WO2005017144A1 - ｄｓＲＮＡ分解およびＲＮＡ合成方法 - Google Patents

ｄｓＲＮＡ分解およびＲＮＡ合成方法 Download PDF

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WO2005017144A1
WO2005017144A1 PCT/JP2004/011480 JP2004011480W WO2005017144A1 WO 2005017144 A1 WO2005017144 A1 WO 2005017144A1 JP 2004011480 W JP2004011480 W JP 2004011480W WO 2005017144 A1 WO2005017144 A1 WO 2005017144A1
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WO
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protein
dsrna
activity
rna
nucleic acid
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PCT/JP2004/011480
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English (en)
French (fr)
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Hiroaki Sagawa
Jun Tomono
Harumi Ueno
Ikunoshin Kato
Original Assignee
Takara Bio Inc.
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a protein having an activity of producing a dsRNA of a specific length, a protein having a dsRNA degrading activity, a dsRNA obtained by combining the protein with a protein having a nucleic acid binding activity, for example, a protein having an RNA binding activity.
  • the present invention relates to a method for efficiently decomposing RNA and a method for efficiently synthesizing RNA by combining a protein having nucleic acid binding activity and a protein having RNA synthesis activity.
  • RNA interference is a phenomenon in which mRNA is degraded by dsRNA in a sequence-specific manner, resulting in suppression of gene expression.
  • the inception that dsRNA was able to silence genes came from studies using antisense in nematodes.
  • Guo and Kemphues conducted an experiment in which a gene called par-1 was suppressed with antisense RNA.
  • Addition of antisense RNA suppressed the expression of par ⁇ l as expected
  • the sense RNA used as a control also suppressed the expression of par-1 and the phenotype of the par-1 mutant showed that.
  • Non-Patent Document 2 When synthesizing antisense RNA and sense RNA using RNA polymerase, respectively, slightly nonspecific reverse RNAs are generated. The dsRNA generated by the contamination is the main component of gene silencing, antisense RNA and sense RNA cannot suppress gene expression, and dsRNA that anneals antisense RNA and sense RNA is effective. It was found that gene expression can be suppressed efficiently. (For example, Non-Patent Document 2)
  • RNA interference an enzyme called Dicer generates small molecule RNA (sRNA: short interfering RNA) from dsRNA.
  • sRNA small molecule RNA
  • dsRNA short interfering RNA
  • Non-Patent Document 4 RNA induced silencing com plex
  • Non-Patent Document 5 human-derived Dicer
  • Non-Patent Document 6 a recombinant Dicer
  • dsRNA having a chain length of about 21 nucleotides synthesized using RNA polymerase is used as it is as an siRNA (for example, Non-Patent Document 7). Therefore, if there is a method that can efficiently produce RNA, it can be used for the above method.
  • Non-patent literature l Guo S. et al. Cell 1995 vol. 81, p611_620
  • Non-patent document 2 Fire A. et al. 5 Nature 1998 vol. 39, ⁇ 806 ⁇ 811
  • Non-patent document 3 Bernstein ⁇ . Et al. 3 people Nature 2001 vol. 409, p363_366
  • Non-patent document 4 Tabara H. et al. 3 Name Cell 2002 vol.109, p861-871
  • Non-Patent Document 5 Zhang H. et al. 4 The EMBO Journal 2002 vol.21, No
  • Non-Patent Document 6 Myers J.W. and 3 others Nature biotechnology 2003 vol. 21, p324-328
  • Non-patent Document 7 Donze O. et al. 1 Nucleic Acids Research 2002 vol. 30, No. 10, e46 Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, analyzed the functional domain of Dicer, and found that it has the activity of acting on long-chain dsRNA to generate dsRNA of a specific length. A protein having dsRNA degradation activity was found.
  • a dsRNA having a specific length can be efficiently prepared by allowing a dsRNA to act on a dsRNA in the presence of a protein having a nucleic acid binding activity, for example, a protein having an RNA binding activity.
  • a protein having the nucleic acid binding activity improves the efficiency of an RNA synthesis reaction represented by dsRNA synthesis, and completed the present invention.
  • a first invention of the present invention is a dsRNA degrading activity, which is a protein having a dsRNA degrading activity, wherein the protein has an activity of acting on dsRNA to generate a dsRNA of a specific length.
  • the protein having dsRNA-degrading activity preferably has a functional domain of Dicer, and for example, preferably comprises RNaseIIIa, b and a dsRNA-binding domain. In addition, even if it contains a PAZ domain. Further, by using the protein of the first invention of the present invention, dsRNA of a specific length can generate dsRNA of about 15 to 30 base pairs. Further, as the protein of the first invention of the present invention, the protein having dsRNA degrading activity is encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 17 in the sequence listing or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 16 in the sequence listing.
  • a protein comprising an amino acid sequence is exemplified.
  • it may be a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 17 in the sequence listing, in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted or added.
  • the protein having the dsRNA-degrading activity of the first invention of the present invention has a codon suitable for expression in a host. It can be efficiently produced by conversion or by using a host reinforced for rare codons.
  • the protein can be expressed using a cold-inducible vector.
  • the protein of the first invention of the present invention can be contained in a kit as a component.
  • a second invention of the present invention is characterized in that a dsRNA having a dsRNA-degrading activity is allowed to act on dsRNA in the presence of a protein having a nucleic acid binding activity to produce a dsRNA of a specific length.
  • the present invention relates to a method for degrading dsRNA.
  • the protein having nucleic acid binding activity and the protein having dsRNA degradation activity may be fusion proteins.
  • the protein having nucleic acid binding activity may be a protein having RNA binding activity.
  • the protein having the RNA binding activity may be a cold shock protein or may be derived from a thermophilic bacterium or a thermostable bacterium.
  • cold shock protein B derived from Thermotoga maritima is exemplified.
  • a dsRNA having a specific length of about 15 to 30 base pairs can be produced.
  • the protein having the dsRNA degrading activity may be the protein of the first invention of the present invention, or may be a natural Dicer or a functional equivalent thereof. .
  • the third invention of the present invention relates to a method for synthesizing RNA, which comprises performing an RNA synthesis reaction using a protein having RNA synthesis activity in the presence of a protein having nucleic acid binding activity.
  • the protein having nucleic acid binding activity and the protein having RNA synthesis activity may be fusion proteins.
  • the protein having the nucleic acid binding activity may be a cold shock protein, or may be derived from a thermophilic bacterium or a thermostable bacterium.
  • cold shock protein B derived from Thermotoga maritima is exemplified.
  • the protein having the activity of synthesizing RNA may be a DNA-dependent RNA polymerase.
  • a fourth invention of the present invention is a composition for use in the method of the second invention of the present invention.
  • a protein having a nucleic acid binding activity and a protein having a dsRNA degrading activity is a composition for use in the method of the second invention of the present invention.
  • a fifth invention of the present invention is a kit for use in the method of the second invention of the present invention.
  • a kit comprising a protein having nucleic acid binding activity and a protein having dsRNA degrading activity.
  • a sixth invention of the present invention is a composition for use in the method of the third invention of the present invention, which comprises a protein having a nucleic acid binding activity and a protein having an RNA synthesis activity.
  • the composition features.
  • a seventh invention of the present invention is a kit for use in the third method of the present invention, which comprises a protein having a nucleic acid binding activity and a protein having an RNA synthesis activity. About.
  • a protein having a dsRNA degrading activity capable of preparing dsRNA of a specific length. Further, according to the present invention, dsRNA of a specific length that can be used for RNA interference or the like can be efficiently produced.
  • Dicer refers to a protein having a function of processing long dsRNA into siRNA at an early stage of RNAi.
  • Examples of the natural Dicer include, but are not limited to, those composed of an ATP binding domain, an RNA helicase domain, a PAZ domain of unknown function, RNasellla and b domains, and a dsRNA binding domain from the N-terminal side.
  • the functional domain of Dicer refers to a site encoding a region involved in an activity capable of producing a dsRNA of a specific length by acting on a long dsRNA.
  • the functional domain is not particularly limited, and examples thereof include RNasellla, b domain and dsRNA binding domain.
  • the RNaseIIIa and b domains specifically act on double-stranded RNA, as described in Zhang H. et al., Four, The EMBO Journal 2002 vol. 21, No. 21, p5875-5885, and 5 ′
  • the dsRNA binding domain may be a site encoding an activity that specifically binds to double-stranded RNA.
  • dsRNA refers to RNA that forms a double-stranded structure of an mRNA to be subjected to RNA interference and an RNA having a complementary nucleotide sequence to the mRNA.
  • examples of application of a product obtained by a degradation reaction of dsRNA include siRNA mainly shown below.
  • the dsRNA of a specific length is not particularly limited, but refers to, for example, a dsRNA of a specific length in a range of about 100 base pairs.
  • the dsRNA may be of a specific length in the range of about 1530 base pairs, particularly of a specific length in the range of 2025 base pairs.
  • These dsRNAs can be used as siRNA.
  • protein having nucleic acid binding activity refers to a protein having an activity of binding to single-stranded or double-stranded DNA or RNA.
  • proteins having a function of resolving the secondary structure of a nucleic acid are preferable, and examples thereof include DNA helicase, RNA helicase and functional equivalents thereof.
  • cold-inducible vector refers to a vector having a promoter that can function at a low temperature, such as a p Cold vector described in WO 99/27117. .
  • cold shock protein is a general term for proteins that are expressed by being stimulated by a decrease in temperature under a condition where the temperature is lower than the original growth condition.
  • the term "completely decompose a long dsRNA serving as a substrate” refers to decomposing a long dsRNA serving as an uncleaved substrate after a decomposition reaction to such an extent that it is not confirmed by electrophoresis. .
  • the PAZ domain is a domain existing between the RNA helicase domain of Dicer and the RNasellla and b domains.
  • it is a region of amino acid numbers 898-1064 (base numbers 269 2-3192 of SEQ ID NO: 2) in the amino acid sequence of Dicer of human origin described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the rare codon means a codon that is rarely used.
  • One amino acid Depending on the species that is defined by multiple codons, there is a bias in the frequency of use between these multiple codons.
  • tRNA transfer RNA
  • the protein having dsRNA-degrading activity of the present invention can act on dsRNA to produce dsRNA of a specific length.
  • the protein having the dsRNA-degrading activity is not particularly limited as long as it can generate a dsRNA of a specific length from a long-chain dsRNA.
  • a protein having a functional domain of Dicer is exemplified.
  • the functional domain of the Dicer may be a protein comprising RNaseIIIa, b and dsRNA binding domains.
  • the origin of the protein does not matter as long as it can generate dsRNA of a specific length from long dsRNA.
  • RNase IIIa, b domain and dsRNA binding domain are not particularly limited, but, for example, in the case of human-derived Dicer, amino acids 1271-1924 on the N-terminal side of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) Base sequence No. 3811-5772).
  • a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing a protein consisting of the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing (Dicer mutant), or a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12
  • examples thereof include a protein consisting of an amino acid sequence or a protein (Dicer variant) consisting of the amino acid sequence IJ encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
  • Dicer is a large protein and is not suitable for recombinant production.
  • the protein having dsRNA-degrading activity of the present invention is small in size and compact as compared with a native enzyme, and is useful for producing a recombinant.
  • enzymes derived from higher organisms such as humans are produced as recombinants in bacterial cells such as Escherichia coli. In the case of production, it is often difficult to produce a recombinant while maintaining the same enzyme activity. Therefore, the protein having dsRNA-degrading activity of the present invention is very useful when produced in cells other than the organism from which it is derived.
  • the protein of the present invention may contain a PAZ domain, but is not particularly limited.
  • amino acids 898 to 1924 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing A protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 in the Sequence Listing, or a protein having an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 in the Sequence Listing (Dicer Mutant) or a protein (Dicer variant) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 in the sequence listing, or an amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 19 in the sequence listing .
  • the enzyme is possible to make more enzymatically stable by using the mutant.
  • stability can be improved as compared to a mutant protein having only an RNaselll domain.
  • the activity can be maintained even after more freezing and thawing, and the activity can be maintained for a long time in a solution state in a certain storage buffer.
  • the protein of the present invention is not particularly limited.
  • long-chain dsRNA can be degraded to generate siRNA effective for RNA interference.
  • substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids or bases in the above amino acid sequence or base sequence may be included in the protein having dsRNA degrading activity of the present invention. included.
  • a sequence derived from an expression vector for example, an expression or translation-enhancing system IK, such as a Perfect DB sequence, etc.
  • a tag sequence for purifying an expressed protein eg, For example, those having an amino acid sequence such as a His tag sequence
  • a sequence for removing an additional sequence at the N-terminal side of the expressed protein eg, a Fact or Xa sequence
  • proteins having The protein is not particularly limited, but has, for example, a dsRNA degrading activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or 18 in the sequence listing. Protein.
  • the protein having a dsRNA-degrading activity of the present invention can convert a long dsRNA into a dsRNA of a specific length. That is, in the present invention, by selecting a protein having dsRNA degradation activity to be used, dsRNA having a desired specific length can be prepared.
  • the dsRNA of the specific length is not particularly limited, for example, a specific length in a range of about 10-100 base pairs, preferably in a range of about 1530 base pairs, and particularly preferably in a range of about 2025 base pairs. DsRNA is exemplified.
  • the protein having the dsRNA-degrading activity of the present invention for example, but not limited to, the Dicer mutant, can be stored at 4 ° C. by storing in a Tris-HCl buffer having a pH of 8.5 or more in the presence of magnesium chloride. Its activity can be stably maintained for a long period of time both in storage and storage at 20 ° C.
  • the protein having dsRNA-degrading activity of the present invention is a protein having nucleic acid binding activity described in the following (2), and is not particularly limited.
  • it may be in the form of a fusion protein with a protein having RNA binding activity. Is also good.
  • protein having the above Dice r mutant and a nucleic acid binding activity for example, fusion proteins with proteins having RNA binding activity is exemplified.
  • the method for producing the protein having the dsRNA-degrading activity of the present invention may be a method comprising converting codons into those suitable for expression in a host or reinforcing the rare codons.
  • a method in which a part or all of the amino acid sequence of the protein may be converted to an optimal codon state for protein expression, or a production method including codon modification of an expressed gene. It can be expressed using a host in a similar state.
  • Optimal codon state or equivalent The host of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a host in which the amount of tRNA recognizing a specific codon is several times or more higher than that normally produced in cells by genetic engineering.
  • Escherichia coli such as Escherichia coli supplemented with tRNAs of arginine codons (AGA, AGG), and Escherichia coli supplemented with tRNAs of isoleucine (AUA), proline (CCC), and leucine (CUA). Is mentioned.
  • a method for improving the expression of the target protein in the host by performing codon modification may be used.
  • the secondary structure of the mRNA may be taken into consideration.
  • the method is not particularly limited as long as it is a method that improves protein expression by codon conversion, reinforcement, and the like of the expressed gene.
  • any commercially available vector or expression system can be used without any particular limitation.
  • a pET system manufactured by Novazidin
  • a vector having a promoter that can function at a low temperature can be suitably used, and examples thereof include a pCold-based vector described in WO99 / 27117.
  • a method of producing the above Dicer mutant with a vector having a promoter capable of functioning at low temperature for example, a pCold-based vector described in WO99 / 27117 is exemplified. .
  • any vector in the production method of the present invention, can be suitably used as long as it can express a protein capable of retaining a function capable of producing dsRNA of a specific length.
  • the protein is in the form of an inclusion body when the protein is expressed, but the function is restored by a subsequent refolding operation. Also included are vectors that can express what is possible.
  • the amount of production is improved as compared with the case where the conventional full-length Dicer of human origin is expressed, and the activity of the protein is further improved.
  • the acquisition rate of the holder can also be improved.
  • a protein having a nucleic acid binding activity described in (2) below for example, but not limited to, RNA
  • a method of expressing in the form of a fusion protein with a protein having a binding activity is also included.
  • the method for promoting the degradation of dsRNA which is characterized by producing dsRNA of a specific length, according to the present invention, is performed in the presence of a protein having nucleic acid binding activity.
  • the nucleic acid binding protein is not particularly limited, as long as it promotes dsRNA degradation activity.
  • the above-mentioned proteins having the RNA binding activity can be suitably used.
  • the protein having the RNA binding activity is not particularly limited, but examples include cold shock protein (Csp: cold shock protein).
  • a cold shock protein that can function in a normal temperature range can be suitably used, and a cold shock protein derived from a thermophilic bacterium or a thermostable bacterium is preferable.
  • Thermotoga maritima having the amino acid sequence IJ described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing (the amino acid sequence IJ encoded by the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing).
  • Thermotoga maritima strain MSB8 derived from Thermotoga maritima strain MSB8 was purchased from Cesamnolenk von Microorganisment sem Zelkulturen GmbH (DSM3109), and obtained from Protein Science, Vol. 8, 394.
  • DSM3109 Cesamnolenk von Microorganisment selkulturen GmbH
  • Recombinants can be produced by genetic engineering according to the method described on page 403 (1999).
  • a vector having a promoter that can function at a low temperature can be suitably used, and examples thereof include a pCold-based vector described in WO99 / 27117.
  • the dsRNA degrading activity can be promoted.
  • the method of the present invention provides a protein having a dsRNA-degrading activity for producing a dsRNA of a specific length according to the above (1), for example, a functional equivalent such as a Dicer mutant, a natural Dicer or a commercially available recombinant Dicer. In either case, the activity of producing dsRNA of a specific length can be promoted.
  • the protein having nucleic acid binding activity and the dsRNA degrading activity By combining the proteins, the resulting dsRNA-degrading activity can be promoted, and the resulting degradation products have a greater RNA interference effect than the degradation products obtained when the protein having no nucleic acid binding activity is not combined. It has the same activity per unit weight. Therefore, using a protein having nucleic acid binding activity is very useful in RNA interference.
  • dsRNA used as a substrate is not completely degraded, whereas in the method of the present invention, substantially all of the long dsRNA serving as a substrate is cleaved. it can. Therefore, if all of the dsRNA of the substrate can be cleaved and the degradation products have the same RNA interference effect, the long dsRNA serving as the substrate will be scaled down, finned, and the undegraded dsRNA removal step will be performed. Can also be omitted.
  • the protein having the nucleic acid binding activity for example, the protein having the RNA synthesis activity, may be in the form of a fusion protein with the protein having the dsRNA degrading activity.
  • the method for promoting RNA synthesis of the present invention is characterized in that the method is carried out in the presence of a protein having a nucleic acid binding activity.
  • the nucleic acid binding protein is not particularly limited as long as it promotes the RNA synthesis activity of the protein having the RNA synthesis activity.
  • Cold shock protein (Csp: cold shock protein) ) Can be suitably used.
  • the cold shock protein is not particularly limited, but a thermophilic bacterium is preferably used as the cold shock protein.
  • the cold shock protein is not particularly limited, but is a CspB protein derived from Thermotoga maritima having an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing (base sequence described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing). Is exemplified.
  • the coexistence of the CspB protein in the RNA synthesis system can promote, for example, the RNA synthesis activity of RNA polymerase.
  • the protein can promote its synthetic activity whether the product is single-stranded or double-stranded RNA.
  • the method for promoting RNA synthesis of the present invention can be used for synthesizing not only long dsRNA but also short dsRNA, for example, siRNA.
  • siRNA short dsRNA
  • it can be used when synthesizing preferably about 15-30 base pairs, particularly preferably about 20-25 base pairs, using T7 RNA polymerase or the like.
  • the protein having nucleic acid binding activity promotes two reactions of dsRNA synthesis by a protein having RNA synthesis activity and dsRNA degradation of a protein having dsRNA degradation activity,
  • it can be used for dsRNA synthesis and siRNA production systems that are important in RNA interference.
  • each protein may be separate or may be in the form of a fusion protein.
  • the composition of the present invention is a composition for efficiently performing a reaction to degrade into dsRNA of a specific length and / or a synthesis reaction of RNA.
  • the composition includes the protein having the nucleic acid binding activity described in (2) above, and the protein having the nucleic acid binding activity is not particularly limited.
  • a cold shock protein is preferable.
  • a cold shock protein (Csp: cold shock protein) derived from a thermophilic bacterium or a thermostable bacterium can be suitably used, and the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing (encoded by the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing) can be used.
  • CspB protein derived from Thermotoga maritima having the following amino acid sequence:
  • the composition of the present invention may contain a protein having dsRNA degradation activity and / or a protein having RNA synthesis activity.
  • a protein having a dsRNA degrading activity capable of producing a dsRNA of a specific length a protein having a functional domain of Dicer is preferable.
  • a protein comprising RNaseIIIa, b and a dsRNA binding domain can be suitably used.
  • any of the functional equivalents such as the Dicer mutant described in (1) above, a natural Dicer, or a commercially available recombinant Dicer may be used.
  • composition containing the Dicer variant a composition comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 17 in the sequence listing, or a protein comprising the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 16 in the sequence listing is used. It may be a composition containing. Also, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 17 in the sequence listing, a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted or added is included. Alternatively, the composition may be.
  • a control sequence derived from an expression vector for example, an expression or translation enhancing sequence (for example, Perfect DB sequence, etc.), a tag sequence for purifying an expressed protein (for example, His tag sequence, etc.) )
  • a protein to which an amino acid sequence such as a sequence for removing an additional sequence at the N-terminal side of the expressed protein eg, Factor Xa sequence
  • the protein include, but are not particularly limited to, a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 or 18 in the sequence listing and having a dsRNA degrading activity.
  • the composition of the present invention may contain a buffer for stabilizing the Dicer mutant described in (1) above.
  • RNA polymerase for example, T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, SP6 RNA polymerase and the like can be suitably used.
