JP2863638B2 - ビスーマレイミド架橋剤 - Google Patents
ビスーマレイミド架橋剤Info
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- JP2863638B2 JP2863638B2 JP9527023A JP52702397A JP2863638B2 JP 2863638 B2 JP2863638 B2 JP 2863638B2 JP 9527023 A JP9527023 A JP 9527023A JP 52702397 A JP52702397 A JP 52702397A JP 2863638 B2 JP2863638 B2 JP 2863638B2
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- Japan
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- enzyme
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- galactosidase
- protease
- hiv
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
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- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、β−ガラクトシダーゼのポリペプチドフラ
グメントの相補性による分析物(analyte)の検出に有
用な化合物、組成物および方法に関する。詳細には、本
発明は、架橋剤β−ガラクトシダーゼの酵素ドナーポリ
ペプチド内での分子内架橋の形成、およびサンプル中の
分析物の検出および定量におけるこのような組成物の使
用に関する。
グメントの相補性による分析物(analyte)の検出に有
用な化合物、組成物および方法に関する。詳細には、本
発明は、架橋剤β−ガラクトシダーゼの酵素ドナーポリ
ペプチド内での分子内架橋の形成、およびサンプル中の
分析物の検出および定量におけるこのような組成物の使
用に関する。
過去に、種々の合成および天然の抗原性ポリペプチド
ならびにポリペプチドフラグメントが、二官能性架橋剤
を用いて、高分子量タンパク質キャリア(例えば、ラテ
ックス官能基化SEPHAROSE(Pharmacia,Inc.)、破傷風
毒素、キーホールリンペットヘモシアニン、アガロー
ス、およびセルロース)、検出可能な標識(例えば、蛍
光団)、および化学療法の薬剤に、結合されてきた。米
国特許第4,493,795号、およびPCT公開WO90/05749号(19
90年5月31日発行)がその例である。このような架橋剤
はまた、生物活性または細胞傷害性の薬剤、色素、放射
性化合物などを抗体分子に結合させるために使用されて
いる。米国特許第4,671,958号がその例である。抗体
は、このような薬剤を用いてともに結合される。Chen、
Res.Virol.141:373−42(1990)を参照のこと。架橋剤
はまた、生物活性でかつ治療に有用なポリペプチドを、
ポリエチレングリコールのようなポリマーと結合させる
ことにより修飾し、薬物動態学的特性を増強するための
用途が見出されている。米国特許第5,166,322号、同第
4,179,337号、および同第4,766,106号がその例である。
ならびにポリペプチドフラグメントが、二官能性架橋剤
を用いて、高分子量タンパク質キャリア(例えば、ラテ
ックス官能基化SEPHAROSE(Pharmacia,Inc.)、破傷風
毒素、キーホールリンペットヘモシアニン、アガロー
ス、およびセルロース)、検出可能な標識(例えば、蛍
光団)、および化学療法の薬剤に、結合されてきた。米
国特許第4,493,795号、およびPCT公開WO90/05749号(19
90年5月31日発行)がその例である。このような架橋剤
はまた、生物活性または細胞傷害性の薬剤、色素、放射
性化合物などを抗体分子に結合させるために使用されて
いる。米国特許第4,671,958号がその例である。抗体
は、このような薬剤を用いてともに結合される。Chen、
Res.Virol.141:373−42(1990)を参照のこと。架橋剤
はまた、生物活性でかつ治療に有用なポリペプチドを、
ポリエチレングリコールのようなポリマーと結合させる
ことにより修飾し、薬物動態学的特性を増強するための
用途が見出されている。米国特許第5,166,322号、同第
4,179,337号、および同第4,766,106号がその例である。
β−ガラクトシダーゼは、約116,000ダルトンのモノ
マー分子量を有する4量体タンパク質である。このモノ
マーは、1023個のアミノ酸からなる。シストロン内性
(intracistoronic)相補性は、酵素の個々の不活性な
ペプチドフラグメントが自発的に会合して、活性なβ−
ガラクトシダーゼタンパク質を形成する、公知の現象で
ある。徹底的に研究された最初のβ−ガラクトシダーゼ
相補性対は、LangleyおよびZabin、Biochemistry 15:48
66(1976)により記載されるM15/CNBr2系であった。M15
は、アミノ酸11〜41が欠失しているβ−ガラクトシダー
ゼの欠失変異体である。CNBr2ペプチドは、β−ガラク
トシダーゼのアミノ酸3〜92からなり、そいてインタク
トな(intact)酵素の臭化シアン切断により調製され
る。個々に不活性であるM15およびCNBr2が、適切な条件
下で一緒にインキュベートされる場合、2つのペプチド
は互いに相補または会合して、完全に活性な4量体β−
ガラクトシダーゼを形成する。この系において、CNBr2
(N末端ペプチド)は、α−酵素ドナーと呼ばれる。N
末端欠失を有するM15は、α−酵素アクセプターと呼ば
れる。β−ガラクトシダーゼのドメインの再会合を用い
て、不活性フラグメントから活性β−ガラクトシダーゼ
を形成する一般的な現象は、相補性と呼ばれる。α−酵
素ドナーとα−酵素アクセプターとの他の組み合わせが
記載される。Zabin、Mol.and Cullular Biochem 49:84
(1982)を参照のこと。各々は、天然のβ−ガラクトシ
ダーゼ配列に由来する変異体である。
マー分子量を有する4量体タンパク質である。このモノ
マーは、1023個のアミノ酸からなる。シストロン内性
(intracistoronic)相補性は、酵素の個々の不活性な
ペプチドフラグメントが自発的に会合して、活性なβ−
ガラクトシダーゼタンパク質を形成する、公知の現象で
ある。徹底的に研究された最初のβ−ガラクトシダーゼ
相補性対は、LangleyおよびZabin、Biochemistry 15:48
66(1976)により記載されるM15/CNBr2系であった。M15
は、アミノ酸11〜41が欠失しているβ−ガラクトシダー
ゼの欠失変異体である。CNBr2ペプチドは、β−ガラク
トシダーゼのアミノ酸3〜92からなり、そいてインタク
トな(intact)酵素の臭化シアン切断により調製され
る。個々に不活性であるM15およびCNBr2が、適切な条件
下で一緒にインキュベートされる場合、2つのペプチド
は互いに相補または会合して、完全に活性な4量体β−
ガラクトシダーゼを形成する。この系において、CNBr2
(N末端ペプチド)は、α−酵素ドナーと呼ばれる。N
末端欠失を有するM15は、α−酵素アクセプターと呼ば
れる。β−ガラクトシダーゼのドメインの再会合を用い
て、不活性フラグメントから活性β−ガラクトシダーゼ
を形成する一般的な現象は、相補性と呼ばれる。α−酵
素ドナーとα−酵素アクセプターとの他の組み合わせが
記載される。Zabin、Mol.and Cullular Biochem 49:84
(1982)を参照のこと。各々は、天然のβ−ガラクトシ
ダーゼ配列に由来する変異体である。
C末端ペプチドおよび対応するC末端欠失タンパク質
との相補性がまた記載される。ω−相補性として公知で
あるこの現象の例は、X−90(C末端において10個のア
ミノ酸が欠失しているβ−ガラクトシダーゼ欠失変異
体)、およびCNBr24(β−ガラクトシダーゼのアミノ酸
990〜1021からなるペプチド)である。α−相補性の場
合、ω−酵素ドナーポリペプチドおよびω−酵素アクセ
プタータンパク質は不活性であるが、再会合して酵素的
に活性な4量体を形成する。Welphy、Biochem.Biophys.
Res.Comm.93:223(1980)を参照のこと。
との相補性がまた記載される。ω−相補性として公知で
あるこの現象の例は、X−90(C末端において10個のア
ミノ酸が欠失しているβ−ガラクトシダーゼ欠失変異
体)、およびCNBr24(β−ガラクトシダーゼのアミノ酸
990〜1021からなるペプチド)である。α−相補性の場
合、ω−酵素ドナーポリペプチドおよびω−酵素アクセ
プタータンパク質は不活性であるが、再会合して酵素的
に活性な4量体を形成する。Welphy、Biochem.Biophys.
Res.Comm.93:223(1980)を参照のこと。
β−ガラクトシダーゼ相補性活性は、高分子量または
低分子量の分析物の両方についての高感度な定量アッセ
イを産生するために利用されている。米国特許第5,362,
625号および同第4,708,929号は、とりわけ、抗体および
レセプター結合アッセイにおける使用のための種々の酵
素ドナーおよび酵素アクセプターポリペプチド組成物を
開示する。酵素ドナーおよび酵素アクセプターは、当業
者に熟知の組換えDNA技術またはポリペプチド合成技術
により産生される。
低分子量の分析物の両方についての高感度な定量アッセ
イを産生するために利用されている。米国特許第5,362,
625号および同第4,708,929号は、とりわけ、抗体および
レセプター結合アッセイにおける使用のための種々の酵
素ドナーおよび酵素アクセプターポリペプチド組成物を
開示する。酵素ドナーおよび酵素アクセプターは、当業
者に熟知の組換えDNA技術またはポリペプチド合成技術
により産生される。
これらのアプローチは、酵素ドナーおよび酵素アクセ
プター分子の設計に対し、大きな柔軟性および制御を可
能にする。遺伝子操作技術の使用は、酵素ドナーおよび
酵素アクセプターのポリペプチドの配列および長さを、
アッセイの性能および薬剤安定性を最適化するように改
変することを可能にする。分析物に化学結合するために
最適化された酵素ドナーおよび分析物のペプチドまたは
タンパク質に遺伝子的に融合された酵素ドナーが記載さ
れ、そしてこれらの組成物を用いるイムノアッセイは市
販されている。Henderson、Clin.Chem.32:1637(198
6);Khanna、Amer.Clin.Lab 8:14(1989)およびCoty、
J.Clin.Immunoassay 17:144(1994)を参照のこと。
プター分子の設計に対し、大きな柔軟性および制御を可
能にする。遺伝子操作技術の使用は、酵素ドナーおよび
酵素アクセプターのポリペプチドの配列および長さを、
アッセイの性能および薬剤安定性を最適化するように改
変することを可能にする。分析物に化学結合するために
最適化された酵素ドナーおよび分析物のペプチドまたは
タンパク質に遺伝子的に融合された酵素ドナーが記載さ
れ、そしてこれらの組成物を用いるイムノアッセイは市
販されている。Henderson、Clin.Chem.32:1637(198
6);Khanna、Amer.Clin.Lab 8:14(1989)およびCoty、
J.Clin.Immunoassay 17:144(1994)を参照のこと。
この領域の当該技術により記載されない1つの問題
は、これらの相補性アッセイにおけるバックグラウンド
の干渉を低減することを含む。酵素ドナーおよび酵素ア
クセプター分子は自発的に結合して活性な分子を形成す
るので、従来は、未改変酵素ドナーまたは酵素アクセプ
ターフラグメントに結合する抗体またはレセプターは、
このような望ましくない相補性を阻害した。このアプロ
ーチは完全には成功しなかった。
は、これらの相補性アッセイにおけるバックグラウンド
の干渉を低減することを含む。酵素ドナーおよび酵素ア
クセプター分子は自発的に結合して活性な分子を形成す
るので、従来は、未改変酵素ドナーまたは酵素アクセプ
ターフラグメントに結合する抗体またはレセプターは、
このような望ましくない相補性を阻害した。このアプロ
ーチは完全には成功しなかった。
発明の要旨 本発明は、分子内で架橋する酵素ドナーポリペプチド
を使用する相補性アッセイのための材料および方法を提
供する。「酵素ドナー」または「酵素ドナーポリペプチ
ド」は、酵素アクセプターと結合または会合して、活性
なβ−ガラクトシダーゼ酵素を形成し得るペプチド配列
を含む、β−ガラクトシダーゼの酵素的に不活性なポリ
ペプチドフラグメントを意味する。「酵素アクセプタ
ー」または「酵素アクセプターポリペプチド」は、酵素
ドナーと結合または会合する場合、相補性のプロセスに
より活性なβ−ガラクトシダーゼを形成し得る、β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子の欠失変異体により産生されるβ
−ガラクトシダーゼの酵素的に不活性なポリペプチドフ
ラグメントを意味する。分子内で架橋した酵素ドナーを
使用するこれらのアッセイは、分子内架橋を酵素ドナー
ポリペプチドに導入することで、酵素ドナーポリペプチ
ドと酵素アクセプターとの間の相補性を大いに低減でき
るかまたは阻害できるという、本発明によりなされた観
察に基づく。「架橋」または「分子内架橋」は、酵素ド
ナーポリペプチド中の2つの反応性アミノ酸残基の間に
ある架橋剤の化学的共有結合、そしてそれによってポリ
ペプチドを環状構造を与えることを意味する。このよう
な架橋酵素ドナーは、本明細書中で「環状酵素ドナー」
とも呼ばれる。
を使用する相補性アッセイのための材料および方法を提
供する。「酵素ドナー」または「酵素ドナーポリペプチ
ド」は、酵素アクセプターと結合または会合して、活性
なβ−ガラクトシダーゼ酵素を形成し得るペプチド配列
