JP3039566B2 - 活性の増大したβ−ガラクトシダーゼ断片の突然変異タンパク質 - Google Patents
活性の増大したβ−ガラクトシダーゼ断片の突然変異タンパク質Info
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Description
【発明の詳細な説明】 背景 本発明は、増大した活性を有するβ−ガラクトシダー
ゼの修飾された酵素アクセプターポリペプチド断片、そ
の生産方法ならびに酵素相補性イムノアッセイにおける
試薬としてその使用に関するものである。
ゼの修飾された酵素アクセプターポリペプチド断片、そ
の生産方法ならびに酵素相補性イムノアッセイにおける
試薬としてその使用に関するものである。
近年、血清のようなサンプル中に存在しうるアナライ
ト（測定対象物質）の定量に利用できる検出可能なシグ
ナルを発生させるステップとして、酵素的に不活性のポ
リペプチド断片同士の相補性（complementation）また
は再会合（reassociation）を用いて活性型酵素を生成
させる均一系のイムノアッセイが数多く記述されてい
る。こうしたアッセイのいくつかは相補性により生成さ
れる酵素としてβ−ガラクトシダーゼ酵素を利用するこ
とを提案している。
ト（測定対象物質）の定量に利用できる検出可能なシグ
ナルを発生させるステップとして、酵素的に不活性のポ
リペプチド断片同士の相補性（complementation）また
は再会合（reassociation）を用いて活性型酵素を生成
させる均一系のイムノアッセイが数多く記述されてい
る。こうしたアッセイのいくつかは相補性により生成さ
れる酵素としてβ−ガラクトシダーゼ酵素を利用するこ
とを提案している。
酵素相補性には２以上の不活性ポリペプチドの会合が
必要となり、これらのポリペプチドが一緒になって生物
活性酵素の形成に必要とされる構造的情報（天然の親酵
素のものに似通っている）を提供する。酵素的に不活性
のポリペプチド断片は、タンパク質分解、化学的開裂、
化学的合成の結果として、あるいは活性酵素をコードし
ている遺伝子のミスセンスまたはナンセンス突然変異の
結果として得ることができる。酵素的に活性のある複合
体を生成するタンパク質相補系の例としては、リボヌク
レアーゼＳ′複合体、ブドウ球菌ヌクレアーゼＴ複合
体、シトクロムｃから誘導される種々の２−および３−
断片複合体、そして大腸菌β−ガラクトシダーゼのαお
よびω相補性複合体が挙げられる。こうした複合体を安
定化する相互作用は非共有結合的であって、天然酵素の
三次元構造の形成および維持に係わっているものに似て
いる。
必要となり、これらのポリペプチドが一緒になって生物
活性酵素の形成に必要とされる構造的情報（天然の親酵
素のものに似通っている）を提供する。酵素的に不活性
のポリペプチド断片は、タンパク質分解、化学的開裂、
化学的合成の結果として、あるいは活性酵素をコードし
ている遺伝子のミスセンスまたはナンセンス突然変異の
結果として得ることができる。酵素的に活性のある複合
体を生成するタンパク質相補系の例としては、リボヌク
レアーゼＳ′複合体、ブドウ球菌ヌクレアーゼＴ複合
体、シトクロムｃから誘導される種々の２−および３−
断片複合体、そして大腸菌β−ガラクトシダーゼのαお
よびω相補性複合体が挙げられる。こうした複合体を安
定化する相互作用は非共有結合的であって、天然酵素の
三次元構造の形成および維持に係わっているものに似て
いる。
酵素相補性は新規な均一系イムノアッセイ法の開発の
ための基本的原理として利用されてきた。Farinaおよび
Golkeの米国特許第4,378,428号（1983年３月29日発行）
およびGonelliら（1981,Biochem.and Biophys.Res.Comm
un.102:917−923）は、リボヌクレアーゼの触媒活性を
生成させるためのＳペプチドおよびＳタンパク質（両方
ともリボヌクレアーゼＡのタンパク質分解切断により得
られる）の再会合に基づくイムノアッセイを記述してい
る。このアッセイ系に特有の成分としては、Ｓペプチド
（アミノ酸１−20）に共有結合されたアナライト、遊離
のＳタンパク質（アミノ酸21−124）、アナライトに特
異的な抗体、およびリポーター分子に変換され得るリボ
ヌクレアーゼの基質が含まれる。抗アナライト抗体がア
ナライト:Sププチド結合体とＳタンパク質との会合を阻
止し、その結果、酵素的に活性のある複合体のレベル、
ひいては酵素反応により生じるシグナルを減少させる。
遊離のアナライトを含有するサンプルの存在下では、サ
ンプル由来のアナライトとＳペプチド結合体との間で抗
原結合部位についての競合が起こる。Ｓタンパク質断片
との相補に関与しないＳペプチド結合体の濃度、および
リボヌクレアーゼＡ′複合体の酵素活性により発生する
シグナルが、サンプル中の遊離アナライトの濃度に直接
比例することとなる。
ための基本的原理として利用されてきた。Farinaおよび
Golkeの米国特許第4,378,428号（1983年３月29日発行）
およびGonelliら（1981,Biochem.and Biophys.Res.Comm
un.102:917−923）は、リボヌクレアーゼの触媒活性を
生成させるためのＳペプチドおよびＳタンパク質（両方
ともリボヌクレアーゼＡのタンパク質分解切断により得
られる）の再会合に基づくイムノアッセイを記述してい
る。このアッセイ系に特有の成分としては、Ｓペプチド
（アミノ酸１−20）に共有結合されたアナライト、遊離
のＳタンパク質（アミノ酸21−124）、アナライトに特
異的な抗体、およびリポーター分子に変換され得るリボ
ヌクレアーゼの基質が含まれる。抗アナライト抗体がア
ナライト:Sププチド結合体とＳタンパク質との会合を阻
止し、その結果、酵素的に活性のある複合体のレベル、
ひいては酵素反応により生じるシグナルを減少させる。
遊離のアナライトを含有するサンプルの存在下では、サ
ンプル由来のアナライトとＳペプチド結合体との間で抗
原結合部位についての競合が起こる。Ｓタンパク質断片
との相補に関与しないＳペプチド結合体の濃度、および
リボヌクレアーゼＡ′複合体の酵素活性により発生する
シグナルが、サンプル中の遊離アナライトの濃度に直接
比例することとなる。
大腸菌β−ガラクトシダーゼポリペプチド断片のα相
補性系に基づく同様のイムノアッセイ系が、Henderson
の米国特許第4,708,929号（1987年11月24日発行）およ
びHendersonのPCT出願第PCT/US90/02491号（1990年11月
15日公開）に記述されており、これらの開示内容を参考
としてここに組み入れる。β−ガラクトシダーゼのα相
補性はαアクセプターポリペプチド断片とαドナーポリ
ペプチド断片との会合、およびその後の活性β−ガラク
トシダーゼ分子の形成を必要とする。αアクセプターは
β−ガラクトシダーゼ分子のＮ末端近位セグメント内に
位置する連続アミノ酸の内部欠失または鎖切断から誘導
される。特定の例としては、野生型配列の残基11−41を
欠失しているlacZ M15β−ガラクトシダーゼ欠失変異体
