JPH07163367A - ヒトｔ細胞由来プロリルエンドペプチダーゼ産生遺伝子断片および該エンドペプチダーゼの製造法 - Google Patents
ヒトｔ細胞由来プロリルエンドペプチダーゼ産生遺伝子断片および該エンドペプチダーゼの製造法Info
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- JPH07163367A JPH07163367A JP5342194A JP34219493A JPH07163367A JP H07163367 A JPH07163367 A JP H07163367A JP 5342194 A JP5342194 A JP 5342194A JP 34219493 A JP34219493 A JP 34219493A JP H07163367 A JPH07163367 A JP H07163367A
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- derived
- prolyl endopeptidase
- pep
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒトＴ細胞由来のＰＥＰ産生遺伝子を入手
し、簡便で効率的に大量のヒトＰＥＰを製造する方法を
確立する。 【構成】 既知のブタＰＥＰ産生遺伝子の塩基配列の一
部をプライマーとしてＰＣＲ法を応用することによっ
て、ヒトＴ細胞由来のＰＥＰ産生遺伝子をクローニング
することを可能とし、さらに、このヒトＴ細胞由来のＰ
ＥＰ産生遺伝子を用いて、大量のヒトＰＥＰを簡便に効
率的に大腸菌に産生させ得る方法を確立した。
し、簡便で効率的に大量のヒトＰＥＰを製造する方法を
確立する。 【構成】 既知のブタＰＥＰ産生遺伝子の塩基配列の一
部をプライマーとしてＰＣＲ法を応用することによっ
て、ヒトＴ細胞由来のＰＥＰ産生遺伝子をクローニング
することを可能とし、さらに、このヒトＴ細胞由来のＰ
ＥＰ産生遺伝子を用いて、大量のヒトＰＥＰを簡便に効
率的に大腸菌に産生させ得る方法を確立した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＴ細胞由来のプロ
リルエンドペプチダーゼ産生遺伝子断片およびこれを利
用したヒトＴ細胞由来のプロリルエンドペプチダーゼの
製造法に関するものである。
リルエンドペプチダーゼ産生遺伝子断片およびこれを利
用したヒトＴ細胞由来のプロリルエンドペプチダーゼの
製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】現在、世界中で問題と成っているエイズ
に関する研究は、１９８３年病原ウィルスであるＨＩＶ
（Human Immunodeficiency Virsu）が発見、同定された
のを初めとして、精力的に進められており、短期間に多
くの知見が得られている。
に関する研究は、１９８３年病原ウィルスであるＨＩＶ
（Human Immunodeficiency Virsu）が発見、同定された
のを初めとして、精力的に進められており、短期間に多
くの知見が得られている。
【０００３】エイズは、ヒトの免疫機構の中枢的役割を
果たすヘルパーＴ細胞を著減させ、患者に免疫不全状態
を生じせしめるものであるが、例えば、ＨＩＶを感染せ
しめたＴ細胞と非感染Ｔ細胞とを試験管内で混合する
と、感染Ｔ細胞と非感染Ｔ細胞とが融合して巨大細胞を
形成する合胞体形成現象が観察されることがすでに知ら
れている。この現象はＨＩＶの細胞間感染に特有のもの
であり、ＨＩＶのＴ細胞感染の証左とされている。
果たすヘルパーＴ細胞を著減させ、患者に免疫不全状態
を生じせしめるものであるが、例えば、ＨＩＶを感染せ
しめたＴ細胞と非感染Ｔ細胞とを試験管内で混合する
と、感染Ｔ細胞と非感染Ｔ細胞とが融合して巨大細胞を
形成する合胞体形成現象が観察されることがすでに知ら
れている。この現象はＨＩＶの細胞間感染に特有のもの
であり、ＨＩＶのＴ細胞感染の証左とされている。
【０００４】ところで、本発明者らは、先に、プロリン
を含有するペプチドのプロリンのカルボキシル側のペプ
チド結合を特異的に加水分解するプロリルエンドペプチ
ダーゼ（ＰＥＰ）の阻害剤をＨＩＶ感染Ｔ細胞と非感染
Ｔ細胞との混合培養系に添加すると、上記の合胞体形成
現象が有効に抑制されること、ＰＥＰ阻害活性と合胞体
形成阻止活性の間に相関関係が認められることを見出し
ている（特開平２−１４８１８号）。しかし、Ｔ細胞の
ＨＩＶ感染におけるプロリルエンドペプチダーゼの役割
については知られていない。
を含有するペプチドのプロリンのカルボキシル側のペプ
チド結合を特異的に加水分解するプロリルエンドペプチ
ダーゼ（ＰＥＰ）の阻害剤をＨＩＶ感染Ｔ細胞と非感染
Ｔ細胞との混合培養系に添加すると、上記の合胞体形成
現象が有効に抑制されること、ＰＥＰ阻害活性と合胞体
形成阻止活性の間に相関関係が認められることを見出し
ている（特開平２−１４８１８号）。しかし、Ｔ細胞の
ＨＩＶ感染におけるプロリルエンドペプチダーゼの役割
については知られていない。
【０００５】また、このようなプロリルエンドペプチダ
ーゼは、生体内においては神経伝達物質の生成や分解に
関与していると考えられているだけでなく、さらに、こ
の酵素は記憶の保持に関係している可能性がある。事
実、この酵素に対する特異的阻害剤は抗痴呆剤として開
発が進められている。
ーゼは、生体内においては神経伝達物質の生成や分解に
関与していると考えられているだけでなく、さらに、こ
の酵素は記憶の保持に関係している可能性がある。事
実、この酵素に対する特異的阻害剤は抗痴呆剤として開
発が進められている。
【０００６】従って、ヒト由来のプロリルエンドペプチ
ダーゼ、特にヒトＴ細胞由来のプロリルエンドペプチダ
ーゼを見出すことは極めて重要である。そこで、ヒトＴ
細胞由来のプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）の製
造法として、本発明者らによって、培養したヒトＴ細胞
から抽出する方法が開発されている。
ダーゼ、特にヒトＴ細胞由来のプロリルエンドペプチダ
ーゼを見出すことは極めて重要である。そこで、ヒトＴ
細胞由来のプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）の製
造法として、本発明者らによって、培養したヒトＴ細胞
から抽出する方法が開発されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
方法は、ヒトＴ細胞の培養細胞を破砕して得られた細胞
質画分より分離採取することにより製造するものであ
り、製造効率の点で満足すべきものとは言えない。ま
た、ＰＥＰの産生遺伝子に関する知見は、一部類似する
ブタＰＥＰについて報告があるが、ヒトのものについて
は知られていなかった。
方法は、ヒトＴ細胞の培養細胞を破砕して得られた細胞
質画分より分離採取することにより製造するものであ
り、製造効率の点で満足すべきものとは言えない。ま
た、ＰＥＰの産生遺伝子に関する知見は、一部類似する
ブタＰＥＰについて報告があるが、ヒトのものについて
は知られていなかった。
【０００８】本発明は、ヒトＴ細胞由来のＰＥＰの産生
遺伝子を入手し、ヒトＴ細胞由来のＰＥＰの効率的な製
造法を確立することを目的とする。
遺伝子を入手し、ヒトＴ細胞由来のＰＥＰの効率的な製
造法を確立することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、請求項１に記載の発明はヒトＴ細胞由来のプロリル
エンドペプチダーゼを産生するヒトＴ細胞由来プロリル
エンドペプチダーゼ産生遺伝子断片である。
め、請求項１に記載の発明はヒトＴ細胞由来のプロリル
エンドペプチダーゼを産生するヒトＴ細胞由来プロリル
エンドペプチダーゼ産生遺伝子断片である。
【００１０】また、請求項２に記載の発明は、以下の塩
基配列からなるプロリルエンドペプチダーゼ産生遺伝子