を含む、β−ガラクトシダーゼの酵素的に不活性なポリ
ペプチドフラグメントを意味する。「酵素アクセプタ
ー」または「酵素アクセプターポリペプチド」は、酵素
ドナーと結合または会合する場合、相補性のプロセスに
より活性なβ−ガラクトシダーゼを形成し得る、β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子の欠失変異体により産生されるβ
−ガラクトシダーゼの酵素的に不活性なポリペプチドフ
ラグメントを意味する。分子内で架橋した酵素ドナーを
使用するこれらのアッセイは、分子内架橋を酵素ドナー
ポリペプチドに導入することで、酵素ドナーポリペプチ
ドと酵素アクセプターとの間の相補性を大いに低減でき
るかまたは阻害できるという、本発明によりなされた観
察に基づく。「架橋」または「分子内架橋」は、酵素ド
ナーポリペプチド中の2つの反応性アミノ酸残基の間に
ある架橋剤の化学的共有結合、そしてそれによってポリ
ペプチドを環状構造を与えることを意味する。このよう
な架橋酵素ドナーは、本明細書中で「環状酵素ドナー」
とも呼ばれる。
完全な相補的活性は、環状ポリペプチドを切断または
開裂することによって回復し得、それによってポリペプ
チドを線状化し得ることも、また観察された。この現象
は、分子内で架橋したドナーペプチドまたは環状ペプチ
ドが、特定の分析物の作用により、あるいは特定の分析
物の存在のために線状化され得る場合のアッセイ形式に
おいて有用である。前述の系に対するこの系の顕著な利
点は、固有のバックグラウンドシグナルが極度に低いこ
とである。架橋分子の相補活性を最小化するように、遺
伝子操作技術を用いて、酵素ドナー架橋点を配置し得
る。本発明者らは、理論に束縛されることを意図しない
が、酵素アクセプターペプチドと会合して活性な酵素を
形成することを可能にするコンフォメーションによっ
て、架橋した酵素ドナーペプチドが立体的に阻害される
と推測する。
開裂することによって回復し得、それによってポリペプ
チドを線状化し得ることも、また観察された。この現象
は、分子内で架橋したドナーペプチドまたは環状ペプチ
ドが、特定の分析物の作用により、あるいは特定の分析
物の存在のために線状化され得る場合のアッセイ形式に
おいて有用である。前述の系に対するこの系の顕著な利
点は、固有のバックグラウンドシグナルが極度に低いこ
とである。架橋分子の相補活性を最小化するように、遺
伝子操作技術を用いて、酵素ドナー架橋点を配置し得
る。本発明者らは、理論に束縛されることを意図しない
が、酵素アクセプターペプチドと会合して活性な酵素を
形成することを可能にするコンフォメーションによっ
て、架橋した酵素ドナーペプチドが立体的に阻害される
と推測する。
ペプチドは、アミド(ペプチド)結合によって2つ以
上のアミノ酸の結合によって形成される任意の化合物で
あり、通常、各α−アミノ酸残基(NH2−末端は除く)
のα−アミノ基が、直鎖内で次の残基のα−カルボキシ
ル基に結合する、α−アミノ酸のポリマーである。用語
ペプチド、ポリペプチド、およびポリ(アミノ酸)は、
サイズに関して制限されないこの化合物のクラスを述べ
るために、本明細書で同義的に使用される。このクラス
の最も大きなメンバーは、タンパク質と言われる。
上のアミノ酸の結合によって形成される任意の化合物で
あり、通常、各α−アミノ酸残基(NH2−末端は除く)
のα−アミノ基が、直鎖内で次の残基のα−カルボキシ
ル基に結合する、α−アミノ酸のポリマーである。用語
ペプチド、ポリペプチド、およびポリ(アミノ酸)は、
サイズに関して制限されないこの化合物のクラスを述べ
るために、本明細書で同義的に使用される。このクラス
の最も大きなメンバーは、タンパク質と言われる。
複合体は、弱い結合または他の力で一緒に保持されて
いる化学的化合物または部分の可逆的な会合であり、例
えば、酵素基質複合体(酵素と1つ以上の基質との会合
は、酵素触媒反応における反応部分である)、抗原−抗
体複合体、ハプテン−抗体複合体、または酵素ドナーと
酵素アクセプターとの相補性により形成されるβ−ガラ
クトシダーゼの活性酵素複合体である。
いる化学的化合物または部分の可逆的な会合であり、例
えば、酵素基質複合体(酵素と1つ以上の基質との会合
は、酵素触媒反応における反応部分である)、抗原−抗
体複合体、ハプテン−抗体複合体、または酵素ドナーと
酵素アクセプターとの相補性により形成されるβ−ガラ
クトシダーゼの活性酵素複合体である。
本発明の別の局面は、架橋した酵素ドナーポリペプチ
ドを作製するための方法、新規なホモ二官能性ビスマレ
イミド架橋剤、および架橋した酵素ドナーポリペプチド
を用いるアッセイ方法を包含する。
ドを作製するための方法、新規なホモ二官能性ビスマレ
イミド架橋剤、および架橋した酵素ドナーポリペプチド
を用いるアッセイ方法を包含する。
本発明の他の局面および利点は、その実施の例示的実
施例を包含する以下の発明の詳細な説明を考慮すること
により明らかになる。
施例を包含する以下の発明の詳細な説明を考慮すること
により明らかになる。
図面の簡単な説明 本発明は、本明細書の一部を形成する図面と組み合わ
せて考慮する場合に、以下の発明の詳細な説明を参照す
ることにより、よりよく理解される。
せて考慮する場合に、以下の発明の詳細な説明を参照す
ることにより、よりよく理解される。
図1は、N−(2−トリメチルシロキシエチル)−マ
レイミドの調製のための特定の合成スキームを示す。
レイミドの調製のための特定の合成スキームを示す。
図2は、4−マレイミドブチルアルデヒドの調製のた
めの特定の合成スキームを示す。
めの特定の合成スキームを示す。
図3は、1,7−ビスマレイミド−4−0−(テトラア
セチル−β−D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘ
プタンおよび1,7−ビス−(3′−メトキシスクシンイ
ミド)−4−0−(β−D−ガラクトピラノシル)−5
−オキサヘプタンの調製のための特定の合成スキームを
示す。
セチル−β−D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘ
プタンおよび1,7−ビス−(3′−メトキシスクシンイ
ミド)−4−0−(β−D−ガラクトピラノシル)−5
−オキサヘプタンの調製のための特定の合成スキームを
示す。
発明の詳細な説明 本発明は、第1に、β−ガラクトシダーゼの架橋酵素
ドナーポリペプチド配列を提供する。本発明の架橋β−
ガラクトシダーゼ酵素ドナーポリペプチドは、架橋部分
を含む架橋剤の結合を可能にする反応性アミノ酸残基を
含むβ−ガラクトシダーゼ配列を包含する。このような
部分への結合を可能にする反応性アミノ酸残基は、α−
またはω−アミノ基(例えば、リジン)、α−、β−、
またはγ−カルボキシル基(例えば、アスパラギン酸ま
たはグルタミン酸)、チオール基(例えば、システイ
ン)、および芳香環(例えば、ヒスチジンまたはチロシ
ン)である。架橋部分は、架橋剤の不可欠な部分であ
り、そして架橋剤を反応性アミノ酸残基に共有結合し得
る化学的部分または官能基を含む。例えば、タンパク質
およびペプチドのチオール基を共有結合させるのに有用
な架橋剤は、ビスマレイミドヘキサン(BMH)である。
この架橋剤は、ヘキサメチレンの各末端に結合したマレ
イミド架橋部分を有するヘキサメチレン部分を含む。他
の架橋剤の例は、Chemistry of Protein Conjugation a
nd Cross−Linking、S.S.Wong、CRC Press、1993に記載
される。
ドナーポリペプチド配列を提供する。本発明の架橋β−
ガラクトシダーゼ酵素ドナーポリペプチドは、架橋部分
を含む架橋剤の結合を可能にする反応性アミノ酸残基を
含むβ−ガラクトシダーゼ配列を包含する。このような
部分への結合を可能にする反応性アミノ酸残基は、α−
またはω−アミノ基(例えば、リジン)、α−、β−、
またはγ−カルボキシル基(例えば、アスパラギン酸ま
たはグルタミン酸)、チオール基(例えば、システイ
ン)、および芳香環(例えば、ヒスチジンまたはチロシ
ン)である。架橋部分は、架橋剤の不可欠な部分であ
り、そして架橋剤を反応性アミノ酸残基に共有結合し得
る化学的部分または官能基を含む。例えば、タンパク質
およびペプチドのチオール基を共有結合させるのに有用
な架橋剤は、ビスマレイミドヘキサン(BMH)である。
この架橋剤は、ヘキサメチレンの各末端に結合したマレ
イミド架橋部分を有するヘキサメチレン部分を含む。他
の架橋剤の例は、Chemistry of Protein Conjugation a
nd Cross−Linking、S.S.Wong、CRC Press、1993に記載
される。
酵素ドナーポリペプチド中の反応性アミノ酸のアミン
基は、架橋剤のアミノ基反応性部分との反応により架橋
され得る。N−ヒドロキシスクシンイミド、ジメチルス
ベリミデート、フェニルジイソシアネート、フェニルジ
イソチオシアネート、ジフルオロジニトロベンゼン、お
よび塩化シアンは、架橋剤の例である。
基は、架橋剤のアミノ基反応性部分との反応により架橋
され得る。N−ヒドロキシスクシンイミド、ジメチルス
ベリミデート、フェニルジイソシアネート、フェニルジ
イソチオシアネート、ジフルオロジニトロベンゼン、お
よび塩化シアンは、架橋剤の例である。
反応性アミノ酸のチオール基は、架橋剤のスルフヒド
リル反応性部分との反応により架橋され得る。この例と
しては、S−ピリジル、マレイミド、およびブロモアセ
チル部分がある。
リル反応性部分との反応により架橋され得る。この例と
しては、S−ピリジル、マレイミド、およびブロモアセ
チル部分がある。
反応性アミノ酸のカルボキシル基は、カルボジイミド
またはヒドラジド部分との反応により架橋され得る。
またはヒドラジド部分との反応により架橋され得る。
架橋部分は、架橋が適切な残基の間で達成されるよう
なホモ二官能性またはヘテロ二官能性であり得、好まし
くは、酵素ドナーのN末端残基およびC末端残基上か、
またはその近傍で達成される。従って、この架橋剤は、
酵素ドナーポリペプチドの所望するアミノ酸残基のアミ
ノ基、チオール基、カルボキシル基、または芳香族基に
化学的に共有結合し得る2つの反応性基を有する。
なホモ二官能性またはヘテロ二官能性であり得、好まし
くは、酵素ドナーのN末端残基およびC末端残基上か、
またはその近傍で達成される。従って、この架橋剤は、
酵素ドナーポリペプチドの所望するアミノ酸残基のアミ
ノ基、チオール基、カルボキシル基、または芳香族基に
化学的に共有結合し得る2つの反応性基を有する。
酵素ドナーは、挿入されたカセットまたは認識部分を
含み得、その性質は、架橋した酵素ドナーポリペプチド
が使用される適用に依存する。認識部分は、プロテアー
ゼ、ヌクレアーゼまたはグリコシダーゼの認識配列を含
むという利点により酵素または特異的プロテアーゼ、ヌ
クレアーゼ、あるいはエンドグリコシダーゼにより切断
可能なペプチド配列または核酸配列を含み得る。あるい
は、認識部分は、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、ア
ミダーゼ、またはエステラーゼのような特異的な加水分
解酵素の基質認識部分を含み得る。HIV−1およびHIV−
2プロテアーゼ、コクサッキーウイルスプロテアーゼ、
およびヘルペスウイルスプロテアーゼなどのウイルスプ
ロテアーゼは、宿主の細胞タンパク質の特異的ペプチド
基質配列を認識する。感染性ビリオンを形成するための
gagおよびgag−polタンパク質のタンパク質分解プロセ
シングを担うので、HIV−1プロテアーゼは特に関心を
集めている。Kramer、Science 231:1580(1986)および
Kohl、Proc.Natl.Acad.Sci.85:4686(1988)を参照のこ
と。HIVプロテアーゼは、Pr55gag p17/p24切断部分に対
応するオクタペプチド配列SQNYPIVQ、およびgag−polタ
ンパク質のp6/PR切断部分に対応するデカペプチド配列V
SFNFPQITLを認識し、そして切断する。Krausslich、Pro
c.Nat.Acad.Sci.86:807−11(1989)を参照のこと。従
って、このようなHIVプロテアーゼにより認識および切
断されるペプチド配列は、認識部分として使用され得
る。
含み得、その性質は、架橋した酵素ドナーポリペプチド
が使用される適用に依存する。認識部分は、プロテアー
ゼ、ヌクレアーゼまたはグリコシダーゼの認識配列を含
むという利点により酵素または特異的プロテアーゼ、ヌ
クレアーゼ、あるいはエンドグリコシダーゼにより切断
可能なペプチド配列または核酸配列を含み得る。あるい
は、認識部分は、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、ア
ミダーゼ、またはエステラーゼのような特異的な加水分
解酵素の基質認識部分を含み得る。HIV−1およびHIV−
2プロテアーゼ、コクサッキーウイルスプロテアーゼ、
およびヘルペスウイルスプロテアーゼなどのウイルスプ
ロテアーゼは、宿主の細胞タンパク質の特異的ペプチド
基質配列を認識する。感染性ビリオンを形成するための
gagおよびgag−polタンパク質のタンパク質分解プロセ
シングを担うので、HIV−1プロテアーゼは特に関心を
集めている。Kramer、Science 231:1580(1986)および
Kohl、Proc.Natl.Acad.Sci.85:4686(1988)を参照のこ
と。HIVプロテアーゼは、Pr55gag p17/p24切断部分に対
応するオクタペプチド配列SQNYPIVQ、およびgag−polタ
ンパク質のp6/PR切断部分に対応するデカペプチド配列V
SFNFPQITLを認識し、そして切断する。Krausslich、Pro
c.Nat.Acad.Sci.86:807−11(1989)を参照のこと。従
って、このようなHIVプロテアーゼにより認識および切
断されるペプチド配列は、認識部分として使用され得
る。
架橋した酵素ドナーポリペプチドがタンパク質分解的
に切断されることが所望される場合、非切断性架橋剤が
使用され得る。これは、全化学的ペプチド合成、または