および残基23−31を欠失しているlacZ M112変異体が挙
げられる。αドナーポリペプチドは野生型タンパク質の
化学的開裂またはタンパク質分解切断から誘導され得
る。アミノ酸残基３−92から成る臭化シアン断片CNBr2
および残基３−40にわたるV8プロテアーゼペプチドは、
双方ともαドナー活性を有している。
補性系に基づく同様のイムノアッセイ系が、Henderson
の米国特許第4,708,929号（1987年11月24日発行）およ
びHendersonのPCT出願第PCT/US90/02491号（1990年11月
15日公開）に記述されており、これらの開示内容を参考
としてここに組み入れる。β−ガラクトシダーゼのα相
補性はαアクセプターポリペプチド断片とαドナーポリ
ペプチド断片との会合、およびその後の活性β−ガラク
トシダーゼ分子の形成を必要とする。αアクセプターは
β−ガラクトシダーゼ分子のＮ末端近位セグメント内に
位置する連続アミノ酸の内部欠失または鎖切断から誘導
される。特定の例としては、野生型配列の残基11−41を
欠失しているlacZ M15β−ガラクトシダーゼ欠失変異体
および残基23−31を欠失しているlacZ M112変異体が挙
げられる。αドナーポリペプチドは野生型タンパク質の
化学的開裂またはタンパク質分解切断から誘導され得
る。アミノ酸残基３−92から成る臭化シアン断片CNBr2
および残基３−40にわたるV8プロテアーゼペプチドは、
双方ともαドナー活性を有している。
また、αドナーおよびαアクセプターポリペプチドは
組換えDNA法やペプチド合成法の使用によっても得るこ
とができる。これらの分子の供給物を容易に入手でき、
さらに、こうした技法によってαドナーまたはαアクセ
プターポリペプチドの構造を修飾できるため、最適化さ
れた相補性系が開発されるようになり、クローン化酵素
ドナーに基づく均一系イムノアッセイにおいて使用され
ている。αドナー分子はこの分子の配列内に適切に配置
されたシステインまたはリシン残基の修飾により特定ア
ナライトと化学的に結合させることができ、しかも、こ
うした結合が相補反応を妨害しないようにすることがで
きる。αアクセプターとαドナー間の相補性は、アナラ
イト特異的抗体とαドナー（アナライトを結合させてあ
る）との抗原−抗体反応によって変調され得る。遊離の
アナライトの存在下にあっては、遊離のアナライトとα
ドナー結合アナライトとの競合が上記抗体の抗原結合部
位について起こる。それゆえ、遊離アナライトのレベル
が増加すると、αアクセプターとの相補反応に利用しう
るαドナー結合体の量が増えることとなる。その結果、
αアクセプター：αドナー複合体の濃度および再構成さ
れた酵素活性から生じるリポーター分子の濃度が増加
し、これらはサンプル中に存在する遊離アナライトの濃
度に比例している。遊離アナライトのさまざまな濃度に
おける活性（すなわち、反応速度の勾配）をモニターす
ることにより用量反応曲線を作成することが可能であ
る。無限濃度の遊離アナライトの存在下でまたは抗体の
不在下で観測された酵素活性が「開放速度（open rat
e）」として規定され、そのアッセイ系から得ることの
できる最大シグナルを表している。
組換えDNA法やペプチド合成法の使用によっても得るこ
とができる。これらの分子の供給物を容易に入手でき、
さらに、こうした技法によってαドナーまたはαアクセ
プターポリペプチドの構造を修飾できるため、最適化さ
れた相補性系が開発されるようになり、クローン化酵素
ドナーに基づく均一系イムノアッセイにおいて使用され
ている。αドナー分子はこの分子の配列内に適切に配置
されたシステインまたはリシン残基の修飾により特定ア
ナライトと化学的に結合させることができ、しかも、こ
うした結合が相補反応を妨害しないようにすることがで
きる。αアクセプターとαドナー間の相補性は、アナラ
イト特異的抗体とαドナー（アナライトを結合させてあ
る）との抗原−抗体反応によって変調され得る。遊離の
アナライトの存在下にあっては、遊離のアナライトとα
ドナー結合アナライトとの競合が上記抗体の抗原結合部
位について起こる。それゆえ、遊離アナライトのレベル
が増加すると、αアクセプターとの相補反応に利用しう
るαドナー結合体の量が増えることとなる。その結果、
αアクセプター：αドナー複合体の濃度および再構成さ
れた酵素活性から生じるリポーター分子の濃度が増加
し、これらはサンプル中に存在する遊離アナライトの濃
度に比例している。遊離アナライトのさまざまな濃度に
おける活性（すなわち、反応速度の勾配）をモニターす
ることにより用量反応曲線を作成することが可能であ
る。無限濃度の遊離アナライトの存在下でまたは抗体の
不在下で観測された酵素活性が「開放速度（open rat
e）」として規定され、そのアッセイ系から得ることの
できる最大シグナルを表している。
KrevolinおよびKatesの欧州特許出願第92304354.1号
（1992年11月19日公開；その開示内容を参考としてここ
に組み入れる）は酵素相補性アッセイを記述しており、
このアッセイはβ−ガラクトシダーゼのω領域の一次構
造の破壊により形成された全β−ガラクトシダーゼ分子
の２つのポリペプチド断片間のβ−ガラクトシダーゼの
ω領域における相補性を用いている。α相補性の場合と
同様に、いくつかの場合には、２つの断片はギャップ
（間隙）やオーバーラップ（重なり部分）のない正確な
β−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を形成するように
厳密に相補性である必要はない。得られる断片が活性型
のβ−ガラクトシダーゼ分子へと組み立てられるのであ
れば、ギャップもオーバーラップも存在可能である。α
アクセプターと同じく、ωアクセプターポリペプチドは
２つの断片のうちの大きい方であり、通常、天然型また
は修飾型の全長β−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列の
ほぼ３分の２を含んでいる。ωドナー分子は残りのおよ
そ３分の１のアミノ酸配列を含む小さい方の断片であ
り、β−ガラクトシダーゼ分子のＣ末端から誘導され
る。
（1992年11月19日公開；その開示内容を参考としてここ
に組み入れる）は酵素相補性アッセイを記述しており、
このアッセイはβ−ガラクトシダーゼのω領域の一次構
造の破壊により形成された全β−ガラクトシダーゼ分子
の２つのポリペプチド断片間のβ−ガラクトシダーゼの
ω領域における相補性を用いている。α相補性の場合と
同様に、いくつかの場合には、２つの断片はギャップ
（間隙）やオーバーラップ（重なり部分）のない正確な
β−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を形成するように
厳密に相補性である必要はない。得られる断片が活性型
のβ−ガラクトシダーゼ分子へと組み立てられるのであ
れば、ギャップもオーバーラップも存在可能である。α
アクセプターと同じく、ωアクセプターポリペプチドは
２つの断片のうちの大きい方であり、通常、天然型また
