KR20240036522A - RNA-가이드 CasΩ 뉴클레아제 및 진단 및 요법에서의 이의 용도 - Google Patents

RNA-가이드 CasΩ 뉴클레아제 및 진단 및 요법에서의 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CasΩ 뉴클레아제 및 적어도 하나의 표적 RNA에 결합하도록 설계된 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA를 포함하는 복합체를 기반으로 하는 dsDNA, ssDNA 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자의 RNA-유도된 절단 방법에 관한 것이다. 표적 RNA 분자에 결합된 본 발명의 복합체 뿐만 아니라, 핵산 분자의 절단을 위한 각각의 시스템, 및 이의 진단 및 치료적 용도를 추가로 제공한다.

Description

RNA-가이드 CasΩ 뉴클레아제 및 진단 및 요법에서의 이의 용도
본 발명은 CasΩ 뉴클레아제 및 적어도 하나의 표적 RNA에 결합하도록 설계된 적어도 하나의 미리 선택된 가이드(guide) RNA를 포함하는 복합체(complex)를 기반으로 하는 dsDNA, ssDNA 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자의 RNA-유도된 절단(cleaving) 방법에 관한 것이다. 표적 RNA 분자에 결합된 본 발명의 복합체 뿐만 아니라, 핵산 분자의 절단을 위한 각각의 시스템, 및 이의 진단 및 치료적 용도를 추가로 제공한다.
본 발명의 배경기술
거의 모든 고세균 및 박테리아의 약 절반은 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR)-CRISPR-연관 유전자 (Cas) 적응 면역계를 보유하고 있으며, 이는 핵산 게놈을 가진 바이러스 및 다른 외부 침입자로부터 원핵생물을 보호한다. CRISPR-Cas 시스템은 이펙터 복합체의 구성에 따라 기능적으로 클래스 1 및 클래스 2로 나누어진다. 클래스 2는 단일 이펙터 뉴클레아제로 구성되며, 타입 II, V, 및 VI CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템을 활용하여 게놈 편집(editing)의 통상적인 실행이 달성되었다. 타입 II 및 V는 주로 DNA 표적화에 사용되는 반면, 타입 VI은 RNA 표적화에만 사용된다 (예를 들어, [Koonin EV and Makarova KS Origins and evolution of CRISPR-Cas systems Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2019 May 13;374(1772):20180087] 참조).
타입 II 및 V Cas 이펙터 뉴클레아제는 일반적으로 표적 DNA 인식의 첫 번째 단계로 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)에 의존하며, 이펙터 뉴클레아제는 단백질-DNA 상호작용을 통해 PAM 서열에 직접 결합한 후, 이어서, 하류 DN서열을 언지핑한다. 이어서, 이펙터 단백질은 DNA 표적의 한 가닥과 CRISPR RNA (crRNA)의 가이드 부분 사이의 염기쌍 형성 정도를 조사한다. 상기 둘 사이의 충분한 상보성 표적 절단을 구동시킨다. PAM 서열은 시스템 사이 뿐만 아니라, 유사한 뉴클레아제 사이에서도 상당히 달라지는 것으로 알려져 있으며, Cas 단백질이 PAM 인식을 변경하도록 조작될 수 있는 것으로 나타났다 (문헌 [Collias, D., Beisel, C.L. CRISPR technologies and the search for the PAM-free nuclease. Nat Commun 12, 555 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20633-y]). DNA를 표적화하는 것 이외에도, 일부 타입 II 및 V 단일-이펙터 뉴클레아제, 예컨대, C. 제주니(C. jejuni) Cas9, N. 메닌지티디스(N. meningitidis) Cas9, S. 아우레우스(S. aureus) Cas9, 미배양 고세균으로부터의 Cas12f1, 및 Cas12g 또한 ssDNA 및/또는 RNA를 표적화하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [RNA-dependent RNA targeting by CRISPR-Cas9. Elife. 2018;7:e32724]; [DNase H Activity of Neisseria meningitidis Cas9. Mol Cell. 2015;60(2):242-255]; [Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes]; [Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems. Science. 2019;363:88-91]). 이러한 경우, PAM은 요구되지 않았다. 일부 뉴클레아제, 예컨대, S. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 (SpyCas9)는, 이중 가닥 PAM 영역을 생성하기 위해 올리고뉴클레오티드를 제공하면 SpyCas9가 단일 가닥 표적에 결합하여 절단할 수는 있었지만, SpyCas9는 ssDNA 또는 RNA를 바로 표적화할 수는 없었다 (문헌 [Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 2014;516(7530):263-266]).
Cas13 단백질, 예컨대, 렙토트리키아 샤히이(Leptotrichia shahii)의 Cas13a (이전 C2c2)는 DNA 대신 RNA에 결합하고, 그를 절단하고, PAM 대신 프로토스페이서 플랭킹 부위(Protospacer Flanking Site: PFS)에 결합한다. 생체내 연구에 따르면 표적 요소 측면에 위치하는(flanking) 반복 서열 (태그:안티 태그 쌍형성)과 확장된 상보성을 갖는 표적 RNA는 타입 VI-A Cas13a 시스템에 의한 RNA 절단을 극적으로 감소시킬 수 있으며, 이는 자기 RNA 표적과 비자기 RNA 표적을 표적화하고, 그 사이를 구별할 수 있는 Cas13a의 능력의 근간이 되는 분자 원리를 정의한다 (문헌 [Wang B, Zhang T, Yin J, Yu Y, Xu W, Ding J, Patel DJ, Yang H. Structural basis for self-cleavage prevention by tag:anti-tag pairing complementarity in type VI Cas13 CRISPR systems. Mol Cell. 2021 Mar 4;81(5):1100-1115.e5. doi: 10.1016/j.molcel.2020.12.033. Epub 2021 Jan 19. PMID: 33472057]).
본 발명의 맥락에서, 표적 RNA로부터 플랭킹 서열을 제거하면 절단 활성이 사라지고, 따라서, 플랭킹 서열은 CasΩ에 대해 활성화되며 또한 특정 서열이 필요한 것으로 보인다 (가이드 RNA 태그와의 상보성 결여 대비). 상기 플랭킹 서열의 역할은 다중-서브유니트 이펙터를 코딩하는 타입 III CRISPR-Cas 시스템에 대해 보고된 rPAM (RNA PAM의 경우)과 가장 밀접하게 관련되어 있다 (문헌 [Elmore JR, et al. Bipartite recognition of target RNAs activates DNA cleavage by the Type III-B CRISPR-Cas system. Genes Dev. 2016 Feb 15;30(4):447-59. doi: 10.1101/gad.272153.115. Epub 2016 Feb 4. PMID: 26848045; PMCID: PMC4762429] 참조). 따라서, 본 발명의 맥락에서, rPAM이라는 용어는 CasΩ를 활성화시키는 데 필요한, RNA 표적 측면에 위치하는 서열을 지정다. 본 발명자들은 CasΩ를 Cas12a2라고도 지칭한다.
(타입 V CRISPR-Cas 시스템 내의) Cas12 뉴클레아제는 DNA를 인식하고 절단하여 ssDNA 분해를 유도하는 것으로 알려져 있다. CRISPR-Cas9 시스템이 개발된 이후, 프레보텔라(Prevotella) 및 프란시셀라(Francisella) 1로부터의 CRISPR (Cpf1, 또는 Cas12a로도 공지), 및 Cas14 (최근 Cas12f로 분류)를 비롯한 다양한 CRISPR 시스템이 박테리아및 고세균에서 확인되었고; 이들 시스템이 각 도구가 고유한 유용성을 갖는 다양한 게놈 편집 도구 상자를 구성한다. CRISPR 게놈 편집 도구는 유전자-표적화 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제로 구성된다. 이 두 구성성분은 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)를 동반하는 표적 서열을 인식하고, 이어서, 프로토스페이서 영역 내부 또는 외부에서 이중 가닥 파단 (DSB)을 유도하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 형성한다.
US9790490B2에는 본 발명에 따른 CasΩ에 상응하는 Cas12a (타입 V)를 포함하는 Cas12a (Cpf1) 효소가 기술되어 있다.
최근, Cas12a는 또한 crRNA 매개의, ssDNA 또는 dsDNA의 특이적 결합시 비특이적 단일 가닥 DNA (ssDNA)도 분해하는 것으로 밝혀졌다. 더욱 최근에, FRET 및 저온 EM 실험에서는 Cas12a가 표적 결합 중에 일련의 체크포인트를 거쳐 결국에는 RuvC 도메인이 노출이 되고, 이는 먼저 비-표적 가닥을 커팅(cutting)한 후, 표적 가닥을 커팅하여 풀린 dsDNA 표적을 절단한 후, 이어서, 무차별적인 ssDNA 절단을 허용하면서 활성화된 상태로 그대로 유지되는 것으로 나타났다 (문헌 [Swarts DC, Jinek M. Mechanistic Insights into the cis- and trans-Acting DNase Activities of Cas12a. Mol Cell. 2019 Feb 7;73(3):589-600.e4. doi: 10.1016/j.molcel.2018.11.021. Epub 2019 Jan 10. PMID: 30639240; PMCID: PMC6858279]). US20200399697A1에는 Cas12a의 ssDNA의 부차적인 분해에 기초한 Cas12a의 진단 용도가 기술되어 있다.
(문헌 [Probing CRISPR-Cas12a Nuclease Activity Using Double-Stranded DNA-Templated Fluorescent Substrates. Biochemistry. 2020 Apr 21;59(15):1474-1481. doi: 10.1021/acs.biochem.0c00140. Epub 2020 Apr 7. PMID: 32233423; PMCID: PMC7384386]에서) 스미스 CW(Smith CW) 등은 표적 검출시 Cas12a 트랜스-절단 활성을 프로빙하기 위한 dsDNA 기질 (프로브-전체)을 보고하고 있다. dsDNA 특징이 교대로 나타나는 다양한 Cas12a 기질 세트를 디자인하고, 형광 분광법을 사용하여 연구하였다. 그들은 닉이 없는 프로브-전체가 닉을 포함하는 형태보다 더 우수한 트랜스-절단 성능을 보였다는 것을 관찰하였다. 프로브 성능을 평가하기 위해 염 농도, 표적 농도 및 미스매치 내성의 다양한 실험 조건을 조사하였다. Cas12a의 활성은 각각 타바코 컬리 슈트 바이러스(tobacco curly shoot virus: TCSV) 또는 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus: HepBV)에 대한 crRNA를 사용하여 TCSV 또는 HepBV 게놈으로부터 복사된 dsDNA 프레임에 대해 프로그래밍되었다. 온-타겟 활성이 10 pM dsDNA 표적만큼 적은 검출을 제공하는 반면, 오프-타겟 활성은 심지어 1 nM 대조군 DNA에서도 관찰되지 않았다. 이를 통해 Cas12a의 트랜스-절단이 ssDNA 기질에 제한되지 않고, Cas12a-기반 진단이 dsDNA 기질로 확장될 수 있다는 것이 입증되었다.
US10337051B2, US10494664B2, US10266887B2, 및 US20180340219A1에는 부차적인 RNase 활성을 갖는 RNA-표적화 뉴클레아제로서 Cas13a (C2c2), 시스템 및 진단적 사용 방법이 개시되어 있다.
(문헌 [The Versatile Type V CRISPR Effectors and Their Application Prospects, Frontiers in Cell and Developmental Biology, Vol. 8, 2021, p. 1835, DOI: 10.3389/fcell.2020.622103]에서) 바이송(Baisong, T.) 등은 단일 이펙터 단백질을 특징으로 하는, 클래스 2 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열 (CRISPR)-Cas 시스템은 타입 II, V, 및 VI으로 추가로 세분화될 수 있다고 개시하고 있다. 유전자 편집에서 서열 특이적 뉴클레아제로서 I타입 II CRISPR 이펙터 단백질 Cas9의 적용은 DNA 조작 분야에 혁명을 일으켰다. 유사하게, 타입 VI의 이펙터 단백질인 Cas13은 RNA 조작을 위한 편리한 도구를 제공한다. 추가로, 타입 V CRISPR-Cas 시스템은 다수의 서브타입 및 다양한 기능을 갖춘 또 다른 귀중한 리소스이다. 이의 리뷰에서는 지금까지 확인된 타입 V 패밀리의 모든 서브타입이 요약되어 있다. 따라서, 현재 타입 V 패밀리에 의해 제시된 기능에 따라 모든 주요 구성원을 대상으로 생명공학 분야의 기능 원리, 현재 적용 상태 및 개발 전망을 소개하고자 한다.
본 발명의 목적은 유전자 편집 및 요법 뿐만 아니라, 분자 진단 분야를 위한 상기로부터 비롯된 추가 도구를 제공하는 것이다. 다른 목적 및 이점은 첨부된 실시예를 참조하여 본 명세서를 추가로 연구하면 명백해질 것이다.
이의 제1 측면에서, 본 발명의 목적은 a) 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소를 제공하는 단계, b) 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA를 제공하는 단계, c) 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이에 복합체를 형성하는 단계, d) 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA에 기초하여 c)의 복합체를 표적 RNA에 결합시키는 단계, 및 e) 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소에 의해 dsDNA, ssDNA, 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자를 절단하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인, dsDNA, ssDNA, 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자를 절단하기 위한 방법을 제공함으로써 해결된다.
이의 제2 측면에서, 본 발명의 목적은 CasΩ 뉴클레아제, 및 적어도 하나의 표적 RNA에 결합하도록 설계된 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA를 포함하는 복합체를 제공함으로써 해결된다. 상기 가이드 RNA와 적어도 90% 상보적인 가이드 서열을 갖는, 표적 RNA 분자에 추가로 결합한, 본 발명에 따른 복합체로서, 여기서 상기 표적 RNA는 바람직하게, 적어도 하나의 RNA 프로토스페이서 인접 모티프 (RNA protospacer-adjacent motif; rPAM)가 측면에 위치하는 것인 복합체가 바람직하다. 한 실시양태에서, rPAM은 바람직하게, 표적의 3' 단부 측면에 위치하고, A가 풍부한 서열이다. 또 다른 실시양태에서, rPAM은 5'-BAAA-3'이다.
이의 제3 측면에서, 본 발명의 목적은 a) 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 ssDNA, dsDNA 또는 RNA 리포터(reporter) 핵산을 제공하는 단계, b) 상기 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플을, 바람직하게, 상기와 같은 본 발명에 따른 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이의 적어도 하나의 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 단계, 및 c) 상기 적어도 하나의 ssDNA, dsDNA 또는 RNA 리포터 핵산의 절단, 커팅 및/또는 니킹(nicking)을 검출하는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 리포터 핵산의 절단이 검출된다면, 상기 세포, 조직, 세포 핵 및/또는 샘플 중 상기 적어도 하나의 표적 RNA가 검출되는 것인 단계를 포함하는, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA를 검출하기 위한 방법을 제공함으로써 해결된다.
이의 제4 측면에서, 본 발명의 목적은 a) 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플을, b) 바람직하게, 상기와 같은 본 발명에 따른 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이의 적어도 하나의 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 적어도 하나의 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 단계, 및 c) b)의 복합체를 적어도 하나의 표적 RNA에 결합시켜 적어도 하나의 표적 RNA의 안정성, 프로세싱(processing), 또는 번역을 변경시키는 단계를 포함하고, 이로써, c)에서의 결합이 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 발현을 조정하는 것인, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 발현을 조정하기 위한 방법으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 mRNA, 비-코딩(non-coding) RNA 및 바이러스 RNA 분자로부터 선택되는 것인 방법을 제공함으로써 해결된다.
이의 제5 측면에서, 본 발명의 목적은 a) 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플을, b) 바람직하게, 상기와 같은 본 발명에 따른 적어도 하나의 RNA 변형 효소와 복합체화된 적어도 하나의 변형되고 촉매 불활성인 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이의 적어도 하나의 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 적어도 하나의 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 단계, 및 c) b)의 복합체를 적어도 하나의 표적 RNA에 결합시키고, 상기 적어도 하나의 RNA 변형 효소에 의해 적어도 하나의 표적 RNA를 편집하는 단계를 포함하는, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 서열을 편집하기 위한 방법으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 mRNA, 비-코딩 RNA 및 바이러스 RNA 분자로부터 선택되는 것인 방법을 제공함으로써 해결된다.
이의 제6 측면에서, 본 발명의 목적은 질환의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한, 예컨대, 예를 들어, 감염 및/또는 유전적 장애(genetic disorder), 예컨대, 증식성 장애, 예컨대, 암, 진균, 원생동물, 박테리아 및/또는 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 복합체를 제공함으로써 해결된다.
이의 제7 측면에서, 본 발명의 목적은 바람직하지 않은 세포를 본 발명에 따른 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 가이드 RNA는 상기 바람직하지 않은 세포가 불활성화되도록 특이적으로 선택되는 것인, 바람직하지 않은 세포를 특이적으로 불활성화시키는 방법을 제공함으로써 해결된다. 본 방법은 바람직하게, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 편집되지 않고 그대로 유지되는 세포를 선택하는 데 사용될 수 있다.
이의 제8 측면에서, 본 발명의 목적은 질환 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체(subject)에게 유효량의 본 발명에 따른 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 예컨대, 예를 들어, 감염 및/또는 유전적 장애, 예컨대, 증식성 장애, 예컨대, 암, 진균, 원생동물, 박테리아 및/또는 바이러스 감염, 자가면역 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법을 제공함으로써 해결된다.
이의 제9 측면에서, 본 발명의 목적은 적합하게는 상기 제제에 유효량의 본 발명에 따른 복합체를 투여하여 바람직하지 않은 오염 물질을 제거하고/거나, 감소시키는 단계를 포함하는, 제제에서 바람직하지 않은 오염 물질, 예컨대, 진균, 원생동물, 박테리아 및/또는 바이러스 오염을 오염제거(decontaminating)하는 방법을 제공함으로써 해결된다.
이의 제10 측면에서, 본 발명의 목적은 dsDNA, ssDNA, 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자를 절단하기 위한, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA를 검출하기 위한, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 발현을 조정하기 위한, 세포, 조직, 세포 핵 중 적어도 하나의 표적 RNA의 서열을 편집하기 위한, 바람직하지 않은 세포 또는 바이러스를 특이적으로 불활성화시키기 위한, 또는 제제에서 바람직하지 않은 오염 물질을 오염제거하기 위한, 본 발명에 따른 복합체의 용도를 제공함으로써 해결된다.
상기 언급된 바와 같이, 이의 제1 측면에서, 본 발명의 목적은 a) 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소를 제공하는 단계, b) 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA를 제공하는 단계, c) 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이에 복합체를 형성하는 단계, d) 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA에 기초하여 c)의 복합체를 표적 RNA에 결합시키는 단계, 및 e) 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소에 의해 dsDNA, ssDNA, 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자를 절단하는 단계를 포함하는, dsDNA, ssDNA, 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자를 절단하기 위한 방법을 제공함으로써 해결된다. 바람직하게, 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 가이드 서열을 포함한다.
본 발명은 가이드 RNA를 이용하여 RNA PAM (rPAM)이 측면에 위치하는 상보적 RNA 서열(들)을 인식하여 단일 가닥 DNA (ssDNA), 이중 가닥 DNA (dsDNA), 및 RNA를 비롯한 핵산의 비-특이적 분해 (절단, 커팅 또는 니킹)를 유도하는 본원에서 CasΩ로 (및 Cas12a2로도 또한) 지정된 CRISPR 뉴클레아제에 의한 RNA 표적 서열의 검출에 기초한다. 확립된 Cas 뉴클레아제 Cas12a와의 구조적 유사성을 고려할 때 CasΩ는 DNA를 표적화하는 것으로 추정되었다.