断片である。 ATGCTGTCCT TCCAGTACCC CGACGTGTAC CGCGACGAGA CCGCCATACA GCATTATCAT GGTCATAAAA TTTGTGACCC TTACGCCTGG CTTGAAGACC CCGACAGTGA ACAGACTAAG GCCTTTGTGG AGGCCCAGAA TAAGATTACT GTGCCATTTC TTGAGCAGTG TCCCATCAGA GGTTTATACA AAGAGAGAAT GACTGAACTA TATGATTATC CCAAGTATAG TTGCCACTTC AAGAAAGGAA AACGGTATTT TTATTTTTAC AATACAGGTT TGCAGAACCA GCGAGTATTA TATGTACAGG ATTCCTTAGA GGGTGAGGCC AGAGTGTTCC TGGACCCCAA CATACTGTCT GACGATGGCA CAGTGGCACT CCGAGGTTAT GCGTTCAGCG AAGATGGTGA ATATTTTGCC TATGGTCTGA GTGCCAGTGG CTCAGACTGG GTGACAATCA AGTTCATGAA AGTTGATGGT GCCAAAGAGC TTCCAGATGT GCTTGAAAGA GTCAAGTTCA GCTGTATGGC CTGGACCCAT GATGGGAAGG GAATGTTCTA CAACTCATAC CCTCAACAGG ATGGAAAAAG TGATGGCACA GAGACATCTA CCAATCTCCA CCAAAAGCTC TACTACCATG TCTTGGGAAC CGATCAGTCA GAAGATATTT TGTGTGCTGA GTTTCCTGAT GAACCTAAAT GGATGGGTGG AGCTGAGTTA TCTGATGATG GCTGCTATGT CTTGTTATCA ATAAGGGAAG GATGTGATCC AGTAAACCGA CTCTGGTACT GTGACCTACA GCAGGAATCC AGTGGCATCG CGGGAATCCT GAAGTGGGTA AAACTGATTG ACAACTTTGA AGGGGAATAT GACTACGTGA CCAATGAGGG GGCGGTGTTC ACATTCAAGA CGAATCGCCA GTCTCCCAAC TATCGCGTGA TCAACATTGA CTTCAGGGAT CCTGAAGAGT CTAAGTGGAA AGTACTTGTT CCTGAGCATG AGAAAGATGT CTTAGAATGG ATAGCTTGTG TCAGGTCCAA CTTCTTGGTC TTATGCTACC TCCATGACGT CAAGAACATT CTGCAGCTCC ATGACCTGAC TACTGGTGCT CTCCTTAAGA CCTTCCCGCT CGATGTCGGC AGCATTGTAG GGTACAGCGG TCAGAAGAAG GACACTGAAA TCTTCTATCA GTTTACTTCC TTTTTATCTC CAGGTATCAT TTATCACTGT GATCTGACCA AAGAGGAGCT GGAGCCAAGA GTCTTCCGCG AGGTGACCGT GAAAGGAATT GATGCTTCTG ACTACCAGAC AGTCCAGCTT TTCTACCCTA GCAAGGATGG TACGAAGATT CCAATGTTCA TTGTGCATAA AAAAAGCATA AAATTGGATG GCTCTCATCC AGCTTTCTTA TATGGCTATG GCGGCTTCAA CATATCCATC ACACCCAACT ACAGTGTTTC CAGGCTTATT TTTGTGAGAC ACATGGGTGG TATCCTGGCA GTGGCCAACA TCAGAGGAGG TGGCGAATAT GGAGAGACGT GGCATAAAGG TGGTATCTTG GCCAACAAAC AAAACTGCTT TGATGACTTT CAGTGTGCTG CTGAGTATCT GATCAAGGAA GGTTACACAT CTCCCAAGAG GCTGACTATT AATGGAGGTT CAAATGGAGG CCTCTTAGTG GCTGCTTGTG CAAATCAGAG ACCTGACCTC TTTGGTTGTG TTATTGCCCA AGTTGGAGTA ATGGACATGC TGAAGTTTCA TAAATATACC ATCGGCCATG CTTGGACCAC TGATTATGGG TGCTCGGACA GCAAACAACA CTTTGAATGG CTTGTCAAAT ACTCTCCATT GCATAATGTG AAGTTACCAG AAGCAGATGA CATCCAGTAC CCGTCCATGC TGCTCCTCAC TGCTGACCAT GATGACCGCG TGGTCCCGCT TCACTCCCTG AAGTTCATTG CCACCCTTCA GTACATCGTG GGCCGCAGCA GGAAGCAAAG CAACCCCCTG CTTATCCACG TGGACACCAA GGCGGGCCAC GGGGCGGGGA AGCCCACAGC CAAAGTGATA GAGGAAGTCT CAGACATGTT TGCGTTCATC GCGCGGTGCC TGAACATCGA CTGGATTCCG
基配列からなるプロリルエンドペプチダーゼ産生遺伝子
断片である。 ATGCTGTCCT TCCAGTACCC CGACGTGTAC CGCGACGAGA CCGCCATACA GCATTATCAT GGTCATAAAA TTTGTGACCC TTACGCCTGG CTTGAAGACC CCGACAGTGA ACAGACTAAG GCCTTTGTGG AGGCCCAGAA TAAGATTACT GTGCCATTTC TTGAGCAGTG TCCCATCAGA GGTTTATACA AAGAGAGAAT GACTGAACTA TATGATTATC CCAAGTATAG TTGCCACTTC AAGAAAGGAA AACGGTATTT TTATTTTTAC AATACAGGTT TGCAGAACCA GCGAGTATTA TATGTACAGG ATTCCTTAGA GGGTGAGGCC AGAGTGTTCC TGGACCCCAA CATACTGTCT GACGATGGCA CAGTGGCACT CCGAGGTTAT GCGTTCAGCG AAGATGGTGA ATATTTTGCC TATGGTCTGA GTGCCAGTGG CTCAGACTGG GTGACAATCA AGTTCATGAA AGTTGATGGT GCCAAAGAGC TTCCAGATGT GCTTGAAAGA GTCAAGTTCA GCTGTATGGC CTGGACCCAT GATGGGAAGG GAATGTTCTA CAACTCATAC CCTCAACAGG ATGGAAAAAG TGATGGCACA GAGACATCTA CCAATCTCCA CCAAAAGCTC TACTACCATG TCTTGGGAAC CGATCAGTCA GAAGATATTT TGTGTGCTGA GTTTCCTGAT GAACCTAAAT GGATGGGTGG AGCTGAGTTA TCTGATGATG GCTGCTATGT CTTGTTATCA ATAAGGGAAG GATGTGATCC AGTAAACCGA CTCTGGTACT GTGACCTACA GCAGGAATCC AGTGGCATCG CGGGAATCCT GAAGTGGGTA AAACTGATTG ACAACTTTGA AGGGGAATAT GACTACGTGA CCAATGAGGG GGCGGTGTTC ACATTCAAGA CGAATCGCCA GTCTCCCAAC TATCGCGTGA TCAACATTGA CTTCAGGGAT CCTGAAGAGT CTAAGTGGAA AGTACTTGTT CCTGAGCATG AGAAAGATGT CTTAGAATGG ATAGCTTGTG TCAGGTCCAA CTTCTTGGTC TTATGCTACC TCCATGACGT CAAGAACATT CTGCAGCTCC ATGACCTGAC TACTGGTGCT CTCCTTAAGA CCTTCCCGCT CGATGTCGGC AGCATTGTAG GGTACAGCGG TCAGAAGAAG GACACTGAAA TCTTCTATCA GTTTACTTCC TTTTTATCTC CAGGTATCAT TTATCACTGT GATCTGACCA AAGAGGAGCT