は修飾型の全長β−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列の
ほぼ３分の２を含んでいる。ωドナー分子は残りのおよ
そ３分の１のアミノ酸配列を含む小さい方の断片であ
り、β−ガラクトシダーゼ分子のＣ末端から誘導され
る。
β−ガラクトシダーゼは分子量約540,000ダルトンの
四量体タンパク質である。４つの同一の単量体が1023個
のアミノ酸から成り、それぞれ116,000ダルトンの分子
量を有する。単量体タンパク質は３つの領域、すなわち
Ｎ末端近位セグメント（α領域）、中間領域およびＣ末
端遠位セグメント（ω領域）、に分割される。
四量体タンパク質である。４つの同一の単量体が1023個
のアミノ酸から成り、それぞれ116,000ダルトンの分子
量を有する。単量体タンパク質は３つの領域、すなわち
Ｎ末端近位セグメント（α領域）、中間領域およびＣ末
端遠位セグメント（ω領域）、に分割される。
大腸菌のβ−ガラクトシダーゼはlacオペロンのＺ遺
伝子から誘導されるもので、β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドの加水分解を触媒する。この酵素の触媒機構はチロシ
ン−503による基質分子のグリコシドエステル結合の一
般的酸触媒作用を伴う。これに続いてアグリコン部分の
損失およびグルタミン酸−461との相互作用による推定
上のカルボニウムイオン中間体の安定化が起こる。触媒
周期の最終段階は、アクセプター分子（通常は水）のト
ランスガラクトシル化および活性部位からの生成物の解
離を伴う。活性酵素は４つの同じサブユニットから構成
されており、サブユニットにつき１つの活性部位があ
る。１価のカチオンは、活性にとって必要ではないが、
酵素触媒作用の速度を劇的に高め、一方、２価のカチオ
ン（例えば、Mg2+またはMn2+）は活性にとって必要であ
る。
伝子から誘導されるもので、β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドの加水分解を触媒する。この酵素の触媒機構はチロシ
ン−503による基質分子のグリコシドエステル結合の一
般的酸触媒作用を伴う。これに続いてアグリコン部分の
損失およびグルタミン酸−461との相互作用による推定
上のカルボニウムイオン中間体の安定化が起こる。触媒
周期の最終段階は、アクセプター分子（通常は水）のト
ランスガラクトシル化および活性部位からの生成物の解
離を伴う。活性酵素は４つの同じサブユニットから構成
されており、サブユニットにつき１つの活性部位があ
る。１価のカチオンは、活性にとって必要ではないが、
酵素触媒作用の速度を劇的に高め、一方、２価のカチオ
ン（例えば、Mg2+またはMn2+）は活性にとって必要であ
る。
大腸菌のβ−ガラクトシダーゼホモ四量体は64個のシ
ステイン残基（サブユニットあたり16個のシステイン残
基）を含み、これらはいずれも酵素活性に関係しておら
ず、また、高濃度の還元剤の存在下でこの分子が安定し
ていることにより示されるように、サブユニット間のジ
スルフィド橋による四次構造の維持にも係わっていな
い。活性四量体を形成させるための個々の単量体のin v
itro会合の効率は、システインが完全に還元される条件
下で劇的に増加する。同様に、還元剤は酵素相補性を大
幅に高める。αアクセプターポリペプチドは単一のβ−
ガラクトシダーゼサブユニット中に存在する16個すべて
のシステイン残基を含んでいる。しかし、αアクセプタ
ー分子は溶液中ではホモ二量体として存在している。こ
うして、β−ガラクトシダーゼの二量体−二量体界面に
通常埋め込まれる表面領域はαアクセプターにおいて露
出される。ヨード酢酸を用いたβ−ガラクトシダーゼの
化学的修飾実験により、β−ガラクトシダーゼ中の表面
接近可能残基としてシステイン−500とシステイン−102
1が同定された（Jornvallら,1978,Biochem.17,5160−6
4）。これら２つの残基のカルボキシメチル化は酵素活
性に対してどのような有意な程度にも影響を与えなかっ
た。ところが、二量体のαアクセプター分子であるM15
をヨード酢酸で処理したときには、78位、389位および6
02位の３つの追加のシステイン残基が修飾された。カル
ボキシメチル化はα相補性に関与するM15の能力を阻害
することが分かった。このことは、これらの追加の残基
の１以上が二量体−二量体界面に位置していて、その修
飾がα相補性を妨げることを示唆している。
ステイン残基（サブユニットあたり16個のシステイン残
基）を含み、これらはいずれも酵素活性に関係しておら
ず、また、高濃度の還元剤の存在下でこの分子が安定し
ていることにより示されるように、サブユニット間のジ
スルフィド橋による四次構造の維持にも係わっていな
い。活性四量体を形成させるための個々の単量体のin v
itro会合の効率は、システインが完全に還元される条件
下で劇的に増加する。同様に、還元剤は酵素相補性を大
幅に高める。αアクセプターポリペプチドは単一のβ−
ガラクトシダーゼサブユニット中に存在する16個すべて
のシステイン残基を含んでいる。しかし、αアクセプタ
ー分子は溶液中ではホモ二量体として存在している。こ
うして、β−ガラクトシダーゼの二量体−二量体界面に
通常埋め込まれる表面領域はαアクセプターにおいて露
出される。ヨード酢酸を用いたβ−ガラクトシダーゼの
化学的修飾実験により、β−ガラクトシダーゼ中の表面
接近可能残基としてシステイン−500とシステイン−102
1が同定された（Jornvallら,1978,Biochem.17,5160−6
4）。これら２つの残基のカルボキシメチル化は酵素活
性に対してどのような有意な程度にも影響を与えなかっ
た。ところが、二量体のαアクセプター分子であるM15
をヨード酢酸で処理したときには、78位、389位および6
02位の３つの追加のシステイン残基が修飾された。カル
ボキシメチル化はα相補性に関与するM15の能力を阻害
することが分かった。このことは、これらの追加の残基
の１以上が二量体−二量体界面に位置していて、その修
飾がα相補性を妨げることを示唆している。
本発明において、まったく予期せざることに、ある種
のアミノ酸残基の修飾は酵素活性を顕著に増大させるこ
とが見いだされた。この活性増加は、相補性活性すなわ
ち触媒的に不活性のドナーおよびアクセプター二量体が
組み合わされて触媒活性のあるβ−ガラクトシダーゼ四
量体に形成する速度に関してだけでなく、平衡活性すな
わち再形成されたβ−ガラクトシダーゼ四量体が基質を
変換する速度に関しても生じた。β−ガラクトシダーゼ
活性の増加によりアナライトについてのアッセイ感度が
向上し、こうした感度の向上はごくわずかな量で血清中
に存在するアナライト（例えば、薬剤および薬剤代謝産
物）をより正確に検出できることを意味する。本発明の
突然変異タンパク質を用いると、酵素の安定性の有意な
低下なしにアッセイ感度が1.3倍ないし３倍またはそれ
以上増加する。
のアミノ酸残基の修飾は酵素活性を顕著に増大させるこ
とが見いだされた。この活性増加は、相補性活性すなわ
