存在するこ とが強くのぞまれる。

遺伝子工学的に作製された宿主細胞における発現により産生されたＣＡＶｓは、 それから精製され、必要であれば、慣用の方法、しばしば、原体タンパク質を精 製しそして／または製剤するために典型的に用いられる方法によって、製剤され 、薬剤組成物となる。医薬的に許容される担体との混合状態にあるＣＡＶを含む そのような薬剤組成物は、ＷＯ８８１００５９８且且ＬＬユ、ａｔ　ｐａｇｅ３ に発表されたような、原体タンパク質と類似した有用性を持つと考えられている 。

本発明のその他の望ましい側面では、上述した組み替え手法によって産生された ＣＡＶｓは、ＣＡＶのペプチド主鎖内にある導入されたシスティン残基のスルフ ヒドリル基に対してスルフヒドリル反応性部分が付加することの可能な条件下で 、望まれるスルフヒドリル反応性化合物と反応する。このような修飾されたＣＡ ＶＳは、最初率さいスゲールで産生されることが望まれるが、それから望まれる ひとつまたは複数の部位に付加したスルフヒドリル反応性化合物を持つ生物活性 のあるミューティンをめてスクリーニングされる。別法として、このスクリーニ ングはスルフヒドリル反応性化合物付加前に行うこともできる。

”スルフヒドリル反応性基”という用語は、システィン残基のスルフヒドリル基 （−ＳＨ）と共有結合が形成可能な反応基を持つか、または、持つように活性化 され得る基を持つ全ての化合物と定義される。ＰＥＧおよびポリプロピレングリ コール（ＰＰＧ）　、デキストラン、コロミニン酸、またはそのほかの含有炭素 基盤の重合体及び、アミノ酸とビオチン誘導体の重合体の様な重合体はこのよう な化合物に含まれる。活性化は、スルフヒドリル基、チオール、トリフレイト、 トリフレイト、アジリジンまたはオキシジン、または望ましくは、Ｓ−ピリジル またはマレイミドのようなスルフヒドリル部分によって化合物を修飾することに よってできる。スルフヒドリル反応性化合物はいかなる特別な分子量である必要 もないが約１，０００から３０．０００の間の分子量が、化合物の活性化のため には、とりわけ、ＰＥＧの場合、望まれる。付加の方法は以下に詳細に述べられ る。ＣＡＶ配列中のシスティンの数と位置を制御する事で、付加したスルフヒド リル反応性化合物の数と位置は選択的に制御可能である。そのような付加位置、 および数の制御は、そのうちのほんの一部のみ活性があるような様々な修飾され た分子の誰多な混合物の産生ではなく、のぞまれる生物学的活性を保持した選択 的に修飾された分子のみを産生することを可能にする。ＰＥＧ化またはその他の 付加の、この位置的選択性が、タンパク質の通常の機能的相互作用がスルフヒド リル反応性化合物の遊離によって保存され、遮られ、あるいは再生されることを 許容する。

本発明のその他の側面は従ってここに述べられているような修飾されたＣＡＶＳ 、例えばＰＥＧ化されたＣＡＶｓ、の均質な構成物である１本発明のニジ−３Ｃ ＡＶｓの特異的な態様は、位置１０のリジンがシスティン残基に置き代わり、ｍ ３開始配列を持ったし１−ＩＬ−３を含んでいる。（本発明のＣＡＶｓのアミノ 酸番号は、ここでは従来のやり方で、Ｎ一端から順番に、Ｅ、ｃｏｌｉ内で発現 された自然状態ヒトＩＬ−３を示す図１で用いられている番号の振り方と相関し て、行われている。）同様に、アミノ酸位置１００のヒトＩＬ−３における（図 １）天然のりジン残基は、本発明のヒトＩＬ−４３ＣＡＶを作製するためにシス ティンに転換され得る。他の態様は、システィンが位置９及び１０にありｍ３開 始配列をもっている。

本発明のＧ−Ｃ３ＦおよびＥＰＯＣＡＶｓの具体的態様は、天然の位置１７のシ スティン残基がアラニン残基に置換し天然の位置３７のアラニン残基がシスティ ン残基に置換したヒトＧ−Ｃ８Ｆ、および、位置９のセリンがシスティン残基に 置換したヒトＥＰＯを含む、Ｇ−Ｃ３ＦのＡｌａ−１７の修飾は、起こりうる誤 ったジスルフィド架橋形成を防ぐために行われる。

ＣＡＶ−コードＤＮＡから分泌リーダー配列が除去された細菌的発現（ことって は、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ　（ＩＬ−３およびＥＰＯの場合）またはＭｅｔ− Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　（Ｇ−Ｃ３Ｆの場合）といったＮ−末端の代わりに、Ｍｅｔ− Ｐｒｏ−−−（ｍｐミューティン）を含むＮ−末端をコードするように、配列を さらに修飾することが望ましい場合もある。そのようなＮ−末端修飾はＮ−末端 メチオニンのさらに一貫した除去を許容する０代わりに、天然ヒトＩＬ−３の最 初のふたつの残基が除去可能となり、そうすると天然の位置３にあるメチオニン 力（翻訳開始点となる（ｍ３ミユーテイン）。

本発明のＣＡＶｓは、上述したように修飾されるが、その他の修飾を含むＣＡＶ ｓも同様に包含しており、ペプチド配列の切断、システィン以外のアミノ酸によ る欠失または新たなアミノ酸の置換、新たなＮ−グリコシレージョン結合部位は ＥＰＯをコードするＤＮＡ分子に厳しい条件下でｔｚ４ブリダイズする事力τ可 能な（あるいは、同意のコドンの使用がなければ可能となる）ＤＮＡ分子（こよ ってコードされており、コードされたポリペプチドが、原体ペプチド配列と比較 して１つ又はそれ以上の導入されたさらなるシスティン残基を含む限りそのよう なＣＡＶｓを含む、典型的な厳しい条件は、Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｅｔ　ａｌ 、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎ　Ａ　Ｌａｂａｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ）。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）。

ｐａｇｅｓ　３８７−３８９で見いだすことができる。そのような厳し−ハイブ リダイゼイション条件の例は、４ＸＳＳＣ６５℃で、その後、ｏ、１ｘｓｓｃ６ ５℃で１時間洗浄する０代わりの典型的な厳い）ノ蔦イブリダイゼイション条件 は、５０％ホルムアミド、４２℃で４ＸＳＳＣである。

本発明の方法と構成物は、均質に修飾されたＩＬ−３ｓ、Ｇ−Ｃ３ＦｓおよびＥ ＰＯｓを提供するため、医薬的に許容される担体との混合物状の、上述した修飾 されたＣＡＶの治療上有効な量を含む医薬用のそのような均質な構成物をも、本 発明は包含する。そのような構成物は自然状態または組み替えポリペプチドの為 の記述と同様の方法で用いることが一般に可能である。構成物は、例えば造血機 能刺激への関与または、患者の血液学的特性の増進といった、様々な状態を扱う のに用いられると考えられている０例えば、本発明の修飾されたＩＬ−３は、ガ ンの化学療法、放射線療法の補助として、または、免疫異常の治療において、Ｗ Ｏ３８１００５９８，第１７−１９頁で議論されているように、用いることが可 能である。投与の正確な量と方法は、製品の作用を修正する様々な因子、例えば 体重、性別、減量、投与の時期、薬品の組み合わせ、反応感度及び状況の特別な 厳しさに依存すると同様に、使用した特別に修飾されたＣＡＶ、効能、および、 特別な化合物の薬理作用特性に依存して、担当の内科医によって決定される。一 般に毎日の処方計画は、自然状態または組み替え非修飾タンパク質の場合の一回 分の投薬量の範囲、例えば、体重１キログラムあたり、ポリペプチド約０．１か ら約１００μｇ、望ましくは体重１キログラム当たりポリペプチド約０．１から 約３０μｇの範囲、にあるべきである。

