TW200521237A - Methods of degrading dsRNA and synthesizing RNA - Google Patents

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200521237 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種將具有生成特定長度dsRNA的活性之 具有dsRNA分解活性的蛋白質，與具有核酸結合活性之蛋 白質（例如具有RNA結合活性之蛋白質）組合，以有效分解 dsRNA的方法；以及一種將具有核酸結合活性的蛋白質與 具有RNA合成活性的蛋白質組合以有效合成RNA之方法。 【先前技術】 _ 最近，出現有利用低分子dsRNA之基因工程學的手法之 報告。 例如，RNA 干涉（RNAi:RNA interference)係根據 dsRNA 之 序列特異地分解mRNA，其結果為抑制基因表現之現象。對 於dsRNA基因沈默的了解係始自於使用線蟲之反義研究。 1995年，Guo與Kemphues進行以反義RNA抑制稱為par-Ι之 基因之實驗。當加入反義RNA，則會如預想一樣發生抑制 par-1之表現，但令人吃驚的是作為對照而使用之顯義RNA · 亦同樣抑制par-1之表現，顯示出par-1變異株之表現形。（例 如，非專利文獻1) 該矛盾於1998年由Fire等人得以闡明。其等分別使用RNA 聚合酶合成反義RNA與顯義RNA時，僅非特異性地形成逆 向之RNA。而確知藉由其污染所產生之dsRNA為基因沈默 之本體，反義RNA以及顯義RNA不能抑制基因之表現，但 是，使反義RNA與顯義RNA黏合而成之dsRNA則可有效抑 制基因之表現。（例如，非專利文獻2) 95345.doc 200521237 在上述RNA干涉中，稱為Dicer的酶會以dsRNA生成小分 子的 RNA(siRNA:short interfering RNA，小干涉 RNA)。（例如，非 專利文獻3) 一般認為將藉由該酶之作用而生成之siRNA，加入稱為 RISC (RNA induced silencing complex，RNA誘導沈默複合物）之複 合體中，則該複合體可識別、分解標靶mRNA。但是，目前 的狀況是，對於被視為與RNA干涉相關之各因子的正確功 能，仍有較多之未知部分。（例如，非專利文獻4) φ 為有效進行上述RNA干涉，其重要的是有效生成dsRNA 以及siRNA。上述Dicer舉例而言可以是來自人之Dicer(例 如，非專利文獻5)，另外亦可係購自基因治療系統公司或 stratagene公司之重組Dicer(例如，非專利文獻6)。 但是，關於上述重組Dicer是否充分地發揮出其原有之酵 素學上的性能，則尚未受到詳細地研究。又，關於含有上 述Dicer之至少何種結構域，才能保持作用於dsRNA生成較 合適的dsRNA(siRNA)之活性，進而能提高其基因工程學上 修 的生產性之情形，則尚未明確。 再者，目前的狀況係對於有效生成dsRNA之方法，亦尚 無特別有效的方法。 再者，亦有報告係將使用RNA聚合酶合成之約21核苷酸 鏈長之dsRNA，以其原樣直接作為siRNA來利用之方法（例 如，非專利文獻7)。因此，若存在有效形成RNA之方法則 亦可利用於上述方法中。 [非專利文獻1] Guo S·及其他研究者1名Cell 1995年vol· 81， 95345.doc 200521237 p611-620 [非專利文獻2] Fire A.及其他研究者5名Nature 1998年vol. 39，ρ806-811 [非專利文獻3] Bernstein Ε·及其他研究者3名Nature 2001年 vol. 409, p363-366 [非專利文獻4] Tabara Η·及其他研究者3名Cell 2002年vol. 109，p861-871 [非專利文獻5 ] Zhang Η·及其他研究者4名The EMBO Journal 2002 年 vol· 21，No· 21，p5875-5885 [非專利文獻 6] Myers J. W·及其他 3 名 Nature biotechnology 2003 年 vol.21，p324-328 [非專利文獻7] Donze 0·及其他研究者1名Nucleic Acids Research 2002 年 vol· 30, No. 10, e46 [發明所欲解決之問題] 本發明之課題係提供一種具有dsRNA分解活性之蛋白 質，其具有生成特定長度的dsRNA之活性；並提供一種有 效生成特定長度之dsRNA的方法，其中該特定長度之 dsRNA的方法可用於RNA干涉等之中；以及促進RNA合成 之方法。 【發明内容】 本案發明人等為解決上述課題，進行潛心研究之結果 為，分析出Dicer之功能結構域，而發現具有作用於長鏈 dsRNA以生成特定長度dsRNA的活性之具有dsRNA分解活 性之蛋白質。又，發現於其與具有核酸結合活性之蛋白質 95345.doc 200521237 (例如具有RNA結合活性之蛋白質）的共存下，可藉由使具有 dsRNA分解活性之蛋白質作用於dsRNA，而有效調製出具 有特定長度之dsRNA，進而亦可提高具有該核酸結合活性 之蛋白質於以dsRNA合成為代表之RNA合成反應中之效 率，從而完成本發明。 即，本發明之第1發明係一種具有dsRNA分解活性之蛋白 質，且係關於一種特徵在於具有作用於dsRNA以生成特定 長度dsRNA的活性之具有dsRNA分解活性之蛋白質。 φ 於本發明之第1發明中，具有dsRNA分解活性之蛋白質以 具有Dicer之功能結構域為較佳，例如，以包含有 RNasellla、b以及dsRNA結合結構域者為較佳。再者，亦可 含有PAZ結構域。又，可藉由使用本發明之第1發明之蛋白 質，生成特定長度的dsRNA，其係約15〜30鹼基對之 dsRNA。又，本發明之第1發明的蛋白質係具有dsRNA分解 活性之蛋白質，舉例而言係包含序列表之序列號4或17所記 載之胺基酸序列或經序列表之序列號3或16所記載之鹼基.籲 序列所編碼的胺基酸序列之蛋白質。或，亦可為包含於序 列表之序列號4或17所記載之胺基酸序列中之經取代、缺 失、插入或附加一至複數個胺基酸之胺基酸序列的蛋白 質。又，本發明的第1發明之具有dsRNA分解活性的蛋白 質，可藉由變換密碼子而成為適合於宿主中表現者，或藉 由使用稀有密碼子經增強之宿主，而有效地製造。 又，可使用低溫誘導性載體表現該蛋白質。進而本發明 之第1發明之蛋白質可作為組份而包含於套組之中。 95345.doc -9- 200521237 本t明之第2發明係關於一種dsRNA之分解方法，其特徵 在於··於具有核酸結合活性之蛋白質存在下，使具有 分解活性之蛋白質作用於dsRNA，生成特定長度之献财。 於本發明之第2發明中，具有核酸結合活性之蛋白質及具 有dsRNA分解活性之蛋白質可為融合蛋白質。又，具有核 酸結合活性之蛋白質可為具有RNA結合活性之蛋白質。具 有該魏結合活性之蛋自質可為冷休克蛋自，其來源可為 來自嗜熱性gS耐熱性g。對於該嗜熱性菌或耐熱性菌並 無特別限制，舉例而言其可為例如如來自棲熱孢菌屬之冷 休克蛋白B。 根據本發明之第2發明的方法，可生成特定長度之 dsRNA，其係約15〜30鹼基對的dsRNA。進而，於本發明之 第2發明中，具有dsRNA分解活性之蛋白質可為本發明之第 1發明之蛋白質，亦可為天然型Dicer*具有其功能同效物。 本發明之第3發明係關於一種RNA之合成方法，其特徵在 於：於具有核酸結合活性之蛋白質的存在下，使用具有RNA 合成活性之蛋白質進行RNA合成反應。 於本發明之第3發明中，具有核酸結合活性之蛋白質及具 有RNA合成活性之蛋白質可為融合蛋白質。又，具有該核 酸結合活性之蛋白質可為冷休克蛋白，其來源可為來自嗜 熱性菌或耐熱性菌。並無特別限制，例如可示例來自棲熱 孢菌屬之冷休克蛋白B。再者，具有RNA合成活性之蛋白質 可為對DNA具有依存性之RNA聚合酶。 本發明之第4發明係關於一種用於本發明之第2發明方法 95345.doc -10- 200521237 中之組合物，其特徵在於：包含有具有核酸結合活性的蛋 白質以及具有dsRNA分解活性的蛋白質。 本發明之第5發明係關於一種用於本發明之第2發明方法 中之套組，其特徵在於：包含有具有核酸結合活性之蛋白 質及具有dsRNA分解活性之蛋白質。 本發明之第6發明係關於一種用於本發明之第3發明方法 中之組合物，其特徵在於··包含有具有核酸結合活性之蛋 白質及具有RNA合成活性之蛋白質。 本發明之第7發明係關於一種用於本發明之第3發明方法 中之套組，其特徵在於：包含有具有核酸結合活性之蛋白 質以及具有RNA合成活性之蛋白質。 [發明效果] 藉由本發明，提供一種dsRNA分解活性的蛋白質，其係 具有可調製出特定長度dsRNA之具有dsRNA分解活性的蛋 白質。進而藉由本發明，可有效生成可利用於RNA干涉等 中之具有特定長度的dsRNA。 【實施方式】 本說明書中之Dicer係指具有一種功能的蛋白質，該功能 係於RNAi之初期階段可將長鏈的dsRNA處理為siRNA。對 於天然型的Dicer，並無特別限制，舉例而言其可為例如在 N末端側包含ATP結合結構域、RNA解螺旋酶結構域、功能 未知之PAZ結構域、RNasellla與b結構域以及dsRNA結合結 構域者。 本說明書中，Dicer*之功能結構域係指一部位，該部位編 95345.doc -11 - 200521237 碼與可作用於長鏈dsRNA以生成特定長度之dsRNA的活性 相關之區域。 對於上述之功能結構域，並無特別限制，舉例而言其可 為例如包含有RNasellla、b結構域以及dsRNA結合結構域 者。該RNasellla、b結構域可以係如Zhang H·及其他4名在 2002 年之 The EMBO Journal vol· 21，No. 21，p5875_5885 中所揭示之 部位，其可特異地作用於雙鏈RNA，並編碼與生成於5’末端 具有鱗酸基之特定鍵長的券核*ί酸的活性相關之區域。進 而，dsRNA結合結構域亦可為編碼特異地結合於雙鏈RNA 的活性之部位。 本說明書中之dsRNA係指形成雙鏈構造之RNA，該雙鏈 構造之RNA係成為RNA干涉對象之mRNA與具有與該 mRNA之鹼基序列互補之RNA。 又，本說明書中之dsRNA分解反應生成物之應用例，主 要有以下所示之siRNA。 對於本說明書中之特定長度的dsRNA並無特別限制，其 例如係指約10〜1〇〇鹼基對之範圍中之特定長度的dsRNA。 進而，亦可為約15〜30鹼基對之範圍中之特定長度之 dsRNA，特別是20〜25鹼基對之範圍中之特定長度。該等 dsRNA可作為siRNA來使用。 本說明書中具有核酸結合活性之蛋白質，係指具有結合 於單鏈或雙鏈之DNA、RNA活性之蛋白質。至於該蛋白質 以是具有解除核酸之二次構造的功能者為較佳，舉例而言 其可為例如DNA螺旋酶、RNA螺旋酶或其功能性同等物。 本說明書中之低溫誘導性載體係指具有於低溫下可發揮 95345.doc -12- 200521237 功此之啟動子之載體’舉例而言其可為例如國際公開第 99/27117號手冊中所揭示之？)(：〇1€1系載體。 本說明書中之冷休克蛋白係指一種蛋白質的總稱，其係 於溫度低於原本繁殖條件之低溫狀況下，可藉由溫度降低 而受到刺激表現者。 本祝明書中所謂之完全分解作為基質之長鏈dsRNA，係 才曰分解至分解反應後以電泳法無法確認出呈未切斷之基質 長鏈dsRNA的程度。 本就明書中之PAZ結構域係存在MDicer2RNA解螺旋酶 結構域與RNasellla以及b結構域之間的結構域。例如，序列 表之序列唬1所圮載之來自人的Dicer胺基酸序列之胺基酸 唬898〜1064(序列號2之鹼基號2692〜3 192)之區域。 本發明中之稀有密碼子係使用頻率較低之密碼子。1個胺 基酸由複數個密碼子決定，❻已發現，根據生物種類的不 同σ亥等複數個密碼子之間在使用頻率上存在有偏差。已 知，對應於使用頻率低之密碼子的轉運RNA(tRNA)之量一 般而言較少，故含有稀有密碼子之鹼基序列所編碼之胺基 酸在表現時之表現效率低下。因此，使對應於稀有密碼子 之tRNA的量等增大’對稀有密碼子進行增強，可藉以製造 效率較好之蛋白質。 以下，詳細說明本發明。 (1)本發明之具有dsRNA分解活性之蛋白質、該蛋白質之 製造方法以及含有該蛋白質之套組 本發明之具有dsRNA分解活性之蛋白質，可作用於 95345.doc -13 - 200521237 dsRNA而生成特定長度的dsRNA。至於具有該dsRNA分解活 性之蛋白吳，若為以長鏈之dsRNA所生成之具有特定長度 的dsRNA者’則無特別限制，舉例而言可以是具有Dicer2 功能結構域之蛋白質。其可為該Dicer之功能結構域包含 RNasellla、b以及dsRNA結合結構域的蛋白質。又，若為自 長鏈之dsRNA可生成特定長度之dsRNA者，則不管其蛋白 質之來源。 對於该RNasellla、b結構域以及dsRNA結合結構域並無特 別限制，例如來自人之Dicer之情形下，可列舉出具有序列 表之序列號1所圯載之胺基酸序列之N末端側的胺基酸 1271〜1924(序列表之序列號2所記載之鹼基序列號 3811〜5 772)者。例如，可示例包含序列表之序列號4所記載 之胺基酸序列者或包含經序列表之序列號3所記載之鹼基 序列所編碼之胺基酸序列的蛋白質（Dicer變異體），或包含 序列表之序列號12所記載之胺基酸序列者或經序列表之序 列唬13所記載之鹼基序列所編碼之胺基酸序列的蛋白質 (Dicer變異體）。 又，Dicer係尺寸較大之蛋白質，不適於製造重組體。然 而，本發明之具有dsRNA分解活性之蛋白質的尺寸比天然 酶小且緊密，故可用於製造重組體。一般而言，以大腸桿 菌等之細菌細胞製造來自A類等高等生物t酶作為重組體 之It形時，想要保持住同等之酶活性來製造重組體會伴隨 •有較多困難的發生。因此，本發明之具有心囊分解活性 之蛋白質，對於以其來源生物之外的細胞製造，非常有用。 95345.doc •14- 200521237 另外’對於本發明之蛋白質中可含有PAZ結構域，並無 特別限制，舉例而言其可以是具有序列表之序列號1所記載 之胺基酸序列的胺基酸號898M924(序列表之序列號2所記 載之驗基號2692〜5772)之蛋白質，包含序列表之序列號17 所記載之胺基酸序列者，或包含經序列表之序列號丨6所記 載之驗基序列所編碼之胺基酸序列之蛋白質（Dicer變異體） 或包含序列表之序列號1 8所記載之胺基酸序列者，或編碼 序列表之序列號19所記載之鹼基序列的胺基酸序列之蛋白 質（Dicer變異體）。 再者，藉由變異體可使其成為進一步之酶穩定者。對其 並無特別限制，例如與僅有RNaseIII結構域之變異體蛋白質 相比，有PAZ結構域+RNaseIII結構域之變異體結構域的穩 定性可獲提高。在施予更多凍結、熔融之情形下亦可保持 活性，又於某種保存緩衝液中呈溶液狀態則可保持更長時 間的活性。 對於本發明之蛋白質並無特別限制，其例如可為分解長 鍵dsRNA而生成對RNA干涉有效的siRNA。 又，具有上述功能之範圍但於上述胺基酸序列或鹼基序 列中經取代、缺失、插入或附加一至複數個胺基酸或鹼基 者，亦包含於本發明之具有dsRNA*解活性的蛋白質中。 對於本發明之具有dsRNA分解活性之蛋白質並無特別的 限制，但其可進一步附加有來自表現載體之序列，例如， 表現或翻譯增強序列（例如，Perfect DB序列等）、表現蛋白 鵞純化用之標簽序列（例如，His tag序列等）或用以除去表 95345.doc -15- 200521237 現蛋白質之N末端側之附加序列的序列（例如，Factor Xa序 列等）等之胺基酸序列者，亦包含於本發明之具有dsRNA分 解活性之蛋白質中。至於上述蛋白質，並無特別限制，舉 例而言其可為例如具有序列表之序列號12或18所記載之胺 基酸序列且具有dsRNA分解活性之蛋白質。 本發明之具有dsRNA分解活性之蛋白質可使長鏈之 dsRNA成為特定長度之dsRNA。即，可藉由選擇本發明中 所用之具有dsRNA分解活性的蛋白質，調製出所期望之特 定長度的dsRNA。對於該特定長度之dsRNA並無特別限 制，舉例而言其可為特定長度係在例如約10〜100鹼基對之 範圍内的dsRNA，以約15〜30鹼基對之範圍為較佳，以約 20〜25鹼基對之範圍中為特佳。 又，相對於作為基質使用之dsRNA，相對於習知之市售 酶不能完全分解之情形，本發明之具有dsRNA分解活性之 蛋白質，卻可實質性地完全切斷作為基質之長鏈dsRNA。 因此，由於可完全切斷基質之dsRNA，且其分解產物之RNA 干涉作用是同等的，故可按比例減少作為基質之長鏈 dsRNA，進而可省略將未分解之dsRNA除去之步驟。 另外，對於本發明之具有dsRNA分解活性的蛋白質並無 特別限制，例如Dicer變異體可藉由在pH值8.5以上之Tris鹽 酸緩衝液中及氣化鎂的存在下保存，從而於4°C保存以及-20°C 保存之任一情形下均可長時間穩定地保持其活性。 本發明之具有dsRNA分解活性之蛋白質係下述（2)中所記 載之具有核酸結合活性的蛋白質，對其並無特別的限制， 95345.doc -16- 200521237 例如可為與具有RNA結合活性的蛋白質形成融合蛋白質之 形態。對於該融合蛋白質並無特別限制，舉例而言可以是 例如上述DiCer變異體與具有核酸結合活性之 疋 其㈡貝、例如 /、有RNA結合活性之蛋白質之融合蛋白質。 作為用以製造本發明之具有dsRNA分解活性的蛋白質之 方法’包含將密碼子變換為適合於宿主中表現者，或對於 稀有密碼子加以增強之方法。對於該等方法並無特別限 制，例如亦可為包含表現基因之密碼子改變之製造方法， 可使用將該蛋白質之胺基酸序列的—部分或全部變換為使 蛋白質表現至最佳之密碼子的狀態者，或基於其狀態之宿 主而表現。對於上述最佳之密碼子狀態或基於其狀態之宿 主，並無特別限制，舉例而言可以係例如一種以基因工程 予處理後的宿主，該宿主可將識別特定密碼子之汛NA量提 兩為平常該細胞中所產生之量的數倍以上之。至於該宿 主，例如可以係大腸桿菌，舉例而言，其可為例如：補充 精氨酸之密碼子（AGA、AGG)之tRNA的大腸桿菌’進而補 充異亮胺酸（AUA)、脯胺酸（CCC)、亮胺酸（CUA)itRNA的 大腸桿菌等。 再者，亦可藉由改變密碼子，提高宿主中之目的蛋白質 的之表現之方法，此時mRNA之二級構造亦可列入考量。 即，對於藉由將表現基因之密碼子變換、增強等而使蛋 白貝表現提高之方法，則並無特別限制。 對於用以製造本發明之具有dsRNA分解活性之蛋白質載 體，亚無特別限制，可使用市售之載體、表現系之任一種。 95345.doc -17- 200521237 例如可使用ρΕΤ系統（Novagen公司製造）而無特別限制。再 者，以使用含有低溫下可發揮功能之啟動子之載體為妥 適，舉例而言其可為例如國際公開第99/27117號手冊中所 記載之pCold系載體。 本發明製造方法之一態樣，係例如以含有低溫下可發揮 功能之啟動子之載體（例如國際公開案第99/2711 7號手冊中 所§己載之pCold糸載體）製造上述Dicer變異體之方法。 即’只要是可使該蛋白質保持可生成獲得特定長度之 dsRNA之功能並將其表現出來之載體，無論何者皆可適用 於本發明之製造方法中。 又，只要是能獲得最終可保持住可生成該特定長度 dsRNA之功能的蛋白質，則呈包涵體形態但可藉由之後的 再摺疊操作恢復該功能而於蛋白質表現時使其表現出來之 載體，亦包含在本發明中。 本發明方法之一態樣’例如於製造上述Dicer變異體之情 形時的生產量，與表現先前之來自人之Dicer全長之情形者 相比較，係被提高的，進而亦可提高該蛋白質之活性保持 體的取得率。 本發明之具有dsRNA分解活性之蛋白質的製造方法中， 亦包含以下之方法：以與下述（2)中所記載之具有核酸結合 活性之蛋白質（並無特別限制，例如係具有RNA結合活性之 蛋白質）的融合蛋白質形態來表現之方法。 (2)促進本發明之具有核酸結合活性的蛋白質2dsRNA分 解的方法以及使用該蛋白質以促進RNA合成之方法 95345.doc -18- 200521237 以生成本發明之特定長度之dsRNA為特徵之dsRNA分解 促進方法，其特徵在於係在具有核酸結合活性之蛋白質的 存在下進行。就該核酸結合蛋白質而言，只要是結果會促 進dsRNA分解活性者，則無特別限制，例如以使用具有上 述RNA結合活性之蛋白質等為妥適。 對於具有該RNA結合活性之蛋白質，並無特別限制，舉 例而言可以是冷休克蛋白（Csp:c〇ld sh〇ck pr〇tein)。以使用 可於常溫環境下發揮功能之冷休克蛋白為妥適，以是來自 嗜熱性菌或耐熱性菌之冷休克蛋白為為更佳。對於CspB蛋 白貝並無特別限制，例如以使用來自具有序列表之序列號9 所記載之胺基酸序列（以序列表之序列號1〇所記載之鹼基 序列編碼之胺基酸序列）之棲熱孢菌屬（Therm〇t〇ga maritima)的CspB蛋白質為妥適。該來自棲熱孢菌屬之cspB 蛋白貝例如可自德國贊姆魯克來自西庫落魯噶尼斯門與切 魯庫魯茨棱（卜、<7千工口才小力、二只/ y々/卜Vk v ) GmbH購入（DSM3109)棲熱孢菌 屬MSB8株，根據蛋白質科學（Pr〇tein Science)，第8卷， 394 403頁（1999)所3己載之方法以基因工程製造重組體。再 者’以使用含有於低溫下可發揮功能之啟動子的載體為妥 適’舉例而言其可為例如國際公開案第99/27117號公告所 舌己載之pCold系載體。