GGAGCCAAGA GTCTTCCGCG AGGTGACCGT GAAAGGAATT GATGCTTCTG ACTACCAGAC AGTCCAGCTT TTCTACCCTA GCAAGGATGG TACGAAGATT CCAATGTTCA TTGTGCATAA AAAAAGCATA AAATTGGATG GCTCTCATCC AGCTTTCTTA TATGGCTATG GCGGCTTCAA CATATCCATC ACACCCAACT ACAGTGTTTC CAGGCTTATT TTTGTGAGAC ACATGGGTGG TATCCTGGCA GTGGCCAACA TCAGAGGAGG TGGCGAATAT GGAGAGACGT GGCATAAAGG TGGTATCTTG GCCAACAAAC AAAACTGCTT TGATGACTTT CAGTGTGCTG CTGAGTATCT GATCAAGGAA GGTTACACAT CTCCCAAGAG GCTGACTATT AATGGAGGTT CAAATGGAGG CCTCTTAGTG GCTGCTTGTG CAAATCAGAG ACCTGACCTC TTTGGTTGTG TTATTGCCCA AGTTGGAGTA ATGGACATGC TGAAGTTTCA TAAATATACC ATCGGCCATG CTTGGACCAC TGATTATGGG TGCTCGGACA GCAAACAACA CTTTGAATGG CTTGTCAAAT ACTCTCCATT GCATAATGTG AAGTTACCAG AAGCAGATGA CATCCAGTAC CCGTCCATGC TGCTCCTCAC TGCTGACCAT GATGACCGCG TGGTCCCGCT TCACTCCCTG AAGTTCATTG CCACCCTTCA GTACATCGTG GGCCGCAGCA GGAAGCAAAG CAACCCCCTG CTTATCCACG TGGACACCAA GGCGGGCCAC GGGGCGGGGA AGCCCACAGC CAAAGTGATA GAGGAAGTCT CAGACATGTT TGCGTTCATC GCGCGGTGCC TGAACATCGA CTGGATTCCG
【００１１】また、請求項３に記載の発明に係る前記請
求項１または２に記載のヒトＴ細胞由来プロリルエンド
ペプチダーゼ産生遺伝子断片の製造法では、ヒトＴ細胞
にて発現しているｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを基
に、ブタのプロリルエンドペプチダーゼ産生遺伝子の塩
基配列の一部をプライマーとして用い、酵素的ＤＮＡ増
幅法によって増幅しクローニングしたもである。
求項１または２に記載のヒトＴ細胞由来プロリルエンド
ペプチダーゼ産生遺伝子断片の製造法では、ヒトＴ細胞
にて発現しているｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを基
に、ブタのプロリルエンドペプチダーゼ産生遺伝子の塩
基配列の一部をプライマーとして用い、酵素的ＤＮＡ増
幅法によって増幅しクローニングしたもである。
【００１２】また請求項４に記載のヒトＴ細胞由来プロ
リルエンドペプチダーゼの製造法では、外来遺伝子をβ
−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として発現する
機能を有するベクターに、前記請求項１又は２に記載の
ヒトＴ細胞由来のプロリルエンドペプチダーゼ産生遺伝
子断片を組み込み、適当な宿主によりヒトＴ細胞由来プ
ロリルエンドペプチダーゼをβ−ガラクトシダーゼとの
融合タンパク質として発現させ、該融合タンパク質の前
記β−ガラクトシダーゼ部分を除去することによってヒ
トＴ細胞由来プロリルエンドペプチダーゼを得るもので
ある。
リルエンドペプチダーゼの製造法では、外来遺伝子をβ
−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として発現する
機能を有するベクターに、前記請求項１又は２に記載の
ヒトＴ細胞由来のプロリルエンドペプチダーゼ産生遺伝
子断片を組み込み、適当な宿主によりヒトＴ細胞由来プ
ロリルエンドペプチダーゼをβ−ガラクトシダーゼとの
融合タンパク質として発現させ、該融合タンパク質の前
記β−ガラクトシダーゼ部分を除去することによってヒ
トＴ細胞由来プロリルエンドペプチダーゼを得るもので
ある。
【００１３】
【作用】本発明は、本発明者らが鋭意探索研究を進めた
結果、既知のブタプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥ
Ｐ）産生遺伝子の塩基配列の一部をプライマーとして用
い、酵素的ＤＮＡ増幅法（polymerase chain reaction,
以下、ＰＣＲ法と記す）を応用することによってヒトＴ
細胞由来のＰＥＰの産生遺伝子をクローニングすること
に成功し、さらに得られたヒトＴ細胞由来ＰＥＰ産生遺
伝子断片を用いてヒトＴ細胞由来のＰＥＰの効率的な製
造法を見出し、確立したものである。
結果、既知のブタプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥ
Ｐ）産生遺伝子の塩基配列の一部をプライマーとして用
い、酵素的ＤＮＡ増幅法（polymerase chain reaction,
以下、ＰＣＲ法と記す）を応用することによってヒトＴ
細胞由来のＰＥＰの産生遺伝子をクローニングすること
に成功し、さらに得られたヒトＴ細胞由来ＰＥＰ産生遺
伝子断片を用いてヒトＴ細胞由来のＰＥＰの効率的な製
造法を見出し、確立したものである。
【００１４】即ち、外来遺伝子をβ−ガラクトシダーゼ
との融合タンパク質として発現する発現ベクターに、ヒ
トＴ細胞由来ＰＥＰ産生遺伝子を組み込み、例えば大腸
菌等の適当な宿主に形質転換してＰＥＰをβ−ガラクト
シダーゼ融合タンパク質として発現させることによっ
て、β−ガラクトシダーゼ抗体カラムによるアフィニテ
ィクロマトグラフィ等を用いて精製を行なうなど、精製
工程を簡便で容易に行なうことを可能とし、効率的にヒ
トＴ細胞由来のＰＥＰを製造することができる。
との融合タンパク質として発現する発現ベクターに、ヒ
トＴ細胞由来ＰＥＰ産生遺伝子を組み込み、例えば大腸
菌等の適当な宿主に形質転換してＰＥＰをβ−ガラクト
シダーゼ融合タンパク質として発現させることによっ
て、β−ガラクトシダーゼ抗体カラムによるアフィニテ
ィクロマトグラフィ等を用いて精製を行なうなど、精製
工程を簡便で容易に行なうことを可能とし、効率的にヒ
トＴ細胞由来のＰＥＰを製造することができる。
【００１５】
【実施例】以下に、本発明を実施例を以て説明する。本
実施例では、まず、ブタＰＥＰ遺伝子の塩基配列をプラ
イマーとして、ヒトＰＥＰ遺伝子の一部をＰＣＲ法にて
増幅し、これをプローブとしてヒトＴ細胞由来の細胞株
であるＭＯＬＴ４ｃｌｏｎｅ８株から作成したｃＤＮＡ
バンクのスクリーニングを行い、数個のクローンを得
た。このうち１クローンは１．５Ｋｂのインサートを持
っており、このインサートをプラスミドベクターｐＵＣ
１１９に部分クローニングし、全塩基配列を決定した。
実施例では、まず、ブタＰＥＰ遺伝子の塩基配列をプラ
イマーとして、ヒトＰＥＰ遺伝子の一部をＰＣＲ法にて
増幅し、これをプローブとしてヒトＴ細胞由来の細胞株
であるＭＯＬＴ４ｃｌｏｎｅ８株から作成したｃＤＮＡ
バンクのスクリーニングを行い、数個のクローンを得
た。このうち１クローンは１．５Ｋｂのインサートを持
っており、このインサートをプラスミドベクターｐＵＣ
１１９に部分クローニングし、全塩基配列を決定した。
【００１６】この塩基配列をブタ由来のＰＥＰ遺伝子と
比較したところ、全域にわたり約９０％のホモロジー
（相同性）が認められた。また一つのタンパク質をコー
ドすることが可能であり、塩基配列から予想されるアミ
ノ酸配列同士の比較ではさらにホモロジーが高かった。
したがって、このクローンはヒトＴ細胞のＰＥＰ遺伝子
のクローンであると考えられる。
比較したところ、全域にわたり約９０％のホモロジー
（相同性）が認められた。また一つのタンパク質をコー
ドすることが可能であり、塩基配列から予想されるアミ
ノ酸配列同士の比較ではさらにホモロジーが高かった。