本発明の治療法及び構成物はその他の薬物または別のヒトの因子と共に投与する 事もできる１本発明のＣＡＶｓと共に同時にまたは連続的に、投与するための、 その他の適当なヘマトボエチン、Ｃ３Ｆｓ　（コロニー刺激因子）およびインタ ーロイキンの非除外リストは、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、Ｃ３Ｆ−１（既知の様々な形態上 のもの、Ｃ３Ｆ−１は、Ｍ−Ｃ３Ｆまたは、マクロファージコロニー刺激因子と も呼ばれている）、Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−６ ゜ＩＬ−１０，８細胞成長因子、Ｂ細胞分化誘導因子および好酸球分化誘導因子 を含む、さらに本発明のＣＡ　Ｖ−ｓは、治療用としてモノクローナルまたはポ リクローナル抗体とともに投与され得るか、または、これらに化学的に付加でき る０代わりにこれらの成長因子は、治療上の投薬計画での使用において例えばり シンのような適当な毒素に付加し得る。上に列挙した一回の投薬量は、治療構成 または投薬計画においてそのような付加的な構成要素を相殺するために補正され ることもある０例えば修飾されたリンホカインＣＡＶｓを含む薬剤組成物の場合 、治療している患者の進行状態は、例えば白血球細胞総数といった血液学的特性 、ヘマトクリット、及び、その類似物の定期的評価によって監視できる。

以下に示す実施例はＣＡＶｓ及び、本発明の方法及び構成を実例と共に記述して いる。

大贋杜社一方法！ブ長去施億 火徳億」−：　こ号７　のｔ・め　２　゛本発明のＣＡＶをコードするＤＮＡ塩 基配列が挿入された（必要又は必要に応じて合成リンカ−が付いている、或いは 付いていない）、真核細胞での発現ベクターは、本研究では良く知られた技術を 用いてき成され得る。ベクターの構成要素であるバクテリアのレプリコン、選択 遺伝子、エンハンサ−、プロモーター並びに同類の要素は、天然に存在するもの 或いは既知の手順によりき成して得られた。Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ 、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、（１９８２）１旦９　：　６０１−６２１　；Ｋａｕｆ ｍａｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（１９８５）８２　６８９−６９３を参照、１９８７年１月２日提出の ＷＯ３７１０４１８７（ｐＭＴ２及びＰＭＴ２−ＡＤＡ）並びに１９８７年８月 ２１日提出の米国特許出願Ｎｏ、８８，１８８　（ＰｘＭＴ２）も参照せよ、１ １乳動物細胞での発現に有効な典型的なベクターは、実施例４で引用され、参考 文献によりここに編入されている特許出願中でも開示されている０本発明の変異 型の作成に有効な真核細胞での発現ベクターは、これまでの研究で既知の誘導可 能プロモーターを含むか、誘導可能発現系から構成されていても良い、米国特許 出願Ｎｏ、８９３，１１５　（１９８６年８月１日提出）及び１９８８年２月１ １日にＷＯ３８１００９７５として公表されたＰＣＴ／ＵＳ８７１０１８７１を 参照せよ。

形質転換したものを含め、確立した細胞株は宿主として適している０通常の二倍 体細胞や一次組織の１旦　ｖｉｔｒｏ培養から導かれた細胞株と同様に、−次外 植片（造血幹細胞のような比較的未分化の細胞も含む）も適している０選択遺伝 子が優性に作用する限りに於いては、候補となる細胞は、選択遺伝子を遺伝的に 欠損している必要はない。

真植生物の宿主細胞を用いる場合、確立された哺乳動物の細胞株が望ましいであ ろう、染色体ＤＮＡへのベクターＤＮＡの適切な挿入及びその後、挿入されたベ クターＤＮＡの増幅を共に定法によって行うためには、現時的でこのような具体 例ではＣＨＯ（チャイニーズハムスターオバリー）細胞が望ましい、或いは、ベ クターＤＮＡがウシパピローマウィルスゲノム（Ｌｕｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ　ｌ　１　（１９８４）３６　：　３９１−４０１）のすべて又は一部を含 み、適当なエビソーム性因子としてＣ１２７マウス細胞のような細胞株に運ばれ ても良い。

他に使用可能な哺乳動物の細胞株としては、ＨｅＬａ、Ｃ０８−１サル細胞、Ｂ ｏｗｅｓ細胞のようなメラノーマ細胞株、マウスＬ−９２９細胞、５ｗ１ｓｓＨ 胞由来の３Ｔ３細胞、Ｂａ１ｂ−ｃ又はＮＩＨマウス細胞、ＢＨＫ又はＨａＫハ ムスター細胞株並びに同類のものが含まれる。

適切な形質転換体は、標準的な免疫学的又は活性測定アッセイにより、ＣＡＶ産 物の発現をスクリーニングされる。ＣＡＶポリペプチドをコードするＤＮＡの存 在は、サザンブロッティングのような標準的な方法で検出できる。ＣＯ３−１サ ル細胞のような適当な宿主細胞に発現ベクターＤＮＡを導入してから数日間は、 一時的なＣＡＶ遺伝子の発現が、非選択的に培地中のタンパク質の活性又は免疫 学的アッセイにより測定される。

定法によるＤＮＡの発現に引き続き、作られたＣＡＶは回収、精製され、さらに ／或いは生理学的、生化学的及び／又は臨床学的パラメーターについて、すべて 既知の方法により、特定が行われる。

割１整：バーｌア　、こ号７ バクテリア及び酵母での発現は、目的とするＣＡＶをコードするＤＮＡ分子を（ 必要又は必要に応じて合成リンカ−を付け、又は付けない）適当なベクターに挿 入しく或いは本来のＤＮＡ塩基配列をベクターに挿入し、そこで望ましいように 塩基配列に突然変異を生じさせ）、そのような作成されたベクターで宿主細胞を 形質転換して行われ得る。ベクター及び方法は、例えば、１９８６年１月３０日 公表の、公表ＰＣＴ出願Ｎｏ、ＷＯ３６１００６３９で開示されているような既 知のものを用いることができる。形質転換体は定法により同定し、必要ならばサ ブクローニングを行う、形質転換体とそのようにして作られた組換え産物の特定 、並びに産物の回収、精製はすべて実施例１で記述されているように行われ得る 。

バクテリアに於ける発現では、ＣＡＶをコードするＤＮＡ塩基配列は、定法を用 いて、完成ポリペプチドのみをコードするよう修飾するのが好ましく、またオプ ションとしてバクテリアで良く用いられるコドンを含むように修飾することも可 能である。

