JPH10508040A

JPH10508040A - ビス−マレイミド架橋剤

Info

Publication number: JPH10508040A
Application number: JP9527023A
Authority: JP
Inventors: マイケルジェイ．ポウェル，; ルッツエフ．ティーツェ，
Original assignee: ベーリンガーマンハイムコーポレイション
Priority date: 1996-01-26
Filing date: 1997-01-23
Publication date: 1998-08-04
Anticipated expiration: 2017-01-23
Also published as: WO1997027203A1; AU1837897A; EP0817789B1; JP2863638B2; DE69709448D1; ES2170937T3; ATE211480T1; EP0817789A1; US5976783A; DE69709448T2

Abstract

(57)【要約】 β-ガラクトシダーゼの酵素ドナーポリペプチドフラグメント中で分子内架橋を形成し、それにより、酵素アクセプターフラグメントとの相補性を妨害する環状酵素ドナーを形成し、活性なβ-ガラクトシダーゼを形成する。環状酵素ドナーは、相補性活性を回復させるために、切断により線状化され得る。このような環状酵素ドナーが特定の分析物により線状化されるアッセイ、および以下の式の新規なホモ二官能性ビスマレイミド架橋剤を開示する：

Description

【発明の詳細な説明】ビス−マレイミド架橋剤発明の背景本発明は、β-ガラクトシダーゼのポリペプチドフラグメントの相補性による分析物（analyte）の検出に有用な化合物、組成物および方法に関する。詳細には、本発明は、架橋剤β-ガラクトシダーゼの酵素ドナーポリペプチド内での分子内架橋の形成、およびサンプル中の分析物の検出および定量におけるこのような組成物の使用に関する。過去に、種々の合成および天然の抗原性ポリペプチドならびにポリペプチドフラグメントが、二官能性架橋剤を用いて、高分子量タンパク質キャリア（例えば、ラテックス官能基化SEPHAROSE（Pharmacia，Inc.）、破傷風毒素、キーホールリンペットヘモシアニン、アガロース、およびセルロース）、検出可能な標識（例えば、蛍光団）、および化学療法の薬剤に、結合されてきた。米国特許第4,49 3,795号、およびPCT公開WO 90/05749号（1990年５月31日発行）がその例である。このような架橋剤はまた、生物活性または細胞傷害性の薬剤、色素、放射性化合物などを抗体分子に結合させるために使用されている。米国特許第4,671,958 号がその例である。抗体は、このような薬剤を用いてともに結合される。Chen、Res ．Virol．141 :337-42(1990)を参照のこと。架橋剤はまた、生物活性でかつ治療に有用なポリペプチドを、ポリエチレングリコールのようなポリマーと結合させることにより修飾し、薬物動態学的特性を増強するための用途が見出されている。米国特許第5,166,322号、同第4,179,337号、および同第4,766,106号がその例である。 β-ガラクトシダーゼは、約116,000ダルトンのモノマー分子量を有する４量体タンパク質である。このモノマーは、1023個のアミノ酸からなる。シストロン内性（intracistoronic）相補性は、酵素の個々の不活性なペプチドフラグメントが自発的に会合して、活性なβ-ガラクトシダーゼタンパク質を形成する、公知の現象である。徹底的に研究された最初のβ-ガラクトシダーゼ相補性対は、 LangleyおよびZabin、Biochemistry 15：4866(1976)により記載されるM15/CNBr2 系であった。M15は、アミノ酸11〜41が欠失しているβ-ガラクトシダーゼの欠失変異体である。CNBr2ペプチドは、β-ガラクトシダーゼのアミノ酸３〜92からなり、そしてインタクトな（intact）酵素の臭化シアン切断により調製される。個々に不活性であるM15およびCNBr2が、適切な条件下で一緒にインキュベートされる場合、２つのペプチドは互いに相補または会合して、完全に活性な４量体β- ガラクトシダーゼを形成する。この系において、CNBr2（Ｎ末端ペプチド）は、 α-酵素ドナーと呼ばれる。Ｎ末端欠失を有するM15は、α-酵素アクセプターと呼ばれる。β-ガラクトシダーゼのドメインの再会合を用いて、不活性フラグメントから活性β-ガラクトシダーゼを形成する一般的な現象は、相補性と呼ばれる。α-酵素ドナーとα-酵素アクセプターとの他の組み合わせが記載される。Za bin、Mol ．and Cellular Biochem 49:84(1982)を参照のこと。各々は、天然のβ -ガラクトシダーゼ配列に由来する変異体である。Ｃ末端ペプチドおよび対応するＣ末端欠失タンパク質との相補性がまた記載される。ω-相補性として公知であるこの現象の例は、X-90（Ｃ末端において10個のアミノ酸が欠失しているβ-ガラクトシダーゼ欠失変異体）、およびCNBr24（ β-ガラクトシダーゼのアミノ酸990〜1021からなるペプチド）である。α-相補性の場合、ω-酵素ドナーポリペプチドおよびω-酵素アクセプタータンパク質は不活性であるが、再会合して酵素的に活性な４量体を形成する。Welphy、Bioche m ．Biophys．Res．Comm．93 :223(1980)を参照のこと。 β-ガラクトシダーゼ相補性活性は、高分子量または低分子量の分析物の両方についての高感度な定量アッセイを産生するために利用されている。米国特許第 5,362,625号および同第4,708,929号は、とりわけ、抗体およびレセプター結合アッセイにおける使用のための種々の酵素ドナーおよび酵素アクセプターポリペプチド組成物を開示する。酵素ドナーおよび酵素アクセプターは、当業者に熟知の組換えDNA技術またはポリペプチド合成技術により産生される。これらのアプローチは、酵素ドナーおよび酵素アクセプター分子の設計に対し、大きな柔軟性および制御を可能にする。遺伝子操作技術の使用は、酵素ドナーおよび酵素アクセプターのポリペプチドの配列および長さを、アッセイの性能および薬剤安定性を最適化するように改変することを可能にする。分析物に化学結合するために最適化された酵素ドナーおよび分析物のペプチドまたはタンパク質に遺伝子的に融合された酵素ドナーが記載され、そしてこれらの組成物を用いるイムノアッセイは市販されている。Henderson，Clin ．Chem．32:1637(1986); Khan na、Amer ．Clin．Lab 8：14(1989)およびCoty、J ．Clin．Immunoassay 17:144(1 994)を参照のこと。この領域の当該技術により記載されない１つの問題は、これらの相補性アッセイにおけるバックグラウンドの干渉を低減することを含む。酵素ドナーおよび酵素アクセプター分子は自発的に結合して活性な分子を形成するので、従来は、未改変酵素ドナーまたは酵素アクセプターフラグメントに結合する抗体またはレセプターは、このような望ましくない相補性を阻害した。このアプローチは完全には成功しなかった。発明の要旨本発明は、分子内で架橋する酵素ドナーポリペプチドを使用する相補性アッセイのための材料および方法を提供する。「酵素ドナー」または「酵素ドナーポリペプチド」は、酵素アクセプターと結合または会合して、活性なβ-ガラクトシダーゼ酵素を形成し得るペプチド配列を含む、β-ガラクトシダーゼの酵素的に不活性なポリペプチドフラグメントを意味する。「酵素アクセプター」または「酵素アクセプターポリペプチド」は、酵素ドナーと結合または会合する場合、相補性のプロセスにより活性なβ-ガラクトシダーゼを形成し得る、β-ガラクトシダーゼ遺伝子の欠失変異体により産生されるβ-ガラクトシダーゼの酵素的に不活性なポリペプチドフラグメントを意味する。分子内で架橋した酵素ドナーを使用するこれらのアッセイは、分子内架橋を酵素ドナーポリペプチドに導入することで、酵素ドナーポリペプチドと酵素アクセプターとの間の相補性を大いに低減できるかまたは阻害できるという、本発明者によりなされた観察に基づく。