RNA 인식 및 유발된 부차적 ssDNA, dsDNA 및 RNA 분해 뿐만 아니라, rPAM 인식의 조합은 공지된 Cas 뉴클레아제 중에서 독특다. 이는 분자 진단에 사용되는 다른 Cas 뉴클레아제에 비해 분명한 이점을 제공하고, RNA 간섭 및 RNA 편집을 달성하는 고유한 수단을 제공하며, 서열 특이적 역선택 및 박테리아, 고세균 및 진핵생물의 사멸 및 DNA 및 RNA 바이러스의 제거에서의 첫 적용을 연다.
(문헌 [Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71. doi: 10.1016/j.cell.2015.09.038. Epub 2015 Sep 25. PMID: 26422227; PMCID: PMC4638220]에서) 체체(Zetsche) 등은 추정 클래스 2 CRISPR 이펙터인 Cpf1의 특징화를 보고하고 있다. 그들은 Cpf1이 Cas9와는 뚜렷이 다른 특징으로 강건한 DNA 간섭을 매개한다는 것을 입증한다. Cpf1은 tracrRNA가 결여된 단일 RNA-가이드 엔도뉴클레아제이며, T가 풍부한 프로토스페이서-인접 모티프를 이용한다. 또한, Cpf1은 엇갈린 DNA 이중 가닥 파단을 통해 DNA를 절단한다. 16개의 Cpf1 패밀리 단백질 중에서 그들은 인간 세포에서 효율적인 게놈 편집 활성을 갖는 아시다미노코쿠스(Acidaminococcus) 및 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae)로부터의 두 후보 효소를 확인하였다. CasΩ 효소는 술푸리쿠르붐_sp_PC08-66(Sulfuricurvum_sp_PC08-66)으로부터 개시되어 있다.
(문헌 [Characterization and validation of a novel group of Type V, Class 2 nucleases for in vivo genome editing. 2017. bioRxiv, pp.1-9]에서) 베게만 M.B.(Begemann, M.B.) 등은 식물의 효소 및 게놈 편집에 대한 몇 가지 증거를 제시한다. 본 발명자들의 맥락에서 생성된 바와 같은 결과에 따르면, 관찰된 게놈 결실은 DNA 표적화로 인한 것이 아니라, 오히려 RNA 표적화에 대한 반응으로 이루어진 정제 선택의 결과인 것으로 보인다.
(문헌 [Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here? 2018. The CRISPR journal, 1(5), pp.325-336]에서) 마카로바, K.S.(Makarova, K.S.) 등은 CasΩ가 아닌 것으로 보이는 다른 두 개의 뉴클레아제와 함께 그룹화된, Sm 클레이드 (KFO67988.1)로부터의 CasΩ를 Cas12a 변이체로 개시하고 있다.
(문헌 [Novel Type V-A CRISPR Effectors Are Active Nucleases with Expanded Targeting Capabilities. 2020. The CRISPR journal, 3(6), pp.454-461]에서) 알리아가 골츠만, D.S.(Aliaga Goltsman, D.S.) 등은 Sm 클레이드로부터의 다수의 CasΩ 뉴클레아제를 Cas12a, 즉, Cas12a-M60-3, Cas12a-M60-1, Cas12a-M60-8, Cas12a-M60-9, Cas12a-M26-5, Cas12a-M26-14, 및 Cas12a-M26-15로 분류하였다.
US 2019/0048357 (이는 그 전문이 참조로 포함된다)에는 진핵 세포, 바람직하게, 식물 세포의 게놈 중 표적 부위에서 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법이 개시되어 있다. 이를 통해, Cms1 폴리펩티드, 또는 Cms1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 DNA-표적화 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 DNA-표적화 RNA를 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드 (여기서 DNA-표적화 RNA는 (a) 표적 DNA 중의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 세그먼트; 및 (b) Cms1 폴리펩티드와 상호작용하는 제2 세그먼트를 포함한다)가 세포 내로 도입된다. 이어서, 본 방법은 상기 표적 부위에서 상기 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 것을 필요로 하고, 여기서 상기의 진핵 세포 게놈은 핵, 색소체 또는 미토콘드리아 게놈이다.
US 2019/0048357의 도 1은 명시된 타입 V 뉴클레아제 아미노산 서열의 RuvC 고정 MUSCLE 정렬로부터 작성된 계통수를 보여주는 것이다. Sm-타입, Sulf-타입, 및 Unk40-타입 Cms1 뉴클레아제가 도시되어 있다. 이어서, 도 2는 Sm-타입 Cms1 단백질 간에 공유되는 아미노산 모티프의 요약을 보여주는 것이다. 상자 1-10에서 웹로그 수치는 각각 US 2019/0048357의 서열 번호: 177-186에 상응하고, SmCms1 단백질 상의 이의 위치 (US 2019/0048357의 서열 번호: 10)가 제시되어 있다. 도 3은 Sulf-타입 Cms1 단백질 간에 공유되는 아미노산 모티프의 요약을 보여주는 것이다. 상자 1-17에서 웹로그 수치는 각각 US 2019/0048357의 서열 번호: 288-289 및 서열 번호: 187-201에 상응하고, SulfCms1 단백질 상의 이의 위치 (US 2019/0048357의 서열 번호: 11)가 제시되어 있다.
도 4는 Unk40-타입 Cms1 단백질 간에 공유되는 아미노산 모티프의 요약을 보여주는 것이다. 박스 1-7에서 웹로그 수치는 각각 서열 번호: 290-296에 상응하고, Unk40Cms1 단백질 상의 이의 위치 (서열 번호: 68)가 제시되어 있다.
따라서, Sm-타입 Cms1 단백질 및 Sulf-타입 Cms1 단백질 뿐만 아니라, Unk40-타입 Cms1 형태의 US 2019/0048357에는 본 발명에 따른 CasΩ 뉴클레아제의 바람직한 예가 개시되어 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, CasΩ 뉴클레아제 또는 CasΩ 뉴클레아제 효소라는 용어는 적어도 하기 특징을 나타내는 Cas 뉴클레아제 폴리펩티드 또는 이의 각각의 기능적 단편을 포함하여야 한다;
a) 적어도 하나의 RuvC 모티프, 더욱 바람직하게, 2개의 RuvC 모티프, 더욱 바람직하게, 3개의 RuvC 모티프로 구성된 RuvC 도메인을 포함하고, 바람직하게, HNH 또는 HEPN 도메인은 포함하지 않는 CRISPR-연관 단일-이펙터 뉴클레아제 효소,
b) 비-CasΩ 뉴클레아제와 비교하여 3개의 모티프 중 하나의 아미노산 삽입을 포함하는 RuvC-I과 RuvC-II 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성,
c) 비-CasΩ 뉴클레아제와 비교하여 아미노산의 결실을 포함하고, Zn-핑거 도메인으로 대체된 RuvC-II와 RuvC-III 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성,
d) 보조 인자 없이 (즉, tracrRNA 및/또는 RNase III 없이) CRISPR RNA 반복부를 프로세싱할 수 있는 뉴클레아제의 능력,
e) 뉴클레아제는 단일 가닥 RNA를 이의 고유한 핵산 표적으로 인식하고,
f) 뉴클레아제는 천연적으로 rPAM이 측면에 위치하는 RNA를 표적화하고,
f) RNA의 인식은 ssRNA, ssDNA, 및/또는 dsDNA의 비-특이적 (비-서열 특이적) 절단을 유도한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 CasΩ 뉴클레아제 또는 CasΩ 뉴클레아제 효소는 또한 US 2019/0048357에 개시된 바와 같은 서열 번호: 10 또는 11 또는 68로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 50%, 바람직하게, 적어도 70, 더욱 바람직하게, 적어도 80%, 더욱 바람직하게, 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게, 적어도 95%의 동일성을 갖고, RNA-의존성 CasΩ 뉴클레아제 활성을 갖는, 즉, dsDNA, ssDNA, 및/또는 RNA를 비-특이적으로 절단하는 폴리펩티드를 포함하여야 한다.
효소들 중 Su-클레이드의 CasΩ 뉴클레아제 또는 CasΩ 뉴클레아제 효소 (도 1 참조)가 바람직하며, 이는 US 2019/0048357에 개시된 바와 같은 서열 번호: 11에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 더욱 바람직하게, 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게, 적어도 95%의 동일성을 갖고, RNA-의존성 CasΩ 뉴클레아제 활성을 갖는, 즉, dsDNA, ssDNA, 및/또는 RNA를 비-특이적으로 절단하는 폴리펩티드를 포함한다.
CasΩ 뉴클레아제 아미노산 서열 정렬을 검사하여 이들 뉴클레아제 중에서 잘 보존된 단백질 서열 내의 모티프를 확인하였다. CasΩ 뉴클레아제는 도 1에 제시된 계통수에서 잘 분리된 3개의 클레이드에서 발견된 것으로 관찰되었다. 이들 클레이드 중 하나는 Sm CasΩ (US 2019/0048357에 개시된 서열 번호: 10)를 포함하고, 또 다른 하나는 Su CasΩ (US 2019/0048357에 개시된 서열 번호: 11)를 포함하며, 세 번째는 Unk40 (US 2019/0048357에 개시된 서열 번호: 68)을 포함한다. 따라서 이들 각 클레이드의 구성원은 이들 뉴클레아제 중에서 부분적으로 및/또는 완전히 보존된 아미노산 모티프를 확인하기 위해 별도로 정렬되었다. Sm CasΩ 뉴클레아제 정렬의 경우, US 2019/0048357에 개시된 서열 번호: 10, 20, 23, 30, 32-34, 37-39, 41, 43, 44, 46-60, 67, 154-156, 208-211, 222, 223, 225, 228, 229, 232, 234, 236, 237, 241, 243, 245, 248, 250, 251, 253, 및 254가 정렬되었다. Su CasΩ 뉴클레아제 정렬의 경우, US 2019/0048357에 개시된 서열 번호: 11, 21, 22, 31, 35, 36, 40, 42, 45, 61-66, 69, 227, 230, 231, 235, 239, 240, 242, 244, 및 247이 정렬되었다. Unk40 CasΩ 뉴클레아제 정렬의 경우, US 2019/0048357에 개시된 서열 번호: 68, 224, 226, 233, 238, 246, 249, 및 252가 정렬되었다. 이들 정렬은 US 2019/0048357에서 MUSCLE을 사용하여 수행되었으며, 생성된 정렬을 수동으로 검사하여 모든 정렬된 단백질 중에서 보존을 보인 영역을 확인하였다.
본 서열 번호: 32 내지 67에 제시된 아미노산 (모티프)은 Sm CasΩ 뉴클레아제의 정렬로부터 확인되었고; 본 서열 번호: 16 내지 31에 제시된 아미노산 모티프는 Su CasΩ 뉴클레아제의 정렬로부터 확인되었고; 본 서열 번호: 1 내지 15에 제시된 아미노산 모티프는 ca40 (Unk40) CasΩ 뉴클레아제의 정렬로부터 확인되었다. Sm CasΩ, 및 Su CasΩ 단백질 서열에서 이러한 보존된 모티프의 위치를 보여주는 개략적 다이어그램은 도 2 내지 4에 제시되어 있다.
본 발명에 따른 뉴클레아제는 또한 하기 (추가) 특징에 기초하여 구별/그룹화될 수 있다. 본 발명에 따른 SuCasΩ 뉴클레아제의 특히 바람직한 서브군, 특히, 서열 번호: 16 내지 31에 제시된 바와 같은 것은 한 식별 특징으로서 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 아미노산 결실을 포함하는, RuvC-II와 RuvC-III 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다 (도 2 또한 참조). 본 발명에 따른 SmCasΩ 뉴클레아제의 서브군, 특히, 서열 번호: 32 내지 67에 제시된 바와 같은 것은 한 식별 특징으로서 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 아미노산의 Zn-핑거 도메인으로의 대체를 포함하는, RuvC-II와 RuvC-III 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다. 마지막으로, 본 발명에 따른 ca40CasΩ 뉴클레아제의 서브군, 특히, 서열 번호: 1 내지 15에 제시된 바와 같은 것은 한 식별 특징으로서 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 아미노산의 Zn-핑거 도메인으로의 대체를 포함하는, RuvC-II와 RuvC-III 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다.
본 발명에 따라 사용되고, 본 발명에 따른 특히 바람직한 CasΩ 뉴클레아제 효소는 하기 표에 제시된 바와 같이 확인되었다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
뉴클레아제에 대한 RuvC 모티프의 위치는 하기와 같이 확인되었다:
Figure pct00007
Figure pct00008
이어서, 본 발명에 따른 방법은 적어도 하나의 표적 RNA에 결합하도록 설계된 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA를 제공한다. 표적 RNA의 성공적인 결합 및 인식은 DNA 및 RNA와 같은 핵산의 분해를 유도하는 신호를 제공한다.
하이브리드화하는 본 발명의 방법에 사용되는 핵산 분자의 파트는 서로 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적이다. 따라서, 바람직하게, rPAM을 제외하고, 표적 RNA와 특이적으로 하이브리드화하는 상기 가이드 RNA의 상기 부분/파트의 뉴클레오티드 서열은 표적 RNA와 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적이도록 생성 및/또는 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 핵산 분자의 특정 부분은 다른 분자의 상보적인 부분과 특이적으로 하이브리드화하는 것으로 발견되고/거나, 그러하도록 설계된다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 이를 위해서는 하이브리드화 및 세척 조건이 중요하다. 서열이 100% 상보적일 경우, 이때 높은 엄격도 하이브리드화가 수행될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 따르면, 하이브리드화 및/또는 특이적으로 하이브리드화하는 부분은 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적이다. 하이브리드화의 엄격도는 하이브리드화 온도 및 하이브리드화 완충제 중의 염 농도에 따라 결정되며, 온도가 높고, 염도가 낮을수록 더 엄격하다. 일반적으로 사용되는 세척액은 SSC (시트르산나트륨 염수, Na시트레이트와 NaCl의 혼합물)이다. 하이브리드화는 용액에서 수행될 수 있거나, 또는 더욱 일반적으로는 적어도 하나의 구성성분이 고체상 지지체, 예컨대, 니트로셀룰로오스 페이퍼 위에 있을 수 있다. 빈번하게 사용되는 프로토콜은 예컨대, 무지방 분유로부터의 카제인 또는 우혈청 알부민과 같은 차단 시약을 종종 변성되고 단편화된 연어 정자 DNA (또는 복잡도가 높은 임의의 다른 이종 DNA) 및 예컨대, SDS와 같은 세제와 결합하여 사용한다. 종종 매우 높은 농도의 SDS가 차단제로 사용된다. 온도는 42 내지 65℃ 또는 그 초과일 수 있으며, 완충제는 최종적으로는 3X SSC, 25 mM HEPES, pH 7.0, 0.25% SDS일 수 있다.
적어도 하나의 표적 RNA에 결합하도록 설계된 상기 미리 선택된 가이드 RNA의 상기 부분은 15개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게, 18개 이상의 뉴클레오티드, 및 더욱 바람직하게, 약 20개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 표적 RNA와 특이적으로 하이브리드화하는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다. 바람직한 범위는 15 내지 30개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게, 18 내지 25개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게, 20 내지 24개의 뉴클레오티드이다. 복합체의 하이브리드화 부분 (가이드의 3')에 대한 확장이 가능하고, 바람직하며, 복합체를 보다 안정적으로 형성하는 이점을 제공한다.
표적 RNA가 rPAM (상기 참조)을 포함하는 본 발명에 따른 방법이 추가로 바람직하다. 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 rPAM 부위의 더 넓은 패널을 인식하기 위해, 예컨대, Cas의 상호작용 (PI) 도메인의 핵심 영역을 관련 Cas 오솔로그 패널 중의 상응하는 영역으로 대체함으로써 변형될 수 있다 (예를 들어, Cas9의 경우, 문헌 [Ma et al., Engineer chimeric Cas9 to expand PAM recognition based on evolutionary information. Nat Commun. 2019 Feb 4;10(1):560. doi: 10.1038/s41467-019-08395-8] 참조). 이는 세포에서 가능한 RNA 표적을 확장시킨다.
본 발명에 따른 방법의 다음 단계에서, 상기와 같이 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이에 형성된 복합체는 상기 언급된 바와 같이 미리 선택된 가이드 RNA에 대해 설계된 서열을 기반으로 표적 RNA에 결합된다. CasΩ 효소는 표적 핵산을 절단할 수 있는 이의 능력과는 독립적으로 표적 핵산에 결합하고, 이러한 유연성은 상기 적어도 하나의 표적 RNA에 결합하기 위해 사용된다.
본 발명의 맥락에서, 표적 RNA는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 절단을 유발하고/거나, 검출되는 트리거로서 사용되는 관심의 대상이 되는 임의의 RNA이다. 일반적으로 및 바람직하게, 표적 RNA는 단일 가닥 RNA 분자, 예컨대, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 전달 RNA, 소형 RNA, 안티센스 RNA, 소형 핵소체 RNA, 마이크로RNA, piwiRNA, 긴 비-코딩 RNA, 스플라이싱된 인트론, 및 고리형 RNA이다. RNA는 자연 기원일 수 있거나, 인공적으로 생산될 수도 있다. 단일 가닥 감지 RNA는 인간 세포, 동물 세포, 식물 세포, 암성 세포, 감염된 세포, 또는 이환된 세포로부터의 것일 수 있고/거나, 바이러스, 기생충, 연충, 진균, 원생동물, 박테리아, 또는 병원성 박테리아로부터 유래될 수 있다. 표적 RNA는 본 발명의 방법에서 생성되고, 사용되는 (비-자연적으로 발생된) 가이드 RNA의 부분과 특이적으로 하이브리드화하는 서열을 포함한다.
상기 가이드 RNA가 박테리아에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 바이러스에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 진균에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 원생동물에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 유전적 장애에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 및 증식성 장애에 대해 특이적이도록 선택된 서열을 포함하는 것인 본 발명에 따른 복합체가 바람직하다. 일반적으로, 상기 서열은 상기 표적 RNA에 대한 상보체 또는 부분 상보체이다.
본 발명에 따른 방법의 마지막 단계에서, 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소는 dsDNA, ssDNA, 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자를 절단 (즉, 즉, 커팅, 절단 및/또는 니킹)한다. 상기 언급된 표적 RNA에 대한 특이적인 RNA 결합의 "트리거"와 달리, 뉴클레아제 활성은 비-특이적이다. RNA 유발 비-특이적 RNase 활성을 보유하는 Cas13a(C2c2), 및 dsDNA 유발 비-특이적 ssDNase 활성을 보유하는 타입 V 이펙터 단백질, Cas12a와 같은 다른 Cas 뉴클레아제와 달리, 본 Cas-뉴클레아제 CasΩ는 RNA 유발 비-특이적 뉴클레아제 활성을 보유한다 (또한 문헌 [Varble A, Marraffini LA. Three New Cs for CRISPR: Collateral, Communicate, Cooperate. Trends Genet. 2019;35(6):446-456. doi:10.1016/j.tig.2019.03.009] 참조).
본 발명에 따른 방법은 생체내 또는 시험관내에서, 예를 들어, 유기체, 세포, 조직 및/또는 핵과 같은 이의 파트에서, 또는 진단 검정법과 같은 시험관내 검정법에서 수행될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 이의 제2 측면에서, 본 발명의 목적은 CasΩ 뉴클레아제, 및 바람직하게, 적어도 하나의 표적 RNA에 결합하도록 설계된 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA를 포함하는 복합체를 제공함으로써 해결된다. 상기 가이드 RNA와 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적인 서열을 갖는, 표적 RNA 분자에 추가로 결합한, 본 발명에 따른 복합체로서, 여기서 상기 표적 RNA는 바람직하게, 적어도 하나의 rPAM이 측면에 위치하는 것인 복합체가 바람직하다.