可藉由將該CspB蛋白質與具有dsRNA分解活性之蛋白質 組合，促進該dsRNA分解活性。進而，本發明之方法對於 生成上述（1)所記載之具有特定長度的dsRNA之具有dsRNA 95345.doc -19- 200521237 分解活性的蛋白質（例如Dicer變異體、天然型Dicer或市售 重組Dicer般之功能同效物之任一種），均可促進其生成該特 定長度的dsRNA之活性。 本發明之方法中，可藉由將具有核酸結合活性之蛋白質 與具有dsRNA分解活性之蛋白質組合在一起，而促進該 dsRNA分解活性，所獲得之分解產物與未組合之具有核酸 結合活性的蛋白質時之分解產物相比，其RNA干涉作用中 每單位重量係具有同等的活性。因此，將具有核酸結合活 @ 性之蛋白質使用於RNA干涉中是非常有用的。 又，習知進行之方法中用作為基質之dsRNA未完全分 解，相對而言，本發明之方法則可實質性地將作為基質之 長鏈dsRNA完全切斷。因此，若可完全切斷基質之dsRNA， 且其分解產物之RNA干涉作用係相同，則可使作為基質之 長鏈dsRNA按比例減少，進而亦可省略除去未分解之 dsRNA之步驟。 再者，本發明之方法中，具有該核酸結合活性之蛋白質 _ (例如具有RNA合成活性之蛋白質）可為與具有dsRNA分解 活性的蛋白質呈融合蛋白質的形態者。 另一方面，本發明之RNA合成促進方法，其特徵在於係 在具有核酸結合活性之蛋白質的存在下進行。就該核酸結 合蛋白質而言，只要結果是會促進具有RNA合成活性的蛋 白質之RNA合成活性者，則無特別限制，以使用具有核酸 結合活性之蛋白質、冷休克蛋白（Csp:cold shock protein)為 妥適。對於該冷休克蛋白並無特別限制，已使用來自嗜熱 95345.doc -20- 200521237 性菌或耐熱性菌者為妥適。對於該冷休克蛋白並無特別限 制，其可以係例如來自棲熱孢菌屬（Thermotoga maritima) 的CspB蛋白質，該棲熱孢菌屬具有序列表之序列號9所記載 的胺基酸序列（序列表之序列號10所記載之鹼基序列）。 可藉由使該CspB蛋白質共存於RNA合成系中，而促進例 如RNA聚合酶之RNA合成活性。該蛋白質於生成物為單鏈 或雙鏈RNA之任一種的情形時，均可促進其合成活性。 再者，本發明之RNA合成之促進方法不僅限於長鏈 dsRNA，其亦可利用於短鏈dsRNA(例如siRNA)之合成中。 對於該siRNA合成言，並無特別限制，可使用T7 RNA聚合 酶等，以於合成是約15〜30鹼基對為較佳，以約20〜25鹼基 對者時為特佳。 再者本發明之方法中，因具有核酸結合活性之蛋白質可 促進具有RNA合成活性的蛋白質之dsRNA的合成以及具有 dsRNA分解活性的蛋白質之dsRNA分解的兩個反應，故特 別可利用於RNA干涉中重要dsRNA之合成以及siRNA之生 成系。此時，各蛋白質可為獨立者，亦可為融合蛋白質之 形態。 (3)本發明之方法中所使用之組合物 本發明之組合物係用於有效進行分解出特定長度dsRNA 之反應以及/或RNA合成反應的組合物。 該組合物含有上述（2)所記載之具有核酸結合活性的蛋 白質，對於該具有核酸結合活性的蛋白質並無特別限制， 以冷休克蛋白為妥適，例如以使用來自嗜熱性菌或耐熱性 95345.doc -21 - 200521237 菌之冷休克蛋白（Csp:cold shock protein)為妥適，以是來自 棲熱抱菌屬（Thermotoga maritima)的CspB蛋白質且其中具 有序列表之序列號9所記載之胺基酸序列（以序列表之序列 號10所記載之鹼基序列編碼之胺基酸序列）者為較佳。 本發明之組合物亦可含有具有dsRNA分解活性的蛋白質 以及/或具有RNA合成活性的蛋白質。作為具有可生成特定 長度dsRNA之具有dsRNA分解活性的蛋白質，以是具有