ち触媒的に不活性のドナーおよびアクセプター二量体が
組み合わされて触媒活性のあるβ−ガラクトシダーゼ四
量体に形成する速度に関してだけでなく、平衡活性すな
わち再形成されたβ−ガラクトシダーゼ四量体が基質を
変換する速度に関しても生じた。β−ガラクトシダーゼ
活性の増加によりアナライトについてのアッセイ感度が
向上し、こうした感度の向上はごくわずかな量で血清中
に存在するアナライト（例えば、薬剤および薬剤代謝産
物）をより正確に検出できることを意味する。本発明の
突然変異タンパク質を用いると、酵素の安定性の有意な
低下なしにアッセイ感度が1.3倍ないし３倍またはそれ
以上増加する。
システイン残基をセリンに変換するtRNAシンテターゼ
の予め決められた部位特異的突然変異誘発が報告されて
いる（G.Winterら,1982,Nature,299,756−758およびA.W
ilkinsonら,1984,Nature,307,187−188）。Estellらの
米国特許第4,760,025号（1988年７月26日発行）は、い
くつかのメチオニン残基をアミノ酸置換を起こさせるよ
うに特定部位で修飾されたクローン化ズブチリシン遺伝
子を記述している。Kothsらの米国特許第4,752,585号
（1988年６月21日発行）および同第5,116,943号（1992
年５月26日発行）は、インターロイキン−２またはイン
ターフェロン−βのような治療用タンパク質を酸化から
保護するために、クロラミンＴまたは過酸化物による酸
化を受けやすいメチオニル残基を同類のアミノ酸で置換
することを記述している。
の予め決められた部位特異的突然変異誘発が報告されて
いる（G.Winterら,1982,Nature,299,756−758およびA.W
ilkinsonら,1984,Nature,307,187−188）。Estellらの
米国特許第4,760,025号（1988年７月26日発行）は、い
くつかのメチオニン残基をアミノ酸置換を起こさせるよ
うに特定部位で修飾されたクローン化ズブチリシン遺伝
子を記述している。Kothsらの米国特許第4,752,585号
（1988年６月21日発行）および同第5,116,943号（1992
年５月26日発行）は、インターロイキン−２またはイン
ターフェロン−βのような治療用タンパク質を酸化から
保護するために、クロラミンＴまたは過酸化物による酸
化を受けやすいメチオニル残基を同類のアミノ酸で置換
することを記述している。
Buchwalterらの欧州特許出願第91106224.8号（1991年
11月27日公開）は、部位特異的突然変異誘発法によって
いくつかのセリンおよびチロシン残基をシステイン残基
で置換し、そしていくつかのシステイン残基をグルタミ
ン酸で置換した動物のソマトトロピン誘導体を記述して
いる。BreddamらのPCT/DK91/00103（1991年10月31日公
開）は化学的に修飾されたデタージェント酵素を記述し
ており、ここでは１個以上のメチオニンをシステインに
突然変異誘発させ、その後システインを化学的に修飾し
て酸化剤に対する該酵素の安定性を向上させている。Ma
ttesらの米国特許第4,963,469号（1990年10月16日発
行）は、β−ガラクトシダーゼのアミノ酸430−550の領
域内のあるアミノ酸を他のアミノ酸に変えて、酵素的に
不活性であるが免疫学的には活性のあるβ−ガラクトシ
ダーゼ突然変異タンパク質を得ることを記述している。
Estellら（1985,J.Biol.Chem.260,6518−6521）はズブ
チリシンのメチオニン222残基（この酵素の酸化的不活
性化のための主要な部位である）を変えるために部位特
異的突然変異誘発を採用した。これらの著者は、非酸化
性アミノ酸（すなわち、セリン、アラニンおよびロイシ
ン）を含む変異体が過酸化物による不活性化に抵抗する
が、メチオニンおよびシステインで置換された酵素は急
速に失活されることを見いだした。
11月27日公開）は、部位特異的突然変異誘発法によって
いくつかのセリンおよびチロシン残基をシステイン残基
で置換し、そしていくつかのシステイン残基をグルタミ
ン酸で置換した動物のソマトトロピン誘導体を記述して
いる。BreddamらのPCT/DK91/00103（1991年10月31日公
開）は化学的に修飾されたデタージェント酵素を記述し
ており、ここでは１個以上のメチオニンをシステインに
突然変異誘発させ、その後システインを化学的に修飾し
て酸化剤に対する該酵素の安定性を向上させている。Ma
ttesらの米国特許第4,963,469号（1990年10月16日発
行）は、β−ガラクトシダーゼのアミノ酸430−550の領
域内のあるアミノ酸を他のアミノ酸に変えて、酵素的に
不活性であるが免疫学的には活性のあるβ−ガラクトシ
ダーゼ突然変異タンパク質を得ることを記述している。
Estellら（1985,J.Biol.Chem.260,6518−6521）はズブ
チリシンのメチオニン222残基（この酵素の酸化的不活
性化のための主要な部位である）を変えるために部位特
異的突然変異誘発を採用した。これらの著者は、非酸化
性アミノ酸（すなわち、セリン、アラニンおよびロイシ
ン）を含む変異体が過酸化物による不活性化に抵抗する
が、メチオニンおよびシステインで置換された酵素は急
速に失活されることを見いだした。
共通に譲渡された継続中の米国特許出願第08/111,248
号（1993年８月24日出願；その開示内容を参考としてこ
こに組み入れる）において、β−ガラクトシダーゼの酵
素アクセプターポリペプチド断片上のシステイン−602
残基の部位特異的突然変異誘発による同類アミノ酸（好
ましくはセリン）置換は、602位にシステインを有する
酵素アクセプターポリペプチド断片の安定性と比べて、
酵素アクセプター突然変異タンパク質の安定性を実質的
に向上させることが見いだされた。
号（1993年８月24日出願；その開示内容を参考としてこ
こに組み入れる）において、β−ガラクトシダーゼの酵
素アクセプターポリペプチド断片上のシステイン−602
残基の部位特異的突然変異誘発による同類アミノ酸（好
ましくはセリン）置換は、602位にシステインを有する
酵素アクセプターポリペプチド断片の安定性と比べて、
酵素アクセプター突然変異タンパク質の安定性を実質的
に向上させることが見いだされた。
ここで用いるβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸残基の
番号付けは、Kalninsら,1983,EMBO Journal2,593−597
に発表されたものであり、その開示内容を参考としてこ
こに組み入れる。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼをコー
ドするlacZ遺伝子のヌクレオチド配列が決定され、β−
ガラクトシダーゼはFowlerおよびZabin（1977,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA74,1507−1510および1978,J.Biol.Chem.