太凰ｌに於辻る１現： 実施例５のＩＬ−３、ＣＡＶは大腸菌内で以下のようにして発現させた：１ラス ミドｐＡＬ−ｈＩＬ３−７８１を大腸菌に１２株のＧＩ５８６に形質転換した。

ＧＩ５８６はＷ３１１０株由来で、Ｃ，８５７アリルを持つバクテリオファージ ラムダのＣＩ及びＲａｗ領域が、バクテリアゲノム上の上ａｃＺ遺伝子のΩ１旦 エサイトに挿入されている。この挿入はファージゲノムのヌクレオチド３５７１ １と３８１０４の間のすべてのＤＮＡ塩基配列から成る。Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ、ｅ ｔａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ　（１９８２）１６２ニア２９を参照、大腸菌 に１２株ＧＩ５８６　（ＰＡＬ−ｈｌＬ３−７８１）は１９８９年４月１９日Ａ ＴＣＣに保存され、アクセスナンバー６７９３２が与えられた。

ｐＡＬ−ｈＩＬ３−７８１で形質転換されたＧＩ５８６を摂氏３０度で高細胞濃 度に増やし、摂氏４０度に加温すると、ＩＬ−３が急速に生産され、２．３時間 で全細胞タンパク質の１０パーセント以上に達するほど蓄積される。このタンパ ク質は不溶性の型で生産され、これは定法により可溶化し、リフオールドされね ばならない、Ｔ、Ｅ、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏ　、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｍ。

Ｉｅｃ、Ｂｉｏｌ、（１９７８）旦３：２３１−２９７を参照せよ０発現に引き 続き、そのようにして生産されたＣＡＶは以下のように回収され、精製され、特 定される。

実施（３’１５のＧ−ＣＳＦ　ＣＡＶ及び実施例６のＥＰＯＣＡＶｉｉ、ｐＡＬ −ｈＩＬ３−７８１からＣＡＶ　Ｉ’Ｌ−３をコードするＤＮＡ塩基配列を除去 し、この実施例で上述されているように適切なＧ−ＣＳ　Ｆ又はＥＰＯのＤＮＡ 塩基配列を挿入して、大腸菌内で同様に発現された。形質転換は上述のものと同 じ条件下で行われた。

１、ＣＡＶＩＬ−３の すべてのＭ衝液はガラス蒸留した水を用いて調製した。それらはすべてＤＴＴを 添加する前に、家庭用バキューム／ソニフイケーションを用いて少なくとも５分 間脱気した。

初めに、湿重量４００グラムの凍結した大腸菌の細胞ペーストを、２５００ｍｌ の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ｐ− アミノベンザミジン、１ｍＭ　ＰＭＳＦ及び２ｍＭ　ＤＴＴを含む緩衝液（本実 施例では以降ＭＷＩ液Ａ”）に懸濁し、最終体積２８５０ｍｌを得た。ガラス棒 とマグネティックスターターを用いて細胞ペーストを懸濁した０次に細胞懸濁を ９０００ｐｓ　ｉでｍａｔｉｒｉ　ｇａｕｌｉｎバルブで４回、毎回間に冷却し ながら通過させ、溶菌した。溶融液を氷水で冷却したガラス容器に集め、摂氏３ ０度以下に維持した。タンパク質濃度は２２６／ｍｌ　；終体積は２８５０ｍｌ であった。

溶融液をＧ５−３０−ターを付けた５ｏｒｖａｌ遠心分離機で８０００ｒｐｍ３ ０分間遠心分離を行った。上澄（１７，ｏｍｇ／輪１，２６００ｍ１）は捨て、 この遠心分離で生じたベレット（本実施例中では以降ＰＬ）をガラス棒及びマグ ネテイックスターターを用いて約４００ｍｌの緩衝液Ａに再懸濁した。白濁した 懸濁液を、６０ｓ＋ｌシリンジを用いて１８ゲージの注射針を通過させた。終体 積は６４０＋ｌ、タンパク質濃度は２５．６＋ｇ／輸１であった。

次に再懸濁したＰ１ベレットをＧ５−３０−ターを付けた５ｏｒｖａｌ遠心分離 機で８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。この遠心分離で生じた上澄を２本 の新たな遠心管に注ぎ（本実施例では以降゛Ｓ２”）、生じたベレットじＰ２” ）はｖ１衝液Ａに再懸濁し、終体積１６５ｓｉ１、タンパク質濃度５０輪ｇ／ｍ 　ｌとなった。

Ｓ２上澄を１０分間遠心分離し、生じたベレット（Ｐ３”）を６５輪１の緩衝液 Ａに再懸濁した。生じた上澄（“’３３”）はさらに１０分間遠心分離し、そこ で生じたＰ４ベレットは終体積５０１１のＭＷＩ液Ａに再懸濁され、タンパク質 濃度１１　、３ｍｇ／ｓ＋ｌとなった。Ｐ４ベレットはほとんどＩＬ−３を含ま なかったため、以後のステップでそれは用いなかった。最後の遠心分離の８４上 澄約６００ｍｌは、濃度的ＩＱ＋＊ｇ／ｍｌの膜性の成分を含んでいた。

Ｐ２及びＰ３ベレットをプールし、９００Ｏｒｐｍ　（ＧＳＡローター）１０分 間遠心分離し、２つのベレット（“Ｐ２−２”）及びＨＰＬＣを用いた分析でＩ Ｌ−３を含まず、捨てられた濁った上澄を生じた。Ｐ２−２ベレツトは以降の使 用のため摂氏−２０度に凍結した。

凍結したＰ２−２ベレツトをガラス棒及びマグネティックスターラーを用いて終 体積１００ｍ１のＩＩ衝液Ａ（２ｍＭ　ＤＴＴでなく１０ｍＭ　ＤＴＴを含む） に再懸濁し、１８ゲージの注射針を通過させた。再懸濁したＰ２−２に１０ｍＭ ＤＴＴＩ！衝液Ａで新たに調製した４　００ｍｌの７Ｍグアニジンを加え、一度 素早く転倒させ、可溶化したＰ２−２ベレツトを素早＜３Ｘ２５０遠心管に移し 、８０００ｒｐｍ　（ＧＳＡローター）で１５分間遠心分離を行った。濃度５． ９８ｍｇ／ｍｌの５００ｍｌの上澄を、ＲＰ　ＨＰ　Ｌ　Ｃを用い、室温でさら に精製した。前の２つのステップは１７分から２２分の間に完了した。

この精製の１０トコールは前述の、大腸菌内で発現させたＧ−Ｃ３Ｆ及びＥＰＯ ＣＡＶの精製にも、同様な結果で適用し得る。

２、ＩＬ−ＣＡＶのＲＰ−ＨＰＬＣの この分離プロトコールで用いられたＭ衝液は０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液及 び０．１％ＴＦＡア七トニトリル溶液である。

２インチＶｙｄａｃ　Ｃ４カラムを１０％アセトニトリルで平衡化した。約４７ ０ｍｌの７Ｍグアニジン可溶化の上澄を１８０ｍ１毎分で素早＜Ｃ４カラムにア ゲライした。カラムを２０請１毎分で展開し、２８０ｎｍの吸光がベースライン に戻るまで１０％アセトニトリルで洗浄した。下記濃度のアセＩ−ニトリルで下 記時間に洗浄することにより、以下のような勾配を設定した。