Dicer之功能結構域者為較佳，例如以使用包含RNasenia、 b以及dsRNA結合結構域的蛋白質為較妥適。對於該等蛋白 質並無特別限制，例如可以是上述（1)所記載之Dica變異 體、天然型Dicer或市售之重組Dicer般之功能同效物之任一 種。含該Dicer變異體之組合物可為含有下列者之組合物： 包含序列表之序列號4或17所記載之胺基酸序列者，或包含 以序列表之序列號3或16所記載之鹼基序列編碼之胺基酸 序列的蛋白貝。又，亦可為含有包含一種胺基酸序列的蛋 白質之組合物，該胺基酸序列係於序列表之序列號4或口 所記載之胺基酸序列中經置換、缺失、插人或附加一至複 數個胺基酸者。 上述具有dsRNA分解活性的蛋白質中，可另外附加有來 自表現載體之序列，例如表現或翻譯增強序列（例如， Perfect DB序列等）、表現蛋白質純化用之標簽序列（例如， His tag序列等）、或用以除去表現蛋白質之财端側之附加 序=之序列（例如，Faet()r Xa序列等）等之胺基酸序列的蛋 ’、可對於上述蛋白質，並無特別限制，舉例而言其 95345.doc •12- 200521237 可為例如具有序列表之序列號12或1 8所記載之胺基酸序列 之具有dsRNA分解活性的蛋白質。進而，本發明之組合物 亦可含有用以使上述（1)所記載之Dicer*變異體穩定化之緩 衝液。 再者，就具有RNA合成活性的蛋白質而言，例如以使用 T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶等為妥適。 此外，本發明之組合物之其他態樣，亦可含有上述（2)所 記載之具有核酸結合活性的蛋白質，例如具有RNA結合活 φ 性的蛋白質與具有可生成特定長度dsRNA之dsRNA分解活 性的蛋白質之融合蛋白質，以及/或具有核酸結合活性的蛋 白質與具有RNA結合活性的蛋白質之融合蛋白質。 本發明之組合物可簡便地進行得到特定長度dsRNA之有 效分解以及/或單鏈或雙鏈RNA之合成反應。 又，作為本發明組合物中之一態樣，舉例而言係一種可 利用於其不僅限於長鏈dsRNA也包括短鏈dsRNA(例如 siRNA)之合成中的組合物。該組合物可有效合成約10〜100 鲁 鹼基對之dsRNA，以約15〜30鹼基對為較佳，以20〜25鹼基 對為特佳。 (4)本發明之方法中所使用之套組 本發明之方法中所使用之套組，係一種用於有效進行分 解出具有特定長度的dsRNA之反應以及/或RNA合成反應之 套組。 該套組含有上述（2)所記載之具有核酸結合活性的蛋白 質，對於該具有核酸結合活性的蛋白質並無特別限制，以 95345.doc -23 - 200521237 冷休克蛋白為較適合，例如以使用來自嗜熱性菌或而f熱性 菌之冷休克蛋白（Csp:cold shock protein)為妥適，以使用來 自棲熱抱菌屬（Thermotoga maritima)的CspB蛋白質且其中 具有序列表之序列號9所記載之胺基酸序列之為較妥適。 本發明之套組中亦可含有具有生成特定長度dsRNA活性 之具有dsRNA分解活性的蛋白質以及/或具有RNA合成活性 的蛋白質。就該具有dsRNA分解活性的蛋白質以及/或具有 RNA合成活性的蛋白質而言，以用上述（3)中所列舉者為較 妥適。進而，本發明之套組中亦可含有用於使上述（1)所記 載之Dicer變異體穩定化之緩衝液。 進而，本發明套組之其他態樣，亦可含有上述（2)所記載 之具有核酸結合活性的蛋白質，例如具有RNA結合活性的 蛋白質與具有可生成特定長度dsRNA之dsRNA分解活性的 蛋白質之融合蛋白質，以及/或具有核酸結合活性的蛋白質 與具有RNA結合活性的蛋白質之融合蛋白質。 再者，本發明之套組中，亦可含有上述以外之組份，例 如用於純化反應之結果所生成之特定長度的dsRNA之試 藥、將其導入生物體樣本本内之試藥等。對於該等試藥並 無特別限制，例如亦可含有用於純化約2 1鹼基對的siRNA 之試樂、將其導入生物體樣本本内之試樂等。 使用本發明之套組，從而可簡便地進行可得到特定長度 之dsRNA之有效分解以及/或RNA合成。 又，作為本發明之套組之一態樣，可列舉出不僅限於長 鍵dsRNA，於短鍵dsRNA，例如siRNA之合成中亦可利用之 95345.doc -24- 200521237 套組。該套組於合成約10〜100鹼基對，以為較佳是約l5〜3〇 鹼基對’特別好的是20〜2 5驗基對之cisRNA時有效。 [實施例] 以下列舉實施例以更具體地說明本發明，但本發明並不 僅限定於以下之實施例。 又，本說明書所所記載之操作中，有關質體之調製、限 制酶之消化等的基本操作，係依據2〇〇1年冷泉港實驗室發 行之由T.馬里提斯（T· Maniatis)等所編輯的分子選殖··實驗 至手冊弟 3 版（Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed.)中所記 載之方法。 實施例1來自人之Dicer之RNaselll的結構域之表現 (1)表現載體之製作 為表現序列表之序列號1所記載之來自人的Dicer之胺基 酸序列的N末端側包含胺基酸編號為1271〜i924(鹼基號為 3811〜5772)的多肽，而以下列方式製作表現載體。 首先，用DNA合成機以基因庫登錄號為AB028449之公開籲 的鹼基序列，合成具有序列表之序列號為5以及6所記載之 鹼基序列的合成引子1以及2，並根據一般方法純化。上述 合成引子1係於鹼基號為9〜14中具有限制酶ΚρηΙ之識別序 列且於驗基號16〜36中具有相當於來自人的Dicer之胺基酸 序列（序列號1)的胺基酸號為1271〜1277之鹼基序列的合成 DNA。又，合成引子2係於驗基號為9〜14中具有限制酶 Hindlll之識別序列且於驗基號為18〜3 6中具有相當於來自 人的Dicer之胺基酸序列（序列號1)的胺基酸號為1919〜1924 95345.doc -25· 200521237 之鹼基序列。 使用上述合成引子，進行PCR。PCR之反應條件如下所示。 即，加入模板DNA(人 cDNA基因庫，HumanPancreas，TaKaRa Bio公司製造）2 μΐ、5 μΐ之 lOxLAPCR緩衝液（TaKaRaBio公 司製造）、5 μΐ之dNTP混合液（TaKaRa Bio公司製造）、10 pmol 之合成引子1、1 〇 pmol之合成引子2、0·5 U之Takara LA Taq (TaKaRa Bio公司製造），添加滅菌水使總量成為50 μΐ。將上 述反應液設置於 TaKaRa PCR Thermal Cycler SP (TaKaRa Bio 公司製 造）中，以94°C1分鐘、55°C1分鐘、72°C3分鐘為1週期進行 30週期反應。 反應結束後，將該反應液5 μΐ供於1.0%瓊脂糖凝膠電泳 中。自電泳凝膠回收並純化所確認之目的之約2 kbp的DNA 片斷，進行乙醇沈澱。於5 μΐ之滅菌水中懸浮乙醇沈澱後之 回收DNA，以限制酶Kpnl (TaKaRa Bio公司製造）以及限制酶 Hindlll (TaKaRaBio公司製造）雙重消化，藉由1 ·0%瓊脂糖凝膠 電泳萃取純化其Kpril-Hindlll消化物，獲得Kpril-Hindlll消 化DNA片斷。 繼而，根據國際公開第99/27117號手冊之實施例1〜6所記 載之方法，調製pCold08NC2載體。 繼而以與調製上述Kpnl-Hindlll消化DNA片斷時所使用 之相同的限制酶，切斷上述pCold08載體，調製末端受到脫 磷酸處理者，與上述Kpril-Hindlll消化DNA片斷混合，使用 DNA接合套組（TaKaRaBio公司製造）連結。之後，使用接合 反應液20 μΐ使大腸桿菌JM109轉形，於含1.5% (w/v)濃度的 95345.doc -26- 200521237 瓊脂之LB培養基（含安比西林5〇 eg/mi)上繁殖該轉形體。 以疋序分析確認插有目的DNA片斷之質體，將該重組質 體作為pCold08 hDi-R。該質體以pc〇ld08 hDi-R，來命名與 表示，自平成15年8月11曰（原寄存曰）作為fERm BP-10074 寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中 心（日本國茨城縣築波市東1號街1號1中央第6(郵政編號 3 05-8566))。該pc〇ld08 hDi-R係含有編碼來自人的Dicer胺 基酸序列（序列號1)之胺基酸編號為1271〜1924的胺基酸序 列之驗基序列的質體。以上述質體所表現之蛋白質具有

Perfect DB序列、His tag序列以及Factor Xa序列。該蛋白質 之胺基酸序列係以序列表之序列號12表示，鹼基序列於序 列表中以序列號13表示。 (2)表現、純化以及各種緩衝液條件下之樣本調製 使用上述（1)中調製之pCold08 hDi-R將大腸桿菌bl21轉 形’於含I·5% (w/v)濃度的瓊脂之LB培養基（含安比西林5〇 pg/ml)上繁殖該轉形體。於2.5 mi之LB液體培養基（含安比 西林50 pg/ml)中植菌繁殖之菌落，於37〇c下培養一晚。將 其一部分植菌於100 ml之相同LB培養基中，於37°C下培養 至對數增殖期。上述培養後，在保溫於丨5。〇之培育器内振 盡10分鐘後，以終濃度為i.OmM之方式添加IPTG，以其原 樣直接於15°C下培養24小時，使其表現誘導。之後藉由離 〜分離集中菌體，再懸浮於5 mi的細胞破碎溶液[5〇

Tris —鹽酸緩衝液（pH值7.5)、100 mM氣化鈉、0.5 mM EDTA、1% Triton (氣）χ-100、i mM 二硫代蘇糖醇、2 碰 95345.doc •27- 200521237 苯甲基磺醯氟]中。藉由超音波破碎使菌體破碎，藉由離心 分離（11，000 rpm 20分鐘）分離上清之萃取液與沈澱物。 使用約5 ml上述之上清液的萃取液，進一步以下列方式 用鎳柱進行純化。 即’在樹脂容積為1 ml份之Ni-NTA瓊脂（QIAGEN公司製 造）中添加緩衝液A[20 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH值7.5)、100 氣化鈉、i mM二硫代蘇糖醇、〇 1%氣χ-1〇〇]1()瓜丨混合 後’以1，500 rpm離心數分鐘，拋棄上清，回收約1 ml之樹 脂。添加自菌體破碎液調製之約5 ml之上清液，於4。(：下約 以方疋轉搖盈器平穩地混合1小時。之後，於φ 15 mm之管柱 中填充吸附有該目的蛋白質之樹脂，以5 ml之緩衝液A洗淨 二級。繼而以5 ml之緩衝液B[20 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH值 7.5)、1〇〇111]^氣化鈉、1111]^二硫代蘇糖醇、〇.1%氚}^1〇〇、 40 mM咪唑]洗淨樹脂後，以5 ml之緩衝液C[20 mM參-鹽 酸緩衝液（pH值7.5)、800 mM氯化鈉、1 mM二硫代蘇糖醇、 0.1%氣X-100、40 mM 11米吐]，繼而以5 ml之緩衝液B進行 洗淨，除去目的物以外之不需要的蛋白質。 洗淨後，以3 ml之緩衝液D[20 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH 值7·5)、100 mM氣化鈉、1 mM二硫代蘇糖醇、〇1%氤 X-100、100 mM咪唑]進行溶出操作。繼而，以5〇〇 ml之緩 衝液E[50mMTris-鹽酸緩衝液（pH值8.0)、l〇〇mM氯化鈉、 0.5 mM EDTA、0.1%氣X-100 ' 1 mM二硫代蘇糖醇]進行透 析，之後，使用滅蟻能（Amicon公司製造）濃縮至約1〇倍。 將該純化濃縮後的樣本之一部分供予1〇% SDS聚丙烯醯胺 95345.doc -28- 200521237 凝膠電泳中，確認分子量約為76,800之目的蛋白質之帶。 再者，對於該樣本使用AntiHisHRPConjugate(QIAGEN公司製造） 並根據其隨附說明檢測使用抗His標簽抗體之西方墨點分 析時，發色檢測出目的之蛋白質帶。以下，將該來自人之 Dicer RNaselll結構域蛋白質稱為hDiR。 然後，將上述方法中以緩衝液D溶出後再以緩衝液E(將其 作為蛋白質樣本I)進行透析，設定為蛋白質形狀緩衝液之條 件，亦同樣地對以下組成之缓衝液實施透析。

1 :使用緩衝液F之透析液[50 mM Tds-鹽酸緩衝液（pH值 8·0)、100 mM 氯化鈉、1 mM 氣化鎂、0.1% 氣 X-100、1 mM 二硫代蘇糖醇]—蛋白質樣本II

2 :使用緩衝液G之透析液[50 mM Tiris-鹽酸缓衝液（pH值 8.5)、100 mM 氣化鈉、1 mM 氣化鎂、0.1% 氚 X-100、1 mM 二硫代蘇糖醇]—蛋白質樣本III

3 :使用緩衝液Η之透析液[5 0 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH值 8.8)、100 mM 氣化鈉、1 mM 氯化鎂、0.1% 氚 X-100、1 mM 二硫代蘇糖醇]—蛋白質樣本IV 實施例2 dsRNA分解活性之測定 (1)反應液之調製 關於上述實施例1-(2)中調製之蛋白質樣本I〜IV測定其 Dicer活性。以下列方式進行該活性測定。 首先，活性測定中用作為基質之dsRNA，係使用 TurboScript T7轉錄套組（GTS公司製造），根據其隨附說明 加以合成。 95345.doc -29- 200521237 即，就編碼插入於質體pQBI125(和光純藥公司製造）之紅 位移之螢光蛋白（Red-shift Green Fluorescent Protein，以下 簡稱為GFP)的基因（序列表之序列好11)而言，將插入於質 體pDON_AI(TaKaRaBio公司製造）之pDON-rsGFP作為模板，使 用具有序列表之序列號7所記載的T7啟動子序列之合成引 子3及序列表之序列號8所記載之合成引子4，進行PCR以獲 得增殖產物。繼而將所獲得之雙鏈DNA作為模板，藉由T7 RNA聚合酶之RNA合成反應調製成約700 bp長度之dsRNA。 鲁 於2 μΐ之以上述方法調製之dsRNA 1 pg、以上述（2)調製 之 hDiR 1 μΐ、10 mM ATP溶液 1 μΐ、50 mM氣化鎂溶液 1 μΐ 的5 χ反應緩衝液（分別濃縮成最終透析中所使用之緩衝液 的5倍者）中，加入無核酸水解酵素的水至總量為1 〇 μΐ者以 作為反應液。 又，在市售之Dicer(GTS公司製造）之情形下，於Dicer酶 液2 μ卜作為基質之dsRNA 1 pg、10 mM ATP溶液1 μΐ、50 mM 氣化鎂溶液Ο·5 μΐ、附屬之反應緩衝液4 μΐ中，加入無核酸·暑 水解酵素的水至總量為10 μΐ者以作為反應液。 調製以上之反應液，於37°C下反應17小時後，將5 μΐ供予 1 5%聚丙浠醯胺凝膠電泳、溴化乙錠之染色，進行切斷產 物之確認。自電泳後溴化乙錠染色之凝膠，確認為約2 1核 苷酸之分解產物者具有活性。 (2)活性測定 進行上述（1)中所調製之反應液的活性測定，研究對 RNaselll結構域蛋白質（hDiR)之影響。進而，為研究各緩衝 95345.doc -30- 200521237 液中之穩定性，使用在純化後樣本立刻以4°C以及-20°C條件 下保存5天之樣本。其結果係，特別特別就蛋白質樣本m、 蛋白質樣本IV而言’無論係在4°C下保存以及-20°C下保存之 任一種情形，均可確認係與市售Dicer相·同大小之約21核普 酸的分解產物，故可確認穩定地保持住其活性。 自以上之情形可確定：將來自人之Dicer的RNaselll結構 域蛋白質（hDiR)下保存於pH值8.5以上之Tris_鹽酸緩衝液 中以及氣化鎂存在之條件，可使活性穩定化。 實施例3有益於dsRNA生產以及分解的因子之研究 (1) 為研究有益於dsRNA生產以及分解的因子，就常溫環 境下具有核酸結合活性之蛋白質加以研究。 由於較難獲得上述具有核酸結合活性之蛋白質。因此， 使用來自具有序列表之序列號9所記載之胺基酸序列的棲 熱抱囷屬（Thermotoga maritima)之CspB蛋白質，作為模型 蛋白貝。s亥蛋白質以蛋白質科學（pr〇te & science)第§卷、 394_4〇3頁（1999)所記載之方法調製。 (2) 來自棲熱孢菌屬之cspB之dsRNA分解之效果 如以下之方式測定呈添加有CspB之形態的dsRNA分解活 性。 即’在使用hDi-R作為酶之情形下，於實施例ι_(2)中所調 製之hDiR(酶液）ι μι、上述中所調製之CspB溶液1 μ1、於 實施例2-(1)中用作為基質idsRNA 1吨、1〇 mM ΑΤΡ溶液1 μΐ、50 mM氣化鎂溶液i μ1、5χ反應緩衝液[25〇 Tris-鹽 酸缓衝液（pH值 8·5)、5 00 mM氣化鈉、0.5% TritonX-l〇〇、 95345.doc -31- 200521237 加入容量為1 〇 μΐ之無核酸水解酵素的水 ，在使用市售Dicer之情形下，於隨附資料 5 mM DTT]2 μΐ 中，； 者作為反應液。又， 市售之Dicer，可使用GTS公司、 公司所販售者。 所記載之組成中添加作為基質之dsRNA1呢，於其中加入容量 為10 μΐ之無核酸水解酵素的水者作為反應液。另外，關於

Stratagene公司、Invitr〇gen

調製以上之反應液，於37^下反應18小時後，供予5 Μ 至15%聚丙烯酿胺凝膠電泳中，藉由漠化乙錠進行染色， 確認分解產物。再將該凝膠藉由T〇tal Lab ver.丨· u…⑽此挪 Dynamics a司製造）之影像分析，進行約2丨核苷酸之心rna 分解物之定里。其結果為，無論是在市或是RNasein 結構域蛋白貝（hDiR)之任一情形中，均可確認添加CspB所春 提局之dsRNA分解量係與添加量有關。特別可確認出於9·2 ng/μΐ前後分解量會提高。 即，確知藉由於反應液中添加CsPB，則無論是市售的 Dicer或RNaselll結構域蛋白質中之任一種，均可獲得更多 的dsRNA分解產物。