所望するタンパク質分解の切断認識部分をコードする配
列と酵素ドナー配列との遺伝子的融合のいずれかにより
達成され得る。好ましくは、タンパク質分解の切断認識
部位は、タンパク質切断部位が、架橋反応に用いられる
酵素ドナーの2つの反応性アミノ酸残基の間に位置する
ように、酵素ドナー配列の内部に組み入れられる。次い
で、不活性または非切断性架橋部分(例えば、ビスマレ
イミドヘキサン)は、架橋酵素ドナープロテアーゼ基質
のキメラを産生するために使用される。キメラな酵素ド
ナーは、所望の認識部位をコードする遺伝子を、適切な
エンドヌクレアーゼ認識部分において酵素ドナー配列を
コードする遺伝子内に遺伝子的に挿入することによる組
換えDNA方法論を用いて作製され得る。β−ガラクトシ
ダーゼ酵素ドナーDNA配列を含むプラスミドベクター
は、当該分野で周知である。組換えポリメラーズ連鎖反
応クローニングは、目的のコード配列およ適切な制限酵
素クローニング部位を含むオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて、内部のプロテアーゼ感受性配列を有する変
異酵素ドナーを構築することで行われ得る。あるいは、
アミノ酸または保護アミノ酸を連続的に付加してペプチ
ド鎖を成長させることによる、アミノ酸出発物質由来の
酵素ドナーポリペプチドおよびプロテアーゼ認識部位の
化学的合成が使用され得る。このような技術は、当業者
に公知である。例えば、米国特許第4,493,795号および
そこで引用される科学的文献を参照のこと。
に切断されることが所望される場合、非切断性架橋剤が
使用され得る。これは、全化学的ペプチド合成、または
所望するタンパク質分解の切断認識部分をコードする配
列と酵素ドナー配列との遺伝子的融合のいずれかにより
達成され得る。好ましくは、タンパク質分解の切断認識
部位は、タンパク質切断部位が、架橋反応に用いられる
酵素ドナーの2つの反応性アミノ酸残基の間に位置する
ように、酵素ドナー配列の内部に組み入れられる。次い
で、不活性または非切断性架橋部分(例えば、ビスマレ
イミドヘキサン)は、架橋酵素ドナープロテアーゼ基質
のキメラを産生するために使用される。キメラな酵素ド
ナーは、所望の認識部位をコードする遺伝子を、適切な
エンドヌクレアーゼ認識部分において酵素ドナー配列を
コードする遺伝子内に遺伝子的に挿入することによる組
換えDNA方法論を用いて作製され得る。β−ガラクトシ
ダーゼ酵素ドナーDNA配列を含むプラスミドベクター
は、当該分野で周知である。組換えポリメラーズ連鎖反
応クローニングは、目的のコード配列およ適切な制限酵
素クローニング部位を含むオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて、内部のプロテアーゼ感受性配列を有する変
異酵素ドナーを構築することで行われ得る。あるいは、
アミノ酸または保護アミノ酸を連続的に付加してペプチ
ド鎖を成長させることによる、アミノ酸出発物質由来の
酵素ドナーポリペプチドおよびプロテアーゼ認識部位の
化学的合成が使用され得る。このような技術は、当業者
に公知である。例えば、米国特許第4,493,795号および
そこで引用される科学的文献を参照のこと。
架橋の解放、または環状ペプチドの開環は、いくつか
の異なる様式で達成され得る。所望の分析物が、部位特
異的プロテアーゼ(例えば、HIVプロテアーゼ)である
場合、架橋した酵素ドナーポリペプチドは、このプロテ
アーゼに対する認識部位を含む配列を含み得る。プロテ
アーゼ活性により、プロテアーゼ認識部位でプロテアー
ゼが酵素ドナーを切断し、酵素ドナーを遊離して酵素ア
クセプターと相補化し、それにより、容易に測定される
β−ガラクトシダーゼ活性を生じる。例えば、Baum、Pr
oc.Nat.Acad.Sci.87:10023−27(1990)(これは、非架
橋β−ガラクトシダーゼ遺伝子へのHIVプロテアーゼ認
識部位の挿入を開示する)、およびLiebig、Proc.Nat.A
cad.Sci.88:5979−83(1991)(これは、ヒトリノウイ
ルスプロテイナーゼと非架橋β−ガラクトシダーゼのα
−フラグメントとの融合を開示する)を参照のこと。分
析物の他の例は、インターロイキン−1−β変換酵素
(ICEプロテアーゼ)であり、これはアポトーシス(細
胞死)において役割を果たす。このプロテアーゼ酵素
は、配列−X−Val−Y−Asp−Z−に対する明確な特異
性を有する。ICEプロテアーゼによる配列の切断は、Asp
の後で起こる。ICEプロテアーゼ酵素の作用を誘発す
る、これまでに見出されている最少かつ最善のペプチド
基質配列は、Ac−Tyr−Val−Ala−Asp−NH−CH3である
ようである。Thornberry、Nature 356:768−74(1992)
を参照のこと。ICEプロテアーゼの強力なインヒビター
は、配列Ac−Tyr−Val−Ala−Asp*を含み、ここで、*
は、クロロメチルケトンを意味する。Nature 375:78−8
1(1995)を参照のこと。合成架橋酵素ドナーポリペプ
チドへのICEプロテアーゼ認識部位の組み込みは、この
重要なプロテアーゼに対する簡便で迅速なアッセイの開
発を可能にする。
の異なる様式で達成され得る。所望の分析物が、部位特
異的プロテアーゼ(例えば、HIVプロテアーゼ)である
場合、架橋した酵素ドナーポリペプチドは、このプロテ
アーゼに対する認識部位を含む配列を含み得る。プロテ
アーゼ活性により、プロテアーゼ認識部位でプロテアー
ゼが酵素ドナーを切断し、酵素ドナーを遊離して酵素ア
クセプターと相補化し、それにより、容易に測定される
β−ガラクトシダーゼ活性を生じる。例えば、Baum、Pr
oc.Nat.Acad.Sci.87:10023−27(1990)(これは、非架
橋β−ガラクトシダーゼ遺伝子へのHIVプロテアーゼ認
識部位の挿入を開示する)、およびLiebig、Proc.Nat.A
cad.Sci.88:5979−83(1991)(これは、ヒトリノウイ
ルスプロテイナーゼと非架橋β−ガラクトシダーゼのα
−フラグメントとの融合を開示する)を参照のこと。分
析物の他の例は、インターロイキン−1−β変換酵素
(ICEプロテアーゼ)であり、これはアポトーシス(細
胞死)において役割を果たす。このプロテアーゼ酵素
は、配列−X−Val−Y−Asp−Z−に対する明確な特異
性を有する。ICEプロテアーゼによる配列の切断は、Asp
の後で起こる。ICEプロテアーゼ酵素の作用を誘発す
る、これまでに見出されている最少かつ最善のペプチド
基質配列は、Ac−Tyr−Val−Ala−Asp−NH−CH3である
ようである。Thornberry、Nature 356:768−74(1992)
を参照のこと。ICEプロテアーゼの強力なインヒビター
は、配列Ac−Tyr−Val−Ala−Asp*を含み、ここで、*
は、クロロメチルケトンを意味する。Nature 375:78−8
1(1995)を参照のこと。合成架橋酵素ドナーポリペプ
チドへのICEプロテアーゼ認識部位の組み込みは、この
重要なプロテアーゼに対する簡便で迅速なアッセイの開
発を可能にする。
所望の分析物が特異的ヌクレオチド配列(すなわち、
標的ヌクレオチド)である場合、架橋剤は、標的ヌクレ
オチド配列に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド配列を
含み得る。分析物ヌクレオチド配列の存在は、一本鎖オ
リゴヌクレオチド配列と標的ヌクレオチド配列との間の
ハイブリダイゼーションをもたらす。次いで、この新た
に形成された二本鎖は、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(例
えば、制限エンドヌクレアーゼまたはRNAase H)の添加
により切断され得、全ての架橋した酵素ドナー(これ
は、相補的な分析物核酸配列と二本鎖を形成し、そして
酵素アクセプターと相補化してβ−ガラクトシダーゼ活
性を産生する)を線状化する。分析物の例は、例えば、
mycobacteria tuberculosis、streptcoccus、N.gonorrh
ea、HIVを含む細菌およびウイルス、サイトメガロウイ
ルス、Epstein Barrウイルス、varicella zosterウイル
ス、および単純ヘルペスなどのヘルペスウイルス、肝炎
およびクラミジアなどの感染性病原体の核酸配列を包含
する。
標的ヌクレオチド)である場合、架橋剤は、標的ヌクレ
オチド配列に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド配列を
含み得る。分析物ヌクレオチド配列の存在は、一本鎖オ
リゴヌクレオチド配列と標的ヌクレオチド配列との間の
ハイブリダイゼーションをもたらす。次いで、この新た
に形成された二本鎖は、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(例
えば、制限エンドヌクレアーゼまたはRNAase H)の添加
により切断され得、全ての架橋した酵素ドナー(これ
は、相補的な分析物核酸配列と二本鎖を形成し、そして
酵素アクセプターと相補化してβ−ガラクトシダーゼ活
性を産生する)を線状化する。分析物の例は、例えば、
mycobacteria tuberculosis、streptcoccus、N.gonorrh
ea、HIVを含む細菌およびウイルス、サイトメガロウイ
ルス、Epstein Barrウイルス、varicella zosterウイル
ス、および単純ヘルペスなどのヘルペスウイルス、肝炎
およびクラミジアなどの感染性病原体の核酸配列を包含
する。
分析物または化学的環境の条件のいくつかのさらなる
群はまた、この技術を用いて検出または測定され得る。
例えば、選択される架橋剤、特異的な化学的または環境
的条件(pH、温度、酸化、還元など)による切断に感受
性のものであり得る。直接に架橋剤を切断しないが、そ
の活性により続いて切断(間接的結合切断)され得る準
安定結合(metastable linker)を生じる酵素はまた、
この方法により検出可能である。この例は、ガラクトシ
ルまたはホスフェートから誘導体化され、アセタールを
含むリンカーであり、ここで、酵素β−ガラクトシダー
ゼまたはホスファターゼの活性が、それぞれ、非常に不
安定化され、そして最終的に切断される架橋をもたら
す。この実施態様において、分析物は、それ自身で酵素
標識(例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、ペルオキシダーゼなど)として使用される場
合、本発明は、強力なシグナル増幅システムとして有用
であることに注目すべきである。なぜなら、第1の基質
(すなわち、酵素切断可能な架橋剤を含む架橋酵素ドナ
ー)の切断の際、第2の発色性、蛍光性、または化学発
光性基質の複数の分子を切断し得る活性酵素が形成され
るからである。このような架橋剤は、式W−(CH2)n
−X−CH(OY)−(CH2)n−Zを有し、ここでWおよ
びZは、それぞれ、マレイミド、スクシンイミド、およ
びチオシアネートからなる群から選択される官能基であ
り;nは1〜10の数であり;Xは酸素、イオウ、または窒素
であり;そしてYは、ガラクトース、マンノース、グル
コース、ホスフェート、ブチレート、およびアセテート
からなる群から選択される、酵素的に切断可能な部分で
ある。
群はまた、この技術を用いて検出または測定され得る。
例えば、選択される架橋剤、特異的な化学的または環境
的条件(pH、温度、酸化、還元など)による切断に感受
性のものであり得る。直接に架橋剤を切断しないが、そ
の活性により続いて切断(間接的結合切断)され得る準
安定結合(metastable linker)を生じる酵素はまた、
この方法により検出可能である。この例は、ガラクトシ
ルまたはホスフェートから誘導体化され、アセタールを
含むリンカーであり、ここで、酵素β−ガラクトシダー
ゼまたはホスファターゼの活性が、それぞれ、非常に不
安定化され、そして最終的に切断される架橋をもたら
す。この実施態様において、分析物は、それ自身で酵素
標識(例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、ペルオキシダーゼなど)として使用される場
合、本発明は、強力なシグナル増幅システムとして有用
であることに注目すべきである。なぜなら、第1の基質
(すなわち、酵素切断可能な架橋剤を含む架橋酵素ドナ
ー)の切断の際、第2の発色性、蛍光性、または化学発
光性基質の複数の分子を切断し得る活性酵素が形成され
るからである。このような架橋剤は、式W−(CH2)n
−X−CH(OY)−(CH2)n−Zを有し、ここでWおよ
びZは、それぞれ、マレイミド、スクシンイミド、およ
びチオシアネートからなる群から選択される官能基であ
り;nは1〜10の数であり;Xは酸素、イオウ、または窒素
であり;そしてYは、ガラクトース、マンノース、グル
コース、ホスフェート、ブチレート、およびアセテート
からなる群から選択される、酵素的に切断可能な部分で
ある。
上記のように、分析物が酵素(例えば、HIV−1プロ
テアーゼまたはN.gonorrheaプロテアーゼ)である実施
態様において、架橋剤は、分析物酵素に対する基質部位
として作用する化学的部分を含み得る。酵素は、基質部
位と反応して架橋剤を不安定化させ、架橋剤を自発的に
加水切断させて、線状化酵素ドナーを生じる。例えば、
アルデヒドのアセタールグリコシドは、特異的グリコシ
ダーゼ酵素による切断の際、水溶液中で自発的に加水分
解して親(parent)アルデヒドを産生するヒドロキシア
セタールを産生することが知られる。この知識に基づ
き、グリコシルアセタール部分を含む新規なホモ二官能
性架橋剤が設計された。グリコシダーゼ酵素の作用によ
るグリコシル残基が脱離すると、自発的に加水分解する
ヒドロキシアセタールが生じる。正味の結果は、架橋剤
内での切断、および結果として生じる架橋酵素ドナーポ
リペプチドの線状化である。これらのグリコシル含有架
橋剤は、以下の式を有する: ここで、Rはヒドロキシまたはアセテートである。