CasΩ 뉴클레아제는 상기 언급된 효소 뿐만 아니라, 본원에 개시된 RNA-의존성 뉴클레아제 활성을 유지하는 이의 단편, 즉, 적어도 RuvC 도메인을 유지하는 단편으로부터 선택될 수 있다. CasΩ 뉴클레아제의 폴리펩티드는 의도된 용도에 따라, 예컨대, 생체내 또는 시험관내에서 제공될 수 있으며, 합성적으로 생산되고, 시험관내 전사에 의해 생성되고/거나, 플라스미드로 클로닝된다. 효소는 정제된 또는 본질적으로 정제된 단리된 효소 제제로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 복합체는 또한 CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, 기술된 바와 같이 2개 또는 3개 이상의 뉴클레아제 또는 이의 단편의 혼합물에 의해 제조될 수 있다.
따라서, 사용되는 CasΩ 폴리펩티드는 야생형 CasΩ 폴리펩티드, 변형된 CasΩ 폴리펩티드, 또는 야생형 또는 변형된 CasΩ 폴리펩티드의 단편일 수 있다. CasΩ 폴리펩티드는 핵산 결합 친화성 및/또는 특이성을 증가시키고/거나, 효소 활성을 변경시키고/거나, 단백질의 또 다른 특성을 변경하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, CasΩ 폴리펩티드의 뉴클레아제 (즉, DNase, RNase) 도메인은 변형, 결실 또는 비활성화될 수 있다. 대안적으로, CasΩ 폴리펩티드는 단백질의 기능, 즉, 바람직하게, RNA-의존성 뉴클레아제 활성에 필수적이지 않은 도메인을 제거하기 위해 말단절단될 수 있다.
본원에서는 CasΩ 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. CasΩ 폴리펩티드는 가이드 RNA에 의해 표적 부위로 지시될 수 있으며, 상기 표적 부위에서 이펙터 도메인은 표적화된 핵산 서열을 변형시키거나, 또는 영향을 미칠 수 있다. 이펙터 도메인은 절단 도메인, RNA 변형 도메인, 번역 활성화 도메인, 번역 리프레서 도메인, 프로세싱/스플라이싱 인자, RNA 국재화에 영향을 미치는 도메인, 또는 이들 기능 중 임의의 것에 영향을 미치는 단백질을 동원하는 도메인일 수 있다. 융합 단백질은 핵 국재화 신호, 색소체 신호 펩티드, 미토콘드리아 신호 펩티드, 다수의 세포내 위치로 단백질 수송이 가능한 신호 펩티드, 세포-투과 도메인, 또는 마커 도메인으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 이 중 임의의 것은 융합 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다. CasΩ 폴리펩티드는 융합 단백질의 N-말단, C-말단에, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다. CasΩ 폴리펩티드는 이펙터 도메인에 직접 융합될 수 있거나, 또는 링커를 이용하여 융합될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, CasΩ 폴리펩티드를 이펙터 도메인과 융합시키는 링커 서열의 길이는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50개의 아미노산 길이일 수 있다. 예를 들어, 링커의 길이는 1-5, 1-10, 1-20, 1-50, 2-3, 3-10, 3-20, 5-20 또는 10-50개의 아미노산 길이 범위일 수 있다. CasΩ 폴리펩티드는 또한 결합 도메인을 통해 이펙터를 동원할 수도 있다.
상기 뉴클레아제가 핵 국재화 신호를 포함하는 본 발명에 따른 복합체가 바람직하다. 핵 국재화 신호를 포함하는 상기 융합 뉴클레아제 및 이와 함께 형성된 본원에 기술된 복합체는 본 발명의 다른 실시양태이다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질의 CasΩ 폴리펩티드는 야생형 CasΩ 단백질로부터 유래될 수 있다. CasΩ 유래 단백질은 변형된 변이체 또는 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, CasΩ 폴리펩티드는 뉴클레아제 활성이 감소되거나, 또는 제거된 뉴클레아제 도메인 (예컨대, RuvC 또는 RuvC 유사 도메인)을 함유하도록 변형될 수 있다. 뉴클레아제 도메인은 공지된 방법, 예컨대, 부위 지정 돌연변이유발법, PCR 매개 돌연변이유발법, 및 전체 유전자 합성 뿐만 아니라, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 하나 이상의 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 및/또는 치환 돌연변이에 의해 변형될 수 있다.
이어서, 복합체 또는 복합체들은 바람직하게, 적어도 하나의 표적 RNA에 결합하도록 특이적으로 설계된 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA를 포함한다. 가이드 RNA의 서열(들)을 디자인하고, 선택하는 방법은 일반적으로 표적 RNA의 서열 및 검정 조건에 따라 달라지고; 상기 서열을 디자인하고 선택하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
상기 가이드 RNA 분자가 표적 RNA와 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적인 서열을 포함하고, 여기서 상기 표적 RNA가 바람직하게, 적어도 하나의 rPAM이 측면에 위치하는 것인 본 발명에 따른 복합체가 바람직하다. 가이드 RNA는 원하는 대로 분자에서 서열을 생성하기 위해 이후에 변형되는 자연적으로 발생된 서열로부터 유래된 적어도 하나의 표적 RNA에 결합하도록 디자인될 수 있다. 가이드 RNA는 예컨대, 표지(label) 또는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대, 이노신 등과 같은 추가 변형을 추가로 포함할 수 있다. 자연적으로 발생된 및/또는 비-자연적으로 발생된 가이드 RNA, 둘 모두의 경우에서, 이는 표준 방법에 따라 생산될 수 있고, 예컨대, 합성에 의해 생산될 수 있고/거나, 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있고/거나, 플라스미드 또는 플라스미드 또는 다른 적합한 벡터로 클로닝될 수 있다.
하이브리드화하는 본 발명의 방법에 사용되는 핵산 분자의 파트는 서로 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적이다. 따라서, 표적 RNA와 특이적으로 하이브리드화하는 상기 가이드 RNA의 상기 부분/파트의 뉴클레오티드 서열은 표적 RNA와 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적이도록 생성 및/또는 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 핵산 분자의 특정 부분은 다른 분자의 상보적인 부분과 특이적으로 하이브리드화하는 것으로 발견되고/거나, 그러하도록 설계된다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 이를 위해서는 하이브리드화 및 세척 조건이 중요하다. 서열이 100% 상보적일 경우, 이때 높은 엄격도 하이브리드화가 수행될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 따르면, 하이브리드화 및/또는 특이적으로 하이브리드화하는 부분은 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적이다. 하이브리드화의 엄격도는 하이브리드화 온도 및 하이브리드화 완충제 중의 염 농도에 따라 결정되며, 온도가 높고, 염도가 낮을수록 더 엄격하다. 일반적으로 사용되는 세척액은 SSC (시트르산나트륨 염수, Na시트레이트와 NaCl의 혼합물)이다. 하이브리드화는 용액에서 수행될 수 있거나, 또는 더욱 일반적으로는 적어도 하나의 구성성분이 고체상 지지체, 예컨대, 니트로셀룰로오스 페이퍼 위에 있을 수 있다. 빈번하게 사용되는 프로토콜은 예컨대, 무지방 분유로부터의 카제인 또는 우혈청 알부민과 같은 차단 시약을 종종 변성되고 단편화된 연어 정자 DNA (또는 복잡도가 높은 임의의 다른 이종 DNA) 및 예컨대, SDS와 같은 세제와 결합하여 사용한다. 종종 매우 높은 농도의 SDS가 차단제로 사용된다. 온도는 42 내지 65℃ 또는 그 초과일 수 있으며, 완충제는 최종적으로는 3X SSC, 25 mM HEPES, pH 7.0, 0.25% SDS일 수 있다.
적어도 하나의 표적 RNA에 결합하도록 설계된 상기 미리 선택된 가이드 RNA의 상기 부분은 15개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게, 18개 이상의 뉴클레오티드, 및 더욱 바람직하게, 약 20개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 표적 RNA와 특이적으로 하이브리드화하는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다. 바람직한 범위는 15 내지 30개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게, 18 내지 25개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게, 20 내지 24개의 뉴클레오티드이다. 복합체의 하이브리드화 부분 (가이드의 3')에 대한 확장이 가능하고, 바람직하며, 복합체를 보다 안정적으로 형성하는 이점을 제공한다.
가이드 RNA는 바람직하게, 증진된 또는 새로운 기능을 도입하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 단부는 표적 RNA에 완벽하게 상보적이도록 확장되어 RNA 변형 효소 (예컨대, ADAR)로 편집될 수 있는 dsRNA를 생성할 수 있다. 인식된 헤어핀 구조를 안정화시키거나, CasΩ에 의한 결합을 촉진시키기 위해 가이드 모티프에 대한 5'의 보존된 CasΩ 핸들 모티프의 구조를 변형시킬 수 있다. 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 단부는 압타머 서열을 추가로 도입하기 위해 확장될 수 있다. 이어서, 상기 압타머는 사용된 바와 같이 이펙터 도메인에 융합된 펩티드 또는 단백질 리간드를 인식할 수 있다. 압타머 및 이의 적용은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Rabiee N, Ahmadi S, Arab Z, Bagherzadeh M, Safarkhani M, Nasseri B, Rabiee M, Tahriri M, Webster TJ, Tayebi L. Aptamer Hybrid Nanocomplexes as Targeting Components for Antibiotic/Gene Delivery Systems and Diagnostics: A Review. Int J Nanomedicine. 2020 Jun 17;15:4237-4256. doi: 10.2147/IJN.S248736. PMID: 32606675; PMCID: PMC7314593] 참조).
본 발명에 따른 복합체는 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와, 상기 언급한 미리 선택된 가이드 RNA에 대해 설계된 서열을 기반으로 표적 RNA에 결합된 상기와 같은 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이에서 최종적으로 형성된다. CasΩ 효소는 표적 핵산을 절단할 수 있는 이의 능력과는 독립적으로 표적 핵산에 결합하고, 이러한 유연성은 상기 적어도 하나의 표적 RNA에 결합하기 위해 사용된다.
본 발명의 맥락에서, 표적 RNA는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 절단을 유발하고/거나, 검출되는 트리거로서 사용되는 관심의 대상이 되는 임의의 RNA이다. 일반적으로 및 바람직하게, 표적 RNA는 단일 가닥 RNA 분자, 예컨대, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 전달 RNA, 소형 RNA, 안티센스 RNA, 소형 핵소체 RNA, 마이크로RNA, piwiRNA, 긴 비-코딩 RNA, 스플라이싱된 인트론, 및 고리형 RNA이다. RNA는 자연 기원일 수 있거나, 인공적으로 생산될 수도 있다. 단일 가닥 감지 RNA는 인간 세포, 동물 세포, 식물 세포, 암성 세포, 감염된 세포, 또는 이환된 세포로부터의 것일 수 있고/거나, 바이러스, 기생충, 연충, 진균, 원생동물, 박테리아, 또는 병원성 박테리아로부터 유래될 수 있다. 상기와 같이, 표적 RNA는 본 발명의 방법에서 생성되고, 사용되는 (비-자연적으로 발생된) 가이드 RNA의 가이드 부분과 특이적으로 하이브리드화하는 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 중요한 측면은 본 발명의 복합체 및 방법의 진단 용도가다. 본 측면은 a) 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 ssDNA, dsDNA 또는 RNA 리포터 핵산을 제공하는 단계, b) 상기 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플을, 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이의 적어도 하나의 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 단계, 및 c) 상기 적어도 하나의 ssDNA, dsDNA 또는 RNA 리포터 핵산의 절단, 커팅 및/또는 니킹을 검출하는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 리포터 핵산의 절단이 검출된다면, 상기 세포, 조직, 세포 핵 및/또는 샘플 중 상기 적어도 하나의 표적 RNA가 검출되는 것인 단계를 포함하는, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA를 검출하기 위한 방법을 제공함으로써 해결한다.
상기 언급된 바와 같이, 하이브리드화하는 본 발명의 방법에 사용되는 핵산 분자의 파트는 서로 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적이다. 따라서, 표적 RNA와 특이적으로 하이브리드화하는 상기 가이드 RNA의 상기 가이드 부분/파트의 뉴클레오티드 서열은 표적 RNA와 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적이도록 생성 및/또는 변형될 수 있다.
각각의 상보성 및 검정 조건을 적용할 때, 본 방법은 표적 RNA의 돌연변이 뿐만 아니라, 바람직하지 않고/거나, 세포 또는 샘플 중에 높은 수준으로 존재하고/거나, 외래인, 예컨대, 예를 들어, 인간 세포, 동물 세포, 식물 세포, 암성 세포, 감염된 세포, 또는 이환된 세포로부터의 것일 수 있고/거나, 바이러스, 기생충, 연충, 진균, 원생동물, 박테리아, 또는 병원성 박테리아로부터 유래될 수 있는 RNA를 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 지카 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 코로나바이러스, 인플루엔자, 단순 포진 바이러스 I, 단순 포진 바이러스 II, 유두종 바이러스, 광견병 바이러스, 거대세포 바이러스, 인간 혈청 파보 유사 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 수두-대상포진 바이러스, 홍역 바이러스, 아데노바이러스, 인간 T 세포 백혈병 바이러스, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 볼거리 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 림프구성 맥락수막염(choriomeningitis) 바이러스, 사마귀 바이러스, 청설병 바이러스, 센다이(Sendai) 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 레오바이러스, 소아마비 바이러스, 시미안 바이러스 40, 마우스 유방 종양 바이러스, 뎅기열 바이러스, 풍진 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 코로나바이러스, 황열병 바이러스, 및 아프리카 돼지 열병 바이러스로부터 선택되는 바이러스로부터 유래된 것이다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 네이세리아 고노르호에아에(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 뉴모코쿠스(Pneumococcus), 크립토코쿠스 네오포만스(Cryptococcus neoformans), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 라임병 스피로헤타(spirochetes), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 및 브루셀라 아보투스(Brucella abortus)로부터 선택되는 병원성 박테리아로부터 유래된 것이다.
적어도 하나의 표적 RNA가 대조군 표적 RNA와 비교하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이화된 표적 RNA인 본 발명에 따른 방법이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 RNA는 전사 및/또는 발현이 예컨대, 예를 들어, 대사 인자 또는 신호, 호르몬, 병원체, 독소, 약물, 노화 및/또는 생물학적 또는 비생물적 스트레스와 같은 외부 인자에 반응하여 변형되는 유전자로부터 유래된 것이다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 표적 RNA는 환경, 종, 계통, 질환, 세포 및/또는 조직 특이적이도록 선택된다. 이러한 측면에서, 본 발명의 방법은 선택된 표적 RNA에 기초하여 세포 또는 유기체를 확인하고/거나, 그룹화하는 데 도움이 된다. 적어도 하나의 표적 RNA는 바람직하게, 바이러스 감염, 예컨대, 예를 들어, 코로나바이러스 감염, 병원체 감염, 대사 질환, 암, 신경퇴행성 질환, 노화, 약물 및 생물학적 또는 비생물학적 스트레스로부터 선택되는 병태와 관련이 있다.
본 발명에 따른 방법의 추가의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 RNA는 단계 a) 이전에 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에 첨가될 수 있고/거나, 여기서 상기 방법은 DNA의 RNA로의 시험관내 전사, RNA의 DNA로의 역전사, 및 최적으로는 상기 DNA의 RNA로의 후속 시험관내 전사로부터 선택되는 적어도 하나의 단계를 추가로 포함한다. 이는 적합하거나, 또는 원하는 신호 증폭을 제공하기 위해 수행될 수 있다. 일반적으로, 상기 세포, 조직 또는 샘플 중의 표적 RNA는 약 500 fM 내지 약 1 uM, 예컨대, 약 500 fM 내지 약 1 nM 범위로 존재하고, 바람직하게, 약 1 pM 내지 약 1 nM 범위로 존재한다. 최적으로, 본 방법은 세포, 조직 및/또는 샘플당 단일 분자를 검출할 수 있다.
DNA 분해를 유발하는 서열-특이적 RNA 인식의 광범위한 적용가능성을 고려할 때, CasΩ 뉴클레아제는 몇 가지 장점을 제공한다. 코로나19 팬데믹으로 인해 심지어 단일 뉴클레오티드 차이도 감지할 수 있는 저렴하고, 신속한 진단의 필요성이 강조되었다. 팬데믹이 진정된 후에도 사회는 진단의 이점을 더 잘 인식하고 일상 환경 (예컨대, 공항)에서의 사용을 수용할 것이다. CasΩ 뉴클레아제는 특이적인 RNA 표적 서열을 인식하여 예를 들어, ssDNA 또는 dsDNA 또는 RNA 리포터를 분해한다. 판독은 형광성 (예컨대, 형광단 및 소광제에 융합된 리포터 절단) 또는 비색 (예컨대, 측면 유동 검정법의 파트로 나노입자 방출)일 수 있다. CasΩ 뉴클레아제의 서열 특이성은 진단 분석을 통해 예컨대, 바이러스, 특히 SARS-CoV-2 변이체와 연관된 것과 같은, 표적 RNA 중의 심지어는 단일 뉴클레오티드 변이 조차도 구별할 수 있게 해준다. Cas12a 또는 Cas13을 기반으로 하는 현 CRISPR 기술은 dsDNA 또는 ssRNA 표적 인식에 의존하여 ssDNA 또는 ssRNA 리포터의 부차적인 절단을 유발한다.
(문헌 [Probing CRISPR-Cas12a Nuclease Activity Using Double-Stranded DNA-Templated Fluorescent Substrates. Biochemistry. 2020 Apr 21;59(15):1474-1481. doi: 10.1021/acs.biochem.0c00140. Epub 2020 Apr 7. PMID: 32233423; PMCID: PMC7384386]에서) 등은 스미쓰 CW(Smith CW) 등은 등은 표적 검출시 Cas12a 트랜스-절단 활성을 프로빙하기 위한 dsDNA 기질 (프로브-전체)을 보고하고 있다. dsDNA 특징이 교대로 나타나는 다양한 Cas12a 기질 세트를 디자인하고, 형광 분광법을 사용하여 연구하였다. 스미쓰 등은 닉이 없는 프로브-전체가 닉을 포함하는 형태보다 더 우수한 트랜스-절단 성능을 보였다는 것을 관찰하였다. 프로브 성능을 평가하기 위해 염 농도, 표적 농도 및 미스매치 내성의 다양한 실험 조건을 조사하였다. Cas12a의 활성은 각각 타바코 컬리 슈트 바이러스 (TCSV) 또는 B형 간염 바이러스 (HepBV)에 대한 crRNA를 사용하여 TCSV 또는 HepBV 게놈으로부터 복사된 dsDNA 프레임에 대해 프로그래밍되었다. 온-타겟 활성이 10 pM dsDNA 표적만큼 적은 검출을 제공하는 반면, 오프-타겟 활성은 심지어 1 nM 대조군 DNA에서도 관찰되지 않았다. 이를 통해 Cas12a의 트랜스-절단이 ssDNA 기질에 제한되지 않고, Cas12a-기반 진단이 dsDNA 기질로 확장될 수 있다는 것이 입증되었다. 그러나, 이 검출 모드에는 여전히 dsDNA 표적이 필요한 바, 사전에 역전사 단계를 추가하지 않으면 RNA 표적을 검출할 수 없다.
예컨대, PCR 및 LAMP와 같은 다른 표준 진단 기술이 있다. 본 기술의 또 다른 장점은 측면 유동 검정법을 사용하여 수행할 수 있다는 점이다. 현 기술은 또한 일반적으로 Cas 뉴클레아제와 연관된 단일 뉴클레오티드 분해능도 제공할 수 있는데, 이는 PCR 또는 LAMP로는 달성하기가 더 어렵다.