  • a protein having the nucleic acid binding activity described in the above (2) for example, a protein having an RNA binding activity and having a dsRNA degrading activity capable of producing dsRNA of a specific length It may contain a fusion protein with a protein and / or a fusion protein of a protein having an activity of binding to a nucleic acid and a protein having an activity of synthesizing an RNA.
  • composition of the present invention can easily perform efficient degradation into dsRNA of a specific length and / or synthesis reaction of single-stranded or double-stranded RNA.
  • composition of the present invention includes not only long dsRNA but also short dsRNA, for example, a composition that can be used for the synthesis of siRNA.
  • the composition is effective in synthesizing dsRNA of about 10-100 base pairs, preferably about 15-30 base pairs, particularly preferably about 20-25 base pairs.
  • the kit used in the method of the present invention is a kit for efficiently performing a reaction for decomposing into dsRNA of a specific length and a reaction for synthesizing Z or RNA.
  • the kit includes the protein having the nucleic acid binding activity described in (2) above, and the protein having the nucleic acid binding activity is not particularly limited.
  • a cold shock protein is preferable.
  • Cold Shock Pro derived from thermostable bacteria Tin (Csp: cold shock protein) can be suitably used, and Cs pB protein derived from Thermotoga maritima having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 in the sequence listing can be suitably used.
  • the kit of the present invention may include a protein having an activity of producing dsRNA of a specific length, a protein having a dsRNA degrading activity, and a protein having a Z or RNA synthesis activity.
  • a protein having the dsRNA degrading activity and / or the protein having the RNA synthesizing activity those mentioned in the above (3) can be suitably used.
  • the kit of the present invention may contain a buffer for stabilizing the Dicer mutant described in (1) above.
  • a protein having the nucleic acid binding activity described in (2) above for example, a protein having an RNA binding activity and a dsRNA degrading activity capable of producing dsRNA of a specific length are provided. It may contain a fusion protein with a protein and a fusion protein of a protein having Z or nucleic acid binding activity and a protein having RNA synthesis activity.
  • the kit of the present invention may contain components other than those described above, for example, a reagent for purifying dsRNA of a specific length generated as a result of the reaction, a reagent for introducing the same into a biological sample, and the like. good. Although not particularly limited, it may contain, for example, a reagent for purifying about 21 base pairs of siRNA, a reagent for introducing the same into a living sample, and the like.
  • kits of the present invention By using the kit of the present invention, efficient degradation into dsRNA of a specific length and / or synthesis of RNA can be easily performed.
  • kits of the present invention includes a kit that can be used for synthesizing not only long dsRNA but also short dsRNA, for example, siRNA.
  • the kit is effective in synthesizing dsRNA of about 10 to 100 base pairs, preferably about 15 to 30 base pairs, particularly preferably about 20 25 base pairs.
  • an expression vector was constructed as follows.
  • synthetic primers 1 and 2 having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6 in the Sequence Listing were synthesized using a DNA synthesizer based on the nucleotide sequences disclosed in Gene Bank Registration No. AB028449, and purified by a conventional method.
  • the synthetic primer 1 has a nucleotide sequence corresponding to amino acid numbers 1271-1277 of the amino acid sequence of human-derived Dicer (SEQ ID NO: 1) at base numbers 16-36, It is a synthetic DNA with.
  • synthetic primer 2 had a base sequence corresponding to amino acid numbers 1919 to 1924 of the amino acid sequence of human-derived Dicer (SEQ ID NO: 1) at base numbers 911 to 1414, — At 36.
  • PCR was performed using the above synthetic primers.
  • the reaction conditions for PCR are shown below.
  • type II DNA human cDNA library, Human Pancreas, manufactured by Takara Bio Inc. 2 / i1, 5 / i 1 of 10X LA PCR buffer (manufactured by Takara Bio Inc.), 5 ⁇ l of dNTP mixed solution (Takara Bio Inc.) Bio Primer), l Opmol Synthetic Primer 1, l Opmol Synthetic Primer 2, 0.5 U Takara LA Taq (Takara Bio) and sterilized water to make a total volume of 50 ⁇ l.
  • the reaction solution was set on a TaKaRa PCR Thermal Cycler SP (manufactured by Takara Bio Inc.), and the temperature was 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72. A 30-cycle reaction was performed with one cycle of C 3 minutes.
  • the pCold08NC2 vector was prepared according to the method described in Example 16 of WO99Z27117 pamphlet.
  • the pCold08 vector was cleaved with the same restriction enzymes used when preparing the Kpnl-Hinddlll digested DNA fragment, and the one obtained by dephosphorizing the end was prepared, mixed with the KpnI_HindIII digested DNA fragment, Ligation was performed using a DNA ligation kit (manufactured by Takara Bio Inc.). Then, Escherichia coli JM109 was transformed using 20 ⁇ l of the ligation reaction mixture, and the transformant was grown on LB medium (containing 50 ⁇ g / ml ampicillin) containing 1.5% (wZv) agar. I let it.
  • the plasmid into which the desired DNA fragment was inserted was confirmed by sequencing, and this recombinant plasmid was designated as pCold08hDi-R.
  • the plasmid is named and designated as pCold08hDi-R, and from August 11, 2003 (Hara Deposit Date), the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba East 1-chome, Ibaraki, Japan) Deposited as FERM BP-10074 at 1 No. 1 Central No. 6 (Zip Code 305-8566).
  • This pCold 08 hDi-R is a plasmid containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of amino acids 1271-2924 of the Dicer amino acid sequence of human origin (SEQ ID NO: 1).
  • the protein expressed from the plasmid has Perfect DB system U, His tag sequence, and Factor Xa system IJ.
  • the amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
  • Escherichia coli BL21 was transformed with pCold08 hDi-R prepared in (1) above, and the transformant was transformed into an LB medium containing 1.5% (w / v) agar (containing 50 ⁇ g / ml ampicillin). Mu).
  • the grown colonies were inoculated into 2.5 ml of an LB liquid medium (containing 50 xg / ml of ampicillin) and cultured at 37 ° C. A portion of this was inoculated into 100 ml of the same LB medium and cultured at 37 ° C until logarithmic growth. Incubator kept at 15 ° C after the culture After shaking for 10 minutes in one tube, IPTG was added to a final concentration of 1.
  • buffer A 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, ImM dithiolate, 0.1% Triton X-100 was added and mixed, and then centrifuged at 1,500 rpm for several minutes. The supernatant was discarded, and about 1 ml of the resin was recovered. About 5 ml of the supernatant prepared from the cell lysate was added to the mixture, and the mixture was gently mixed on a rotary shaker at 4 ° C for about 1 hour. Thereafter, the resin to which the target protein was adsorbed was packed in a ⁇ 15 mm column, and washed twice with 5 ml of buffer A.
  • buffer B 20 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ 7.5), 100 mM sodium chloride, ImM dithylate latex, 0.1% Triton X_100, 40 mM imidazole, and then washed with 5 ml.
  • BufferC 20mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 800mM sodium chloride, ImM dithiothreitol, 0.1% Triton X_100, 40mM imidazole
  • Unnecessary proteins other than the purpose were removed.
  • bufferD 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5), lOOmM sodium chloride, ImM dithiothrein monol, 0.1% Triton X-100, lOOmM imidazole].
  • buffer E 50 mM Tris-monohydrochloride buffer (pH 8.0), 100 mM salt solution]; pam, 0.5 mM EDTA, 0.1% toluene X_100, lm M dithiothre And then concentrated to about 10-fold using Centricon (manufactured by Amicon). For a portion of this purified concentrated sample 10.
  • hDiR human-derived Dicer RNaselll domain protein
  • Dicer activity of the protein samples I-IV prepared in Example 11- (2) above was measured. The activity was measured as follows.
  • dsRNA as a substrate used for activity measurement was synthesized using TurboScript T7 Transcription kit (manufactured by GTS) according to the protocol attached thereto.
  • dsRNA having a length of about 700 bp was prepared by performing an RNA synthesis reaction using T7 RNA polymerase using the obtained double-stranded DNA as type II.
  • a reaction solution was prepared by adding 2 ⁇ l of the buffer solution used for dialysis, which was 5 times concentrated, and adding nuclease free water to make a total volume of 10 ⁇ l.
  • Dicer manufactured by GTS
  • 2 ⁇ l of Dicer enzyme solution 1 ⁇ l of dsRNA lzgl OmM ATP solution as a substrate, 1 ⁇ m at night, and 0.5 ⁇ m of 50 mM salted magnesium solution at night 1.
  • the attached reaction buffer (4 ⁇ l) was added with nuclease-free water to make a total volume of 10 ⁇ l.
  • the activity of the reaction solution prepared in the above (1) was measured, and the influence on the RNaselll domain protein (hDiR) was examined. Furthermore, in order to examine the stability in each buffer solution, a sample immediately after purification and a sample stored at 4 ° C. and 120 ° C. for 5 days were used. As a result, especially in protein sample III and protein sample IV, degradation products of about 21 nucleotides, the same size as the commercially available Dicer, were confirmed at both 4 ° C storage and -20 ° C storage. It was confirmed that the activity was stably maintained.
  • Thermotoga maritima having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 in the Sequence Listing tima) -derived CspB protein was used as a model protein.
  • the protein was prepared by the method described in Protein Science, Vol. 8, pages 394-403 (1999).
  • the dsRNA degradation activity in the form to which CspB was added was measured as follows.
  • Example 2_ 1 ⁇ l of dsRNA lzgl OmM ATP solution used in 1), 1 ⁇ m of 50 mM salted magnesium solution, 5 ⁇ reaction buffer [250 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.5), 500 mM salted sodium, 0.5 mM % TritonX-100, 5 mM DTT] 2 ⁇ l, and nuclease-free water was added to make a volume of 10 ⁇ l, and this was used as a reaction solution.
  • Dicer In the case of commercially available Dicer, 1 ⁇ g of dsRNA serving as a substrate was added to the composition described in the attached document, and nuclease-free water was added thereto to make the volume 10 ⁇ l.
  • dsRNA dsRNA serving as a substrate
  • nuclease-free water was added thereto to make the volume 10 ⁇ l.
  • commercially available Dicer those manufactured by GTS, Stratagene and Invitrogen were used.
  • the added CspB protein was added at a final concentration of 4.6 ng / ⁇ 1 , 9.2 ng // i1, 18.4 ng // il, and 92 ⁇ / ⁇ 1.
  • 1 ⁇ 1 was added to a 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) as a CspB shape buffer.
  • RNA interference based on the view that it is also important to promote the activity of the RNA synthesis system to synthesize dsRNA, the effect of Thermotoga maritima-derived CspB on RNA synthesis was examined.
  • the T7 RNA polymerase system was selected as a model system.
  • the effect on the RNA synthesis system was performed as follows. That is, the amount of transcription by T7 RNA polymerase in the form in which CspB was added was used as a standard.
  • a plasmid prepared by introducing the rsGFP gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 into pET16b (manufactured by Novadin) having a T7 promoter prepared by a conventional method as 1 ⁇ g type 10 DNA for 10X T7 RNA polymerase Buffer solution (Takara Bio Inc.) 2 ⁇ 1, 50 ⁇ DTT 2 ⁇ 1, RNase inhibitor (Takara Bio Inc.) 0.4 ⁇ 1, 25 mM NTP 2 ⁇ 1, T7 RNA polymerase (Takara Bio Inc.) 1 ⁇ 1.
  • the mRNA synthesized by T7 RNA polymerase was quantified by image analysis of the gel using Total Lab ver. 1.11 (Nonlinear Dynamics). As a result, it was confirmed that the transcript amount was improved at any concentration. In particular, it was confirmed that when the added amount of CspB was 460 ng Zxl or more, the amount of the transcript was about twice or more than that when no addition was performed, and about 3 times when the addition of 920 ng / z 1 was further added. .
  • Example 2_ (1) the ⁇ type for dsRNA synthesis prepared in Example 2_ (1) was used.
  • a commercially available TurboScript T7 Transcription kit manufactured by Gene Therapy Systems
  • the final concentration of CspB protein added at this time was 90 ng / ⁇ 1, 180 ng / ⁇ 1, 460 ng / ⁇ 1, and 920 ng Zxl.
  • a 10 mM potassium phosphate buffer solution (pH 7.5) was added in a single addition.
  • dsRNA synthesis type 1 prepared in Example 2_ (1), 1 ⁇ l of 10 XT7 RNA polymerase buffer (manufactured by Takara Bio Inc.), 50 mM DTT 1 / i 1, RNase inhibitor (Takara Bio Inc.) 0.2 ⁇ 1, 25 ⁇ ⁇ 1 / i1, ⁇ 7 RNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) 0.5 xl, CspB solution 1 / i1, and add nuclease free water to make the volume 10 ⁇
  • the reaction mixture was used as a reaction solution and reacted at 37 ° C. for 4 hours.
  • the concentration of C spB protein / protein added at this time should be 90 ng / ⁇ 1, 180 ng / ⁇ 1, 460 ng / ⁇ 1, and 920 ng // i1 in the final concentration.
  • 1 ⁇ m potassium phosphate buffer ( ⁇ 7.5) which is a CspB shape buffer, was added.
  • DNas el manufactured by Takara Bio Inc.
  • 1 ⁇ l of a 40-fold diluted solution of this reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis containing ethidium bromide.
  • the gel was also quantified for dsRNA. As a result, it was confirmed that the transcript amount was improved at any concentration. In particular, when the added amount of CspB was 920 ng / zl or more, it was confirmed that the amount of the transcript was about three times or more than that in the case of the untreated kafun.
  • an expression vector was constructed as follows.
  • synthetic primers 5 and 6 having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 14 and 15 in the sequence listing were synthesized using a DNA synthesizer, and purified by a conventional method.
  • the above-mentioned synthetic primer 5 has a nucleotide sequence corresponding to amino acid number 679-685 of the amino acid sequence of human-derived Dicer (SEQ ID NO: 1) at nucleotide number 914, and a nucleotide sequence at nucleotide number 916, which is a recognition sequence of restriction enzyme Kpnl. — Synthetic DNA of 36.
  • synthetic primer 6 has a base sequence corresponding to amino acid numbers 1919 to 1924 of amino acid sequence 1J (SEQ ID NO: 1) of human-derived Dicer, and a base sequence corresponding to the recognition sequence of restriction enzyme Hindlll at base numbers 911 to 1414. 18-35.
  • PCR was performed using the above synthetic primers.
  • the reaction conditions for PCR are shown below.
  • type II DNA human cDNA library, Human Pancreas, manufactured by Takara Bio Inc. 2 / i1, 5 / i 1 of 10X LA PCR buffer (manufactured by Takara Bio Inc.), 5 ⁇ l of dNTP mixed solution (Takara Bio Inc.) Bio Primer), l Opmol synthetic primer 5, l Opmol synthetic primer 6, 0.5 U of Takara LA Taq (manufactured by Takara Bio Inc.), and sterilized water were added to make a total volume of 50 / i 1.
  • the reaction solution was set on a TaKaRa PCR Thermal Cycler SP (manufactured by Takara Bio Inc.), and 30 cycles of reaction were performed at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 3 minutes.
  • Example 1_ (1) the pCold08NC2 vector prepared in Example 1_ (1) was digested with Kpnl-Hindll as described above.
  • a DNA fragment was digested with the same restriction enzymes used when the DNA fragment was prepared, dephosphorylated, and mixed with the above Kpnl-Hindlll digested DNA fragment, and a DNA ligation kit (Takara Bio Inc.) Were connected.
  • Escherichia coli JM109 was transformed using the ligation reaction mixture 20/1, and the transformant was grown on LB medium (containing 50 ⁇ g Zml of ampicillin) containing 1.5% (w / v) agar.
  • LB medium containing 50 ⁇ g Zml of ampicillin
  • the plasmid into which the target DNA fragment was inserted was confirmed by sequencing, and this recombinant plasmid was designated as pCold08hDi_ASI.
  • the plasmid is named and designated as pCold08hDi-ASI, and from September 26, 2003 (Hara Deposit Date) Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba East 1-chome, Ibaraki, Japan) Address No. 1 Central No. 6 (Zip code 305-8566) is deposited as FERM BP-10076.
  • This pCold08 hDi-ASI is the base sequence described in SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 in the base sequence IK sequence listing which encodes the amino acid sequence of amino acids 679 to 1924 in the Dicer amino acid sequence of human origin (SEQ ID NO: 1).
  • the protein expressed by the plasmid has the Perfect DB system, His tag sequence, and Factor Xa sequence.
  • the amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing.
  • Escherichia coli BL21—CodonPlus-RI L strain (Stratagene) was transformed, and the transformant was concentrated at 1.5% (w / v). It was grown on LB medium containing ampicillin (containing 50 ⁇ g / ml ampicillin). The grown colonies were inoculated into 2.5 ml of LB liquid medium (containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin) and cultured at 37 ° C. A portion of this was inoculated into 100 ml of the same LB medium and cultured at 37 ° C until logarithmic growth.
  • the cells were shaken in an incubator kept at 15 ° C for 10 minutes, IPTG was added to a final concentration of 1.0 mM, and the cells were cultured at 15 ° C for 24 hours to induce expression.
  • the cells were then collected by centrifugation, and 5 ml of the cell disruption solution [50 mM Tris monochloride buffer ( ⁇ 8.5), lOOmM sodium chloride, ImM magnesium chloride, 0.1% Triton X_100, ImM dithiothreitol , ImM phenylmethylsulfonyl fluoride].
  • the cells are disrupted by sonication and centrifuged (11, OOOrpm (20 minutes) to separate the supernatant into an extract and a precipitate.
  • buffer A 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 100 mM sodium chloride, ImM dithiothreitol, ImM magnesium chloride, 0.1% Triton X were added to Ni_NTA agarose (manufactured by QIAGEN) for 1 ml of resin volume. Then, the mixture was centrifuged at 1,500 rpm for several minutes, the supernatant was discarded, and about 1 ml of the resin was recovered. About 5 ml of the supernatant prepared from the cell lysate was added and gently mixed on a rotary shaker at 4 ° C for about 1 hour.
  • the resin to which the target protein was adsorbed was filled in a ⁇ 15 mm column, and washed twice with 5 ml of buffer A.
  • wash the resin with 5 ml of buffer B [20 mM Tris monochloride buffer ( ⁇ 8.5), 100 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, ImM dithiothreitol, 0.1% Triton X_100, 40 mM imidazole], and then wash 5 ml of the resin.
  • BufferC 20 mM Tris-hydrochloride buffer ( ⁇ 8.5), 800 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, ImM dithiothreitol, 0.1% Triton X_100, 40 mM imidazole], followed by 5 ml buffer B After washing, unnecessary proteins other than those intended were removed.
  • bufferD 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.5), lOOmM sodium chloride, ImM magnesium chloride, ImM dithiothreitol, 0.1% Triton X-100, lOOmM imidazole
  • concentration was performed to about 10-fold using Centricon (manufactured by Amicon).
  • hDi_ASI human-derived Dicer PAZ + RNaseIII domain protein
  • a degradation product of about 21 nucleotides was confirmed in the gel stained with ethidium bromide after electrophoresis, and was found in the RNaselll domain protein (hDiR) and the protein containing the PAZ region (hDi-ASI). Also, dsRNA degradation activity was confirmed.
  • Example 4-(2) For the hDi-ASI prepared in Example 4-(2) above, the effect of a protein having nucleic acid binding activity at room temperature was examined.
  • the CspB protein derived from Thermotoga maritima prepared in Example 3 was used as the protein having the nucleic acid binding activity.
  • the effect on dsRNA degradation was measured as follows.
  • the concentration of CspB protein was adjusted to a final concentration of 9.2 ng / zl, 18.4 ng / ⁇ l, and 92 ng / ⁇ l, and as a control in the case of no addition, 10 mM phosphorus, a CspB shape buffer, was used. Potassium acid buffer (pH 7.5) was added: 1. After preparing the above reaction solution and reacting at 37 ° C. for 17 hours, 5 / l was subjected to 15% polyacrylamide gel electrophoresis and stained with ethidium bromide to confirm the cleavage product. Furthermore, the genole was analyzed by image analysis using Total Lab ver. 1.11 (Nonlinear Dynamics) to quantify dsRNA degradation products of about 21 nucleotides.
  • CspB promotes its dsRNA degradation activity even in the case of natural or mutant human-derived Dicer containing an RNaselll domain.
  • RNA interference of siRNA prepared using the human-derived hDiR of the present invention was examined.
  • a commercially available Dicer GTS
  • Preparation of the dsRNA degradation product was basically performed by the method described in Example 2- (1) above. That is, using 10 units of the hDiR described in Example 1_ (2) and a commercially available Dicer, 10 ⁇ g of dsRNA was cut at 37 ° C. for 18 hours. These cleavage products were purified using RNA Purification Columns 1 and 2 (manufactured by Gene Therapy Systems) and used for the following evaluation of RNA interference.
  • TransIT 293 Transfection Reagent (manufactured by TAKARA BIO INC.) was added to 50 / il serum-free medium and stirred vigorously. After leaving at room temperature for 5 minutes, 0.3 / g of pQBI25 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, mixed gently, and left at room temperature for 5 minutes. 4 ⁇ l of TransIT-TKO reagent was added thereto, mixed gently, and left at room temperature for 5 minutes. Then, 500 ng of the above siRNA was added thereto, mixed gently, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes to prepare a DNA / siRNA solution.
  • the DNA / siRNA solution was added dropwise to the D-MEM medium containing 10% FBS in the wells at a concentration of 250 ⁇ l, and mixed gently so that the solution in the wells became uniform.