253,5521−5525）により以前に報告された1021アミノ酸
残基ではなく1023アミノ酸残基から成ると予測された。
番号付けは、Kalninsら,1983,EMBO Journal2,593−597
に発表されたものであり、その開示内容を参考としてこ
こに組み入れる。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼをコー
ドするlacZ遺伝子のヌクレオチド配列が決定され、β−
ガラクトシダーゼはFowlerおよびZabin（1977,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA74,1507−1510および1978,J.Biol.Chem.
253,5521−5525）により以前に報告された1021アミノ酸
残基ではなく1023アミノ酸残基から成ると予測された。
発明の概要 本発明は、β−ガラクトシダーゼの酵素アクセプター
ポリペプチド断片の新規な突然変異タンパク質ならびに
該突然変異タンパク質の生産方法を提供する。特に、本
発明は、次の部位、すなわちシステイン−500、メチオ
ニン−443およびシステイン−76のうちの少なくとも１
つの部位にアミノ酸置換を有する新規な酵素アクセプタ
ー断片を提供する。本発明のある実施態様では、500位
にシステイン以外のアミノ酸が存在するβ−ガラクトシ
ダーゼの酵素アクセプターポリペプチド断片の新規な突
然変異タンパク質が提供される。特に好ましいものはシ
ステイン−500をセリンまたはバリンで置換してあるβ
−ガラクトシダーゼのαアクセプターポリペプチド断片
である。
ポリペプチド断片の新規な突然変異タンパク質ならびに
該突然変異タンパク質の生産方法を提供する。特に、本
発明は、次の部位、すなわちシステイン−500、メチオ
ニン−443およびシステイン−76のうちの少なくとも１
つの部位にアミノ酸置換を有する新規な酵素アクセプタ
ー断片を提供する。本発明のある実施態様では、500位
にシステイン以外のアミノ酸が存在するβ−ガラクトシ
ダーゼの酵素アクセプターポリペプチド断片の新規な突
然変異タンパク質が提供される。特に好ましいものはシ
ステイン−500をセリンまたはバリンで置換してあるβ
−ガラクトシダーゼのαアクセプターポリペプチド断片
である。
別の実施態様において、本発明はまた、443位にメチ
オニン以外のアミノ酸が存在するβ−ガラクトシダーゼ
の酵素アクセプターポリペプチド断片の新規な突然変異
タンパク質を提供する。特に好ましいものはシステイン
−76をロイシンまたはセリンで置換してあるβ−ガラク
トシダーゼのαアクセプターポリペプチド断片である。
オニン以外のアミノ酸が存在するβ−ガラクトシダーゼ
の酵素アクセプターポリペプチド断片の新規な突然変異
タンパク質を提供する。特に好ましいものはシステイン
−76をロイシンまたはセリンで置換してあるβ−ガラク
トシダーゼのαアクセプターポリペプチド断片である。
さらに他の実施態様において、本発明はまた、76位に
システイン以外のアミノ酸が存在するβ−ガラクトシダ
ーゼの酵素アクセプターポリペプチド断片の新規な突然
変異タンパク質を提供する。特に好ましいものはメチオ
ニン−443をロイシンで置換してあるβ−ガラクトシダ
ーゼのαアクセプターポリペプチド断片である。
システイン以外のアミノ酸が存在するβ−ガラクトシダ
ーゼの酵素アクセプターポリペプチド断片の新規な突然
変異タンパク質を提供する。特に好ましいものはメチオ
ニン−443をロイシンで置換してあるβ−ガラクトシダ
ーゼのαアクセプターポリペプチド断片である。
１より多い置換を有する突然変異タンパク質も本発明
によって提供されるが、こうした置換の少なくとも１つ
はアミノ酸位置500、443または76に存在しなければなら
ない。
によって提供されるが、こうした置換の少なくとも１つ
はアミノ酸位置500、443または76に存在しなければなら
ない。
本発明の新規な突然変異タンパク質は著しく増大した
活性（相補性活性と触媒活性の両方）をもつことが判明
した。本発明の突然変異タンパク質または該突然変異タ
ンパク質を含む試薬組成物の安定性の有意な低下は見ら
れないが、これらの部位のいずれかのランダム突然変異
誘発は活性と安定性の両方が向上した突然変異タンパク
質をもたらす可能性がある。
活性（相補性活性と触媒活性の両方）をもつことが判明
した。本発明の突然変異タンパク質または該突然変異タ
ンパク質を含む試薬組成物の安定性の有意な低下は見ら
れないが、これらの部位のいずれかのランダム突然変異
誘発は活性と安定性の両方が向上した突然変異タンパク
質をもたらす可能性がある。
さらに、これら新規な突然変異タンパク質を含有する
試薬組成物、ならびに酵素的に不活性のドナー断片とア
クセプター断片との相補性を利用して酵素的に活性のあ
る酵素を形成させることを含むクローン化酵素ドナーイ
ムノアッセイにおいて該組成物を用いるイムノアッセイ
法を提供する。本発明の新規な酵素アクセプター突然変
異タンパク質は、親酵素アクセプター断片と比べ、平衡
活性および速度論的相補性活性の実質的向上を示すこと
が見いだされた。
試薬組成物、ならびに酵素的に不活性のドナー断片とア
クセプター断片との相補性を利用して酵素的に活性のあ
る酵素を形成させることを含むクローン化酵素ドナーイ
ムノアッセイにおいて該組成物を用いるイムノアッセイ
法を提供する。本発明の新規な酵素アクセプター突然変
異タンパク質は、親酵素アクセプター断片と比べ、平衡
活性および速度論的相補性活性の実質的向上を示すこと
が見いだされた。
本発明の新規な突然変異タンパク質は、親酵素アクセ
プターをコードする遺伝子上の適当な位置で部位特異的
突然変異誘発を起こさせることにより作ることができ
る。部位特異的突然変異誘発法（Wallaceら,1981,Nucle
ic Acids Res.9,3647−3656;Zoller and Smith,1982,Nu
cleic Acids Res.10,6487−6500;およびDeng and Nicko
loff,1992,Anal.Biochem.200,81−88）はβ−ガラクト
シダーゼのシステイン−500、メチオニン−443またはシ
ステイン−76の任意アミノ酸による置換を可能とする。
ポリペプチド断片の化学合成は本発明の範囲を越えるも
のではない。しかし、こうした技法は一般にアミノ酸の
長さが比較的短いポリペプチドの製造に適用される。
プターをコードする遺伝子上の適当な位置で部位特異的
突然変異誘発を起こさせることにより作ることができ
る。部位特異的突然変異誘発法（Wallaceら,1981,Nucle
ic Acids Res.9,3647−3656;Zoller and Smith,1982,Nu
cleic Acids Res.10,6487−6500;およびDeng and Nicko