(3)來自棲熱孢菌屬的CspB之RNA合成之效果 RNA干涉中，基於促進用於合成dsRNA之RNA合成系的 活性亦為重要之觀點，而對來自棲熱孢菌屬的CspB的RNA 95345.doc -32 - 200521237 合成效果近形研究。選擇T7 RNA聚合酶系作為模型系。關 於對RNA合成系之影響以如下之方式進行。即，以呈添加 有CspB之形態的T7 RNA聚合酶之轉錄量為目的。於模板 DNA1 pg(其係具有依一般方法調製之T7啟動子的pET16b (Novagen公司製造）中導入有具有序列表之序列號11所記載 之鹼基序列的rsGFP基因之質體）、10XT7RNA聚合酶用緩衝 液（TaKaRa Bio公司製造）2 μΐ、50 mM DTT 2 μ卜 RNase抑 制劑（TaKaRa Bio公司製造）0·4 μ卜 25 mM ΝΤΡ 2 μ卜 T7 RNA 聚合酶（TaKaRa Bio公司製造）1 μΐ、CspB溶液1 μΐ中，加入 無核酸水解酵素的水，使容量為20 μΐ者以作為反應液，於 37°C下反應4小時。另外，本實施例中CspB蛋白質之濃度以 終濃度為 90 ng/μΐ、180 ng/μΐ、460 ng/μΐ、920 ng/μΐ之方式 添加，添加1 μΐ CspB形狀緩衝液，即10 mM磷酸鉀緩衝液 (pH值7.5)，以作為無添加之對照組。 於反應後之樣本2 μΐ中，添加lOxMOPS緩衝液（200 mM MOPS、50 mM醋酸鈉、lOmMEDTA、10mMEGTA)2p卜甲醛 2 μΐ、脫離子化甲醯胺9 μΐ以及無核酸水解酵素的水3 μΐ， 於70艺保溫1〇分鐘，之後於冰水中培育1分鐘。於其中添加 l〇x沈降緩衝液2 μΐ，於lxMOPS緩衝液中使用含有溴化乙 錠之1.25%瓊脂糖凝膠進行電泳解析。將該凝膠藉由Total Lab ver. 1· 11 (Nonlinear Dynamics公司製造）之影像分析，進行藉由T7 RNA聚合酶所合成之mRNA之定量。其結果為，可確認於任 一濃度中之轉錄產物量均獲提高。特別是，可確認CspB之 添加量為460 ng/μΐ以上之情形時，轉錄產物量為無添加時 95345.doc -33- 200521237 之約2倍以上，且添加920 ng/μΐ時為約3倍。 (4)来自棲熱孢菌屬的CspB之dsRNA合成之效果 接著是關於對於來自棲熱孢菌屬的CspB之dsRNA合成之 影響所進行之研究。本實施例中係利用實施例2-(1)中所調 製之dsRNA合成用模板。關於RNA方面之轉錄，使用市售 之 TurboScript T7 轉錄套組（Genetherapy Systems 公司製 造），根據其隨附說明來進行。另外，此時添加之CspB蛋白 質之濃度係設定成終濃度為90 ng/μΐ、180 ng/μΐ、460 _ ng/μΐ、920 ng/μΐ之方式，添力σ 1 plCspB形狀緩衝液即1 〇 πιΜ 磷酸鉀緩衝液（pH值7.5)作為無添加的對照組。於37°C反應4 小時後添加1 μΐ之DNasel，於37°C下反應15分鐘。將該反應 液之40倍稀釋液1 μΐ供予含有溴化乙錠之1%瓊脂糖凝膠電 泳。將該凝膠以與上述（3)同樣之方法進行藉由Τ7 RNA聚合 酶所合成之dsRNA的定量。其結果為，可確認於任一濃度 之轉錄產物量均獲提高。特別是，可確認出CspB之添加量 為920 ng/μΐ以上之時，轉錄產物量為無添加時之約2倍以 馨 上。 就上述實施例之相同方式，對其他態樣之T7 RNA聚合酶 轉錄系加以研究。即，於實施例2·(1)中調製之dsRNA合成 用模板1 pg、l〇xT7 RNA聚合酶緩衝液（TaKaRa Bio公司製 造）1 μ卜 50 mM DTT 1 μ卜 RNase抑制劑（TaKaRa Bio公司 製造）0·2 μ卜 25 mM ΝΤΡ 1 μΐ、T7 RNA聚合酶（TaKaRa Bio 公司製造）〇·5 μΐ、CspB溶液1 μΐ中，加入容量為10 μΐ之無 核酸水解酵素的水以作為反應液，於37°C下反應4小時。另 95345.doc -34- 200521237 外，此時添加之CspB蛋白質的濃度係設定成終濃度為90 ng/μΐ、1 80 ng/μΐ、460 ng/μΐ、920 ng/μΐ，添力口 1 plCspB形 狀緩衝液即10 mM磷酸鉀緩衝液（pH值7.5)作為無添加之對 照組。於反應後之樣本中添加0.5 0DNaseI(TaKaRaBio公司製 造），於37°C下反應15分鐘。將該反應液之40倍稀釋液1 μΐ 供予至含溴化乙錠之1%瓊脂糖凝膠電泳中。亦對該凝膠進 行dsRNA之定量。其結果為，可確認於任一濃度之轉錄產 物量均獲提高。特別是，可確認CspB之添加量為920 ng/μΐ 以上之時，轉錄產物量為無添加時之約3倍以上。 如上述般，確認出藉由於反應液中添加CspB，可獲得更 多的T7 RNA聚合酶之轉錄產物。該效果亦可於單鏈RNA合 成以及雙鏈RNA合成中之任一情形下得到確認。 實施例4來自人之Dicer之ΡΑΖ+RNaseIII結構域的表現 (1)表現載體之製作 為表現自序列表之序列號1所記載之來自人的Dicer胺基 酸序列之N末端側包含胺基酸679〜1924(鹼基號2035〜5772) 之多肽，以下列方式製作表現載體。 首先，自基因庫登錄No. AB028449中公開之鹼基序列， 以D N A合成機合成含有序列表之序列號14以及1 5所記載之 鹼基序列的合成引子5以及6，依據一般方法純化。上述合 成引子5係於鹼基號9〜14中具有限制酶ΚρηΙ之識別序列，進 而於鹼基號16〜3 6中具有相當於來自人之Dicer之胺基酸序 列（序列號1)的胺基酸號679〜685之鹼基序列之合成DNA。 又，合成引子6係於鹼基號9〜14中具有限制酶Hindlll之識別 95345.doc -35- 200521237 序列，進而於鹼基號18〜35中具有相當於來自人之Dicer之 胺基酸序列（序列號1)的胺基酸號1919〜1924之鹼基序列。 使用上述合成引子’進行PCR ° PCR之反應條件於如下所 示。 gp，加入模板DNA(人cDNA基因庫，HumanPancreas，TaKaRa Bio公司製造）2 μΐ、5 μΐ之 l〇xLA PCR緩衝液（TaKaRa Bio社 製造）、5 μΐ之dNTP混合液（TaKaRa Bio社製造）、10 pmol之 合成引子5、10 pmol之合成引子6、0·5 U之Takara LA Taq (TaKaRa Bio公司製造），並添加滅菌水使總量為50 μΐ。將上 述反應液設置於 TaKaRa PCR Thermal Cycler SP (TaKaRa Bio 公司製 造）中，以94°C 1分鐘、55°C 1分鐘、72°C 3分鐘為1週期進 行3 0週期反應。 反應結束後，將該反應液5 μΐ供予1.0%瓊脂糖凝膠電泳 中。自電泳凝膠回收·純化所確認之約2.7 kbp的目的DNA片 斷，進行乙醇沈澱。將乙醇沈澱後之回收DNA懸浮於5 μΐ 之滅菌水中，以限制酶KpnI(TaKaRa Bio公司製造）以及限制 酶Hindlll (TaKaRaBio公司製造）雙重消化，藉由1 ·0%瓊脂糖凝 膠電泳萃取純化其Kpnl-Hindlll消化物，獲得Kpiil-Hindlll 消化DNA片斷。 繼而以與調製上述KpnI-Hindlll消化DNA片斷時所使用 之相同限制酶，切斷實施例1-(1)中所調製之pCold08NC2載 體，以調製末端受到脫磷酸處理者，與上述KpnI-Hindlll 消化DNA片斷混合，使用DNA接合套組（TaKaRa Bio公司製 造）連結。之後，使用接合反應液20 μΐ轉形大腸桿菌JM109， 95345.doc -36- 200521237 於含有1.5% (w/v)》農度的瓊脂之LB培養基（含安比西林5〇 pg/ml)上繁殖該轉形體。