「架橋」または「分子内架橋」は、酵素ドナーポリペプチド中の２つの反応性アミノ酸残基の間にある架橋剤の化学的共有結合、そしてそれによってポリペプチドを環状構造を与えることを意味する。このような架橋酵素ドナーは、本明細書中で「環状酵素ドナー」とも呼ばれる。完全な相補的活性は、環状ポリペプチドを切断または開裂することによって回復し得、それによってポリペプチドを線状化し得ることも、また観察された。この現象は、分子内で架橋したドナーペプチドまたは環状ペプチドが、特定の分析物の作用により、あるいは特定の分析物の存在のために線状化され得る場合のアッセイ形式において有用である。前述の系に対するこの系の顕著な利点は、固有のバックグラウンドシグナルが極度に低いことである。架橋分子の相補活性を最小化するように、遺伝子操作技術を用いて、酵素ドナー架橋点を配置し得る。本発明者らは、理論に束縛されることを意図しないが、酵素アクセプターペプチドと会合して活性な酵素を形成することを可能にするコンフォメーションによって、架橋した酵素ドナーペプチドが立体的に阻害されると推測する。ペプチドは、アミド（ペプチド）結合によって２つ以上のアミノ酸の結合によって形成される任意の化合物であり、通常、各α-アミノ酸残基（NH₂-末端は除く）のα-アミノ基が、直鎖内で次の残基のα-カルボキシル基に結合する、α- アミノ酸のポリマーである。用語ペプチド、ポリペプチド、およびポリ（アミノ酸）は、サイズに関して制限されないこの化合物のクラスを述べるために、本明細書で同義的に使用される。このクラスの最も大きなメンバーは、タンパク質と言われる。複合体は、弱い結合または他の力で一緒に保持されている化学的化合物または部分の可逆的な会合であり、例えば、酵素基質複合体（酵素と１つ以上の基質との会合は、酵素触媒反応における反応部分である）、抗原-抗体複合体、ハプテン-抗体複合体、または酵素ドナーと酵素アクセプターとの相補性により形成されるβ-ガラクトシダーゼの活性酵素複合体である。本発明の別の局面は、架橋した酵素ドナーポリペプチドを作製するための方法、新規なホモ二官能性ビスマレイミド架橋剤、および架橋した酵素ドナーポリペプチドを用いるアッセイ方法を包含する。本発明の他の局面および利点は、その実施の例示的実施例を包含する以下の発明の詳細な説明を考慮することにより明らかになる。図面の簡単な説明本発明は、本明細書の一部を形成する図面と組み合わせて考慮する場合に、以下の発明の詳細な説明を参照することにより、よりよく理解される。図１は、N-(2-トリメチルシロキシエチル)-マレイミドの調製のための特定の合成スキームを示す。図２は、4-マレイミドブチルアルデヒドの調製のための特定の合成スキームを示す。図３は、1,7-ビスマレイミド-4-O-(テトラアセチル-β-D-ガラクトピラノシル )-5-オキサヘプタンおよび1,7-ビス-(3'-メトキシスクシンイミド)-4-O-(β-D- ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタンの調製のための特定の合成スキームを示す。発明の詳細な説明本発明は、第１に、β-ガラクトシダーゼの架橋酵素ドナーポリペプチド配列を提供する。本発明の架橋β-ガラクトシダーゼ酵素ドナーポリペプチドは、架橋部分を含む架橋剤の結合を可能にする反応性アミノ酸残基を含むβ-ガラクトシダーゼ配列を包含する。このような部分への結合を可能にする反応性アミノ酸残基は、α-またはε-アミノ基（例えば、リジン）、α-、β-、またはγ-カルボキシル基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）、チオール基（例えば、システイン）、および芳香環（例えば、ヒスチジンまたはチロシン）である。架橋部分は、架橋剤の不可欠な部分であり、そして架橋剤を反応性アミノ酸残基に共有結合し得る化学的部分または官能基を含む。例えば、タンパク質およびペプチドのチオール基を共有結合させるのに有用な架橋剤は、ビスマレイミドヘキサン（BMH）である。この架橋剤は、ヘキサメチレンの各末端に結合したマレイミド架橋部分を有するヘキサメチレン部分を含む。他の架橋剤の例は、Chemis try of Protein Conjugation and Cross-Linking 、S.S.Wong、CRC Press、1993 に記載される。酵素ドナーポリペプチド中の反応性アミノ酸のアミン基は、架橋剤のアミノ基反応性部分との反応により架橋され得る。N-ヒドロキシスクシンイミド、ジメチルスベリミデート、フェニルジイソシアネート、フェニルジイソチオシアネート、ジフルオロジニトロベンゼン、および塩化シアンは、架橋剤の例である。反応性アミノ酸のチオール基は、架橋剤のスルフヒドリル反応性部分との反応により架橋され得る。この例としては、S-ピリジル、マレイミド、およびブロモアセチル部分がある。反応性アミノ酸のカルボキシル基は、カルボジイミドまたはヒドラジド部分との反応により架橋され得る。架橋部分は、架橋が適切な残基の間で達成されるようなホモ二官能性またはヘテロ二官能性であり得、好ましくは、酵素ドナーのＮ末端残基およびＣ末端残基上か、またはその近傍で達成される。従って、この架橋剤は、酵素ドナーポリペプチドの所望するアミノ酸残基のアミノ基、チオール基、カルボキシル基、または芳香族基に化学的に共有結合し得る２つの反応性基を有する。酵素ドナーは、挿入されたカセットまたは認識部分を含み得、その性質は、架橋した酵素ドナーポリペプチドが使用される適用に依存する。認識部分は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼまたはグリコシダーゼの認識配列を含むという利点により酵素または特異的プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、あるいはエンドグリコシダーゼにより切断可能なペプチド配列または核酸配列を含み得る。あるいは、認識部分は、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、アミダーゼ、またはエステラーゼのような特異的な加水分解酵素の基質認識部分を含み得る。HIV-1およびHIV-2プロテアーゼ、コクサッキーウイルスプロテアーゼ、およびヘルペスウイルスプロテアーゼなどのウイルスプロテアーゼは、宿主の細胞タンパク質の特異的ペプチド基質配列を認識する。感染性ビリオンを形成するためのgagおよびgag-polタンパク質のタンパク質分解プロセシングを担うので、HIV-1プロテアーゼは特に関心を集めている。Kramer、Science 231:1580(1986)およびKohl、Proc ．Natl．Acad． Sci．85 :4686(1988)を参照のこと。HIVプロテアーゼは、Pr55gag p17/p24切断部分に対応するオクタペプチド配列SQNYPIVQ、およびgag-polタンパク質のp6/PR切断部分に対応するデカペプチド配列VSFNFPQITLを認識し、そして切断する。Krau sslich、Proc ．Nat．Acad．Sci．86:807-11(1989)を参照のこと。従って、このようなHIVプロテアーゼにより認識および切断されるペプチド配列は、認識部分として使用され得る。架橋した酵素ドナーポリペプチドがタンパク質分解的に切断されることが所望される場合、非切断性架橋剤が使用され得る。これは、全化学的ペプチド合成、または所望するタンパク質分解の切断認識部位をコードする配列と酵素ドナー配列との遺伝子的融合のいずれかにより達成され得る。好ましくは、タンパク質分解の切断認識部位は、タンパク質切断部位が、架橋反応に用いられる酵素ドナーの２つの反応性アミノ酸残基の間に位置するように、酵素ドナー配列の内部に組み入れられる。次いで、不活性または非切断性架橋部分（例えば、ビスマレイミドヘキサン）は、架橋酵素ドナープロテアーゼ基質のキメラを産生するために使用される。