したがって、このクローンはヒトＴ細胞のＰＥＰ遺伝子
のクローンであると考えられる。
【００１７】また、ブタＰＥＰ遺伝子との比較からこの
クローンは遺伝子の５’側が欠けていると認められた。
そこで、このクローンのなるべく５’側に近い塩基配列
の一部を化学合成し、これをプライマーとして用い、Ｔ
細胞から抽出したｍＲＮＡに対し、逆転写酵素によって
ファーストランドのｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡ
を用いてＰＣＲ反応を行い、５’側の塩基配列を含むＤ
ＮＡ断片を増幅することができた。また３’側もＰＣＲ
反応で増幅することができた。これら２つのＤＮＡを重
複している部分でつなぎ合わせることによってＰＥＰ遺
伝子の全長をクローニングすることができた。以下に、
本実施例で行った操作を図１を用いて説明する。
クローンは遺伝子の５’側が欠けていると認められた。
そこで、このクローンのなるべく５’側に近い塩基配列
の一部を化学合成し、これをプライマーとして用い、Ｔ
細胞から抽出したｍＲＮＡに対し、逆転写酵素によって
ファーストランドのｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡ
を用いてＰＣＲ反応を行い、５’側の塩基配列を含むＤ
ＮＡ断片を増幅することができた。また３’側もＰＣＲ
反応で増幅することができた。これら２つのＤＮＡを重
複している部分でつなぎ合わせることによってＰＥＰ遺
伝子の全長をクローニングすることができた。以下に、
本実施例で行った操作を図１を用いて説明する。
【００１８】実施例１ 操作(1) Ｔ細胞の培養： ヒトＴ細胞由来のＭＯＬＴ４ｃｌｏｎｅ８株を使用し、
以下の条件で培養を行った。ＲＰＭＩ１６４０培地（日
水製薬社製）に、10％ウシ胎児血清と、ゲンタマイシン
を20mg/l加えたものを培地とし、37℃にて、CO2 濃度５
％の CO2インキュベター中で培養を行った。
以下の条件で培養を行った。ＲＰＭＩ１６４０培地（日
水製薬社製）に、10％ウシ胎児血清と、ゲンタマイシン
を20mg/l加えたものを培地とし、37℃にて、CO2 濃度５
％の CO2インキュベター中で培養を行った。
【００１９】操作(2) ｍＲＮＡの抽出： 操作(1) にて得られたＭＯＬＴ４ｃｌｏｎｅ８細胞から
ｍＲＮＡ isolation kit（Fast TrackTM：インビトロゲ
ン社製）を用いて、下記のごとくマニュアルに従ってｍ
ＲＮＡの抽出を行った。即ち、細胞１×108 個に、15ml
の溶解用緩衝液を加えて溶解したものを１８ゲージの針
に通してＤＮＡを切断する。さらにオリゴαＴセルロー
スを加え、これにｍＲＮＡを吸着させる。このｍＲＮＡ
が吸着した状態のオリゴαＴセルロースを、緩衝液で繰
返し洗浄を行った後カラムに充填し、溶出用緩衝液をカ
ラム内に流通してｍＲＮＡを溶出した。
ｍＲＮＡ isolation kit（Fast TrackTM：インビトロゲ
ン社製）を用いて、下記のごとくマニュアルに従ってｍ
ＲＮＡの抽出を行った。即ち、細胞１×108 個に、15ml
の溶解用緩衝液を加えて溶解したものを１８ゲージの針
に通してＤＮＡを切断する。さらにオリゴαＴセルロー
スを加え、これにｍＲＮＡを吸着させる。このｍＲＮＡ
が吸着した状態のオリゴαＴセルロースを、緩衝液で繰
返し洗浄を行った後カラムに充填し、溶出用緩衝液をカ
ラム内に流通してｍＲＮＡを溶出した。
【００２０】操作(3) ｃＤＮＡの合成： ＭＯＬＴ４ｃｌｏｎｅ８細胞から抽出して得られたｍＲ
ＮＡから、逆転写酵素Molony MLV RTase Superscript
（ギブコ BRL社製）を用いて下記のごとくｃＤＮＡの合
成を行った。上記操作(2) でヒトＴ細胞から抽出したｍ
ＲＮＡ１μg を、500 μg/mlのオリゴｄＴ12-18 1μl
、250mM Tris-HCl(pH8.3)・375mM KCl ・15mM MgCl2 の
５倍希釈緩衝液、0.1M DTT 2μl 、10mM（dATP+dGTP+dC
TP+dTTP ） 1μl 、滅菌水 11μl からなる溶液に溶解
し、200unit/μl SuperscriptTM（逆転写酵素） 1μl
を加えて37℃で60分間反応させ、ｃＤＮＡを合成した
（ａ）。反応後、セファデックスＧ２５を充填したスピ
ンカラムに反応液をのせ、遠心して未反応物を除いた。
更に、Tris-HCl(pH7)/1mM EDTAの溶出用緩衝液を加えて
再度遠心し、ｃＤＮＡを回収した。
ＮＡから、逆転写酵素Molony MLV RTase Superscript
（ギブコ BRL社製）を用いて下記のごとくｃＤＮＡの合
成を行った。上記操作(2) でヒトＴ細胞から抽出したｍ
ＲＮＡ１μg を、500 μg/mlのオリゴｄＴ12-18 1μl
、250mM Tris-HCl(pH8.3)・375mM KCl ・15mM MgCl2 の
５倍希釈緩衝液、0.1M DTT 2μl 、10mM（dATP+dGTP+dC
TP+dTTP ） 1μl 、滅菌水 11μl からなる溶液に溶解
し、200unit/μl SuperscriptTM（逆転写酵素） 1μl
を加えて37℃で60分間反応させ、ｃＤＮＡを合成した
（ａ）。反応後、セファデックスＧ２５を充填したスピ
ンカラムに反応液をのせ、遠心して未反応物を除いた。
更に、Tris-HCl(pH7)/1mM EDTAの溶出用緩衝液を加えて
再度遠心し、ｃＤＮＡを回収した。
【００２１】操作(4) ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅： 予め、ブタＰＥＰ遺伝子の塩基配列の一部を化学合成し
てなるプライマー；AGCTGAATTCATGCTGTCCTTCCAGTAC、
プライマー；ATACAGCTGAACTTGACTCTTT、プライマー
；AGCTGTCGACCGGAATCCAGTCGATGTT、プライマー；AA
AGAGTCAAGTTCAGCTGTATを用いて、操作３によって得られ
たｃＤＮＡを基に、以下のごとくＰＣＲ反応（ＰＣ−７
００：アステック社製）を行いＤＮＡ断片を増幅させた
（ｂ）。なお、プライマーは５’側に制限酵素切断部位
を持つように設計して化学合成した。
てなるプライマー；AGCTGAATTCATGCTGTCCTTCCAGTAC、
プライマー；ATACAGCTGAACTTGACTCTTT、プライマー
；AGCTGTCGACCGGAATCCAGTCGATGTT、プライマー；AA
AGAGTCAAGTTCAGCTGTATを用いて、操作３によって得られ
たｃＤＮＡを基に、以下のごとくＰＣＲ反応（ＰＣ−７
００：アステック社製）を行いＤＮＡ断片を増幅させた
（ｂ）。なお、プライマーは５’側に制限酵素切断部位
を持つように設計して化学合成した。
【００２２】まず、 1μg ｃＤＮＡ 1μl を、 1μM プ
ライマー 5μl と 1μM プライマー 5μl 、及び10
mM（dATP+dCTP+dGTP+dTTP) 4μl 、100mM Tris-HCl(pH
8.3）・500mM KCl ・15mM MgCl2・0.01% セラチンの10
倍希釈緩衝液、滅菌水 31 μlからなる溶液に溶解し、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaqTM）を 0.5μl を
加えて、94℃,1分間、次いで37℃,2分間、72℃,3分間で
反応させ、これを３０回繰返すことによってＤＮＡ断片
Ａを増幅させた。
ライマー 5μl と 1μM プライマー 5μl 、及び10
mM（dATP+dCTP+dGTP+dTTP) 4μl 、100mM Tris-HCl(pH
8.3）・500mM KCl ・15mM MgCl2・0.01% セラチンの10
倍希釈緩衝液、滅菌水 31 μlからなる溶液に溶解し、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaqTM）を 0.5μl を
加えて、94℃,1分間、次いで37℃,2分間、72℃,3分間で
反応させ、これを３０回繰返すことによってＤＮＡ断片
Ａを増幅させた。
【００２３】次に、上記プライマー、プライマーの
代わりにプライマー、プライマーを用い、その他同
様の組成で94℃,1分間、次いで37℃,2分間、72℃,3分間