  • a sample containing only pQBI25 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • a sample containing only sterile water were also performed. Then CO
  • RNA interference occurs as the average fluorescence value decreases as compared with the control (vector only). Therefore, it was confirmed that the siRNA obtained by hDiR exhibited an RNA interference effect similarly to that of the commercially available Dicer, and showed a stronger level of RNA interference than that of the commercially available Dicer.
  • the hDiR of the present invention is useful for preparing siRNA for RNA interference.
  • siRNA prepared using the hDiR of the present invention were examined by changing the amount of siRNA added.
  • a commercially available Dicer manufactured by Gene Therapy Systems
  • the cleavage of dsRNA was basically performed by the method described in Example 2_ (1) above. That is, 10 ⁇ g of dsRNA was cut at 37 ° C. for 18 hours using 10 ⁇ l of the hDiR described in Example 11 (2) and a commercially available Dicer. In this case, CspB used in Example 3- (2) was added to the final concentration of 9.2 ng / xl, and reacted.
  • RNA Purification Columns 1 and 2 Gene Therapy Systems
  • a separate tube prepared by adding 3 ⁇ l of Ribojuice Transfection Reagent (manufactured by Takara Bio Inc.) to 47 ⁇ l of a serum-free medium was prepared and stirred vigorously. After leaving at room temperature for 5 minutes, 166.7 ng, 55.6 ng and 18.5 ng of the above siRNA were added, mixed gently, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • the two solutions prepared in this way were used in wells. /.
  • the D-MEM medium containing FBS was added dropwise to the medium to which the concentration had been adjusted to 250 ⁇ ⁇ , and the mixture was gently mixed so that the solution in the well became uniform.
  • a sample to which only a vector (DNA) was added and a sample to which only sterilized water was added were also used. Then in the CO incubator 24
  • Control door (vector only) 1 0 0
  • RNA interference occurs as the value of the average fluorescence intensity is smaller as compared with the control (vector only). Therefore, it was confirmed that the siRNA obtained by hDiR exhibited an RNA interference effect in the same manner as the commercial Dicer.
  • the hDiR of the present invention was useful for preparing siRNA for RNA interference.
  • RNA interference was evaluated by extracting total RNA from the above cell sample and subjecting it to real-time RT-PCR to quantify rsGFP mRNA. [0091] That is, after cells were cultured at 37 ° C for 24 hours in a CO incubator after siRNA introduction,
  • reaction solution was set in TaKaRa PCR Thermal Cycler SP (manufactured by Takara Bio Inc.), and reacted at 42 ° C for 10 minutes and at 95 ° C for 2 minutes.
  • 20 ⁇ of a reaction diluent IX M_MLV buffer, 0.5 mM dNTP mixture
  • 10XR-PCR buffer 2.5 ⁇ 1, 250mM Mg 2+ 0.3 ⁇ ⁇ lOmM dNTP 0.75 ⁇ 1, TaKaRa Ex Taq R—PCR (Takara Bio Inc.) 1.
  • rsGFP_F SEQ ID NO: 20
  • rsGFP-R SEQ ID NO: 21
  • Neo Neo_F: SEQ ID NO: 22, Neo-R: SEQ ID NO: 23
  • the reaction solution was set in a Smart Cycler II Unit (manufactured by TAKARA BIO INC.), Heat denatured at 95 ° C for 10 seconds, and then 95 cycles at 5 seconds at 95 ° C and 20 cycles at 60 ° C for 45 cycles was carried out.
  • TAKARA BIO INC. Smart Cycler II Unit
  • the mRNA levels of human-derived i3_actin and GAPDH, and rsGFP and Neo derived from the introduced plasmid were quantified. The results are shown in Table 3.
  • RNA interference occurs as the amount of rsGFP mRNA is smaller than that of the control (vector only). Therefore, it was confirmed that hDiR exhibited an RNA interference effect similarly to the retail Dicer.
  • the hDiR of the present invention was useful for preparing siRNA for RNA interference.
  • dsRNA as a substrate for dsRNA degradation activity was prepared from the luciferase gene and evaluated.
  • dsRNA was synthesized using TurboScript T7 Transcription kit (manufactured by GTS) according to the protocol attached thereto.
  • the plasmid pGL3_Basic vector (Promega) is used as a type III, and the T7 promoter described in SEQ ID NO: 24 in the sequence listing is used.
  • PCR amplified fragment length: about 500 base pairs
  • dsRNA with a length of about 500 bp was prepared by using the obtained double-stranded DNA as ⁇ type and performing RNA synthesis reaction with T7 RNA polymerase.
  • RNA interference effect of siRNA prepared using the hDiR and hDi-ASI of the present invention was examined.
  • a commercially available Dicer (Gene Therapy Systems) was used as a control.
  • the cleavage of dsRNA was basically performed by the method described in Example 2- (1) above. That is, using the hDiR described in Example 11- (2), the hDi-ASI described in Example 4-1- (2), and a commercially available Dicer ⁇ , the above-mentioned dsRNA10 ⁇ g was converted to 37 ° C. C, cut in 18 hours. In this case, the CspB used in Example 3- (2) was added with calorie so as to have a final concentration of 9.2 ngZ ⁇ l, and reacted.
  • RNA Purification Columns 1 and 2 Gene Therapy Systems
  • a separate tube prepared by adding 47 ⁇ l of serum-free medium to 3 ⁇ l of Ribojuice Transfection Reagent (Takara Bio Inc.) was prepared and stirred vigorously. The mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and the above-mentioned siRNA was transcribed without calorie from 166.7 ng, 55.6 ng, and 18.5 ng, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • the two solutions prepared in this way were added to the wells 10. /.
  • the D-MEM medium containing FBS was added dropwise to the medium to which the concentration had been adjusted to 250 ⁇ ⁇ , and the mixture was gently mixed so that the solution in the well became uniform.
  • a sample to which only the vector (DNA) was added and a sample to which only sterilized water was added were also performed at the same time. Then in the CO incubator 24
  • siRNA sample GL3 expression level relative value control (no addition) ⁇
  • hDiR and hDi-ASI of the present invention were useful for preparing siRNA for RNA interference.
  • RNA interference was examined for the siRNA prepared by adding CspB and the siRNA prepared without the addition.
  • the actual operation was learned from the method using luciferase described in Example 7.
  • Commercially available Dicer (Gene Therapy Systems) was used.
  • Cleavage of dsRNA was basically performed by the method described in Example 2- (1) above. That is, using the hDiR prepared by the method described in Example 1- (2), the hDi-ASI prepared by the method described in Example 4_ (2), and Cut at 18 ° C for 18 hours. Note that at this time, was reacted with the case where the CspB used was added to a final concentration 9.2 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 in Example 3- (2) added Shinare, if the.
  • RNA Purification Columns 1 and 2 Gene Therapy Systems
  • the CspB of the present invention was not affected qualitatively.
  • Example 4_ The PAZ domain + RNase III domain protein (hDi-ASI) purified in (2) and CspB added to a final concentration of 92 ng / ⁇ l were added to storage buffer I (50 mM Tris-HCl buffer ( pH 8.5), stored in 250 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, 0.1 mM DTT, 0.1% TritonX-100, 50% glycerol), and its dsRNA degradation at regular intervals as follows: Activity was measured.
  • Example 2 1 ⁇ g of dsRNA prepared in (1), 1 ⁇ l of protein sample prepared in 4_ (2) above, 5X reaction buffer (100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 750 mM chloride Sodium, 12.5 mM magnesium chloride) 2 ⁇ l, and nuclease free water was added to make a total volume of 10 ⁇ l, which was used as a reaction solution. After reacting at 37 ° C for 18 hours, 5 was subjected to 15% polyacrylamide gel electrophoresis and staining with ethidium bromide to confirm the cleavage product. As a result, degradation products of about 21 base pairs were confirmed in the stored samples for 6 months or longer, and dsRNA degradation activity was confirmed. On the other hand, under the same buffer conditions, the activity of RNaselll domain protein (hDiR) plus CspB was maintained for 3 months or more.
  • hDiR RNaselll domain protein
  • TmCspB Thermotoga maritima
  • synthetic primers E and F having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 26 and 27 in the sequence listing were synthesized using a DNA synthesizer, and purified by a conventional method.
  • the synthetic primer E has a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence 117 of the amino acid sequence 1J (SEQ ID NO: 26) of the amino acid sequence 1J (SEQ ID NO: 26) of the recognition sequence of the restriction enzyme Ndel, 34 is a synthetic DNA of 34.
  • Synthetic primer F has a base sequence corresponding to amino acids 61-66 of the amino acid sequence of TmCspB (SEQ ID NO: 26) at base Nos. DNA. [0105] PCR was performed using the above synthetic primers.
  • the reaction conditions for PCR are shown below. That is, type 3 DNA (50 ng) of Example 3_ (1), 5 / il lOX Ex Taq buffer (manufactured by Takara Bio Inc.), 5 / il dNTP mixed solution (manufactured by Takara Bio Inc.), synthetic lOpmol Ima-E, lOpmol of synthetic primer F, 0.5 U of Takara Ex Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) were added, and sterile water was added to make a total volume of 50 ⁇ .
  • the reaction solution was set on a TaKaRa PCR Thermal Cycler SP (manufactured by Takara Bio Inc.), and set at 94 ° C. for 1 minute, 55. The reaction was performed for 30 cycles, each cycle consisting of C1 minute and 72 ° C1 minute.
  • reaction solution 5 was subjected to 3.0% agarose gel electrophoresis to confirm a target DNA fragment of about 22 Obp.
  • the remaining PCR reaction solution was subjected to electrophoresis, the fragments were collected, purified, and ethanol precipitated.
  • the recovered DNA after ethanol precipitation was suspended in 5 ⁇ l of sterile water, double digested with the restriction enzyme Ndel (Takara Bio Inc.) and the restriction enzyme BamHI (Takara Bio Inc.), and subjected to 3.0% agarose electrophoresis.
  • the NdeI_BamHI digest was extracted and purified to obtain an Nde-BamHI digested DNA fragment.
  • pCold04NC2 vector was prepared according to the method described in Example 16 of WO 99/27117 (hereinafter, this pCold04NC2 vector is referred to as pColdl4 vector).
  • the above pColdl4 vector was cleaved with the same restriction enzymes used when preparing the above DNA fragment, and the one obtained by dephosphorizing the end was prepared, and mixed with the above Nde to BamHI digested DNA fragment. And ligated using a DNA ligation kit (manufactured by Takara Bio Inc.). Then, Escherichia coli JM109 was transformed using 20 ⁇ l of the ligation reaction mixture, and the transformant was transformed into an LB medium containing agar at a concentration of 1.5% (w / v) (containing 50 ⁇ g / ml ampicillin). Grown on top.
  • the plasmid into which the target DNA fragment was inserted was confirmed by sequencing.
  • Escherichia coli BL21 was transformed using pColdl4-TmCspB prepared in Example 10- (1) above, and the transformant was transformed into an LB medium containing 1.5% (wZv) agar in LB medium (ampicillin 50 ⁇ m). g / ml). The grown colonies are transferred to a 30 ml LB liquid medium (bact 0.3 g of o-tryptone, 0.15 g of bacto-yeast extract, 0.15 g of NaCl, and 1.5 mg of ampicillin), and cultured at 37 ° C for 1 hour.
  • the cells were collected by centrifugation to obtain 11 lg of wet cells.
  • the wet bacterial cells were resuspended in 44 ml of buffer A [20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)].
  • the cells were disrupted by sonication and separated into a supernatant extract and a precipitate by centrifugation (10,000 ⁇ g, 20 minutes).
  • the supernatant extract was further separated into a supernatant extract and a precipitate by ultracentrifugation (70,000 ⁇ g for 20 minutes).
  • the supernatant and the precipitate were separated by centrifugation (3,000 X g for 20 minutes), and the supernatant was further filtered through a glass filter. 45 ml of the filtrate was dialyzed against 3 liters of buffer A [20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)].
  • the fraction containing the target protein with a molecular weight of about 7,500 confirmed by Tricine-SDS polyacrylamide electrophoresis was collected and dialyzed against 3 liters of bufferA [20 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ 80)].
  • bufferA 20 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ 80)].
  • 65 ml of the dialyzed solution was concentrated up to about 144 times using UF3,000 cut Centriprep YM-3 (manufactured by Millipore) to obtain about 450 protein samples.
  • An equal amount of glycerol was added to this protein sample to obtain 850 ⁇ l of a 50% glycerol solution (WZW).
  • WZW 50% glycerol solution
  • Example 10 1 ⁇ l of the protein sample (hDi-R enzyme solution) or 1 ⁇ l of the protein sample (hDi-ASI enzyme solution) prepared in Example 11 (2) and Example 4 (2), and Example 10— ( 1 / i 1 of the CspB solution (92 ng / ⁇ 1) prepared in 2), 1 g of dsRNA as a substrate prepared in Example 2- (1), 5X reaction buffer (100 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ 8 ⁇ 5), 750 mM sodium chloride, 12.5 mM magnesium chloride) 2 / i1, and nuclease-free water was added to make a total volume of 10 ⁇ 10, and the reaction solution was used.
  • the final concentration of CspB protein is 9.2 ng // il.
  • a commercially available Dicer was also used as a control in this case.
  • 2 ⁇ l of enzyme solution, 1 n1 of CspB solution, dsRNA l / ig as a substrate, 10 mM ATP solution 1 / i 1, 50 mM salted magnesium solution 0.5 ⁇ 1, the attached reaction buffer 41, and nuclease-free water were added to make a volume of 10 ⁇ 1 to obtain a reaction solution.
  • a negative control was prepared by adding 1 ⁇ l of nuclease free water instead of TmCspB.
  • Example 10- (2) After preparing the above reaction solution and reacting at 37 ° C for 18 hours, 5 was subjected to 15% polyacrylamide electrophoresis and stained with ethidium bromide to confirm the cleavage product. The resulting DNA was analyzed by image analysis using Total Lab ver. 1.11 (Nonlinear Dynamics) to quantitate dsRNA degradation products of about 21 nucleotides. As a result, it was confirmed that TmCspB expressed and purified in Example 10- (2) had an improved degradation amount of dsRNA, similarly to TmCspB expressed and purified in Example 3- (1).
  • E. coli BL21 was transformed using pCold08 hDi-ASI prepared in Example 4 (1) above, and the transformant was transformed into an LB medium (ampicillin 50) containing agar at a concentration of 1.5% (wZv). ⁇ g / ml).
  • the grown colonies were inoculated into 200 ml of TB liquid medium (bacto-tryptone 2.4 g, bacto-yeast extract 4.8 g, glycerol 0.8 mi, 1 / mM KHP ⁇ , 72 mM KHP ⁇ , ampicillin lOmg). Fungus and 37.
  • a portion of 12 g of the wet cells was treated with 48 ml of a cell disruption solution [50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 100 mM sodium chloride, 1 mM magnesium chloride, protease inhibitor (Complete, EDTA-free, Boehringer Mannheim)] ].
  • the cells were disrupted by sonication and separated into a supernatant extract and a precipitate by centrifugation (12, OOOrpm for 30 minutes).
  • the resin to which the target protein is adsorbed is packed into a ⁇ 20 mm column, and 40 ml of a cell disruption solution [50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 100 mM sodium chloride, ImM salt Magnesium chloride and protease inhibitor (Complete, EDTA-free, Boehringer Mannheim)].
  • a cell disruption solution 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 100 mM sodium chloride, ImM salt Magnesium chloride and protease inhibitor (Complete, EDTA-free, Boehringer Mannheim)].
  • buffer A 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 100 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, 10% glycerol, 20 mM imidazole
  • buffer B [20 mM Tris-HCl buffer. (PH 8.5), 800 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, 10% glycerol, 20 mM imidazole]
  • buffer C 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 100 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, 10% glycerol, 100 mM imidazole.
  • dialysis was performed against 300 ml of buffer D [20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 100 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, 10% glycerol].
  • buffer E 20 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ 8.5), 200 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, 10% dalycerol
  • buffer F 20 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ 8 5), 400 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, 10% glycerol
  • buffer G 20 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ 8.5), 800 mM sodium chloride, ImM magnesium chloride, 10% glycerol
  • Example 11- (1) For the protein sample prepared in Example 11- (1) above, the dsRNA lig prepared in Example 2- (1), the protein sample prepared in Example 11- (1), l / il, 5X Reaction buffer (100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 750 mM sodium chloride, 12.5 mM magnesium chloride) 2 ⁇ l, add nuclease free water to make a total volume of 10 ⁇ l Liquid. After reaction at 37 ° C for 18 hours, 5 was subjected to 15% polyacrylamide gel electrophoresis and staining with ethidium bromide to confirm the cleavage product. As a result, a degradation product of about 21 base pairs was confirmed, and dsRNA degradation activity was confirmed.
  • 5X Reaction buffer 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 750 mM sodium chloride, 12.5 mM magnesium chloride
  • Example 10_ (3) the protein sample (enzyme solution) 11 prepared in Example 11- (1), the CspB solution 1 ⁇ l prepared in Example 10- (2), Example 2—1 ⁇ g of dsRNA to be used as a substrate prepared in (1), 5X reaction buffer (100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 750 mM sodium chloride sodium salt, 12.5 mM sodium chloride salt magnesium) 21) 11 uclease free water was added to this to make a total amount of 10 / i1, which was used as a reaction solution.
  • the CspB protein was added to a final concentration of 9 ⁇ 2 ⁇ ⁇ / ⁇ 1.
  • a commercially available Dicer was also used as a control in this case.
  • 2 ⁇ l of enzyme solution, 1 / i of CspB solution, 1 / ig of dsRNA as a substrate, 1 ⁇ l of 10 mM ATP solution, 0.5 mM of 50 mM magnesium chloride solution, 4 ⁇ l of the attached reaction buffer and nuclease-free water were added to the reaction buffer to make the volume 10 / i1, which was used as the reaction solution.
  • the control water was obtained by adding nuclease free water instead of Cs pB.
  • a mutant protein containing the ⁇ + RNaseIII domain of the present invention (hDi-ASI)
  • CspB a mutant protein containing the ⁇ + RNaseIII domain of the present invention
  • the amount of degradation of dsRNA by the addition of CspB was improved, and further, it was confirmed that almost no uncleaved substrate was present and almost all of the substrate was degraded.
  • Dicer although an increase in dsRNA degradation was confirmed, it was confirmed that about half of the uncleaved substrate was present.
  • Example 11 The RNA interference effect of the siRNA prepared using the protein of 11_ (1) was examined.
  • a commercially available Dicer GTS
  • Preparation of the dsRNA degradation product was basically performed by the method described in Example 11- (3) above.
  • CspB prepared in Example 10- (2) was added to a final concentration of 9.2 ng / zl. That is, using the enzyme described in Example 11- (1) to which CspB was added and the commercially available Dicer, the dsRNA 10 / g portion prepared in Example 2- (1) was used at 37 ° C. Cut in 18 hours.
  • These cleavage products were purified using Microcon-100 and Micropure-EZ (both manufactured by Takara Bio Inc.), and used for the following evaluation of RNA interference.
  • a separate tube prepared by adding 47 ⁇ l of serum-free medium to 3 ⁇ l of Ribojuice Transfection Reagent (Takara Bio Inc.) was prepared and stirred vigorously. The mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes, 55.6 ng of the above siRNA was added, and the mixture was gently mixed and allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • RNA interference occurs as the average fluorescence value decreases as compared to the control (vector only). Therefore, siRNA obtained by hDi-ASI + CspB showed an RNAi effect similarly to commercial Dicer, indicating that it is effective for RNAi. Furthermore, it was confirmed that siRNA could be produced efficiently, and that when the same amount of siRNA was used, a higher RNAi effect was obtained than with a commercially available enzyme.
  • the present invention provides a protein having a dsRNA-degrading activity for producing a dsRNA of a specific length.
  • the method of the present invention provides a method for promoting degradation into dsRNA of a specific length and / or a method for promoting RNA synthesis, which is useful in RNA interference and the like.
  • a composition and a kit which can easily carry out the method for promoting the degradation of dsRNA of a specific length and / or the method for promoting RNA synthesis of the present invention.