loff,1992,Anal.Biochem.200,81−88）はβ−ガラクト
シダーゼのシステイン−500、メチオニン−443またはシ
ステイン−76の任意アミノ酸による置換を可能とする。
ポリペプチド断片の化学合成は本発明の範囲を越えるも
のではない。しかし、こうした技法は一般にアミノ酸の
長さが比較的短いポリペプチドの製造に適用される。
本発明のアッセイでは、血清のようなサンプル中のア
ナライト（すなわち、リガンドまたは受容体）が酵素ド
ナーおよび酵素アクセプターポリペプチド断片を含有す
る試薬組成物を用いて定量される。その際、酵素ドナー
断片はアナライトに特異的なアナライト結合性タンパク
質に結合されており、また、アナライトは結合されたア
ナライト結合性タンパク質と交差反応性であるか、ある
いはそれに相補的である。酵素アクセプターポリペプチ
ドは本質的にβ−ガラクトシダーゼの断片から成り、こ
の断片は上記の結合体に結合するアナライト結合性タン
パク質の不在下で酵素ドナーと一緒になってβ−ガラク
トシダーゼ活性を有する活性酵素複合体を形成する点に
特徴がある。これらの試薬をサンプルおよび適当なアッ
セイ媒体中で活性酵素複合体と反応し得る基質と組み合
わせる。該酵素による基質の変換速度を、既知濃度のア
ナライトを用いて得られた基質の変換速度に対比させ
て、サンプル中のアナライトの量を決定する。
ナライト（すなわち、リガンドまたは受容体）が酵素ド
ナーおよび酵素アクセプターポリペプチド断片を含有す
る試薬組成物を用いて定量される。その際、酵素ドナー
断片はアナライトに特異的なアナライト結合性タンパク
質に結合されており、また、アナライトは結合されたア
ナライト結合性タンパク質と交差反応性であるか、ある
いはそれに相補的である。酵素アクセプターポリペプチ
ドは本質的にβ−ガラクトシダーゼの断片から成り、こ
の断片は上記の結合体に結合するアナライト結合性タン
パク質の不在下で酵素ドナーと一緒になってβ−ガラク
トシダーゼ活性を有する活性酵素複合体を形成する点に
特徴がある。これらの試薬をサンプルおよび適当なアッ
セイ媒体中で活性酵素複合体と反応し得る基質と組み合
わせる。該酵素による基質の変換速度を、既知濃度のア
ナライトを用いて得られた基質の変換速度に対比させ
て、サンプル中のアナライトの量を決定する。
図面の簡単な説明 本発明は、本明細書の一部を構成する図面とともに考
察するとき、以下の本発明の詳細な説明を参照すること
により一層理解されるであろう。
察するとき、以下の本発明の詳細な説明を参照すること
により一層理解されるであろう。
図１は、本発明の突然変異タンパク質EA45の速度論的
β−ガラクトシダーゼ活性と親酵素アクセプターEA22の
速度論的活性とを比較したグラフである。
β−ガラクトシダーゼ活性と親酵素アクセプターEA22の
速度論的活性とを比較したグラフである。
図２は、本発明の突然変異タンパク質EA45の平衡β−
ガラクトシダーゼ活性と親酵素アクセプターEA22の平衡
活性とを比較したグラフである。
ガラクトシダーゼ活性と親酵素アクセプターEA22の平衡
活性とを比較したグラフである。
図３は、本発明の突然変異タンパク質EA33、EA34、EA
51およびEA500Vの平衡β−ガラクトシダーゼ活性と親酵
素アクセプターEA22の平衡活性とを比較したグラフであ
る。
51およびEA500Vの平衡β−ガラクトシダーゼ活性と親酵
素アクセプターEA22の平衡活性とを比較したグラフであ
る。
図４は、突然変異タンパク質EA45を用いた用量反応曲
線であり、さまざまなレベルのアナライトに応答する再
形成β−ガラクトシダーゼ酵素による基質変換の速度を
示す。
線であり、さまざまなレベルのアナライトに応答する再
形成β−ガラクトシダーゼ酵素による基質変換の速度を
示す。
特定の実施態様の説明 本発明によると、酵素アクセプター断片をコードする
遺伝子上の特定位置で突然変異を誘発させる部位特異的
突然変異誘発法によりβ−ガラクトシダーゼの新規な酵
素アクセプターポリペプチド断片が作られる。本発明の
ある実施態様では、部位特異的突然変異誘発法を用いて
天然配列の500位のシステインをコードする位置に突然
変異を起こさせ、それによりシステインを同類アミノ酸
で置換する。好ましいアミノ酸置換はバリンまたはセリ
ンである。他のアミノ酸で置換してもよいが、同類置換
が好適である。同類置換（conservative substitutio
n）とは、類似した特性を有し、かつ酵素ドナーと相補
する酵素アクセプターの能力または再形成されたβ−ガ
ラクトシダーゼの触媒活性に有害作用を及ぼさないよう
なアミノ酸によるβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸置換
を意味する。このような同類アミノ酸置換の例として、
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ
ン、セリン、トレオニン、およびメチオニンがある。シ
ステインの特に好ましい置換はセリンまたはバリンであ
り、そして特に好ましい親酵素アクセプターは米国特許
第4,708,929号に詳述されているEA22である。
遺伝子上の特定位置で突然変異を誘発させる部位特異的
突然変異誘発法によりβ−ガラクトシダーゼの新規な酵
素アクセプターポリペプチド断片が作られる。本発明の
ある実施態様では、部位特異的突然変異誘発法を用いて
天然配列の500位のシステインをコードする位置に突然
変異を起こさせ、それによりシステインを同類アミノ酸
で置換する。好ましいアミノ酸置換はバリンまたはセリ
ンである。他のアミノ酸で置換してもよいが、同類置換
が好適である。同類置換（conservative substitutio
n）とは、類似した特性を有し、かつ酵素ドナーと相補
する酵素アクセプターの能力または再形成されたβ−ガ
ラクトシダーゼの触媒活性に有害作用を及ぼさないよう
なアミノ酸によるβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸置換
を意味する。このような同類アミノ酸置換の例として、
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ
ン、セリン、トレオニン、およびメチオニンがある。シ
ステインの特に好ましい置換はセリンまたはバリンであ
り、そして特に好ましい親酵素アクセプターは米国特許
第4,708,929号に詳述されているEA22である。
本発明の別の実施態様では、部位特異的突然変異誘発
法を用いて天然配列の443位のメチオニンをコードする
位置に突然変異を起こさせ、それによりメチオニンを同
類アミノ酸で置換する。特に好ましいアミノ酸置換はロ
イシンである。