で反応させ、これを３０回繰返すことによってＤＮＡ断
片Ｂを増幅させた。
代わりにプライマー、プライマーを用い、その他同
様の組成で94℃,1分間、次いで37℃,2分間、72℃,3分間
で反応させ、これを３０回繰返すことによってＤＮＡ断
片Ｂを増幅させた。
【００２４】以上の操作で得られたヒトＰＥＰの２つの
ＤＮＡ断片Ａ、Ｂを、重複している部分でつなぎ合わせ
ることによってヒトＴ細胞由来のＰＥＰ産生遺伝子の全
長をクローニングすることができた。このヒトＴ細胞由
来のＰＥＰ産生遺伝子の塩基配列２１３０ｂｐは配列表
に示した通りである。
ＤＮＡ断片Ａ、Ｂを、重複している部分でつなぎ合わせ
ることによってヒトＴ細胞由来のＰＥＰ産生遺伝子の全
長をクローニングすることができた。このヒトＴ細胞由
来のＰＥＰ産生遺伝子の塩基配列２１３０ｂｐは配列表
に示した通りである。
【００２５】この遺伝子が発現していることを確かめる
ために、クローンのＤＮＡをプローブとして、ヒト組織
から抽出されたｍＲＮＡに対してノーザンブロッティン
グを行った（Multiple Tissue Northern Blot ：クロー
ンテック社製）ところ、Ｔ細胞、脳、心臓、胎盤、肝
臓、骨格筋、腎臓およびすい臓等で発現していることが
確かめられた。ｍＲＮＡの長さは何れも約３Ｋヌクレオ
チドであった。
ために、クローンのＤＮＡをプローブとして、ヒト組織
から抽出されたｍＲＮＡに対してノーザンブロッティン
グを行った（Multiple Tissue Northern Blot ：クロー
ンテック社製）ところ、Ｔ細胞、脳、心臓、胎盤、肝
臓、骨格筋、腎臓およびすい臓等で発現していることが
確かめられた。ｍＲＮＡの長さは何れも約３Ｋヌクレオ
チドであった。
【００２６】次に、得られたヒトＴ細胞由来のＰＥＰ産
生遺伝子を、外来遺伝子をβ−ガラクトシダーゼとの融
合タンパク質として発現するベクターｐＡＸ４ａ＋に組
み込み、これを大腸菌に形質転換し、ヒトＴ細胞由来Ｐ
ＥＰをβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として
発現させ、精製工程を経て大量のＰＥＰを得るまでの工
程を以下に説明する。
生遺伝子を、外来遺伝子をβ−ガラクトシダーゼとの融
合タンパク質として発現するベクターｐＡＸ４ａ＋に組
み込み、これを大腸菌に形質転換し、ヒトＴ細胞由来Ｐ
ＥＰをβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として
発現させ、精製工程を経て大量のＰＥＰを得るまでの工
程を以下に説明する。
【００２７】なお、本実施例では、発現ベクターとし
て、図２に概略遺伝子地図を示したプラスミドｐＡＸ４
ａ＋（モビテック社製）を用いた。これは、外来遺伝子
をｌａｃオペレーターのコントロール下でβ−ガラクト
シダーゼの融合タンパク質として発現させる。また、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子ｌａｃＺの下流には、エンド
プロテイナーゼＸａにより認識切断されるアミノ酸配列
Ile-Glu-Gly-Arg が存在している。
て、図２に概略遺伝子地図を示したプラスミドｐＡＸ４
ａ＋（モビテック社製）を用いた。これは、外来遺伝子
をｌａｃオペレーターのコントロール下でβ−ガラクト
シダーゼの融合タンパク質として発現させる。また、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子ｌａｃＺの下流には、エンド
プロテイナーゼＸａにより認識切断されるアミノ酸配列
Ile-Glu-Gly-Arg が存在している。
【００２８】実施例２ 操作(1) プラスミドｐＡＸ４ａＰＥＰの作製： まず、上記実施例１の操作(4) で得たＤＮＡ断片Ａを制
限酵素ＥｃｏＲＩおよび制限酵素ＰｖｕＩＩとで両端部
を切断してＤＮＡ断片Ａa を、ＤＮＡ断片Ｂを制限酵素
ＰｖｕＩＩおよび制限酵素ＳａｌＩとで両端部を切断し
てＤＡＮ断片Ｂb をそれぞれ調製した（図１（ｃ））。
これらの調製法を以下に示す。
限酵素ＥｃｏＲＩおよび制限酵素ＰｖｕＩＩとで両端部
を切断してＤＮＡ断片Ａa を、ＤＮＡ断片Ｂを制限酵素
ＰｖｕＩＩおよび制限酵素ＳａｌＩとで両端部を切断し
てＤＡＮ断片Ｂb をそれぞれ調製した（図１（ｃ））。
これらの調製法を以下に示す。
【００２９】各ＤＮＡ溶液に、制限酵素を各々10unit加
え、37℃で３時間インキュベートした後、65℃で10分間
の酵素失活処理を行う。各反応液をアガロースゲルにて
電気泳動させ、ＤＮＡ断片を切り出して抽出する。ゲル
からの抽出は、ゲルをNaI 溶液に溶かし、この溶液にガ
ラスビーズを加えてＤＮＡ断片を吸着させ、このガラス
ビーズを洗浄した後、滅菌水中で65℃に加熱することに
よってガラスビーズからＤＮＡ断片を回収する。
え、37℃で３時間インキュベートした後、65℃で10分間
の酵素失活処理を行う。各反応液をアガロースゲルにて
電気泳動させ、ＤＮＡ断片を切り出して抽出する。ゲル
からの抽出は、ゲルをNaI 溶液に溶かし、この溶液にガ
ラスビーズを加えてＤＮＡ断片を吸着させ、このガラス
ビーズを洗浄した後、滅菌水中で65℃に加熱することに
よってガラスビーズからＤＮＡ断片を回収する。
【００３０】前述したベクターｐＡＸ４ａ＋を制限酵素
ＥｃｏＲＩおよび制限酵素ＳａｌＩとで切断し、β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子ｌａｃＺとその下流のエンドプロ
テイナーゼＸａにより認識切断されるアミノ酸配列を含
む領域Ｃを調製した（図１（ｄ））。調製法は、上記の
ＤＡＮ断片の調製法と同様である。
ＥｃｏＲＩおよび制限酵素ＳａｌＩとで切断し、β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子ｌａｃＺとその下流のエンドプロ
テイナーゼＸａにより認識切断されるアミノ酸配列を含
む領域Ｃを調製した（図１（ｄ））。調製法は、上記の
ＤＡＮ断片の調製法と同様である。
【００３１】これらＤＮＡ断片ＡａとＤＮＡ断片Ｂｂと
ベクターｐＡＸ４ａ＋のＣ領域とを、フレームを合わせ
てリガーゼにより以下のごとく結合させ、プラスミドｐ
ＡＸ４ａＰＥＰを作成した（図１（ｅ））。即ち、上記
３種のＤＡＮ断片の混合液に、リガーゼを加えて12℃に
て１晩反応させ、反応後、65℃、１０分間の酵素失活処
理を行った。
ベクターｐＡＸ４ａ＋のＣ領域とを、フレームを合わせ
てリガーゼにより以下のごとく結合させ、プラスミドｐ
ＡＸ４ａＰＥＰを作成した（図１（ｅ））。即ち、上記
３種のＤＡＮ断片の混合液に、リガーゼを加えて12℃に
て１晩反応させ、反応後、65℃、１０分間の酵素失活処
理を行った。
【００３２】操作(2) ヒトＴ細胞由来ＰＥＰ産生遺伝子
の大腸菌中での発現： まず、上記操作(1) によって調製されたプラスミドｐＡ
Ｘ４ａＰＥＰを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。な
お、形質転換体としてプラスミドｐＡＸ４ａＰＥＰを導
入した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０９（ｐ
ＡＸ４ａＰＥＰ））は、寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１３
９６３として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
済である。
の大腸菌中での発現： まず、上記操作(1) によって調製されたプラスミドｐＡ
Ｘ４ａＰＥＰを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。な
お、形質転換体としてプラスミドｐＡＸ４ａＰＥＰを導
入した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０９（ｐ
ＡＸ４ａＰＥＰ））は、寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１３
９６３として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