キメラな酵素ドナーは、所望の認識部位をコードする遺伝子を、適切なエンドヌクレアーゼ認識部分において酵素ドナー配列をコードする遺伝子内に遺伝子的に挿入することによる組換えDNA方法論を用いて作製され得る。β-ガラクトシダーゼ酵素ドナーDNA配列を含むプラスミドベクターは、当該分野で周知である。組換えポリメラーゼ連鎖反応クローニングは、目的のコード配列およ適切な制限酵素クローニング部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、内部のプロテアーゼ感受性配列を有する変異酵素ドナーを構築することで行われ得る。あるいは、アミノ酸または保護アミノ酸を連続的に付加してペプチド鎖を成長させることによる、アミノ酸出発物質由来の酵素ドナーポリペプチドおよびプロテアーゼ認識部位の化学的合成が使用され得る。このような技術は、当業者に公知である。例えば、米国特許第4,493,795号およびそこで引用される科学的文献を参照のこと。架橋の解放、または環状ペプチドの開環は、いくつかの異なる様式で達成され得る。所望の分析物が、部位特異的プロテアーゼ（例えば、HIVプロテアーゼ）である場合、架橋した酵素ドナーポリペプチドは、このプロテアーゼに対する認識部位を含む配列を含み得る。プロテアーゼ活性により、プロテアーゼ認識部位でプロテアーゼが酵素ドナーを切断し、酵素ドナーを遊離して酵素アクセプターと相補化し、それにより、容易に測定されるβ-ガラクトシダーゼ活性を生じる。例えば、Baum、Proc ．Nat．Acad．Sci．87:10023-27(1990)（これは、非架橋 β-ガラクトシダーゼ遺伝子へのHIVプロテアーゼ認識部位の挿入を開示する）、およびLiebig、Proc ．Nat．Acad．Sci．88:5979-83(1991)（これは、ヒトリノウイルスプロテイナーゼと非架橋β-ガラクトシダーゼのα-フラグメントとの融合を開示する）を参照のこと。分析物の他の例は、インターロイキン-1-β変換酵素（ICEプロテアーゼ）であり、これはアポトーシス（細胞死）において役割を果たす。このプロテアーゼ酵素は、配列-X-Val-Y-Asp-Z-に対する明確な特異性を有する。ICEプロテアーゼによる配列の切断は、Aspの後で起こる。ICEプロテアーゼ酵素の作用を誘発する、これまでに見出されている最少かつ最善のペプチド基質配列は、Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-NH-CH₃であるようである。Thornberry、Natur e 356 :768-74(1992)を参照のこと。ICEプロテアーゼの強力なインヒビターは、配列Ac-Tyr-Val-Ala-Asp^*を含み、ここで、^*は、クロロメチルケトンを意味する。Nature 375:78-81(1995)を参照のこと。合成架橋酵素ドナーポリペプチドへの ICEプロテアーゼ認識部位の組み込みは、この重要なプロテアーゼに対する簡便で迅速なアッセイの開発を可能にする。所望の分析物が特異的ヌクレオチド配列（すなわち、標的ヌクレオチド）である場合、架橋剤は、標的ヌクレオチド配列に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド配列を含み得る。分析物ヌクレオチド配列の存在は、一本鎖オリゴヌクレオチド配列と標的ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションをもたらす。次いで、この新たに形成された二本鎖は、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼまたはRNAase Ｈ）の添加により切断され得、全ての架橋した酵素ドナー（これは、相補的な分析物核酸配列と二本鎖を形成し、そして酵素アクセプターと相補化してβ-ガラクトシダーゼ活性を産生する）を線状化する。分析物の例は、例えば、mycobacteria tuberculosis、streptcoccus、N．gono rrhea、HIVを含む細菌およびウイルス、サイトメガロウイルス、Epstein Barrウイルス、varicella zosterウイルス、および単純ヘルペスなどのヘルペスウイルス、肝炎およびクラミジアなどの感染性病原体の核酸配列を包含する。分析物または化学的環境の条件のいくつかのさらなる群はまた、この技術を用いて検出または測定され得る。例えば、選択される架橋剤は、特異的な化学的または環境的条件（pH、温度、酸化、還元など）による切断に感受性のものであり得る。直接に架橋剤を切断しないが、その活性により続いて切断（間接的結合切断）され得る準安定結合（metastable linker）を生じる酵素はまた、この方法により検出可能である。この例は、ガラクトシルまたはホスフェートから誘導体化され、アセタールを含むリンカーであり、ここで、酵素β-ガラクトシダーゼまたはホスファターゼの活性が、それぞれ、非常に不安定化され、そして最終的に切断される架橋をもたらす。この実施態様において、分析物は、それ自身で酵素標識（例えば、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなど）として使用される場合、本発明は、強力なシグナル増幅システムとして有用であることに注目すべきである。なぜなら、第１の基質（すなわち、酵素切断可能な架橋剤を含む架橋酵素ドナー）の切断の際、第２の発色性、蛍光性、または化学発光性基質の複数の分子を切断し得る活性酵素が形成されるからである。このような架橋剤は、式W-(CH₂)_n-X-CH(OY)-(CH₂)_n-Zを有し、ここでWおよびZは、それぞれ、マレイミド、スクシンイミド、およびチオシアネートからなる群から選択される官能基であり；ｎは１〜10の数であり；Xは酸素、イオウ、または窒素であり；そしてYは、ガラクトース、マンノース、グルコース、ホスフェート、ブチレート、およびアセテートからなる群から選択される、酵素的に切断可能な部分である。上記のように、分析物が酵素（例えば、HIV-1プロテアーゼまたはN.gonorrhea プロテアーゼ）である実施態様において、架橋剤は、分析物酵素に対する基質部位として作用する化学的部分を含み得る。酵素は、基質部位と反応して架橋剤を不安定化させ、架橋剤を自発的に加水切断させて、線状化酵素ドナーを生じる。例えば、アルデヒドのアセタールグリコシドは、特異的グリコシダーゼ酵素による切断の際、水溶液中で自発的に加水分解して親（parent）アルデヒドを産生するヒドロキシアセタールを産生することが知られる。この知識に基づき、グリコシルアセタール部分を含む新規なホモ二官能性架橋剤が設計された。グリコシダーゼ酵素の作用によるグリコシル残基が脱離すると、自発的に加水分解するヒドロキシアセタールが生じる。正味の結果は、架橋剤内での切断、および結果として生じる架橋酵素ドナーポリペプチドの線状化である。これらのグリコシル含有架橋剤は、以下の式を有する：ここで、Rはヒドロキシまたはアセテートである。さらに、化学的または環境的条件による切断に感受性である架橋剤を構築することが可能である。例えば、酸、塩基、酸化、還元、温度、光などにより切断される架橋部分の間にスペーサーを有する架橋剤を選択または設計することが可能である。この目的のために有用な架橋剤の例は、酸に不安定な2,2-ビスマレイミドエトキシプロパン（BMEP）であり、これは穏やかな酸の加水分解により切断される。他のこのような薬剤が当該分野で公知であり、そして同様の形式で使用され得る。架橋される酵素ドナーポリペプチドは、例えば、β-ガラクトシダーゼのＮ末端配列を含み得る。β-ガラクトシダーゼ酵素ドナー配列は、当該分野で公知である。米国特許第4,708,929号、LangleyおよびZabin、Biochemistry 15:4866(19 76)；Zabin、Mol ．and Cellular Biochem．49:84(1982)；Henderson，Clin.Chem istry 32 :1637(1986)；Khanna、Amer ．Clin．Lab．8:14(1989)およびCoty、J ．C lin．