  • SEQ ID NO: 4 An amino acid sequence of human dicer mutant

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Abstract

　長鎖のｄｓＲＮＡに作用して特定の長さのｄｓＲＮＡを生成させる活性を有する、ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質、核酸結合活性を有するタンパク質、例えばＲＮＡ結合活性を有するタンパク質の共存下でｄｓＲＮＡにｄｓＲＮＡ分解活性を持ったタンパク質を作用させることにより、特定の長さのｄｓＲＮＡを効率よく調製できる方法及び当該核酸結合活性を有するタンパク質がｄｓＲＮＡ合成に代表されるＲＮＡ合成反応においてもその効率を向上させる方法。

Description

明 細 書
dsRNA分解および RNA合成方法
技術分野
[0001] 本発明は、特定の長さの dsRNAを生成する活性を有する、 dsRNA分解活性を有 するタンパク質、当該タンパク質と核酸結合活性を有するタンパク質、例えば RNA結 合活性を有するタンパク質を組み合わせた dsRNAの効率的な分解方法並びに核酸 結合活性を有するタンパク質と RNA合成活性を有するタンパク質を組み合わせた R NAの効率的な合成方法に関する。
背景技術
[0002] 最近、低分子 dsRNAを利用する遺伝子工学的手法が報告されている。
例えば、 RNA干渉（RNAi : RNA interference)は、 dsRNAによってその配列 特異的に mRNAが分解され、その結果遺伝子発現が抑制される現象である。 dsRN Aによって遺伝子サイレンシングができることがわかった発端は、線虫におけるアンチ センスを用いた研究からであった。 1995年、 Guoと Kemphuesは par— 1と呼ばれる 遺伝子をアンチセンス RNAで抑制する実験を行なった。アンチセンス RNAを加える と、予想通り par~lの発現を抑制した力 驚いたことに、コントロールとして用いたセン ス RNAも同様に par— 1の発現を抑制し、 par— 1変異株の表現形を示した。 （例えば 、非特許文献 1)
この矛盾は、 1998年に Fireらによって解き明力^れた。アンチセンス RNAとセンス RNAを、それぞれ RNAポリメラーゼを用いて合成するとき、わずかに非特異的に逆 向きの RNAができてしまう。そのコンタミネーシヨンよつてできる dsRNAが遺伝子サイ レンシングの本体であり、アンチセンス RNAおよびセンス RNAは遺伝子の発現を抑 制できなレ、こと、またアンチセンス RNAとセンス RNAをァニールさせた dsRNAが効 率よく遺伝子の発現を抑制できることが明らかとなった。 （例えば、非特許文献 2)
[0003] 上記 RNA干渉においては、 Dicerと呼ばれる酵素が dsRNAから小分子の RNA(s iRNA: short interfering RNA)を生成させる。 （例えば、非特許文献 3)
この酵素の作用により生じた siRNAは、 RISC (RNA induced silencing com plex)と呼ばれる複合体に取り込まれ、該複合体が標的 mRNAを認識し、分解する と考えられている。し力しながら、 RNA干渉に関与すると考えられる各因子について の正確な機能についてはまだまだ未知の部分が多いのが現状であった。 （例えば、 非特許文献 4)
[0004] 上記 RNA干渉を効率よく行うためには、 dsRNAならびに siRNAを効率よく生成さ せること力 S重要である。上記 Dicerとしてはヒト由来 Dicer (例えば、非特許文献 5)が 例示され、さらにリコンビナント Dicer (例えば、非特許文献 6)がジーンセラピーシス テムズ社あるいはストラタジーン社より販売されている。
し力 ながら、上記のようなリコンビナント Dicerについては、本来の酵素学的な性 能を十分に発揮しているかどうかについては詳細に検討されていなレ、。また、上記 Di cerの少なくともどのドメインを含有すれば、 dsRNAに作用させて好適な dsRNA (si RNA)を生成させる活性を保持することができる力、、さらにその遺伝子工学的な生産 性を向上できるかについては知られていない。
さらに、 dsRNAを効率よく生成させる方法についても特に有効な方法は知られて いないのが現状であった。
[0005] さらに、 RNAポリメラーゼを用いて合成した約 21ヌクレオチドの鎖長の dsRNAをそ のまま siRNAとして利用する方法も報告されている（例えば、非特許文献 7)。 従つ て、 RNAが効率よくできる方法があれば上記方法にも利用できる。
[0006] 非特許文献 l : Guo S.他 1名 Cell 1995年 vol. 81、 p611_620
非特許文献 2 : Fire A.他 5名 Nature 1998年 vol. 39, ρ806~811 非特許文献 3： Bernstein Ε·他 3名 Nature 2001年 vol. 409、 p363_366 非特許文献 4 : Tabara H.他 3名 Cell 2002年 vol. 109、 p861— 871 非特許文献 5 : Zhang H.他 4名 The EMBO Journal 2002年 vol. 21 , No
. 21 , p5875-5885
非特許文献 6 : Myers J. W.他 3名 Nature biotechnology 2003年 vol. 21 、 p324-328
非特許文献 7 : Donze O.他 1名 Nucleic Acids Research 2002年 vol. 30 , No. 10, e46 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の課題は、特定の長さの dsRNAを生成させる活性を有する、 dsRNA分解 活性を有するタンパク質の提供、 RNA干渉等に利用可能な特定の長さの dsRNAを 効率よく生成させる方法並びに RNA合成の促進方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、 Dicerの機能ドメィ ンを解析し、長鎖の dsRNAに作用して特定の長さの dsRNAを生成させる活性を有 する、 dsRNA分解活性を有するタンパク質を見出した。また、核酸結合活性を有す るタンパク質、例えば RNA結合活性を有するタンパク質の共存下で dsRNAに dsRN A分解活性を持ったタンパク質を作用させることにより、特定の長さの dsRNAを効率 よく調製できること、さらに当該核酸結合活性を有するタンパク質が dsRNA合成に代 表される RNA合成反応においてもその効率を向上させることを見出し、本発明を完 成させた。
[0009] すなわち、本発明の第 1の発明は、 dsRNA分解活性を有するタンパク質であって、 dsRNAに作用して特定の長さの dsRNAを生成する活性を有することを特徴とする d sRNA分解活性を有するタンパク質に関する。
本発明の第 1の発明において、 dsRNA分解活性を有するタンパク質は、 Dicerの 機能ドメインを有することが好ましぐ例えば、 RNaseIIIa、 bならびに dsRNA結合ドメ インからなるものが好ましい。さらに、 PAZドメインを含んでいても良レ、。また、本発明 の第 1の発明のタンパク質を用いることにより、特定の長さの dsRNAが約 15— 30塩 基対の dsRNAを生成させることができる。また本発明の第 1の発明のタンパク質とし ては、 dsRNA分解活性を有するタンパク質が配列表の配列番号 4又は 17記載のァ ミノ酸配列あるいは配列表の配列番号 3又は 16記載の塩基配列でコードされるァミノ 酸配列からなるタンパク質が例示される。あるいは、配列表の配列番号 4又は 17記載 のアミノ酸配列において、一ないしは複数個のアミノ酸が置換、欠失、揷入あるいは 付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、本発明の第 1の発 明の dsRNA分解活性を有するタンパク質は、コドンを宿主での発現に適したものに 変換することによって、あるいはレアコドンに対する補強がなされた宿主を使用するこ とによって効率よく製造することができる。
また、当該タンパク質を低温誘導性ベクターを用いて発現させることができる。さら に本発明の第 1の発明のタンパク質は、コンポーネントとしてキットに含有させることが できる。
[0010] 本発明の第 2の発明は、核酸結合活性を有するタンパク質の存在下で dsRNAに d sRNA分解活性を有するタンパク質を作用させ、特定の長さの dsRNAを生成するこ とを特徴とする dsRNAの分解方法に関する。
本発明の第 2の発明において、核酸結合活性を有するタンパク質と dsRNA分解活 性を有するタンパク質は融合タンパク質であっても良レ、。また、核酸結合活性を有す るタンパク質は、 RNA結合活性を有するタンパク質であっても良レ、。当該 RNA結合 活性を有するタンパク質は、コールド ショック プロテインであってもよぐその由来 は好熱性菌あるいは耐熱性菌由来であっても良レ、。特に限定はされないが例えば、 サーモトガ マリティマ由来のコールド ショック プロテイン Bが例示される。
本発明の第 2の発明の方法により、特定の長さの dsRNA力 約 15— 30塩基対の d sRNAを生成することができる。さらに、本発明の第 2の発明において、 dsRNA分解 活性を有するタンパク質は、本発明の第 1の発明のタンパク質であっても良いし、天 然型 Dicerあるいはその機能的同等物であっても良い。
[0011] 本発明の第 3の発明は、核酸結合活性を有するタンパク質の存在下で RNA合成 活性を有するタンパク質を用いて RNA合成反応を行うことを特徴とする RNAの合成 方法に関する。
本発明の第 3の発明において、核酸結合活性を有するタンパク質と RNA合成活性 を有するタンパク質は融合タンパク質であっても良レ、。また、当該核酸結合活性を有 するタンパク質は、コールド ショック プロテインであってもよぐその由来は好熱性 菌あるいは耐熱性菌由来であっても良レ、。特に限定はされないが例えば、サーモト ガ マリティマ由来のコールド ショック プロテイン Bが例示される。さらに、 RNA合 成活性を有するタンパク質は DNA依存性 RNAポリメラーゼであってもよい。
[0012] 本発明の第 4の発明は、本発明の第 2の発明の方法に用いるための組成物であつ て、核酸結合活性を有するタンパク質並びに dsRNA分解活性を有するタンパク質を 含有することを特徴とする組成物に関する。
[0013] 本発明の第 5の発明は、本発明の第 2の発明の方法に用いるためのキットであって
、核酸結合活性を有するタンパク質と dsRNA分解活性を有するタンパク質を含有す ることを特徴とするキットに関する。
[0014] 本発明の第 6の発明は、本発明の第 3の発明の方法に用いるための組成物であつ て、核酸結合活性を有するタンパク質と RNA合成活性を有するタンパク質を含有す ることを特徴とする組成物に関する。
[0015] 本発明の第 7の発明は、本発明の第 3の方法に用いるためのキットであって、核酸 結合活性を有するタンパク質と RNA合成活性を有するタンパク質を含有することを 特徴とするキットに関する。
発明の効果
[0016] 本発明により、特定の長さの dsRNAを調製できる dsRNA分解活性を有するタンパ ク質が提供される。さらに本発明により、 RNA干渉等に利用できる特定の長さの dsR NAを効率よく生成させることができる。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 本明細書にぉレ、て Dicerとは、 RNAiの初期段階で長鎖の dsRNAを siRNAにプロ セッシングできる機能を有するタンパク質のことを言う。天然型の Dicerとしては、とく に限定はされないが例えば N末端側より ATP結合ドメイン、 RNAヘリカーゼドメイン 、機能未知な PAZドメイン、 RNasellla及び bドメイン、さらに dsRNA結合ドメインか ら構成されているものが挙げられる。
[0018] 本明細書において、 Dicerの機能ドメインとは、長鎖 dsRNAに作用して特定の長さ の dsRNAを生成できる活性に関与する領域をコードする部位のことを言う。
[0019] 上記機能ドメインとしては、特に限定はされないが例えば、 RNasellla, bドメイン並 びに dsRNA結合ドメイン力 なるものが例示される。当該 RNaseIIIa、 bドメインは、 Z hang H.他 4名 The EMBO Journal 2002年 vol. 21, No. 21, p5875— 5 885に記載のように、 2本鎖 RNAに特異的に作用し、 5'末端にリン酸基をもつを特 定の鎖長のオリゴヌクレオチドを生成させる活性に関与する領域をコードする部位で あっても良い。さらに、 dsRNA結合ドメインは、 2本鎖 RNAに特異的に結合する活性 をコードする部位であっても良い。
[0020] 本明細書において dsRNAとは、 RNA干渉の対象となる mRNAと該 mRNAに相 補的な塩基配列を有する RNAとの 2本鎖構造を形成した RNAのことを言う。
また、本明細書において dsRNAの分解反応による生成物の応用例としては、主に 以下に示す siRNAがある。
[0021] 本明細書において特定の長さの dsRNAとは、特に限定はされないが例えば、約 1 0 100塩基対の範囲中の特定の長さの dsRNAのことを言う。さらに、約 15 30塩 基対の範囲中の特定の長さ、特に 20 25塩基対の範囲中の特定の長さの dsRNA であっても良い。これらの dsRNAは、 siRNAとして使用できる。
[0022] 本明細書において核酸結合活性を有するタンパク質とは、一本鎖または二本鎖の DNA、 RNAに結合する活性を有するタンパク質のことを言う。当該タンパク質として は、核酸の二次構造を解消する機能を有するものが好ましぐ例えば、 DNAヘリカー ゼ、 RNAヘリカーゼあるいはその機能的同等物が挙げられる。
[0023] 本明細書において低温誘導性ベクターとは、低温で機能し得るプロモーターを有 するベクターのことを言レ、、例えば国際公開第 99/27117号パンフレットに記載の p Cold系ベクターが挙げられる。
[0024] 本明細書においてコールド ショック プロテインとは、本来の生育条件よりも低温に なるような状況下でその温度低下により刺激されて発現されるタンパク質の総称を言 5。
[0025] 本明細書において基質となる長鎖の dsRNAを完全に分解するとは、分解反応後 に未切断の基質となる長鎖の dsRNAが電気泳動法において確認されない程度に分 解することを言う。
[0026] 本明細書において PAZドメインとは、 Dicerの RNAヘリカーゼドメインと RNasellla および bドメインの間に存在するドメインである。例えば、配列表の配列番号 1記載の ヒト由来 Dicerアミノ酸配列のアミノ酸番号 898— 1064 (配列番号 2の塩基番号 269 2— 3192)の領域である。
[0027] 本発明においてレアコドンとは、使用頻度の低いコドンを意味する。 1つのアミノ酸 は複数のコドンにより規定されている力 生物種により、この複数のコドンの間で使用 する頻度に偏りが見られる。一般に、使用頻度の低いコドンに対応するトランスファー RNA (tRNA)の量が少なぐレアコドンを含有する塩基配列にコードされるアミノ酸 を発現させる場合に、発現効率が低下することが知られている。従って、レアコドンに 対応する tRNAの量を増大させるなど、レアコドンに対する補強を行うことにより、効 率よくタンパク質を製造することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
(1)本発明の dsRNA分解活性を有するタンパク質、該タンパク質の製造方法ならび に該タンパク質を含有するキット
本発明の dsRNA分解活性を有するタンパク質は、 dsRNAに作用して特定の長さ の dsRNAを生成することができる。当該 dsRNA分解活性を有するタンパク質として は、長鎖の dsRNAから特定の長さの dsRNAを生成できるものであれば特に限定は なぐ例えば、 Dicerの機能ドメインを有するタンパク質が例示される。当該 Dicerの 機能ドメインは、 RNaseIIIa、 bならびに dsRNA結合ドメインからなるタンパク質であ つても良い。また、長鎖の dsRNAから特定の長さの dsRNAを生成できるものであれ ば、そのタンパク質の由来は問わない。
当該 RNaseIIIa、 bドメイン並びに dsRNA結合ドメインは、特に限定はされないが 例えばヒト由来 Dicerの場合、配列表の配列番号 1記載のアミノ酸配列の N末端側の アミノ酸 1271— 1924 (配列表の配列番号 2記載の塩基配列番号 3811— 5772)を 有するものが挙げられる。例えば、配列表の配列番号 4記載のアミノ酸配列からなる もの、あるいは配列表の配列番号 3記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列から なるタンパク質（Dicer変異体）あるいは配列表の配列番号 12記載のアミノ酸配列か らなるもの、あるいは配列表の配列番号 13記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配 歹 IJからなるタンパク質 (Dicer変異体）が例示される。
また、 Dicerはサイズの大きいタンパク質であり、組換え体を製造するのに適してい ない。一方、本発明の dsRNA分解活性を有するタンパク質は、ネイティブな酵素に 比べてサイズが小さくコンパクトであり、組換え体を製造するのに有用である。一般に 、ヒトなどの高等生物由来の酵素を組換え体として大腸菌などのバクテリア細胞で製 造する場合、同等の酵素活性を保持したまま組換え体を製造することは困難を伴うこ とが多い。従って、本発明の dsRNA分解活性を有するタンパク質は、その由来とな る生物以外の細胞で製造する際に非常に有用である。
[0029] さらに本発明のタンパク質においては、 PAZドメインを含有していても良ぐ特に限 定はされないが例えば、配列表の配列番号 1記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号 898 一 1924 (配列表の配列番号 2記載の塩基番号 2692— 5772)を有するタンパク質、 配列表の配列番号 17記載のアミノ酸配列からなるもの、あるいは配列表の配列番号 16記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質（Dicer変異体）あ るいは配列表の配列番号 18記載のアミノ酸配列からなるもの、あるいは配列表の配 列番号 19記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質 (Dicer変 異体）が例示される。
[0030] さらに、変異体により、さらに酵素的に安定なものにすることが可能である。特に限 定はされないが、例えば、 PAZドメイン + RNaseIIIドメインの場合、 RNaselllドメイン のみの変異体タンパク質に比べて安定性を向上させることができる。より多くの凍結、 融解を施した場合でも活性を保持でき、またある保存緩衝液中では溶液状態でより 長期間の活性保持が可能である。
[0031] 本発明のタンパク質は、特に限定はされないが例えば、長鎖 dsRNAを分解し、 RN A干渉に有効な siRNAを生成させることができる。
また、上記機能を有する範囲であれば上記アミノ酸配列あるいは塩基配列におい て、一ないしは複数個のアミノ酸あるいは塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加され たものも本発明の dsRNA分解活性を有するタンパク質に含まれる。
特に限定はされないが、本発明の dsRNA分解活性を有するタンパク質において、 さらに発現ベクター由来の配列、例えば、発現あるいは翻訳増強配歹 IK例えば、 Perf ect DB配列等）、発現タンパク質精製用のタグ配列（例えば、 His tag配列等）、あ るいは発現タンパク質の N末端側の付加配列を除去するための配列（例えば、 Fact or Xa配列等）などのアミノ酸配列を付加したものも本発明の dsRNA分解活性を有 するタンパク質に含まれる。前記タンパク質としては、特に限定はされないが、例えば 配列表の配列番号 12又は 18記載のアミノ酸配列を有する dsRNA分解活性を有す るタンパク質が挙げられる。
本発明の dsRNA分解活性を有するタンパク質は、長鎖の dsRNAを特定の長さの dsRNAにすることができる。すなわち、本発明においては使用する dsRNA分解活 性を有するタンパク質を選択することにより、所望の特定の長さの dsRNAを調製する こと力 Sできる。当該特定の長さの dsRNAは、特に限定はされないが例えば、約 10— 100塩基対の範囲、好ましくは約 15 30塩基対の範囲、特に好ましくは約 20 25 塩基対の範囲中の特定の長さの dsRNAが例示される。
また、従来市販されている酵素によって、基質として用いた dsRNAは完全に分解さ れないのに対し、本発明の dsRNA分解活性を有するタンパク質は、基質となる長鎖 の dsRNAを実質的に全て切断することができる。従って、基質の dsRNAを全て切 断することができ、なおかつその分解産物による RNA干渉作用が同等であるので、 基質となる長鎖の dsRNAのスケールダウン、ひレ、ては未分解の dsRNA除去工程の 省略も可能となる。
さらに、本発明の dsRNA分解活性を有するタンパク質、特に限定はされないが例 えば Dicer変異体は、 pH8. 5以上のトリス-塩酸緩衝液中で塩化マグネシウムの存 在下で保存することにより、 4°C保存ならびに一 20°C保存のいずれの場合においても その活性を長期間安定に保持することができる。
本発明の dsRNA分解活性を有するタンパク質は、下記（2)に記載の核酸結合活 性を有するタンパク質、特に限定はされないが例えば、 RNA結合活性を有するタン パク質との融合タンパク質の形態であっても良い。特に限定はされなレ、が、上記 Dice r変異体と核酸結合活性を有するタンパク質、例えば、 RNA結合活性を有するタン パク質との融合タンパク質が例示される。
本発明の dsRNA分解活性を有するタンパク質を製造するための方法としては、コ ドンを宿主での発現に適したものに変換するカ あるいはレアコドンに対する補強す ることを含む方法であっても良い。特に限定はされないが例えば、発現遺伝子のコド ン改変を含む製造方法であってもよぐ当該タンパク質のアミノ酸配列の一部又は全 てをタンパク発現の至適のコドン状態に変換したもの、もしくはそれに準じる状態の宿 主を用いて発現させることができる。前記至適のコドン状態、もしくはそれに準じる状 態の宿主としては、特に限定はされないが例えば、特定のコドンを認識する tRNA量 を遺伝子工学的に通常この細胞中で産生する量よりも数倍以上高めた宿主が例示 される。当該宿主としては、大腸菌が例示され、例えばアルギニンのコドン (AGA、 A GG)の tRNAを補充した大腸菌、さらにイソロイシン (AUA)、プロリン（CCC)、ロイ シン（CUA)の tRNAを補充した大腸菌等が挙げられる。
さらに、コドン改変を行って、宿主中での目的のタンパク質の発現を向上させる方 法を用いても良ぐその際に mRNAの 2次構造を考慮にいれても良い。
すなわち、発現遺伝子のコドン変換、補強等によりタンパク発現が向上するような方 法であれば特に限定はされない。
本発明の dsRNA分解活性を有するタンパク質を製造するためのベクターには、特 に限定はなぐ市販のベクター、発現系のいずれもが使用できる。特に、限定はされ ないが例えば pETシステム（ノバジヱン社製）を用いることができる。さらに、低温で機 能し得るプロモーターを有するベクターが好適に使用でき、例えば国際公開第 99/ 27117号パンフレットに記載の pCold系ベクターが挙げられる。
本発明の製造方法の一態様としては、上記 Dicer変異体を低温で機能し得るプロ モーターを有するベクター、例えば国際公開第 99/27117号パンフレットに記載の pCold系ベクターで製造する方法が例示される。
すなわち、本発明の製造方法においては、特定の長さの dsRNAを生成させ得る機 能を保持できるタンパク質を発現できるベクターであればいずれもが好適に使用でき る。