済である。
【００３３】形質転換の方法は以下の通りである。ライ
ゲーション反応液 2μl とＪＭ１０９コンピテントセル
（東洋紡社製） 100μl を混ぜ、氷中で30分放置した
後、ＬＢ培地（バクトトリプトン10g ，イーストエキス
5g，NaCl 5g ／ｌ）1ml を加え、37℃で１時間振盪す
る。これをＬＢ培地とアンピシリンの入った寒天培地に
まいて37℃で１晩培養する。この培地上に生じたコロニ
ーから、上記ｐＡＸ４ａＰＥＰプラスミドを含む菌をス
クリーニングして迸択した。スクリーニングは、大腸菌
のプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断し、構造
を確認することで行った。
ゲーション反応液 2μl とＪＭ１０９コンピテントセル
（東洋紡社製） 100μl を混ぜ、氷中で30分放置した
後、ＬＢ培地（バクトトリプトン10g ，イーストエキス
5g，NaCl 5g ／ｌ）1ml を加え、37℃で１時間振盪す
る。これをＬＢ培地とアンピシリンの入った寒天培地に
まいて37℃で１晩培養する。この培地上に生じたコロニ
ーから、上記ｐＡＸ４ａＰＥＰプラスミドを含む菌をス
クリーニングして迸択した。スクリーニングは、大腸菌
のプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断し、構造
を確認することで行った。
【００３４】次に、上記の迸択した大腸菌をアンピシリ
ン入りのＬＢ培地に接種し、37℃、３時間振盪培養を行
った。さらに、この培養液にＩＰＴＧを添加し、37℃ま
たは28℃で５時間培養し、ＰＥＰをβ−ガラクトシダー
ゼとの融合タンパク質として発現させた。
ン入りのＬＢ培地に接種し、37℃、３時間振盪培養を行
った。さらに、この培養液にＩＰＴＧを添加し、37℃ま
たは28℃で５時間培養し、ＰＥＰをβ−ガラクトシダー
ゼとの融合タンパク質として発現させた。
【００３５】ここで、この培養菌体を回収し、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥのサンプル緩衝液に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で解析を行った。大腸菌の培養の際に 1mMのイソプロピ
ルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ：β−ガラクシダーゼの
無償性誘導物質）を添加した場合では、約 180kdと約 1
10Kdのバンドが誘導結合されていた。約 180Kdのバンド
は、その大きさからβ−ガラクトシダーゼとＰＥＰとの
融合タンパク質であると思われた。また約 110Kdのバン
ドは、β−ガラクトシダーゼとほぼ同じぐらいの大きさ
で、細かく見ると複数のバンドからなっており、上記融
合タンパク質の分解物あるいは翻訳途中で合成が止まっ
たものである可能性がある。
ＰＡＧＥのサンプル緩衝液に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で解析を行った。大腸菌の培養の際に 1mMのイソプロピ
ルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ：β−ガラクシダーゼの
無償性誘導物質）を添加した場合では、約 180kdと約 1
10Kdのバンドが誘導結合されていた。約 180Kdのバンド
は、その大きさからβ−ガラクトシダーゼとＰＥＰとの
融合タンパク質であると思われた。また約 110Kdのバン
ドは、β−ガラクトシダーゼとほぼ同じぐらいの大きさ
で、細かく見ると複数のバンドからなっており、上記融
合タンパク質の分解物あるいは翻訳途中で合成が止まっ
たものである可能性がある。
【００３６】操作(3) ＰＥＰの精製： 上記培養により得られた大腸菌を破砕し、その大腸菌破
砕液を遠心分離して上清液と沈殿層とを分けたところ、
沈殿にβ−ガラクトシダーゼとＰＥＰとの融合タンパク
質が多く含まれていた。そこで、これを8M尿素で可溶化
し、透析して尿素を除いた。この融合タンパク質溶液を
抗β−ガラクトシダーゼカラム（ProtoSorb lacZ：プロ
メガ社製）内を通すことによって、カラム内に固定され
たβ−ガラクトシダーゼ抗体に融合タンパク質のβ−ガ
ラクトシダーゼ部を吸着させた。これを洗浄したのち、
ｐＨを上げて融合タンパクを溶出した。この溶出された
融合タンパク質は、主に 180Kdのタンパクであった。こ
こでは 110Kdのタンパクも若干溶出されていた。溶出液
に対して行った銀染色のゲル上では、これら以外のバン
ドは観察されなかった。
砕液を遠心分離して上清液と沈殿層とを分けたところ、
沈殿にβ−ガラクトシダーゼとＰＥＰとの融合タンパク
質が多く含まれていた。そこで、これを8M尿素で可溶化
し、透析して尿素を除いた。この融合タンパク質溶液を
抗β−ガラクトシダーゼカラム（ProtoSorb lacZ：プロ
メガ社製）内を通すことによって、カラム内に固定され
たβ−ガラクトシダーゼ抗体に融合タンパク質のβ−ガ
ラクトシダーゼ部を吸着させた。これを洗浄したのち、
ｐＨを上げて融合タンパクを溶出した。この溶出された
融合タンパク質は、主に 180Kdのタンパクであった。こ
こでは 110Kdのタンパクも若干溶出されていた。溶出液
に対して行った銀染色のゲル上では、これら以外のバン
ドは観察されなかった。
【００３７】その後、上記融合タンパク質の溶出液に、
モル濃度で 1/100量のエンドプロテイナーゼＸａ（Prot
ease Factor Xa：宝酒造製）を加え、４℃、１晩インキ
ュベートして反応させることによってβ−ガラクトシダ
ーゼタンパクとＰＥＰタンパクとの間を切断分離した。
モル濃度で 1/100量のエンドプロテイナーゼＸａ（Prot
ease Factor Xa：宝酒造製）を加え、４℃、１晩インキ
ュベートして反応させることによってβ−ガラクトシダ
ーゼタンパクとＰＥＰタンパクとの間を切断分離した。
【００３８】上記反応によって切断分離したβ−ガラク
トシダーゼタンパクとＰＥＰタンパクとの溶液を、再び
抗β−ガラクトシダーゼカラム（ProtoSorb lacZ：プロ
メガ社製）内を通すことによってカラム内に固定された
β−ガラクトシダーゼ抗体に溶液中のβ−ガラクトシダ
ーゼのみが吸着される。従って、カラムを通過した液
は、β−ガラクトシダーゼのみが除去されたＰＥＰ溶液
である。以上の操作によって、ＰＥＰ遺伝子産物を大腸
菌に合成させ、簡単に精製することができる。
トシダーゼタンパクとＰＥＰタンパクとの溶液を、再び
抗β−ガラクトシダーゼカラム（ProtoSorb lacZ：プロ
メガ社製）内を通すことによってカラム内に固定された
β−ガラクトシダーゼ抗体に溶液中のβ−ガラクトシダ
ーゼのみが吸着される。従って、カラムを通過した液
は、β−ガラクトシダーゼのみが除去されたＰＥＰ溶液
である。以上の操作によって、ＰＥＰ遺伝子産物を大腸
菌に合成させ、簡単に精製することができる。
【００３９】なお、操作(2) において培養し、β−ガラ
クトシダーゼとＰＥＰとの融合タンパク質を有すると思
われる大腸菌の破砕液に対してＰＥＰ活性測定を行った
ところ、大腸菌の培養を37℃で行ったものについてはＰ
ＥＰ活性は認められなかったが、培地にＩＰＴＧを添加
して28℃で培養を行った融合タンパクを誘導発現させも
のについてはＰＥＰ活性が認められた。これは、ＩＰＴ
Ｇ非添加のもののバックグラウンドよりも１０倍高いＰ
ＥＰ活性であった。この活性がＰＥＰの特異的阻害剤で
あるｚＰＰにより阻害されたことから、今回クローニン
グした遺伝子がＰＥＰタンパクをコードしている遺伝子
であることが立証された。
クトシダーゼとＰＥＰとの融合タンパク質を有すると思
われる大腸菌の破砕液に対してＰＥＰ活性測定を行った
ところ、大腸菌の培養を37℃で行ったものについてはＰ
ＥＰ活性は認められなかったが、培地にＩＰＴＧを添加
して28℃で培養を行った融合タンパクを誘導発現させも
のについてはＰＥＰ活性が認められた。これは、ＩＰＴ
Ｇ非添加のもののバックグラウンドよりも１０倍高いＰ
ＥＰ活性であった。この活性がＰＥＰの特異的阻害剤で
あるｚＰＰにより阻害されたことから、今回クローニン
グした遺伝子がＰＥＰタンパクをコードしている遺伝子