法を用いて天然配列の443位のメチオニンをコードする
位置に突然変異を起こさせ、それによりメチオニンを同
類アミノ酸で置換する。特に好ましいアミノ酸置換はロ
イシンである。
本発明のさらに他の実施態様では、部位特異的突然変
異誘発法を用いて天然配列の76位のシステインをコード
する位置に突然変異を起こさせ、それによりシステイン
を同類アミノ酸で置換する。好ましいアミノ酸置換はロ
イシンまたはセリンである。他のアミノ酸で置換しても
よいが、同類置換が好適である。
異誘発法を用いて天然配列の76位のシステインをコード
する位置に突然変異を起こさせ、それによりシステイン
を同類アミノ酸で置換する。好ましいアミノ酸置換はロ
イシンまたはセリンである。他のアミノ酸で置換しても
よいが、同類置換が好適である。
親酵素アクセプターはいろいろな組換えDNA法、例え
ば欠失構築または所望のアミノ酸配列を有するDNAの直
接合成とこれに続く天然β−ガラクトシダーゼをコード
するlacZ遺伝子のα領域のDNA配列へのインフレーム（i
n frame）連結、を用いて作ることができる。こうした
技法は米国特許第4,708,929号に詳述されている。
ば欠失構築または所望のアミノ酸配列を有するDNAの直
接合成とこれに続く天然β−ガラクトシダーゼをコード
するlacZ遺伝子のα領域のDNA配列へのインフレーム（i
n frame）連結、を用いて作ることができる。こうした
技法は米国特許第4,708,929号に詳述されている。
また、親酵素アクセプターポリペプチド断片を産生す
る生物も一般に入手可能である。In Vitro Internation
al社（IVI）（Ann Arbor,MI）の大腸菌株AMA1004（受託
番号10051）はアミノ酸13−40を欠失させたβ−ガラク
トシダーゼ酵素アクセプター（EA22）の遺伝子を担うプ
ラスミドpMG22を保有する。大腸菌株AMA1004,IVI10050
はアミノ酸30−37を欠失させたβ−ガラクトシダーゼ酵
素アクセプター（EA14）の遺伝子を担うプラスミドpMG1
4を保有する。
る生物も一般に入手可能である。In Vitro Internation
al社（IVI）（Ann Arbor,MI）の大腸菌株AMA1004（受託
番号10051）はアミノ酸13−40を欠失させたβ−ガラク
トシダーゼ酵素アクセプター（EA22）の遺伝子を担うプ
ラスミドpMG22を保有する。大腸菌株AMA1004,IVI10050
はアミノ酸30−37を欠失させたβ−ガラクトシダーゼ酵
素アクセプター（EA14）の遺伝子を担うプラスミドpMG1
4を保有する。
本明細書で定義するとき、酵素アクセプターはβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子の欠失変異体により得られる酵素
的に不活性のポリペプチドであり、酵素ドナーと組み合
わされるとき、相補の過程により酵素活性のあるβ−ガ
ラクトシダーゼを形成する能力があるものである。ここ
で述べる置換された特定の酵素アクセプター突然変異タ
ンパク質はEA22から作られ、EA22はβ−ガラクトシダー
ゼタンパク質のＮ末端をコードするβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子のα領域内に欠失を有する酵素アクセプターで
ある。詳細には、EA22はアミノ酸残基13−40の欠失を有
する。また、アミノ酸位置500、443または76を含む天然
配列を有するβ−ガラクトシダーゼの他の酵素アクセプ
ター断片も、本発明の突然変異タンパク質を作るために
使用することができる。酵素αアクセプターの特定の例
は米国特許第4,708,929号に記述されており、例えばEA
5、EA11、EA14、EA17、EA18、EA20、EA23およびEA24が
ある。適当なαアクセプター中の欠失セグメントの遠位
末端は通常、β−ガラクトシダーゼ配列のアミノ酸位置
26−54の間にあるだろう。EA22においては、欠失セグメ
ントの遠位末端がアミノ酸40である。
ラクトシダーゼ遺伝子の欠失変異体により得られる酵素
的に不活性のポリペプチドであり、酵素ドナーと組み合
わされるとき、相補の過程により酵素活性のあるβ−ガ
ラクトシダーゼを形成する能力があるものである。ここ
で述べる置換された特定の酵素アクセプター突然変異タ
ンパク質はEA22から作られ、EA22はβ−ガラクトシダー
ゼタンパク質のＮ末端をコードするβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子のα領域内に欠失を有する酵素アクセプターで
ある。詳細には、EA22はアミノ酸残基13−40の欠失を有
する。また、アミノ酸位置500、443または76を含む天然
配列を有するβ−ガラクトシダーゼの他の酵素アクセプ
ター断片も、本発明の突然変異タンパク質を作るために
使用することができる。酵素αアクセプターの特定の例
は米国特許第4,708,929号に記述されており、例えばEA
5、EA11、EA14、EA17、EA18、EA20、EA23およびEA24が
ある。適当なαアクセプター中の欠失セグメントの遠位
末端は通常、β−ガラクトシダーゼ配列のアミノ酸位置
26−54の間にあるだろう。EA22においては、欠失セグメ
ントの遠位末端がアミノ酸40である。
本明細書ではαアクセプター断片が例示されるが、さ
らに、ωアクセプター断片も本発明の範囲内である。ω
アクセプターは欧州特許出願第92304354.1号に詳述され
ており、適当な親ωアクセプターの特定の例はOA721で
ある。
らに、ωアクセプター断片も本発明の範囲内である。ω
アクセプターは欧州特許出願第92304354.1号に詳述され
ており、適当な親ωアクセプターの特定の例はOA721で
ある。
本発明の教示にしたがって修飾のためにβ−ガラクト
シダーゼの酵素アクセプターポリペプチドを選択する際
に考慮すべき主な事柄は、所望の突然変異を起こそうと
する位置、すなわち適宜にアミノ酸500、443または76の
いずれかの位置に、欠失が前もって存在しないというこ
とである。
シダーゼの酵素アクセプターポリペプチドを選択する際
に考慮すべき主な事柄は、所望の突然変異を起こそうと
する位置、すなわち適宜にアミノ酸500、443または76の
いずれかの位置に、欠失が前もって存在しないというこ
とである。
本明細書で定義するとき、酵素ドナーとは、２つのド
メイン、すなわち酵素アクセプターと一緒になって活性
酵素を形成しうるタンパク質配列を含むドナードメイン
およびアナライト結合性タンパク質と相互作用しうるア
ナライトドメイン、から成る酵素的に不活性のポリペプ
チドのことである。アナライトドメインは、（ａ）種々
のアナライトまたはアナライト類似体との結合が行われ
るアナライト結合性ドメイン、または（ｂ）それ自体が