사용된 구성성분에 관한 본 측면의 기본 원리는 상기와 같지만, 이러한 본 발명의 측면에서, 상기 세포, 조직 및/또는 샘플 중 상기 적어도 하나의 표적 RNA의 검출은 상기 뉴클레아제 효소에 의한 상기 샘플 중의 상기 적어도 하나의 표적 핵산의 절단 검출에 의존하며, 따라서, 상기의 상기 적어도 하나의 표적 핵산 절단이 검출된다면, 상기 세포, 조직 및/또는 샘플 중 상기 적어도 하나의 표적 RNA가 검출되는 것이다.
CasΩ는 RNA 표적을 인식하고, ssDNA 및 dsDNA를 분해할 수 있다. 이를 통해 뉴클레아제는 역전사 단계 없이 RNA를 직접 감지할 수 있으며, 저렴하고, 안정적인 ssDNA 및 dsDNA를 분해한다. 선도적인 기술인 Cas13은 RNA를 부차적으로 절단한다. 연관된 RNA 리포터는 ssDNA 또는 dsDNA보다 합성 비용이 더 많이 들고, 안정성이 낮아 CasΩ에 당면한 이점을 제공한다. dsDNA 리포터를 사용할 수 있는 능력는 추가로 다수의 형광단과 복합체를 형성한 dsDNA 오리가미를 생성함으로써 절단 활성의 판독을 강화시킬 수 있는 방법을 허용한다.
본 발명의 방법에 바람직한 시험관내 진단 포맷의 예로는 측면 유동 검정법이 있다. 측면 유동 검정법은 당업자에게 공지되어 있고, 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)과 동일한 원리로 작동한다. 본질적으로, 상기 시험은 시각적으로 양성 또는 음성 결과를 보여주는 반응성 분자가 있는 패드 표면을 따라 액체 샘플을 전개시킨다.
따라서, 상기 적어도 하나의 리포터 핵산의 절단, 커팅 및/또는 니킹 검출은 적합한 표지, 예컨대, 염료, 형광단 (예컨대, 형광 검출 또는 라만 분광법에 의해 검출), 또는 전기 전도성 신호 변화를 검출하고/거나, 상기의 자체로 절단된 적어도 하나의 리포터 핵산 단편을 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 중요한 측면은 a) 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플을, b) 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이의 적어도 하나의 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 적어도 하나의 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 가이드 서열을 포함하는 것인 단계, 및 c) b)의 복합체를 적어도 하나의 표적 RNA에 결합시켜 적어도 하나의 표적 RNA의 안정성, 프로세싱, 국재화, 또는 번역을 변경시키는 단계를 포함하고, 이로써, c)에서의 결합이 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 발현을 조정하는 것인, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 발현을 조정하기 위한 방법으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 mRNA, 비-코딩 RNA 및 바이러스 RNA 분자로부터 선택되는 것인 방법이다.
CasΩ에 의한 RNA 표적화는 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 번역에 영향을 미치는 데 사용되며, 여기서 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 mRNA, 비-코딩 RNA 및 바이러스 RNA 분자로부터 선택된다. 본 발명의 이러한 측면은 또한 기초 연구, 예컨대, 항바이러스제 또는 다른 치료 물질에 대한 고처리량 스크린에 사용될 수 있는 다중화 가능하고, 서열 특이적 유전자 침묵을 허용한다. 따라서, 관심의 대상이 되는 표적 RNA를 표적화함에 따라 예컨대, mRNA 안정성, 프로세싱 또는 번역을 변경시킴으로써 서열-특이적 방식으로 유전자 발현을 조정한다.
상기 언급된 바와 같이, 하이브리드화하는 본 발명의 방법에 사용되는 핵산 분자의 파트는 서로 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적이다. 따라서, 표적 RNA와 특이적으로 하이브리드화하는 상기 가이드 RNA의 상기 부분/파트의 뉴클레오티드 서열은 표적 RNA와 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적이도록 생성 및/또는 변형될 수 있다.
각각의 상보성 및 검정 조건을 적용할 때, 본 방법은 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 발현을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 발현 조정이 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플에 유익한 효과를 미칠 RNA, 예컨대, mRNA, 비-코딩 RNA 및 바이러스 RNA 분자로부터 선택된다. 본 발명에 따른 본 방법에서, 세포, 조직, 세포 세포질, 세포 핵, 및/또는 샘플은 본 발명에 따른 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이의 적어도 하나의 복합체와 접촉된다. 복합체의 적어도 하나의 표적 RNA에의 결합을 통해 적어도 하나의 표적 RNA의 안정성, 프로세싱, 또는 번역은 변경될 것이며, 따라서, 복합체의 결합은 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중의 적어도 하나의 표적 RNA의 발현을 조정한다. 세포핵 및/또는 샘플. 본 방법의 구성성분 및 조건은 일반적으로 상기 설명한 것과 동일하지만, 상기와 같이 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이에 형성된 복합체는 표적 핵산을 절단할 수 있는 CasΩ 효소의 능력과는 독립적으로 상기 언급된 바와 같이 미리 선택된 가이드 RNA에 대해 설계된 바와 같은 서열을 기반으로 표적 RNA에 결합하고, 이러한 유연성은 상기 적어도 하나의 표적 RNA에 결합하기 위해 사용된다. 따라서, 이러한 측면에서, CasΩ 폴리펩티드는 뉴클레아제 활성이 감소되거나, 또는 제거된 뉴클레아제 도메인 (예컨대, RuvC 또는 RuvC 유사 도메인)을 함유하도록 변형될 수 있다. 뉴클레아제 도메인은 공지된 방법, 예컨대, 부위 지정 돌연변이유발법, PCR 매개 돌연변이유발법, 및 전체 유전자 합성 뿐만 아니라, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 하나 이상의 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 및/또는 치환 돌연변이에 의해 변형될 수 있다.
바람직하게, 이러한 측면에서, CasΩ 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. CasΩ 폴리펩티드는 가이드 RNA에 의해 표적 부위로 지시될 수 있으며, 상기 표적 부위에서 이펙터 도메인은 표적화된 핵산 서열을 변형시키거나, 또는 영향을 미칠 수 있다. 이펙터 도메인은 절단 도메인, RNA 변형 도메인, 번역 활성화 도메인, 번역 리프레서 도메인, 프로세싱/스플라이싱 인자, RNA 국재화에 영향을 미치는 도메인, 또는 이들 기능 중 임의의 것에 영향을 미치는 단백질을 동원하는 도메인일 수 있다. 융합 단백질은 핵 국재화 신호, 색소체 신호 펩티드, 미토콘드리아 신호 펩티드, 다수의 세포내 위치로 단백질 수송이 가능한 신호 펩티드, 세포-투과 도메인, 또는 마커 도메인으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 이 중 임의의 것은 융합 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다. CasΩ 폴리펩티드는 융합 단백질의 N-말단, C-말단에, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다. CasΩ 폴리펩티드는 이펙터 도메인에 직접 융합될 수 있거나, 또는 링커를 이용하여 융합될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, CasΩ 폴리펩티드를 이펙터 도메인과 융합시키는 링커 서열의 길이는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50개의 아미노산 길이일 수 있다. 예를 들어, 링커의 길이는 1-5, 1-10, 1-20, 1-50, 2-3, 3-10, 3-20, 5-20 또는 10-50개의 아미노산 길이 범위일 수 있다.
상기 뉴클레아제가 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함하고, 각 신호는 본원에 기술된 바와 같고, 당업계에 공지되어 있는 것인, 본 발명에 따른 복합체가 바람직하다. 핵 국재화 신호를 포함하는 상기 융합 뉴클레아제 및 이와 함께 형성된 본원에 기술된 복합체는 본 발명의 다른 실시양태이다. 대안적으로, NLS는 포함될 수 없으며, 이는 진핵생물에서 핵소체 또는 미토콘드리아 DNA의 부차적인 절단 또는 분해를 방지하는 이점이 있다.
이어서, 본 발명의 또 다른 중요한 측면은 a) 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플을, b) 적어도 하나의 RNA 변형 효소와 복합체화된 적어도 하나의 변형되고 촉매 불활성인 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이의 적어도 하나의 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 적어도 하나의 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 서열을 포함하는 것인 단계, 및 c) b)의 복합체를 적어도 하나의 표적 RNA에 결합시키고, 상기 적어도 하나의 RNA 변형 효소에 의해 적어도 하나의 표적 RNA를 편집하는 단계를 포함하는, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 서열을 편집하기 위한 방법으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 mRNA, 비-코딩 RNA 및 바이러스 RNA 분자로부터 선택되는 것인 방법에 관한 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 하이브리드화하는 본 발명의 방법에 사용되는 핵산 분자의 파트는 서로 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적이다. 따라서, 표적 RNA 및/또는 rPAM와 특이적으로 하이브리드화하는 상기 가이드 RNA의 상기 부분/파트의 뉴클레오티드 서열은 표적 RNA와 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적이도록 생성 및/또는 변형될 수 있다.
본 발명의 이러한 측면에서, 복합체는 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 서열을 편집하는 데 사용되고, 여기서 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 mRNA, 비-코딩 RNA 및 바이러스 RNA 분자로부터 선택된다. 예를 들어, 상이한 유전 질환은 기본 DNA가 아닌 RNA를 편집함으로써 교정될 수 있고, 이는 게놈 중에 영구적인 편집을 생성하지 않고도 질환을 치료할 수 있는 수단을 제공한다. 당업계에는 변형된 Cas9 및 Cas13 뉴클레아제 뿐만 아니라, 천연 RNA 변형 효소 (ADAR)를 동원하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 수 개의 편집 접근법이 있다.
바람직하게, 이러한 측면에서, CasΩ 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. CasΩ 폴리펩티드는 가이드 RNA에 의해 표적 부위로 지시될 수 있으며, 상기 표적 부위에서 이펙터 도메인은 표적화된 핵산 서열을 변형시킬 수 있다. 융합 단백질은 핵 국재화 신호, 색소체 신호 펩티드, 미토콘드리아 신호 펩티드, 다수의 세포내 위치로 단백질 수송이 가능한 신호 펩티드, 세포-투과 도메인, 또는 마커 도메인으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 이 중 임의의 것은 융합 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다. CasΩ 폴리펩티드는 융합 단백질의 N-말단, C-말단에, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다. CasΩ 폴리펩티드는 이펙터 도메인에 직접 융합될 수 있거나, 또는 링커를 이용하여 융합될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, CasΩ 폴리펩티드를 이펙터 도메인과 융합시키는 링커 서열의 길이는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50개의 아미노산 길이일 수 있다. 예를 들어, 링커의 길이는 1-5, 1-10, 1-20, 1-50, 2-3, 3-10, 3-20, 5-20 또는 10-50개의 아미노산 길이 범위일 수 있다. 표적화된 편집을 지시하여 번역된 단백질에서 변경된 코돈과 다른 아미노산을 초래할 수 있는 RNA 변형 효소 (예컨대, ADAR)에 융합된 촉매적으로 불활성화된 버전의 CasΩ의 융합물이 바람직하다.
상기 적어도 하나의 가이드 RNA-의존성 CasΩ 뉴클레아제 효소 복합체의 상기 적어도 하나의 표적 RNA에의 결합은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 검출 방법에 의해 검출될 수 있고, 뉴클레아제에 대한 항체 및 관심 RNA 서열에 대한 RT-PCR 프라이머를 사용하는 염색질 면역침전 (ChIP) 방법을 포함할 수 있다. 항체는 다른 RNA-단백질 복합체로부터 단백질-RNA 복합체를 선택적으로 침전시키는 데 사용된다. PCR 프라이머를 통해 표적 RNA 서열을 특이적으로 증폭시키고, 검출할 수 있다. 정량적 PCR (qPCR) 기술을 통해 표적 핵산 서열의 양을 정량화할 수 있다. ChIP 검정법은 어레이 기반 포맷 (ChIP-온-칩) 또는 면역침전된 단백질 (ChIP-seq)에 의해 포획된 표적 RNA의 역전사된 DNA의 직접 시퀀싱에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 질환 상태에 대해, 예컨대, 예를 들어, 유전적 장애를 보이는 세포, 증식성 장애를 보이는 세포, 예컨대, 암 세포, 자기항체를 생산하는 면역 세포, 박테리아 또는 바이러스 병원체로 감염된 세포, 박테리아 병원체, 원생동물 병원체, 마이크로바이오타(microbiota)의 세포, 및 오염 박테리아 또는 고세균으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포에 대해 특이적인 핵산 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 단일 가닥이거나, 또는 초기에 이중 가닥이다. 본 발명의 맥락에서, 표적 RNA는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 관심 RNA이다. 일반적으로 및 바람직하게, 표적 RNA는 단일 가닥 RNA 분자, 예컨대, mRNA, 바이러스 RNA 또는 비-코딩 RNA이다. RNA는 자연 기원일 수 있거나, 인공적으로 생산될 수도 있다. 단일 가닥 표적 RNA는 인간 세포, 동물 세포, 식물 세포, 면역 세포, 암성 세포, 감염된 세포, 또는 이환된 세포로부터의 것일 수 있고/거나, 바이러스, 기생충, 연충, 진균, 원생동물, 박테리아, 또는 병원성 박테리아로부터 유래될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 생체내, 예를 들어, 세포, 조직에서, 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물에서 또는 시험관내 샘플에서 수행된다. 샘플은 고체 또는 액체 샘플일 수 있고, 세포를 포함하는 샘플 및 무세포 시험관내 샘플로부터 선택될 수 있다. 세포는 바람직하게, 식물 세포 또는 동물 세포, 예컨대, 포유동물 세포, 바람직하게, 인간 세포이다. 샘플은 바람직하게, 조직 샘플, 타액, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 가래, 점액, 림프, 윤활액, 뇌척수액, 복수, 흉수, 장액종, 고름 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑으로부터 수득된 생물학적 샘플일 수 있다. 한 측면에서, 세포, 조직 및/또는 샘플은 미정제 샘플일 수 있고/거나, 여기서 하나 이상의 핵산 분자는 본 방법을 적용하기 전에 샘플로부터 정제 또는 증폭되지 않는다. 또 다른 측면에서, 세포, 조직 및/또는 샘플은 정제되거나, 또는 부분적으로 정제된 (농축된) 샘플일 수 있고/거나, 하나 이상의 핵산 분자는 방법을 적용하기 전에 샘플로부터 정제되거나 증폭된다. 또 다른 측면에서, 세포는 예컨대, 대기, 자연 수역 (예컨대, 강, 호수, 바다), 폐수 또는 토양과 같은 환경 샘플의 파트일 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 부분적으로 또는 완전히 자동화될 수 있고, 예컨대, 로봇에 의해 완전히 또는 부분적으로 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 얻은 결과를 수행 및/또는 분석하기 위해 컴퓨터 및 각각의 데이터베이스를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 각각이 하나 이상의 샘플, 조직 및/또는 세포에서, 및 바람직하게, 수개 또는 심지어는 다수의 샘플, 조직 및/또는 세포 중의 상기 표적 RNA의 상이한 부분과 특이적으로 하이브리드화하는 것인, 1 초과의 가이드 RNA가 선택, 디자인, 생성 (생산, 상기 참조) 및 사용된다.
본 발명에 따른 유전자 발현 변경, RNA 편집 또는 프로그래밍가능한 바이러스 또는 세포 제거의 맥락에서, 본 시스템은 예를 들어, 다중 가이드 RNA를 단일 플라스미드로 클로닝함으로써 2 내지 7개의 유전자좌 어디든 표적화할 수 있다. 가이드 RNA는 별도의 프로모터로부터 개별적으로 발현되거나, 또는 단일 프로모터로부터 전사된 CRISPR 어레이로 조합될 수 있다. 이들 다중 가이드 RNA 벡터는 본 발명의 측면에서 사용될 수 있도록 상기 언급된 CasΩ 뉴클레아제와 적합하게 조합될 수 있다고 생각된다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 측면에서, 상기 방법은 적어도 부분적으로는 정량적 분석을 포함한다. 따라서, 상기 샘플, 조직 및/또는 세포에서 절단된 핵산의 양을 검출하는 것을 포함하는 단계가 바람직한다. 바람직하게, 대조군과 비교하여 샘플, 조직 및/또는 세포당 양을 측정한다. 정량화 검정법은 당업자에게 알려져 있으며 흡광도 (예컨대, UV, 분광광도법) 및/또는 형광 검정법, 및 실시간 PCR을 포함할 수 있다. 검정법은 (예컨대, 사용된 검정법의 결과로서 또는 이의 "종료"시) 단일 값으로 정량화된 핵산의 양(들) 및/또는 비를 정량화할 수 있거나, 또는 시간 경과에 따른 핵산 변화를 모니터링할 수 있으며, 즉, 바람직하게는 특히 대조군과 비교했을 때 상기 절단된 핵산(들)의 양의 변화를 검출하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 추가의 또 다른 측면에서, 다중 표지 및/또는 마커가 사용된다. 마커는 검정법의 파트를 형성하는 핵산 분자 뿐만 아니라, 단백질 구성성분 (예컨대, 뉴클레아제 및/또는 융합물), 둘 모두에 사용될 수 있다. 표지 및 마커는 검정법의 구성성분 (특히, 핵산 및/또는 단백질)에 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 공유 또는 비-공유적으로 부착되는 모이어티를 구성할 수 있다.
이어서, 본 발명의 또 다른 측면은 세포, 조직 또는 유기체, 예컨대, 포유동물, 바람직하게, 인간에서 의학적 병태를 검출하기 위한 방법으로서, 여기서 상기 병태는 적어도 하나의 표적 RNA의 존재, 이의 발현 및/또는 적어도 하나의 표적 RNA 중의 돌연변이(들)와 관련이 있는 것인 방법에 관한 것이다. 본 방법은 상기와 같은 본 발명에 따른 방법을 수행하는 단계, 및 검출된 상기 적어도 하나의 표적 RNA의 존재, 이의 발현 및/또는 상기 적어도 하나의 표적 RNA 중 돌연변이(들)에 의해 유발되는 핵산 절단에 기초하여 상기 의학적 병태를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명을 사용하여 검출할 수 있는 의학적 병태는 적어도 하나의 표적 RNA 분자와 관련된 병태이다. 상기 설명된 바와 같이, 표적 RNA는 예를 들어, 시험된 세포, 조직 및/또는 샘플의 감염, 예컨대, 바이러스, 예컨대, 예를 들어, 코로나바이러스 감염, 박테리아 및/또는 진균 감염인 경우 그 자체로 병태 또는 질환의 기원을 구성할 수 있다. 다른 병태는 예를 들어, 비정상적으로 전사 (존재 또는 발견), 발현, 프로세싱 (예컨대, 스플라이싱) 및/또는 돌연변이화된 RNA의 경우, 적어도 하나의 표적 RNA 분자와 더 간접적으로 관련될 수 있다. 표적 RNA 분자는 건강한 대조군 (예컨대, 건강한 또는 이환된 샘플 군에 기초한 대조군)과 비교할 때 증가된 양 또는 감소된 양으로 존재할 수 있다.
본 발명의 방법에 바람직한 시험관내 진단 포맷의 예로는 측면 유동 검정법이 있다. 측면 유동 검정법은 당업자에게 공지되어 있고, 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)과 동일한 원리로 작동한다. 본질적으로, 상기 시험은 시각적으로 양성 또는 음성 결과를 보여주는 반응성 분자가 있는 패드 표면을 따라 액체 샘플을 전개시킨다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 RNA는 단계 a) 이전에 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에 첨가될 수 있고/거나, 여기서 상기 방법은 DNA의 RNA로의 시험관내 전사, RNA의 DNA로의 역전사, 및 최적으로는 상기 DNA의 RNA로의 후속 시험관내 전사로부터 선택되는 적어도 하나의 단계를 추가로 포함한다. 이는 적합하거나, 또는 원하는 신호 증폭을 제공하기 위해 수행될 수 있다. 일반적으로, 상기 세포, 조직 또는 샘플 중의 표적 RNA는 약 500 fM 내지 약 1 uM, 예컨대, 약 500 fM 내지 약 1 nM 범위로 존재하고, 바람직하게, 약 1 pM 내지 약 1 nM 범위로 존재한다. 최적으로, 본 방법은 세포, 조직 및/또는 샘플당 단일 분자를 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 중요한 측면은 의학에서의 본 발명의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면은 바람직하지 않은 세포 또는 바이러스를 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 가이드 RNA, 특히, 이의 서열은 상기 바람직하지 않은 세포 또는 바이러스가 본원에 기술된 바와 같이 불활성화되거나, 또는 비-편집된 세포가 되도록 특이적으로 선택/디자인되는 것인, 바람직하지 않은 세포 또는 바이러스를 특이적으로 불활성화시키는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 질환의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한, 예컨대, 예를 들어, 감염 및/또는 유전적 장애, 예컨대, 증식성 장애, 예컨대, 암, 진균, 원생동물, 박테리아 및/또는 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 복합체이다.