テアーゼまたはN.gonorrheaプロテアーゼ)である実施
態様において、架橋剤は、分析物酵素に対する基質部位
として作用する化学的部分を含み得る。酵素は、基質部
位と反応して架橋剤を不安定化させ、架橋剤を自発的に
加水切断させて、線状化酵素ドナーを生じる。例えば、
アルデヒドのアセタールグリコシドは、特異的グリコシ
ダーゼ酵素による切断の際、水溶液中で自発的に加水分
解して親(parent)アルデヒドを産生するヒドロキシア
セタールを産生することが知られる。この知識に基づ
き、グリコシルアセタール部分を含む新規なホモ二官能
性架橋剤が設計された。グリコシダーゼ酵素の作用によ
るグリコシル残基が脱離すると、自発的に加水分解する
ヒドロキシアセタールが生じる。正味の結果は、架橋剤
内での切断、および結果として生じる架橋酵素ドナーポ
リペプチドの線状化である。これらのグリコシル含有架
橋剤は、以下の式を有する: ここで、Rはヒドロキシまたはアセテートである。
さらに、化学的または環境的条件による切断に感受性
である架橋剤を構築することが可能である。例えば、
酸、塩基、酸化、還元、温度、光などにより切断される
架橋部分の間にスペーサーを有する架橋剤を選択または
設計することが可能である。この目的のために有用な架
橋剤の例は、酸に不安定な2,2−ビスマレイミドエトキ
シプロパン(BMEP)であり、これは穏やかな酸の加水分
解により切断される。他のこのような薬剤が当該分野で
公知であり、そして同様の形式で使用され得る。
である架橋剤を構築することが可能である。例えば、
酸、塩基、酸化、還元、温度、光などにより切断される
架橋部分の間にスペーサーを有する架橋剤を選択または
設計することが可能である。この目的のために有用な架
橋剤の例は、酸に不安定な2,2−ビスマレイミドエトキ
シプロパン(BMEP)であり、これは穏やかな酸の加水分
解により切断される。他のこのような薬剤が当該分野で
公知であり、そして同様の形式で使用され得る。
架橋される酵素ドナーポリペプチドは、例えば、β−
ガラクトシダーゼのN末端配列を含み得る。β−ガラク
トシダーゼ酵素ドナー配列は、当該分野で公知である。
米国特許第4,708,929号、LangleyおよびZabin、Biochem
istry 15:4866(1976):Zabin、Mol.and Cellular Bioc
hem.49:84(1982);Henderson、Clin.Chemistry 32;163
7(1986);Khanna、Amer.Clin.Lab.8:14(1989)および
Coty、J.Clin.Immunoassay 17:144(1994)を参照のこ
と。
ガラクトシダーゼのN末端配列を含み得る。β−ガラク
トシダーゼ酵素ドナー配列は、当該分野で公知である。
米国特許第4,708,929号、LangleyおよびZabin、Biochem
istry 15:4866(1976):Zabin、Mol.and Cellular Bioc
hem.49:84(1982);Henderson、Clin.Chemistry 32;163
7(1986);Khanna、Amer.Clin.Lab.8:14(1989)および
Coty、J.Clin.Immunoassay 17:144(1994)を参照のこ
と。
本発明の架橋酵素ドナーポリペプチドは、望ましくな
い自発的な酵素相補化に起因するバックグラウンド干渉
をほとんど有さないか全く有さないアッセイを設計およ
び構築することを可能にする。
い自発的な酵素相補化に起因するバックグラウンド干渉
をほとんど有さないか全く有さないアッセイを設計およ
び構築することを可能にする。
本発明の別の局面は、架橋酵素ドナーポリペプチドを
作製する方法および本発明の架橋酵素ドナーポリペプチ
ドを使用するアッセイ方法を包含する。
作製する方法および本発明の架橋酵素ドナーポリペプチ
ドを使用するアッセイ方法を包含する。
本発明の架橋酵素ドナーポリペプチドを作製する方法
は、架橋剤を酵素ドナーの2つの反応性アミノ酸残基へ
の共有結合を引き起こすのに適切な反応条件下で、β−
ガラクトシダーゼ酵素ドナーを架橋剤との混合物中で反
応させる工程、および架橋したペプチドを反応混合物か
ら単離する工程を包含する。
は、架橋剤を酵素ドナーの2つの反応性アミノ酸残基へ
の共有結合を引き起こすのに適切な反応条件下で、β−
ガラクトシダーゼ酵素ドナーを架橋剤との混合物中で反
応させる工程、および架橋したペプチドを反応混合物か
ら単離する工程を包含する。
本発明のアッセイ方法は、通常、所望の試薬を適切な
緩衝液中に含むアッセイ媒体中で行われる。緩衝液の処
方は、一般に重要ではないが、分析物の存在下で酵素ド
ナーの線状化に影響を与える方法で、目的の分析物と分
子内架橋酵素ドナーとの間の相互作用を可能にしなくて
はならない。一般に、β−ガラクトシダーゼフラグメン
トの相補化と相容性である任意の緩衝液(リン酸緩衝
液、MOPS緩衝液などを含む)が許容され得る。本発明の
1つの実施態様では、緩衝液は、約100mM〜約300mMのリ
ン酸ナトリウム、約100mM〜約500mMの塩化ナトリウム、
約1mM〜約6mMの塩化マグネシウム、約5mM〜約15mMのEGT
A(エチレングリコール四酢酸)またはEDTA(エチレン
ジアミン四酢酸)、および約5mM〜約20mMのアジ化ナト
リウムの濃度を有し、約6〜約8のpHを有する。
緩衝液中に含むアッセイ媒体中で行われる。緩衝液の処
方は、一般に重要ではないが、分析物の存在下で酵素ド
ナーの線状化に影響を与える方法で、目的の分析物と分
子内架橋酵素ドナーとの間の相互作用を可能にしなくて
はならない。一般に、β−ガラクトシダーゼフラグメン
トの相補化と相容性である任意の緩衝液(リン酸緩衝
液、MOPS緩衝液などを含む)が許容され得る。本発明の
1つの実施態様では、緩衝液は、約100mM〜約300mMのリ
ン酸ナトリウム、約100mM〜約500mMの塩化ナトリウム、
約1mM〜約6mMの塩化マグネシウム、約5mM〜約15mMのEGT
A(エチレングリコール四酢酸)またはEDTA(エチレン
ジアミン四酢酸)、および約5mM〜約20mMのアジ化ナト
リウムの濃度を有し、約6〜約8のpHを有する。
キレート化剤が、金属触媒酸化から保護するために、
システインまたはメチオニン残基を含む任意のポリペプ
チドまたはタンパク質に添加され得る。金属イオンに対
するキレート化剤(例えば、EDTAまたはEGTA)の安定化
量を添加することが好ましい。アジ化ナトリウムのよう
な殺菌剤は、特に貯蔵の間の細菌の増殖を防ぐために、
存在し得る。
システインまたはメチオニン残基を含む任意のポリペプ
チドまたはタンパク質に添加され得る。金属イオンに対
するキレート化剤(例えば、EDTAまたはEGTA)の安定化
量を添加することが好ましい。アジ化ナトリウムのよう
な殺菌剤は、特に貯蔵の間の細菌の増殖を防ぐために、
存在し得る。
酵素活性のためのマグネシウムイオンまたは他のイオ
ン、システイン残基の切断を防ぐための試薬(例えばジ
チオスレイトール(DTT))、エチレングリコールのよ
うな可溶化剤、ならびにソルビトールおよびエチレンオ
キシドの脂肪酸縮合生成物(例えば、TWEEN 20(ICI
Americas,Inc.))のような非イオン性界面活性剤を含
む(これらに限定されない)他の材料が存在し得る。メ
チオニンおよびウシ血清アルブミン(BSA)もまた存在
し得る。
ン、システイン残基の切断を防ぐための試薬(例えばジ
チオスレイトール(DTT))、エチレングリコールのよ
うな可溶化剤、ならびにソルビトールおよびエチレンオ
キシドの脂肪酸縮合生成物(例えば、TWEEN 20(ICI
Americas,Inc.))のような非イオン性界面活性剤を含
む(これらに限定されない)他の材料が存在し得る。メ
チオニンおよびウシ血清アルブミン(BSA)もまた存在
し得る。
貯蔵安定性アッセイ媒体は、代表的には水性である。
酵素ドナーポリペプチドは、通常約2pM〜約5mMの濃度で
存在し、そして酵素アクセプターは、種々のモル過剰の
程度で存在する。
酵素ドナーポリペプチドは、通常約2pM〜約5mMの濃度で
存在し、そして酵素アクセプターは、種々のモル過剰の
程度で存在する。
サンプルは、有機または無機の目的とする任意の供給
源から得られ得る。サンプルは、一般的には液体である
が、固体物質の抽出物でもあり得る。本発明と組み合わ
せて使用され得るサンプルの量は、なかでも、分析物の
濃度、サンプルの性質、およびアッセイの精度に依存す
る。
源から得られ得る。サンプルは、一般的には液体である
が、固体物質の抽出物でもあり得る。本発明と組み合わ
せて使用され得るサンプルの量は、なかでも、分析物の
濃度、サンプルの性質、およびアッセイの精度に依存す
る。
アッセイ媒体の種々の試薬、サンプルおよび適切に架
橋された酵素ドナーポリペプチドを合わせて、反応混合
物を形成した後、媒体は、通常少なくとも0.2分間、そ
して通常約30分未満、好ましくは、約1分間〜約10分間
インキュベートされる。温度およびインキュベート期間
は、目的の分析物または化学的条件の能力に適合され、
分析物が存在する場合に適切な架橋酵素ドナーの切断を
もたらす能力を付与する。いくつかの方式では、さらな
るアッセイ組成物およびインキュベーションが必要であ
り得る。次いで、酵素アクセプターポリペプチドおよび
β−ガラクトシダーゼ基質は、一緒にまたは別々に添加
され、そして相補性活性が測定される。
橋された酵素ドナーポリペプチドを合わせて、反応混合
物を形成した後、媒体は、通常少なくとも0.2分間、そ
して通常約30分未満、好ましくは、約1分間〜約10分間
インキュベートされる。温度およびインキュベート期間
は、目的の分析物または化学的条件の能力に適合され、
分析物が存在する場合に適切な架橋酵素ドナーの切断を
もたらす能力を付与する。いくつかの方式では、さらな
るアッセイ組成物およびインキュベーションが必要であ
り得る。次いで、酵素アクセプターポリペプチドおよび
β−ガラクトシダーゼ基質は、一緒にまたは別々に添加
され、そして相補性活性が測定される。
β−ガラクトシダーゼにより切断された場合に吸光度
(光学密度)または発光量の検出可能な変化を生じる酵
素基質が、本発明の方法において用いられる。すなわ
ち、基質の切断は、分光光度分析、化学分析または蛍光
分析に適切な、着色、化学発光、または蛍光生成物の出
現または消失をもたらす。β−ガラクトシダーゼと共に
用いるのに適切な基質は、以下のものであるが、これら
に限定されない:p−アミノフェニル−β−D−ガラクト
ピラノシド、2′−N−(ヘキサデカノール)−N−
(アミノ−4′−ニトロフェニル)−β−D−ガラクト
ピラノシド、4−メチルウンベリフェリル−β−D−ガ
ラクトピラノシド、ナフチル−A−S−B1−β−D−ガ
ラクトピラノシド、2−ナフチル−A−S−B1−β−D
−ガラクトピラノシド−水和物、o−ナフチル−β−D
−ガラクトピラノシド、p−ナフチル−β−D−ガラク
トピラノシド、フェニル−β−D−ガラクトピラノシ
ド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D
−ガラクトピラノシド、レゾルフィン−β−D−ガラク
トピラノシド、7−ヒドロキシ−4−トリフルオロメチ
ルクマリン、ω−ニトロスチリル−β−D−ガラクトピ
ラノシド、フルオレセイン−β−D−ガラクトピラノシ
ド、クロロフェノールレッドβ−ガラクトシドなど。好
ましい基質は、クロロフェノールレッドβ−ガラクトシ
ド(CPRG)およびo−ニトロフェノール−β−D−ガラ
クトピラノシド(ONPG)である。酵素基質とのインキュ
ベーションは、基質の切断をもたらし、(好ましくは色
により)検出可能な生成物を産生する。
(光学密度)または発光量の検出可能な変化を生じる酵
素基質が、本発明の方法において用いられる。すなわ
ち、基質の切断は、分光光度分析、化学分析または蛍光
分析に適切な、着色、化学発光、または蛍光生成物の出
現または消失をもたらす。β−ガラクトシダーゼと共に
用いるのに適切な基質は、以下のものであるが、これら
に限定されない:p−アミノフェニル−β−D−ガラクト
ピラノシド、2′−N−(ヘキサデカノール)−N−
(アミノ−4′−ニトロフェニル)−β−D−ガラクト
ピラノシド、4−メチルウンベリフェリル−β−D−ガ
ラクトピラノシド、ナフチル−A−S−B1−β−D−ガ
ラクトピラノシド、2−ナフチル−A−S−B1−β−D
−ガラクトピラノシド−水和物、o−ナフチル−β−D
−ガラクトピラノシド、p−ナフチル−β−D−ガラク
トピラノシド、フェニル−β−D−ガラクトピラノシ
ド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D
−ガラクトピラノシド、レゾルフィン−β−D−ガラク
トピラノシド、7−ヒドロキシ−4−トリフルオロメチ
ルクマリン、ω−ニトロスチリル−β−D−ガラクトピ
ラノシド、フルオレセイン−β−D−ガラクトピラノシ
ド、クロロフェノールレッドβ−ガラクトシドなど。好
ましい基質は、クロロフェノールレッドβ−ガラクトシ
ド(CPRG)およびo−ニトロフェノール−β−D−ガラ
クトピラノシド(ONPG)である。酵素基質とのインキュ
ベーションは、基質の切断をもたらし、(好ましくは色
により)検出可能な生成物を産生する。
上記で他に記載されない限り、本発明において使用さ
れる試薬の相対量は、広範に変化し得、アッセイ方法の
感度を実質的に最適化し得る試薬の濃度を提供する。試
薬は、任意の賦形剤を含む、通常、凍結乾燥された乾燥
粉末として提供され得る。これは、溶解されると、本発
明のアッセイ方法を実施するために適切な濃度を有する
試薬溶液を提供する。
れる試薬の相対量は、広範に変化し得、アッセイ方法の
感度を実質的に最適化し得る試薬の濃度を提供する。試
薬は、任意の賦形剤を含む、通常、凍結乾燥された乾燥
粉末として提供され得る。これは、溶解されると、本発
明のアッセイ方法を実施するために適切な濃度を有する
試薬溶液を提供する。
実施例1:天然システイン残基を介するED28の分子内架橋 ED28は、90個のアミノ酸を含み、かつアミノ酸23位お
よび68位に2個のシステイン残基を含む酵素ドナーポリ