また、当該特定の長さの dsRNAを生成させ得る機能を最終的に保持できるタンパ ク質を得られるならば、タンパク発現時は封入体の形態であるがその後のリホールデ イング操作により当該機能を回復できるものを発現できるベクターも含まれる。
本発明の方法の一態様、例えば上記 Dicer変異体を製造する場合においては、従 来のヒト由来 Dicerの全長を発現させた場合に比較して、生産量が向上し、さらに当 該タンパク質の活性保持体の取得率も向上させることができる。
本発明の dsRNA分解活性を有するタンパク質の製造方法においては、下記（2) に記載の核酸結合活性を有するタンパク質、特に限定はされないが例えば、 RNA 結合活性を有するタンパク質との融合タンパク質の形態で発現させる方法も含まれる (2)本発明の核酸結合活性を有するタンパク質による dsRNAの分解の促進方法並 びに当該タンパク質を用レヽた RNA合成促進方法
本発明の特定の長さの dsRNAを生成することを特徴とする dsRNA分解の促進方 法は、核酸結合活性を有するタンパク質の存在下に行うことを特徴とする。当該核酸 結合タンパクとしては、結果的に dsRNA分解活性を促進するものであれば特に限定 はなぐ例えば、上記 RNA結合活性を有するタンパク質等が好適に使用できる。 当該 RNA結合活性を有するタンパク質としては特に限定はなレ、が、コールド ショ ック プロテイン（Csp : cold shock protein)が例示される。特に常温域で機能し 得るコールドショックプロテインが好適に使用でき、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来 のコールドショックプロテインが好ましレ、。特に限定はされなレ、が、例えば配列表の配 列番号 9記載のアミノ酸配歹 IJ (配列表の配列番号 10記載の塩基配列でコードされる アミノ酸配歹 IJ)を有するサーモトガ マリティマ（Thermotoga maritima)由来の Csp Bタンパク質が好適に使用できる。当該サーモトガ マリティマ由来の CspBタンパク 質は、 列えば、 Thermotoga maritima strain MSB8を、ドイツチェ ザムノレンク フォン ミクロオルガニスメン ゥント ツェルクルツレン GmbHより購入（DSM3109 )し、プロテイン サイエンス（Protein Science)、第 8卷、 394— 403頁（1999)記 載の方法に従い遺伝子工学的に組換え体を製造することができる。さらに、低温で 機能し得るプロモーターを有するベクターが好適に使用でき、例えば国際公開第 99 /27117号パンフレットに記載の pCold系ベクターが挙げられる。
当該 CspBタンパク質を dsRNA分解活性を有するタンパク質と組み合わせることに より、当該 dsRNA分解活性を促進させることができる。さらに本発明の方法は、上記 (1)記載の特定の長さの dsRNAを生成させる dsRNA分解活性を有するタンパク質 、例えば Dicer変異体、天然型 Dicerあるいは市販のリコンビナント Dicerのような機 能的同等物のいずれにおいてもその特定の長さの dsRNAを生成させる活性を促進 できる。
本発明の方法において、核酸結合活性を有するタンパク質と dsRNA分解活性を 有するタンパク質を組み合わせることにより、当該 dsRNA分解活性を促進させること ができ、得られる分解産物は核酸結合活性を有するタンパク質を組合わせなかった 場合の分解産物と比べて、 RNA干渉作用におレ、て単位重量あたり同等の活性を有 する。従って、核酸結合活性を有するタンパク質を使用することは、 RNA干渉におい て非常に有用である。
また、従来行われている方法では、基質として用いた dsRNAは完全に分解されな いのに対し、本発明の方法において、基質となる長鎖の dsRNAを実質的に全て切 断すること力 Sできる。従って、基質の dsRNAを全て切断することができ、なおかつそ の分解産物による RNA干渉作用が同等であれば、基質となる長鎖の dsRNAのスケ ールダウン、ひレ、ては未分解の dsRNA除去工程の省略も可能となる。
さらに、本発明の方法においては、当該核酸結合活性を有するタンパク質、例えば RNA合成活性を有するタンパク質は、 dsRNA分解活性を有するタンパク質との融 合タンパク質の形態のものであってもよい。
[0035] 一方、本発明の RNA合成の促進方法は、核酸結合活性を有するタンパク質の存 在下に行うことを特徴とする。当該核酸結合タンパクとしては、結果的に RNA合成活 性を有するタンパク質の RNA合成活性を促進するものであれば特に限定はなぐ核 酸結合活性を有するタンパク質、コールドショックプロテイン（Csp : cold shock pro tein)が好適に使用できる。当該コールド ショック プロテインは、特に限定はされな レヽが好熱性菌あるレヽは耐熱性菌由来のものが好適に使用できる。当該コ一ルドショッ クプロテインとしては特に限定はされないが、配列表の配列番号 9記載のアミノ酸配 列（配列表の配列番号 10記載の塩基配列）を有するサーモトガ マリティマ (Therm otoga maritima)由来の CspBタンパク質が例示される。
当該 CspBタンパク質を RNA合成系に共存させることにより、例えば RNA ポリメラ ーゼの RNA合成活性を促進させることができる。当該タンパク質は、生成物が一本 鎖あるいは二本鎖 RNAのいずれの場合においても、その合成活性を促進することが できる。
[0036] さらに、本発明の RNA合成の促進方法は、長鎖 dsRNAのみならず、短鎖 dsRNA 、例えば siRNAの合成に利用することができる。当該 siRNA合成においては、特に 限定はされないが T7 RNAポリメラーゼ等を用いて、好ましくは約 15— 30塩基対、 特に好ましくは約 20— 25塩基対のものを合成する際に利用できる。
[0037] さらに本発明の方法においては、核酸結合活性を有するタンパク質が RNA合成活 性を有するタンパク質による dsRNAの合成ならびに dsRNA分解活性を有するタン パク質の dsRNA分解の二つの反応を促進するため、特に RNA干渉において重要 な dsRNAの合成ならびに siRNAの生成系に利用することができる。この場合、各タ ンパク質は別個であってもよいし、融合タンパク質の形態であってもよい。
[0038] (3)本発明の方法に使用される組成物
本発明の組成物は、特定の長さの dsRNAに分解する反応及び/又は RNAの合 成反応を効率よく行うための組成物である。
当該組成物は、上記（2)記載の核酸結合活性を有するタンパク質を含み、当該核 酸結合活性を有するタンパク質は特に限定はされなレ、が、コールド ショック プロテ インが好適であり、例えば、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールド ショック プ 口ティン（Csp : cold shock protein)が好適に使用でき、配列表の配列番号 9記 載のアミノ酸配列（配列表の配列番号 10記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列 )を有するサーモトガ マリティマ（Thermotoga maritima)由来の CspBタンパク質 が好ましい。
[0039] 本発明の組成物には、 dsRNA分解活性を有するタンパク質及び/又は RNA合成 活性を有するタンパク質を含んでいてもよい。特定の長さの dsRNAを生成し得る ds RNA分解活性を有するタンパク質としては、 Dicerの機能ドメインを有するものが好 ましぐ例えば、 RNaseIIIa、 bならびに dsRNA結合ドメインからなるタンパク質が好 適に使用できる。特に限定はされないが例えば、上記（1)記載の Dicer変異体、天 然型 Dicerあるいは、市販のリコンビナント Dicerのような機能的同等物のいずれであ つても良レ、。当該 Dicer変異体を含む組成物としては、配列表の配列番号 4又は 17 記載のアミノ酸配列からなるもの、あるいは配列表の配列番号 3又は 16記載の塩基 配列でコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質を含む組成物であってもよレ、。ま た、配列表の配列番号 4又は 17記載のアミノ酸配列において、一ないしは複数個の アミノ酸が置換、欠失、揷入あるいは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を含 む組成物であってもよい。
上記 dsRNA分解活性を有するタンパク質において、さらに発現ベクター由来の配 歹 IJ、例えば、発現あるいは翻訳増強配列（例えば、 Perfect DB配列等）、発現タン パク質精製用のタグ配列（例えば、 His tag配列等）、あるいは発現タンパク質の N 末端側の付加配列を除去するための配列（例えば、 Factor Xa配列等）などのァミノ 酸配列を付加したタンパク質であっても良レ、。前記タンパク質としては、特に限定はさ れないが、例えば配列表の配列番号 12又は 18記載のアミノ酸配列を有する dsRNA 分解活性を有するタンパク質が挙げられる。さらに、本発明の組成物には、上記（1) 記載の Dicer変異体を安定化させるための緩衝液を含んでいてもよい。
[0040] さらに、 RNA合成活性を有するタンパク質としては、例えば T7 RNAポリメラーゼ 、T3 RNAポリメラーゼ、 SP6 RNAポリメラーゼ等が好適に使用できる。
さらに本発明の組成物の別態様としては、上記（2)記載の核酸結合活性を有する タンパク質、例えば、 RNA結合活性を有するタンパク質と特定の長さの dsRNAを生 成し得る dsRNA分解活性を有するタンパク質との融合タンパク質及び/又は核酸 結合活性を有するタンパク質と RNA合成活性を有するタンパク質との融合タンパク 質を含有していてもよい。
本発明の組成物は、特定の長さの dsRNAへの効率の良い分解及び/又は一本 鎖あるいは 2本鎖 RNAの合成反応を簡便に行なうことができる。
[0041] また、本発明の組成物の一態様としては、長鎖 dsRNAのみならず、短鎖 dsRNA、 例えば siRNAの合成に利用することができる組成物が挙げられる。当該組成物は、 約 10— 100塩基対、好ましくは約 15— 30塩基対、特に好ましくは約 20— 25塩基対 の dsRNAを合成する際に有効である。
[0042] (4)本発明の方法に使用されるキット
本発明の方法に使用されるキットは、特定の長さの dsRNAに分解する反応及び Z 又は RNAの合成反応を効率よく行うためのキットである。
当該キットは、上記（2)記載の核酸結合活性を有するタンパク質を含み、当該核酸 結合活性を有するタンパク質は特に限定はされなレ、が、コールド ショック プロティ ンが好適であり、例えば、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールド ショック プロ ティン（Csp : cold shock protein)が好適に使用でき、配列表の配列番号 9記載 のアミノ酸配列を有するサーモトガ マリティマ（Thermotoga maritima)由来の Cs pBタンパク質が好適に使用できる。
[0043] 本発明のキットには、特定の長さの dsRNAを生成する活性を有する、 dsRNA分解 活性を有するタンパク質及び Z又は RNA合成活性を有するタンパク質を含んでい てもよレ、。該 dsRNA分解活性を有するタンパク質及び/又は RNA合成活性を有す るタンパク質としては、上記（3)で挙げられたものが好適に使用できる。さらに、本発 明のキットには、上記（1)記載の Dicer変異体を安定化させるための緩衝液を含んで いてもよい。
さらに本発明のキットの別態様としては、上記（2)記載の核酸結合活性を有するタ ンパク質、例えば、 RNA結合活性を有するタンパク質と特定の長さの dsRNAを生成 し得る dsRNA分解活性を有するタンパク質との融合タンパク質及び Z又は核酸結 合活性を有するタンパク質と RNA合成活性を有するタンパク質との融合タンパク質 を含有していてもよい。
さらに、本発明のキットには、上記以外のコンポーネント、例えば反応の結果生成さ れた特定の長さの dsRNAを精製するための試薬、それを生体サンプルに導入する 試薬等を含有していても良い。特に限定はされないが例えば、約 21塩基対の siRN Aを精製するための試薬、それを生体サンプノレに導入する試薬等を含有していても 良い
本発明のキットを用いることで、特定の長さの dsRNAへの効率の良い分解及び/ 又は RNAの合成を簡便に行なうことができる。
[0044] また本発明のキットの一態様としては、長鎖 dsRNAのみならず、短鎖 dsRNA、例 えば siRNAの合成に利用することができるキットが挙げられる。当該キットは、約 10 一 100塩基対、好ましくは約 15— 30塩基対、特に好ましくは約 20 25塩基対の ds RNAを合成する際に有効である。
実施例
[0045] 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施 例のみに限定されるものではない。 また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本 的な操作については 2001年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、 T •マニアテイス（Τ· Maniatis)ら編集、モレキュラー クローニング：ァ ラボラトリー マ二ユアノレ第 3版 (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 3rd ed. ) に記載の方法によった。
[0046] 実施例 1 ヒト由来 Dicerの RNaselllドメインの発現
( 1 )発現ベクターの構築
配列表の配列番号 1記載のヒト由来 Dicer アミノ酸配列の N末端側よりアミノ酸 12 71— 1924 (塩基番号 381 1 5772)よりなるポリペプチドを発現させるため、以下の ようにして発現ベクターを構築した。
まず、ジーンバンク登録 No. AB028449で公開されている塩基配列より、配列表 の配列番号 5及び 6記載の塩基配列を有する合成プライマー 1及び 2を DNA合成機 で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー 1は、制限酵素 Kpnlの認識配 列を塩基番号 9一 14に、さらにヒト由来 Dicerのアミノ酸配列（配列番号 1 )のアミノ酸 番号 1271— 1277に相当する塩基配列を塩基番号 16— 36にもつ合成 DNAである 。また、合成プライマー 2は、制限酵素 Hindlllの認識配列を塩基番号 9一 14に、さら にヒト由来 Dicerのアミノ酸配列（配列番号 1 )のアミノ酸番号 1919一 1924に相当す る塩基配列を塩基番号 18— 36にもつ。
[0047] 上記合成プライマーを用いて、 PCRを行った。 PCRの反応条件を以下に示す。
すなわち、铸型 DNA (ヒト cDNAライブラリー、 Human Pancreas,タカラバイオ 社製） 2 /i 1、 5 /i 1の 10 X LA PCR buffer (タカラバイオ社製）、 5 μ 1の dNTP混合 液（タカラバイオ社製）、 l Opmolの合成プライマー 1、 l Opmolの合成プライマー 2、 0 . 5Uの Takara LA Taq (タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を 50 μ 1 とした。前記反応液を TaKaRa PCR Thermal Cycler SP (タカラバイオ社製） にセットし、 94°C 1分、 55°C 1分、 72。C 3分を 1サイクルとする 30サイクルの反応 を行なった。
[0048] 反応終了後、該反応液 5 μ 1を 1. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。確認され た目的の約 2kbpの DNAフラグメントを電気泳動ゲルより回収'精製し、エタノール沈 殿を行なった。エタノール沈殿後の回収 DNAを 5 /i lの滅菌水に懸濁し、制限酵素 K pnl (タカラバイオ社製)及び制限酵素 Hindlll (タカラバイオ社製）で 2重消化し、 1. 0%ァガロース電気泳動によりその Kpnl— Hindlll消化物を抽出精製し、 Kpnl-Hin dill消化 DNA断片を得た。
[0049] 次に国際公開第 99Z27117号パンフレットの実施例 1一 6記載の方法に従レ、、 pC old08NC2ベクターを調製した。
次に上記 pCold08ベクターを上記 Kpnl— Hindlll消化 DNA断片を調製した時に 用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記 Kpn I_HindIII消化 DNA断片と混合し、 DNAライゲーシヨンキット（タカラバイオ社製）を 用いて連結した。その後、ライゲーシヨン反応液 20 μ ΐを用いて大腸菌 JM109を形質 転換し、その形質転換体を 1. 5% (wZv)濃度の寒天を含む LB培地（アンピシリン 5 0 μ g/ml含む）上で生育させた。
[0050] 目的の DNA断片が挿入されたプラスミドは、シークェンシングすることにより確認し 、この組み換えプラスミドを pCold08 hDi— Rとした。当該プラスミドは、 pCold08 h Di - Rと命名、表示され、平成 15年 8月 11日（原寄託日）より独立行政法人産業技術 総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305—8566) )に FERM BP—10074として寄託されている。この pCold 08 hDi— Rは、ヒト由来 Dicer アミノ酸配列（配列番号 1)のアミノ酸番号 1271— 19 24のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。前記プラスミドから 発現させたタンパク質は、 Perfect DB配歹 U、 His tag配列、並びに Factor Xa配 歹 IJを有している。当該タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号 12に、塩基配 列を配列表の配列番号 13に示す。
[0051] (2)発現、精製及び各種 buffer条件でのサンプル調製
上記（1)で調製した pCold08 hDi-Rを用いて大腸菌 BL21を形質転換し、その 形質転換体を 1. 5% (w/v)濃度の寒天を含む LB培地（アンピシリン 50 μ g/ml含 む）上で生育させた。生育したコロニーを 2. 5mlの LB液体培地（アンピシリン 50 x g /ml含む）に植菌し、 37°Cでー晚培養した。この一部を 100mlの同 LB培地に植菌 し、 37°Cで対数増殖期まで培養した。前記培養後、 15°Cに保温したインキュベータ 一内で 10分間振とうした後、 IPTGを終濃度 1. OmMになるように添カ卩し、そのまま 1 5°Cで 24時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、 5mlの 細胞破砕溶液 [50mM トリス一塩酸緩衝液（pH7. 5)、 100mM 塩化ナトリウム、 0 . 5mM EDTA、 l %Triton (トライトン） X_100、 ImM ジチオスレイト一ノレ、 2mM フエ二ルメチルスルフォニルフルオライド]に再懸濁した。超音波破砕により菌体を 破砕し、遠心分離（11 , OOOrpm 20分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。
[0052] 上記上清の抽出液 約 5mlを用いてさらにニッケノレカラムによる精製を以下のように 行なった。
すなわち、樹脂容積にして lml分の Ni_NTA agarose (キアゲン社製）に buffer A[20mM トリス—塩酸緩衝液（pH7. 5)、 100mM 塩化ナトリウム、 ImM ジチォ スレイト一ノレ、 0. 1 %トライトン X—100]を 10ml添加し、混和後、 1 , 500 rpmで数分 間遠心し、上清を廃棄して、約 lmlの樹脂を回収した。菌体破砕液より調製した約 5 mlの上清を添カ卩し、 4°Cで約 1時間、ロータリーシエイカーで穏やかに混和した。その 後、この目的タンパク質の吸着した樹脂を φ 15mmのカラムに充填し、 5mlの buffer Aで 2回洗浄した。次に 5mlの bufferB[20mM トリス—塩酸緩衝液（ρΗ 7. 5)、 100 mM 塩ィ匕ナトリウム、 ImM ジチ才スレイト一ノレ、 0· 1%トライトン X_100、 40mM イミダゾール]で樹脂を洗浄後、 5mlの bufferC[20mM トリス-塩酸緩衝液（pH 7 · 5)、 800mM 塩化ナトリウム、 ImM ジチオスレィトール、 0· 1 %トライトン X_100、 40mM イミダゾール]、続レ、て 5mlの buff erBで洗浄を行レ、目的以外の不要タンパ ク質の除去を行った。
[0053] 洗浄後、 3mlの bufferD [20mM トリス一塩酸緩衝液（pH7. 5)、 lOOmM 塩化 ナトリウム、 ImM ジチオスレイト一ノレ、 0. 1%トライトン X— 100、 lOOmM イミダゾ ール]で溶出操作を行った。次に、 500mlの buff erE[50mM トリス一塩酸緩衝液（ pH8. 0)、 lOOmM 塩ィ匕ナ卜];ゥム、 0. 5mM EDTA, 0. 1 %卜ジ卜ン X_100、 lm M ジチオスレィトール]で透析を行なレ、、その後、セントリコン（アミコン社製）を用い て約 10倍まで濃縮を行なった。この精製濃縮サンプルの一部について 10。/oSDSポ リアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約 76， 800のところに目的タン パク質のバンドが確認された。さらに、当該サンプルについて Anti His HRP Co njugate (キアゲン社製）を用い、その添付プロトコルに従って抗 Hisタグ抗体を用い たウェスタンブロッテイング検出を行なったところ、 目的のタンパク質バンドが発色検 出された。以下、このヒト由来 Dicer RNaselllドメインタンパク質を hDiRと称する。
[0054] さらに上記方法では bufferDでの溶出後、 buff erE (これをタンパク質サンプル Iと する）で透析を行なっている力 タンパク形状緩衝液の条件設定のため、以下の組成 の緩衝液での透析も同様にして実施した。
l : bufferFを用いた透析 [50mM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 0)、 lOOmM 塩化 ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 0. 1 %トリトン X_100、 ImM ジチオスレイト ール]→タンパク質サンプル II
2 : bufferGを用いた透析 [50mM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 5)、 lOOmM 塩化 ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 0. 1 %トリトン X_100、 ImM ジチオスレイト ール]→タンパク質サンプル III
3 : bufferHを用いた透析 [50mM トリス一塩酸緩衝液（ρΗ8· 8)、 lOOmM 塩化 ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 0· 1 %トリトン X_100、 ImM ジチオスレイト 一ノレ]→タンパク質サンプル IV
[0055] 実施例 2 dsRNA分解活性の測定
(1)反応液の調製
上記実施例 1一（2)で調製したタンパク質サンプル I一 IVについてその Dicer活性を 測定した。当該活性測定は以下のようにして行った。
まず、活性測定に用いた基質となる dsRNAは、 TurboScript T7 Transcriptio n kit (GTS社製）を用いて、その添付プロトコルに従って合成した。