６７．５　１０ 勾配に入って３５分後より、４０輸ｌのフラクションを回収した。各フラクショ ンから１０μｍのサンプルを取り、真空乾燥し、２０μｌの２ＸＳＤＳ−サンプ ルＬａｅｍｍｌｉ［衝液に溶解した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、ＩＬ−３の 存在を確認した。全フラクションを摂氏−８０度に凍結させた。

Ｇ−ＣＳＦ及びＥＰＯＣＡｖのＲＰ−ＨＰＬＣ分離も同様に行われ得る。

３、ＩＬ−３ＣＡＶの１）　−ルー　ン約７５ｍｇ（７，５１１１）（７）ＩＬ −３を含むＲＰ−ｉ（ＰＬＣ分離もフラクションの一つに５０ｍＭ　ＮａＰＯ， ｐＨ７，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ及ｕ０．２ｍＭＤＴＴ中７７）６．４Ｍグアニジ ン１４２．５ｍｌを加え、約０．５ｍｇ／＋ｍｌに希釈した。

混合液に７５０＋ｓｌの５０ｍＭ　ＮａＰＯ＜　’ｐＨ７，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、 ０．２ｍＭ　ＤＴＴＩＩ衝液を加え、透析チューブに移し、４１の同緩衝液に対 し、２時間透析を行った。ＩＬ−３（現時点では約０．２２Ｍグアニジン）をさ らに８１の０．１ｍＭ　ＤＴＴを含む同ｗｔＩＩ液に対し、２回透析を行った。

この精製ＩＬ−３のポリエチレングリコール化は下の実施例７及び８で述べられ る。

Ｇ−Ｃ３Ｆ及びＥＰＯＣＡＶのリフォールディングも同様な方法で行われ得る。

４、註工指括作Ω皿認 ＩＬ−３ＣＡＶ又はＥＰＯＣＡＶの対生物活性は、ＴＦ−１細胞増殖アツセイに より確かめられる。ＴＦ−１細胞系は既に記述されている。（Ｋｉｔａｍｕｒａ 　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｌｏｏｄ　（１９８９＞７二−３：　３７５−３８０ンその アッセイでは細胞は摂氏３７度、５％ＣＯｚを含む湿潤空気中に維持され、用い た培地は５Ｈｇ／ｍｌの組換えＧＭ−Ｃ３Ｆを添加したＲＰＭＩ（Ｇｊ、ｂｃｏ ）、１０％熱処理ウシつ児血清、２ｍＭ　Ｌ−グルタミンである。３．４日毎に 細胞密度を２Ｘ１０’細胞／輪１に調節した。アッセイの寸前に細胞を５００Ｘ Ｇ、５分間遠心分離し、ｒＧＭ−Ｃ３Ｆを含まない培地で洗浄後、再遠心分離し 、密度１０’Ｍ胞／＊Ｉに再懸濁した。

検査されるＩＬ−３又はＥＰＯサンプルは１　：　５００から１　：　１０，０ ００の間でｒＧＭ−Ｃ３Ｆを含まない培地で希釈する。９６ウエルのマイクロタ イタープレートの最上列に１２５μｍの希釈したサンプルを載せる。残りのウェ ルは１００μｍのｒＧＭ−Ｃ３Ｆを含まない培地で満たし、最上列のサンプルは マイクロタイタープレートの下段に向かって、連続して５倍ずつ希釈される。各 ウェルに１００μｍの希釈した細胞（１０４細胞）を加え、プレートを摂氏３７ 度、５％ＣＯｚで４８−７２時間インキュベートする。その後、ウェル当り０． ５μＣＬの３Ｈ−チミジンを加え、プレートをさらに４−６時間インキュベート する。

そこで細胞を自動細胞回収機（ＬＫＢ１２９５−００１）を用いて回収し、’Ｈ −チミジンの取り込みを定量する。

ＩＬ−３に対しては、１９８８年１月２８日公表の国際公表Ｎｏ、ＷＯ３８１０ ０５９８のＰＣＴ／ＵＳ８７１０１７０２４で記述されているＣＭＬ増殖アッセ イも用いることができる。

Ｇ−Ｃ３Ｆ　ＣＡＶの対生物活性は、Ｈａｐｅｌ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｌｏｏｄ（ １９８４）６４　：　７８６−７９０で記述されているように３２Ｄマウス細胞 系を用い、ＡＴＣＣＴＩＢ６８のＷＥＨＩ−３細胞を５ｎｇ／ｍ１組換えＧＭ− Ｃ３Ｆの代わりに２ｍＭ　Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中 で４８時時間養した（　Ｉ　Ｘ　１０　’細胞／ｍｌ　）　培地ｈ’う得り、Ｗ ＥＨＩ−３ならし培地を５％ｖ　／　ｖ加えて、ＴＦ−１細胞増殖アツセイプロ トコールで行うことによっても確認され得る。洗浄及びアッセイのステップはＷ ＥＨＩ−３ならし培地を除いて行われる。

大施広まニア、　′　−プロトコール 部位特異的突然変異生成は、既知の定法を用いて行われ得る１例えば、国際出願 Ｎｏ、ＷＯ３７１０７１４４及びＷＯ３７／’０４７２２並びに米国特許出願シ リアルＮｏ、０９９，９３８　（１９８７年９月２３日提出）及び０８８．１８ ８（１９８７年８月′り１日提出）並びにそれらに引用されている嘗考文献を参 照せよ。