ペプチドである。23〜73位は、天然のβ−ガラクトシダ
ーゼのN末端を含む(N末端Met残基を「1」とする従
来のナンバリングを用いる)。ED28の配列はまた、米国
特許第4,708,929号(その作製方法を開示する)に開示
される。アミノ酸23位および68位における2つのシステ
イン残基の間にジスルフィド結合を形成することによ
り、それは分子内で結合された。
よび68位に2個のシステイン残基を含む酵素ドナーポリ
ペプチドである。23〜73位は、天然のβ−ガラクトシダ
ーゼのN末端を含む(N末端Met残基を「1」とする従
来のナンバリングを用いる)。ED28の配列はまた、米国
特許第4,708,929号(その作製方法を開示する)に開示
される。アミノ酸23位および68位における2つのシステ
イン残基の間にジスルフィド結合を形成することによ
り、それは分子内で結合された。
ED28(2.5mg)を、30%アセトニトリル(0.5ml)を含
有する50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.5)に溶解し
た。溶液を、39%アセトニトリルを含む30mMリン酸ナト
リウム(pH8.5)の5カラム容積で予め平衡化した、充
填済みのSEPHADEX G25高分子量精製カラム(NAP5、Ph
armacia.Inc.)に付与した。ED28を1mlの同じ緩衝液で
溶離した。この手順は、ジスルフィド結合形成を妨げる
ジチオスレイトールのような任意の低分子量の還元剤の
除去を確実にする。得られた溶液を撹拌しながら12時間
インキュベートし、その後ED28は約95%がジスルフィド
結合分子に転換された。
有する50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.5)に溶解し
た。溶液を、39%アセトニトリルを含む30mMリン酸ナト
リウム(pH8.5)の5カラム容積で予め平衡化した、充
填済みのSEPHADEX G25高分子量精製カラム(NAP5、Ph
armacia.Inc.)に付与した。ED28を1mlの同じ緩衝液で
溶離した。この手順は、ジスルフィド結合形成を妨げる
ジチオスレイトールのような任意の低分子量の還元剤の
除去を確実にする。得られた溶液を撹拌しながら12時間
インキュベートし、その後ED28は約95%がジスルフィド
結合分子に転換された。
架橋EDを、C4 RPLCカラム(Vydac Protein C4、25cm
×10mm)の逆相HPLCにより精製した。カラムを4ml/分の
流速で展開した。H2O中で0.1%トリフルオロ酢酸(TF
A)の弱溶離液を有する開始濃度、およびアセトニトリ
ル中で0.1%TFAの強溶離液を有する最終濃度を溶いる。
45分間の23〜33%の勾配を確率した。精製された分子内
架橋材料のサンプルを、還元剤DTTの10mM溶液で処理
し、そしてHPLCに再注入した。予想されたように、溶離
プロフィールは、線状化物質に対応した。
×10mm)の逆相HPLCにより精製した。カラムを4ml/分の
流速で展開した。H2O中で0.1%トリフルオロ酢酸(TF
A)の弱溶離液を有する開始濃度、およびアセトニトリ
ル中で0.1%TFAの強溶離液を有する最終濃度を溶いる。
45分間の23〜33%の勾配を確率した。精製された分子内
架橋材料のサンプルを、還元剤DTTの10mM溶液で処理
し、そしてHPLCに再注入した。予想されたように、溶離
プロフィールは、線状化物質に対応した。
システイン連結ED28ポリペプチドの相補的活性の阻害
を確認するために、CEDIAアッセイ(Microgenics Cor
p.、Concord CA)を、この材料を用いて、DTTの存在下
または非存在下で行った。架橋および線状のED28の溶液
(20pmol)を調製し、そして酵素アクセプターEA22(20
U/試験)(これは、13〜40位のアミノ酸欠失を有する相
補性β−ガラクトシダーゼフラグメントを含む)、およ
び緩衝溶液(リン酸水素二カリウム210mM;リン酸二水素
カリウム150mM;塩化ナトリウム400mM;EGTA 10mM;酢酸マ
グネシウム2mM;メチオニン10mM;TWEEN20 0.05%;PLURON
IC 101(BASF Corporation)0.001%;Dextran T40 4
%;ウシ血清アルブミン0.1%;アジ化ナトリウム10mM;
pH6.95)中のCPRG(2mg/ml)とともに、37℃で4分間イ
ンキュベートした。574nmの吸光度における速度を、4
分〜6分の間で、1分毎に測定した。結果を以下の表1
に示す。
を確認するために、CEDIAアッセイ(Microgenics Cor
p.、Concord CA)を、この材料を用いて、DTTの存在下
または非存在下で行った。架橋および線状のED28の溶液
(20pmol)を調製し、そして酵素アクセプターEA22(20
U/試験)(これは、13〜40位のアミノ酸欠失を有する相
補性β−ガラクトシダーゼフラグメントを含む)、およ
び緩衝溶液(リン酸水素二カリウム210mM;リン酸二水素
カリウム150mM;塩化ナトリウム400mM;EGTA 10mM;酢酸マ
グネシウム2mM;メチオニン10mM;TWEEN20 0.05%;PLURON
IC 101(BASF Corporation)0.001%;Dextran T40 4
%;ウシ血清アルブミン0.1%;アジ化ナトリウム10mM;
pH6.95)中のCPRG(2mg/ml)とともに、37℃で4分間イ
ンキュベートした。574nmの吸光度における速度を、4
分〜6分の間で、1分毎に測定した。結果を以下の表1
に示す。
表1 酵素ドナー 還元剤 mAU/分@574nm 架橋ED28 なし 42 架橋ED28 DTT 344.5 線状ED28 なし 346 線状ED28 DTT 345.2 これらの結果は、システイン連結のED28ポリペプチド
の相補性活性が、DTTを用いた化学的還元により線状化
されたED28の12%であったことを示す。DTTの存在また
は非存在は、新鮮な再構築された線状ED28に対し影響を
与えなかった。
の相補性活性が、DTTを用いた化学的還元により線状化
されたED28の12%であったことを示す。DTTの存在また
は非存在は、新鮮な再構築された線状ED28に対し影響を
与えなかった。
実施例2:ホモ二官能性の酸不安定架橋部分によるED28の
分子内架橋 酸不安定であるホモ二官能性架橋剤2,2−ビスマレイ
ミドエトキシプロパン(BMEP)(これは、Srinivasvach
ar、Biochemistry 28:2501(1989)の方法に従って作製
され得る)を用いて、ED28を架橋した。この架橋剤は、
スルフヒドリル基と速やかに、そして特異的に反応して
安定な共有結合を形成する2つのマレイミド基を含む。
2つのマレイミド基の間の結合は、架橋を酸不安定性に
するケタール部分を含む。この架橋剤は、ED28の2つの
システイン残基間で分子内架橋を形成するのに使用され
た。
分子内架橋 酸不安定であるホモ二官能性架橋剤2,2−ビスマレイ
ミドエトキシプロパン(BMEP)(これは、Srinivasvach
ar、Biochemistry 28:2501(1989)の方法に従って作製
され得る)を用いて、ED28を架橋した。この架橋剤は、
スルフヒドリル基と速やかに、そして特異的に反応して
安定な共有結合を形成する2つのマレイミド基を含む。
2つのマレイミド基の間の結合は、架橋を酸不安定性に
するケタール部分を含む。この架橋剤は、ED28の2つの
システイン残基間で分子内架橋を形成するのに使用され
た。
ED28(1.0mg)を、39%アセトニトリル(0.5ml)を含
む50mMリン酸ナトリウム緩衝溶液(pH7.0)に溶解し、
架橋を妨げるDTTのような任意の低分子量の還元剤を除
去した。溶液を30%アセトニトリルを含む30mMリン酸ナ
トリウム(pH7.5)の5カラム容積で予め平衡化した、
充填済みのSEPHADEX G25カラムに付与した。ED28を1ml
の同じ緩衝液で溶離した。この溶離液に、アセトニトリ
ル中のBMEPの11×0.1等価アリコート(全体積5μl)
を30分にわたって添加した。次いで、反応混合物を室温
で1時間インキュベートした。その後、出発物質は完全
に架橋生成物に転換された。
む50mMリン酸ナトリウム緩衝溶液(pH7.0)に溶解し、
架橋を妨げるDTTのような任意の低分子量の還元剤を除
去した。溶液を30%アセトニトリルを含む30mMリン酸ナ
トリウム(pH7.5)の5カラム容積で予め平衡化した、
充填済みのSEPHADEX G25カラムに付与した。ED28を1ml
の同じ緩衝液で溶離した。この溶離液に、アセトニトリ
ル中のBMEPの11×0.1等価アリコート(全体積5μl)
を30分にわたって添加した。次いで、反応混合物を室温
で1時間インキュベートした。その後、出発物質は完全
に架橋生成物に転換された。
BMEP架橋のED28を、C4 RPLCカラムの逆相HPLCにより
精製した。カラムを4ml/分の流速で展開した。24.5%の
強溶離アイソクラチック(isochratic)プロフィールを
用いて、H2O中の100mMトリエチルアンモニウムアセテー
ト(TEAA)の弱溶離液およびアセトニトリル強溶離液の
濃度を用いて、精製材料を溶離した。精製した材料を凍
結乾燥し、そして−80℃で貯蔵した。精製した材料のサ
ンプルを水中で再構成し、そしてpHを0.1M HClで2.0に
調整し、そして室温で3分間インキュベートした。次い
で、pHを緩衝溶液を用いて6.8に調整し(実施例1を参
照)、そして酵素アクセプタータンパク質との相補性活
性を、実施例1に記載のように測定した。結果を以下の
表IIに示す。
精製した。カラムを4ml/分の流速で展開した。24.5%の
強溶離アイソクラチック(isochratic)プロフィールを
用いて、H2O中の100mMトリエチルアンモニウムアセテー
ト(TEAA)の弱溶離液およびアセトニトリル強溶離液の
濃度を用いて、精製材料を溶離した。精製した材料を凍
結乾燥し、そして−80℃で貯蔵した。精製した材料のサ
ンプルを水中で再構成し、そしてpHを0.1M HClで2.0に
調整し、そして室温で3分間インキュベートした。次い
で、pHを緩衝溶液を用いて6.8に調整し(実施例1を参
照)、そして酵素アクセプタータンパク質との相補性活
性を、実施例1に記載のように測定した。結果を以下の
表IIに示す。
表II 酵素ドナー 処理 mAU/分@574nm 架橋ED28 なし 22.5 架橋ED28 pH2.0で3分間 925 線状ED28 なし 930 線状ED28 pH2.0で3分間 927 これらの結果は、未処理BMEP連結ED28は、酸処理した
BMEP連結ED28の2.5%の相補性活性を有することを示
す。従って、架橋したED28は、化学的架橋部分の穏やか
な酸加水分解により線状化され得る。線状ED28を用いる
対照実験では、3分間の酸前処理は、線状ED28の相補性
に影響を与えないことを示す。
BMEP連結ED28の2.5%の相補性活性を有することを示
す。従って、架橋したED28は、化学的架橋部分の穏やか
な酸加水分解により線状化され得る。線状ED28を用いる
対照実験では、3分間の酸前処理は、線状ED28の相補性
に影響を与えないことを示す。
実施例3:ED28のホモ二官能性架橋剤による分子内架橋お
よびエンドプロテアーゼGlu−Cでの架橋されたED28の
プラテアーゼ切断 本実施例は、アッセイ条件下で切断されない部分を使
用して架橋される酵素ドナーポリペプチドの構築および
使用を記載する。本実施例において、目的のプロテアー
ゼ分析物の認識配列は、架橋剤に組み込まれず、酵素ド
ナーのアミノ酸配列に組み込まれるか、あるいはこのN
末端またはC末端に結合される。これは、組換えDNA技
術により達成され得るか、または固相ペプチド合成技術
により達成され得る。これらの技術は、共に当業者に周
知である。プロテアーゼの作用は、プロテアーゼ認識部
位で架橋された酵素ドナーを切断する。これにより、分
子内架橋されたペプチドを線状化し、そして酵素アクセ
プターとの相補を可能にする。
よびエンドプロテアーゼGlu−Cでの架橋されたED28の
プラテアーゼ切断 本実施例は、アッセイ条件下で切断されない部分を使
用して架橋される酵素ドナーポリペプチドの構築および
使用を記載する。本実施例において、目的のプロテアー
ゼ分析物の認識配列は、架橋剤に組み込まれず、酵素ド
ナーのアミノ酸配列に組み込まれるか、あるいはこのN
末端またはC末端に結合される。これは、組換えDNA技
術により達成され得るか、または固相ペプチド合成技術
により達成され得る。これらの技術は、共に当業者に周
知である。プロテアーゼの作用は、プロテアーゼ認識部
位で架橋された酵素ドナーを切断する。これにより、分
子内架橋されたペプチドを線状化し、そして酵素アクセ
プターとの相補を可能にする。
この概念を示す。ED28を、ホモ二官能性架橋剤(ビス
−マレイミドヘキサン)で架橋した。この試薬の使用に
より、穏和な条件下でスルフヒドリル部分の不可逆性架
橋を生じる。Partis、J.Prot.Chem.2:263−77(1983)
を参照。1.0mgのED28を、50mMのリン酸ナトリウム緩衝
液(pH7.0、30%のアセトニトリルを含有)(0.5ml)に
溶解した。この溶液を、30mMのリン酸ナトリウム(pH7.
0、30%のアセトニトリルを含有)の5カラム容量で予
め平衡化した充填済みのSEPHADEX G25に付与した。ED28
を1mlの同じ緩衝液で溶出した。この溶離液に、アセト
ニトリル中のBMHの11×0.1当量アリコート(全容量5μ
l)を、30分間かけて添加した。次いで反応混合物を室
温で2時間インキュベートし、その後、出発物質は架橋
生成物に完全に変換された。
−マレイミドヘキサン)で架橋した。この試薬の使用に
より、穏和な条件下でスルフヒドリル部分の不可逆性架
橋を生じる。Partis、J.Prot.Chem.2:263−77(1983)
を参照。1.0mgのED28を、50mMのリン酸ナトリウム緩衝
液(pH7.0、30%のアセトニトリルを含有)(0.5ml)に
溶解した。この溶液を、30mMのリン酸ナトリウム(pH7.