であることが立証された。
【００４０】上記の28℃培養によって発現させたＰＥＰ
は、ＰＥＰ活性をそのまま保持しているだけでなく、Ｐ
ＥＰそのものより安定性にも優れており、ＰＥＰ阻害物
質のスクリーニングに利用できる。また、37℃培養によ
るＰＥＰは、ＰＥＰ活性が認められなかったが、これ
は、タンパク質が絡み合って固まりになっていると考え
られる。しかしながら、ＰＥＰ活性はなくてもタンパク
質としては同じものであるので、抗体の作成や分析に利
用することができる。
は、ＰＥＰ活性をそのまま保持しているだけでなく、Ｐ
ＥＰそのものより安定性にも優れており、ＰＥＰ阻害物
質のスクリーニングに利用できる。また、37℃培養によ
るＰＥＰは、ＰＥＰ活性が認められなかったが、これ
は、タンパク質が絡み合って固まりになっていると考え
られる。しかしながら、ＰＥＰ活性はなくてもタンパク
質としては同じものであるので、抗体の作成や分析に利
用することができる。
【００４１】なお、本発明は、上記実施例で用いた試
薬、大腸菌株等に限定するものではない。
薬、大腸菌株等に限定するものではない。
【００４２】
【発明の効果】本発明は以上説明したとおり、既知のブ
タＰＥＰ産生遺伝子の塩基配列の一部をプライマーとし
てＰＣＲ法を応用することによって、ヒトＴ細胞由来の
ＰＥＰ産生遺伝子をクローニングすることを可能とし
た。さらに、このヒトＴ細胞由来のＰＥＰ産生遺伝子を
用いた本発明のヒトＰＥＰの製造方法によれば、大量の
ヒトＰＥＰを簡便に大腸菌に産生させられるという効果
がある。
タＰＥＰ産生遺伝子の塩基配列の一部をプライマーとし
てＰＣＲ法を応用することによって、ヒトＴ細胞由来の
ＰＥＰ産生遺伝子をクローニングすることを可能とし
た。さらに、このヒトＴ細胞由来のＰＥＰ産生遺伝子を
用いた本発明のヒトＰＥＰの製造方法によれば、大量の
ヒトＰＥＰを簡便に大腸菌に産生させられるという効果
がある。
配列番号：１ 配列の長さ：２１３０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト 細胞の種類：Ｔ細胞 株名：ＭＯＬＴ４ｃｌｏｎｅ８株 配列 ATGCTGTCCT TCCAGTACCC CGACGTGTAC CGCGACGAGA CCGCCATACA GCATTATCAT 60 GGTCATAAAA TTTGTGACCC TTACGCCTGG CTTGAAGACC CCGACAGTGA ACAGACTAAG 120 GCCTTTGTGG AGGCCCAGAA TAAGATTACT GTGCCATTTC TTGAGCAGTG TCCCATCAGA 180 GGTTTATACA AAGAGAGAAT GACTGAACTA TATGATTATC CCAAGTATAG TTGCCACTTC 240 AAGAAAGGAA AACGGTATTT TTATTTTTAC AATACAGGTT TGCAGAACCA GCGAGTATTA 300 TATGTACAGG ATTCCTTAGA GGGTGAGGCC AGAGTGTTCC TGGACCCCAA CATACTGTCT 360 GACGATGGCA CAGTGGCACT CCGAGGTTAT GCGTTCAGCG AAGATGGTGA ATATTTTGCC 420 TATGGTCTGA GTGCCAGTGG CTCAGACTGG GTGACAATCA AGTTCATGAA AGTTGATGGT 480 GCCAAAGAGC TTCCAGATGT GCTTGAAAGA GTCAAGTTCA GCTGTATGGC CTGGACCCAT 540 GATGGGAAGG GAATGTTCTA CAACTCATAC CCTCAACAGG ATGGAAAAAG TGATGGCACA 600 GAGACATCTA CCAATCTCCA CCAAAAGCTC TACTACCATG TCTTGGGAAC CGATCAGTCA 660 GAAGATATTT TGTGTGCTGA GTTTCCTGAT GAACCTAAAT GGATGGGTGG AGCTGAGTTA 720 TCTGATGATG GCTGCTATGT CTTGTTATCA ATAAGGGAAG GATGTGATCC AGTAAACCGA 780 CTCTGGTACT GTGACCTACA GCAGGAATCC AGTGGCATCG CGGGAATCCT GAAGTGGGTA 840 AAACTGATTG ACAACTTTGA AGGGGAATAT GACTACGTGA CCAATGAGGG GGCGGTGTTC 900 ACATTCAAGA CGAATCGCCA GTCTCCCAAC TATCGCGTGA TCAACATTGA CTTCAGGGAT 960 CCTGAAGAGT CTAAGTGGAA AGTACTTGTT CCTGAGCATG AGAAAGATGT CTTAGAATGG 1020 ATAGCTTGTG TCAGGTCCAA CTTCTTGGTC TTATGCTACC TCCATGACGT CAAGAACATT 1080 CTGCAGCTCC ATGACCTGAC TACTGGTGCT CTCCTTAAGA CCTTCCCGCT CGATGTCGGC 1140 AGCATTGTAG GGTACAGCGG TCAGAAGAAG GACACTGAAA TCTTCTATCA GTTTACTTCC 1200 TTTTTATCTC CAGGTATCAT TTATCACTGT GATCTGACCA AAGAGGAGCT GGAGCCAAGA 1260 GTCTTCCGCG AGGTGACCGT GAAAGGAATT GATGCTTCTG ACTACCAGAC AGTCCAGCTT 1320 TTCTACCCTA GCAAGGATGG TACGAAGATT CCAATGTTCA TTGTGCATAA AAAAAGCATA 1380 AAATTGGATG GCTCTCATCC AGCTTTCTTA TATGGCTATG GCGGCTTCAA CATATCCATC 1440 ACACCCAACT ACAGTGTTTC CAGGCTTATT TTTGTGAGAC ACATGGGTGG TATCCTGGCA 1500 GTGGCCAACA TCAGAGGAGG TGGCGAATAT GGAGAGACGT GGCATAAAGG TGGTATCTTG 1560 GCCAACAAAC AAAACTGCTT TGATGACTTT CAGTGTGCTG CTGAGTATCT GATCAAGGAA 1620 GGTTACACAT CTCCCAAGAG GCTGACTATT AATGGAGGTT CAAATGGAGG CCTCTTAGTG 1680 GCTGCTTGTG CAAATCAGAG ACCTGACCTC TTTGGTTGTG TTATTGCCCA AGTTGGAGTA 1740 ATGGACATGC TGAAGTTTCA TAAATATACC ATCGGCCATG CTTGGACCAC TGATTATGGG 1800 TGCTCGGACA GCAAACAACA CTTTGAATGG CTTGTCAAAT ACTCTCCATT GCATAATGTG 1860 AAGTTACCAG AAGCAGATGA CATCCAGTAC CCGTCCATGC TGCTCCTCAC TGCTGACCAT 1920 GATGACCGCG TGGTCCCGCT TCACTCCCTG AAGTTCATTG CCACCCTTCA GTACATCGTG 1980 GGCCGCAGCA GGAAGCAAAG CAACCCCCTG CTTATCCACG TGGACACCAA GGCGGGCCAC 2040 GGGGCGGGGA AGCCCACAGC CAAAGTGATA GAGGAAGTCT CAGACATGTT TGCGTTCATC 2100 GCGCGGTGCC TGAACATCGA CTGGATTCCG 2130
【図１】本発明の一実施例によるプラスミドｐＡＸａＰ
ＥＰの作製工程を示す説明図である。
ＥＰの作製工程を示す説明図である。
【図２】上記実施例で発現ベクターとして用いたプラス
ミドｐＡＸａ＋の概略遺伝子地図である。
ミドｐＡＸａ＋の概略遺伝子地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】 ヒトＴ細胞由来のプロリルエンドペプチ