Immunoassay 17 :144(1994)を参照のこと。本発明の架橋酵素ドナーポリペプチドは、望ましくない自発的な酵素相補化に起因するバックグラウンド干渉をほとんど有さないか全く有さないアッセイを設計および構築することを可能にする。本発明の別の局面は、架橋酵素ドナーポリペプチドを作製する方法および本発明の架橋酵素ドナーポリペプチドを使用するアッセイ方法を包含する。本発明の架橋酵素ドナーポリペプチドを作製する方法は、架橋剤を酵素ドナーの２つの反応性アミノ酸残基への共有結合を引き起こすのに適切な反応条件下で、β-ガラクトシダーゼ酵素ドナーを架橋剤との混合物中で反応させる工程、および架橋したペプチドを反応混合物から単離する工程を包含する。本発明のアッセイ方法は、通常、所望の試薬を適切な緩衝液中に含むアッセイ媒体中で行われる。緩衝液の処方は、一般に重要ではないが、分析物の存在下で酵素ドナーの線状化に影響を与える方法で、目的の分析物と分子内架橋酵素ドナーとの間の相互作用を可能にしなくてはならない。一般に、β-ガラクトシダーゼフラグメントの相補化と相容性である任意の緩衝液（リン酸緩衝液、MOPS緩衝液などを含む）が許容され得る。本発明の１つの実施態様では、緩衝液は、約10 0mM〜約300mMのリン酸ナトリウム、約100mM〜約500mMの塩化ナトリウム、約１mM 〜約６mMの塩化マグネシウム、約５mM〜約15mMのEGTA（エチレングリコール四酢酸）またはEDTA（エチレンジアミン四酢酸）、および約５mM〜約200mMのアジ化ナトリウムの濃度を有し、約６〜約８のpHを有する。キレート化剤が、金属触媒酸化から保護するために、システインまたはメチオニン残基を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質に添加され得る。金属イオンに対するキレート化剤（例えば、EDTAまたはEGTA）の安定化量を添加することが好ましい。アジ化ナトリウムのような殺菌剤は、特に貯蔵の間の細菌の増殖を防ぐために、存在し得る。酵素活性のためのマグネシウムイオンまたは他のイオン、システイン残基の切断を防ぐための試薬（例えばジチオスレイトール（DTT））、エチレングリコールのような可溶化剤、ならびにソルビトールおよびエチレンオキシドの脂肪酸縮面活性剤を含む（これらに限定されない）他の材料が存在し得る。メチオニンおよびウシ血清アルブミン（BSA）もまた存在し得る。貯蔵安定性アッセイ媒体は、代表的には水性である。酵素ドナーポリペプチドは、通常約２pM〜約５mMの濃度で存在し、そして酵素アクセプターは、種々のモル過剰の程度で存在する。サンプルは、有機または無機の目的とする任意の供給源から得られ得る。サンプルは、一般的には液体であるが、固体物質の抽出物でもあり得る。本発明と組み合わせて使用され得るサンプルの量は、なかでも、分析物の濃度、サンプルの性質、およびアッセイの精度に依存する。アッセイ媒体の種々の試薬、サンプルおよび適切に架橋された酵素ドナーポリペプチドを合わせて、反応混合物を形成した後、媒体は、通常少なくとも0.2分間、そして通常約30分未満、好ましくは、約１分間〜約10分間インキュベートされる。温度およびインキュベート期間は、目的の分析物または化学的条件の能力に適合され、分析物が存在する場合に適切な架橋酵素ドナーの切断をもたらす能力を付与する。いくつかの方式では、さらなるアッセイ組成物およびインキュベーションが必要であり得る。次いで、酵素アクセプターポリペプチドおよびβ- ガラクトシダーゼ基質は、一緒にまたは別々に添加され、そして相補性活性が測定される。 β-ガラクトシダーゼにより切断された場合に吸光度（光学密度）または発光量の検出可能な変化を生じる酵素基質が、本発明の方法において用いられる。すなわち、基質の切断は、分光光度分析、化学分析または蛍光分析に適切な、着色、化学発光、または蛍光生成物の出現または消失をもたらす。β−ガラクトシダーゼと共に用いるのに適切な基質は、以下のものであるが、これらに限定されない：p-アミノフェニル-β-D-ガラクトピラノシド、2'-N-(ヘキサデカノール)-N- (アミノ-4'-ニトロフェニル)-β-D-ガラクトピラノシド、4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトピラノシド、ナフチル-A-S-B1-β-D-ガラクトピラノシド、2 -ナフチル-A-S-B1-β-D-ガラクトピラノシド一水和物、o-ナフチル-β-D-ガラクトピラノシド、p-ナフチル-β-D-ガラクトピラノシド、フェニル-β-D-ガラクトピラノシド、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド、レゾルフィン-β-D-ガラクトピラノシド、7-ヒドロキシ-4-トリフルオロメチルクマリン、ω-ニトロスチリル-β-D-ガラクトピラノシド、フルオレセイン-β-D-ガラクトピラノシド、クロロフェノールレッドβ-ガラクトシドなど。好ましい基質は、クロロフェノールレッドβ-ガラクトシド（CPRG）およびo-ニトロフェノール-β-D-ガラクトピラノシド（ONPG）である。酵素基質とのインキュベーションは、基質の切断をもたらし、（好ましくは色により）検出可能な生成物を産生する。上記で他に記載されない限り、本発明において使用される試薬の相対量は、広範に変化し得、アッセイ方法の感度を実質的に最適化し得る試薬の濃度を提供する。試薬は、任意の賦形剤を含む、通常、凍結乾燥された乾燥粉末として提供され得る。これは、溶解されると、本発明のアッセイ方法を実施するために適切な濃度を有する試薬溶液を提供する。実施例１：天然システイン残基を介するED28の分子内架橋 ED28は、90個のアミノ酸を含み、かつアミノ酸23位および68位に２個のシステイン残基を含む酵素ドナーポリペプチドである。23〜73位は、天然のβ-ガラクトシダーゼのＮ末端を含む（Ｎ末端Met残基を「１」とする従来のナンバリングを用いる）。ED28の配列はまた、米国特許第4,708,929号（その作製方法を開示する）に開示される。アミノ酸23位および68位における２つのシステイン残基の間にジスルフィド結合を形成することにより、それは分子内で結合された。 ED28（2.5mg）を、30％アセトニトリル（0.5ml）を含有する50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.5）に溶解した。溶液を、39％アセトニトリルを含む30mMリン酸ナトリウム（pH8.5）の５カラム容積で予め平衡化した、充填済みのSEP を１mlの同じ緩衝液で溶離した。この手順は、ジスルフィド結合形成を妨げるジチオスレイトールのような任意の低分子量の還元剤の除去を確実にする。得られた溶液を撹拌しながら12時間インキュベートし、その後ED28は約95％がジスルフィド結合分子に転換された。架橋EDを、C4 RPLCカラム（Vydac Protein C4、25cm×10mm）の逆相HPLCにより精製した。カラムを4ml/分の流速で展開した。H₂O中で0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）の弱溶離液を有する開始濃度、およびアセトニトリル中で0.1％TFAの強溶離液を有する最終濃度を用いる、45分間の23〜33％の勾配を確立した。精製された分子内架橋材料のサンプルを、還元剤DTTの10mM溶液で処理し、そしてHPLCに再注入した。予想されたように、溶離プロフィールは、線状化物質に対応した。システイン連結ED28ポリペプチドの相補的活性の阻害を確認するために、CED の存在下または非存在下で行った。架橋および線状のED28の溶液（20pmol）を調製し、そして酵素アクセプターEA22(20U/試験)（これは、13〜40位のアミノ酸欠失を有する相補性β-ガラクトシダーゼフラグメントを含む）、および緩衝溶液（リン酸水素二カリウム210mM；リン酸二水素カリウム150mM；塩化ナトリウム40 0mM；EGTA 10mM；酢酸マグネシウム２mM；メチオニン10mM；TWEEN 20 0. 