0、30%のアセトニトリルを含有)の5カラム容量で予
め平衡化した充填済みのSEPHADEX G25に付与した。ED28
を1mlの同じ緩衝液で溶出した。この溶離液に、アセト
ニトリル中のBMHの11×0.1当量アリコート(全容量5μ
l)を、30分間かけて添加した。次いで反応混合物を室
温で2時間インキュベートし、その後、出発物質は架橋
生成物に完全に変換された。
BMH架橋されたED28は、C4 RPLCカラムの逆相HPLCによ
り精製した。カラムを、4ml/分の流速で展開した。28.5
%の強溶離液アイソクラチックプロフィールを用いて、
精製された物質を、H2O中の0.1%トリフルオロ酢酸(TF
A)弱溶離液およびアセトニトリル中の0.1%TFA強溶離
液の濃度を用いて溶出した。精製された物質を凍結乾燥
し、そして25mMの炭酸アンモニウム緩衝液(pH7.8)で
再構成した。次いで、緩衝化サンプルを10μgのエンド
プロテイナーゼGlu−Cプロテアーゼ(S.aureus V8由
来、Boehringer Mannheim)と、室温にて1時間インキ
ュベートした。酵素アクセプタータンパク質(50μl、
500U/ml)およびCPRG溶液(50μl、3mg/ml)を添加
し、プレートを37℃でインキュベートし、そして570nm
での吸光度を測定した。結果を以下の表IIIに示す。
り精製した。カラムを、4ml/分の流速で展開した。28.5
%の強溶離液アイソクラチックプロフィールを用いて、
精製された物質を、H2O中の0.1%トリフルオロ酢酸(TF
A)弱溶離液およびアセトニトリル中の0.1%TFA強溶離
液の濃度を用いて溶出した。精製された物質を凍結乾燥
し、そして25mMの炭酸アンモニウム緩衝液(pH7.8)で
再構成した。次いで、緩衝化サンプルを10μgのエンド
プロテイナーゼGlu−Cプロテアーゼ(S.aureus V8由
来、Boehringer Mannheim)と、室温にて1時間インキ
ュベートした。酵素アクセプタータンパク質(50μl、
500U/ml)およびCPRG溶液(50μl、3mg/ml)を添加
し、プレートを37℃でインキュベートし、そして570nm
での吸光度を測定した。結果を以下の表IIIに示す。
表III 試料I mAU/分@570nm プロテアーゼ処理なし 25 プロテアーゼ処理あり 713 このGlu−Cプロテアーは、グルタミン酸残基のC末
端側でペプチドを特異的に切断する。ゆえに、ED28のグ
ルタミン酸残基62および63に対するこのプロテアーゼの
特異性を、BMH部分によるよりはむしろそれらの位置
で、BMH架橋されたED28を線状化するのに利用した。架
橋された酵素ドナーポリペプチドをGlu−Cプロテアー
ゼで処理した場合、活性は劇的(約24倍)に増加した。
このことは、切断が起こったことを示す。
端側でペプチドを特異的に切断する。ゆえに、ED28のグ
ルタミン酸残基62および63に対するこのプロテアーゼの
特異性を、BMH部分によるよりはむしろそれらの位置
で、BMH架橋されたED28を線状化するのに利用した。架
橋された酵素ドナーポリペプチドをGlu−Cプロテアー
ゼで処理した場合、活性は劇的(約24倍)に増加した。
このことは、切断が起こったことを示す。
実施例4:ホモ二官能性ビスマレイミドアセタール架橋剤
の調製 N−(2−トリメチルシロキシエチル)−マレイミドの
合成 図1に示すように、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(10
0ml)中のエタノールアミン(1.8g、29.5mmol)の溶液
に、N−メトキシカルボニルマレイミド(95g、32.3mmo
l)を0℃で激しく撹拌しながら分割して添加した。混
合物を室温まで加温し、そして1時間撹拌した。混合物
のpHを、濃硫酸(5ml)を注意深く添加することにより
6〜7に調整した。得られた溶液を凍結乾燥し、そして
固体の残渣を、各抽出物を30分間撹拌することにより酢
酸エチル(2×400ml)で抽出した。酢酸エチル抽出物
を濾過により回収して、そして真空下でエバポレートし
てN−(2−ヒドロキシエチル)マレイミド(式I)
を、白色固体(4.0g、収率96%)として得た;薄層クロ
マトグラフィー(TLC)、Rf=0.27、酢酸エチル/石油
エーテル1:1。
の調製 N−(2−トリメチルシロキシエチル)−マレイミドの
合成 図1に示すように、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(10
0ml)中のエタノールアミン(1.8g、29.5mmol)の溶液
に、N−メトキシカルボニルマレイミド(95g、32.3mmo
l)を0℃で激しく撹拌しながら分割して添加した。混
合物を室温まで加温し、そして1時間撹拌した。混合物
のpHを、濃硫酸(5ml)を注意深く添加することにより
6〜7に調整した。得られた溶液を凍結乾燥し、そして
固体の残渣を、各抽出物を30分間撹拌することにより酢
酸エチル(2×400ml)で抽出した。酢酸エチル抽出物
を濾過により回収して、そして真空下でエバポレートし
てN−(2−ヒドロキシエチル)マレイミド(式I)
を、白色固体(4.0g、収率96%)として得た;薄層クロ
マトグラフィー(TLC)、Rf=0.27、酢酸エチル/石油
エーテル1:1。
乾燥ジクロロメタン(10ml)中のN−(2−ヒドロキ
シエチル)マレイミド(0.2g、1.41mmol)およびトリエ
チルアミン(0.22ml、1.57mmol)の溶液に、0℃にてク
ロロトリメチルシラン(TMS−Cl、0.2ml、1.57mmol)を
添加した。室温で1時間撹拌した後、TLC分析(酢酸エ
チル/石油エーテル1:1)は、1つのスポット(Rf=0.6
7)を示した。溶媒を真空下で除去し、残渣をジクロロ
メタン中に溶解し、そしてジクロロメタンで溶出する少
量のシリカゲルカラムを通して濾過した。生成物を含有
する画分をプールし、真空下でエバポレートして、N−
(2−トリメチルシロキシエチル)−マレイミド(式I
I)を、無色の薄片として得た(0.3g、収率100%)。
シエチル)マレイミド(0.2g、1.41mmol)およびトリエ
チルアミン(0.22ml、1.57mmol)の溶液に、0℃にてク
ロロトリメチルシラン(TMS−Cl、0.2ml、1.57mmol)を
添加した。室温で1時間撹拌した後、TLC分析(酢酸エ
チル/石油エーテル1:1)は、1つのスポット(Rf=0.6
7)を示した。溶媒を真空下で除去し、残渣をジクロロ
メタン中に溶解し、そしてジクロロメタンで溶出する少
量のシリカゲルカラムを通して濾過した。生成物を含有
する画分をプールし、真空下でエバポレートして、N−
(2−トリメチルシロキシエチル)−マレイミド(式I
I)を、無色の薄片として得た(0.3g、収率100%)。
4−マレイミドブチルアルデヒド(4−maleimidobutyr
aldehyde)の合成 図2に示すように、飽和炭酸水素緩衝液(100ml)中
の4−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール(5
g、31mmol)の溶液に、0℃(氷浴)にてN−メトキシ
カルボニルマレイミド(4.91g、31.6mmol)を添加し
た。15分後、テトラヒドロフラン(100ml)を室温で添
加し、そして得られた混合物を1時間撹拌した。次い
で、得られた混合物を1Nの塩酸でpH6〜7に酸性化し、
酢酸エチルで抽出した(3×200ml)。合わせた有機抽
出物を乾燥し(MgSO4)、そして真空下でエバポレート
した。粗生成物を、酢酸エチル/石油エーテル1:2で溶
出するシリカゲル60のクロマトグラフィーにより精製し
て、4−マレイミドブチルアルデヒドジエチルアセター
ルを、黄色オイルとして得た(4.31g;58%);TLC Rf=
0.65、酢酸エチル/ヘキサン1:1。
aldehyde)の合成 図2に示すように、飽和炭酸水素緩衝液(100ml)中
の4−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール(5
g、31mmol)の溶液に、0℃(氷浴)にてN−メトキシ
カルボニルマレイミド(4.91g、31.6mmol)を添加し
た。15分後、テトラヒドロフラン(100ml)を室温で添
加し、そして得られた混合物を1時間撹拌した。次い
で、得られた混合物を1Nの塩酸でpH6〜7に酸性化し、
酢酸エチルで抽出した(3×200ml)。合わせた有機抽
出物を乾燥し(MgSO4)、そして真空下でエバポレート
した。粗生成物を、酢酸エチル/石油エーテル1:2で溶
出するシリカゲル60のクロマトグラフィーにより精製し
て、4−マレイミドブチルアルデヒドジエチルアセター
ルを、黄色オイルとして得た(4.31g;58%);TLC Rf=
0.65、酢酸エチル/ヘキサン1:1。
テトラヒドロフラン(20ml)および水(0.5ml)中の
4−マレイミドブチルアルデヒドジエチルアセタール
(2g、8.29mmol)を、アルゴン下で撹拌し、そしてDOWE
X 50X8イオン交換樹脂(H+、2g、Dow Chemical Co.)
を添加した。室温で12時間撹拌した後、溶媒をデカント
し、乾燥し(MgSO4)、そして真空下でエバポレートし
て、4−マレイミドブチルアルデヒド(式III)を、黄
色オイル(放置すると速やかに凝固した)として得た
(1.38g、99%);TLC Rf=0.4、酢酸エチル/ヘキサン
1:1。4−マレイミドブチルアルデヒドは変化して極度
に不安定になるため、低温(0℃)で、かつ酸素を完全
に排除して(不活性雰囲気下)全ての処理を行うことが
必要であった。
4−マレイミドブチルアルデヒドジエチルアセタール
(2g、8.29mmol)を、アルゴン下で撹拌し、そしてDOWE
X 50X8イオン交換樹脂(H+、2g、Dow Chemical Co.)
を添加した。室温で12時間撹拌した後、溶媒をデカント
し、乾燥し(MgSO4)、そして真空下でエバポレートし
て、4−マレイミドブチルアルデヒド(式III)を、黄
色オイル(放置すると速やかに凝固した)として得た
(1.38g、99%);TLC Rf=0.4、酢酸エチル/ヘキサン
1:1。4−マレイミドブチルアルデヒドは変化して極度
に不安定になるため、低温(0℃)で、かつ酸素を完全
に排除して(不活性雰囲気下)全ての処理を行うことが
必要であった。
1,7−ビスマレイミド−4−0−(テトラアセチル−β
−D−ガラクトピラノシル)5−オキサヘプタンの合成 図3に示すように、乾燥ジクロロメタン(40ml)中の
4−マレイミドブチルアルデヒド(1.82g、11mmol)、
N−(2−トリメチルシロキシエチル)−マレイミド
(0.79g、3.5mmol)、1−トリメチルシリロキシ−2,3,
4,6−テトラ−0−アセチル−β−D−ガラクトピラノ
ース(1.52g、3.5mmol)およびモルキュラーシーブ(4
Å)の撹拌溶液に、TMSOTf(トリメチルシリルトリフレ
ート、0.67ml、3.5mmol)を、過酷な乾燥条件かつ不活
性雰囲気(アルゴン)下で−78℃にて添加した。反応混
合物を、1.5mlのトリエチルアミン/メタノール(1:1)
を2日後に添加することによりクエンチした。セライト
(Celite Corp.)(5g)濾過後、真空下で溶媒を除去
した。粗生成物を、クロマトグラフ(酢酸エチル/軽
油、1:1)を行い、1,7−ビスマレイミド−4−0−(テ
トラアセチル−β−D−ガラクトピラノシル)−5−オ
キサヘプタン(式IV)(1.78g、2.7mmol)を収率77%で
得た。
−D−ガラクトピラノシル)5−オキサヘプタンの合成 図3に示すように、乾燥ジクロロメタン(40ml)中の
4−マレイミドブチルアルデヒド(1.82g、11mmol)、
N−(2−トリメチルシロキシエチル)−マレイミド
(0.79g、3.5mmol)、1−トリメチルシリロキシ−2,3,
4,6−テトラ−0−アセチル−β−D−ガラクトピラノ
ース(1.52g、3.5mmol)およびモルキュラーシーブ(4
Å)の撹拌溶液に、TMSOTf(トリメチルシリルトリフレ
ート、0.67ml、3.5mmol)を、過酷な乾燥条件かつ不活
性雰囲気(アルゴン)下で−78℃にて添加した。反応混
合物を、1.5mlのトリエチルアミン/メタノール(1:1)
を2日後に添加することによりクエンチした。セライト
(Celite Corp.)(5g)濾過後、真空下で溶媒を除去
した。粗生成物を、クロマトグラフ(酢酸エチル/軽
油、1:1)を行い、1,7−ビスマレイミド−4−0−(テ
トラアセチル−β−D−ガラクトピラノシル)−5−オ
キサヘプタン(式IV)(1.78g、2.7mmol)を収率77%で
得た。
1,7−ビスマレイミド−4−0−(テトラアセチル−β
−D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘプタンの脱
保護 乾燥メタノール(20ml)中の1,7−ビスマレイミド−
4−0−(テトラアセチル−β−D−ガラクトピラノシ
ル)−5−オキサヘプタン(200mg、0.3mmol)の撹拌溶
液に、Zn(0Ac)2(60mg、0.3mmol)を添加した。溶液
を過酷な乾燥条件下で9時間還流した。tert−ブチルメ
チルエーテル(20ml)を室温で添加した。tert−ブチル
メチルエーテル/メタノール(1:1)(200ml)を用いて
セライト濾過(5g)し、真空下で溶媒をエバポレート
し、続いてクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノー
ル/トリエチルアミン、4:1:1)を行い、1,7−ビスマレ
イミド−4−0−(β−D−ガラクトピラノシル)−5
−オキサヘプタン(式IV)および1,7−ビス(3′−メ
トキシスクシンイミド)−4−0−(β−D−ガラクト
ピラノシル)−5−オキサヘプタン(式V)の混合物
を、1:2(145mg、0.29mmol)の比で収率99%にて得た。
Zn(OAc)2を80℃(p=0.001Torr)で24時間乾燥し
た。
−D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘプタンの脱
保護 乾燥メタノール(20ml)中の1,7−ビスマレイミド−
4−0−(テトラアセチル−β−D−ガラクトピラノシ
ル)−5−オキサヘプタン(200mg、0.3mmol)の撹拌溶
液に、Zn(0Ac)2(60mg、0.3mmol)を添加した。溶液
を過酷な乾燥条件下で9時間還流した。tert−ブチルメ
チルエーテル(20ml)を室温で添加した。tert−ブチル
メチルエーテル/メタノール(1:1)(200ml)を用いて
セライト濾過(5g)し、真空下で溶媒をエバポレート
し、続いてクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノー
ル/トリエチルアミン、4:1:1)を行い、1,7−ビスマレ
イミド−4−0−(β−D−ガラクトピラノシル)−5
−オキサヘプタン(式IV)および1,7−ビス(3′−メ
トキシスクシンイミド)−4−0−(β−D−ガラクト
ピラノシル)−5−オキサヘプタン(式V)の混合物
を、1:2(145mg、0.29mmol)の比で収率99%にて得た。
Zn(OAc)2を80℃(p=0.001Torr)で24時間乾燥し
た。
1,7−ビスマレイミド−4−0−(テトラアセチル−
β−D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘプタンを
用いて、β−ガラクトシダーゼ酵素ドナーおよびHIV ga
g配列からなる環状融合ペプチドを調製した。これは、
以下の実施例5に示すように構築した。
β−D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘプタンを
用いて、β−ガラクトシダーゼ酵素ドナーおよびHIV ga
g配列からなる環状融合ペプチドを調製した。これは、
以下の実施例5に示すように構築した。
実施例5:二重Cys−HIVペプチド含有酵素ドナーの調製 HIVプロテアーゼ認識部位もまた含む二重システイン
含有酵素ドナーポリペプチドを、組換えDNA技術および
固相ペプチド合成により調製した。
含有酵素ドナーポリペプチドを、組換えDNA技術および
固相ペプチド合成により調製した。
EA、EDおよび相補されたβ−ガラクトシダーゼの発現
のためにE.Coli AMA1004株(Casadaban、Methods in En
zymology 100:293、1983)を使用した。組換えクローン
の単離のためにE.Coli MC1061株(Meissner、Proc Nat
Acad Sci 84:4171、1987)を使用した。
のためにE.Coli AMA1004株(Casadaban、Methods in En
zymology 100:293、1983)を使用した。組換えクローン
の単離のためにE.Coli MC1061株(Meissner、Proc Nat
Acad Sci 84:4171、1987)を使用した。
オリゴヌクレオチドプライマーを、8残基(p17/p2
4)または10残基(p6/PR)のいずれかのHIVプロテアー
ゼ認識部位(クローン選択のためのHind III制限部位を
有する)の付加を伴う、プラスミドp187由来のED7とし
て知られるβ−ガラクトシダーゼα領域を増幅するため
に設計した。ED7−HIV p17/p24遺伝子(5′−GATACGAA
TTCTCAGAACTATCCGATCGTTCAGTCACTGGCCGTCGTTTTACAA−
3′)の増幅のためのN末端プライマーは、8残基HIV
プロテアーゼ認識部位を含んだ。
4)または10残基(p6/PR)のいずれかのHIVプロテアー
ゼ認識部位(クローン選択のためのHind III制限部位を
有する)の付加を伴う、プラスミドp187由来のED7とし
て知られるβ−ガラクトシダーゼα領域を増幅するため
に設計した。ED7−HIV p17/p24遺伝子(5′−GATACGAA
TTCTCAGAACTATCCGATCGTTCAGTCACTGGCCGTCGTTTTACAA−
3′)の増幅のためのN末端プライマーは、8残基HIV
プロテアーゼ認識部位を含んだ。
ED7−HIV p6/PR遺伝子の増幅のためのN末端プライマ