ダーゼを産生することを特徴とするヒトＴ細胞由来プロ
リルエンドペプチダーゼ産生遺伝子断片。 - 【請求項２】 以下の塩基配列からなるプロリルエンド
ペプチダーゼ産生遺伝子断片。 ATGCTGTCCT TCCAGTACCC CGACGTGTAC CGCGACGAGA CCGCCATACA GCATTATCAT GGTCATAAAA TTTGTGACCC TTACGCCTGG CTTGAAGACC CCGACAGTGA ACAGACTAAG GCCTTTGTGG AGGCCCAGAA TAAGATTACT GTGCCATTTC TTGAGCAGTG TCCCATCAGA GGTTTATACA AAGAGAGAAT GACTGAACTA TATGATTATC CCAAGTATAG TTGCCACTTC AAGAAAGGAA AACGGTATTT TTATTTTTAC AATACAGGTT TGCAGAACCA GCGAGTATTA TATGTACAGG ATTCCTTAGA GGGTGAGGCC AGAGTGTTCC TGGACCCCAA CATACTGTCT GACGATGGCA CAGTGGCACT CCGAGGTTAT GCGTTCAGCG AAGATGGTGA ATATTTTGCC TATGGTCTGA GTGCCAGTGG CTCAGACTGG GTGACAATCA AGTTCATGAA AGTTGATGGT GCCAAAGAGC TTCCAGATGT GCTTGAAAGA GTCAAGTTCA GCTGTATGGC CTGGACCCAT GATGGGAAGG GAATGTTCTA CAACTCATAC CCTCAACAGG ATGGAAAAAG TGATGGCACA GAGACATCTA CCAATCTCCA CCAAAAGCTC TACTACCATG TCTTGGGAAC CGATCAGTCA GAAGATATTT TGTGTGCTGA GTTTCCTGAT GAACCTAAAT GGATGGGTGG AGCTGAGTTA TCTGATGATG GCTGCTATGT CTTGTTATCA ATAAGGGAAG GATGTGATCC AGTAAACCGA CTCTGGTACT GTGACCTACA GCAGGAATCC AGTGGCATCG CGGGAATCCT GAAGTGGGTA AAACTGATTG ACAACTTTGA AGGGGAATAT GACTACGTGA CCAATGAGGG GGCGGTGTTC ACATTCAAGA CGAATCGCCA GTCTCCCAAC TATCGCGTGA TCAACATTGA CTTCAGGGAT CCTGAAGAGT CTAAGTGGAA AGTACTTGTT CCTGAGCATG AGAAAGATGT CTTAGAATGG ATAGCTTGTG TCAGGTCCAA CTTCTTGGTC TTATGCTACC TCCATGACGT CAAGAACATT CTGCAGCTCC ATGACCTGAC TACTGGTGCT CTCCTTAAGA CCTTCCCGCT CGATGTCGGC AGCATTGTAG GGTACAGCGG TCAGAAGAAG GACACTGAAA TCTTCTATCA GTTTACTTCC TTTTTATCTC CAGGTATCAT TTATCACTGT GATCTGACCA AAGAGGAGCT GGAGCCAAGA GTCTTCCGCG AGGTGACCGT GAAAGGAATT GATGCTTCTG ACTACCAGAC AGTCCAGCTT TTCTACCCTA GCAAGGATGG TACGAAGATT CCAATGTTCA TTGTGCATAA AAAAAGCATA AAATTGGATG GCTCTCATCC AGCTTTCTTA TATGGCTATG GCGGCTTCAA CATATCCATC ACACCCAACT ACAGTGTTTC CAGGCTTATT TTTGTGAGAC ACATGGGTGG TATCCTGGCA GTGGCCAACA TCAGAGGAGG TGGCGAATAT GGAGAGACGT GGCATAAAGG TGGTATCTTG GCCAACAAAC AAAACTGCTT TGATGACTTT CAGTGTGCTG CTGAGTATCT GATCAAGGAA GGTTACACAT CTCCCAAGAG GCTGACTATT AATGGAGGTT CAAATGGAGG CCTCTTAGTG GCTGCTTGTG CAAATCAGAG ACCTGACCTC TTTGGTTGTG TTATTGCCCA AGTTGGAGTA ATGGACATGC TGAAGTTTCA TAAATATACC ATCGGCCATG CTTGGACCAC TGATTATGGG TGCTCGGACA GCAAACAACA CTTTGAATGG CTTGTCAAAT ACTCTCCATT GCATAATGTG AAGTTACCAG AAGCAGATGA CATCCAGTAC CCGTCCATGC TGCTCCTCAC TGCTGACCAT GATGACCGCG TGGTCCCGCT TCACTCCCTG AAGTTCATTG CCACCCTTCA GTACATCGTG GGCCGCAGCA GGAAGCAAAG CAACCCCCTG CTTATCCACG TGGACACCAA GGCGGGCCAC GGGGCGGGGA AGCCCACAGC CAAAGTGATA GAGGAAGTCT CAGACATGTT TGCGTTCATC GCGCGGTGCC TGAACATCGA CTGGATTCCG - 【請求項３】 ヒトＴ細胞にて発現しているｍＲＮＡか
ら合成したｃＤＮＡを基に、ブタのプロリルエンドペプ
チダーゼ産生遺伝子の塩基配列の一部をプライマーとし
て用い、酵素的ＤＮＡ増幅法によって増幅しクローニン
グすることを特徴とする請求項１又は２に記載のヒトＴ
細胞由来のプロリルエンドペプチダーゼ産生遺伝子断片
の製造法。 - 【請求項４】 外来遺伝子をβ−ガラクトシダーゼとの
融合タンパク質として発現する機能を有するベクター
に、前記請求項１又は２に記載のヒトＴ細胞由来のプロ
リルエンドペプチダーゼ産生遺伝子断片を組み込み、適
当な宿主によりヒトＴ細胞由来プロリルエンドペプチダ
ーゼをβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として
発現させ、該融合タンパク質の前記β−ガラクトシダー
ゼ部分を除去することによってヒトＴ細胞由来プロリル
エンドペプチダーゼを得ることを特徴とするヒトＴ細胞
由来プロリルエンドペプチダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5342194A JPH07163367A (ja) | 1993-12-15 | 1993-12-15 | ヒトｔ細胞由来プロリルエンドペプチダーゼ産生遺伝子断片および該エンドペプチダーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5342194A JPH07163367A (ja) | 1993-12-15 | 1993-12-15 | ヒトｔ細胞由来プロリルエンドペプチダーゼ産生遺伝子断片および該エンドペプチダーゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07163367A true JPH07163367A (ja) | 1995-06-27 |
Family
ID=18351849
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5342194A Pending JPH07163367A (ja) | 1993-12-15 | 1993-12-15 | ヒトｔ細胞由来プロリルエンドペプチダーゼ産生遺伝子断片および該エンドペプチダーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07163367A (ja) |
-
1993
- 1993-12-15 JP JP5342194A patent/JPH07163367A/ja active Pending
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