すなわち、プラスミド pQBIl 25 (和光純薬社製）に揷入されている Red—shift Gre en Fluorescent Protein (以下 GFPと略称する）をコードする遺伝子（配列表の 配列番号 11)について、プラスミド pDON— AI (タカラバイオ社製）に揷入した pD〇N 一 rsGFPを錡型とし、配列表の配列番号 7記載の T7プロモーター配列をもった合成 プライマー 3と配列表の配列番号 8記載の合成プライマー 4を用いて PCRを行レ、、増 幅産物を得た。次に得られた 2本鎖 DNAを錡型として、 T7 RNA polymeraseに よる RNA合成反応により約 700bpの長さの dsRNAを調製した。 [0056] 上記方法で調製した dsRNA 1 /i g、上記（2)で調製した hDiR 1 μ 1, 10mM A TP溶液 1 μ 1、 50mM 塩化マグネシウム溶液 1 / 1、 5 X反応緩衝液 (それぞれ最 終透析に用いた緩衝液の 5倍濃縮したもの） 2 μ ΐ、これに nuclease free水を加え て、全量を 10 μ 1としたものを反応液とした。
[0057] また、市販の Dicer (GTS社製）の場合は、 Dicer酵素液 2 μ 1、基質となる dsRNA l z g l OmM ATP溶 f夜 1 μ 1、 50mM 塩ィ匕マグネシウム溶 ί夜 0. 5 μ 1、付属 の反応緩衝液 4 μ 1、これに nuclease free水を加えて、全量を 10 μ 1としたものを 反応液とした。
[0058] 以上の反応液を調製し、 37°Cで 17時間反応後、 5 μ 1を 15%ポリアクリルアミドゲル 電気泳動、ェチジゥムブロマイドによる染色に供して切断産物の確認を行なった。電 気泳動後にェチジゥムブロマイド染色したゲルより、約 21ヌクレオチドの分解産物の 確認されたものを活性有とした。
[0059] (2)活性測定
上記（1)で調製した反応液の活性測定を行い、 RNaselllドメインタンパク質 (hDiR )への影響を検討した。さらに、各緩衝液中における安定性についても検討するため 、精製直後のサンプルを用いた場合と、 4°C及び一 20°C条件で 5日間保存したサン プノレを用いた。その結果、特にタンパク質サンプル III、タンパク質サンプノレ IVにおい ては、 4°C保存ならびに- 20°C保存のいずれの場合においても巿販 Dicerと同じ大き さの約 21ヌクレオチドの分解産物が確認され、その活性を安定に保持していることが 確認できた。
[0060] 以上のことから、ヒト由来 Dicerの RNaselllドメインタンパク質（hDiR)は、 ρΗ8· 5 以上のトリス一塩酸緩衝液中、塩化マグネシウムが存在する条件で保存することで活 性を安定化できることが判明した。
[0061] 実施例 3 dsRNA生産及び分解に寄与する因子の検討
(l) dsRNA生産及び分解に寄与する因子を検討するために、常温域で核酸結合活 性を有するタンパク質について検討した。
上記核酸結合活性を有するタンパク質は入手が困難であった。従って、配列表の 配列番号 9記載のアミノ酸配列を有するサーモトガ マリティマ（Thermotoga mari tima)由来の CspBタンパク質をモデルタンパク質として用いた。当該タンパク質は、 プロテイン サイエンス（Protein Science)第 8卷、 394—403頁（1999)記載の方 法で調製した。
[0062] (2)サーモトガ マリティマ由来 CspBの dsRNA分解への効果
CspBを添加した形での dsRNA分解活性は以下のように測定した。
すなわち、 hDi— Rを酵素として用いた場合、実施例 1一 (2)で調製した hDiR (酵素 液） 1 μ 1、上記（ 1 )で調製した CspB溶液 1 μ 1、基質として実施例 2_ ( 1 )で使用し た dsRNA l z g l OmM ATP溶液 1 μ 1、 50mM 塩ィ匕マグネシウム溶液 1 μ \ 、 5 Χ反応緩衝液 [250mM トリス—塩酸（pH8. 5)、 500mM 塩ィ匕ナトリウム、 0. 5 %TritonX-100, 5mM DTT] 2 μ 1、これに nuclease free水を加えて、容量を 10 μ ΐとしたものを反応液とした。また市販の Dicerの場合は、添付資料記載の組成 に基質となる dsRNAを 1 μ gカロえ、これに nuclease free水を加えて、容量を 10 μ 1 としたものを反応液とした。なお市販の Dicerについては、 GTS社、 Stratagene社、 Invitrogen社のものを使用した。
[0063] 添加した CspBタンパク質の濃度は終濃度で 4· 6ng/ β 1、 9. 2ng/ /i 1、 18. 4ng / /i l、 92η§/ μ 1になるように添カロし、無添加の場合のコントロールとして CspBの形 状緩衝液である 10mM リン酸カリウム緩衝液 (pH7. 5)を 1 β 1添加した。
[0064] 以上の反応液を調製し、 37°Cで 18時間反応後、 5 μ 1を 15%ポリアクリルアミドゲル 電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイドによる染色を行い分解産物を確認した。さら に、当該ゲノレを Total Lab ver. 1. 1 1 (Nonlinear Dynamics社製)による画像 解析によって、約 21ヌクレオチドの dsRNA分解物の定量を行なった。その結果、巿 販 Dicer及び RNaselllドメインタンパク質（hDiR)のレ、ずれの場合にぉレ、ても CspB 添加による dsRNAの分解量の向上が全ての添加量に関して確認できた。特に 9. 2 ng/ μ 1の前後で分解量が向上することが確認できた。
[0065] すなわち、 CspBを反応液中に添加することで、市販の Dicer、 RNaselllドメインタ ンパク質のいずれにおいても dsRNA分解産物がより多く得られることが明らかとなつ た。
[0066] (3)サーモトガ マリティマ由来 CspBの RNA合成への効果 RNA干渉においては、 dsRNAを合成するために RNA合成系の活性を促進する ことも重要であるとの見地に基づき、サーモトガ マリティマ由来 CspBの RNA合成へ の効果を検討した。モデル系として、 T7 RNAポリメラーゼ系を選択した。 RNA合 成系への影響については以下のようにして行った。すなわち、 CspBを添カ卩した形で の T7 RNAポリメラーゼによる転写量を目安とした。常法により調製した T7プロモー ターを有する pET16b (ノバジヱン社製）に配列表の配列番号 11記載の塩基配列を 有する rsGFP遺伝子を導入したプラスミドを铸型 DNAとして 1 μ g、 10 X T7RNAポ リメラーゼ用緩衝液（タカラバイオ社製） 2 μ 1、 50πιΜ DTT 2 μ 1、 RNaseインヒビ ター（タカラバイオ社製） 0. 4 μ 1、 25mM NTP 2 μ 1、 T7 RNAポリメラーゼ（タ カラバイオ社製） 1 μ 1、 CspB溶液 1 μ 1、これに nuclease free水を加えて容量を 20 μ ΐとしたものを反応液とし、 37°Cで 4時間反応させた。なお本実施例で CspBタン ノ、°ク質の濃度は終濃度で 90ng/ l、 180ng/ z l、 460ng/ l、 920ng/ z lに なるように添加し、無添加の場合のコントロールとして CspBの形状緩衝液である 10 mM リン酸カリウム緩衝液（ρΗ7· 5)を Ι μ ΐ添加した。
反応後のサンプル 2 μ 1に、 10 X MOPS緩衝液（200mM MOPS、 50mM 酢酸 ナトリウム、 10mM EDTA、 10mM EGTA) 2 /i 1、ホルムアルデヒド 2 μ 1、脱ィ オン化ホルムアミド 9 /i 1及び nuclease free水 3 μ 1を添カロして 70°C、 10分間保 温し、その後氷中で 1分間インキュベートした。これに 10 X loading buffer 2 μ 1を 添加して、 1 X MOPS緩衝液中でェチジゥムブロマイドを含む 1. 25%ァガロースゲ ルを用いて電気泳動解析を行なった。そのゲルを Total Lab ver. 1. 11 (Nonlin ear Dynamics社製）による画像解析によって、 T7 RNAポリメラーゼによって合成 された mRNAの定量を行なった。その結果、いずれの濃度においても転写産物量の 向上が確認できた。特に、 CspBの添カ卩量が 460ngZ x l以上の場合、転写産物量 が無添加時の場合の約 2倍以上に、さらに 920ng/ z 1添加した場合は約 3倍になる ことが確認できた。
(4)サーモトガ マリティマ由来 CspBの dsRNA合成への効果
次にサーモトガ マリティマ由来 CspBの dsRNA合成に対する影響について検討し た。本実施例においては、実施例 2_ (1)で調製した dsRNA合成用铸型を利用した 。 RNAへの転写については、市販の TurboScript T7 Transcription kit (ジー ンセラピーシステムズ社製）を用いて、その添付プロトコルに従った。なお、この際に 添加した CspBタンパク質の濃度は終濃度で 90ng/ μ 1、 180ng/ μ 1、 460ng/ μ 1、 920ngZ x lになるようにし、無添加の場合のコントロールとして CspBの形状緩衝 液である 10mM リン酸カリウム緩衝液 (pH7. 5)を: 1添カ卩した。 37°C、 4時間反 応後に Ι μ ΐの DNaselを添加し、 37°Cで 15分間反応させた。この反応液の 40倍希 釈液 1 μ ΐをェチジゥムブロマイドを含む 1%ァガロースゲル電気泳動に供した。その ゲルを上記（3)と同様の方法で Τ7 RNAポリメラーゼによって合成された dsRNAの 定量を行なった。その結果、いずれの濃度においても転写産物量の向上が確認でき た。特に、 CspBの添カ卩量が 920ngZ x l以上の場合、転写産物量が無添加時の場 合の約 2倍以上なることが確認できた。
[0068] 上記実施例と同様に別態様の T7 RNAポリメラーゼ転写系についても検討した。
すなわち、実施例 2_ (1)で調製した dsRNA合成用铸型 1 μ g、 10 XT7 RNAポリ メラーゼ緩衝液（タカラバイオ社製） 1 μ 1、 50mM DTT 1 /i 1、 RNaseインヒビタ 一（タカラバイオ社製） 0· 2 μ 1、25ιηΜ ΝΤΡ 1 /i 1、 Τ7 RNAポリメラーゼ（タカ ラバイオ社製） 0. 5 x l、CspB溶液 1 /i 1、これに nuclease free水を加えて容量 を 10 μ ΐとしたものを反応液とし、 37°Cで 4時間反応させた。なおこの際に添加した C spBタン/ヽ°ク質の濃度は終濃度で 90ng/ μ 1、 180ng/ μ 1、 460ng/ μ 1、 920ng / /i 1になるようにし、無添加の場合のコントロールとして CspBの形状緩衝液である 1 OmM リン酸カリウム緩衝液（ρΗ7· 5)を Ι μ ΐ添加した。反応後のサンプルに DNas el (タカラバイオ社製）を 0. 5 / l加えて、 37°Cで 15分間反応させた。この反応液の 4 0倍希釈液 1 μ 1をェチジゥムブロマイドを含む 1%ァガロースゲル電気泳動に供した 。そのゲルについても dsRNAの定量を行なった。その結果、いずれの濃度において も転写産物量の向上が確認できた。特に、 CspBの添加量が 920ng/ z l以上の場 合、転写産物量が無添カ卩時の場合の約 3倍以上なることが確認できた。
[0069] 以上のように、 CspBを反応液中に添加することで、 T7 RNAポリメラーゼによる転 写産物がより多く得られることが明らかとなった。この効果は、 1本鎖 RNA合成ならび に 2本鎖 RNA合成のレ、ずれの場合にぉレ、ても確認できた。 [0070] 実施例 4 ヒト由来 Dicerの ΡΑΖ + RNaseIIIドメインの発現
( 1 )発現ベクターの構築
配列表の配列番号 1記載のヒト由来 Dicer アミノ酸配列の N末端側よりアミノ酸 67 9一 1924 (塩基番号 2035 5772)よりなるポリペプチドを発現させるため、以下の ようにして発現ベクターを構築した。
まず、ジーンバンク登録 No. AB028449で公開されている塩基配列より、配列表 の配列番号 14及び 15記載の塩基配列を有する合成プライマー 5及び 6を DNA合 成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー 5は、制限酵素 Kpnlの認 識配列を塩基番号 9一 14に、さらにヒト由来 Dicerのアミノ酸配列（配列番号 1 )のアミ ノ酸番号 679— 685に相当する塩基配列を塩基番号 16— 36にもつ合成 DNAであ る。また、合成プライマー 6は、制限酵素 Hindlllの認識配列を塩基番号 9一 14に、 さらにヒト由来 Dicerのアミノ酸配歹 1J (配列番号 1 )のアミノ酸番号 1919一 1924に相 当する塩基配列を塩基番号 18— 35にもつ。
[0071] 上記合成プライマーを用いて、 PCRを行った。 PCRの反応条件を以下に示す。
すなわち、铸型 DNA (ヒト cDNAライブラリー、 Human Pancreas,タカラバイオ 社製） 2 /i 1、 5 /i 1の 10 X LA PCR buffer (タカラバイオ社製）、 5 μ 1の dNTP混合 液（タカラバイオ社製）、 l Opmolの合成プライマー 5、 l Opmolの合成プライマー 6、 0 . 5Uの Takara LA Taq (タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を 50 /i 1 とした。前記反応液を TaKaRa PCR Thermal Cycler SP (タカラバイオ社製） にセットし、 94°C 1分、 55°C 1分、 72°C 3分を 1サイクルとする 30サイクルの反応 を行なった。
[0072] 反応終了後、該反応液 5 μ 1を 1. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。確認され た目的の約 2. 7kbpの DNAフラグメントを電気泳動ゲルより回収'精製し、エタノー ル沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収 DNAを 5 μ ΐの滅菌水に懸濁し、制限 酵素 Kpnl (タカラバイオ社製)及び制限酵素 Hindlll (タカラバイオ社製)で 2重消化 し、 1. 0%ァガロースゲル電気泳動によりその KpnI_HindIII消化物を抽出精製し、 KpnI_HindIII消化 DNA断片を得た。
[0073] 次に実施例 1_ ( 1 )で調製した pCold08NC2ベクターを上記 Kpnl— Hindlll消化 DNA断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理し たものを調製し、上記 Kpnl— Hindlll消化 DNA断片と混合し、 DNAライゲーシヨン キット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーシヨン反応液 20 / 1を 用いて大腸菌 JM109を形質転換し、その形質転換体を 1. 5% (w/v)濃度の寒天 を含む LB培地（アンピシリン 50 μ gZml含む）上で生育させた。
[0074] 目的の DNA断片が揷入されたプラスミドは、シークェンシングすることにより確認し 、この組み換えプラスミドを pCold08 hDi_ASIとした。当該プラスミドは、 pCold08 hDi - ASIと命名、表示され、平成 15年 9月 26日（原寄託日）より独立行政法人産 業技術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305—8566) )に FERM BP—10076として寄託されてレ、る。こ の pCold08 hDi— ASIは、ヒト由来 Dicer アミノ酸配列（配列番号 1 )のアミノ酸番 号 679— 1924のアミノ酸配列をコードする塩基配歹 IK配列表の配列番号 16記載の 塩基配列、配列番号 17記載のアミノ酸配歹 IJ)を含むプラスミドである。前記プラスミド 力 発現させたタンパク質は、 Perfect DB配歹 lj、 His tag配列、並びに Factor X a配列を有している。当該タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号 18に、塩基 配列を配列表の配列番号 19に示す。
[0075] (2)発現、精製
上記（ 1 )で調製した pCold08 hDi-ASIを用レ、て大腸菌 BL21— CodonPlus-RI L strain (ストラタジーン社製）を形質転換し、その形質転換体を 1 · 5% (w/v)濃 度の寒天を含む LB培地（アンピシリン 50 μ g/ml含む）上で生育させた。生育したコ ロニーを 2· 5mlの LB液体培地（アンピシリン 50 μ g/ml含む）に植菌し、 37°Cで一 晚培養した。この一部を 100mlの同 LB培地に植菌し、 37°Cで対数増殖期まで培養 した。前記培養後、 15°Cに保温したインキュベーター内で 10分間振とうした後、 IPT Gを終濃度 1. OmMになるように添加し、そのまま 15°Cで 24時間培養して発現誘導 させた。その後菌体を遠心分離により集め、 5mlの細胞破砕溶液 [50mM トリス一塩 酸緩衝液（ρΗ8. 5)、 l OOmM 塩化ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 0. 1 %ト ライトン X_100、 ImM ジチオスレィトール、 ImM フエ二ルメチルスルフォニルフ ルォライド]に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（1 1， OOOrpm 20分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。
[0076] 上記上清の抽出液 約 5mlを用いてさらにニッケノレカラムによる精製を以下のように 行なった。
すなわち、樹脂容積にして lml分の Ni_NTA agarose (キアゲン社製）に buffer A[20mM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 5)、 100mM 塩化ナトリウム、 ImM ジチォ スレイトール、 ImM 塩化マグネシウム、 0. 1 %トライトン X—100]を 10ml添加し、混 和後、 1 , 500 rpmで数分間遠心し、上清を廃棄して、約 lmlの樹脂を回収した。菌 体破砕液より調製した約 5mlの上清を添加し、 4°Cで約 1時間、ロータリーシエイカー で穏やかに混和した。その後、この目的タンパク質の吸着した樹脂を φ 15mmのカラ ムに充填し、 5mlの buff erAで 2回洗浄した。次に 5mlの bufferB [20mM トリス一塩 酸緩衝液（ρΗ8. 5)、 lOOmM 塩化ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 ImM ジチオスレィトール、 0. 1%トライトン X_100、 40mM イミダゾール]で樹脂を洗浄 後、 5mlの bufferC [20mM トリス一塩酸緩衝液（ρΗ8· 5)、 800mM 塩化ナトリウ ム、 ImM 塩化マグネシウム、 ImM ジチオスレィトール、 0. 1 %トライトン X_100、 40mM イミダゾール]、続レ、て 5mlの buff erBで洗浄を行レ、目的以外の不要タンパ ク質の除去を行った。
[0077] 洗浄後、 3mlの bufferD [20mM トリス一塩酸緩衝液（pH8. 5)、 lOOmM 塩化 ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 ImM ジチオスレィトール、 0. 1%トライトン X 一 100、 lOOmM イミダゾール]で溶出操作を行った。次に、 500mlの buff erE [50 mM トリス一塩酸緩衝液（ρΗ8· 5)、 100mM 塩化ナトリウム、 ImM 塩化マグネシ ゥム、 0. 1%トリトン X— 100、 ImM ジチオスレィトール]で透析を行ない、その後、 セントリコン (アミコン社製）を用いて約 10倍まで濃縮を行なった。その一部について 10%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、大腸菌 BL21_CodonPlu s-RIL strain (ストラタジーン社製）を宿主として用いたサンプルで分子量約 144, 0 00のところに目的タンパク質のバンドが確認され、これを以下の活性の確認に使用し た。以下、このヒト由来 Dicer PAZ + RNaseIIIドメインタンパク質を hDi_ASIとする
[0078] (3) dsRNA分解活性の測定 上記実施例 4一（2)で調製したタンパク質サンプノレについて、実施例 2記載の方法 でその dsRNA分解活性を測定した。
その結果、電気泳動後にェチジゥムブロマイド染色したゲルより、約 21ヌクレオチド の分解産物が確認され、 RNaselllドメインタンパク質（hDiR)と PAZ領域を含むタン パク質 (hDi— ASI)におレ、ても dsRNA分解活性が確認された。
[0079] さらに、凍結 '融解における安定性についても検討するため、 _80°C条件で上記タ ンパク質サンプノレを凍結、その後、室温で融解させるという操作を 6回、及び 10回繰 り返した。また、コントロールとして実施例 1一（2)で調製した hDiRについても同様の 検討を行った。
その結果、 PAZ + RNaselllドメインタンパク質（hDi— ASI)の場合、凍結'融解を 6 回、 10回繰り返しても分解活性を保持していた。一方、 hDiRについては 6回の凍結 •融解まで活性は確認された。このこと力ら、 RNaselllドメインにさらに PAZドメインを 含むことにより当該タンパク質は、より多くの凍結 ·融解に対する安定性を獲得するこ とが確認できた。
[0080] (4)分解に寄与する因子についての検討
上記実施例 4 - (2)で調製した hDi - ASIについて、常温域で核酸結合活性を有す るタンパク質の影響を検討した。
上記核酸結合活性を有するタンパク質としては、上記実施例 3で調製したサーモト ガ マリティマ由来の CspBタンパク質を用いた。また、 dsRNA分解への効果につい ては、以下のように測定した。
すなわち、実施例 4一 (2)で調製した hDi— ASI (酵素液） 1 μ 1、実施例 3で調製した CspB溶 f夜 1 μ 1、基質となる dsRNA 1 μ g, 10mM ATP溶 f夜 1 μ 1、 50mM 塩化マグネシウム溶液 1 μ 1、 5 X反応緩衝液 [250mM トリス—塩酸（pH8. 5)、 7 50mM 塩ィ匕ナトリクム、 0. 5%トライトン X_100、 5mM DTT]を 2 μ 1、これに nucl ease free水を加えて、容量を 10 μ 1としたものを反応液とした。 CspBタンパク質の 濃度は終濃度で 9. 2ng/ z l, 18. 4ng/ μ 1, 92ng/ μ 1になるように添カロし、無添 加の場合のコントロールとして CspBの形状緩衝液である 10mM リン酸カリウム緩衝 液（pH7. 5)を: 1添加した。 以上の反応液を調製し、 37°Cで 17時間反応後、 5 / lを 15%ポリアクリルアミドゲル 電気泳動に供し、ェチジゥムブロマイドによる染色を行い切断産物を確認した。さら に、当該ゲノレを Total Lab ver. 1. 11 (Nonlinear Dynamics社製)による画像 解析によって、約 21ヌクレオチドの dsRNA分解物の定量を行なった。
その結果、 hDi— ASIの場合においても、 CspB添加による dsRNAの分解量の向上 が確認できた。特に 9. 2ng/ z lの前後で分解量が向上することが確認できた。
[0081] すなわち、 CspBは、 RNaselllドメインを含む天然型、あるいは変異型のヒト由来 Di cerのレ、ずれにぉレ、てもその dsRNA分解活性を促進することが確認できた。
[0082] 実施例 5
本発明のヒト由来 hDiRを用いて調製した siRNAの RNA干渉の効果について検討 した。対照として、市販の Dicer (GTS社)を用いた。 dsRNA分解産物の調製は、基 本的に上記実施例 2—（1)記載の方法で行った。すなわち、実施例 1_ (2)記載の hD iR並びに市販の Dicerを 10単位用いて、 dsRNAlO μ g分を、 37°C、 18時間で切断 した。これらの切断産物を RNA Purification Column 1、 2 (Gene Therapy Systems社製）を用いて精製し、これらを以下の RNA干渉の評価に使用した。