ー(5′GATACGAATTCTGTAAGCTTTAACTTTCCGCAGATCACCCTG
CTGGCCGTCGTTTTACAA−3′)は、10残基HIVプロテアー
ゼ認識部位を含んだ。両方の増幅に、C末端プライマー
KM1(5′−CTGGCTTAACTATGCGGCATC−3′)を使用し
た。PCR増幅を、94℃で1分の変性から始まり、続いて9
2℃で40秒間、65℃で40秒間、および75℃で1.5分間の40
サイクル、そして75℃で5分間の最終伸長工程を行うよ
うにして、MJ Reserch minicycler PTC−150で行った。
反応物は100μl容量であり、PCR Gems(Perkin/Elme
r)を用いてホットスタートとして行った。
ー(5′GATACGAATTCTGTAAGCTTTAACTTTCCGCAGATCACCCTG
CTGGCCGTCGTTTTACAA−3′)は、10残基HIVプロテアー
ゼ認識部位を含んだ。両方の増幅に、C末端プライマー
KM1(5′−CTGGCTTAACTATGCGGCATC−3′)を使用し
た。PCR増幅を、94℃で1分の変性から始まり、続いて9
2℃で40秒間、65℃で40秒間、および75℃で1.5分間の40
サイクル、そして75℃で5分間の最終伸長工程を行うよ
うにして、MJ Reserch minicycler PTC−150で行った。
反応物は100μl容量であり、PCR Gems(Perkin/Elme
r)を用いてホットスタートとして行った。
増幅されたDNAを、フェノール−クロロホルム抽出物
で清浄し、そしてエタノール中に沈殿させた。再懸濁さ
せた物質を、EcoR1およびSal1消化により平滑断端し、
そしてアガロースゲル電気泳動により精製した。ゲル精
製された挿入片DNAをp187 EcoR1/Sa1ベクターに連結し
た。得られたクローンは、ED7遺伝子の3′末端の近く
に位置するEcoR1部位に挿入された内部遺伝子融合カセ
ットとして、HIV p17/p24またはp6/PR切断部位のいずれ
かと共にED7遺伝子を有した。正確なクローンを、PCR生
成物中に位置するHind III部位の存在により同定し、そ
してDNA配列決定により確かめた。発現および精製のた
めに、ED7−HIV遺伝子を、BamH1/Sal1消化により、β−
ガラクトシダーゼのラージフラグメントEA46(ED7−HIV
遺伝子生成物とインビボで相補する)を有するBamH1/Sa
l1ベクター(p43)に転移した。
で清浄し、そしてエタノール中に沈殿させた。再懸濁さ
せた物質を、EcoR1およびSal1消化により平滑断端し、
そしてアガロースゲル電気泳動により精製した。ゲル精
製された挿入片DNAをp187 EcoR1/Sa1ベクターに連結し
た。得られたクローンは、ED7遺伝子の3′末端の近く
に位置するEcoR1部位に挿入された内部遺伝子融合カセ
ットとして、HIV p17/p24またはp6/PR切断部位のいずれ
かと共にED7遺伝子を有した。正確なクローンを、PCR生
成物中に位置するHind III部位の存在により同定し、そ
してDNA配列決定により確かめた。発現および精製のた
めに、ED7−HIV遺伝子を、BamH1/Sal1消化により、β−
ガラクトシダーゼのラージフラグメントEA46(ED7−HIV
遺伝子生成物とインビボで相補する)を有するBamH1/Sa
l1ベクター(p43)に転移した。
ED7−HIV p17/24、ED7−HIV p6/PR、およびEA46タン
パク質を、λPLプロモーターからプラスミドCI857リプ
レッサーの不活性化にまで40℃で誘導した。誘導の4時
間後、細胞を採取し、そして相補されたβ−ガラクトシ
ダーゼを40%硫酸アンモニウム沈殿、続いてQ−SEHAOS
Eのイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。相
補された酵素を、10Mの尿素中で変性し、そして組換えE
D−HIVタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーに
より6Mの尿素中で変性されたEA46から分離した。ED−HI
Vタンパク質を含む画分を、Amicon撹拌セルで濃縮し、
そして中性TRIS緩衝液中に透析した。いずれの残りの混
入タンパク質も、Q−SEPHAROSEのイオン交換クロマト
グラフィーを通して除去した。
パク質を、λPLプロモーターからプラスミドCI857リプ
レッサーの不活性化にまで40℃で誘導した。誘導の4時
間後、細胞を採取し、そして相補されたβ−ガラクトシ
ダーゼを40%硫酸アンモニウム沈殿、続いてQ−SEHAOS
Eのイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。相
補された酵素を、10Mの尿素中で変性し、そして組換えE
D−HIVタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーに
より6Mの尿素中で変性されたEA46から分離した。ED−HI
Vタンパク質を含む画分を、Amicon撹拌セルで濃縮し、
そして中性TRIS緩衝液中に透析した。いずれの残りの混
入タンパク質も、Q−SEPHAROSEのイオン交換クロマト
グラフィーを通して除去した。
標的ペプチドをまた、2−1H−ベンゾトリアゾル−1
−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフ
ルオロホスフェート(HBTU;ABI user bulletin ♯33)
で活性化されたFmoc保護アミノ酸を用いて、Applied Bi
osystems(ABI)モデル431A固相ペプチド合成機で合成
した。合成は0.25mmolのスケールで行い、そして予め充
填されたHMP樹脂を固相として使用した。脱保護および
カップリングの時間を製造者により推奨される標準時間
より長くした。以下のアミノ酸を使用した:Fmoc−Ala、
Fmoc−Arg(Pmc)、Fmoc−Asn(Trt)、Fmoc−Asp(OtB
u)、Fmoc−Cry(Trt)、Fmoc−Gln(Trt)、Fmoc−Glu
(OtBu)、Fmoc−Gly、Fmoc−His(Trt)、Fmoc−Leu、
Fmoc−Lys(Boc)、Fmoc−Phe、Fmoc−Pro、およびFmoc
−Ser(tBu)。N末端をアセチル化せず、そしてC末端
をカルボキシ形態で残した。
−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフ
ルオロホスフェート(HBTU;ABI user bulletin ♯33)
で活性化されたFmoc保護アミノ酸を用いて、Applied Bi
osystems(ABI)モデル431A固相ペプチド合成機で合成
した。合成は0.25mmolのスケールで行い、そして予め充
填されたHMP樹脂を固相として使用した。脱保護および
カップリングの時間を製造者により推奨される標準時間
より長くした。以下のアミノ酸を使用した:Fmoc−Ala、
Fmoc−Arg(Pmc)、Fmoc−Asn(Trt)、Fmoc−Asp(OtB
u)、Fmoc−Cry(Trt)、Fmoc−Gln(Trt)、Fmoc−Glu
(OtBu)、Fmoc−Gly、Fmoc−His(Trt)、Fmoc−Leu、
Fmoc−Lys(Boc)、Fmoc−Phe、Fmoc−Pro、およびFmoc
−Ser(tBu)。N末端をアセチル化せず、そしてC末端
をカルボキシ形態で残した。
粗ペプチド−樹脂の切断を、カルボニウムスカベンジ
ャー、水(4%)、チオアニソール(4%)、フェノー
ル(1.5%)、および1,2−エタンジチオール(2%)を
含有するTFA溶液中で3時間インキュベートすることに
より達成した。混合物を濾過し、エバポレートしてオイ
ルを得、そして冷ジエチルエーテルで沈殿させた。粗ペ
プチドの精製を、対イオンとして0.1%TFAを用いるVyda
c 2.2×300mm C18カラムおよび16〜41%のアセトニトリ
ル/水グラジエントを使用して逆相HPLCにより行った。
精製されたペプチドはSED35と称し、そしてVSFNFQITLプ
ロテアーゼ切断部位を含んだ。
ャー、水(4%)、チオアニソール(4%)、フェノー
ル(1.5%)、および1,2−エタンジチオール(2%)を
含有するTFA溶液中で3時間インキュベートすることに
より達成した。混合物を濾過し、エバポレートしてオイ
ルを得、そして冷ジエチルエーテルで沈殿させた。粗ペ
プチドの精製を、対イオンとして0.1%TFAを用いるVyda
c 2.2×300mm C18カラムおよび16〜41%のアセトニトリ
ル/水グラジエントを使用して逆相HPLCにより行った。
精製されたペプチドはSED35と称し、そしてVSFNFQITLプ
ロテアーゼ切断部位を含んだ。
実施例6:1,7−ビスマレイミド−4−0−(テトラアセ
チル−β−D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘプ
タンで架橋されたED7−HIV融合ペプチド 次いで、実施例5からのED7−HIV融合ペプチドを、1,
7−ビスマレイミド−4−0−(テトラアセチル−β−
D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘプタンで、こ
の融合ペプチドの残基10と53との間を共有結合すること
により架橋した。
チル−β−D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘプ
タンで架橋されたED7−HIV融合ペプチド 次いで、実施例5からのED7−HIV融合ペプチドを、1,
7−ビスマレイミド−4−0−(テトラアセチル−β−
D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘプタンで、こ
の融合ペプチドの残基10と53との間を共有結合すること
により架橋した。
ED7−HIV融合ペプチドED7−HIV p17/p24を、50mMリン
酸ナトリウム緩衝液(pH7.0(1ml))中で再構成し、そ
してこの溶液を充填済みのSEPHADEX G25カラムに付与し
た。融合ペプチドを、同じ緩衝液(1.5ml)で溶出し
た。362μg/mlの融合ペプチド(97%回収)を含む溶離
液に、アセトニトリル(全容量5μl、全量38μg)中
の11×0.1当量アリコートの1,7−ビスマレイミド−4−
0−(テトラアセチル−β−D−ガラクトピラノシル)
−5−オキサヘプタンを、30分間かけて添加した。次い
で、反応混合物を、室温で30分間インキュベートした。
酸ナトリウム緩衝液(pH7.0(1ml))中で再構成し、そ
してこの溶液を充填済みのSEPHADEX G25カラムに付与し
た。融合ペプチドを、同じ緩衝液(1.5ml)で溶出し
た。362μg/mlの融合ペプチド(97%回収)を含む溶離
液に、アセトニトリル(全容量5μl、全量38μg)中
の11×0.1当量アリコートの1,7−ビスマレイミド−4−
0−(テトラアセチル−β−D−ガラクトピラノシル)
−5−オキサヘプタンを、30分間かけて添加した。次い
で、反応混合物を、室温で30分間インキュベートした。
架橋されたED−HIV融合ペプチドを、溶媒Aとして100
mMのTEAA(pH6.5)および溶媒Bとしてアセトニトリル
を使用するVydac Protein C4(25cm×10mm)半分取HPLC
カラムを用いるHPLCにより精製した。カラムを、4ml/分
の流速で展開した。溶媒Bの22〜40%グラジエントを15
分間かけて確立した。線状ED−HIV融合ペプチドは、13
分の保持時間を示した。架橋されたED−HIV融合ペプチ
ドは、14.2分の保持時間を示した。生成物を含有する画
分をプールし、そして凍結乾燥した。架橋されたED−HI
V融合ペプチドの収量は155mgであった。
mMのTEAA(pH6.5)および溶媒Bとしてアセトニトリル
を使用するVydac Protein C4(25cm×10mm)半分取HPLC
カラムを用いるHPLCにより精製した。カラムを、4ml/分
の流速で展開した。溶媒Bの22〜40%グラジエントを15
分間かけて確立した。線状ED−HIV融合ペプチドは、13
分の保持時間を示した。架橋されたED−HIV融合ペプチ
ドは、14.2分の保持時間を示した。生成物を含有する画
分をプールし、そして凍結乾燥した。架橋されたED−HI
V融合ペプチドの収量は155mgであった。
相補活性を試験するために、線状ED−HIV融合ペプチ
ドおよび架橋されたED−HIV融合ペプチドのサンプル
を、アッセイ緩衝液中で再構成し、そしてマイクロタイ
タープレートを通じて連続希釈した。酵素アクセプター
(2050U/ml)およびCPRG(1mg/ml)(各50μl)を各ウ
ェルに添加し、そして570nmでの吸光度の変化を、Vmax
プレートリーダーで30秒ごとにモニターした。結果を以
下の表IVに示す: 表IV 酵素ドナー 濃度 mAU/分@570nm 線状ED−HIV融合ペプチド 1.84pmol 57.25 環状ED−HIV融合ペプチド 1.84pmol 1.29 線状ED−HIV融合ペプチド 3.68pmol 85.18 環状ED−HIV融合ペプチド 3.68pmol 2.17 これらの結果は、架橋された酵素ドナーの相補活性
が、線状酵素ドナーの相補活性の2.5%であったことを
示す。第2のHPLC精製を、一旦精製された物質を用いて
行い、そして再精製された環状ED−HIV融合ペプチド
を、このアッセイにおいて再び試験した。この試験にお
いて、環状ED−HIV融合ペプチドは、線状ED−HIV融合ペ
プチドが示した相補活性の0.04%のみを示した。これ
は、1回のみのHPLC精製後により高い活性が見られるこ
とは、おそらく線状ED−HIV混入の存在によることを示
す。
ドおよび架橋されたED−HIV融合ペプチドのサンプル
を、アッセイ緩衝液中で再構成し、そしてマイクロタイ
タープレートを通じて連続希釈した。酵素アクセプター
(2050U/ml)およびCPRG(1mg/ml)(各50μl)を各ウ
ェルに添加し、そして570nmでの吸光度の変化を、Vmax
プレートリーダーで30秒ごとにモニターした。結果を以
下の表IVに示す: 表IV 酵素ドナー 濃度 mAU/分@570nm 線状ED−HIV融合ペプチド 1.84pmol 57.25 環状ED−HIV融合ペプチド 1.84pmol 1.29 線状ED−HIV融合ペプチド 3.68pmol 85.18 環状ED−HIV融合ペプチド 3.68pmol 2.17 これらの結果は、架橋された酵素ドナーの相補活性
が、線状酵素ドナーの相補活性の2.5%であったことを
示す。第2のHPLC精製を、一旦精製された物質を用いて
行い、そして再精製された環状ED−HIV融合ペプチド
を、このアッセイにおいて再び試験した。この試験にお
いて、環状ED−HIV融合ペプチドは、線状ED−HIV融合ペ
プチドが示した相補活性の0.04%のみを示した。これ
は、1回のみのHPLC精製後により高い活性が見られるこ
とは、おそらく線状ED−HIV混入の存在によることを示
す。
実施例7:1,7−ビスマレイミド−4−0−(テトラアセ
チル−β−D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘプ
タンで架橋されたSED35−HIV融合ペプチド SED35は、固相ペプチド合成により生産される60残基
融合ペプチドである。これは、p6/PR HIV−1プロテア
ーゼ切断部位に相当するデカペプチドVSFNEPQITLおよび
HIV gag/polポリペプチドにおけるアミノ末端残基GGGC
からなる14残基N末端配列、およびED28の残基28〜73か
らなる46残基C末端配列を含む。
チル−β−D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘプ
タンで架橋されたSED35−HIV融合ペプチド SED35は、固相ペプチド合成により生産される60残基
融合ペプチドである。これは、p6/PR HIV−1プロテア
ーゼ切断部位に相当するデカペプチドVSFNEPQITLおよび
HIV gag/polポリペプチドにおけるアミノ末端残基GGGC
からなる14残基N末端配列、およびED28の残基28〜73か
らなる46残基C末端配列を含む。
5mMのEDTAおよび30%のアセトニトリルを含有する100
mMのリン酸緩衝液(pH6.5)中のSED35(0.5mg、75nmo
l)を、アセトニトリル(計57μg)中の6×0.2mol当
量の1,7−ビスマレイミド−4−0−(テトラアセチル
−β−D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘプタン
の5μlアリコートと、30分間かけて合わせた。次い
で、反応混合物を、室温で30分間インキュベートした。
mMのリン酸緩衝液(pH6.5)中のSED35(0.5mg、75nmo
l)を、アセトニトリル(計57μg)中の6×0.2mol当
量の1,7−ビスマレイミド−4−0−(テトラアセチル
−β−D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘプタン
の5μlアリコートと、30分間かけて合わせた。次い
で、反応混合物を、室温で30分間インキュベートした。
架橋されたED−HIV融合ペプチドを、溶媒Aとして100
mMのTEAA(pH6.5)および溶媒Bとしてアセトニトリル
を使用するVydac Protein C4(25cm×10mm)半分取HPLC
カラムを用いるHPLCにより精製した。カラムを、4ml/分
の流速で展開した。溶媒Bの35〜40%グラジエントを、
20分間かけて確立した。架橋されたED−HIV融合ペプチ
ドを含む画分をプールした。
mMのTEAA(pH6.5)および溶媒Bとしてアセトニトリル
を使用するVydac Protein C4(25cm×10mm)半分取HPLC
カラムを用いるHPLCにより精製した。カラムを、4ml/分
の流速で展開した。溶媒Bの35〜40%グラジエントを、
20分間かけて確立した。架橋されたED−HIV融合ペプチ
ドを含む画分をプールした。
実施例8:HIV−1プロテアーゼインヒビターを決定する
ためのELISAアッセイフォーマット ELISAプレートフォーマットを、キネティックマイク