실시양태는 세포로부터 감염성 DNA 또는 RNA 바이러스를 제거하고, 암 돌연변이를 포함하기 때문에 바람직하지 않은 세포를 (특이적으로) 사멸시키는 것이다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은 질환 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명에 따른 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 예컨대, 예를 들어, 감염 및/또는 유전적 장애, 예컨대, 증식성 장애, 예컨대, 암, 진균, 원생동물, 박테리아 및/또는 바이러스 감염, 자가면역 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법이다.
본 발명은 서열-특이적 세포 사멸에 사용될 수 있다. 서열 특이적 방식으로 세포를 사멸시키는 것이 바람직한 적용이 다수 존재한다. 구체적인 예는 암 세포, 자기항체를 생산하는 면역 세포, 박테리아 또는 바이러스 병원체로 감염된 세포, 박테리아 병원체, 또는 산업 배양물 중 오염 박테리아 또는 고세균의 선택적 사멸이다. 핵 내 표적 RNA 인식 (예컨대, 진핵 생물에서 핵 국재화 신호에 융합된 CasΩ를 사용)은 광범위한 dsDNA 절단 및 세포 사멸을 초래한다. 표적 RNA가 세포 또는 샘플에 부재하거나, 돌연변이를 포함하는 경우, 세포는 살아남는다. 이 효과는 특히 암 세포, 박테리아 및 고세균에 적용된다. 진핵생물에서 프로그래밍 가능하고, 서열-특이적 사멸을 위한 이용가능한 접근 방식은 없고; 대신 현장에서는 편집 효율성을 높이는 개선에 중점을 두었다.
따라서, CasΩ는 원핵 및 진핵 세포의 서열-특이적 사멸/불활성화를 달성하는 최초의 수단을 제공한다. 진핵 생물에서, 이는 고유한 돌연변이를 기반으로 암세포 뿐만 아니라, 특정 항체를 코딩하는 차별화된 유전 물질을 기반으로 한 특정 면역 세포를 사멸시키는 고유한 수단을 제공할 수 있다. 이러한 접근법은 특정 자가면역 장애를 치료하기 위한 새로운 요법을 유도하고, 집단에서 편집된 세포를 농축시키기 위한 표준 접근법이 될 수 있다.
본 발명의 접근법은 또한 감염성 질환과 싸우는 데에도 사용된다. 바이러스 또는 박테리아로 감염된 진핵 세포에 CasΩ를 전달하면 바이러스 또는 박테리아의 RNA를 인식한 후, 바이러스 또는 박테리아의 DNA를 파괴하여 면역계를 돕는다. 이러한 치료는 감염된 숙주 세포의 죽음을 초래하여 질환 확산을 막고, 면역계를 추가로 활성화시킨다. CasΩ는 선택적이기 때문에, 상보적인 바이러스 또는 박테리아 RNA를 포함하지 않는 비-감염 세포로의 전달은 불활성 반응을 유발한다.
본 발명의 접근법은 또한 산업 및 의학에 중요한 미생물 집단을 치료/조절/조작하는 데 사용되고, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간 내의 특정 박테리아 균주인 마이크로플로러가 비만과 상관관계가 있는 경우, 계내 다른 박테리아 집단을 사멸시키지 않고, 세포 사멸을 표적화한다. 상기 치료법은 또한 항생제 내성 박테리아를 퇴치하는 길을 제공할 수 있을 것이다.
이러한 측면에서, 복합체 또는 복합체 모두 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산은 예방 및/또는 치료에 있어서 실제 활성 성분으로 사용된다. 환자 세포 또는 샘플로 복합체를 전달하는 것은 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어, 본 발명에 따른 적어도 하나의 복합체 (폴리펩티드 및/또는 핵산)의 단리된 구성성분을 적합한 안정제 또는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물로서 수행될 수 있다. 또 다른 실시양태는 적어도 하나의 핵산 벡터에 코딩된 복합체를 환자, 세포, 조직, 샘플 또는 핵에 제공하는 것이다. 이들 제약 조성물 및 이의 용도는 본 발명의 바람직한 실시예를 구성한다. 이 측면은 치료를 모니터링하는 단계도 포함한다.
또 다른 측면은 상기 기술된 바와 같이 전반적인 유전자 편집 결과를 개선하기 위해 비-편집된 세포의 역선택을 위한 본 발명의 복합체 및 방법의 용도이다. 이 접근법은 표적 RNA 서열, rPAM, 이의 접근성 및/또는 이의 전사를 방해하는 도입된 임의의 원하는 편집을 선택할 수 있다.
이어서, 본 발명의 추가의 또 다른 측면은 세포, 조직 또는 유기체, 예컨대, 포유동물, 바람직하게, 인간에서 질환 또는 의학적 병태를 치료하기 위한 방법으로서, 여기서 상기 병태는 적어도 하나의 표적 RNA의 존재, 이의 발현 및/또는 적어도 하나의 표적 RNA 중의 돌연변이(들)와 관련이 있는 것인 방법에 관한 것이다.
이러한 측면은 본 발명의 진단 접근법과 별도의 "통상의" 의학적 치료를 조합하고, 치료를 모니터링하기 위한 사용도 포함한다. 본 방법은 상기 세포, 조직 또는 유기체에 적합한 치료, 특히 특정 의학적 치료를 제공하고, 상기와 같은 본 발명에 따른 방법을 수행하고, 검출된 상기 적어도 하나의 표적 RNA의 존재, 이의 발현 및/또는 상기 적어도 하나의 표적 RNA 중의 돌연변이(들)에 기초하여 상기 질환 또는 의학적 병태의 상기의 치료를 변형시키는 것을 포함한다. 본 발명을 사용하여 검출될 수 있는 의학적 병태는 적어도 하나의 표적 RNA 분자와 관련된 것이다. 상기 설명된 바와 같이, 표적 RNA는 예를 들어, 시험된 세포, 조직 및/또는 샘플의 감염, 예컨대, 바이러스, 예컨대, 예를 들어, 코로나바이러스 감염, 박테리아 및/또는 진균 감염인 경우 그 자체로 병태 또는 질환의 기원을 구성할 수 있다. 다른 병태는 예를 들어, 비정상적으로 전사 (존재 또는 발견), 발현, 프로세싱 및/또는 돌연변이화된 RNA의 경우, 적어도 하나의 표적 RNA 분자와 더 간접적으로 관련될 수 있다. 표적 RNA 분자는 건강한 대조군 (예컨대, 건강한 또는 이환된 샘플 군에 기초한 대조군)과 비교할 때 증가된 양 또는 감소된 양으로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 치료 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 단일 가닥이거나, 또는 초기에 이중 가닥이다. 단일 가닥 표적 RNA는 인간 세포, 동물 세포, 식물 세포, 면역 세포, 암성 세포, 감염된 세포 또는 이환된 세포로부터의 것일 수 있고/거나, 그에 관한 것이고/거나, 바이러스 (상기 참조), 기생충, 연충, 진균, 원생동물, 박테리아, 또는 병원성 박테리아 (상기 참조)로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 RNA는 유전자로부터 유래되고/그에 관한 것이고, 이의 전사 및/또는 발현은 외부 인자, 예컨대, 예를 들어, 대사 인자, 또는 신호, 호르몬, 병원체, 독소, 약물, 노화 및/또는 생물적 또는 비생물적 스트레스에 반응하여 변형된다. 결과적으로, 적어도 하나의 표적 RNA는 바람직하게는 바이러스 감염, 예컨대, 예를 들어, 코로나바이러스 감염, 병원체 감염, 대사 질환, 암, 신경퇴행성 질환, 노화, 약물 및 생물학적 또는 비생물적 스트레스로부터 선택된 병태와 관련되어 있다. 일반적으로, 표적 RNA의 존재 또는 이의 양 증가 또는 감소는 상기 질환 또는 병태의 존재를 나타낸다. 본 방법의 또 다른 측면은 상기 개체, 환자 또는 유기체, 특히, 세포, 조직 및/또는 샘플의 수득 기점이 된 개체, 환자 또는 유기체의 치료 동안 상기 표적 RNA의 양 또는 존재의 모니터링에 관한 것이다. 주치의는 그에 따라 치료를 조정할 것이며, 즉, 필요한 경우, 항바이러스 화학요법제 및/또는 생물학적 제제를 더 많이 제공할 것이다. 필요한 경우, 이 치료 스케줄을 반복할 수 있다.
마지막으로 다시 상기와 유사하게 설계된 가이드 RNA (예컨대, 박테리아 또는 진균 표적 핵산에 특이적인 것)는 환자에게 투여할 최선의 항생제 요법을 결정하기 위해 항생제 내성의 특정 마커를 확인하기 위하여 감염성 박테리아 또는 진균 병원체 (예컨대, 대변 샘플 중의 클로스트리디오이데스 디피실(Clostridioides difficile), 가래 샘플 중의 슈도모나스 아에루기노사)를 포함하는 샘플과 함께 사용될 수 있다.
이의 또 다른 바람직한 측면에서, 본 발명의 목적은 a) 표적 RNA의 적어도 한 부분에 결합하도록 설계된 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA로서, 여기서 상기 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 서열을 포함하는 것인 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA, 및 b) 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소를 포함하는 표적 RNA에 대한 검출 시스템을 제공함으로써 해결된다. 여러 표적 RNA에 대한 여러 가이드 RNA 세트를 포함하는, 여러 표적 RNA를 병렬로 병렬 검출하기 위한 검출 시스템이 바람직한다. 또 다른 검출 시스템은 하나의 표적 RNA의 여러 위치에서 하이브리드화하는 여러 가이드 RNA를 포함한다.
하이브리드화하는 본 발명의 방법에 사용되는 핵산 분자의 파트는 서로 적어도 80% 상보적이고, 바람직하게, 90% 초과 상보적이고, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적이고, 가장 바람직하게, 100% 상보적이다. 따라서, 표적 RNA와 특이적으로 하이브리드화하는 상기 가이드 RNA의 상기 부분/파트의 뉴클레오티드 서열은 표적 RNA와 적어도 80% 상보적, 바람직하게, 90% 초과 상보적, 더욱 바람직하게, 95% 초과 상보적, 가장 바람직하게, 100% 상보적이도록 생성 및/또는 변형될 수 있다.
본 발명의 이러한 측면은 검출 시스템으로서, 예를 들어, 진단 키트의 파트로서 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한, 상기와 같은 구성성분, 예컨대, 미리 선택된 가이드 RNA 핵산 분자 및 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소를 제공한다. 시스템은 또한 적합한 안정제 또는 담체와 함께 본 발명에 따른 적어도 하나의 복합체 (폴리펩티드 및/또는 핵산)의 단리된 구성성분을 포함하는 치료 키트, 또는 제약 조성물에 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태는 적어도 하나의 핵산 벡터 상에에 코딩된 복합체를 환자, 세포, 조직, 샘플 또는 핵에 제공하는 것이다.
바람직하게, 상기 시스템은 하나 이상의 용기에 제공되며, 적합한 효소, 완충제 및 부형제 뿐만 아니라, 사용 설명서를 포함한다. 구성성분은 적어도 부분적으로는 기판에 고정될 수 있으며, 여기서 상기 기판은 상기 세포, 조직 및/또는 샘플에 노출될 수 있다. 검출 시스템은 상기 기판, 예컨대, 가요성 물질 기판, 예를 들어, 칩 상의 다중의 별개의 위치에 적용될 수 있다. 가요성 물질 기판은 종이 기판, 직물 기판, 또는 가요성 중합체 기반 기판일 수 있다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은 본원에 개시된 바와 같은 방법에 따라 dsDNA, ssDNA, 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자를 절단하기 위한, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA를 검출하기 위한, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 발현을 조정하기 위한, 세포, 조직, 세포 핵 중 적어도 하나의 표적 RNA의 서열을 편집하기 위한, 바람직하지 않은 세포 또는 바이러스를 특이적으로 불활성화시키기 위한, 또는 제제에서 바람직하지 않은 오염 물질을 오염제거하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 복합체의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 본 발명의 목적은 상기 측면들 중 어느 하나에 따른 방법을 수행하기 위한, 특히, 상기 언급된 바와 같이, 표적 RNA, 바이러스 표적 RNA, 질환 마커로부터 전사된 표적 RNA를 검출하기 위한, 질환 치료를 위한, 및/또는 하나 이상의 표적 RNA에 대한 발현 프로파일을 생성하기 위한, CasΩ/가이드 RNA 핵산 복합체의 용도를 제공함으로써 해결된다.
본원에 기술된 실시양태는 광범위한 적용을 위해, 예컨대, 치료 과정을 알리기 위해 의학적 병태를 진단하기 위해, 예컨대, 급성 패혈증과 같은 건강 결과 또는 질환과 연관련 SNP를 확인하기 위해, 병원체의 아이덴티티, 병독성 인자, 내성 마커, SNP, 바이러스 검출, 즉 아이덴티티, 및/또는 바이러스 변이체 (예를 들어, 본원에 개시된 SARS CoV-2 참조), 암 샘플, 예컨대, 생검 중 암 진단을 결정하기 위해, 돌연변이 및/또는 SNP를 결정하기 위해, 음용수 중 미생물 오염 물질을 확인하기 위해, 발효 또는 세포 배양물 중 바이러스 또는 미생물 오염 물질을 확인하기 위해, 식물 또는 곤충 변이체를 확인하기 위해, 또는 혼합된 집락 (예컨대, 소화관, 토양, 물)에서 중요한 미생물 구성원을 확인하기 위해, 예컨대, 마이크로바이옴 및/또는 미생물 센티널(sentinel) (즉, 비침습적 측정을 위한 리포터 역할을 하는 공생 박테리아), 특히, 아이덴티티, 상대적 존재비, 내성 마커, 대사 유전자, 문/속/종/균주 특이적 유전자 등 분석을 위해, 생체내에서, 예컨대, 전체 유기체에서, 또는 예를 들어, 환경으로부터 채취한 샘플에 기초한 바이러스 또는 박테리아 확산 (예컨대, 폐수 샘플에서 검출된 바이러스 또는 저항성 박테리아의 확산 등)을 추적하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, "약"이라는 용어는 +/- 10%로 주어진 값을 의미하여야 한다.
(타입 V CRISPR-Cas 시스템 내의) Cas12 뉴클레아제는 dsDNA를 인식하여 결합된 dsDNA의 절단 및 그에 따른 ssDNA의 분해를 유도하는 것으로 알려져 있다. Cas12a가 대표적인 예이다. 확립된 Cas 뉴클레아제 Cas12a와의 유사성을 고려하면, CasΩ는 DNA를 표적화하는 것으로 추정되었다. Cas12 뉴클레아제 내의 유일한 예외는 RNA를 인식하고, RNA와 ssDNA를 분해하는 Cas12g이다. 본원에서 사용되는 CasΩ는 뚜렷이 다른 도메인을 갖고, 때로는 Cas12a와 함께 나타나는 경우도 있지만, 원래는 이의 유사성에 기초하여 Cas12a로 분류되었다.
본원에서 언급되는 바와 같이, 본 발명은 특히 하기 항목에 관한 것이다.
1항. CasΩ 뉴클레아제, 및 적어도 하나의 표적 RNA에 결합하도록 설계된 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA를 포함하는 복합체.
2항. 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA와 적어도 90% 상보적인 서열을 갖는 표적 RNA 분자에 추가로 결합하고, 여기서 상기 표적 RNA는 바람직하게 적어도 하나의 rPAM이 측면에 위치하는 것인 복합체.
3항. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 박테리아에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 바이러스에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 진균에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 원생동물에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 유전적 장애에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 및 증식성 장애에 대해 특이적이도록 선택된 서열을 포함하는 것인 복합체.
4항. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 핵 국재화 신호를 포함하는 것인 복합체.
5항. a) 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소를 제공하는 단계, b) 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA를 제공하는 단계, c) 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이에 복합체를 형성하는 단계, d) 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA에 기초하여 c)의 복합체를 표적 RNA에 결합시키는 단계, 및 e) 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소에 의해 dsDNA, ssDNA, 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자를 절단하는 단계를 포함하는, dsDNA, ssDNA, 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자를 절단하기 위한 방법.
6항. a) 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 ssDNA, dsDNA 또는 RNA 리포터 핵산을 제공하는 단계, b) 상기 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플을, 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이의 적어도 하나의 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 서열을 포함하는 것인 단계, 및 c) 상기 적어도 하나의 ssDNA, dsDNA 또는 RNA 리포터 핵산의 절단, 커팅 및/또는 니킹을 검출하는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 리포터 핵산의 절단이 검출된다면, 상기 세포, 조직, 세포 핵 및/또는 샘플 중 상기 적어도 하나의 표적 RNA가 검출되는 것인 단계를 포함하는, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA를 검출하기 위한 방법.
7항. 제6항에 있어서, 상기 적어도 하나의 리포터 핵산의 절단, 커팅 및/또는 니킹을 검출하는 것이 적합한 표지, 예컨대, 염료, 형광단, 또는 전기 전도성 신호 변화를 검출하고/거나, 상기의 자체로 절단된 적어도 하나의 리포터 핵산 단편을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
8항. 제6항 또는 제7항에 있어서, 적어도 하나의 표적 RNA가 대조군 표적 RNA와 비교하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이화된 표적 RNA인 것인 방법.
9항. a) 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플을 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이의 적어도 하나의 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 적어도 하나의 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 서열을 포함하는 것인 단계, 및 c) b)의 복합체를 적어도 하나의 표적 RNA에 결합시켜 적어도 하나의 표적 RNA의 안정성, 프로세싱, 국재화, 또는 번역을 변경시키는 단계를 포함하고, 이로써, c)에서의 결합이 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 발현을 조정하는 것인, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 발현을 조정하기 위한 방법으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 mRNA, 비-코딩 RNA 및 바이러스 RNA 분자로부터 선택되는 것인 방법.
10항. a) 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플을, 적어도 하나의 RNA 변형 효소와 복합체화된 적어도 하나의 변형되고 촉매 불활성인 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이의 적어도 하나의 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 적어도 하나의 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 서열을 포함하는 것인 단계, 및 c) b)의 복합체를 적어도 하나의 표적 RNA에 결합시키고, 상기 적어도 하나의 RNA 변형 효소에 의해 적어도 하나의 표적 RNA를 편집하는 단계를 포함하는, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 서열을 편집하기 위한 방법으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 mRNA, 비-코딩 RNA 및 바이러스 RNA 분자로부터 선택되는 것인 방법.
11항. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 표적 RNA가 질환 상태에 대해, 예컨대, 예를 들어, 유전적 장애를 보이는 세포, 증식성 장애를 보이는 세포, 예컨대, 암 세포, 자기항체를 생산하는 면역 세포, 박테리아 또는 바이러스 병원체로 감염된 세포, 박테리아 병원체, 원생동물 병원체, 마이크로바이오타의 세포, 및 오염 박테리아 또는 고세균으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포에 대해 특이적인 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
12항. 제3항 또는 제4항에 있어서, 질환의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한, 예컨대, 예를 들어, 감염 및/또는 유전적 장애, 예컨대, 증식성 장애, 예컨대, 암, 진균, 원생동물, 박테리아 및/또는 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 복합체.