藉由定序分析確認插入有目的DNA片斷之質體，並將該 重組質體稱為pCold08 hDi-ASI。該質體係被命名、表示為 pCold08 hDi-ASI，自平成15年9月26曰起（原寄存曰）以FERM BP-10076之編碼寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所 專利生物寄存中心（曰本國茨城縣築波市東1號街1號1中央 第6(郵政編號305-8566))。該pCold08 hDi_ASI係含有編碼來 自人之Dicer胺基酸序列（序列號之胺基酸號679〜1924之 胺基酸序列的鹼基序列（序列表之序列號丨6所記載之鹼基 序列、序列號17所記載之胺基酸序列）的質體。以上述質體 表現之蛋白質具有Perfect DB序列、His tag序列以及Factor Xa序列。該蛋白質之胺基酸序列以序列表之序列號丨8表 示，鹼基序列以序列表之序列號19表示。 (2)表現、純化 使用上述（1)中所調製之pCold08 hDi-ASI轉形大腸桿菌 BL21 - CodonPlus-RIL 株（Stratagene 公司製造），於含 1.5% (w/v)濃度的瓊脂之LB培養基（含安比西林50 pg/ml)上繁殖 該轉形體。使於2.5 ml之LB液體培養基（含安比西林50 pg/ml)中植菌繁殖之菌落，於37°C下培養一晚。將其一部分 植菌於100 ml之相同LB培養基中，於37°C下培養至對數增 殖期。經上述培養後，於保溫於15°C之培育器内振盪10分 鐘後，以終濃度為1.0 mM之方式添加IPTG，以其原樣直接 於15°C下培養24小時以發生誘導。之後藉由離心分離將菌 95345.doc -37- 200521237 體集中’並使之於5ml的細胞破碎溶液[5〇111^11[^3_鹽酸缓 衝液（pH值8·5)、100瓜^氣化鈉、1 mM氯化鎂、0.1%氚 X_100、1 mM二硫代蘇糖醇、1 mM苯甲基磺醯氟]中再懸 淨。藉由超聲波破碎菌體，再藉由離心分離（11，000 rpm20 分鐘）分離上清之萃取液與沈澱。 使用上述上清之萃取液約5 ml，進一步以下列方式藉由 鎳柱進行純化。 即’以樹脂容積1 ml份之Ni_NTA瓊脂⑴IAGEN社製造） 中添加緩衝液A[20 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH值8.5)、100 mM 氯化納' 1 mM二硫代蘇糖醇、丨氣化鎂、〇·ΐ%氚χ-100]10 ml混合後’以L500 rpm離心數分鐘，拋棄上清液，回收約1 ml之樹脂。添加以菌體破碎液調製之約5 〇1之上请，4°c下 約1小時’以旋轉搖盪器平穩地混合。之後，於Φ15 mm之 管柱中填充吸附有該目的蛋白質之樹脂，以5 ml之緩衝液A 洗淨二級。繼而以5 ml之緩衝液B [20 mM Tris-鹽酸緩衝液 (pH值8.5)、1〇〇 mM氯化鈉、1 mM氣化鎮、1 mM二硫代蘇 糖醇、0.1%氚X-1 〇〇、40 mM咪唑]洗淨樹脂後，以5 ml之緩 衝液C[20 mM Tris·鹽酸緩衝液（PH值8.5)、800 mM氣化鈉、 1 mM氣化鎂、1 m]y[二硫代蘇糖醇、〇·1%氣χ_1〇〇、4〇 mM 咪唑]，繼而以5 ml之緩衝液B進行洗淨，除去目的以外之 不需要的蛋白質。 洗淨後，以3 ml之緩衝液D[20 mM Tris-鹽酸缓衝液（pH 值8.5)、100 mM氣化鈉、1 mM氣化鎂、1 mM二硫代蘇糖醇、 〇·1。/〇氚X-100、1〇〇 mM咪唑]進行溶出操作。繼而，以5〇〇 mi 95345.doc -38- 200521237 之緩衝液E[50 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH值8.5)、100 mM氯化 鈉、1 mM氯化鎂、0.1%氣X-100、1 mM二硫代蘇糖醇]進行 透析，之後，使用滅蟻能（Amicon公司製造）濃縮至約10倍。 將其一部分供予10% SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳中，於使用 大腸桿菌BL21-CodonPlus-RIL株（Stratagene公司製造）作為 宿主之樣本本中確認出分子量約144,000者為目的蛋白質 之帶，將其用於以下之活性確認。以下，將來自人之Dicer ΡΑΖ+RNaseIII結構域蛋白質作為hDi-ASI。 (3)dsRNA分解活性之測定 關於上述實施例4_(2)中調製之蛋白質樣本樣本，以實施 例2所記載之方法測定其dsRNA分解活性。 其結果為，自電泳後經溴化乙錠染色的凝膠，確認出約 21核苷酸之分解產物，於RNaselll結構域蛋白質（hDiR)與包 含PAZ區域的部份之蛋白質（hDi-ASI)中亦可確認出dsRNA 分解活性。 再者，為研究關於凍結·熔融中之穩定性，於-80°C條件下 凍結上述蛋白質樣本，之後，使其於室溫下熔融，反覆進 行6次以及10次該操作。又，亦對作為對照組之實施例1_(2) 所調製之hDiR進行同樣的研究。 其結果為，就ΡΑΖ+RNaseIII結構域蛋白質（hDi-ASI)而 言，即使反覆進行6次、10次凍結·熔融亦可保持分解活性。 相對而言，就hDiR而言，僅至凍結·熔融至6次為止可確認 活性。因此，可藉由使RNaselll結構域中進一步含PAZ結構 域，而確認該蛋白質可獲得更高之凍結·熔融穩定性。 95345.doc -39- 200521237 (4)關於有益於分解之因子的討論 針對上述實施例4-(2)中所調製之hDi-ASI，研究常溫環境 下具有核酸結合活性之蛋白質的影響。 作為上述具有核酸結合活性之蛋白質，使用上述實施例3 中所調製之來自棲熱孢菌屬的CspB蛋白質。又，關於對 dsRNA分解之效果，係以如下之形式測定。 即，於實施例4-(2)中所調製之hDi-ASI(酶液）1 μΐ、實施 例3中所調製之CspB溶液1 μΐ、作為基質之dsRNA 1 gg、10 φ mM ATP溶液1 μΐ、50 mM氯化鎂溶液1 μΐ、5x反應缓衝液 [25 0 mM Tris-鹽酸（pH值 8·5)、750 mM 氣化鈉、0·5% 氚 Χ-100、5 mM DTT]2 μΐ中加入，容量為10 μΐ之無核酸水解 酵素的水以作為反應液。CspB蛋白質之濃度以終濃度為9.2 ng/μΐ、1 8.4 ng/μΐ、92 ng/μΐ之方式添加，添加 1 μΐ之 CspB 形狀缓衝液即10 mM磷酸鉀緩衝液（pH值7.5)作為無添加的 對照組。 調製以上之反應液，於37。(：下反應17小時後，提供5 μΐ 籲 至1 5%聚丙烯醯胺凝膠電泳中，以溴化乙錠進行染色，確 認切斷產物。再將該凝膠藉由Total Lab ver. 1· 11 (Nonlinear Dynamics公司製造）之影像分析，進行約2 1核苦酸之dsRNA 分解物之定量。 其結果為，可確認於hDi-ASI之情形時，添加CspB之 dsRNA分解量亦獲提高。特別是可確認於9.2 ng/μΐ前後分解 量會提高。 即，可禮認CspB不論是在含有RNaselll結構域之天然型 95345.doc -40- 200521237 或變異型之來自人的Dicer之任一種中，均可促進該dsRNA 分解活性。 實施例5 針對使用本發明之來自人之hDiR所調製的siRNA所造成 之RNA干涉的效果進行研究。使用市售之Dicer(GTS公司）作 為對照組。dsRNA分解產物之調製基本係以上述實施例2-(1) 所記載之方法進行。即，使用實施例1_(2)所記載之hDiR以 及市售之Dicer 10單位，於37°C、18小時，切斷dsRNA成10 pg份，使用RNA純化柱1、2 (Gene Therapy Systems公司製造）純 化該等經切斷之產物，將其等用於以下之RNA干涉之評估 中〇 即，於進行SiRNA導入24小時前，將含10% FBS以及1% 盤尼西林/鏈黴素之D-MEM培養基（SIGMA公司製造）中的 293細胞適量（細胞數：5χ104)地散佈於24孔盤中，於C02細 菌培育器中培養一晚。以80%之長滿狀態下於50 μΐ之無血 清培養基中加入3 μΐ的TransIT 293轉染試劑（TaKaRa Bio公 司製造），激烈攪拌。室溫下放置5分鐘，加入〇·3 之 pQBI25(和光純藥公司製造），平穩地混合，室溫下放置5分 鐘。於其中加入4 μΐ之Tr*ansIT-TKO試藥平穩地混合，室溫 下放置5分鐘。再於其中加入上述siRNA500 ng平穩地混 合，於室溫下放置5分鐘，以其作為DNA/siRNA溶液。以250 μΐ之添加方式將DNA/siRNA滴於孔中之含10% FBS的 D-MEM培養基中，將孔内之溶液平穩地混合至均勻。又以 僅添加0.3 gg的pQBI25(和光純藥公司製造）者作為對照 95345.doc -41 - 200521237 組，又僅添加滅菌水者亦同時進行。之後於co2細菌培育器 中培養24小時。將該細胞供予使用FACS Vantage (Becton Dickinson公司製造）之流式細胞儀中，測定對於僅導入載體 (DNA)者之導入DNA/siRNA溶液情形時之GFP所表現的阻 礙效果。其結果於表1中表示。 [表1] 導入樣本 平均螢光強 對照組（無添加） 8.09 對照組（僅載體） 1331.44 hDiR 14.92 市售Dicer 71.57 如表1所示，與對照組（僅載體）相比較，其平均螢光值越 小，則越會產生RNA干涉。因此，藉由hDiR所獲得之siRNA 與市售Dicer同樣顯示出RNA干涉效果，，且可確認顯示出 強於市售Dicer者的RNA干涉效果。 由以上情形可確認本發明之hDiR可用以調製用於RNA干 涉中之siRNA。 實施例6 關於使用本發明之hDiR調製的siRNA之RNA干涉效果， 以變換siRNA之添加量的方式加以研究。使用市售之Dicer (Gene Therapy Systems公司製造）作為對照組。基本以上述實施 例2-(1)中所記載之方法進行dsRNA之切斷。即，使用實施 例1_(2)所記載之11〇丨11以及市售之〇卜61：1〇01，於37°(：、18 小時，將dsRNA切斷成10 pg份。另外，此時，將實施例3·(2) 中使用之CspB以最終濃度為9.2 ng/μΐ之方式添加，使其反應。 使用RNA純化管柱1、2 (Gene Therapy Systems公司製造）純 95345.doc -42- 200521237 化該等切斷產物，將其用於以下之RNA干涉的評估中。 即，於進行siRNA導入之24小時前，將含10% FBS以及1% 盤尼西林/鏈黴素之D-MEM培養基（SIGMA公司製造）中的 293細胞，適量（細胞數：1.5 χΙΟ5)地散佈於24孔盤中，於C02 細菌培育器中培養一晚。於該培養細胞約95%之長滿程度 時，於49 μΐ之無血清培養基中加入1 μΐ的Genejuice轉染試 劑（TaKaRa Bio公司製造），激烈攪拌。室溫下放置5分鐘， 加入0.3 gg之PQBI25(和光純藥公司製造），平穩地混合，室 溫下放置5分鐘。 同時，於其他試管中預備於47 μΐ之無血清培養基中，加 入3μl之Ribojuice轉染試劑（TaKaRaBio公司製造）者，經激 烈攪拌。於室溫下放置5分鐘，加入上述siRNA 166.7 ng、 5 5 · 6 ng、1 8 · 5 ng平穩地混合，室溫下放置5分鐘。 以25 0 μΐ之添加方式將如此調製之2種溶液滴於孔中之含 10% FBS的D-MEM培養基中，將孔内之溶液平穩地混合至 均勻。又，作為對照組之僅添加載體（DNA)者及僅添加滅 菌水者亦同時進行。之後於C02細菌培育器中培養24小時。 將該細胞供予使用FACS Vantage (Becton Dickinson公司製造）之 流式細胞儀中，測定對於僅導入載體（DNA)者之導入 DNA/siRNA時對rsGFP表現的阻礙效果。其結果於表2中表 示0 95345.doc -43- 200521237 [表2] 導入樣本 平均螢光強度（相對值） 對照組（無添加） 0 對照組（僅載體） 100 hDiR 166.7 ng 18.21 hDiR 55.6 ng 18.97 hDiR 18.5 ng 32.67 市售 Dicer 166.7 ng 17.74 市售 Dicer 55.6 ng 19.80 市售 Dicer 1 8.5 ng 32.34 如表2所示，與對照組（僅載體）相比較平均螢光強度之值 越小則越會產生RNA干涉。因此’可確認藉由hDiR所獲得 修 之siRNA與市售Dicer同樣顯示出RNA干涉效果。 由以上情形可確認本發明之hDiR可用於調至RNA干涉之 siRNA。 將上述細胞樣本本中萃取出來的總RNA，供予至即時反 轉錄酶一聚合酶鏈反應（real time RT-PCR)中，以進行定量 rsGFP之mRNA，以及進行RNA干涉之評估。 即，自導入siRNA後於C02細胞培育器中37°C下培養24小 i 時之細胞，使用trizole (Invitrogen公司製造）萃取、純化全部 RN A。此外，此時之操作係依據隨附的說明進行。加入其 全部RNA80 ng、5XM-MLV緩衝液（TaKaRa Bio公司製造）4 01、1〇11114(1]^?(丁&1^1^8丨〇公司製造）101、6鹼基隨機引子序 列（random hexamer ) 100 pmol、RNase 抑制劑（TaKaRa Bio 公司製造）20 U、M-MLV反轉錄酶100 U，以滅菌水使總量 為20 μΐ。將上述反應液設置於TaKaRa PCR熱循環反應器 SP(TaKaRaBio公司製造）中，以42°C 10分鐘、95°C 2分鐘進行 95345.doc -44- 200521237 反應。於該反應液中加入20 μΐ之反應稀釋液（lxM-MLV缓 衝液、0.5 mM dNTP混合物），將其以每1〇 μΐ分注。於上述 反應物10 μΐ中加入l〇xR-PCR缓衝液（TaKaRa Bio公司製 造）2·5 μ卜 25 0 mM Mg2+ 0·3 μΐ、10 mM dNTP 0·75 μ卜 TaKaRa Ex Taq R-PCR (TaKaRa Bio公司製造）1.25 U、以滅菌水3000 倍稀釋之 SYBR Green (TaKaRa Bio 公司製造）2·5 μΐ、100% DMSO 1.25 μΐ，分別加入用以檢測β-肌動蛋白（TaKaRa Bio 公司製造）、GAPDH(TaKaRaBio公司製造）、rsGFP(rsGFP-F :序 列號 20、rsGFP_R :序列號 21)、Neo(Neo_F :序列號 22、 Neo-R :序列號23)之合成引子5 pmol，以滅菌水使總量為 25 μΐ。將上述反應液設置於Smart Cycler II單元（TaKaRa Bio公司製造），於95°C下進行1〇秒熱變性後，以95°C 5秒、 60°C 20秒為1週期進行45週期反應。藉由解析所獲得之資 料，定量來自人之β-肌動蛋白、GAPDH、以及來自導入質 體之rsGFP、Neo之mRNA量。其結果於表3中表示。 [表 3]____ 導入樣本 rsGFP mRNA量（相對值） 2 2 11 7 1 4 0 9 7 6 7 9 8 0 5 2 0 4 0 5 01123133 對照組（無添加） 對照組（僅載體） hDiR 166.7 ng hDiR 55.6 ng hDiR 18.5 ng 市售 Dicer 166.7 ng 市售 Dicer 55.6 ng 市售 Dicer 18.5 ng 如表3所示，與對照組（僅載體）相比較rsGFP之mRNAi越 小則越會產生RNA干涉。因此，可確認hDiR與市售Dicer同 95345.doc -45- 200521237 樣顯示出RNA干涉效果。 由以上情形可確認本發明之hDiR於用以RNA干涉之 siRNA調製中為有用。 實施例7 就上述實施例卜(2)、實施例4-(2)中所調製之樣本而言， 係以螢光素酶基因製作評估其dsRNA分解活性之作為基質 的 dsRNA。與實施例 2-(1)—樣，dsRNA使用 TurboScript T7 轉錄套組（GTS公司製造），係依據其隨附說明來合成。 即，就編碼插入於質體pGL3-Basic載體（Promega公司製 造）中之螢光素酶的基因而言，係以質體pGL3-Basic載體 (Promega公司製造）作為模板，使用具有序列表之序列號24 所記載之T7啟動子序列的dsl-Ι引子與序列表之序列號25所 記載的dsl-2引子，進行PCR(擴增片斷長約500鹼基對），以 獲得擴增產物。繼而將獲得之雙鏈DNA作為模板，藉由T7 RNA聚合酶之RNA合成反應調製出約500 bp長度之dsRNA。 研究關於使用本發明之hDiR、hDi-ASI調製的siRNA之 RNA干涉之效果。使用市售之Dicer (Gene Therapy Systems公司 製造）作為對照組。關於dsRNA之切斷，基本上係以上述實 施例2-(1)所記載之方法進行。即，使用實施例1-(2)所記載 之hDiR、實施例4-(2)所記載之hDi-ASI以及市售之Dicer 10 μΐ，於37°C、18小時，將上述dsRNA切斷成10 μ§份。另外 此時，將實施例3_(2)中使用之CspB以最終濃度為9.2 ng/μΐ 之方式添加，使其反應。 使用RN A純化管柱1、2 (Gene Therapy Systems公司製造）純化 95345.doc -46· 200521237 該等切斷產物，以用於以下之RNA干涉之評估中。 即，於進行siRNA導入之24小時前，將含10% FBS以及1% 盤尼西林/鏈黴素之D-MEM培養基（SIGMA公司製造）中的 293細胞，適量（細胞數·· 1·5χ105)地散佈於24孔孔盤中，於 C02細菌培育器中培養一晚。當該培養細胞約95%之長滿程 度時，於49 μΐ之無血清培養基中加入1 μΐ之Genejuice轉染 試劑（TaKaRa Bio公司製造），並激烈攪拌。室溫下放置5分 鐘，加入0.5 pg 之 pGL3-control 及 0.1 pg 之 pRL-TK(Promega 公 司製造），平穩地混合，室溫下放置5分鐘。 同時，於其他試管中預備於47 μΐ之無血清培養基中加入 有3#1之11丨1)〇】1146轉染試劑（丁&^^1^6丨〇公司製造）者，激烈 攪拌。室溫下放置5分鐘，加入上述siRNA 166.7ng、55.6ng、 18.5 ng，平穩地混合，室溫下放置5分鐘。 以25 0 μΐ之添加方式將如此調製之2種溶液滴於孔中之含 10% FBS的D-MEM培養基中，將孔内之溶液平穩地混合至 均勻。又，亦同時進行僅添加載體（DNA)者及僅添加滅菌 水者以作為對照組。之後於C02細菌培育器中培養24小時。 將該細胞供予至使用Dual Luciferase Reporter分析套組 (Promega公司製造）之檢定中，對於僅導入載體（DNA)者測 定添加siRNA時之GL3蛋白質表現的阻礙效果。其結果於表 4中表示。 [表4] 導入siRNA樣本 GL3表現量：相對值

組（無添加） 對照組（僅載體） 95345.doc -47- 200521237 25.70 38.90 74.51 25.87 25.00 31.09 25.11 30.15 55.41 hDiR 166.7 ng hDiR 5 5.6 ng hDiR 18.5 ng hDi-ASI 166.7 ng hDi-ASI 55.6 ng hDi-ASI 18.5 ng 市售 Dicer 166.7 ng 市售 Dicer 55.6 ng 市售 Dicer 18.5 ng 表4中，可看出與對照組（僅載體）相比較，其QL3表現量 之值越小則越會產生RNA干涉。因此，可確認藉由hDiR、 hDi-ASI所獲得之siRNA與市售mcer同樣顯示出rna干涉 效果。 由以上情形可確認本發明2hDiR、hDi_ASI可用KRna 干涉之siRNA的調製中。 實施例8 針對使用本發明之hDiR、hDi-ASI，添加CspB所調製的 siRNA與無添加而調製之siRNA，就其等2RNA干涉的效果 加以研九。另外，使用實施例7所記載之螢光素酶之方法進 行實際之操作。使用市售之以咖（Gene几咖取Systems公司製 造）作為對照組。關於dsRNA之切斷，基本上係以上述實施 例2-( 1)所記載之方法進行。即，使用以實施例1 _(2)所記載 之方法所調製之hDiR、以實施例4-(2)所記載之方法所調製 之hD卜ASI以及市售之Dicer 10 μΐ，於37°C、18小時，將上 述dsRNA切斷成1 〇吨份。另外此時，於添加有最終濃度為 9.2 ng/μΐ之實施例3_(2)中所使用之CspB的情形下與無添加 之情形下進行反應。 使用RNA純化管柱1、2 (Gene Therapy Systems公司製造）純 95345.doc -48 - 200521237 化该等切斷產物，以用 用於Μ下之RNA干涉之評估中

對照組（僅載體） hDiR 55.6 ng+CspB hDiR 55.6 ng [表5] GL3表現量：_相兩7^ 0 100 9.66 16.40 14.31 市售 Dicer 55.6 ng+CspB 市售 Dicer 55.6 ng hDi-ASI 55·6 ng+CspB hDi-ASI 55.6 ng

之值越小則越會產SRNA干;步。因此，顯示出添加有CSPB 之樣本或為添加之樣本，其間並無RNA干涉效果之差異。 由以上情形可確認，於用以調製rna干涉之siRNA時，本 發明之CspB對於siRNA並無實質的影響。 13.19 1 η Α Λ 實施例9酶之穩定性 以終濃度為92 ng/μΐ之方式，將CspB者添加於實施例4_(2) 中所純化之PAZ結構域+RNasem結構域的蛋白質 (hDi ASI) ’而於緩衝液i(5〇mMTris_鹽酸緩衝液值、 250 mM 氣化鈉、1 mM 氣化鎂、〇1 mM dtt、