大施ｔ５　：６・８５、′生　応 以下のヒトＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ及びＥＰＯミューティンは定法の部位特異的突 然変異生成法を用いてシスティンコドンを示すように置換、又はシスティンコド ンの挿入により作成された： 一一−−−−−−−−−−−−−−工五二旦−一まｄ■−嗟亘山二　−一５Ｓ ｓｐｃｙｓｌｏ　ｍ３ｃｙｓ１．ｏ　八＾＾をＴｃｃに（ＬｙｓをＣｙｓに）＊ ｐＣｙｓ６　ｄＣｙｓ６　ＡＣＴをＴＧＣに（ＴｈｒをＣｙｓに）ｍ３ｃｙｓ１ 　曽３Ｃｙｓ８　ＴＣＴ　ｔＴＣＣ４；：　（ＳｅｒをＣｙｓ４．：）ｍ３ｃｙ ｓ１２　ｍ３ｃｙｓ１２　ＴＣＴをＴＧＣ４Ｃ（ＳｅｒをＣｙｓＧ；：）ｅｘｇ ｃｙｓｌｏｏ　ｍ３ｃｙｓｌｏｏ　＾＾ＧをＴＧＴに＜ＬｙｓをＣｙｓに）ｍ３ ｃｙｓ１３４　＋１３ＣＦ！１１３４　ＴＴＣとＴＡ（、の間にＴＧＴを挿入（ Ｐｈｅ１３３とストップコドンの間にＣｙｓ） 鎗ｐＣｙｓ３　＾Ｔｃ？：ＴＧＣに（Ｎｅｔをｃｙｓにン−ｐΔＩＣｙｓ１９　 アミノ酸１−１５で”ｍｐ”末端で置換し、１９番目を＾ＴＧからＴにＣ（Ｍｅ Ｌｊ？＞Ｃｙｓ）に修飾５３ｃｙｓ６，１０　ＡＣＴ及びＡＡＡをＴＧＣに（Ｔ Ｉ＋　ｒ及びＬｙｓをＣｙｓに）ｍ３ｃｙｓ９，１０　ＴＴ＾及び＾＾八をＴＧ Ｃに（Ｌｅｕ及びＬｙｓをｃｙｓに）ｍ３ｃｙｓ６，８　ＡＣＴ及びＴＣＴをＴ ＧＣニ（Ｔｂｒ及びＳｅｒをＣｙｓニ）ｍ３ｃｙｓ６，８，１０　ＡＣＴ、ＴＣ Ｔ及びＡＡＡを丁ＣＣに（丁ｈｒ、　Ｓｅｒ及びＬｙｓをＣｙｓに） ｍ３ｃｙｓ８，９．！ＯＴＣＴ、ＴＴ＾及び＾＾＾をＴＧＣに（Ｓｅｒ　、　Ｌ ｅｕ及びＬｙｓを―ｐ＾Ｉ＠１７Ｃｙｓ３７　ＧＣＣをＴＧＣに（ＡｌｔをＣｙ ｓｉＣ）ｍ３ｃｙｓ１　ＴＣＴをＴＣＴ４．：　（ＳｅｒをＣｙｓｔｍ）上述の 実施例において、天然ＩＬ−３．Ｇ−Ｃ３Ｆ、ＥＰＯタンパク質の修飾部位は、 “Ｃｙｓ“のあとの番号によって示されており、ＣＡＶのアミノ酸配列はＮ末端 に関しては示された位置を除いては天然タンパク質と同じである（第１図参＠） 、“ｍｐ”および“ｍ３”という表示は、以下で詳細に述べる２種類の興なるＮ 末端の変化を示すものである。さらに、Ｃｙｓは、例えば位置６３または位置６ ６などの天然のＩＬ−３コドンの位置に、単独で、あるいは上述のＮ末端のいず れかの、例えば位置１０に導入された別のＣｙｓとの組み合せで導入することが できる。予想されるＥＰＯ変異変異タンパ上質ては、ｍｐ　Ｎ末端を持ち、位置 １６６の天然のアルギニンがシスティンに置換されているＥＰＯｍｐＣｙｓ１６ ６、ｍｐＮ末端を持ち、３箇所のＮ連結型グリコジル化部位のアスパラギンがシ スティンに置換されているｍｐＣｙｓ２４Ｃｙｓ３８Ｃｙｓ８３が含まれる。

ＩＬ−３変異タンパク質に関しては、ある種の点変異により、生物活性またはス ルフヒドリル反応性化合物に結きする能力が部分的に失われる可能性がある。

例えば、位置２８の修飾は生物活性のあるＣＡＶを産するが、スルフヒドリル反 応性化合物の結合能は失われ、これはおそらく再度折り畳まれたＣＡＶの三次構 造において位置２８が内側になるためだと思われる。ＩＬ−１βの位置１３８に おけるＣｙｓの修飾によって活性のあるＩＬ−１β−フィコエリスリン複合体が 得られると著者らが述べている、Ｄ、ウィングフィールド（Ｗｉｒ＋ｇｆｉｅｌ ｄ）ほか、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８９）１７９：　５６５−５７ １と比較のこと、さらに、我々は天然ヒトＩＬ−３の位置１５または位置５１の アミノ酸をシスティン残基に置換することにより生物活性が部分的に失われる場 合があることを見いだした。スルフヒドリル反応性化合物の結合後の活性を測定 するために、本発明はさらに、修飾と結きが成功したか否かを容易に決定するた めの「小スケール」スクリーニング法を与える（以下に述べる実施例９参照）。

ヒトＩＬ−３はさらに、”ｍ、ｐ”または’ｍ３”と表される２種類の異なる、 二者選択の構造でＮ末端が修飾された。”ｍｐ”の表示は、天然ヒトＩＬ−３タ ンパク質の最初のアラニンを欠失させるものであり、それによりＮ末端の配列が ＭＥＴ＊ＡＬＡ＊ＰＲＯからＭ　Ｅ　Ｔ　＊　Ｐ　ＲＯとなる。”ｍ３”の表示 は、ＭＥＴ＊ＡＬＡ＊ＰＲＯから始まる天然ヒトＩＬ−３タンパク質の最初の２ アミノ酸を欠失させることを示し、ＭＥＴ＊ＴＨＲＩＧＬＵ＊ＴＨＲから始まる 末端となる。

これらの修飾の理由は既に述べた。ＩＬ−３ｍｐΔＩＣｙｓ１９変異タンパク質 のＮ末端の修飾に関しては、アミノ酸１−１５が欠失し、“ｍｐ”末端と置換さ れた。ヒトＧ−Ｃ３ＦとＥＰＯ変異変異タンパ上質最初のアミノ酸が欠失される ことによりＮ末端がさらに修飾され、ｍｐ”変異タンパク質が得られた。

上述のリストの変異タンパク質は単なる例であり、独占的なものではないことは 、もちろん理解されるべきである１本発明にしたがった別の変異タンパク質の考 案および合成は、十分に本分野の既知の技術の範囲内である。このような変異タ ンパク質の合成は、通常の技術および方法によって行われ得る。

本分野の技術者は、もちろん、ＩＬニー３．Ｇ−Ｃ３Ｆ、およびＥＰＯをコード するＤＮＡ配列中で、システィンコドンの置換またはその挿入による他の変異タ ンパク質の考案および自戒を容易に行なうことができる。１箇所以上の部位を修 飾するためには、ミュータジエネジスを繰り返し行なうか、あるいはいくつかの 場合には１箇所以上の部位でのミュータジエネシスのためのオリゴヌクレオチド を用いて行なう。

寒施逍旦：ＣＡｖｓをコード−７ＤＮＡ　のへ＠ＤＮＡ配列に突然変異を起こす ことによるＣＡＶをコードするＤＮＡの生産に対して代わるものとして請求めら れるＣＡＶをコードするＤＮＡが合成により調製されるかもしれないことが理解 されるべきである。その場合、ふつう請求められるコード配列におよび、かつめ られるシスティン付加物を含むところの、例えばオーバラップした５０−８０１ 体の、オーバーラッピングオリゴヌクレオチドの形状でＣＡＶ　ＤＮＡを合成す ることが望まれるだろう。

この実施例にしたがって作製された５具体例としてのＥＰＯミューティンはＥＰ Ｑ　ｍｐＣｙｓ９である。第３図に示された化学的にき成されたｃＤＮＡは、当 業者が既知の技術を用いて会合させられ、第９番部位で修飾され、そして精製さ れる。ウォスニツクら、Ｇｅｎｅ　６０：１１５−１２７　（１９８７）参照； また、米国特許第４，９０４．５８４号明細書をり照のこと、合成ｃＤＮＡは、 制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｂａｌによって作られる突出末端に対応する「突出末 端」ヌクレオチド配列を持つように指定されている。精製された、合成由来のｃ ＤＮＡは、精製されたプラスミドｐＡＬｈＩＬ３−７８１のＮｄｅＩ−ＸｂａＩ ベクタ一部分と連結され、その結果ヒトＩＬ−３ｃＤＮＡがヒト　エリロトボエ チン　ｃＤＮＡと置換される。ＥＰＯｍｐｃｙｓ１６６およびＥＰＯｍｐＣｙｓ ２４Ｃｙｓ３８Ｃｙｓ８３は、同じ方法で作製されることができる。