13항. 바람직하지 않은 세포 또는 바이러스를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 가이드 RNA는 상기 바람직하지 않은 세포 또는 바이러스가 불활성화되도록 특이적으로 선택되는 것인, 바람직하지 않은 세포 또는 바이러스를 특이적으로 불활성화시키는 방법.
14항. 질환 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제3항 또는 제4항에 따른 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 예컨대, 예를 들어, 감염 및/또는 유전적 장애, 예컨대, 증식성 장애, 예컨대, 암, 진균, 원생동물, 박테리아 및/또는 바이러스 감염, 자가면역 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법.
15항. dsDNA, ssDNA, 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자를 절단하기 위한, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA를 검출하기 위한, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 발현을 조정하기 위한, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 서열을 편집하기 위한, 바람직하지 않은 세포 또는 바이러스를 특이적으로 불활성화시키기 위한, 제제에서 바람직하지 않은 오염 물질을 오염제거하기 위한, 또는 제10항에 따른 방법에 의해 편집되지 않은 상태 그대로 남아 있는 세포를 제거하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 복합체의 용도.
16항. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA 분자가 표적 RNA와 적어도 80%, 바람직하게, 90% 초과, 더욱 바람직하게, 95% 초과, 및 가장 바람직하게, 100% 상보적인 서열을 포함하는 것인 복합체 또는 방법.
17항. 제10항에 따른 방법에 의해 편집되지 않은 바람직하지 않은 세포를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 가이드 RNA는 상기 편집되지 않은 세포가 제거, 불활성화 및/또는 사멸되도록 특이적으로 선택되는 것인, 제10항에 따른 방법에 의해 편집되지 않은 바람직하지 않은 세포를 특이적으로 제거, 불활성화 및/또는 사멸시키는 방법.
본 발명은 이제 첨부된 도면을 참조하여 하기 실시예에서 추가로 설명될 것이지만, 이에 제한되는 것은 원치 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 본 개시내용은 설명의 일부로서 서열 번호: 1 내지 67을 포함하는 서열 목록을 포함하며, 이 또한 그 전문이 참조로 포함된다.
도 1은 CasΩ가 클래스 2 타입 V CRISPR-Cas 뉴클레아제 중에서 뚜렷이 다른 3개의 클레이드를 형성한다는 것을 보여주는 것이다. 대표적인 뉴클레아제 SmCasΩ, SuCasΩ 및 ca40CasΩ로 대표되는 뚜렷이 다른 3개의 단일계통 CasΩ 클레이드를 비롯한 클래스 2 타입 V CRISPR-Cas 단백질 서열의 최대 가능도 계통발생이 생성되었다. CasΩ 뉴클레아제는 Cas12a와 마지막 공통 조상을 공유하지 않는다.
도 2는 CRISPR-SuCasΩ 뉴클레아제에서의 RuvC-I과 RuvC-III 모티프 사이의 아미노산 보존을 보여주는 것이다. SuCasΩ 계통발생 클레이드로부터의 뉴클레아제 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 다중 보존된 아미노산 모티프의 삽입을 포함하는 RuvC-I과 RuvC-II 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다. 추가로, SuCasΩ 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 아미노산의 결실을 포함하는 RuvC-II와 RuvC-III 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다. 상대 엔트로피는 비트 단위로 제시되어 있다. 높은 엔트로피는 주어진 아미노산이 16개의 SuCasΩ 오솔로그 정렬을 기반으로 한 오솔로그 모티프에 존재한다는 높은 확실성을 나타낸다.
도 3은 CRISPR-SmCasΩ 뉴클레아제에서의 RuvC-I과 RuvC-III 모티프 사이의 아미노산 보존을 보여주는 것이다. SmCasΩ 계통발생 클레이드로부터의 뉴클레아제 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 다중 보존된 아미노산 모티프의 삽입을 포함하는 RuvC-I과 RuvC-II 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다. 추가로, SmCasΩ 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 아미노산의 결실을 포함하는 RuvC-II와 RuvC-III 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다. 상대 엔트로피는 비트 단위로 제시되어 있다. 높은 엔트로피는 주어진 아미노산이 36개의 SmCasΩ 오솔로그 정렬을 기반으로 한 오솔로그 모티프에 존재한다는 높은 확실성을 나타낸다.
도 4는 CRISPR-ca40CasΩ 뉴클레아제에서의 RuvC-I과 RuvC-III 모티프 사이의 아미노산 보존을 보여주는 것이다. ca40CasΩ 계통발생 클레이드로부터의 뉴클레아제 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 다중 보존된 아미노산 모티프의 삽입을 포함하는 RuvC-I과 RuvC-II 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다. 추가로, ca40CasΩ 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 아미노산의 결실을 포함하는 RuvC-II와 RuvC-III 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다. 상대 엔트로피는 비트 단위로 제시되어 있다. 높은 엔트로피는 주어진 아미노산이 15개의 ca40CasΩ 오솔로그 정렬을 기반으로 한 오솔로그 모티프에 존재한다는 높은 확실성을 나타낸다.
도 5는 CasΩ가 시험관내에서 RNA를 인식하고, RNA, ssDNA 및 dsDNA를 절단한다는 것을 보여주는 것이다. 정제된 SuCasΩ 및 설계된 가이드 RNA (crRNA)를 비표지된 표적 또는 비-표적 RNA 뿐만 아니라, 표지된 비-표적 단일 가닥 DNA (ssDNA), 이중 가닥 DNA (dsDNA), 및 단일 가닥 RNA (ssRNA)와 조합하였다. (a) RNA 표적이 존재하는 경우에만 SuCasΩ는 비-표적 ssDNA, dsDNA, 및 ssRNA를 분해하였다. (b) 비-표적 RNA가 존재하는 경우, SuCasΩ는 ssDNA, dsDNA, 및 ssRNA를 분해하지 않았다. 이러한 활성 (특히, RNA 표적 인식 및 dsDNA 부차적 분해)은 CRISPR 뉴클레아제에 대한 완전히 고유한 활성을 나타낸다.
도 6은 시험관내 CasΩ에 의한 RNA 유발 DNA 분해가 RuvC 도메인에 의존한다는 것을 보여주는 것이다. SuCasΩ는 DNA 절단과 연관된 RuvC 모티프 내의 두 부위에서 돌연변이화시켰다. 이전 도면에 기술된 바와 같이 절단 검정법을 수행하였다. 이 경우, RuvC 도메인을 돌연변이시켰을 때, RNA 유발 dsDNA 분해가 제거되었다.
도 7은 CasΩ가 시험관내에서 RNA 표적 인식 후 ssDNA를 분해한다는 것을 보여주는 것이다. RNA 유발 SuCasΩ 활성을 ssDNA를 사용하여 시험관내에서 시험하였다. ssDNA를 형광 검출을 위해 형광단으로 표지하였다. 결과는 ssDNA 또한 유발된 SuCasΩ에 의해 분해된다는 것을 보여준다. 표적 ssDNA 및 dsDNA는 SuCasΩ 활성을 유발하지 않았다.
도 8은 CasΩ가 시험관내에서 RNA 표적 인식 후 플라스미드 DNA를 분해한다는 것을 보여주는 것이다. RNA 유발 SuCasΩ 활성을 플라스미드 DNA를 사용하여 시험관내에서 시험하였다. 플라스미드는 핵산 생성물을 아가로스 겔 상에 전개시키고, 에티듐 브로마이드로 염색하여 검출하였다. 결과는 플라스미드 DNA 또한 유발된 SuCasΩ에 의해 분해된다는 것을 보여준다.
도 9는 CasΩ가 E. 콜라이(E. coli)에서 표적 인식 후 성장을 손상시킨다는 것을 보여주는 것이다. SuCasΩ의 활성은 표적 플라스미드 또는 임의의 플라스미드를 선택하지 않고 평가하였다. (a-b) 이미 crRNA 플라스미드 및 표적/비-표적 플라스미드를 보유하는 세포로 SuCasΩ 플라스미드를 형질전환시켰을 때의 형질전환 감소 배수. 표적 플라스미드의 선택하에 또는 그러한 선택 없이 상이한 PAM 및 rPAM 및 표적 미스매치를 시험하였다. rPAM은 Cas12a에 대한 PAM과 일치하는 DNA 역상보체로 보고된다 (예컨대, 5'-GAAA-3' rPAM은 5'-TTTC-3'으로 보고된다). Cas12a가 아닌 SuCasΩ는 심지어 표적 플라스미드에 대한 선택이 이루어지지 않은 때에도 플라스미드 형질전환을 감소시켰다. (c) 상이한 선택 조건하에서 상이한 뉴클레아제를 발현하는 E. 콜라이 세포의 성장 평가. LbCas12a가 아닌 SuCasΩ 및 LsCas13a는 심지어 선별 항생제 부재하에서도 성장을 감소시켰다. LsCas13a는 표적 인식시 세포 RNA를 부차적으로 분해하여 성장에 대해 유사한 효과를 발휘하는 것으로 공지되어 있다. 추가로, CasΩ 표적화는 E. 콜라이에서 SOS 반응, 세포 독성 및 DNA 손실을 유도하는 것으로 나타났다. 다른 뉴클레아제와 비교하여 SuCasΩ에 의한 표적화의 영향을 E. 콜라이에서 추가로 평가하였다. (d) GFP 발현을 구동시키는 recA 프로모터를 사용한 SOS 반응 측정. 모두 선별 항생제의 부재하에서 뉴클레아제 및 가이드 RNA의 4 h 유도 후에 GFP 형광을 측정하였다. 비-표적 대조군과 비교하여 오직 SuCasΩ만이 SOS 반응을 유의적으로 유도하였다. (e) 세포 형태 및 DNA 함량 평가. 세포를 DNA 결합 염료 DAPI로 염색하고, 유세포 분석법에 의한 분석에 의해 평가하였다. SuCasΩ 표적화가 이루어진 세포만이 집단에서 분기가 일어났는데, 일부 세포는 사상형 세포가 되었고, 다른 나머지 세포는 작아지고, DNA를 적게 함유하게 되었다. 둘 모두 광범위한 DNA 손상을 반영하는 것이다.
도 10은 CasΩ 뉴클레아제가 TXTL에서 RNA 유발 부차적 활성을 나타낸다는 것을 보여주는 것이다. 형광 GFP 리포터를 코딩하는 비-표적 플라스미드 DNA를 사용하여 무세포 전사-번역 (TXTL) 반응에서 RNA 유발 SuCasΩ 및 SmCasΩ 활성을 시험하였다. SuCasΩ 및 SmCasΩ 뉴클레아제 및 crRNA가 플라스미드로부터 발현되었다. 표적 RNA는 반응에서 별도의 플라스미드로부터 발현되거나, 발현되지 않았다. 결과는 CasΩ 뉴클레아제에 의한 RNA 인식이 비-표적 GFP 발현 리포터 플라스미드의 부차적인 분해로 인한 GFP 형광을 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 11은 SuCasΩ가 표적 RNA 분자를 검출할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. CasΩ의 이러한 특성은 표적 RNA 농도가 알려지지 시험 샘플에서 crRNA에 의해 정의된 RNA 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다.
도 12는 SuCasΩ 계통발생 클레이드로부터의 CasΩ 뉴클레아제가 TXTL에서 RNA 유발 온-타겟 활성 및 부차적 오프-타겟 활성을 나타낸다는 것을 보여주는 것이다.
도 13은 SmCasΩ 계통발생 클레이드로부터의 CasΩ 뉴클레아제가 TXTL에서 RNA 유발 온-타겟 활성 및 부차적 오프-타겟 활성을 나타낸다는 것을 보여주는 것이다.
도 14는 ca40CasΩ 계통발생 클레이드로부터의 CasΩ 뉴클레아제가 TXTL에서 RNA 유발 온-타겟 활성 및 부차적 오프-타겟 활성을 나타낸다는 것을 보여주는 것이다.
도 15는 SuCasΩ 뉴클레아제가 비-표적화 crRNA와 비교하여 표적화 crRNA의 존재하에서 T4 박테리오파지 플라크의 개수를 감소시켰다는 것을 보여주는 것이다.
도 16은 CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, N-말단 및 C-말단에 핵 국재화 서열 (NLS) (N-NLS 및 C-NLS)을 함유하는 ca33CasΩ 및 SuCasΩ가 TXTL에서 RNA 유발 온-타겟 활성 및 부차적 오프-타겟 활성을 나타낸다는 것을 보여주는 것이다.
도 17은 ca33CasΩ의 활성이 HEK293T 세포의 상대적 생존능을 감소시켰다는 것을 보여주는 것이다.
도 18은 혈구계수기 데이터를 보여주는 것이다 (하기 실시예 참조). 비형질감염 세포 - 리포펙타민으로 처리되었으나 DNA는 처리되지 않은 HEK293 세포; 대조군 - 포유동물 세포에서 어느 것도 표적화하지 않는 스크램블된 가이드가 있는 야생형 (WT) SuCasΩ; GAPDH - GAPDH mRNA 상의 별개의 세 영역을 표적화하는 가이드가 있는 WT SuCasΩ; MALAT1 - MALAT1 mRNA 상의 별개의 세 영역을 표적화하는 가이드가 있는 WT SuCasΩ; 및 GAPDH RuvC - GAPDH mRNA 상의 별개의 세 영역을 표적화하는 가이드가 있는 RuvC 활성 부위 중의 SuCasΩ E1070A 돌연변이체.
도 19는 혈구계수기 데이터를 보여주는 것이다 (하기 실시예 참조). 대조군 - 포유동물 세포에서 어느 것도 표적화하지 않는 스크램블된 가이드가 있는 WT SuCasΩ; GAPDH - GAPDH mRNA 상의 별개의 세 영역을 표적화하는 가이드가 있는 WT SuCasΩ.
도 20은 유세포 분석법의 데이터를 보여주는 것이다 (하기 실시예 참조). 대조군 - 포유동물 세포에서 어느 것도 표적화하지 않는 스크램블된 가이드가 있는 WT SuCasΩ; GAPDH - GAPDH mRNA 상의 별개의 세 영역을 표적화하는 가이드가 있는 WT SuCasΩ.
도 21은 유세포 분석법의 데이터를 보여주는 것이다 (하기 실시예 참조). 대조군 - 포유동물 세포에서 어느 것도 표적화하지 않는 스크램블된 가이드가 있는 WT SuCasΩ; GAPDH - GAPDH mRNA 상의 별개의 세 영역을 표적화하는 가이드가 있는 WT SuCasΩ.
도 22는 세포분석법의 데이터를 보여주는 것이다 (하기 실시예 참조). 대조군 - 포유동물 세포에서 어느 것도 표적화하지 않는 스크램블된 가이드가 있는 WT SuCasΩ; GAPDH - GAPDH mRNA 상의 별개의 세 영역을 표적화하는 가이드가 있는 WT SuCasΩ.
실시예
CasΩ가 클래스 2 타입 V CRISPR - Cas 뉴클레아제 중에서 뚜렷이 다른 3개의 클레이드를 형성한다.
대표적인 뉴클레아제 SmCasΩ, SuCasΩ, 및 ca40CasΩ로 대표되는 뚜렷이 다른 3개의 단일계통 CasΩ 클레이드를 비롯한 클래스 2 타입 V CRISPR-Cas 단백질 서열의 최대 가능도 계통발생이 생성되었다. CasΩ 뉴클레아제는 Cas12a와 마지막 공통 조상을 공유하지 않는다. ClustalΩ를 이용하여 단백질의 아미노산 서열을 정렬하였다. 하기 파라미터를 사용하여 RAxML-NG를 이용함으로써 계통발생적 재구성을 생성하였다:
--model JTT+G --bs-metric fbp,tbe --tree pars{60},rand{60} --seed 12345 --bs-trees autoMRE. TnpB 아미노산 서열은 외집단 분류군으로서의 역할을 하였다. 도 1 또한 참조한다.
CRISPR - SuCasΩ 뉴클레아제 내의 아미노산 보존 분석.
SuCasΩ 계통발생 클레이드로부터의 뉴클레아제 오솔로그는 타입 V CRISPR-Cas 뉴클레아제에 공통된 RuvC-I, RuvC-II, 및 RuvC-III 촉매성 모티프를 함유한다. SuCasΩ 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a에는 없는 다중의 보존된 아미노산 모티프를 함유한다. 평균적으로, SuCasΩ 오솔로그는 Cas12a 뉴클레아제와 ≤10%의 서열 동일성을 공유한다. 16개의 SuCasΩ 오솔로그의 정렬 내의 각 위치에 아미노산 확률이 제시되어 있다. ClustalΩ를 이용하여 단백질의 아미노산 서열을 정렬하였다. WebLogo 3을 이용하여 아미노산 로고 및 상응하는 확률을 생성하였다.
CRISPR - SuCasΩ 뉴클레아제에서의 RuvC -I과 RuvC -III 모티프 사이의 아미노산 보존.
SuCasΩ 계통발생 클레이드로부터의 뉴클레아제 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 다중 보존된 아미노산 모티프의 삽입을 포함하는 RuvC-I과 RuvC-II 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다. 추가로, SuCasΩ 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 아미노산의 결실을 포함하는 RuvC-II와 RuvC-III 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다. 상대 엔트로피는 비트 단위로 제시되어 있다. 높은 엔트로피는 주어진 아미노산이 16개의 SuCasΩ 오솔로그 정렬을 기반으로 한 오솔로그 모티프에 존재한다는 높은 확실성을 나타낸다. ClustalΩ를 이용하여 단백질의 아미노산 서열을 정렬하였다. WebLogo 3을 이용하여 아미노산 로고 및 상응하는 엔트로피 값을 생성하였다. 도 2 또한 참조한다.
CRISPR - SmCasΩ 뉴클레아제 내의 아미노산 보존.
SmCasΩ 계통발생 클레이드로부터의 뉴클레아제 오솔로그는 타입 V CRISPR-Cas 뉴클레아제에 공통된 RuvC-I, RuvC-II, 및 RuvC-III 촉매성 모티프를 함유한다. SmCasΩ 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제 예컨대, Cas12a에는 없는 다중의 보존된 아미노산 모티프를 함유한다. 평균적으로, SmCasΩ 오솔로그는 Cas12a 뉴클레아제와 ≤10%의 서열 동일성을 공유한다. 36개의 SmCasΩ 오솔로그의 정렬 내의 각 위치에 아미노산 확률이 제시되어 있다. ClustalΩ를 이용하여 단백질의 아미노산 서열을 정렬하였다. WebLogo 3을 이용하여 아미노산 로고 및 상응하는 확률을 생성하였다.
CRISPR - SmCasΩ 뉴클레아제에서의 RuvC -I과 RuvC -III 모티프 사이의 아미노산 보존.
SmCasΩ 계통발생 클레이드로부터의 뉴클레아제 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 다중 보존된 아미노산 모티프의 삽입을 포함하는 RuvC-I과 RuvC-II 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다. 추가로, SmCasΩ 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 아미노산의 결실을 포함하는 RuvC-II와 RuvC-III 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다. 상대 엔트로피는 비트 단위로 제시되어 있다. 높은 엔트로피는 주어진 아미노산이 36개의 SmCasΩ 오솔로그 정렬을 기반으로 한 오솔로그 모티프에 존재한다는 높은 확실성을 나타낸다. ClustalΩ를 이용하여 아미노산 서열을 정렬하였다. WebLogo 3을 이용하여 아미노산 로고 및 상응하는 엔트로피 값을 생성하였다. 도 3 또한 참조한다.