Trit〇nX-100、50%甘油）中保存之，於每一定期間以下列之 方式測定其dsRNA分解活性。於實施例中所調製之 dsRNA 1 、上述4-(2)中所調製之蛋白質樣本j μ1、5χ反 應緩衝液（100 mM Tris-鹽酸緩衝液（ρΗ值8·5)、75〇 mM氯化 鈉、12.5 mM氯化鎂）2 μΐ中加入無核酸水解酵素的水，使總 量為10 μΐ以作為反應液。於37t;下反應18小時後，提供5 y 95345.doc •49- 200521237 於15。/。聚丙烯醯胺凝膠電泳中、溴化乙錠之染色中進行切 斷產物之確認。其結果為，於保存6個月以上之樣本中可確 認出約21鹼基對之分解產物，可確認dsRNA分解活性。另 一方面，於相同緩衝液條件中，於RNaselll結構域蛋白質 (hDiR)中添加CspB者，活性可保持3個月以上。 實施例10 pColdl4-TmCspB之製作、重組體之培養以及純化 (1) pColdl4-TmCspB之製作 參照蛋白質科學（Protein Science)、第8卷、394_403頁 (1999)所記載之序列（胺基酸序列以序列號9表示，鹼基序列 以序列號1 〇表示），選殖於以下之來自棲熱孢菌屬 (Thermotoga maritima)的 CspB(以下，稱為 TmCspB)。 首先，以DNA合成機合成具有序列表之序列號26以及27 所記載之鹼基序列的合成引子E以及F，根據一般方法純 化。上述合成引子E係於鹼基號11〜16中具有限制酶Ndel之 識別序列，且於鹼基號14〜34中具有相當於TmCspB之胺基 酸序列（序列號26)的胺基酸號1〜7之鹼基序列的合成 DNA。又，合成引子F係於鹼基號11〜16中具有限制酶BamHI 之識別序列，且於鹼基號20〜37中具有相當於TmCspB之胺 基酸序列（序列號26)的胺基酸號61〜66之鹼基序列的合成 DNA。 使用上述合成引子’進行PCR。PCR之反應條件如下所示。 gp，加入實施例3-(1)之模板DNA 1 μΐ (50 ng)、5 μΐ之 1〇χΕχ Taq緩衝液（TaKaRa Bio公司製造）、5 μΐ之dNTP混合 液（TaKaRa Bio公司製造）、10 pmol之合成引子E、10 pm〇l 95345.doc -50- 200521237 之合成引子F、0.5 U之TakaraExTaq(TaKaRaBio公司製造），添 加滅菌水使總量為50 μΐ。將上述反應液設置於TaKaRa PCR ThermalCyclei:SP(TaKaRaBio 公司製造）中，以 94°C 1 分鐘、55°C 1分鐘、72°C 1分鐘為1週期進行30週期反應。 反應結束後，將該反應液5 μΐ供予至3.0%瓊脂糖凝膠電泳 中，確認出約220 bp之目的DNA片斷。將電泳殘留之PCR反 應液回收·純化其片斷，進行乙醇沈澱。將其懸浮於5 μΐ之 滅菌水中以乙醇沈澱後回收DNA，以限制酶NdeI(TaKaRaBio 公司製造）以及限制酶BamHI (TaKaRa Bio公司製造）雙重消化 之，藉由3.0%瓊脂糖凝膠電泳萃取純化其Ndel-BamHI消化 物，獲得Ndel-BamHI消化DNA片斷。 繼而根據國際公開第99/27117號手冊之實施例1〜6所記 載之方法，調製pCold04NC2載體（以下，該PCold04NC2載 體稱為pColdl4載體）。 繼而以與調製上述DNA片斷時使用之相同的限制酶切斷 上述pColdl4載體，調製末端經脫磷酸處理者，與上述 Ndel-BamHI消化DNA片斷混合，使用DNA接合套組 (TaKaRa Bio公司製造）連結。之後，使用接合反應液20 μΐ 使大腸桿菌JM109轉形，於含1.5% (w/v)濃度之瓊脂的LB培 養基（含安比西林50 pg/ml)上繁殖該轉形體。 藉由定序分析而確認出插入有目的DNA片斷之質體。 (2) CspB於5公升缸中之培養以及純化 使用上述實施例10-(1)中調製之pColdl4-TmCspB轉形大 腸桿菌BL21，於含1.5% (w/v)濃度的瓊脂之LB培養基（含安 95345.doc -51- 200521237 比西林50 pg/ml)上繁殖該轉形體。於30 ml之LB液體培養基 (bacto-tryptone 0.3 g、bacto-yeast萃取物 0.15 g、NaCl 0.15 g、 安比西林1.5 mg)中植菌繁殖之菌落，於37°C下培養一晚。 將該培養液30 ml份於含3公升之LB液體培養基 (bacto-tryptone 30 g、bacto-yeast 萃取物 15 g、NaCl 15 g、 安比西林150 mg)之5公升發酵缸（able公司製造）中植菌 後，於1 50 rpm、Air=0.5公升/min、37°C之條件下培養至對 數增殖期，之後，冷卻至1。冷卻後，以終濃度為1 ·〇 mM 之方式添加IPTG，於150rpm、Air=0.5公升/min、15°C之條 件下培養24小時表現誘導。之後藉由離心分離集中菌體， 獲得11 g濕菌體。將濕菌體11 g再懸浮於44 ml的緩衝液 A[20 mM THs-鹽酸緩衝液（pH值8.0)]中。藉由超音波破碎 使菌體破碎，藉由離心分離（10,000xg 20分鐘）將上清之萃 取液與沈澱物分離。將該上清之萃取液進一步藉由超離心 分離（70,000xg 20分鐘）將上清之萃取液與沈澱物分離。 以水浴方式對上述上清之萃取液約53 ml進行熱處理 (70°C、10分鐘），藉由離心分離（10,000xg 20分鐘）將上清液 與沈澱物分離。於該熱處理後之上清液中，以終濃度為200 mM之方式添加NaCl，進而添加以緩衝液B[20 mM Tris-鹽 酸緩衝液（pH值8·0)、200 mM氣化鈉]平衡化之 AnionExchanger DE52 10 m公升，於4〇C下緩慢授拌一晚。 藉由離心分離（3，000xg 20分鐘）將上清液與沈澱物分離。進 一步以玻璃過濾器對上清液進行過濾。繼該濾液45 ml後， 對於3公升之緩衝液A[20 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH值8.0)]進 95345.doc -52- 200521237 行透析。 以填充於Φ20 mm之管柱中之樹脂容積於100 ml份之 Q-Sepharose F· F· (Amersham Biosciences 公司製造）中添加透析後之 液體50 ml，以400 ml之緩衝液A[20 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH 值8.0)]洗淨。回收該非吸著成分，使通過1；?30,000切點值 Centriprep YM-30 (MLLIP0RE 公司製造）。於充填於 Φ30ηπη 之管 柱中之 40 ml Heparin Sepharose CL-6B (Amersham Biosciences 公司製 造）添加該UF通過液260 m卜以160 ml之緩衝液A[20 mM φ Tris-鹽酸緩衝液（pH值8.0)]洗淨。之後，以200 ml之緩衝液 A[20 mM Tris-鹽酸缓衝液（pH值8.0)]之0〜1 Μ氣化鈉梯度 進行目的蛋白質之溶出。回收於三羥甲基氨基甲烷-SDS聚 丙烯醯胺電泳中確認分子量約7,500之目的蛋白質之成 分，對於3公升之緩衝液A[20 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH值 8.0)]進行透析。使用UF3,000切點值Centriprep YM-3 (MILLIPORE公司製造）將該透析後之液體65 ml濃縮至約144 倍，獲得約450 μΐ之蛋白質樣本。於該蛋白質樣本添加等量 f 之甘油，獲得50°/。甘油溶液（W/W)850 μΐ。將其一部分供予 至三經甲基氨基甲烧-SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳中，於分子 量約7,5 00之位置確認目的蛋白質之單一的染色帶。 (3)關於CspB蛋白質之切斷活性之上升。 繼而針對實施例卜（2)、實施例4-(2)中所調製之蛋白質樣 本，研究具有核酸結合活性之蛋白質（CspB)的影響。另外， 此時使用實施例10-(2)中所調製之TmCspB。 即，於實施例1-(2)、實施例4-(2)中所調製之蛋白質樣本 95345.doc -53- 200521237 (hDl_R酶液）、或蛋白質樣本（hDi-ASI酶液）1 μ1、實施例 ι〇-(2)中所調製之CspB溶液（92η§/μ1)1 μ、實施例2-(1)中所 凋製之作為基質之dsRNA i 、5χ反應緩衝液（i〇〇 Tns-鹽酸緩衝液（1)11值8.5)、75〇瓜乂氯化鈉、ΐ2·5 氣化 鎂）2 μΐ中加入無核酸水解酵素的水，使總量為1〇 -者以作 為反應液。CspB蛋白質之濃度之終濃度為9·2 ng/]Lll。又， 此日可亦對作為對照組之市售Dicer進行同樣的處理。在市售 之Dicer(GTS公司製造）的情形下，於酶液2 μΐ、cSpB溶液1

μΐ、作為基質之dsRNA 1 pg、1〇 mM ATP溶液 1 μΐ、50 mM 氣化鎮溶液0·5 μΐ、附屬之反應緩衝液4…中加入無核酸水 解酵素的水，總量為1〇 μΐ者作為反應液。再者，代替TmCspB 加入1 μΐ的無核酸水解酵素的水者作為陰性對照組。 調製以上之反應液，37°C下反應18小時後，5 μΐ供予至 15 %聚丙烯醯胺凝膠電泳，進行漠化乙錠之染色，確認切 斷產物。將 s亥凝膠猎由 Total Lab ver. 1 · 11 (Nonlinear Dynamics 公司 製造）之影像分析，進行約21核苷酸之dsRNA分解物之定 量。 其結果為，實施例10-(2)中表現、純化之TmCspB與於實 施例3-(1)中表現、純化之TmCspB同樣，可確認dsRNA分解 量之提南。 實施例11 hDi-ASI於30公升缸中之培養以及純化 (1)表現、純化 使用上述實施例4-(1)中調製之pCold08 hDi-ASI轉形大 腸桿菌BL21，於含1.5% (w/v)濃度的瓊月旨之LB培養基（含安 95345.doc -54- 200521237 比西林50 pg/ml)上繁殖該轉形體。於200 ml之TB液體培養 基（bacto-tryptone 2.4 g、bacto-yeast extract 4.8 g、glycerol 0.8 ml、1 7 mM KH2P〇4、72mMK2HP04、安比西林10 mg)中植菌繁殖之菌落， 於37°C下培養一晚。將該培養液200 ml份於含20公升TB液 體培養基（bacto-tryptone 240 g、bacto-yeast extract 480 g、glycerol 80 ml、17mMKH2P04、72mMK2HP04、安比西林 1 g)之 30 公升發 酵缸（丸菱生物工程公司製造）中植菌後，於100 rpm、Air==6 公升/min、37°C之條件下培養至對數增殖期，之後，冷卻 至15°C。冷卻後，以終濃度為1.0 mM之方式添加IPTG，於 100 rpm、Air=6公升/min、15°C之條件下培養24小時表現誘 導。之後藉由離心分離集中菌體，獲得26 g濕菌體。於48 ml 之細胞破碎溶液[50 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH值8.5)、100 mM氣化鈉、1 mM氯化鎮、蛋白酶抑制劑（Complete、無EDTA 貝林噶曼哈姆公司製造）]中再懸浮濕菌體之一部分12 g。藉 由超聲波破碎破碎菌體，藉由離心分離（12,000 rpm 30分鐘） 使上清之萃取液與沈澱分離。 進一步以下列方式藉由鎳柱使用上述上清之萃取液約56 ml進行純化。 即，以樹脂容積為16 ml份之Ni-NTA瓊脂（QIAGEN公司製 造）中添加細胞破碎溶液50 ml，混合後，以1，500 rpm離心 數分鐘，拋棄上清，重複2次該操作，回收約8 ml之樹脂。 添加自菌體破碎液調製之約56 ml之上清，於4°C下約1小時 以旋轉搖盪器平穩地混合。之後，於Φ20 mm之管柱中填充 吸附有該目的蛋白質之樹脂，以40 ml之細胞破碎溶液[50 95345.doc -55- 200521237

mM Tris-鹽酸緩衝液（pH值8.5)、100 mM氯化鈉、1 mM氯化 鎮、蛋白酶抑制劑（Complete，EDTA-free、貝林喝曼哈姆公 司製造）]洗淨。繼而以40 ml之緩衝液A[20 mM Tris-鹽酸缓 衝液（pH值8.5)、100 mM氣化鈉、1 mM氯化鎂、10%甘油、 20 mM咪哇]洗淨樹脂後，以40 ml之緩衝液B[20 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH值8.5)、800 mM氣化鈉、1 mM氯化鎂、10% 甘油、20 mM咪唑]，繼而以40 ml之緩衝液A進行洗淨，除 去目的以外之不需要的蛋白質。 洗淨後，以24 ml之緩衝液C[20 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH 值8·5)、100 mM氣化鈉、1 mM氣化鎂、10%甘油、100 mM 咪唑]進行溶出操作。繼而，對於300 ml之缓衝液D[20 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH值8·5)、100 mM氣化鈉、1 mM氣化鎂、 10%甘油]進行透析。

於充填於φ 1 〇 mm之管柱中之1 ml的肝素Sepharose CL-6B (Amersham Biosciences公司製造）中添加透析後之酶溶液，以5 ml之緩衝液D[20 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH值8.5)、100 mM 氣化鈉、1 mM氣化鎂、10%甘油]進行洗淨。繼而，以5 ml 之緩衝液E[20 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH值8.5)、200 mM氣化