血清アルブミン0.1％；アジ化ナトリウム10mM；pH6.95）中のCPRG（2mg/ml）とともに、37℃で４分間インキュベートした。574nmの吸光度における速度を、４分〜６分の間で、１分毎に測定した。結果を以下の表１に示す。これらの結果は、システイン連結のED28ポリペプチドの相補性活性が、DTTを用いた化学的還元により線状化されたED28の12％であったことを示す。DTTの存在または非存在は、新鮮な再構築された線状ED28に対し影響を与えなかった。実施例２：ホモ二官能性の酸不安定架橋部分によるED28の分子内架橋酸不安定であるホモ二官能性架橋剤2,2-ビスマレイミドエトキシプロパン(BME P)（これは、Srinivasvachar、Biochemistry 28:2501(1989)の方法に従って作製され得る）を用いて、ED28を架橋した。この架橋剤は、スルフヒドリル基と速やかに、そして特異的に反応して安定な共有結合を形成する２つのマレイミド基を含む。２つのマレイミド基の間の結合は、架橋を酸不安定性にするケタール部分を含む。この架橋剤は、ED28の２つのシステイン残基間で分子内架橋を形成するのに使用された。 ED28（1.0mg）を、39％アセトニトリル（0.5ml）を含む50mMリン酸ナトリウム緩衝溶液（pH7.0）に溶解し、架橋を妨げるDTTのような任意の低分子量の還元剤を除去した。溶液を30％アセトニトリルを含む30mMリン酸ナトリウム（pH7.5）の５カラム容積で予め平衡化した、充填済みのSEPHADEX G25カラムに付与した。 ED28を１mlの同じ緩衝液で溶離した。この溶離液に、アセトニトリル中のBMEPの 11×0.1等価アリコート（全体積５μｌ）を30分にわたって添加した。次いで、反応混合物を室温で１時間インキュベートした。その後、出発物質は完全に架橋生成物に転換された。 BMEP架橋のED28を、C4 RPLCカラムの逆相HPLCにより精製した。カラムを4ml/ 分の流速で展開した。24.5％の強溶離アイソクラチック(isochratic)プロフィールを用いて、H₂O中の100mMトリエチルアンモニウムアセテート（TEAA）の弱溶離液およびアセトニトリル強溶離液の濃度を用いて、精製材料を溶離した。精製した材料を凍結乾燥し、そして-80℃で貯蔵した。精製した材料のサンプルを水中で再構成し、そしてpHを0.1M HClで2.0に調整し、そして室温で３分間インキュベートした。次いで、pHを緩衝溶液を用いて6.8に調整し（実施例１を参照）、そして酵素アクセプタータンパク質との相補性活性を、実施例１に記載のように測定した。結果を以下の表IIに示す。これらの結果は、未処理BMEP連結ED28は、酸処理したBMEP連結ED28の2.5％の相補性活性を有することを示す。従って、架橋したED28は、化学的架橋部分の穏やかな酸加水分解により線状化され得る。線状ED28を用いる対照実験では、３分間の酸前処理は、線状ED28の相補性に影響を与えないことを示す。実施例３：ED28のホモ二官能性架橋剤による分子内架橋およびエンドプロテアーゼGlu-Cでの架橋されたED28のプロテアーゼ切断本実施例は、アッセイ条件下で切断されない部分を使用して架橋される酵素ドナーポリペプチドの構築および使用を記載する。本実施例において、目的のプロテアーゼ分析物の認識配列は、架橋剤に組み込まれず、酵素ドナーのアミノ酸配列に組み込まれるか、あるいはこのＮ末端またはＣ末端に結合される。これは、組換えDNA技術により達成され得るか、または固相ペプチド合成技術により達成され得る。これらの技術は、共に当業者に周知である。プロテアーゼの作用は、プロテアーゼ認識部位で架橋された酵素ドナーを切断する。これにより、分子内架橋されたペプチドを線状化し、そして酵素アクセプターとの相補を可能にする。この概念を示す。ED28を、ホモ二官能性架橋剤（ビス−マレイミドヘキサン）で架橋した。この試薬の使用により、穏和な条件下でスルフヒドリル部分の不可逆性架橋を生じる。Partis、J.Prot.Chem.2:263-77(1983)を参照。1.0mgのED28 を、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0、30%のアセトニトリルを含有）(0.5 ml)に溶解した。この溶液を、30mMのリン酸ナトリウム（pH7.0、30%のアセトニトリルを含有）の５カラム容量で予め平衡化した充填済みのSEPHADEX G25に付与した。ED28を1mlの同じ緩衝液で溶出した。この溶離液に、アセトニトリル中のB MHの11×0.1当量アリコート（全容量5μl）を、30分間かけて添加した。次いで反応混合物を室温で２時間インキュベートし、その後、出発物質は架橋生成物に完全に変換された。 BMH架橋されたED28は、C4 RPLCカラムの逆相HPLCにより精製した。カラムを、 4ml/分の流速で展開した。28.5%の強溶離液アイソクラチックプロフィールを用いて、精製された物質を、H₂O中の0.1%トリフルオロ酢酸（TFA）弱溶離液およびアセトニトリル中の0.1%TFA強溶離液の濃度を用いて溶出した。精製された物質を凍結乾燥し、そして25mMの炭酸アンモニウム緩衝液（pH7.8）で再構成した。次いで、緩衝化サンプルを10μgのエンドプロテイナーゼGlu-Cプロテアーゼ（S. aureus V8由来、Boehringer Mannheim）と、室温にて１時間インキュベートした。酵素アクセプタータンパク質（50μl、500U/ml）およびCPRG溶液（50μl、3mg /ml）を添加し、プレートを37℃でインキュベートし、そして570nmでの吸光度を測定した。結果を以下の表IIIに示す。このGlu-Cプロテアーゼは、グルタミン酸残基のＣ末端側でペプチドを特異的に切断する。ゆえに、ED28のグルタミン酸残基62および63に対するこのプロテアーゼの特異性を、BMH部分によるよりはむしろそれらの位置で、BMH架橋されたED 28を線状化するのに利用した。架橋された酵素ドナーポリペプチドをGlu-Cプロテアーゼで処理した場合、活性は劇的(約24倍)に増加した。このことは、切断が起こったことを示す。実施例４：ホモ二官能性ビスマレイミドアセタール架橋剤の調製 N-(2- トリメチルシロキシエチル)-マレイミドの合成図１に示すように、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（100ml）中のエタノールアミン（1.8g、29.5mmol）の溶液に、N-メトキシカルボニルマレイミド（95g、32. 3mmol）を０℃で激しく撹拌しながら分割して添加した。混合物を室温まで加温し、そして１時間撹拌した。混合物のpHを、濃硫酸（5ml）を注意深く添加することにより６〜７に調整した。得られた溶液を凍結乾燥し、そして固体の残渣を、各抽出物を30分間撹拌することにより酢酸エチル（2×400ml）で抽出した。酢酸エチル抽出物を濾過により回収し、そして真空下でエバポレートしてN-(2-ヒドロキシエチル)マレイミド（式I）を、白色固体（4.0g、収率96％）として得た；薄層クロマトグラフィー（TLC）、Rf=0.27、酢酸エチル／石油エーテル１：１。乾燥ジクロロメタン（10ml）中のN-(2-ヒドロキシエチル)マレイミド（0.2g、 1.41mmol）およびトリエチルアミン（0.22ml、1.57mmol）の溶液に、０℃にてクロロトリメチルシラン（TMS-Cl、0.2ml、1.57mmol）を添加した。室温で１時間撹拌した後、TLC分析（酢酸エチル／石油エーテル１：１）は、１つのスポット（Rf=0.67）を示した。溶媒を真空下で除去し、残渣をジクロロメタン中に溶解し、そしてジクロロメタンで溶出する少量のシリカゲルカラムを通して濾過した。生成物を含有する画分をプールし、真空下でエバポレートして、N-(2-トリメチルシロキシエチル)-マレイミド（式II）を、無色の薄片として得た（0.3g、収率100％）。