[0083] すなわち、 siRNA導入を行なう 24時間前に 293細胞を、 10%FBSおよび l%peni cillin/streptomycinを含む D—MEM培地（SIGMA社製）で適当量（cell数： 5 X 104) 24wellプレートにまき、ー晚 COインキュベーター内で培養した。約 80%コンフ
2
レントになった状態で 50 /i lの無血清培地に 3 μ 1の TransIT 293 Transfection Reagent (タカラバイオ社製）をカ卩え、激しく撹拌した。室温で 5分間放置し、 0. 3 / g の pQBI25 (和光純薬社製）を加えて、穏やかに混和し、 5分間室温で放置した。そこ に 4 μ 1の TransIT— TKO試薬を加えて穏やかに混和し、室温で 5分間放置した。そ こに上記 siRNAを 500ng加えて穏やかに混和し、 5分間室温で放置し、これを DNA /siRNA溶液とした。 Well中の 10%FBSを含む D—MEM培地を 250 μ 1になるよう に添加したものに、 DNA/siRNA溶液を滴下し、 Well内の溶液が均一になるように 穏やかに混和を行なった。またコントロールとして、 0. の pQBI25 (和光純薬社 製）のみを添加したもの、また滅菌水のみを加えたものも同時に行なった。その後 CO
-ター内で 24時間培養した。この細胞を FACS Vantage (ベタトン 'デ イツキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ベクター（DNA)のみを導入し たものに対する DNA/siRNA溶液を導入した場合の GFP発現の阻害効果を測定 した。その結果を表 1に示す。
[0084] [表 1]
導入サンプル 平均蛍光強度 コ ン ト ロ ール （無添加） 8 . 0 9 コ ン ト ロ ーノレ （ベク ターのみ） 1 3 3 1 . 4 4 h D i R 1 4 . 9 2 巿販 D i c e r 7 1 . 5 7
[0085] 表 1に示したように、コントロール (ベクターのみ）と比較してその平均蛍光値が小さ いほど RNA干渉が起こっている。従って、 hDiRによって得られる siRNAは、巿販 Di cerと同様に RNA干渉効果を示し、巿販 Dicerのものよりも強レ、 RNA干渉効果を示 すことが確認できた。
以上のことから、本発明の hDiRが RNA干渉ための siRNA調製に有用であること が確認、できた。
[0086] 実施例 6
本発明の hDiRを用レ、て調製した siRNAの RNA干渉の効果にっレ、て、 siRNAの 添加量を換えて検討した。対照として、市販の Dicer (Gene Therapy Systems社 製）を用いた。 dsRNAの切断については、基本的に上記実施例 2_ (1)記載の方法 で行った。すなわち、実施例 1一（2)記載の hDiR並びに市販の Dicerを 10 μ ΐ用いて 、 dsRNA10 x g分を、 37°C、 18時間で切断した。なおこの際には、実施例 3— (2)で 使用した CspBを最終濃度 9. 2ng/ x lになるように添カ卩し、反応させた。
これらの切断産物を RNA Purification Column 1、 2 (Gene Therapy Sys tems社製）を用いて精製し、これらを以下の RNA干渉の評価に使用した。
[0087] すなわち、 siRNA導入を行なう 24時間前に 293細胞を、 10%FBSおよび l%peni cillin/streptomycinを含む D—MEM培地（SIGMA社製）で適当量（cell数：1. 5 X 105)を 24wellプレートにまき、ー晚 COインキュベーター内で培養した。この培養
2
細胞が約 95%コンフレントになった時点で、 49 μ 1の無血清培地に 1 μ 1の Genejuic e Transfection Reagent (タカラバイオ社製）を加え、激しく撹拌した。室温で 5分 間放置し、 0. 3 /i gの pQBI25 (和光純薬社製）をカ卩えて、穏やかに混和し、 5分間室 温で放置した。
同時に、別チューブに 47 μ 1の無血清培地に 3 /i lの Ribojuice Transfection R eagent (タカラバイオ社製）を加えたものを用意し、激しく撹拌した。室温で 5分間放 置し、上記 siRNA 166. 7ng、 55. 6ng、 18. 5ngを加えて穏やかに混和し、 5分間 室温で放置した。
このように調製した 2種類の溶液を， Well中の 10。/。FBSを含む D—MEM培地を 2 50 μ ΐになるように添加したものに滴下し、 Well内の溶液が均一になるように穏やか に混和を行なった。またコントロールとして、ベクター（DNA)のみを添加したもの、ま た滅菌水のみをカ卩えたものも同時に行なった。その後 COインキュベーター内で 24
2
時間培養した。この細胞を F ACS Vantage (ベタトン'ディッキンソン社製）を用いた フローサイトメトリーに供し、ベクター（DNA)のみを導入したものに対する DNA/si RNA溶液を導入した場合の rsGFP発現の阻害効果を測定した。その結果を表 2に 示す。
[0088] [表 2]
導入サンプル 平均蛍光強度 （相対値） コン ト口ール （無添加） 0
コン ト口ール 〔ベク ターのみ） 1 0 0
h D i R 1 6 6 . 7 n g 1 8 . 2 1
h D i R 5 5 . D n g 1 8 . 9 7
h D i R 1 8 . 5 n g 3 2 . 6 7
市販 D i c e r 1 6 6 . 7 n g 1 7 . 7 4
市販 D i c e r 5 5 . 6 n g 1 9 . 8 0
市販 D i c e r 1 8 . 5 n g 3 2 . 3 4
[0089] 表 2に示したように、コントロール (ベクターのみ）と比較して平均蛍光強度の値が小 さいほど RNA干渉が起こっている。従って、 hDiRによって得られる siRNAは、巿販 Dicerと同様に RNA干渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明の hDiRが RNA干渉のための siRNA調製に有用であるこ とが確認できた。
[0090] 上記細胞サンプルについて total RNAを抽出し real time RT— PCRに供し rs GFPの mRNAを定量する事で、 RNA干渉の評価を行った。 [0091] すなわち、 siRNA導入後 COインキュベーターで 37°C、 24時間培養した細胞から
2
trizole(Invitrogen社製）を使用してトータル RNAを抽出、精製した。なおこの際の 作業は、添付のプロトコルに従って行った。そのトータノレ RNAを 80ng、 5XM—ML V buffer (タカラバイオ社製） 4 μ 1、 10mM dNTP (タカラバイオ社製） 1 μ 1、 rand om hexamer 100pmol、 RNase Inhibitor (タカラバイオ社製） 20U、 M—MLV Reverse Transcriptase 100U、を加え、滅菌水で全量を 20 μ 1とした。前記反 応液を TaKaRa PCR Thermal Cycler SP (タカラバイオ社製）にセットし、 42 °C 10分、 95°C 2分の反応を行った。この反応液に 20 μΐの反応希釈液（IX M_ MLV buffer, 0. 5mM dNTP mixture)を加え、これを 10 μ 1ずつに分注した。 前述の反応物 10 μΐに、 10XR-PCR buffer (タカラバイオ社製） 2. 5μ1、 250m M Mg2+ 0. 3μ\ lOmM dNTP 0. 75 μ 1、 TaKaRa Ex Taq R— PCR (タ カラバイオ社製） 1. 25U、滅菌水で 3000倍希釈した SYBR Green (タカラバイオ 社製） 2. 5/il、 100% DMSO 1. 25 μ 1を加え、 — actin (タカラバイオ社製）、 G APDH (タカラバイオ社製）、 rsGFP (rsGFP_F:配列番号 20、 rsGFP-R:配列番 号 21)、 Neo(Neo_F:配列番号 22、 Neo— R:配列番号 23)を検出するための合成 プライマーを 5pmolずつ加え、滅菌水で全量を 25 /ilとした。前記反応液を Smart Cycler II Unit (タカラバイオ社製）にセットし、 95°C、 10秒で熱変性を行った後、 95°C 5秒、 60°C 20秒を 1サイクルとする 45サイクルの反応を行なった。得られた データを解析することで，ヒト由来の i3_actin、 GAPDH、および導入プラスミド由来 の rsGFP、 Neoの mRNA量を定量した。その結果を表 3に示す。
[0092] [表 3]
導入サンプル r s G F P mR NA量 （相対値
)
コン ト口ール （無添加）
コン トローノレ （ベクターのみ） 0 0
h D i 1 6 6. 7 n g 5. 9 2
h D i 5 5. 6 n g 2 2 7 2
h D i 1 8 . 5 n g 3 0 6 1
市販 D i c e r 1 6 6. 7 n g 1 4
市販 D i c e r 5 5. 6 n g 3 0 9 1
市販 D i c e r 1 8 . 5 n g 3 5 8 4 [0093] 表 3に示したように、コントロール（ベクターのみ）と比較して rsGFPの mRNA量が 小さいほど RNA干渉が起こっている。従って、 hDiRは、巿販 Dicerと同様に RNA干 渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明の hDiRは、 RNA干渉のための siRNA調製に有用である ことが確認できた。
[0094] 実施例 7
上記実施例 1_ (2)、実施例 4一（2)で調製したサンプルについてその dsRNA分解 活性の基質となる dsRNAをルシフヱラーゼ遺伝子より作製し評価した。実施例 2_ (1 )と同様に dsRNAは、 TurboScript T7 Transcription kit (GTS社製）を用レヽ て、その添付プロトコルに従って合成した。
[0095] すなわち、プラスミド pGL3_Basicベクター（プロメガ社製）に揷入されているルシフ エラーゼをコードする遺伝子について、プラスミド pGL3_Basicベクター（プロメガ社 製）を铸型とし、配列表の配列番号 24記載の T7プロモーター配列をもった dsl— 1プ ライマーと配列表の配列番号 25記載の dsl— 2プライマーを用いて PCR (増幅断片長 約 500塩基対）を行レ、、増幅産物を得た。次に得られた 2本鎖 DNAを铸型として、 T 7 RNAポリメラーゼによる RNA合成反応により約 500bpの長さの dsRNAを調製し
[0096] 本発明の hDiR、 hDi— ASIを用いて調製した siRNAの RNA干渉の効果について 検討した。対照として、市販の Dicer (Gene Therapy Systems社製）を用いた。 d sRNAの切断については、基本的に上記実施例 2- (1)記載の方法で行った。すな わち、実施例 1一（2)記載の hDiR、実施例 4一（2)記載の hDi— ASI並びに市販の Di cerを ΙΟ μ Ι用いて、上記の dsRNAlO μ g分を、 37°C、 18時間で切断した。なおこ の際には、実施例 3—（2)で使用した CspBを最終濃度 9. 2ngZ x lになるように添カロ し、反応させた。
これらの切断産物を RNA Purification Column 1、 2 (Gene Therapy Sys tems社製）を用いて精製し、これらを以下の RNA干渉の評価に使用した。
[0097] すなわち、 siRNA導入を行なう 24時間前に 293細胞を、 10%FBSおよび l%peni cillinZstreptomvcinを含む D—MEM培地（SIGMA社製）で適当量（cell数：1. 5 X 105) 24wellプレートにまき、ー晚 COインキュベーター内で培養した。この培養細
2
胞が約 95%コンフレントになった時点で、 49 μ 1の無血清培地に 1 μ 1の Genejuice Transfection Reagent (タカラバイオ社製）を加え、激しく撹拌した。室温で 5分間 放置し、 0. 5 μ gの pGL3_controlと 0. 1 μ gの pRL— TK (Promega社製）を加えて 、穏やかに混和し、 5分間室温で放置した。
同時に、別チューブに 47 μ 1の無血清培地に 3 μ 1の Ribojuice Transfection R eagent (タカラバイオ社製）を加えたものを用意し、激しく撹拌した。室温で 5分間放 置し、上記 siRNAを 166. 7ng、 55. 6ng、 18. 5ngをカロ免て穏、や力、に 禾口し、 5分 間室温で放置した。
このように調製した 2種類の溶液を、 Well中の 10。/。FBSを含む D—MEM培地を 2 50 μ ΐになるように添加したものに滴下し、 Well内の溶液が均一になるように穏やか に混和を行なった。またコントロールとして、ベクター（DNA)のみを添加したもの、ま た滅菌水のみを加えたものも同時に行なった。その後 COインキュベーター内で 24
2
時間培養した。この細胞を Dual Lucif erase Reporter assay kit (Promega社 製）を用いたアツセィに供することで、ベクター（DNA)のみを導入したものに対する、 siRNAを添加した場合の GL3タンパク質発現の阻害効果を測定した。その結果を表 4に示す。
[0098] [表 4]
導入 s i R N Aサンプル G L 3発現量：相対値 コントロール （無添加） 〇
コント口一ノレ ベクターのみ） 1 0 0
h D i R 1 6 6 . 7 n g 2 5 . 7 0
h D i R 5 5 - 6 n g 3 8 . 9 0
h D i R 1 8 - 5 n g 7 4 . 5 1
h D i — A S I 1 6 6 . 7 n g 2 5 . 8 7
h D i — A S I 5 5 . 6 n g 2 5 . 〇 〇
h D i - A S I 1 8 . 5 n g 3 1 . 0 9
巿販 D i c e r 1 6 6 . 7 n g 2 5 . 1 1
市販 D i c e r 5 5 . 6 n g 3 〇 . 1 5
巿販 D i c e r 1 8 . 5 n g 5 5 . 4 1
[0099] 表 4では、コントロール（ベクターのみ）と比較してその GL3発現量の値が小さレ、ほ ど RNA干渉が起こっていると考えられる。従って、 hDiR、 hDi— ASIによって得られ る siRNAは、巿販 Dicerと同様に RNA干渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明の hDiR、 hDi— ASIが RNA干渉のための siRNA調製に有 用であることが確認できた。
[0100] 実施例 8
本発明の hDiR、 hDi— ASIを用レ、、 CspBを添加して調製した siRNAと無添加で調 製した siRNAについて、その RNA干渉の効果について検討した。なお実際の操作 は実施例 7記載のルシフェラーゼを用いた方法に習った。対照として、市販の Dicer ( Gene Therapy Systems社製）を用いた。 dsRNAの切断については、基本的に 上記実施例 2 -（1)記載の方法で行った。すなわち、実施例 1 - (2)記載の方法で調 整した hDiR、実施例 4_ (2)記載の方法で調整した hDi— ASI並びに市販の Dicerを ΙΟμΙ用いて、上記の dsRNA10 xg分を、 37°C、 18時間で切断した。なおこの際に は、実施例 3—（2)で使用した CspBを最終濃度 9.2η§/μ1になるように添加した場 合と添加しなレ、場合とで反応させた。
これらの切断産物を RNA Purification Column 1、 2 (Gene Therapy Sys tems社製）を用いて精製し、これらを以下の RNA干渉の評価に使用した。
[0101] [表 5]
導入 R GL 3発現量：相対値 コントロール （無添加）
コント口ール .クタ一のみ） 00
h D i R 55. 6 n g +C s p B . 66
h D i R 55. 6 n g 6. 40
h D i— A S I 5 5. 6 n g + C s p B 4 3 1
h D i - A S I 5 5. 6 n g 3 1 9
巿販 D i c e r 5 5. 6 n g + C s p B 0 40
市販 D i c e r 5 5. 6 n g 2 0 7
[0102] 表 5では、コントロール（ベクターのみ）と比較してその GL3発現量の値が小さレ、ほ ど RNA干渉が起こっていると考えられる。従って、 CspBの添加、無添加サンプルの 間に、 RNA干渉効果の差はないことを示した。
以上のこと力も RNA干渉のための siRNA調製の際に、本発明の CspBが siRNA に対し、質的な影響を与えないことが確認できた。
[0103] 実施例 9 酵素の安定性
実施例 4_ (2)で精製した PAZドメイン + RNaseIIIドメインタンパク質（hDi— ASI) に CspBを終濃度で 92ng/ μ 1になるように加えたものを保存緩衝液 I (50mMトリス —塩酸緩衝液（pH8. 5)、 250mM 塩化ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 0. 1 mM DTT、 0. 1% TritonX-100, 50% グリセロール）中で保存し、一定期間ご とに以下のようにして、その dsRNA分解活性を測定した。実施例 2—（1)で調製した d sRNA 1 μ g、上記 4_ (2)で調製したタンパク質サンプノレ 1 μ 1、 5 X反応緩衝液（ lOOmM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 5)、 750mM 塩化ナトリウム、 12. 5mM 塩 化マグネシウム） 2 μ 1、これに nuclease free水を加えて、全量を 10 μ 1としたものを 反応液とした。 37°Cで 18時間反応後、 5 を 15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動、 ェチジゥムブロマイドによる染色に供して切断産物の確認を行なった。その結果、 6ケ 月以上の保存サンプルにおいて約 21塩基対の分解産物が確認され、 dsRNA分解 活性が確認された。一方、同緩衝液条件においては、 RNaselllドメインタンパク質（ hDiR)に CspBを加えたものについて、活性が 3ヶ月以上保持された。
[0104] 実施例 10 pColdl4 - TmCspBの作製、組み換え体の培養、及び精製
(l) pColdl4_TmCspBの作製
以下の Thermotoga maritima由来の CspB (以降、 TmCspBとする）のクロー二 ングに際しては、プロテイン サイエンス（Protein Science)、第 8卷、 394— 403頁 (1999)記載の配列（アミノ酸配列を配列番号 9、塩基配列を配列番号 10に示す。） を参照した。
まず、配列表の配列番号 26及び 27記載の塩基配列を有する合成プライマー E及 び Fを DNA合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー Eは、制限酵 素 Ndelの認識配列を塩基番号 11一 16に、さらに TmCspBのアミノ酸配歹 1J (配列番 号 26)のアミノ酸番号 1一 7に相当する塩基配列を塩基番号 14一 34にもつ合成 DN Aである。また、合成プライマー Fは、制限酵素 BamHIの認識配列を塩基番号 11一 16に、 TmCspBのアミノ酸配列（配列番号 26)のアミノ酸番号 61— 66に相当する塩 基配列を塩基番号 20 37にもつ合成 DNAである。 [0105] 上記合成プライマーを用いて、 PCRを行った。 PCRの反応条件を以下に示す。 すなわち、実施例 3_ (1)の铸型 DNAl i 50ng)、 5 /i lの lO X Ex Taq buffer (タカラバイオ社製）、 5 /i lの dNTP混合液 (タカラバイオ社製）、 lOpmolの合成ブラ イマ一 E、 lOpmolの合成プライマー F、 0. 5Uの Takara Ex Taq (タカラバイオ社 製）を加え、滅菌水を加えて全量を 50 μ ΐとした。前記反応液を TaKaRa PCR Th ermal Cycler SP (タカラバイオ社製）にセットし、 94°C1分、 55。C1分、 72°C1分 を 1サイクルとする 30サイクルの反応を行なった。
反応終了後、該反応液 5 を 3. 0%ァガロースゲル電気泳動に供し、 目的の約 22 Obpの DNAフラグメントを確認した。残りの PCR反応液を電気泳動し、そのフラグメン トを回収、精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収 DNAを 5 μ 1 の滅菌水に懸濁し、制限酵素 Ndel (タカラバイオ社製)及び制限酵素 BamHI (タカ ラバイオ社製）で 2重消化し、 3. 0%ァガロース電気泳動によりその NdeI_BamHI消 化物を抽出精製し、 Ndeト BamHI消化 DNA断片を得た。
[0106] 次に国際公開第 99/27117号パンフレットの実施例 1一 6記載の方法に従レ、、 pC old04NC2ベクターを調製した（以下、この pCold04NC2ベクターを pColdl4ベタ ターと称する)。
[0107] 次に上記 pColdl4ベクターを、上記 DNA断片を調製した時に用いたのと同じ制限 酵素で切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記 Ndeト BamHI消化 DN A断片と混合し、 DNAライゲーシヨンキット (タカラバイオ社製）を用いて連結した。そ の後、ライゲーシヨン反応液 20 μ ΐを用いて大腸菌 JM109を形質転換し、その形質 転換体を 1 · 5% (w/v)濃度の寒天を含む LB培地（アンピシリン 50 μ g/ml含む） 上で生育させた。
目的の DNA断片が揷入されたプラスミドは、シークェンシングすることにより確認し た。
[0108] (2) CspBの 5リットルジャーでの培養、及び精製
上記実施例 10—（1)で調製した pColdl4— TmCspBを用いて、大腸菌 BL21を形 質転換し、その形質転換体を 1. 5% (wZv)濃度の寒天を含む LB培地（アンピシリ ン 50 μ g/ml含む）上で生育させた。生育したコロニーを 30mlの LB液体培地（bact o-tryptone 0. 3g、 bacto— yeast extract 0. 15g、 NaCl 0. 15g、アンピシリ ン 1. 5mg)に植菌し、 37°Cでー晚培養した。この培養液 30ml分を 3リットノレの LB液 体培地 (bacto— tryptone 30g、 bacto— yeast extract 15g、 NaCl 15g、ゾン ピシリン 150mg)を含む 5リットルジャーフアーメンター（エイブル社製）に植菌後、 15 0rpm、 Air=0. 5リットル Zmin、 37°Cの条件で対数増殖期まで培養し、その後、 1 5°Cに冷却した。冷却後に IPTGを終濃度 1. OmMになるように添カ卩し、 150rpm、 A ir=0. 5リットル/ min、 15°Cの条件で 24時間培養して発現誘導させた。その後菌 体を遠心分離により集め、 l lgの湿菌体を得た。湿菌体 l lgを 44mlの bufferA[20 mM トリス一塩酸緩衝液 (pH8. 0) ]に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し 、遠心分離（10, 000 X g 20分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。この上清 の抽出液をさらに超遠心分離（70， 000 X g 20分）により上清の抽出液と沈殿とに 分離した。