求められるコード配列が与えられた場き、もし必要であれば、指定およびき成、 合音ならびに、他の適当なオリゴヌクレオチドの合成リンカ−への連結は、当業 の現在の技術レベルの範囲に完全に含まれるものである。

火、施倒ｌ：ＩＬ−３ｍ　Ｃｓｌｏミュー−インのＰＥＧミューティン　ヒトＩ Ｌ　３　ｍｐｃｙｓｌｏは、上述の実施例５にしたがって調製され、２種類のＰ ＥＧ　５０００誘導体、すなわちＳ−ピリジル・モノメトキシＰＥ０５０００　 （ＰＥＢ　５０００　５ＰＤＰ）およびマレイミド・モノメトキシＰＥＧ５００ ０（ＰＥＧ　５０００　ＳＭＣＣ）を用いてＰＥＧ化された。

ａ、）スルフィドリル反応性化象物の調製。

ＰＥＧ５０００は、以下のようにしてスルフィドリル基に連結させるために活性 化された。２．０グラムのモノメトキシＰＥＧ５０００アミンは、１２ｍｌの乾 燥した過酸化物を含まないジオキサンに溶解された。１４４餉ｇ（１５％過剰） のＮ−サクシンイミジルー３−（２ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ ）が、乾燥粉末として添加され、反応は室温で進行させられた。２４時間後、Ｓ −ビリジル・モノメトキシＰ　Ｅ　Ｑ　５０００産物は、乾燥した、過酸化物を 含まないジエチル・エーテルを用いて沈殿させられ、エーテルで洗われた。この 産物は真空下で乾燥させられて１．９２グラムの白色固体を与えたが、ＮＭＲお よびＩＲにより、これがＳ−ピリジル・モノメトキシＰＥ０５０００であると同 定された。

ＰＥＧＩｏ、０００類似体（ＰＥＧＩｏ、０００　５ＰＤＰ）も同様に、類似の 方法によって調製された５ ｂ、）ミューティンＣ１０ヒトＩＬ−３のＰＥＧ化。

このカップリングのために、陰性対照として、天然のく野生型の）ヒトｌ−３も ＰＥＧ化試薬による処理を受けた。　５０　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４、１ ００ｕ　ＭＤＴＴ、１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび３ｍＭ　塩酸グアニジンを含むＰＨ ７の緩衝溶液に、ｍｐｃｙｓｌＯミューティンを１−ｇ／端１で溶解した保存溶 液が用いられた。

ＤＴＴはタンパク質の２１体化を妨げるために添加され、ＥＤＴＡは、金属を介 した酸化的カップリングによる２１体を阻害するために添加された。グアニジン は、タンパク質の再生の人工物として残る。ＰＨ７が用いられたが、６．５−７ ．５の範囲が好ましい、上述のようにして調製された０、９ｍｇのＳ−ピリジル ・モノメトキシＰＥＧ５０００は、エツベンドルフ・チューブ内にはかりとられ た。

３６０ｕ　ｌの［１１化したミューティンが添加され、この混合物は均一になる ように軽くポルテックスにかけられた０反応は４℃で行われ、２時間後に試験採 取したときには、反応が完了していることが分かった。クマシーブルーによって 染色した１０−２０％グラジェントＳＤＳアクリルアミド・ゲルによる分析は、 この産物がほとんど純粋で、約８２ｋＤの移動度であることを示した。（比較と して、ｍｐｃｙｓｌＯおよびその２１体が標準試料として用いられ、これらはそ れぞれ１５ｋＤと３０ｋＤの位置に移動することが示された。）ゲル上の還元性 レーンは、ＰＥＧ化したＩＬ−３ミユーテインがＤＴＴによる還元に感受性であ り、約１５ｋＤの本来の状部のタンパク質を再生することを示した。

２、ヱにイｎ・モノメ　シＰＥＧ５０００　いｆ−ＰＥＧ　：　、’　−へａ、 ）スルフィドリル反応性化会物の調製。

本実験において、ＰＥＧ５０００の活性化は以下のようにして行われた。

２．０ｍｇのモノメトキシＰＥＧ５０００アミンは１２１の乾燥した、過酸化物 を含まないジオキサンに溶解さ“れな、１５４＋ｍｇのスルホサクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣ Ｃ）（１５％過剰）が乾燥粉末として添加され、反応は室温で進行させられた。

２４時間後、この産物の構築はＳ−ピリジル・モノメトキシＰＥＧ５０００と同 じ方法で行われ、１．８２グラムのマレイミド・モノメトキシＰＥＧ５０００が 得られた。ＰＥＧＩＯ，０ＯＯＷ似体は同様にして調製された。

ｂ、）ＣｙｓｌＯＩＬ−３ミユーテインのＰＥＧ化。

この反応は、還元性ＰＥＧ５０００試薬を用い、陰性対照として天然のヒトＩＬ −３を用いることにより、ＰＥＧ化反応と同様な方法で行われた。しかし、１． ０ｍｇのＰＥＧ由来のＰＥＧ化試薬であるマレイミド・モノメトキシＰＥ０５０ ００が用いられた。４００ｕ　Ｉのｍｐｃｙｓｌｏ　ＩＬ−３ミユーテインが添 加され、均一になるまでポルテックスにかけた。ｔ＝２時間において、反応が完 了したことが分かった。この産物はほぼ純粋であり、分子量においてＳ−ピリジ ル由来の複合体と区別できなかった。しかし、この産物はＤＴＴなどの還元条件 下で完全に不活性であり、この還元性レーンでは、２８ｋＤの産物が存続してい る。

いずれの対照反応においても、２時間あるいは、２４時間においてすら複合化を 示すものはみられない、したがって、この化学反応における反応可能なスルフィ ドリル基の選択性は極めて高い。

ｍ旦：　シス−インミュー−インｍ３Ｃｓ９　１０お　ｍ３ＣＳ９上仄Ｏ旦旦旦 止− この実験では、両ミューティンのタンパク質保存標品は、実施例７で述べたよう に、リン酸緩衝液の３００　ｕ　ｇ／ｌｌ１ｌ溶液であった。ＰＥＧ化保存溶液 は同様な［１１液中に、５０ｕｇ／＋＊Ｉの濃度でＳ−ピリジルまたはマレイミ ド活性化Ｐ　Ｅ　Ｇ５０００ポリマーからなるものであった０反応を開始するた めに、ポルテックスにかけなから１ｌｕｌの適当なＰＥＧ（ｌ存液が、１００ｕ ｌの適当なタンパク質保存液（ｍ３Ｃｙｓ９．１０ミユーテインあるいはｍ３Ｃ ｙｓ９．１０ミユーテイン）に添加された９反応は４℃で一夜進行させられた。