4- マレイミドブチルアルデヒド（4-maleimidobutyraldehyde）の合成図２に示すように、飽和炭酸水素緩衝液（100ml）中の4-アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（５ｇ、31mmol）の溶液に、０℃（氷浴）にてN-メトキシカルボニルマレイミド（4.91g、31.6mmol）を添加した。15分後、テトラヒドロフラン（100ml）を室温で添加し、そして得られた混合物を１時間撹拌した。次いで、得られた混合物を１Nの塩酸でpH６〜７に酸性化し、酢酸エチルで抽出した(3×200ml)。合わせた有機抽出物を乾燥し（MgSO₄）、そして真空下でエバポレートした。粗生成物を、酢酸エチル／石油エーテル１：２で溶出するシリカゲル60のクロマトグラフィーにより精製して、4-マレイミドブチルアルデヒドジエチルアセタールを、黄色オイルとして得た（4.31g；58％）；TLC Rf=0.65、酢酸エチル／ヘキサン１：１。テトラヒドロフラン（20ml）および水（0.5ml）中の4-マレイミドブチルアルデヒドジエチルアセタール（２ｇ、8.29mmol）を、アルゴン下で撹拌し、そしてで12時間撹拌した後、溶媒をデカントし、乾燥し（MgSO₄）、そして真空下でエバポレートして、4-マレイミドブチルアルデヒド（式III）を、黄色オイル（放置すると速やかに凝固した）として得た（1.38g、99％）；TLC Rf=0.4、酢酸エチル／ヘキサン１：１。4-マレイミドブチルアルデヒドは変化して極度に不安定になるため、低温（0℃）で、かつ酸素を完全に排除して（不活性雰囲気下）全ての処理を行うことが必要であった。1,7- ビスマレイミド-4-O-(テトラアセチル-β-D-ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタンの合成図３に示すように、乾燥ジクロロメタン（40ml）中の4-マレイミドブチルアルデヒド（1.82g、11mmol）、N-(2-トリメチルシロキシエチル)-マレイミド（0.79 g、3.5mmol）、1-トリメチルシリロキシ-2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノース（1.52g、3.5mmol）およびモレキュラーシーブ（4Å）の撹拌溶液に、TMSOTf（トリメチルシリルトリフレート、0.67ml、3.5mmol）を、過酷な乾燥条件かつ不活性雰囲気（アルゴン）下で-78℃にて添加した。反応混合物を、1.5mlのトリエチルアミン／メタノール（１：１）を２日後に添加することによ除去した。粗生成物を、クロマトグラフ（酢酸エチル／軽油、１：１）を行い、 1,7-ビスマレイミド-4-O-(テトラアセチル-β-D-ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタン（式IV）（1.78g、2.7mmol）を収率77％で得た。1,7- ビスマレイミド-4-O-(テトラアセチル-β-D-ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタンの脱保護乾燥メタノール（20ml）中の1,7-ビスマレイミド-4-O-(テトラアセチル-β-D- ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタン（200mg、0.3mmol）の撹拌溶液に、Zn(O Ac)₂（60mg、0.3mmol）を添加した。溶液を過酷な乾燥条件下で９時間還流した。tert-ブチルメチルエーテル（20ml）を室温で添加した。tert-ブチルメチルエーテル／メタノール（１：１）（200ml）を用いてセライト濾過（5g）し、真空下で溶媒をエバポレートし、続いてクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール／トリエチルアミン、４：１：１）を行い、1,7-ビスマレイミド-4-O-(β-D- ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタン（式IV）および1,7-ビス-(3'-メトキシスクシンイミド)-4-O-(β-D-ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタン（式V）の混合物を、１：２（145mg、0.29mmol）の比で収率99％にて得た。Zn(OAc)₂を80℃ （p=0.001Torr）で24時間乾燥した。 1,7-ビスマレイミド-4-O-(テトラアセチル-β-D-ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタンを用いて、β-ガラクトシダーゼ酵素ドナーおよびHIV gag配列からなる環状融合ペプチドを調製した。これは、以下の実施例５に示すように構築した。実施例５：二重Cys-HIVペプチド含有酵素ドナーの調製 HIVプロテアーゼ認識部位もまた含む二重システイン含有酵素ドナーポリペプチドを、組換えDNA技術および固相ペプチド合成により調製した。 EA、EDおよび相補されたβ−ガラクトシダーゼの発現のためにE.Coli AMA1004 株（Casadaban、Methods in Enzymology 100:293、1983）を使用した。組換えクローンの単離のためにE.Coli MC1061株（Meissner、Proc Nat Acad Sci 84:4171 、1987）を使用した。オリゴヌクレオチドプライマーを、８残基（p17/p24）または10残基（p6/PR）のいずれかのHIVプロテアーゼ認識部位（クローン選択のためのHindIII制限部位を有する）の付加を伴う、プラスミドp187由来のED7として知られるβ-ガラクトシダーゼα領域を増幅するために設計した。ED7-HIV p17/p24遺伝子（5'-GATACG AATTCTCAGAACTATCCGATCGTTCAGTCACTGGCCGTCGTTTTACAA-3'）の増幅のためのＮ末端プライマーは、８残基HIVプロテアーゼ認識部位を含んだ。 ED7-HIV p6/PR遺伝子の増幅のためのＮ末端プライマー（5'GATACGAATTCTGTAAG CTTTAACTTTCCGCAGATCACCCTGCTGGCCGTCGTTTTACAA-3'）は、10残基HIVプロテアーゼ認識部位を含んだ。両方の増幅に、Ｃ末端プライマーKM1（5'-CTGGCTTAACTATG CGGCATC-3'）を使用した。PCR増幅を、94℃で１分の変性から始まり、続いて92 ℃で40秒間、65℃で40秒間、および75℃で1.5分間の40サイクル、そして75℃で5 分間の最終伸長工程を行うようにして、MJ Reserch minicycler PTC-150で行った。反応物は100μl容量であり、PCR Gems（Perkin/Elmer）を用いてホットスタートとして行った。増幅されたDNAを、フェノール−クロロホルム抽出物で清浄し、そしてエタノール中に沈殿させた。再懸濁させた物質を、EcoR1およびSal1消化により平滑断端し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製した。ゲル精製された挿入片 DNAをp187 EcoR1/Sa1ベクターに連結した。得られたクローンは、ED7遺伝子の3' 末端の近くに位置するEcoR1部位に挿入された内部遺伝子融合カセットとして、H IV p17/p24またはp6/PR切断部位のいずれかと共にED7遺伝子を有した。正確なクローンを、PCR生成物中に位置するHindIII部位の存在により同定し、そしてDNA 配列決定により確かめた。発現および精製のために、ED7-HIV遺伝子を、BamH1/S al1消化により、β−ガラクトシダーゼのラージフラグメントEA46（ED7-HIV遺伝子生成物とインビボで相補する）を有するBamH1/Sal1ベクター（p43）に転移した。 ED7-HIV p17/24、ED7-HIV p6/PR、およびEA46タンパク質を、λPLプロモーターからプラスミドCI857リプレッサーの不活性化にまで40℃で誘導した。