ロタイタープレートリーダーを用いて種々のインヒビタ
ーのIC50値(酵素活性の50%減少を生じるインヒビター
濃度)を決定するために使用した。
ためのELISAアッセイフォーマット ELISAプレートフォーマットを、キネティックマイク
ロタイタープレートリーダーを用いて種々のインヒビタ
ーのIC50値(酵素活性の50%減少を生じるインヒビター
濃度)を決定するために使用した。
HIV gag/polポリペプチドのp6/PR切断部位に相当する
HIV−1基質配列VSFNFPQITLを含む架橋されたキメラペ
プチドSED35−HIV p6/PRのストック溶液を、プロテアー
ゼアッセイ緩衝液(100mM NaOAc、1M NaCl、0.1%BSA、
1mM EDTA、pH5.0)中、1μg/mlの濃度で調製した。組
換えHIVプロテアーゼもまた、プロテアーゼアッセイ緩
衝液中、10μg/mlの濃度で調製した。HIVプロテアーゼ
インヒビターを、ジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶
解し、そして10%のDMSOを含むプロテアーゼアッセイ緩
衝液中で作用濃度に希釈した。β−ガラクトシダーゼ酵
素アクセプタータンパク質EA22を、β−ガラクトシダー
ゼアッセイ緩衝液中に調製して、最終濃度500U/mlにし
た。CPRGを、3mg/mlの濃度でβ−ガラクトシダーゼアッ
セイ緩衝液中に溶解した。
HIV−1基質配列VSFNFPQITLを含む架橋されたキメラペ
プチドSED35−HIV p6/PRのストック溶液を、プロテアー
ゼアッセイ緩衝液(100mM NaOAc、1M NaCl、0.1%BSA、
1mM EDTA、pH5.0)中、1μg/mlの濃度で調製した。組
換えHIVプロテアーゼもまた、プロテアーゼアッセイ緩
衝液中、10μg/mlの濃度で調製した。HIVプロテアーゼ
インヒビターを、ジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶
解し、そして10%のDMSOを含むプロテアーゼアッセイ緩
衝液中で作用濃度に希釈した。β−ガラクトシダーゼ酵
素アクセプタータンパク質EA22を、β−ガラクトシダー
ゼアッセイ緩衝液中に調製して、最終濃度500U/mlにし
た。CPRGを、3mg/mlの濃度でβ−ガラクトシダーゼアッ
セイ緩衝液中に溶解した。
HIVプロテアーゼインヒビター94−001、94−002、94
−003、94−004、および94−005を、DMSO中に溶解し
て、ストック濃度394nM、78.8nM、および15.76nMにし
た。Ghoshら、J.Med.Chem.37:1177−88(1994)およびG
hoshら、J.Med.Chem.37:2506−8(1994)を参照のこ
と。組換えHIV−1プロテアーゼ(ホモダイマー、Mr=2
2,000)ストック溶液(10μl、4.54pmol)、プロテア
ーゼインヒビターストック溶液(10μl)、環状ED−HI
Vストック溶液(25μl、3.57pmol)、EA22溶液(50μ
l、25U)、およびCPRG溶液(50μl)を、ポリスチレ
ンマイクロタイタープレートのウェル中にピペットし
た。プレートを、37℃で5分間インキュベートし、次い
で、570nmでの吸光度を20分間モニターした。各インヒ
ビターのIC50値を、Vmax対時間のグラフから決定した。
(IC50は、インヒビターのKi値に比例する)。各インヒ
ビターについて見出された相対IC50値を、表Vに示す。
−003、94−004、および94−005を、DMSO中に溶解し
て、ストック濃度394nM、78.8nM、および15.76nMにし
た。Ghoshら、J.Med.Chem.37:1177−88(1994)およびG
hoshら、J.Med.Chem.37:2506−8(1994)を参照のこ
と。組換えHIV−1プロテアーゼ(ホモダイマー、Mr=2
2,000)ストック溶液(10μl、4.54pmol)、プロテア
ーゼインヒビターストック溶液(10μl)、環状ED−HI
Vストック溶液(25μl、3.57pmol)、EA22溶液(50μ
l、25U)、およびCPRG溶液(50μl)を、ポリスチレ
ンマイクロタイタープレートのウェル中にピペットし
た。プレートを、37℃で5分間インキュベートし、次い
で、570nmでの吸光度を20分間モニターした。各インヒ
ビターのIC50値を、Vmax対時間のグラフから決定した。
(IC50は、インヒビターのKi値に比例する)。各インヒ
ビターについて見出された相対IC50値を、表Vに示す。
表V インヒビター 相対IC50(nM) 94−001 5 94−002 4 94−003 2.5 94−004 3 94−005 7.5 実施例9:HIV−1プロテアーゼインヒビターを決定する
ためのCOBAS MIRAアッセイフォーマット 3つの試薬アッセイシステムを、種々のインヒビター
のIC50濃度を決定するために使用した。COBAS MIRA分析
器(Roche Diagnostic Systems,Inc.,Nutley,NJ)を
使用した。
ためのCOBAS MIRAアッセイフォーマット 3つの試薬アッセイシステムを、種々のインヒビター
のIC50濃度を決定するために使用した。COBAS MIRA分析
器(Roche Diagnostic Systems,Inc.,Nutley,NJ)を
使用した。
サンプル(インヒビター94−001、94−002、94−003
または94−004)を、10%DMSOで改変されたHIVプロテア
ーゼ緩衝液(10mM酢酸ナトリウム、1M NaCl、1mM EDT
A、0.1%BSA、pH5.0)で希釈して、10の希釈係数で45.3
mMから4.53nMまでの最終試薬インヒビター濃度を得た。
または94−004)を、10%DMSOで改変されたHIVプロテア
ーゼ緩衝液(10mM酢酸ナトリウム、1M NaCl、1mM EDT
A、0.1%BSA、pH5.0)で希釈して、10の希釈係数で45.3
mMから4.53nMまでの最終試薬インヒビター濃度を得た。
試薬1(R1)は、HIVプロテアーゼ緩衝液中、45nMの
試薬濃度に希釈したHIVプロテアーゼを含んだ。
試薬濃度に希釈したHIVプロテアーゼを含んだ。
試薬2(R2)は、HIVプロテアーゼ緩衝液中、0.30mM
の架橋された酵素ドナーSED35および43mg/mlのCPRGを含
んだ。
の架橋された酵素ドナーSED35および43mg/mlのCPRGを含
んだ。
試薬3(R3)は、1315U/mlの試薬濃度に希釈したEA22
を含んだ。
を含んだ。
COBAS MIRA装置を、10μlのサンプルを送るように、
そして時刻1(T=0分)に100mlのR1、時刻2(T=
2分)に10mlのR2、および時刻3(T=7分)に95mlの
R3を送るようにプログラムした。速度(種々の時間間隔
内における吸光度の変化)は、時刻4(T=9〜11分)
で得た。これらの値を使用して速度対インヒビター濃度
の対数のグラフを作成し、IC50値を決定した。全てのア
ッセイを、37℃で行った。表VIに示すインヒビター94−
001のデータを例として挙げる。
そして時刻1(T=0分)に100mlのR1、時刻2(T=
2分)に10mlのR2、および時刻3(T=7分)に95mlの
R3を送るようにプログラムした。速度(種々の時間間隔
内における吸光度の変化)は、時刻4(T=9〜11分)
で得た。これらの値を使用して速度対インヒビター濃度
の対数のグラフを作成し、IC50値を決定した。全てのア
ッセイを、37℃で行った。表VIに示すインヒビター94−
001のデータを例として挙げる。
表VI インヒビター濃度(M) 速度(mAU/分) 2.1×10-7 849 2.1×10-5 247 2.1×10-3 90 このデータを使用して、速度対インヒビター濃度の対
数のグラフを作成し、そしてカーブフィッティングプロ
グラムを適用して、対数の直線方程式を求めた。この場
合、f(x)=−169*ln(x)+602、またはf(y)
=−9.19*ln(y)+60.9である。次いで、速度データ
の中点(50%応答)を決定し、そしてこの値をf(y)
方程式に代入し、IC50濃度を求めた。ここで、中間値は
470mAU/分であり、そしてIC50値は4.35nMであった。ア
ッセイにおけるこの結果を、表VIIに示す。
数のグラフを作成し、そしてカーブフィッティングプロ
グラムを適用して、対数の直線方程式を求めた。この場
合、f(x)=−169*ln(x)+602、またはf(y)
=−9.19*ln(y)+60.9である。次いで、速度データ
の中点(50%応答)を決定し、そしてこの値をf(y)
方程式に代入し、IC50濃度を求めた。ここで、中間値は
470mAU/分であり、そしてIC50値は4.35nMであった。ア
ッセイにおけるこの結果を、表VIIに示す。
表VII インヒビター♯ IC50(nM) 参照 9.00 1 4.35 2 5.11 3 4.30 4 4.41 本明細書中で言及される全ての刊行物および特許出願
は、各刊行物または特許出願が、参考として援用される
ように具体的および個々に示される場合と同じ程度に、
本明細書中で参考として援用される。本発明は十分に記
載され、本発明に対し、多くの変化および改変が添付の
請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく行わ
れることが当業者に明らかである。
は、各刊行物または特許出願が、参考として援用される
ように具体的および個々に示される場合と同じ程度に、
本明細書中で参考として援用される。本発明は十分に記
載され、本発明に対し、多くの変化および改変が添付の
請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく行わ
れることが当業者に明らかである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C07C 331/10 C07D 207/452 C07H 15/04 CA(STN) REGISTRY(STN)
Claims (10)
- 【請求項1】式W−(CH2)n−X−CH(OY)−(CH2)
n−Zの架橋剤であって、ここで: 各WおよびZは、マレイミド、スクシンイミド、および
チオシアネートからなる群から独立して選択される官能
基であり; nは、1〜10の数であり; Xは、酸素、イオウ、または窒素であり;そして Yは、グリコシド、ホスフェート、ブチレート、および
アセテートからなる群から選択される酵素的に切断可能
な部分である。 - 【請求項2】前記酵素的に切断可能な部分が、必要に応
じてアセチル化されているグリコシドである、請求項1
に記載の架橋剤。 - 【請求項3】前記酵素的に切断可能な部分が、ガラクト
ース、マンノース、およびグルコースからなる群から選
択される、請求項2に記載の架橋剤。 - 【請求項4】以下の式の、請求項1または2に記載の架
橋剤: ここで、各Rは独立して、ヒドロキシまたはアセテート
である。 - 【請求項5】1,7−ビスマレイミド−4−0−(テトラ
アセチル−β−D−ガラクトピラノシル)−5−オキサ
ヘプタンおよび1,7−ビスマレイミド−4−0−(β−
D−ガラクトピラノシル)−5−オキサヘプタンからな
る群から選択される化合物である、請求項1に記載の架
橋剤。 - 【請求項6】架橋タンパク質を形成する方法であって、
該タンパク質を、請求項1〜5のいずれかに記載の架橋
剤と接触させる工程を含む、方法。 - 【請求項7】前記タンパク質が、酵素の一部である、請
求項6に記載の方法。 - 【請求項8】前記タンパク質が、β−ガラクトシダーゼ
の酵素ドナーである、請求項7に記載の方法。 - 【請求項9】請求項1〜5のいずれかに記載の架橋剤を
用いて架橋した酵素部分。 - 【請求項10】サンプル中の酵素の存在または量を測定
する方法であって、該サンプル中の任意の酵素を、請求
項1〜5のいずれかに記載の架橋剤を用いて架橋されて
いる酵素部分と接触させる工程を包含し、ここで、該架
橋剤の前記酵素的に切断可能な部分が、測定されるべき
該酵素により切断可能である、方法。
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---|---|---|---|
US59201596A | 1996-01-26 | 1996-01-26 | |
US08/592,015 | 1996-01-26 | ||
US592,015 | 1996-01-26 |
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JPH10508040A JPH10508040A (ja) | 1998-08-04 |
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AU (1) | AU1837897A (ja) |
DE (1) | DE69709448T2 (ja) |
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GB0125658D0 (en) * | 2001-10-25 | 2001-12-19 | Ssl Int Plc | Medicaments |
US7993749B2 (en) * | 2005-12-16 | 2011-08-09 | University Of Kansas | Nanoparticles comprising a nanoparticle template and a polymer shell having an amide side chain, and method of making thereof |
WO2011056799A1 (en) * | 2009-11-05 | 2011-05-12 | Sangart, Inc. | Methods for preparing polyethylene glycol maleimide using n-(2-hydroxyethyl) maleimide as a starting material |
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US4708929A (en) * | 1984-10-29 | 1987-11-24 | Microgenics Corporation | Methods for protein binding enzyme complementation assays |
AU592324B2 (en) * | 1984-10-29 | 1990-01-11 | Roche Diagnostics Corporation | Mehods for protein binding enzyme complementation assays |
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US5166322A (en) * | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
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EP0419081A3 (en) * | 1989-09-22 | 1992-07-22 | Microgenics Corporation | Method for protein binding enzyme complementation assays |
US5011910A (en) * | 1989-12-28 | 1991-04-30 | Washington University | Reagent and method for determining activity of retroviral protease |
US5164300A (en) * | 1989-12-28 | 1992-11-17 | Washington University | Method for determining activity of retroviral protease |
EP0497949A1 (de) * | 1990-08-28 | 1992-08-12 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Testsystem zur aktivitätsüberprüfung viraler proteinasen |
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CA2068190C (en) * | 1991-05-15 | 1996-12-17 | Microgenics Corporation | Methods and compositions for enzyme complementation assays using the omega region of beta-galactosidase |
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US5506115A (en) * | 1994-04-29 | 1996-04-09 | G. D. Searle & Co. | Reagent and method for determining activity of herpes protease |
AU702122B2 (en) * | 1994-10-25 | 1999-02-11 | Merck & Co., Inc. | Microbial synthesis of HIV protease inhibitors |
US5861267A (en) * | 1995-05-01 | 1999-01-19 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Methods, nucleotide sequences and host cells for assaying exogenous and endogenous protease activity |
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