上述のように、この産物のＳＤＳゲル分析は、どちらの化学反応についてもほん のわずかな開始物質しか残っていないことを示した。さらに、どちらの化学反応 も約３７ｋＤのゲル移動度を持った新しい産物を生じた。同じゲルの還元性レー ンは、マレイミド複合体が還元に対して耐性であるが、一方Ｓ−ピリジル由来の 複合体は開始物質に転換することを示した。

叉施■２：Ｇ−ＣＳＦ　ｍ　ＡＩａ１７Ｃｓ３７ミユーーインのＰＥＧミューテ ィン・ヒトＧ−ＣＳＦ　ｍｐＡＩａ１７ｃｙｓ３７は、上述の実施例５にしタカ ッテ調製すレ、ＰＥＧ５０００　５ＰＤＰ、ＰＥＧ５０００　ＳＭＣＣおよびＰ ＥＧＩｏ、０００　５ＰＤＰによってＰＥＧ化された。第１７番部位の天然のシ スティンは、考えられる不適当なジスルフィド架橋形成を妨げるなめに除かれ、 アラニンと置換された。ｍｐＡ１ａ１７ｃｙｓ３７　Ｇ−Ｃ３Ｆタンパク質保存 液は、５０ｍＭ　ＮａＨｚＰＯ４および１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００ｕ１００ｕの ｐＨ７，０ＭｆＮ溶液で透析され、約１００　ｕ　ｇ／ｅａｌまで濃縮された。

総容量は６７０ｕ　ｌであった。

ＰＥＧ化試薬（ＰＥＧ　５０００　５ＰＤＰ、ＰＥＧ　５０００　ＳＭＣＣおよ びＰＥＧ　１０．０００　５ＰＤＰ）の保存液は、Ｈ，Ｏ中で１０ｍＭの濃度で 変時調製された（１８×保存溶液は実施例７の１ａおよび１ｂで述べられたよう にして調製された）、この反応は以下に示した試薬および量を用いて行われた。

１　５０００５ＰＤＰ　１７０　１０ ２　５０００　ＳＭＣＣ１７０１０ ３１０，０００５ＰＤＰ　Ｉ７０　１０すべての反応はＰＥＧ試薬に関して１ｍ Ｍであった。実施例７にあるように、ミューティンはＰＥＧ試薬に添加され、均 一になるまでポルテックスにかけられた１反応は４℃で一夜進行させられ、完了 していることが分かった。

還元性および非還元性レーンを用いた１０−２０％グラジェントＳＤＳアクリル アミド・ゲルを行い、クマシーブルー染色を行った分析は、ｍｐＡ１ａ１７ｃｙ ｓ３７　ＰＥＧ５０００　５ＰＤＰおよびｍｐＡＩａ１７ｃｙｓ３７　ＰＥＧ５ ０００　ＳＭＣＣ産物がほとんど純粋で、約２８ｋＤの移動度であることを示し た。

非ＰＥＧ化Ｇ−Ｃ３Ｆミューティンは、約１９ｋＤの移動度を示す、ゲル上の還 元性レーンは、５ＰＤＰ複合体はＤＴＴ存在下の還元に感受性であることを示し た。ＳＭＣＣ由来の試薬は還元処理に対して総会的に耐性である。ＰＥＧＩｏ。

０００　５ＰＤＰ　ＰＥＧ化　ｍｐＡＩａ１７ｃｙｓ３７　Ｇ−ＣＳＦは、約３ ２ｋＤの移動度を示す、非ＰＥＧ化　Ｇ−Ｃ３ＦミユーテインはＤＴＴ処理によ り再生する。

ｍ：ＥＰｏ　ｍ　Ｃｓ９”、ｚ−−インのＰＥＧミューティン・ヒトＥＰＯｍ３ Ｃｙｓ９は、上述の実施例５にしたがって調製され、実施例９で調製されたＰＥ Ｇ化試薬保存液と、陰性対照として天然のし）ＥＰＯを用いてＰＥＧ化されるこ とができる１反応を開始するために、実施例９で調製されたような１０ｕｌの適 当なＰＥＧ保存液が、１００　ｕ　ｇ／＋＊Ｉの濃度のＥＰＯｍｐＣｙｓ保存液 １７０ｕｌに添加される。この混合液はポルテックスにかけられ、反応は４℃で 一夜進行させられた９反応完了時には、反応物は実施例９にあるようにして分析 されることができる。

大施但１１：　ｆｏＣＡＶＳ もし適当な発現ベクターに構築されたＣＡＶｓをコードする新規なりＮＡ分子を 有し、スルフィドリル反応性化き物がミューティンに結きしていた場合、それぞ れのＣＡＭタンパク質を小規模で作製し請求められている結合部位を持つミュー ティンを「検索する」ことが要求されるかもしれない、スルフィドリル反応性化 合物への結合前および後の、それぞれのＣＡＶの生物学的活性は１旦　ヱ上土ｒ ｏアッセイを用いることにより、すみやかに評価されることができる。

Ｔ−Ｌ−３ＣＡＶミュー−インの　バ　″１アに　７ハバクテリアＧＩ５８６株 は、新規なＣＡＶ　ＩＬ、−３コ一ド配列を持つ、精製されたバクテリア発現ベ クター、ｐＡＬ−ｈＩＬ３−７８１、ＡＴＣＣ寄託番号６７９３２によって形質 転換された。形質転換細胞は、プレートあたり約１００コロニーを得られる濃度 で、５０　ｕ　ｇ、’ｎｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に広げられ た。　５０１１　ｇ、／＋Ｉのアンピシリンを添加した３＋ａｌのＬ培地は、単 一のバクテリアのコロニーで接種され、３０℃で一夜培養された。５０ｍ１の誘 導培地（０，ＩＸＬ培地、ＩＸＭ９塩、０．４％ブドウ糖、１ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ， および５０ｕｇ／鶴１のアンピシリン）がこの−夜培養液１１で接種された。５ ０睦１の培養液が０．５　０Ｄ　６００ｎｍレベルに達するまで、３０℃で撹拌 しながら培養され、次に温度は４０℃に上げられ、少なくとも２時間培養を続け た。

次に、細胞をソーパル遠心機、３Ｂローターを用いて３５００ｒｐｍで５分間遠 心することにより集めた。上清は捨てられ、細胞ベレットは１１のＭｔＩＩＰＥ Ｄ（５０ｍＭ　ＮａＨ，Ｐ（Ｌ、ＰＨ７，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＤＴ Ｔおよび１０ｍＭ　ＰＭＳＦ）に再懸濁された。この１躊１の溶液は１０，００ ０ｐｓｉで２回フレンチプレスにかけられ、氷におかれた。この溶液は、次に１ ２，０００ｒｐｍで５分間微量遠心された。上清は捨てられ、沈殿した材料はＰ ＥＤ［衝液中の７Ｍグアニジン−ＨＣｌ溶液１５０ｕｌに再懸濁された９次にこ の溶液は６５０ｕ　ＩのＰＥＤ榎衝液で希釈され、透析チューブ（１０，ＯＯＯ ＭＷＣＯスペクトロボア）中におかれた。この試料は、２リツＩ・ルのＰＥＤ、 １［１ｉ液（５０ｍＭ　ＮａＨ，ＰＯ−ｐＨ７，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、Ｏ，ｉ ｍＭ　ＤＴＴ）に対して少なくとも４時間透析された。この試料は回収され、沈 殿したタンパク質を除くために微量遠心された０次にこの試料は１２％レムリー ＳＤＳ　ＰＡＧＥゲルで分析され、ＩＬ−３タンパク質の量が概算された。