[0109] 上記上清の抽出液、約 53mlを水浴上で熱処理（70°C、 10分）を行い、遠心分離（ 10, 000 X g 20分）により上清と沈殿とに分離した。この熱処理上清に終濃度 200 mMとなるように NaClを添加し、さらに buff erB [20mM トリス一塩酸緩衝液（ρΗ8· 0)、 200mM 塩化ナトリウム]で平衡化した AnionExchanger DE52 10mリット ルを添カ卩し、 4°Cで一晩緩やかに攪拌した。遠心分離（3, 000 X g 20分）により上 清と沈殿とに分離し、上清をさらにガラスフィルターで濾過を行った。この濾液 45ml にっき、 3リットルの bufferA[20mM トリス-塩酸緩衝液（pH 8. 0) ]に対して透析を 行なった。
[0110] φ 20mmのカラムに充填した樹脂容積にして 100ml分の Q_SepharoseF. F. (ァ マシャム 'バイオサイエンス社製）に透析後の液 50mlを添加し、 400mlの bufferA[2 OmM トリス一塩酸緩衝液（pH8. 0) ]で洗浄を行った。この非吸着画分を回収し、 U F30, 000カット Centriprep YM—30 (MILLIPORE社製）を通過させた。この U F通過液 260mlを φ 30mmのカラムに充填した 40mlの Heparin Sepharose CL —6B (アマシャム'バイオサイエンス社製）に添加し、 160mlの bufferA[20mM トリ ス—塩酸緩衝液（pH8. 0) ]で洗浄を行なった。その後、 200mlの bufferA[20mM トリス—塩酸緩衝液（ρΗ8. 0) ]の 0— 1M塩化ナトリウムグラジェントで目的タンパク 質の溶出を行なった。トリシン一 SDSポリアクリルアミド電気泳動にて分子量約 7, 500 の目的タンパク質が確認された画分を回収し、 3リットルの bufferA[20mM トリス- 塩酸緩衝液（ρΗ8· 0) ]に対して透析を行なった。この透析後の液 65mlを UF3, 00 0カット Centriprep YM—3 (MILLIPORE社製）を用いて約 144倍まで濃縮を 行レ、、約 450 のタンパク質サンプルを得た。このタンパク質サンプルに等量のグリ セロールを添加し、 50%グリセロール溶液（WZW) 850 μ ΐを得た。その一部につい てトリシン一 SDSポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、分子量約 7， 500の位置 に目的タンパク質の単一な染色バンドが確認された。
(3) CspBタンパク質による切断活性の上昇について。
次に実施例実施例 1一（2)、実施例 4一（2)で調製したタンパク質サンプルについて 、核酸結合活性を有するタンパク質 (CspB)の影響を検討した。なおこの際には、実 施例 10— (2)で調製した TmCspBを用いた。
すなわち、実施例 1一 (2)、実施例 4一 (2)で調製したタンパク質サンプノレ (hDi— R酵 素液）、またはタンパク質サンプル (hDi— ASI酵素液） 1 μ 1、実施例 10—（2)で調製 した CspB溶液（92ng/ μ 1)を 1 /i 1、実施例 2—（1)で調製した基質となる dsRNA 1 g、 5 X反応緩衝液（lOOmM トリス—塩酸緩衝液（ρΗ8· 5)、 750mM 塩化ナト リウム、 12. 5mM 塩化マグネシウム） 2 /i 1、これに nuclease free水を加えて、全 量を 10 μ ΐとしたものを反応液とした。 CspBタンパク質の濃度は終濃度で 9. 2ng/ /i lになる。また、この際のコントロールとして市販の Dicerについても同様に行なった 。市販の Dicer (GTS社製）の場合は、酵素液 2 μ 1、 CspB溶液 1 n 1、基質となる d sRNA l /i g、 10mM ATP溶液 1 /i 1、 50mM 塩ィ匕マグネシウム溶液 0. 5 μ 1 、付属の反応緩衝液 4 1、これに nuclease free水を加えて、容量を 10 μ 1とした ものを反応液とした。さらに、 TmCspBの代わりに 1 μ 1の nuclease free水を加えた ものをネガティブコントロールとした。
以上の反応液を調製し、 37°Cで 18時間反応後、 5 を 15%ポリアクリルアミド電 気泳動に供し、ェチジゥムブロマイドによる染色を行い切断産物を確認した。当該ゲ ノレを Total Lab ver. 1. 11 (Nonlinear Dynamics社製）による画像解析によつ て、約 21ヌクレオチドの dsRNA分解物の定量を行なった。 その結果、実施例 10 -（2)で発現、精製された TmCspBは、実施例 3 -（1 )で発現 、精製された TmCspBと同様に、 dsRNAの分解量の向上が確認された。
[0112] 実施例 1 1 hDi— ASIの 30リットルジャーでの培養、及び精製
( 1 )発現、精製
上記実施例 4一（1 )で調製した pCold08 hDi— ASIを用いて、大腸菌 BL21を形 質転換し、その形質転換体を 1. 5% (wZv)濃度の寒天を含む LB培地（アンピシリ ン 50 μ g/ml含む）上で生育させた。生育したコロニーを 200mlの TB液体培地（ba cto— tryptone 2. 4g、 bacto— yeast extract 4. 8g、 glycerol 0. 8mi、 1 / m M KH P〇、 72mM K HP〇 、アンピシリン l Omg)に植菌し、 37。Cでー晚培養
2 4 2 4
した。この培養液 200ml分を 20リットルの TB液体培地（bacto—tryptone 240g、 b acto-yeast extract 480g、 glycerol 80ml, 17mM KH PO、 72mM K H
2 4 2
PO、アンピシリン l g)を含む 30リットルジャーフアーメンター（丸菱バイオェンジ社製
4
)に植菌後、 100rpm、 Air= 6リットル/ min、 37°Cの条件で対数増殖期まで培養し 、その後、 15°Cに冷却した。冷却後に IPTGを終濃度 1. OmMになるように添加し、 1 00rpm、八 = 6リットル/11^1、 15°Cの条件で 24時間培養して発現誘導させた。そ の後菌体を遠心分離により集め、 26gの湿菌体を得た。湿菌体の一部 12gを 48mlの 細胞破砕溶液 [50mM トリス一塩酸緩衝液（pH8. 5)、 100mM 塩化ナトリウム、 1 mM 塩化マグネシウム、プロテアーゼインヒビター（Complete、 EDTA— free、ベー リンガーマンハイム社製) ]に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離 ( 12, OOOrpm 30分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。
上記上清の抽出液 約 56mlを用いてさらにニッケルカラムによる精製を以下のよう に行なった。
[0113] すなわち、樹脂容積にして 16ml分の Ni— NTA agarose (キアゲン社製）に細胞 破砕溶液を 50ml添加し、混和後、 1， 500rpmで数分間遠心し、上清を廃棄する操 作を 2回繰り返して、約 8mlの樹脂を回収した。菌体破砕液より調製した約 56mlの上 清を添加し、 4°Cで約 1時間、ロータリーシエイカーで穏やかに混和した。その後、こ の目的タンパク質の吸着した樹脂を φ 20mmのカラムに充填し、 40mlの細胞破砕 溶液 [50mM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 5)、 100mM 塩化ナトリウム、 ImM 塩 化マグネシウム、プロテアーゼインヒビター（Complete, EDTA— free、ベーリンガー マンハイム社製）]で洗浄した。次に 40mlの bufferA[20mM トリス一塩酸緩衝液（p H8. 5)、 lOOmM 塩化ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 10% グリセロール、 20mM イミダゾール]で樹脂を洗浄後、 40mlの bufferB [20mM トリス—塩酸緩衝 液（pH8. 5)、800mM 塩化ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 10% グリセ口 ール、 20mM イミダゾール]、続いて 40mlの buff erAで洗浄を行い目的以外の不 要タンパク質の除去を行った。
洗浄後、 24mlの bufferC[20mM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 5)、 100mM 塩化 ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 10% グリセロール、 lOOmM イミダゾール] で溶出操作を行った。次に、 300mlの buff erD [20mM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 5)、 100mM 塩化ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 10% グリセロール]に対 して透析を行なった。
透析後の酵素溶液を φ 10mmのカラムに充填した lmlの Heparin Sepharose
CL—6B (アマシャムバイオサイエンス社製）に添加し、 5mlの buffer D [20mM トリ ス一塩酸緩衝液（ρΗ8· 5)、 lOOmM 塩化ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 10 % グリセロール]で洗浄を行なった。次に、 5mlの buffer E[20mM トリス一塩酸 緩衝液（ρΗ8· 5)、 200mM 塩化ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 10% ダリ セロール]、その後、 5mlの buffer F[20mM トリス—塩酸緩衝液（ρΗ8· 5)、 400 mM 塩化ナトリウム、 ImM 塩化マグネシウム、 10% グリセロール]、 5mlの buffe r G[20mM トリス一塩酸緩衝液（ρΗ8· 5)、800mM 塩化ナトリウム、 ImM 塩化 マグネシウム、 10% グリセロール]でタンパク質の溶出を行なった。その後、各溶出 サンプルについて Centricon YM—10 (アミコン社製）を用いて約 20倍まで濃縮を 行ない、約 250 のタンパク質サンプルを得た。その一部について 10%SDSポリア クリルアミド電気泳動に供したところ、分子量約 144, 000の位置に目的タンパク質の バンドが確認され、これを以下の活性の確認に使用した。以上の過程で発現、精製 されたものを、実施例 4_(2)で大腸菌 BL21_CodonPlus_RIL strain (ストラタジ ーン社製）を宿主として発現、精製したものと比較すると ΙΟΟπ 培養液あたりの活性 で約 2倍程度の収量を得ることができた。 [0115] (2) dsRNA分解活性の測定
上記実施例 11一（ 1 )で調製したタンパク質サンプルにつレ、て、実施例 2— ( 1 )で調 製した dsRNA l i g、上記 11一（1)で調製したタンパク質サンプノレ l /i l、 5 X反応 緩衝液（lOOmM トリス—塩酸緩衝液（pH8. 5)、 750mM 塩化ナトリウム、 12. 5m M 塩化マグネシウム） 2 μ 1、これに nuclease free水を加えて、全量を 10 μ 1とした ものを反応液とした。 37°Cで 18時間反応後、 5 を 15%ポリアクリルアミドゲル電気 泳動、ェチジゥムブロマイドによる染色に供して切断産物の確認を行なった。その結 果、約 21塩基対の分解産物が確認され、 dsRNA分解活性が確認された。
[0116] (3) CspBタンパク質による切断活性の上昇について
次に実施例 11一（1)で調製したタンパク質サンプルについて、核酸結合活性を有 するタンパク質 (CspB)の影響を検討した。
すなわち、実施例 10_ (3)と同様にして、実施例 11- (1)で調製したタンパク質サン プノレ (酵素液） 1 1、実施例 10—（2)で調製した CspB溶液 1 μ 1、実施例 2—（ 1 )で 調製した基質となる dsRNA 1 μ g、 5 X反応緩衝液 ( lOOmM トリス一塩酸緩衝液（ pH8. 5) , 750mM 塩ィ匕ナトリウム、 12. 5mM 塩ィ匕マグネヽシゥム） 2 1、これに11 uclease free水を加えて、全量を 10 /i 1としたものを反応液とした。 CspBタンパク質 の濃度は終濃度で 9· 2η§/ μ 1になるように添加した。また、この際のコントロールと して市販の Dicerについても同様に行なった。市販の Dicer (GTS社製）の場合は、 酵素液 2 μ 1、 CspB溶液 1 /i 1、基質となる dsRNA 1 /i g、 10mM ATP溶液 1 μ l、 50mM 塩化マグネシウム溶液 0· 5 /i l、付属の反応緩衝液 4 μ 1、これに nucl ease free水を加えて、容量を 10 /i 1としたものを反応液とした。なお、この際には Cs pBの代わりに nuclease free水を加えたものをコントローノレとした。
[0117] 以上の反応液を調製し、 37°Cで 18時間反応後、 5 μ 1を 15%ポリアクリルアミド電 気泳動に供し、ェチジゥムブロマイドによる染色を行い切断産物を確認した。さらに、 当該ゲルを Total Lab ver. 1. 11 (Nonlinear iDvnamics千土 による幽像解个/ τ によって、約 21ヌクレオチドの dsRNA分解物、並びに未切断 dsRNAの解析を行な つた。
その結果、本発明の ΡΑΖ + RNaseIIIドメインを含む変異体タンパク質（hDi— ASI) を用いた場合において、 CspB添加による dsRNAの分解量の向上が確認でき、さら には、未切断の基質がほとんど存在せず、ほぼ全てが分解されていることが確認され た。一方、市販の Dicerの場合は、 dsRNA分解の上昇が確認されるものの、半分程 度の未切断の基質が存在していることが確認された。
すなわち、本発明のタンパク質を用いた場合、 CspB添カ卩により基質を完全に分解 することが可能であることが明らかとなった。
[0118] 実施例 12 hDi— ASIによる切断産物の RNAi効果
実施例 1 1_ ( 1 )のタンパク質を用レ、て調製した siRNAの RNA干渉の効果にっレヽ て検討した。対照として、市販の Dicer (GTS社)を用いた。 dsRNA分解産物の調製 は、基本的に上記実施例 1 1一（3)記載の方法で行った。なお hDi— ASIの場合には 、実施例 10—（2)で調製した CspBを終濃度で 9. 2ng/ z lになるように添加した。す なわち、実施例 1 1— ( 1 )記載の酵素に CspBを添加したもの、並びに市販の Dicerを 用いて、実施例 2—（1 )で調製した dsRNA10 / g分を、 37°C、 18時間で切断した。 これらの切断産物を Microcon— 100、 Micropure-EZ (共にタカラバイオ社製）を用 いて精製し、これらを以下の RNA干渉の評価に使用した。
[0119] すなわち、 siRNA導入を行なう 24時間前に 293細胞を、 10% FBSおよび 1 % p enicillin/streptomycinを含む D—MEM培地（SIGMA社製）で適当量（cell数： 1. 5 X 105)を 24well穴プレートにまき、ー晚 COインキュベーター内で培養した。こ
2
の培養細胞が約 95%コンフレントになった時点で、 49 μ 1の無血清培地に 1 μ 1の Ge nejuice Transfection Reagent (タカラバイオ社製）を加え、激しく撹拌した。室 温で 5分間放置し、 0. 3 μ gの pQBI25 (タカラバイオ社製）を加えて、穏やかに混和 し、 5分間室温で放置した。
同時に、別チューブに 47 μ 1の無血清培地に 3 μ 1の Ribojuice Transfection R eagent (タカラバイオ社製）を加えたものを用意し、激しく撹拌した。室温で 5分間放 置し、上記 siRNAを 55. 6ngをカ卩えて穏やかに混和し、 5分間室温で放置した。
[0120] このように調製した 2種類の溶液を、 Well中の 10%FBSを含む D—MEM培地を 2 50 μ ΐになるように添加したものに滴下し、 Well内の溶液が均一になるように穏やか に混和を行なった。またコントロールとして、ベクター（DNA)のみを添加したもの、ま た滅菌水のみを加えたものも同時に行なった。その後 COインキュベーター内で 24
2
時間培養した。この細胞を F ACS Vantage (ベタトン'ディッキンソン社製）を用いた フローサイトメトリーに供し、ベクター（DNA)のみを導入したものに対する DNA/si RNA溶液を導入した場合の rsGFP発現の阻害効果を測定した。その結果を表 6に 示す。
[0121] [表 6]
導入サンプル 平均蛍光強度 コ ン ト ロ ール （無添加） 3 . 5 2 コ ン ト ロ ーノレ （ベク ターのみ） 1 1 2 0 . 0 8 h D i - A S I 十 C s p B 9 3 . 0 9 巿販 D i c e r 2 7 8 . 5 9
[0122] 表 6に示したように、コントロール (ベクターのみ）と比較してその平均蛍光値が小さ レ、ほど RNA干渉が起こっている。従って、 hDi-ASI + CspBによって得られる siRN Aは、巿販 Dicerと同様に RNAi効果を示し、 RNAiに有効であることが示された。さ らに、効率よく siRNAを生産することができ、同量の siRNAを使用した場合、市販の 酵素より高い RNAi効果が得られることを確認した。
以上のことから、本発明の方法で調製したタンパク質カ；！^！八干渉ための siRNA調 製に有用であることが確認できた。
産業上の利用可能性
[0123] 本発明により特定の長さの dsRNAを生成する dsRNA分解活性を有するタンパク 質が提供される。また、本発明の方法により RNA干渉等において有用な、特定の長 さの dsRNAへの分解促進方法及び/又は RNA合成促進方法が提供される。さら に本発明の特定の長さの dsRNAへの分解促進方法及び/又は RNA合成促進方 法を簡便に実施することができる組成物ならびにキットが提供される。
配列表フリーテキスト
[0124] SEQ ID N〇：3; A gene encoding human dicer mutant
SEQ ID NO:4; An amino acid sequence of human dicer mutant
SEQ ID N〇：5; Synthetic primer 1 to amplify a gene encoding human dicer mutant
SEQ ID N〇：6; Synthetic primer 2 to amplify a gene encoding human dicer mutant
Figure imgf000045_0001
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Claims

請求の範囲
[I] dsRNA分解活性を有するタンパク質であって、 dsRNAに作用して特定の長さの d sRNAを生成する活性を有することを特徴とする dsRNA分解活性を有するタンパク 質。
[2] dsRNA分解活性を有するタンパク質が、 Dicerの機能ドメインを有することを特徴と する請求項 1記載のタンパク質。
[3] Dicerの機能ドメイン力 RNaseIIIa、 bならびに dsRNA結合ドメインからなることを 特徴とする請求項 2記載のタンパク質。
[4] さらに PAZドメインを含むことを特徴とする請求項 3記載のタンパク質。
[5] 特定の長さの dsRNA力 約 15— 30塩基対の dsRNAであることを特徴とする請求 項 1記載のタンパク質。
[6] dsRNA分解活性を有するタンパク質力 配列表の配列番号 4又は 17記載のァミノ 酸配列、あるいは配列表の配列番号 3又は 16記載の塩基配列でコードされるァミノ 酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする請求項 1記載のタンパク質。
[7] dsRNA分解活性を有するタンパク質力 配列表の配列番号 4又は 17記載のァミノ 酸配列において、一ないしは複数個のアミノ酸が置換、欠失、揷入あるいは付加され たアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする請求項 1記載のタンパク質。
[8] 請求項 1記載の dsRNA分解活性を有するタンパク質を製造する方法であって、コ ドンを宿主での発現に適したものに変換するカ あるいはレアコドンに対する補強が なされた宿主を使用することを特徴とする dsRNA分解活性を有するタンパク質の製 造方法。
[9] 請求項 1記載の dsRNA分解活性を有するタンパク質の製造方法であって、当該タ ンパク質を低温誘導性ベクターを用いて発現させることを特徴とする dsRNA分解活 性を有するタンパク質の製造方法。
[10] 請求項 1記載の dsRNA分解活性を有するタンパク質を含有するキット。
[II] 核酸結合活性を有するタンパク質の存在下で dsRNAに dsRNA分解活性を有す るタンパク質を作用させ、特定の長さの dsRNAを生成することを特徴とする dsRNA の分解方法。
[12] 核酸結合活性を有するタンパク質と dsRNA分解活性を有するタンパク質が融合タ ンパク質であることを特徴とする請求項 11記載の方法。
[13] 核酸結合活性を有するタンパク質が、 RNA結合活性を有するタンパク質であること を特徴とする請求項 11記載の方法。
[14] RNA結合活性を有するタンパク質がコールド ショック プロテインであることを特 徴とする請求項 13記載の方法。
[15] コールド ショック プロテイン力 好熱性菌あるいは耐熱性菌由来であることを特徴 とする請求項 14記載の方法。
[16] コールド ショック プロテインがサーモトガ マリティマ由来のコールド ショック プ 口ティン Bであることを特徴とする請求項 15記載の方法。
[17] 特定の長さの dsRNA力 約 15 30塩基対の dsRNAであることを特徴とする請求 項 11記載の方法。
[18] dsRNA分解活性を有するタンパク質力 S、請求項 1一 7のいずれ力 1項に記載のタン パク質であることを特徴とする請求項 11記載の方法。
[19] dsRNA分解活性を有するタンパク質力 S、天然型 Dicerあるいはその機能的同等物 であることを特徴とする請求項 11記載の方法。
[20] 核酸結合活性を有するタンパク質の存在下で RNA合成活性を有するタンパク質を 用いて RNA合成反応を行うことを特徴とする RNAの合成方法。
[21] 核酸結合活性を有するタンパク質と RNA合成活性を有するタンパク質との融合タ ンパク質を用いることを特徴とする請求項 20記載の方法。
[22] 核酸結合活性を有するタンパク質が、コールド ショック プロテインであることを特 徴とする請求項 20記載の方法。
[23] コールド ショック プロテイン力 好熱性菌あるいは耐熱性菌由来であることを特徴 とする請求項 22記載の方法。
[24] コールド ショック プロテイン力 サーモトガ マリティマ由来のコールド ショック プロテイン Bであることを特徴とする請求項 23記載の方法。
[25] RNA合成活性を有するタンパク質が、 DNA依存性 RNAポリメラーゼであることを 特徴とする請求項 20記載の方法。
[26] 請求項 11記載の方法に用いるための組成物であって、核酸結合活性を有するタン パク質並びに dsRNA分解活性を有するタンパク質を含有することを特徴とする組成 物。
[27] 請求項 11記載の方法に用いるためのキットであって、核酸結合活性を有するタン パク質と dsRNA分解活性を有するタンパク質を含有することを特徴とするキット。
[28] 請求項 20記載の方法に用いるための組成物であって、核酸結合活性を有するタン パク質と RNA合成活性を有するタンパク質を含有することを特徴とする組成物。
[29] 請求項 20記載の方法に用いるためのキットであって、核酸結合活性を有するタン パク質と RNA合成活性を有するタンパク質を含有することを特徴とするキット。
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