誘導の４時間後、細胞を採取し、そして相補されたβ−ガラクトシダーゼを40％硫酸アンモニウム沈殿、続いてQ-SEHAOSEのイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。相補された酵素を、10Mの尿素中で変性し、そして組換えED-HIVタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーにより６Mの尿素中で変性されたEA46から分離した。ED-HIVタンパク質を含む画分を、Amicon撹拌セルで濃縮し、そして中性TRIS緩衝液中に透析した。いずれの残りの混入タンパク質も、Q-SEPHAROSEのイオン交換クロマトグラフィーを通して除去した。標的ペプチドをまた、2-1H-ベンゾトリアゾル-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU;ABI user bulletin #33）で活性化されたFmoc保護アミノ酸を用いて、Applied Biosystems（ABI）モデル431A固相ペプチド合成機で合成した。合成は0.25mmolのスケールで行い、そして予め充填されたHMP樹脂を固相として使用した。脱保護およびカップリングの時間を製造者により推奨される標準時間より長くした。以下のアミノ酸を使用した：Fmoc -Ala、Fmoc-Arg(Pmc)、Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc- Gln(Trt)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys(Bo c)、Fmoc-Phe、Fmoc-Pro、およびFmoc-Ser(tBu)。Ｎ末端をアセチル化せず、そしてＣ末端をカルボキシ形態で残した。粗ペプチド−樹脂の切断を、カルボニウムスカベンジャー、水（４％）、チオアニソール（４％）、フェノール（1.5％）、および1,2-エタンジチオール（２％）を含有するTFA溶液中で３時間インキュベートすることにより達成した。混合物を濾過し、エバポレートしてオイルを得、そして冷ジエチルエーテルで沈殿させた。粗ペプチドの精製を、対イオンとして0.1％TFAを用いるVydac 2.2×300 mm C18カラムおよび16〜41％のアセトニトリル／水グラジエントを使用して逆相 HPLCにより行った。精製されたペプチドはSED35と称し、そしてVSFNFPQITLプロテアーゼ切断部位を含んだ。実施例６：1,7-ビスマレイミド-4-O-(テトラアセチル-β-D-ガラクトピラノシル )-5-オキサヘプタンで架橋されたED7-HIV融合ペプチド次いで、実施例５からのED7-HIV融合ペプチドを、1,7-ビスマレイミド-4-O-( テトラアセチル-β-D-ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタンで、この融合ペプチドの残基10と53との間を共有結合することにより架橋した。 ED7-HIV融合ペプチドED7-HIV p17/p24を、50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 0(1ml)）中で再構成し、そしてこの溶液を充填済みのSEPHADEX G25カラムに付与した。融合ペプチドを、同じ緩衝液（1.5ml）で溶出した。362μg/mlの融合ペプチド（97％回収）を含む溶離液に、アセトニトリル（全容量5μl、全量38μg）中の11×0.1当量アリコートの1,7-ビスマレイミド-4-O-(テトラアセチル-β-D- ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタンを、30分間かけて添加した。次いで、反応混合物を、室温で30分間インキュベートした。架橋されたED-HIV融合ペプチドを、溶媒Aとして100mMのTEAA（pH6.5）および溶媒Bとしてアセトニトリルを使用するVydac Protein C4（25cm×10mm）半分取H PLCカラムを用いるHPLCにより精製した。カラムを、4ml/分の流速で展開した。溶媒Bの22〜40％グラジエントを15分間かけて確立した。線状ED-HIV融合ペプチドは、13分の保持時間を示した。架橋されたED-HIV融合ペプチドは、14.2分の保持時間を示した。生成物を含有する画分をプールし、そして凍結乾燥した。架橋されたED-HIV融合ペプチドの収量は155mgであった。相補活性を試験するために、線状ED-HIV融合ペプチドおよび架橋されたED-HIV 融合ペプチドのサンプルを、アッセイ緩衝液中で再構成し、そしてマイクロタイタープレートを通じて連続希釈した。酵素アクセプター（2050U/ml）およびCPRG (1mg/ml)（各50μl）を各ウェルに添加し、そして570nmでの吸光度の変化を、Vm axプレートリーダーで30秒ごとにモニターした。結果を以下の表IVに示す：これらの結果は、架橋された酵素ドナーの相補活性が、線状酵素ドナーの相補活性の2.5％であったことを示す。第２のHPLC精製を、一旦精製された物質を用いて行い、そして再精製された環状ED-HIV融合ペプチドを、このアッセイにおいて再び試験した。この試験において、環状ED-HIV融合ペプチドは、線状ED-HIV融合ペプチドが示した相補活性の0.04％のみを示した。これは、１回のみのHPLC精製後により高い活性が見られることは、おそらく線状ED-HIV混入の存在によることを示す。実施例７：1,7-ビスマレイミド-4-O-(テトラアセチル-β-D-ガラクトピラノシル )-5-オキサヘプタンで架橋されたSED35-HIV融合ペプチド SED35は、固相ペプチド合成により生産される60残基融合ペプチドである。これは、p6/PR HIV-1プロテアーゼ切断部位に相当するデカペプチドVSFNFPQITLおよびHIVgag/polポリペプチドにおけるアミノ末端残基GGGCからなる14残基Ｎ末端配列、およびED28の残基28〜73からなる46残基Ｃ末端配列を含む。 5mMのEDTAおよび30%のアセトニトリルを含有する100mMのリン酸緩衝液（pH6.5 ）中のSED35（0.5mg、75nmol）を、アセトニトリル（計57μg）中の6×0.2mol当量の1,7-ビスマレイミド-4-O-(テトラアセチル-β-D-ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタンの5μlアリコートと、30分間かけて合わせた。次いで、反応混合物を、室温で30分間インキュベートした。架橋されたED-HIV融合ペプチドを、溶媒Ａとして100mMのTEAA（pH6.5）および溶媒Ｂとしてアセトニトリルを使用するVydac Protein C4（25cm×10mm）半分取 HPLCカラムを用いるHPLCにより精製した。カラムを、4ml/分の流速で展開した。溶媒Ｂの35〜40％グラジエントを、20分間かけて確立した。架橋されたED-HIV融合ペプチドを含む画分をプールした。実施例８：HIV-1プロテアーゼインヒビターを決定するためのELISAアッセイフォーマット ELISAプレートフォーマットを、キネティックマイクロタイタープレートリーダーを用いて種々のインヒビターのIC₅₀値（酵素活性の50％減少を生じるインヒビター濃度）を決定するために使用した。 HIV gag/polポリペプチドのp6/PR切断部位に相当するHIV-1基質配列VSFNFPQIT Lを含む架橋されたキメラペプチドSED35-HIV p6/PRのストック溶液を、プロテアーゼアッセイ緩衝液（100mM NaOAc、1M NaCl、0.1%BSA、1mM EDTA、pH5.0）中、 1μg/mlの濃度で調製した。組換えHIVプロテアーゼもまた、プロテアーゼアッセイ緩衝液中、10μg/mlの濃度で調製した。HIVプロテアーゼインヒビターを、ジメチルスルホキシド（DMSO）中に溶解し、そして10％のDMSOを含むプロテアーゼアッセイ緩衝液中で作用濃度に希釈した。β-ガラクトシダーゼ酵素アクセプタータンパク質EA22を、β-ガラクトシダーゼアッセイ緩衝液中に調製して、最終濃度500U/mlにした。