次にタンパク質溶液は約０．５１１１１／Ｉｌｌに濃縮され、そして２００ｕｇ がモル濃度で１５倍過剰のＳ−ピリジル・モノメトキシＰＥＧ５０００あるいは マレイミド・モノメトキシＰＥＧ５０００と、４℃で数時間反応させられた０次 にこの産物はＳＤＳ　ＰＡＧＥで分析され、生物学的活性はｉｎ　ｖｉｔｒｏ　 ＴＦ−１細胞分裂アッセイで決定された。

この小規模の生産法は、同様な有用性をもって、本発明の新規なＣＡＶ　Ｇ−Ｃ ３ＦｓおよびＥＰＯｓの生産に適用されるかもしれない。

もうひとつの点として、この検索のための小規模の生産法は、スルフィドリル反 応性化合物の結合以前に行われるかもしれない。この場合、生物学的活性は依然 、上ｎ　ｖｉｔｒｏ　ＴＦ−１ａ胞分裂アッ七イ（あるいはＧ−Ｃ３Ｆの場合、 ３２Ｄ細胞分裂アッセイ）によって決定されるであろうし、またこの産物は既知 の技術にしたがってＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析によって分析されるかもしれない。

他のスルフィドリル反応性化合物の、本発明の他のＣＡＶｓへの結合のために、 同じあるいは同様の方法が当業者によって用いられるかもしれない、そのように して生産された修飾ＣＡＶｓの均一性が、従来の分析法、例えば標準的なＳＤＳ −ＰＡＧＥあるいはＨＰＬＣ分析によって観察されることができる。

本明細書で開示される観点から、本発明の方法および組成物に対して、当業者に よる無数の修飾がなされるかもしれない、そのような修飾は、添付の請求の範囲 で定義されるように、この発明によって包含されると信じられている。

Ｆ工ＧＵＲＥ　：Ｌ フ０ ＣＴＣＧＣＧ　ＡＴＣＴＴＣＴＡＧ Ｌａｕ　Ａｌａ工１ｔａ　Ｐｈａ　５ｔｏｐＴＧ ＥＴ Ｆ工ＧＵＲＥ　２ｂ ＦＩＧＵＲＥ　３ａ ＴＴＡ　ＴＡＧ　ＴＧＡ　ＣＡＧ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＴＧＧ　ＴＴＴ　ＣＡＡ　 ＴＴＧ　ＡＡＡ　ＡＴＧ　ＣＧＣＡＣＣＴＴＴ　ＴＣＴ　’Ｉ’ＡＣＣＴＴ　Ｃ ＡＡ　ＣＣＧ　ＧＴＣＧＴＣＣＧＡ　ＣＡＴ　ＣＴＴ　ＣＡＴＡＣＣＧＴＣＣＣ Ｔ　ＭＴ　ＣＧＣＧＡＴ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＣＴＴ　ＣＧＡ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　 ＧＣＧＣＣＡ　ＧＴＣＣＧＡ　ＭＴ　ＡＡＴ　ＣＡＧ　ＴＴＧ　ＡＧＡ　ＡＧＧ 　ＧＴＣＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧｃｃ　ＧＡＴ　ＧＴＣＧＡＣＧＴＡ　ＣＡＣＣＴ Ａ　ＴＴＴ　ＣＧＧ　ＣＡＧ　ＴＣＡ　ＣＣＧ　ＧＡＡＦＩＧＵＲＥ　３ｂ ＴＯＰ 国際調査報告 Ｉ崗１１ｎ＋４酊１＾―畦、、、、ＩＩＮＬ　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０２１４４ 国際調査報告 ＵＳ　９００２１４４ Ｓ＾　３６７６９

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．該ＣＡＶが少なくともひとつのポリアルケン・グリコール部分に共有結合し ている、少なくとも１つの非−天然システイン残基を含むように修飾した、ヒト ＩＬ−３のペプチド配列からなるところの、システインが添加されたインターロ イキン−３の変種（「ＣＡＶ」）。
2. ２．少なくともひとつの該非−天然システイン残基がＩＬ−３ＣＡＶの成熟型ペ プチド配列を含めて１から１４番目の位置に含まれるところの、請求の範囲第１ 項のＣＡＶ。
3. ３．少なくともひとつの該非−天然システイン残基がＩＬ−３ＣＡＶの成熟型ペ プチド配列を含めて６から１２番目の位置に含まれるところの、請求の範囲第１ 項のＣＡＶ。
4. ４．少なくともひとつの該非−天然システイン残基がＩＬ−３ＣＡＶの成熟型ペ プチド配列の１０番目の位置にあるところの、請求の範囲第１項のＣＡＶ。
5. ５．非−天然システイン残基をＩＬ−３ＣＡＶの成熟型ペプチド配列の９番目お よび１０番目の位置にもっところの、請求の範囲第１項のＣＡＶ。
6. ６．該ＣＡＶが少なくともひとつのポリアルケン・グリコール部分に共有結合し ている、少なくとも１つの非−天然システイン残基を含むように修飾した、ヒト Ｇ−ＣＳＦのペプチド配列からなるところの、Ｇ−ＣＳＦのＣＡＶ。
7. ７．該ＣＡＶが少なくともひとつのポリアルケン・グリコール部分に共有結合し ている、少なくとも１つの非−天然システイン残基を含むように修飾した、ヒト ＥＰＯのペプチド配列からなるところの、ＥＰＯのＣＡＶ。
8. ８．ＣＡＶのＮ−末端がメチオニンで始まり、成熟型ペプチド配列の第１番目が 除かれるところの、請求の範囲第１項から請求の範囲第８項のＣＡＶ。
9. ９．Ｎ−末端がＩＬ−３ＣＡＶの成熟型ペプチド配列の第１番目および第２番目 の位置のアラニンおよびプロリンの削除によって修飾されているところの、請求 の範囲第１項から請求の範囲第５項のＣＡＶ。
10. １０．少なくともひとつの該ポリアルケン・グリコール部分がポリエチレン・グ リコールであるところの、請求の範囲第１項から請求の範囲第９項のＣＡＶ。
11. １１．請求の範囲第１項から請求の範囲第９項のＣＡＶをコードするＤＮＡ配列 。
12. １２．請求の範囲第１１項のＤＮＡ配列を含み、これを発現できる宿主細胞。
13. １３．該ＣＡＶをコードするＤＮＡ配列を含み、これを発現することができる宿 主細胞の培養によって生産された該ＣＡＶの、少なくともひとつの非−天然シス テイン残基に共有結合した該ポリエチレン・グリコール部分からなる、請求の範 囲第１０項のＣＡＶを生産する方法。
14. １４．造血刺激に適した薬学的組成物の調製のための請求の範囲第１項から請求 の範囲第１０項のＣＡＶの利用。