CRISPR - ca40CasΩ 뉴클레아제 내의 아미노산 보존.
ca40CasΩ 계통발생 클레이드로부터의 뉴클레아제 오솔로그는 타입 V CRISPR-Cas 뉴클레아제에 공통된 RuvC-I, RuvC-II, 및 RuvC-III 촉매성 모티프를 함유한다. ca40CasΩ 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제 예컨대, Cas12a에는 없는 다중의 보존된 아미노산 모티프를 함유한다. 평균적으로, ca40CasΩ 오솔로그는 Cas12a 뉴클레아제와 ≤10%의 서열 동일성을 공유한다. 15개의 ca40CasΩ 오솔로그의 정렬 내의 각 위치에 아미노산 확률이 제시되어 있다. ClustalΩ를 이용하여 단백질의 아미노산 서열을 정렬하였다. WebLogo 3을 이용하여 아미노산 로고 및 상응하는 확률을 생성하였다.
CRISPR - ca40CasΩ 뉴클레아제에서의 RuvC -I과 RuvC -III 모티프 사이의 아미노산 보존.
ca40CasΩ 계통발생 클레이드로부터의 뉴클레아제 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 다중 보존된 아미노산 모티프의 삽입을 포함하는 RuvC-I과 RuvC-II 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다. 추가로, ca40CasΩ 오솔로그는 비-CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, Cas12a와 비교하여 아미노산의 결실을 포함하는 RuvC-II와 RuvC-III 촉매성 모티프 사이의 독특한 아미노산 조성을 나타낸다. 상대 엔트로피는 비트 단위로 제시되어 있다. 높은 엔트로피는 주어진 아미노산이 15개의 ca40CasΩ 오솔로그 정렬을 기반으로 한 오솔로그 모티프에 존재한다는 높은 확실성을 나타낸다. ClustalΩ를 이용하여 단백질의 아미노산 서열을 정렬하였다. WebLogo 3을 이용하여 아미노산 로고 및 상응하는 엔트로피 값을 생성하였다. 도 4 또한 참조한다.
CasΩ가 시험관내에서 RNA를 인식하고, RNA, ssDNA , 및 dsDNA를 절단한다.
도 5에 제시된 바와 같이, 정제된 SuCasΩ 및 설계된 가이드 RNA (crRNA)를 비표지된 표적 또는 비-표적 RNA 뿐만 아니라, 표지된 비-표적 단일 가닥 DNA (ssDNA), 이중 가닥 DNA (dsDNA), 및 단일 가닥 RNA (ssRNA)와 조합하였다. (a) RNA 표적이 존재하는 경우에만 SuCasΩ는 비-표적 ssDNA, dsDNA, 및 ssRNA를 분해하였다. (b) 비-표적 RNA가 존재하는 경우, SuCasΩ는 ssDNA, dsDNA, 및 ssRNA를 분해하지 않았다. 이러한 활성 (특히, RNA 표적 인식 및 dsDNA 부차적 분해)은 CRISPR 뉴클레아제에 대한 완전히 고유한 활성을 나타낸다.
도 5의 a)의 경우, 대략 250 nM CasΩ:crRNA 복합체를 100 nM의 비표지된 표적화된 ssRNA 또는 비-표적화된 ssRNA 및 100 nM의 표지된 부차적 기질 (비-표적 ssDNA, dsDNA, 및 ssRNA, *는 5' FAM 표지를 나타낸다)과 함께 혼합하였다. 반응물을 NEB 3.1 (50 mM 트리스-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 100 ㎍/mL BSA)에서 러닝시켰다. 반응물을 H2O로 10 ㎕가 되도록 희석시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응물을 12% UREA-PAGE에 의해 분리하기 전, 페놀:클로로포름으로 추출하였다. 겔 상의 밴드는 표지된 FAM 기질의 것이다. 도 5의 b)의 경우, 대략 250 nM WT CasΩ:crRNA 복합체를 100 nM의 비표지된 표적 ssRNA 또는 비-표적 ssRNA 및 100 nM의 5' FAM 표지된 비-표적 dsDNA와 함께 혼합하였다. 반응물을 NEB 3.1 (50 mM 트리스-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 100 ㎍/mL BSA)에서 러닝시켰다. 반응물을 H2O로 10 ㎕가 되도록 희석시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 시점을 1, 5, 10, 30, 60 min으로 취하고, 12% UREA-PAGE에서 분리하기 전, 페놀:클로로포름 추출로 ??칭하였다. 겔 상의 밴드는 표지된 FAM 기질의 것이다.
시험관내 CasΩ에 의한 RNA 유발 DNA 분해가 RuvC 도메인에 의존한다.
도 6에 제시된 바와 같이, SuCasΩ는 DNA 절단과 연관된 RuvC 모티프 내의 두 부위에서 돌연변이화시켰다. 이전 도면에 기술된 바와 같이 절단 검정법을 수행하였다. 이 경우, RuvC 도메인을 돌연변이시켰을 때, RNA 유발 dsDNA 분해가 제거되었다. 대략 250 nM E1064A/D1213A CasΩ:crRNA 복합체를 100 nM의 비표지된 표적 ssRNA 또는 비-표적 ssRNA 및 100 nM의 5' FAM 표지된 비-표적 dsDNA와 함께 혼합하였다. 반응물을 NEB 3.1 (50 mM 트리스-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 100 ㎍/mL BSA)에서 러닝시켰다. 반응물을 H2O로 10 ㎕가 되도록 희석시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 시점을 1, 5, 10, 30, 60 min으로 취하고, 12% UREA-PAGE에서 분리하기 전, 페놀:클로로포름 추출로 ??칭하였다. 도 6 중 겔 상의 밴드는 표지된 FAM 기질의 것이다.
CasΩ가 시험관내에서 RNA 표적 인식 후 ssDNA를 분해한다.
RNA 유발 SuCasΩ 활성을 비-표적 ssDNA를 사용하여 시험관내에서 시험하였다. ssDNA를 형광 검출을 위해 형광단으로 표지하였다. 결과는 ssDNA 또한 유발된 SuCasΩ에 의해 분해된다는 것을 보여준다. 표적 ssDNA 및 dsDNA는 SuCasΩ 활성을 유발하지 않았다. 도 7에 제시된 바와 같은 결과의 경우, 대략 250 nM CasΩ:crRNA 복합체를 100 nM의 표지된 기질 (표적: ssRNA, ssDNA, 또는 dsDNA)과 함께 혼합하였다. 반응물을 NEB 3.1 (50 mM 트리스-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 100 ㎍/mL BSA)에서 러닝시켰다. 반응물을 H2O로 10 ㎕가 되도록 희석시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응물을 0.5X MOPS 완충제 (10mM MOPS, (pH 7.0), 2.5 mM 아세트산 나트륨, 0.5 mM EDTA) 중 12% UREA-PAGE에서 분리하기 전, 페놀:클로로포름으로 추출하고, 포름알데히드 중에서 변성시켰다. 겔 상의 밴드는 표지된 FAM 기질의 것이다.
CasΩ가 시험관내에서 RNA 표적 인식 후 플라스미드 DNA를 분해한다.
RNA 유발 SuCasΩ 활성을 플라스미드 DNA를 사용하여 시험관내에서 시험하였다. 플라스미드는 핵산 생성물을 아가로스 겔 상에 전개시키고, 에티듐 브로마이드로 염색하여 검출하였다. 결과는 플라스미드 DNA 또한 유발된 SuCasΩ에 의해 분해된다는 것을 보여준다. 도 8에 제시된 결과의 경우, 대략 100 nM CasΩ:crRNA 복합체를 100 nM의 비표지된 표적 ssRNA 또는 비-표적 ssRNA 및 40 nM의 비-표적 플라스미드 (비-표적 pet27b TTTC)와 함께 혼합하였다. 반응물을 NEB 3.1 (50 mM 트리스-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 100 ㎍/mL BSA)에서 러닝시켰다. 반응물을 H2O로 10 ㎕가 되도록 희석시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응물을 1% 아가로스 중에서의 전기영동에 의해 분리하기 전, 페놀:클로로포름으로 추출하였다. 핵산을 에티듐 브로마이드로 염색하여 시각화하였다.
CasΩ가 E. 콜라이에서 표적 인식 후 성장을 손상시킨다.
SuCasΩ의 활성은 표적 플라스미드 또는 임의의 플라스미드를 선택하지 않고 평가하였다. 도 9에 제시된 바와 같이; (a-b) 이미 crRNA 플라스미드 및 표적/비-표적 플라스미드를 보유하는 세포로 SuCasΩ 플라스미드를 형질전환시켰을 때의 형질전환 감소 배수. 표적 플라스미드의 선택하에 또는 그러한 선택 없이 상이한 PAM 및 rPAM 및 표적 미스매치를 시험하였다. Cas12a가 아닌 SuCasΩ는 심지어 표적 플라스미드에 대한 선택이 이루어지지 않은 때에도 플라스미드 형질전환을 감소시켰다. (c) 상이한 선택 조건하에서 상이한 뉴클레아제를 발현하는 E. 콜라이 세포의 성장 평가. LbCas12a가 아닌 SuCasΩ 및 LsCas13a는 심지어 선별 항생제 부재하에서도 성장을 감소시켰다. LsCas13a는 표적 인식시 세포 RNA를 부차적으로 분해하여 성장에 대해 유사한 효과를 발휘하는 것으로 공지되어 있다. 다른 뉴클레아제와 비교하여 SuCasΩ에 의한 표적화의 영향을 E. 콜라이에서 추가로 평가하였다. (d) GFP 발현을 구동시키는 recA 프로모터를 사용한 SOS 반응 측정. 모두 선별 항생제의 부재하에서 뉴클레아제 및 가이드 RNA의 4 h 유도 후에 GFP 형광을 측정하였다. 비-표적 대조군과 비교하여 오직 SuCasΩ만이 SOS 반응을 유의적으로 유도하였다. (e) 세포 형태 및 DNA 함량 평가. 세포를 DNA 결합 염료 DAPI로 염색하고, 유세포 분석법에 의한 분석에 의해 평가하였다. SuCasΩ 표적화가 이루어진 세포만이 집단에서 분기가 일어났는데, 일부 세포는 사상형 세포가 되었고, 다른 나머지 세포는 작아지고, DNA를 적게 함유하게 되었다. 둘 모두 광범위한 DNA 손상을 반영하는 것이다.
CasΩ 뉴클레아제가 TXTL에서 RNA 유발 부차적 활성을 나타낸다.
형광 GFP 리포터를 코딩하는 비-표적 플라스미드 DNA를 사용하여 무세포 전사-번역 (TXTL) 반응에서 RNA 유발 SuCasΩ 및 SmCasΩ 활성을 시험하였다. SuCasΩ 및 SmCasΩ 뉴클레아제 및 crRNA가 플라스미드로부터 발현되었다. 표적 RNA는 반응에서 별도의 플라스미드로부터 발현되거나, 발현되지 않았다. 결과는 CasΩ 뉴클레아제에 의한 RNA 인식이 비-표적 GFP 발현 리포터 플라스미드의 부차적인 분해로 인한 GFP 형광을 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 10, 및 도 12 내지 14 및 16 또한 참조한다.
진단 용도 예시: SARS-CoV-2를 인식하도록 설계된 CasΩ 및 가이드 RNA를 형광단 및 소광제 뿐만 아니라, 환자 샘플로부터 추출된 RNA에 융합된 dsDNA 프로브와 조합한다. RNA 샘플이 SARS-CoV-2 RNA를 함유할 경우, CasΩ:가이드 RNA 복합체는 dsDNA 프로브를 분해하도록 유발될 것이다.
소광제로부터 형광단이 방출되면 형광 신호가 생성될 것이다. 이러한 동일한 접근법을 사용하여 SARS-CoV-2 변이체를 구별할 수 있다.
서열-특이적 사멸 예시: 키메라 항원 수용체는 면역요법의 파트로서 천연 수용체 유전자좌의 환자 T 세포에 삽입되지만, 편집은 세포의 1%에서만 발생한다. CasΩ-NLS 및 편집되지 않은 유전자 좌 (편집된 유전자좌가 아닌 것)를 인식하도록 설계된 가이드 RNA는 플라스미드의 일시적인 형질감염 또는 RNP 전달을 통해 도입된다. 전사된 WT 유전자좌에서 RNA를 인식하면 광범위한 dsDNA 분해가 유발되어 편집되지 않은 세포가 제거된다. 그 결과 집단은 이제 거의 100% 편집된 세포를 포함한다. CasΩ는 또한 접합된 플라스미드 또는 박테리오파지/파지미드를 통해 병원체에 전달될 수 있으며, 이는 미생물 집단 또는 마이크로바이옴 내에서 서열-특이적 사멸을 허용한다.
CasΩ 뉴클레아제가 다양한 표적 RNA 농도를 검출할 수 있다.
도 11은 SuCasΩ가 표적 RNA 분자를 검출할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 1x100 내지 1x109 분자의 표적 RNA를 1x NEB 3.1 완충제 (NEB B7203)에서 100 nM SuCasΩ-crRNA 복합체 및 1 μM DNAse Alert (IDT, 11-02-01-04)를 사용하여 시험하였다. SuCasΩ-crRNA 복합체는 SuCasΩ 뉴클레아제를 crRNA와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킴에 따라 형성되었다. 검출은 각각 500/20 및 560/20의 여기 파장과 방출 파장으로 형광을 측정하여 실온에서 1시간 동안 수행하였다. 결과는 SuCasΩ의 활성화가 표적 RNA의 농도에 의존한다는 것을 보여준다. CasΩ의 이러한 특성은 진단 용도로 표적 RNA 농도가 알려지지 않은 시험 샘플에서 crRNA에 의해 정의된 RNA 농도를 결정하는 데 이용될 수 있다.
SuCasΩ , SmCasΩ , 및 ca40CasΩ 계통발생 클레이드로부터의 CasΩ 뉴클레아제가 무세포 전사-번역 ( TXTL ) 검정법에서 RNA 유발 온- 타겟 활성 및 오프 - 타겟 부차적 활성을 나타낸다.
도 12에 제시된 바와 같이, SuCasΩ 계통발생 클레이드로부터의 CasΩ 뉴클레아제는 TXTL에서 RNA 유발 온-타겟 활성 및 부차적 오프-타겟 활성을 나타낸다 (도 10 또한 참조). GFP를 코딩하는 표적 플라스미드 DNA 및 mCherry 형광 리포터를 코딩하는 비-표적 플라스미드 DNA를 이용하여 RNA 유발 ca33CasΩ, ca17CasΩ, AbCasΩ, 및 SuCasΩ 활성을 시험하였다. ca33CasΩ, ca17CasΩ, AbCasΩ, 및 SuCasΩ 뉴클레아제 및 표적화 또는 비-표적화 crRNA가 플라스미드로부터 발현되었다. 결과는 CasΩ 뉴클레아제에 의한 RNA 인식이 표적 GFP 발현 리포터 플라스미드 및 동족 RNA의 분해로 인한 GFP 형광의 감소 및 비-표적 mCherry 발현 리포터 플라스미드 및 동족 RNA의 부차적 분해로 인한 mCherry 형광의 감소로 이어진다는 것을 보여준다.
도 13에 제시된 바와 같이, SmCasΩ 계통발생 클레이드로부터의 CasΩ 뉴클레아제는 TXTL에서 RNA 유발 온-타겟 활성 및 부차적 오프-타겟 활성을 나타낸다 (도 10 또한 참조). GFP를 코딩하는 표적 플라스미드 DNA 및 mCherry 형광 리포터를 코딩하는 비-표적 플라스미드 DNA를 이용하여 RNA 유발 ca16CasΩ 및 SmCasΩ 활성을 시험하였다. ca16CasΩ 및 SmCasΩ 뉴클레아제 및 표적화 또는 비-표적화 crRNA가 플라스미드로부터 발현되었다. 결과는 CasΩ 뉴클레아제에 의한 RNA 인식이 표적 GFP 발현 리포터 플라스미드 및 동족 RNA의 분해로 인한 GFP 형광의 감소 및 비-표적 mCherry 발현 리포터 플라스미드 및 동족 RNA의 부차적 분해로 인한 mCherry 형광의 감소로 이어진다는 것을 보여준다.
도 14에 제시된 바와 같이, ca40CasΩ 계통발생 클레이드로부터의 CasΩ 뉴클레아제는 TXTL에서 RNA 유발 온-타겟 활성 및 부차적 오프-타겟 활성을 나타낸다 (도 10 또한 참조). GFP를 코딩하는 표적 플라스미드 DNA 및 mCherry 형광 리포터를 코딩하는 비-표적 플라스미드 DNA를 이용하여 RNA 유발 ca40CasΩ, ca50CasΩ, 및 ca134CasΩ 활성을 시험하였다. ca40CasΩ, ca50CasΩ, 및 ca134CasΩ 뉴클레아제 및 표적화 또는 비-표적화 crRNA가 플라스미드로부터 발현되었다. 결과는 CasΩ 뉴클레아제에 의한 RNA 인식이 표적 GFP 발현 리포터 플라스미드 및 동족 RNA의 분해로 인한 GFP 형광의 감소 및 비-표적 mCherry 발현 리포터 플라스미드 및 동족 RNA의 부차적 분해로 인한 mCherry 형광의 감소로 이어진다는 것을 보여준다.
CasΩ가 E. 콜라이에서 표적 인식 후 T4 파지 증식을 손상시킨다.
박테리아 바이러스 (박테리오파지)를 불활성화시키는 SuCasΩ의 능력을 플라크 검정법에서 평가하였다. 도 15에 제시된 바와 같이, SuCasΩ 뉴클레아제가 비-표적화 crRNA와 비교하여 표적화 crRNA의 존재하에서 T4 박테리오파지 플라크의 개수를 감소시켰다. E. 콜라이 박테리아는 SuCasΩ 또는 LbCas12a 뉴클레아제, 및 T4 박테리오파지의 e 유전자의 전사체를 표적화하는 crRNA 또는 비-표적 crRNA를 발현하였다. 상기 박테리아를 아가 플레이트에서 성장시키고, T4 박테리오파지로 감염시켰다. 성공적인 T4 박테리오파지 감염 및 증식을 나타내는 플라크를 계수하였다. 상대적 플라크 감소는 표적화 crRNA와 함께 뉴클레아제를 발현하는 배양물, 및 비-표적화 crRNA와 함께 뉴클레아제를 발현하는 배양물에 대하여 수득된 플라크 계수 사이의 비를 나타낸다.
핵 국재화 신호를 함유하는 CasΩ 뉴클레아제가 TXTL에서 RNA 유발 온-타겟 활성 및 오프-타겟 부차적 활성을 나타낸다.
도 16에 제시된 바와 같이, CasΩ 뉴클레아제, 예컨대, N-말단 및 C-말단에 핵 국재화 서열 (NLS) (N-NLS 및 C-NLS)을 함유하는 ca33CasΩ 및 SuCasΩ가 TXTL에서 RNA 유발 온-타겟 활성 및 부차적 오프-타겟 활성을 나타낸다 (도 또한 10 참조). NLS를 갖는 ca33CasΩ 및 SuCasΩ 뉴클레아제 코딩 유전자의 코돈은 포유동물 세포의 코돈 사용빈도를 반영하도록 최적화하였다. C-NLS 및 N-NLS를 포함하는 ca33CasΩ 및 SuCasΩ의 RNA 유발 활성은 GFP를 코딩하는 표적 플라스미드 DNA 및 mCherry 형광 리포터를 코딩하는 비-표적 플라스미드 DNA를 사용하여 시험하였다. 표적화 및 비-표적화 crRNA, 및 C-NLS 및 N-NLS를 포함하는 ca33CasΩ 및 SuCasΩ 뉴클레아제가 플라스미드로부터 발현되었다. 결과는 CasΩ 뉴클레아제에 의한 RNA 인식이 표적 GFP 발현 리포터 플라스미드 및 동족 RNA의 분해로 인한 GFP 형광의 감소 및 비-표적 mCherry 발현 리포터 플라스미드 및 동족 RNA의 부차적 분해로 인한 mCherry 형광의 감소로 이어진다는 것을 보여준다.