CPRGを、3mg/mlの濃度でβ−ガラクトシダーゼアッセイ緩衝液中に溶解した。 HIVプロテアーゼインヒビター94-001、94-002、94-003、94-004、および94-00 5を、DMSO中に溶解して、ストック濃度394nM、78.8nM、および15.76nMにした。G hoshら、J.Med.Chem.37:1177-88(1994)およびGhoshら、J.Med.Chem.37:2506-8(1 994)を参照のこと。組換えHIV-1プロテアーゼ（ホモダイマー、Mr=22,000）ストック溶液（10μl、4.54pmol）、プロテアーゼインヒビターストック溶液（10μl ）、環状ED-HIVストック溶液（25μl、3.57pmol）、EA22溶液（50μl、25U）、およびCPRG溶液（50μl）を、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル中にピペットした。プレートを、37℃で５分間インキュベートし、次いで、570n mでの吸光度を20分間モニターした。各インヒビターのIC₅₀値を、Vmax対時間のグラフから決定した。（IC₅₀は、インヒビターのKi値に比例する）。各インヒビターについて見出された相対IC₅₀値を、表Ｖに示す。実施例９：HIV-1プロテアーゼインヒビターを決定するためのCOBAS MIRAアッセイフォーマット３つの試薬アッセイシステムを、種々のインヒビターのIC₅₀濃度を決定するた J）を使用した。サンプル（インヒビター94-001、94-002、94-003または94-004）を、10％DMSO で改変されたHIVプロテアーゼ緩衝液（10mM酢酸ナトリウム、１M NaCl、１mM ED TA、0.1％BSA、pH5.0）で希釈して、10の希釈係数で45.3mMから4.53nMまでの最終試薬インヒビター濃度を得た。試薬１（R1）は、HIVプロテアーゼ緩衝液中、45nMの試薬濃度に希釈したHIVプロテアーゼを含んだ。試薬２（R2）は、HIVプロテアーゼ緩衝液中、0.30mMの架橋された酵素ドナーS ED35および43mg/mlのCPRGを含んだ。試薬３（R3）は、1315U/mlの試薬濃度に希釈したEA22を含んだ。 COBAS MIRA装置を、10μlのサンプルを送るように、そして時刻１（T=０分）に100mlのR1、時刻２（T=２分）に10mlのR2、および時刻３（T=７分）に95mlのR 3を送るようにプログラムした。速度（種々の時間間隔内における吸光度の変化）は、時刻４（T=9〜11分）で得た。これらの値を使用して速度対インヒビター濃度の対数のグラフを作成し、IC₅₀値を決定した。全てのアッセイを、37℃で行った。表VIに示すインヒビター94-001のデータを例として挙げる。このデータを使用して、速度対インヒビター濃度の対数のグラフを作成し、そしてカーブフィッティングプログラムを適用して、対数の直線方程式を求めた。この場合、f(x)=-169*ln(x)+602、またはf(y)=-9.19*ln(y)+60.9である。次いで、速度データの中点（50％応答）を決定し、そしてこの値をf(y)方程式に代入し、IC₅₀濃度を求めた。ここで、中間値は470mAU/分であり、そしてIC₅₀値は4.35n Mであった。アッセイにおけるこの結果を、表VIIに示す。本明細書中で言及される全ての刊行物および特許出願は、各刊行物または特許出願が、参考として援用されるように具体的および個々に示される場合と同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。本発明は十分に記載され、本発明に対し、多くの変化および改変が添付の請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく行われることが当業者に明らかである。

【手続補正書】【提出日】１９９７年１２月２５日【補正内容】請求の範囲１．式W-(CH₂) _n -X-CH(OY)-(CH₂)_n-Zの架橋剤であって、ここで：各WおよびZは、マレイミド、スクシンイミド、およびチオシアネートからなる群から独立して選択される官能基であり； nは、１〜10の数であり； Xは、酸素、イオウ、または窒素であり；そして Yは、グリコシド、ホスフェート、ブチレート、およびアセテートからなる群から選択される酵素的に切断可能な部分である。２．前記酵素的に切断可能な部分が、必要に応じてアセチル化されているグリコシドである、請求項１に記載の架橋剤。３．前記酵素的に切断可能な部分が、ガラクトース、マンノース、およびグルコースからなる群から選択される、請求項２に記載の架橋剤。４．以下の式の、請求項１または２に記載の架橋剤：ここで、各Rは独立して、ヒドロキシまたはアセテートである。５．1,7-ビスマレイミド-4-O-(テトラアセチル-β-D-ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタンおよび1,7-ビスマレイミド-4-O-(β-D-ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタンからなる群から選択される化合物である、請求項１に記載の架橋剤。６．架橋タンパク質を形成する方法であって、該タンパク質を、請求項１〜５のいずれかに記載の架橋剤と接触させる工程を含む、方法。７．前記タンパク質が、酵素の一部である、請求項６に記載の方法。８．前記タンパク質が、β-ガラクトシダーゼの酵素ドナーである、請求項７に記載の方法。９．請求項１〜５のいずれかに記載の架橋剤を用いて架橋した酵素部分。１０．サンプル中の酵素の存在または量を測定する方法であって、該サンプル中の任意の酵素を、請求項１〜５のいずれかに記載の架橋剤を用いて架橋されている酵素部分と接触させる工程を包含し、ここで、該架橋剤の前記酵素的に切断可能な部分が、測定されるべき該酵素により切断可能である、方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．式W-(CH₂)₂-X-CH(OY)-(CH₂)_n-Zの架橋剤であって、ここで：各WおよびZは、マレイミド、スクシンイミド、およびチオシアネートからなる群から選択される官能基であり； nは、１〜10の数であり； Xは、酸素、イオウ、または窒素であり； Yは、グリコシド、ホスフェート、ブチレート、およびアセテートからなる群から選択される酵素的に切断可能な部分である。２．前記酵素的に切断可能な部分が、グリコシドである、請求項１に記載の架橋剤。３．前記酵素的に切断可能な部分が、アセタールグリコシドである、請求項２に記載の架橋剤。４．前記酵素的に切断可能な部分が、ガラクトース、マンノース、およびグルコースからなる群から選択される、請求項２に記載の架橋剤。５．前記酵素的に切断可能な部分が、ホスフェート、ブチレート、およびアセテートからなる群から選択される、請求項１に記載の架橋剤。６．WおよびZがマレイミドであり、そしてYがガラクトースである、前述の請求項のいずれかに記載の架橋剤。７．以下の式の架橋剤：ここで、各Rは独立して、ヒドロキシまたはアセテートである。８．化合物 1,7-ビスマレイミド-4-O-(テトラアセチル-β-D-ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタン。９．化合物 1,7-ビスマレイミド-4-O-(β-D-ガラクトピラノシル)-5-オキサヘプタン。１０．架橋タンパク質を形成する方法であって、該タンパク質を、請求項１〜９のいずれかに記載の架橋剤と接触させる工程を含む、方法。１１．前記タンパク質が、酵素の一部である、請求項１０に記載の方法。１２．前記タンパク質が、β-ガラクトシダーゼの酵素ドナーである、請求項１１に記載の方法。１３．請求項１〜９のいずれかに記載の架橋剤を用いて架橋した酵素部分。１４．サンプル中の酵素の存在または量を測定する方法であって、該サンプル中の任意の酵素を、請求項１〜９のいずれかに記載の架橋剤を用いて架橋した酵素部分と接触させる工程を包含し、ここで、該架橋剤の前記酵素的に切断可能な部分が、測定されるべき該酵素により切断可能である、方法。