鈉、1 mM氯化鎂、10%甘油]，之後以5 ml之緩衝液F[20 mM

Tris_鹽酸緩衝液（pH值8·5)、400 mM氣化鈉、1 mM氯化鎂、 10%甘油]、5 ml之緩衝液G[20 mM Tris-鹽酸緩衝液（pH值 8·5)、800 mM氯化鈉、1 mM氯化鎂、10%甘油]進行蛋白質 之溶出。之後，對於各溶出樣本使用Centricon YM-10 (Amicon 公司製造）濃縮至約20倍，獲得約250 μΐ之蛋白質樣本。將 95345.doc -56- 200521237 其部分供予至10% SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳中，於分子 里約144,000之位置確認目的蛋白質之帶，將其使用於以下 之活性確認中。將於以上過程中表現、純化者與於實施例 4_(2)中以大腸桿菌 BL21-C〇d〇nPlus_RlL strain (Stratagene 公司製造） 作為宿主表現、純化者相比較，每1〇〇瓜丨培養液之活性可 獲得約2倍左右之收量。 (2) dsRNA分解活性之測定 關於上述實施例丨丨-^)中調製之蛋白質樣本，於實施例 2 (1)中調製之dsRNA 1 pg、於上述中調製之蛋白質樣 本1 μΐ、5χ反應緩衝液（1〇〇 mM THs_鹽酸緩衝液（#值 8.5)、750 mM氣化納、12.5 mM氣化鎮）2μΐ中加入無核酸水 解酵素的水，使總量成為10 μ1以作為反應液。37<t下反應 18小時後，供予5 μΐ至15%聚丙烯醯胺凝膠電泳、溴化乙錠 之染色，進行切斷產物之確認。其結果為，可確認出約21 驗基對之分解產物’而確認dsRNΑ分解活性。 (3) 關於CspB蛋白質之切斷活性之上升 繼而關於實施例11-(1)中調製之蛋白質樣本，研究具有核 酸結合活性之蛋白質（CspB)的影響。 即，與實施例HK3)同樣，於實施例u_(1)中所調製之蛋 白質樣本（酶液）1 μ卜實施例1〇-(2)中所調製之CspB溶液i μ1、 實施例2-⑴中所調製之作為基質之dsRNA1 μ、5χ反應緩 衝液（lOOmMTris-鹽酸緩衝液（{^值8 5)、75〇〇1]^氯化鈉、 12.5 mM氣化鎂）2 μΐ中加入無核酸水解酵素的水，使總量 成為1 0 μ 1以作為反應液。C s ρ Β蛋白質之濃度以終濃度為 95345.doc -57- 200521237 9 ·2 ng/μΐ之方式添加。又，對於市售之Dicer亦以同樣方式 進行以作為此時之對照組。市售之Dicer (GTS公司製造）之情 形下，於酶液2 μΐ、CspB溶液1 μΐ、作為基質之dsRNA 1 pg、 10 mM ATP溶液1 μ卜50 mM氣化鎂溶液0.5 μΐ、附屬之反應 緩衝液4 μΐ中，加入容量為10 μΐ者之無核酸水解酵素的水 作為反應液。再者，此時取代CspB而加入無核酸水解酵素 的水以作為對照組。 調製以上之反應液，於37°C下反應18小時後，供予5 μΐ 至15%聚丙烯醯胺凝膠電泳，進行溴化乙錠之染色，確認 切斷產物。進而，將該凝膠藉由Total Lab ver· 1· 11 (Nonlinear Dynamics公司製造）之影像分析，進行約21核苷酸之dsRNA 分解物以及未切斷dsRNA之解析。 其結果為，可確認於使用本發明之含ΡΑΖ+RNaseIII結構 域之變異體蛋白質（hDi-ASI)之情形中，添加CspB之dsRNA 之分解量會提高，甚而，可確認未切斷之基質幾乎不存在， 幾乎全部都被分解了。相對而言，在市售Dicer之情形下， 雖可確認dsRNA分解之上升，但亦可確認有一半左右的未 切斷基質之存在。 即，明確使用本發明之蛋白質之情形下，可藉由添加CspB 完全分解基質。 實施例12 hDi-ASI之切斷產物之RNAi效果 研究關於使用實施例11-(1)之蛋白質調製之siRNA之 RNA干涉效果。使用市售之Dicer (GTS公司）作為對照組。 dsRNA分解產物之調製基本上係以上述實施例11-(3)所記 95345.doc -58 - 200521237 載之方法進行。另外，在hDi-ASI之情形下，以終濃度為9·2 ng/μΐ之方式添加實施例10_(2)中調製之CspB。即，使用於 實施例11-(0所記載之酶中添加有CspB者及市售之Dicer 者’將實施例2-(1)中調製之dsRNA 10 pg份，於37t下、18 小時切斷。使用 Microcon_100、Micropure-EZ (均為 TaKaRa Bio 公司公司製造）純化該等切斷產物，使用於以下之RNA干涉 之評估中。 即’於進行siRNA導入之24小時前，將含10% FBS以及1% 盤尼西林/鏈黴素之D-MEM培養基（SIGMA公司製造）中之 293細胞，適量（細胞數·· 15xl〇5)散佈於24孔孔板中，於c〇2 細菌培育器中培養一晚。於該培養細胞約95%之長滿程度 b ’於49 μΐ之無血清培養基中加入1 μΐ的Genejuice轉染試 劑（TaKaRa Bio公司製造），激烈攪拌。室溫下放置5分鐘， 加入0.3 pg的pQBI25(TaKaRaBio公司製造），平穩地混合，室 溫下放置5分鐘。 同時，於其他試管中預備於47 μΐ之無血清培養基中加入 有3 μΐ的Ribojuice轉染試劑（TaKaRa Bio公司製造）者，激烈 攪拌。室溫下放置5分鐘，加入上述siRNA 55.6 ng平穩地混 合，室溫下放置5分鐘。 以25 0 μΐ之添加方式將如此調製之2種溶液滴於孔中之含 10% FBS的D-MEM培養基中，將孔内之溶液平穩地混合至 均勻。又，僅添加載體（DNA)者及僅添加滅菌水者亦同時 進行以作為對照組。之後於C02細菌培育器中培養24小時。 將該等細胞供予FACS Vantage (Becton Dickinson公司製造）之流 95345.doc -59- 200521237 式細胞儀中使用，以測定對於僅導入載體（DNA)者在導入 DNA/siRNA的情形下之rsGFP表現的阻礙效果。其結果顯示 於表6中。 [表6] 導入樣本 平均螢光強度 對照組（無添加） 3.52 對照組（僅載體） 1120.08 hDi-ASI+CspB 93.09 市售Dicer 278.59 如表6所示，與對照組（僅載體）相比較，其平均螢光值越 φ 小則越會產生RNA干涉。因此，可確認藉由hDi-ASI+CspB 所獲得之siRNA與市售Dicer同樣顯示出RNAi效果，而顯示 出於RNAi中有效。進而，可有效生產siRNA，確認使用同 量之siRNA之情形下，可獲得高於市售之酶之RNAi效果。 由以上情形可確認，以本發明之方法調製之蛋白質可用 於調製RNA干涉用之siRNA。 [產業上之可利用性] 藉由本發明，可提供一種具有生成特定長度的dsRNA之 · dsRNA分解活性的蛋白質。又，藉由本發明之方法，可提 供一種可用於RNA干涉等中之生成特定長度之dsRNA的分 解促進方法以及/或RNA合成促進方法。再者，可提供一種 可較簡便地實施生成本發明之特定長度之dsRNA的分解促 進方法以及/或RNA合成促進方法的組合物及套組。 [序列表說明] SEQ ID NO:3;—種基因編碼人類dicer變異體 SEQ ID ΝΟ··4 ; —種人類dicer變異體之胺基酸序列 95345.doc -60- 200521237 SEQ ID NO:5;擴增一種基因編碼人類dicer變異體之合成引子1 SEQ ID NO:6;擴增一種基因編碼人類dicer變異體之合成引子2 SEQIDNO:7 ;擴增一種基因編碼紅移綠色螢光蛋白之合成引子3 * SEQ ID NO:8 ;擴增一種基因編碼紅移綠色螢光蛋白之合成引子4 SEQ IDNO:14 ;擴增一種基因編碼人類dicer變異體之合成引子5 SEQ ID NO: 15 ;擴增一種基因編碼人類dicer變異體之合成引子6 SEQIDNO:16; —種基因編碼人類dicer變異體 SEQ ID NO:17 ; —種人類dicer變異體之胺基酸序列 SEQ ID NO: 18 ; —種人類dicer變異體之胺基酸序列 SEQIDNOH9; —種基因編碼人類dicer變異體 SEQ ID NO:20 ;擴增一種基因編碼rsGFP之合成引子

rsGFP-F

SEQ ID NO:21 ;擴增一種基因編碼rsGFP之合成引子 rsGFP-R

SEQ ID NO:22 ;擴增一種基因編碼Neo之合成引子Neo-F SEQIDNO:23;擴增一種基因編碼Neo之合成引子Neo_R SEQ ID NO:24;擴增一種基因編碼螢光素酶之合成引子dsl_l SEQ ID NO:25;擴增一種基因編碼螢光素酶之合成引子dsl-2 SEQ ID NO:26;擴增一種基因編碼CspB之合成引子E SEQ ID NO:27;擴增一種基因編碼CspB之合成引子F 95345.doc -61 - 200521237 序列表 <110> TAKARA BIO INC.<120〉分解dsRNA以及合成RNA之方法 <130〉 <140> 093124411 <141 > 2004-08-13 <150〉 JP 2003-293553 <151〉 2003-08-14 <150〉 JP 2003-342126 <151〉 2003-09-30 <150〉 JP 2003-409639 <151〉 2003-12-08 <150〉 JP 2004-086129 〈151〉 2004-03-24 <160〉 27 <170〉專利版本3. 1 <210> 1 <211> 1924 <212〉 PRT <213〉現代人 <400〉 1

Met Lys Ser Pro Ala Leu Gin Pro Leu Ser Met Ala Gly Leu Gin Leu 95345.doc 200521237 5 10 15

Met Thr Pro Ala Ser Ser Pro Met Gly Pro Phe Phe Gly Leu Pro Trp 20 25 30

Gin Gin Glu Ala lie His Asp Asn lie Tyr Thr Pro Arg Lys Tyr Gin 35 40 45

Val Glu Lea Leu Glu Ala Ala Leu Asp His Asn Thr lie Val Cys Leu 50 55 60

Asn Thr Gly Ser Gly Lys Thr Phe lie Ala Ser Thr Thr Leu Leu Lys 65 70 75 80

Ser Cys Leu Tyr Leu Asp Leu Gly Glu Thr Ser Ala Arg Asn Gly Lys 85 90 95

Arg Thr Val Phe Leu Val Asn Ser Ala Asn Gin Val Ala Gin Gin Val 100 105 110 95345.doc 2- 200521237 145 150 155 160

Leu Lys Asn Gly Tyr Leu Ser Leu Ser Asp lie Asn Leu Leu Val Phe 165 170 175

Asp Glu Cys His Leu Ala lie Leu Asp His Pro Tyr Arg Glu Phe Met 180 185 190

Lys Leu Cys Glu lie Cys Pro Ser Cys Pro Arg lie Leu Gly Leu Thr 195 200 205

Ala Ser lie Leu Asn Gly Lys Trp Asp Pro Glu Asp Leu Glu Glu Lys 210 215 220

Phe Gin Lys Leu Glu Lys lie Leu Lys Ser Asn Ala Glu Thr Ala Thr 225 230 235 240

Asp Leu Val Val Leu Asp Arg Tyr Thr Ser Gin Pro Cys Glu He Val 245 250 255

Val Asp Cys Gly Pro Phe Thr Asp Arg Ser Gly Leu Tyr Glu Arg Leu 260 265 270

Leu Met Glu Leu Glu Glu Ala Leu Asn Phe lie Asn Asp Cys Asn lie 275 280 285

Ser Val His Ser Lys Glu Arg Asp Ser Thr Leu lie Ser Lys Gin He 95345.doc 200521237 290 295 300

Leu Ser Asp Cys Arg Ala Val Leu Val Val Leu Gly Pro Trp Cys Ala 305 310 315 320

Asp Lys Val Ala Gly Met Met Val Arg Glu Leu Gin Lys Tyr lie Lys 325 330 335

His Glu Gin Glu Glu Leu His Arg Lys Phe Leu Leu Phe Thr Asp Thr 340 345 350

Phe Leu Arg Lys lie His Ala Leu Cys Glu Glu His Phe Ser Pro Ala 355 360 365

Ser Leu Asp Leu Lys Phe Val Thr Pro Lys Val lie Lys Leu Leu Glu 370 375 380 lie Leu Arg Lys Tyr Lys Pro Tyr Glu Arg His Ser Phe Glu Ser Val 385 390 395 400

Glu Trp Tyr Asn Asn Arg Asn Gin Asp Asn Tyr Val Ser Trp Ser Asp 405 410 415

Ser Glu Asp Asp Asp Glu Asp Glu Glu lie Glu Glu Lys Glu Lys Pro 420 425 430

Glu Thr Asn Phe Pro Ser Pro Phe Thr Asn lie Leu Cys Gly He lie -4- 95345.doc 200521237 435 440 445

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Glu Ala Glu Phe Arg Lys Gin Glu Glu Val Leu Arg Lys Phe Arg Ala 500 505 510

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Thr Val Lys Tyr Glu Glu Glu Leu Asp Leu His Asp Glu Glu Glu Thr 6- 95345.doc 200521237 725 730 735

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Ser <210〉 2 <211〉 5772 <212> DNA <213>現代人 15- 95345.doc 200521237 <400> 2 atgaaaagcc ctgctttgca acccctcagc atggcaggcc tgcagctcat gacccctgct 60 tcctcaccaa tgggtccttt ctttggactg ccatggcaac aagaagcaat tcatgataac 120 atttatacgc caagaaaata tcaggttgaa ctgcttgaag cagctctgga tcataatacc 180 atcgtctgtt taaacactgg ctcagggaag acatttattg ctagtactac tctactaaag 240 agctgtctct atctagatct aggggagact tcagctagaa atggaaaaag gacggtgttc 300 ttggtcaact ctgcaaacca ggttgctcaa caagtgtcag ctgtcagaac tcattcagat 360 ctcaaggttg gggaatactc aaacctagaa gtaaatgcat cttggacaaa agagagatgg 420 aaccaagagt ttactaagca ccaggttctc attatgactt gctatgtcgc cttgaatgtt 480 ttgaaaaatg gttacttatc actgtcagac attaaccttt tggtgtttga tgagtgtcat 540 cttgcaatcc tagaccaccc ctatcgagaa tttatgaagc tctgtgaaat ttgtccatca 600 tgtcctcgca ttttgggact aactgcttcc attttaaatg ggaaatggga tccagaggat 660 ttggaagaaa agtttcagaa actagagaaa attcttaaga gtaatgctga aactgcaact 720 gacctggtgg tcttagacag gtatacttct cagccatgtg agattgtggt ggattgtgga 780 ccatttactg 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tcctgcggat tttagatacc ctaacttaga cttcgggtgg aaaaaatcta ttgacagcaa atctttcatc tcaatttcta actcctcttc agctgaaaat gataattact gtaagcacag cacaattgtc cctgaaaatg ctgcacatca aggtgctaat agaacctcct ctctagaaaa tcatgaccaa atgtctgtga actgcagaac gttgctcagc gagtcccctg gtaagctcca cgttgaagtt tcagcagatc ttacagcaat taatggtctt tcttacaatc aaaatctcgc caatggcagt tatgatttag ctaacagaga cttttgccaa ggaaatcagc taaattacta caagcaggaa atacccgtgc aaccaactac ctcatattcc attcagaatt tatacagtta cgagaaccag ccccagccca gcgatgaatg tactctcctg agtaataaat accttgatgg aaatgctaac aaatctacct cagatggaag tcctgtgatg gccgtaatgc ctggtacgac agacactatt caagtgctca agggcaggat ggattctgag cagagccctt ctattgggta ctcctcaagg actcttggcc ccaatcctgg acttattctt caggctttga ctctgtcaaa cgctagtgat ggatttaacc tggagcggct tgaaatgctt ggcgactcct ttttaaagca tgccatcacc acatatctat tttgcactta ccctgatgcg catgagggcc gcctttcata tatgagaagc aaaaaggtca gcaactgtaa tctgtatcgc cttggaaaaa agaagggact acccagccgc atggtggtgt caatatttga tccccctgtg aattggcttc ctcctggtta tgtagtaaat 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Gin Val Leu Lys Gly Arg Met Asp Ser Glu Gin Ser Pro Ser lie Gly 1 5 10 15 95345.doc -23- 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1962 200521237

Tyr Ser Ser Arg Thr Leu Gly Pro Asn Pro Gly Leu lie Leu Gin Ala 20 25 30

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Cys Thr Tyr Pro Asp Ala His Glu Gly Arg Leu Ser Tyr Met Arg Ser 65 70 75 80

Lys Lys Val Ser Asn Cys Asn Leu Tyr Arg Leu Gly Lys Lys Lys Gly 85 90 95

Leu Pro Ser Arg Met Val Val Ser lie Phe Asp Pro Pro Val Asn Trp 100 105 110

Leu Pro Pro Gly Tyr Val Val Asn Gin Asp Lys Ser Asn Thr Asp Lys 115 120 125

Trp Glu Lys Asp Glu Met Thr Lys Asp Cys Met Leu Ala Asn Gly Lys 130 135 140

Leu Asp Glu Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Ser Leu Met 145 150 155 160 -24- 95345.doc 200521237

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Ser Ser Ser Val Pro Gin Val Leu Lys Gly Arg Met Asp Ser Glu Gin 20 25 30

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Glu Glu Ser Leu Met Trp Arg Ala Pro Lys Glu Glu Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

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Val Val Ala Leu lie Cys Cys Glu Lys Leu His Lys lie Gly Glu Leu 20 25 30

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Glu Leu Asp Leu His Asp Glu Glu Glu Thr Ser Val Pro Gly Arg Pro 50 55 60

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Arg Arg Lys Leu Tyr Pro Pro Glu Asp Thr Thr Arg Cys Phe Gly lie 115 120 125

Leu Thr Ala Lys Pro lie Pro Gin lie Pro His Phe Pro Val Tyr Thr 130 135 140

Arg Ser Gly Glu Val Thr lie Ser He Glu Leu Lys Lys Ser Gly Phe 145 150 155 160 44- 95345.doc 200521237