CasΩ 뉴클레아제가 포유동물 세포에서 RNA 표적 인식 후 세포 생존능을 감소시킨다.
세포 생존능을 감소시키는 RNA 유발 CasΩ의 능력을 HEK293T 세포에서 시험하였다. 도 17에 제시된 바와 같이, ca33CasΩ의 활성이 HEK293T 세포의 상대적 생존능을 감소시켰다. 사용된 ca33CasΩ 뉴클레아제 코딩 유전자는 포유동물 세포의 코돈 사용빈도를 반영하도록 최적화하였다. 뉴클레아제를 N-말단 및 C-말단에 NLS로 태그부착하거나 (N-/C-NLS); N-말단에는 NLS로, 및 C-말단에는 핵 외수송 서열 (NES)로 태그부착하거나 (N-NLS C-NES); NLS로도 NES로도 태그부착하지 않거나 (부재); C-말단에 NES로 태그부착하였다 (C-NES). 표적화 및 비-표적화 crRNA 및 ca33CasΩ 뉴클레아제가 플라스미드로부터 발현되었다. 표적 GFP RNA가 플라스미드로부터 발현되었다. ca33CasΩ 뉴클레아제 및 비-표적화 crRNA를 발현하는 세포와 비교하여 ca33CasΩ 뉴클레아제 및 GFP RNA를 표적화하는 crRNA를 발현하는 세포에서의 발광 신호의 비율(%)로서 상대적 세포 생존능을 측정하였다. 프로메가(Promega)로부터 입수한 셀타이터-글로 발광 세포 생존능 검정법(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay) (G7570)을 사용하였다. 포유동물 세포의 생존능을 감소시키는 CasΩ의 능력은 치료 용도로 사용될 수 있다.
표적화 crRNA 및 RNA 표적의 존재하에서 CasΩ가 포유동물 세포를 파괴시킨다 .
도 18에 제시된 데이터의 경우, 24 웰 플레이트에 5x104개의 HEK293 세포를 시딩하고, 항생제가 포함된 이글스(Eagle's) 최소 필수 배지 (MEM)에서 48시간 동안 부착 및 성장시켰다. SuCasΩ 뉴클레아제 및 각각의 crRNA를 코딩하는 플라스미드 DNA 500 ng을 리포펙타민 3000 (1.5 ㎕)과 조합하고, 1 ㎕ p3000과 함께 50 ㎕의 opi-MEME에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. DNA-지질 복합체를 세포에 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5.0% CO2의 인큐베이터에 넣었다. 24시간 후, 배지를 제거하고, 수집하였다. 부착 세포를 PBS로 세척하고, 트립신 100 ㎕를 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5.0% CO2에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 400 ㎕의 MEM을 첨가하여 트립신을 불활성화시켰다. 수집된 배지와 함께 세포를 트리판 블루(Trypan blue)를 사용하여 혈구계수기에서 계수하였다. 본 결과는 CasΩ 및 표적화 가이드의 존재가 포유동물 세포의 파괴로 이어진다는 것을 보여주며, 이는 세포의 특정 서열을 표적화하도록 설계된 가이드 및 활성 면역계를 포함하는 실험 조건에서 전체 세포 계수의 감소로 볼 수 있다. 대조군과 비교하여 GAPDH 표적화 조건 및 MALAT1 표적화 조건에서 각각 전체 세포 계수가 20% 및 30% 감소를 보인다.
도 19에 제시된 데이터의 경우, 24 웰 플레이트에 5x104개의 HEK293 세포를 시딩하고, 항생제가 포함된 이글스 최소 필수 배지 (MEM)에서 48시간 동안 부착 및 성장시켰다. SuCasΩ 뉴클레아제 및 각각의 crRNA를 코딩하는 플라스미드 DNA 500 ng을 리포펙타민 3000 (1.5 ㎕)과 조합하고, 1 ㎕ p3000과 함께 50 ㎕의 opi-MEME에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. DNA-지질 복합체를 세포에 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5.0% CO2의 인큐베이터에 넣었다. 24시간, 48시간, 및 72시간 후, 배지를 제거하고, 수집하였다. 부착 세포를 PBS로 세척하고, 트립신 100 ㎕를 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5.0% CO2에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 400 ㎕의 MEM을 첨가하여 트립신을 불활성화시켰다. 수집된 배지와 함께 세포를 트리판 블루를 사용하여 혈구계수기에서 계수하였다. 매일 대조군 조건보다 GAPDH 표적화 조건에서 사멸 세포의 비율이 더 높은 것으로 나타났다. 대조군과 비교하면 GAPDH 표적화 조건에서는 사멸 세포가 50% 내지 120% 더 많았다.
도 20에 제시된 데이터의 경우, 6 웰 플레이트에 5x105개의 HEK293 세포를 시딩하고, 항생제가 포함된 이글스 최소 필수 배지 (MEM)에서 48시간 동안 부착 및 성장시켰다. SuCasΩ 뉴클레아제 및 각각의 crRNA를 코딩하는 플라스미드 DNA 2.5 ㎍을 리포펙타민 3000 (7.5 ㎕)과 조합하고, 5 ㎕ p3000과 함께 250 ㎕의 opi-MEME에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. DNA-지질 복합체를 세포에 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5.0% CO2의 인큐베이터에 넣었다. 48시간 및 120시간 후, 배지를 제거하고, 수집하였다. 부착 세포를 PBS로 세척하고, 트립신 500 ㎕를 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5.0% CO2에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 1.5 ml의 MEM을 첨가하여 트립신을 불활성화시켰다. 수집된 배지와 함께 세포를 트리판 블루를 사용하여 혈구계수기에서 계수하였다. 1x106개의 세포를 수집하고, 별도의 튜브에 첨가하고, 3분 동안 300xg로 스핀 다운시켰다. 세포를 1 ml의 PBS로 1회 세척하고, 다시 스핀 다운시켰다. 재구성된 형광 반응성 염료 1 ㎕를 세포 현탁액에 첨가하고, 완전히 혼합한 후, 차광하에 얼음 상에서 30분 동안 길게 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 1 ml PBS로 세척하고, 900 ㎕의 PBS 중에 재현탁시켰다. 이어서, 2% 포름알데히드로 60분 동안 고정시켰다. 투과화는 0.1% 시트르산나트륨 중 0.1% 트리톤(Triton) X를 사용하여 2분 동안 수행하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, TUNEL 반응 혼합물 50 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 혼합물을 어두운 가습형 인큐베이터에서 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 추가로 2회 더 세척하고, 1% BSA가 포함된 500 ㎕ PBS에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 GFP, DAPI 및 TUNEL에 대한 파장을 모니터링하는 유세포 분석기를 통해 살펴보았다. 본 데이터는 각 조건에서 400 내지 1400개 이벤트로부터 수집하였다. GFP를 포함하는 세포의 비율(%)은 형질감염 효율에 대한 대략적인 추정치를 나타낸다. 활성 CasΩ는 잠재적으로 세포를 완전한 파괴시키는 바, 그 결과로 대조군과 비교하여 GAPDH 표적화 crRNA 및 SuCasΩ를 발현하는 플라스미드를 사용할 때 관찰된 형질감염 효율은 더 낮다.
도 21에 제시된 데이터의 경우, 6 웰 플레이트에 5x105개의 HEK293 세포를 시딩하고, 항생제가 포함된 이글스 최소 필수 배지 (MEM)에서 48시간 동안 부착 및 성장시켰다. SuCasΩ 뉴클레아제 및 각각의 crRNA를 코딩하는 플라스미드 DNA 2.5 ㎍을 리포펙타민 3000 (7.5 ㎕)과 조합하고, 5 ㎕ p3000과 함께 250 ㎕의 opi-MEME에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. DNA-지질 복합체를 세포에 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5.0% CO2의 인큐베이터에 넣었다. 48시간 및 120시간 후, 배지를 제거하고, 수집하였다. 부착 세포를 PBS로 세척하고, 트립신 500 ㎕를 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5.0% CO2에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 1.5 ml의 MEM을 첨가하여 트립신을 불활성화시켰다. 수집된 배지와 함께 세포를 트리판 블루를 사용하여 혈구계수기에서 계수하였다. 1x106개의 세포를 수집하고, 별도의 튜브에 첨가하고, 3분 동안 300xg로 스핀 다운시켰다. 세포를 1 ml의 PBS로 1회 세척하고, 다시 스핀 다운시켰다. 재구성된 형광 반응성 염료 1 ㎕를 세포 현탁액에 첨가하고, 완전히 혼합한 후, 차광하에 얼음 상에서 30분 동안 길게 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 1 ml PBS로 세척하고, 900 ㎕의 PBS 중에 재현탁시켰다. 이어서, 2% 포름알데히드로 60분 동안 고정시켰다. 투과화는 0.1% 시트르산나트륨 중 0.1% 트리톤 X를 사용하여 2분 동안 수행하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, TUNEL 반응 혼합물 50 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 혼합물을 어두운 가습형 인큐베이터에서 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 추가로 2회 더 세척하고, 1% BSA가 포함된 500 ㎕ PBS에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 GFP, DAPI 및 TUNEL에 대한 파장을 모니터링하는 유세포 분석기를 통해 살펴보았다. GAPDH 표적화 조건에서 훨씬 더 많은 DNA 손상이 관찰되었다.
도 22에 제시된 데이터의 경우, 6 웰 플레이트에 5x105개의 HEK293 세포를 시딩하고, 항생제가 포함된 이글스 최소 필수 배지 (MEM)에서 48시간 동안 부착 및 성장시켰다. SuCasΩ 뉴클레아제 및 각각의 crRNA를 코딩하는 플라스미드 DNA 2.5 ㎍을 리포펙타민 3000 (7.5 ㎕)과 조합하고, 5 ㎕ p3000과 함께 250 ㎕의 opi-MEME에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. DNA-지질 복합체를 세포에 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5.0% CO2의 인큐베이터에 넣었다. 48시간 및 120시간 후, 배지를 제거하고, 수집하였다. 부착 세포를 PBS로 세척하고, 트립신 500 ㎕를 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5.0% CO2에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 1.5 ml의 MEM을 첨가하여 트립신을 불활성화시켰다. 수집된 배지와 함께 세포를 트리판 블루를 사용하여 혈구계수기에서 계수하였다. 1x106개의 세포를 수집하고, 별도의 튜브에 첨가하고, 3분 동안 300xg로 스핀 다운시켰다. 세포를 1 ml의 PBS로 1회 세척하고, 다시 스핀 다운시켰다. 재구성된 형광 반응성 염료 1 ㎕를 세포 현탁액에 첨가하고, 완전히 혼합한 후, 차광하에 얼음 상에서 30분 동안 길게 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 1 ml PBS로 세척하고, 900 ㎕의 PBS 중에 재현탁시켰다. 이어서, 2% 포름알데히드로 60분 동안 고정시켰다. 투과화는 0.1% 시트르산나트륨 중 0.1% 트리톤 X를 사용하여 2분 동안 수행하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, TUNEL 반응 혼합물 50 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 혼합물을 어두운 가습형 인큐베이터에서 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 추가로 2회 더 세척하고, 1% BSA가 포함된 500 ㎕ PBS에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 GFP, DAPI 및 TUNEL에 대한 파장을 모니터링하는 유세포 분석기를 통해 살펴보았다. GAPDH 표적화 조건에서 훨씬 더 많은 DNA 손상이 관찰되었다. 예상대로, 사망률은 2일째부터 5일째까지 증가하였다. 전면생장 및 새로운 매질의 부족이 이러한 일반적인 추세에 기여했을 가능성이 높지만, GAPDH 표적화 조건에서 사망률이 더 높았으며, 이는 SuCasΩ가 포유동물 세포의 프로그래밍가능한 파괴를 일으킬 수 있다는 것을 입증한다. CasΩ의 이러한 특성은 치료 용도로 적합화될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Helmholtz-Zentrum f? Infektionsforschung GmbH Utah State University <120> RNA-guided Cas-omega nucleases and uses thereof in diagnostics and therapy <130> H33965WO <150> US 17/335,818 <151> 2021-06-01 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1180 <212> PRT <213> unknown <220> <223> Metagenome-derived sequence <400> 1 Met Ser Asp Lys Asn Gln Ser Phe Ser Gln Phe Thr Asn Leu Tyr Glu 1 5 10 15 Leu Ser Lys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Lys Pro Ser Glu Ile Thr Phe 20 25 30 Glu Lys Leu Glu Asn Asn Lys Leu Phe Lys Val Lys Asp Val Glu Ser 35 40 45 Lys Ile Phe Ser Lys Asn Glu Asn Gly Glu Ile Ser Glu Ala Glu Lys 50 55 60 Lys Val Lys Asn Tyr Leu Phe Asp Ile Asn Glu Thr Glu Leu Asn Asn 65 70 75 80 Leu Val Lys Lys Cys Asp Glu Lys Ile Glu Glu Ile Lys Lys Ile Lys 85 90 95 Asp Phe Leu Glu Lys Asn Pro Asp Lys Leu Trp Gln Val Trp Ile Asp 100 105 110 Asn Glu Lys Ile Lys Ile Ile Asp Lys Asp Leu Lys Tyr Ile Leu Gln 115 120 125 Glu Lys Lys Ser Trp Glu Lys Ser Phe Trp Asn Glu Ala Lys Asn Asp 130 135 140 Lys Lys Thr Gly Asn Leu 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Ser Cys Glu Lys Lys Ala Tyr Glu Leu Gln Lys Glu Lys Lys 1010 1015 1020 Gly Glu Glu Lys Pro Ala Glu Asn Lys Arg Tyr Glu Ala Asp Lys 1025 1030 1035 Lys Ala Gly Val Phe Cys Cys Pro Lys Cys Gly Phe His Asn Arg 1040 1045 1050 Thr Asn Pro Met Gly Tyr Glu Ser Leu Asp Ser Asn Asp Lys Val 1055 1060 1065 Ala Ala Phe Asn Ile Ala Lys Arg Gly Phe Glu Gln Asn Phe Arg 1070 1075 1080 Gln

Claims (15)

  1. CasΩ 뉴클레아제, 및 적어도 하나의 표적 RNA에 결합하도록 설계된 적어도 하나의 미리 선택된 가이드(guide) RNA를 포함하는 복합체(complex).
  2. 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA와 적어도 90% 상보적인 서열을 갖는 표적 RNA 분자에 추가로 결합하고, 여기서 상기 표적 RNA는 바람직하게 적어도 하나의 RNA 프로토스페이서-인접 모티프 (RNA protospacer-adjacent motif; rPAM)가 측면에 위치하는(flanked) 것인 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 박테리아에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 바이러스에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 진균에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 원생동물에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 유전적 장애(genetic disorder)에 대해 특이적이도록 선택된 서열, 및 증식성 장애에 대해 특이적이도록 선택된 서열을 포함하는 것인 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 핵 국재화 신호를 포함하는 것인 복합체.
  5. a) 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소를 제공하는 단계, b) 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA를 제공하는 단계, c) 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이에 복합체를 형성하는 단계, d) 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA에 기초하여 c)의 복합체를 표적 RNA에 결합시키는 단계, 및 e) 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소에 의해 dsDNA, ssDNA, 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자를 절단하는 단계를 포함하는, dsDNA, ssDNA, 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자를 절단하기 위한 방법.
  6. a) 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 ssDNA, dsDNA 또는 RNA 리포터(reporter) 핵산을 제공하는 단계,
    b) 상기 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플을, 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이의 적어도 하나의 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 서열을 포함하는 것인 단계, 및
    c) 상기 적어도 하나의 ssDNA, dsDNA 또는 RNA 리포터 핵산의 절단(cleaving), 커팅(cutting) 및/또는 니킹(nicking)을 검출하는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 리포터 핵산의 절단이 검출된다면, 상기 세포, 조직, 세포 핵 및/또는 샘플 중 상기 적어도 하나의 표적 RNA가 검출되는 것인 단계를 포함하는,
    세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA를 검출하기 위한 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 적어도 하나의 리포터 핵산의 절단(cleaving), 커팅 및/또는 니킹을 검출하는 것이 적합한 표지(label), 예컨대, 염료, 형광단, 또는 전기 전도성 신호 변화를 검출하고/거나, 상기의 자체로 절단된 적어도 하나의 리포터 핵산 단편을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 적어도 하나의 표적 RNA가 대조군 표적 RNA와 비교하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이화된 표적 RNA인 것인 방법.
  9. a) 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플을 적어도 하나의 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이의 적어도 하나의 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 적어도 하나의 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 서열을 포함하는 것인 단계, 및
    c) b)의 복합체를 적어도 하나의 표적 RNA에 결합시켜 적어도 하나의 표적 RNA의 안정성, 프로세싱(processing), 또는 번역을 변경시키는 단계를 포함하고,
    이로써, c)에서의 결합이 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 발현을 조정하는 것인,
    세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 발현을 조정하기 위한 방법으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 mRNA, 비-코딩(non-coding) RNA 및 바이러스 RNA 분자로부터 선택되는 것인 방법.
  10. a) 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플을, 적어도 하나의 RNA 변형 효소와 복합체화된 적어도 하나의 변형되고 촉매 불활성인 CasΩ 뉴클레아제 효소와 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA 사이의 적어도 하나의 복합체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 적어도 하나의 미리 선택된 가이드 RNA는 적어도 하나의 표적 RNA와 적어도 90% 상보적인 서열을 포함하는 것인 단계, 및
    c) b)의 복합체를 적어도 하나의 표적 RNA에 결합시키고, 상기 적어도 하나의 RNA 변형 효소에 의해 적어도 하나의 표적 RNA를 편집하는 단계를 포함하는,
    세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 서열을 편집(editing)하기 위한 방법으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 표적 RNA는 mRNA, 비-코딩 RNA 및 바이러스 RNA 분자로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 표적 RNA가 질환 상태에 대해, 예컨대, 예를 들어, 유전적 장애를 보이는 세포, 증식성 장애를 보이는 세포, 예컨대, 암 세포, 자기항체를 생산하는 면역 세포, 박테리아 또는 바이러스 병원체로 감염된 세포, 박테리아 병원체, 원생동물 병원체, 마이크로바이오타(microbiota)의 세포, 및 오염 박테리아 또는 고세균으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포에 대해 특이적인 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  12. 제3항 또는 제4항에 있어서, 질환의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한, 예컨대, 예를 들어, 감염 및/또는 유전적 장애, 예컨대, 증식성 장애, 예컨대, 암, 진균, 원생동물, 박테리아 및/또는 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 복합체.
  13. 바람직하지 않은 세포 또는 바이러스를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 가이드 RNA는 상기 바람직하지 않은 세포 또는 바이러스가 불활성화되도록 특이적으로 선택되는 것인, 바람직하지 않은 세포 또는 바이러스를 특이적으로 불활성화시키는 방법.
  14. 질환 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체(subject)에게 유효량의 제3항 또는 제4항에 따른 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 예컨대, 예를 들어, 감염 및/또는 유전적 장애, 예컨대, 증식성 장애, 예컨대, 암, 진균, 원생동물, 박테리아 및/또는 바이러스 감염, 자가면역 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법.
  15. dsDNA, ssDNA, 및 RNA로부터 선택되는 핵산 분자를 절단하기 위한, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA를 검출하기 위한, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 발현을 조정하기 위한, 세포, 조직, 세포 핵, 및/또는 샘플 중 적어도 하나의 표적 RNA의 서열을 편집하기 위한, 바람직하지 않은 세포 또는 바이러스를 특이적으로 불활성화시키기 위한, 또는 제제에서 바람직하지 않은 오염 물질을 오염제거(decontaminating)하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 복합체의 용도.
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