Met Leu Ser Leu Gin Met Leu Glu Leu lie Thr Arg Leu His Gin Tyr 165 170 175 lie Phe Ser His lie Leu Arg Leu Glu Lys Pro Ala Leu Glu Phe Lys 180 185 190

Pro Thr Asp Ala Asp Ser Ala Tyr Cys Val Leu Pro Leu Asn Val Val 195 200 205

Asn Asp Ser Ser Thr Leu Asp lie Asp Phe Lys Phe Met Glu Asp lie 210 215 220

Glu Lys Ser Glu Ala Arg lie Gly lie Pro Ser Thr Lys Tyr Thr Lys 225 230 235 240

Glu Thr Pro Phe Val Phe Lys Leu Glu Asp Tyr Gin Asp Ala Val lie 245 250 255 lie Pro Arg Tyr Arg Asn Phe Asp Gin Pro His Arg Phe Tyr Val Ala 260 265 270

Asp Val Tyr Thr Asp Leu Tlir Pro Leu Ser Lys Phe Pro Ser Pro Glu 275 280 285

Tyr Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Tyr Lys Thr Lys Tyr Asn Leu Asp Leu 290 295 300 45- 95345.doc 200521237

Thr Asn Leu Asn Gin Pro Leu Leu Asp Val Asp His Thr Ser Ser Arg 305 310 315 320

Leu Asn Leu Leu Thr Pro Arg His Leu Asn Gin Lys Gly Lys Ala Leu 325 330 335

Pro Leu Ser Ser Ala Glu Lys Arg Lys Ala Lys Trp Glu Ser Leu Gin 340 345 350

Asn Lys Gin He Leu Val Pro Glu Leu Cys Ala lie His Pro lie Pro 355 360 365

Ala Ser Leu Trp Arg Lys Ala Val Cys Leu Pro Ser lie Leu Tyr Arg 370 375 380

Leu His Cys Leu Leu Thr Ala Glu Glu Leu Arg Ala Gin Thr Ala Ser 385 390 395 400

Asp Ala Gly Val Gly Val Arg Ser Leu Pro Ala Asp Phe Arg Tyr Pro 405 410 415

Asn Leu Asp Phe Gly Trp Lys Lys Ser lie Asp Ser Lys Ser Phe He 420 425 430

Ser lie Ser Asn Ser Ser Ser Ala Glu Asn Asp Asn Tyr Cys Lys His 435 440 445 95345.doc 46- 200521237

Ser Thr He Val Pro Glu Asn Ala Ala His Gin Gly Ala Asn Arg Thr 450 455 460

Ser Ser Leu Glu Asn His Asp Gin Met Ser Val Asn Cys Arg Thr Leu 465 470 475 480

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Tyr Lys Gin Glu lie Pro Val Gin Pro Thr Thr Ser Tyr Ser lie Gin 530 535 540

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Leu Leu Ser Asn Lys Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Asn Lys Ser Thr Ser 565 570 575

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Asn Gin Leu Asn Tyr Tyr Lys Gin Glu lie Pro Val Gin Pro Thr Thr 545 550 555 560

Ser Tyr Ser lie Gin Asn Leu Tyr Ser Tyr Glu Asn Gin Pro Gin Pro 565 570 575

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Asn Ser -61- 95345.doc <210〉 200521237 <211〉 3804 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉 <223〉編碼人類dicer突變體之基因 <400〉 19 atgaatcaca aagtgcatca tcatcatcat catatcgaag gtaggaattc gageteggta 60 cccgcctcca ttgttggtcc accaatgagc tgtgtacgat tggctgaaag agttgtcgct 120 ctcatttgct gtgagaaact gcacaaaatt ggcgaactgg atgaccattt gatgccagtt 180 gggaaagaga ctgttaaata tgaagaggag cttgatttgc atgatgaaga agagaccagt 240 gttccaggaa gaccaggttc cacgaaacga aggeagtget acccaaaagc aattccagag 300 tgtttgaggg atagttatcc cagacctgat cagccctgtt acctgtatgt gataggaatg 360 gttttaacta cacctttacc tgatgaactc aactttagaa ggeggaaget ctatcctcct 420 gaagatacca caagatgctt tggaatactg acggccaaac ccatacctca gattccacac 480 tttcctgtgt acacacgctc tggagaggtt accatatcca ttgagttgaa gaagtctggt 540 ttcatgttgt ctctacaaat gcttgagttg attacaagac ttcaccagta tatattetea 600 catattcttc ggcttgaaaa acctgcacta gaatttaaac ctacagacgc tgattcagca 660 tactgtgttc tacctcttaa tgttgttaat gactccagca ctttggatat tgactttaaa 720 ttcatggaag atattgagaa gtctgaagct egeataggea ttcccagtac aaagtataca 780 aaagaaacac cctttgtttt taaattagaa gattaccaag atgeegttat cattccaaga 840 -62- 95345.doc 900 200521237 tatcgcaatt ttgatcagcc tcatcgattt tatgtagctg atgtgtacac tgatcttacc ccactcagta aatttccttc ccctgagtat gaaacttttg cagaatatta taaaacaaag tacaaccttg acctaaccaa tctcaaccag ccactgctgg atgtggacca cacatcttca agacttaatc ttttgacacc tcgacatttg aatcagaagg ggaaagcgct tcctttaagc agtgctgaga agaggaaagc caaatgggaa agtctgcaga ataaacagat actggttcca gaactctgtg ctatacatcc aattccagca tcactgtgga gaaaagctgt ttgtctcccc agcatacttt atcgccttca ctgccttttg actgcagagg agctaagagc ccagactgcc agcgatgctg gcgtgggagt cagatcactt cctgcggatt ttagataccc taacttagac ttcgggtgga aaaaatctat tgacagcaaa tctttcatct caatttctaa ctcctcttca gctgaaaatg ataattactg taagcacagc acaattgtcc ctgaaaatgc tgcacatcaa ggtgctaata gaacctcctc tctagaaaat catgaccaaa tgtctgtgaa ctgcagaacg ttgctcagcg agtcccctgg taagctccac gttgaagttt cagcagatct tacagcaatt aatggtcttt cttacaatca aaatctcgcc aatggcagtt atgatttagc taacagagac ttttgccaag gaaatcagct aaattactao aagcaggaaa tacccgtgca accaactacc tcatattcca ttcagaattt atacagttac gagaaccagc cccagcccag cgatgaatgt actctcctga gtaataaata ccttgatgga aatgctaaca aatctacctc agatggaagt cctgtgatgg ccgtaatgcc tggtacgaca gacactattc aagtgctcaa gggcaggatg gattctgagc agagcccttc tattgggtac tcctcaagga ctcttggccc caatcctgga 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 95345.doc -63- 200521237 cttattcttc aggctttgac tctgtcaaac gctagtgatg gatttaacct ggagcggctt gaaatgcttg gcgactcctt tttaaagcat gccatcacca catatctatt ttgcacttac cctgatgcgc atgagggccg cctttcatat atgagaagca aaaaggtcag caactgtaat ctgtatcgcc ttggaaaaaa gaagggacta cccagccgca tggtggtgtc aatatttgat ccccctgtga attggcttcc tcctggttat gtagtaaatc aagacaaaag caacacagat aaatgggaaa aagatgaaat gacaaaagac tgcatgctgg cgaatggcaa actggatgag gattacgagg aggaggatga ggaggaggag agcctgatgt ggagggctcc gaaggaagag gctgactatg aagatgattt cctggagtat gatcaggaac atatcagatt tatagataat atgttaatgg ggtcaggagc ttttgtaaag aaaatctctc tttctccttt ttcaaccact gattctgcat atgaatggaa aatgcccaaa aaatcctcct taggtagtat gccattttca tcagattttg aggattttga ctacagctct tgggatgcaa tgtgctatct ggatcctagc aaagctgttg aagaagatga ctttgtggtg gggttctgga atccatcaga agaaaactgt ggtgttgaca cgggaaagca gtccatttct tacgacttgc acactgagca gtgtattgct gacaaaagca tagcggactg tgtggaagcc ctgctgggct gctatttaac cagctgtggg gagagggctg ctcagctttt cctctgttca ctggggctga aggtgctccc ggtaattaaa aggactgatc gggaaaaggc cctgtgccct actcgggaga atttcaacag ccaacaaaag aacctttcag tgagctgtgc tgctgcttct gtggccagtt cacgctcttc tgtattgaaa gactcggaat atggttgttt gaagattcca ccaagatgta tgtttgatca tccagatgca 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 95345.doc -64- 200521237 gataaaacac tgaatcacct tatatcgggg tttgaaaatt ttgaaaagaa aatcaactac agattcaaga ataaggctta ccttctccag gcttttacac atgcctccta ccactacaat actatcactg attgttacca gcgcttagaa ttcctgggag atgcgatttt ggactacctc ataaccaagc acctttatga agacccgcgg cagcactccc cgggggtcct gacagacctg cggtctgccc tggtcaacaa caccatcttt gcatcgctgg ctgtaaagta cgactaccac aagtacttca aagctgtctc tcctgagctc ttccatgtca ttgatgactt tgtgcagttt cagcttgaga agaatgaaat gcaaggaatg gattctgagc ttaggagatc tgaggaggat gaagagaaag aagaggatat tgaagttcca aaggccatgg gggatatttt tgagtcgctt gctggtgcca tttacatgga tagtgggatg tcactggaga cagtctggca ggtgtactat cccatgatgc ggccactaat agaaaagttt tctgcaaatg taccccgttc ccctgtgcga gaattgcttg aaatggaacc agaaactgcc aaatttagcc cggctgagag aacttacgac gggaaggtca gagtcactgt ggaagtagta ggaaagggga aatttaaagg tgttggtcga agttacagga ttgccaaatc tgcagcagca agaagagccc tccgaagcct caaagctaat caacctcagg ttcccaatag ctaa <210> 20 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工 <220〉

<223〉用以放大編碼rsGFP之基因的合成引子rsGFP-F 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3804 95345.doc -65- 200521237 <400> 20 gccacaacat tgaagatgga 20 <210〉 21 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223〉用以放大編碼rsGFP之基因的合成引子rsGFP-R <400> 21 20 20 gaaagggcag attgtgtgga <210> 22 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉 <223〉用以放大編碼之基因的合成引子Ne〇-F <400> 22 atagcgttgg ctacccgtga <210〉 23 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工 <220>

<223〉用以放大編碼Neo之基因的合成引子Neo-R 95345.doc 66- 200521237 <400〉 23 gaaggcgata gaaggcgatg 20 <210> 24 <211〉 42 <212> DNA 〈213>人工 <220〉 <223〉用以放大編碼螢光酶之基因的合成引子dsl-1 <400〉 24 42 42 gggtaatacg actcactata gggagaatgg aagacgccaa aa <210〉 25 <211〉 42 <212〉 DNA <213〉人工 <220〉 <223〉用以放大編碼螢光酶之基因的合成引子ds卜2 <400> 25 gggtaatacg actcactata gggagagaac gtgtacatcg ac <210〉 26 <211〉 34 <212> DNA 〈213〉人工 <220〉

<223〉用以放大編碼CspB之基因的合成引子E 95345.doc -67- 200521237 <400〉 26 gagcggataa catatgagag gaaaggttaa gtgg <210〉 27 <211〉 37 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223〉用以放大編碼CspB之基因的合成引子F <400〉 27 gagcggataa ggatccttac tcaactactt tcacgtg 68- 95345.doc

Claims (1)

1. 200521237 十、申請專利範圍： 1 · 一種具有dsRNA分解活性之蛋白質，其特徵在於具有作用 於dsRNA而生成特定長度的dsRNA之活性。 2. 如請求項1之蛋白質，其中該具有dsRNA分解活性之蛋白 質具有Dicer*之功能結構域。 3. 如請求項2之蛋白質，其中Dicer之功能結構域包含 RNasellla、b以及dsRNA結合結構域。 4·如請求項3之蛋白質，其更包含有PAZ結構域。 5. 如請求項1之蛋白質，其中該特定長度之dsRNA係具有約 15〜30鹼基對之dsRNA。 6. 如請求項1之蛋白質，其中該具有dsRNA分解活性之蛋白 質係包含序列表之序列號4或17所記載之胺基酸序列，或 包含經序列表之序列號3或16所記載之鹼基序列編碼之 胺基酸序列的蛋白質。 7. 如請求項1之蛋白質，其中該具有dsRNA分解活性之蛋白 質係包含序列表之序列號4或1 7所記載之胺基酸序列中 經取代、缺失、插入或附加一至複數個胺基酸之胺基酸 序列的蛋白質。 8. 一種如請求項1之具有dsRNA分解活性的蛋白質之製造方 法，其特徵在於：變換密碼子以成為適合於宿主中表現 者，或使用稀有密碼子經增強之宿主。 9· 一種如請求項1之具有dsRNA分解活性的蛋白質之製造方 法，其特徵在於：使用低溫誘導性載體表現該蛋白質。 "10· —種套組，其含有如請求項1之具有dsRNA分解活性的蛋 95345.doc 200521237 白質。 11 -禋⑽ΝΑ之分解方法，其特徵在於：於具有核酸^活 性之蛋白質的存在下，使具有dsRNA分解活性之蛋^作 用於dsRNA，從而生成特定長度之dsRNA。 、 12. 如請求項"之方法，其中具有核酸結合活性之蛋白質及 具有dsRNA分解活性之蛋白質係融合蛋白質。 13. 如請求項"之方法，其中具有核酸結合活性之蛋白質係 具有RNA結合活性之蛋白質。 、” 14·如請求項13之方法，其中具有RNA結合活性之蛋白質係 冷休克蛋白。 、 15.如請求項14之方法，其中冷休克蛋白來自嗜熱性菌㈣ 熱性菌。 16.如請求項15之方法，其中冷休克蛋㈣來自棲熱抱菌屬 (Themotoga maritima)之冷休克蛋白 B。 17·如請求項丨丨之方法，其中該特定長度之dsRNA為約15〜3〇 鹼基對的dsRNA。 18·如請求項U之方法，其中該具有dsRNA分解活性之蛋白質 係如請求項1至7中任一項的蛋白質。 19·如請求項U之方法，其中該具有dsRNA分解活性之蛋白質 係天然型Dicer或其功能性同效物。 20· —種RNA之合成方法，其特徵在於：於具有核酸結合活 性之蛋白質存在下，使用具有RNA合成活性之蛋白質進 行RNA合成反應。 21·如請求項20之方法，其中使用具有核酸結合活性之蛋白 95345.doc 200521237 質與具有RNA合成活性之蛋白質的融合蛋白質。 22. 如請求項20之方法，其中該具有核酸結合活性之蛋白質 係冷休克蛋白。 23. 如請求項22之方法，其中該冷休克蛋白來自嗜熱性菌或 财熱性菌。 24. 如請求項23之方法，其中該冷休克蛋白係來自棲熱孢菌 屬（Thermotoga maritima)之冷休克蛋白 B。 25. 如請求項20之方法，其中該具有RNA合成活性之蛋白質 .係DNA依存性RNA聚合酶。 26. —種用於如請求項11之方法中之組合物，其特徵在於： 含有具有核酸結合活性之蛋白質以及具有dsRNA分解活 性之蛋白質。 27. —種用於如請求項11之方法中之套組，其特徵在於：含 有具有核酸結合活性之蛋白質及具有dsRNA分解活性之 蛋白質。 28. —種用於如請求項20之方法中之組合物，其特徵在於： 含有具有核酸結合活性之蛋白質及具有RNA合成活性之 蛋白質。 29. —種用於如請求項20之方法中的套組，其特徵在於：含 有具有核酸結合活性之蛋白質以及具有RNA合成活性之 蛋白質。 95345.doc 200521237 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明: 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 95345.doc