アナライト類似体として機能するタンパク質ドメイン、
のいずれかである。特に好ましい酵素ドナーであるED4
は米国特許第4,708,929号に詳述されている。
メイン、すなわち酵素アクセプターと一緒になって活性
酵素を形成しうるタンパク質配列を含むドナードメイン
およびアナライト結合性タンパク質と相互作用しうるア
ナライトドメイン、から成る酵素的に不活性のポリペプ
チドのことである。アナライトドメインは、（ａ）種々
のアナライトまたはアナライト類似体との結合が行われ
るアナライト結合性ドメイン、または（ｂ）それ自体が
アナライト類似体として機能するタンパク質ドメイン、
のいずれかである。特に好ましい酵素ドナーであるED4
は米国特許第4,708,929号に詳述されている。
本発明のアッセイ法においては、対象アナライト（ま
たは類似のアナライト誘導体）を結合または融合させた
β−ガラクトシダーゼ系の酵素ドナー、つまり酵素ドナ
ー結合体、の既知量を、既知量の特異的なアナライト結
合性タンパク質または他の結合性分子および既知量の酵
素アクセプター（酵素ドナーとの相補性を有する）と組
み合わせる。酵素ドナー結合体のアナライトドメインと
サンプル中の遊離の未知アナライトの間で既知量の特異
的なアナライト結合性タンパク質についての競合が起こ
って、酵素ドナー結合体が遊離の状態で存在するように
なり、その結果、それが酵素アクセプターと会合する。
ドナー結合体とアクセプターの会合は触媒活性のある酵
素複合体の形成をもたらし、かくして、サンプル中で検
出可能なβ−ガラクトシダーゼ酵素活性の量が変調され
る。結果的に、サンプル中の遊離アナライトが測定可能
な酵素活性の直接的関数として定量される。酵素活性は
分光光度測定法および蛍光光度測定法を含むがこれらに
限らない各種の技法を用いて酵素触媒反応による基質の
変換速度をモニターすることにより測定される。
たは類似のアナライト誘導体）を結合または融合させた
β−ガラクトシダーゼ系の酵素ドナー、つまり酵素ドナ
ー結合体、の既知量を、既知量の特異的なアナライト結
合性タンパク質または他の結合性分子および既知量の酵
素アクセプター（酵素ドナーとの相補性を有する）と組
み合わせる。酵素ドナー結合体のアナライトドメインと
サンプル中の遊離の未知アナライトの間で既知量の特異
的なアナライト結合性タンパク質についての競合が起こ
って、酵素ドナー結合体が遊離の状態で存在するように
なり、その結果、それが酵素アクセプターと会合する。
ドナー結合体とアクセプターの会合は触媒活性のある酵
素複合体の形成をもたらし、かくして、サンプル中で検
出可能なβ−ガラクトシダーゼ酵素活性の量が変調され
る。結果的に、サンプル中の遊離アナライトが測定可能
な酵素活性の直接的関数として定量される。酵素活性は
分光光度測定法および蛍光光度測定法を含むがこれらに
限らない各種の技法を用いて酵素触媒反応による基質の
変換速度をモニターすることにより測定される。
本明細書中で用いる速度論的活性は酵素アクセプター
と酵素ドナーとの相補反応の速度および再形成されたβ
−ガラクトシダーゼの触媒活性の両方を含むものであ
る。平衡活性は酵素アクセプターと酵素ドナーとの相補
が完結した後の再形成β−ガラクトシダーゼの触媒活性
である。
と酵素ドナーとの相補反応の速度および再形成されたβ
−ガラクトシダーゼの触媒活性の両方を含むものであ
る。平衡活性は酵素アクセプターと酵素ドナーとの相補
が完結した後の再形成β−ガラクトシダーゼの触媒活性
である。
実施例１ 酵素アクセプター突然変異タンパク質EA500Vの構築 DengとNickoloffの方法（前掲）にしたがって、親α
アクセプターEA22の部位特異的突然変異誘発により突然
変異タンパク質EA500Vを構築した。EA22の構造遺伝子を
含む出発プラスミドはp230であった。ハイブリダイゼー
ションのための連続した20の塩基および500位にシステ
インからバリンへの置換を導入する置換を含む２つのオ
リゴヌクレオチドプライマーを合成した。さらに、これ
らのプライマーはスクリーニングおよび選択の目的でそ
れぞれ新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を組み入れ、
かつ天然の制限エンドヌクレアーゼ部位を取り除いた。
アクセプターEA22の部位特異的突然変異誘発により突然
変異タンパク質EA500Vを構築した。EA22の構造遺伝子を
含む出発プラスミドはp230であった。ハイブリダイゼー
ションのための連続した20の塩基および500位にシステ
インからバリンへの置換を導入する置換を含む２つのオ
リゴヌクレオチドプライマーを合成した。さらに、これ
らのプライマーはスクリーニングおよび選択の目的でそ
れぞれ新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を組み入れ、
かつ天然の制限エンドヌクレアーゼ部位を取り除いた。
変性したp230に２つのプライマーをアニーリングさせ
た後、それらをDNAポリメラーゼにより伸長させ、そし
てエレクトロポレーションを使って鎖修復に欠陥のある
mut S E.coli株BMH71−18に形質転換した。これらの細
胞の一夜培養物から得られたプラスミドのプールをlacZ
欠陥株AMA1004に再度形質転換した。個々のコロニーか
ら得られたプラスミドは新たなユニーク制限エンドヌク
レアーゼ部位の導入についてスクリーニングした。陽性
クローンはシステイン−500からバリンへの変化の導入
について配列を解析した。最終的な突然変異誘発産物
は、システイン−500の位置に突然変異誘発アミノ酸を
有しかつ２つのサイレント変化（１つは突然変異誘発ア
ミノ酸の近くにあり、１つはプラスミド上の他のユニー
ク部位位置にある）を含むプラスミドp230であった。
た後、それらをDNAポリメラーゼにより伸長させ、そし
てエレクトロポレーションを使って鎖修復に欠陥のある
mut S E.coli株BMH71−18に形質転換した。これらの細
胞の一夜培養物から得られたプラスミドのプールをlacZ
欠陥株AMA1004に再度形質転換した。個々のコロニーか
ら得られたプラスミドは新たなユニーク制限エンドヌク
レアーゼ部位の導入についてスクリーニングした。陽性
クローンはシステイン−500からバリンへの変化の導入
について配列を解析した。最終的な突然変異誘発産物
は、システイン−500の位置に突然変異誘発アミノ酸を
有しかつ２つのサイレント変化（１つは突然変異誘発ア
ミノ酸の近くにあり、１つはプラスミド上の他のユニー
ク部位位置にある）を含むプラスミドp230であった。
実施例２ 酵素アクセプター突然変異タンパク質EA45の構築 DengとNickoloffの方法（前掲）にしたがって、親α
アクセプターEA22の部位特異的突然変異誘発により突然
変異タンパク質EA45Vを構築した。EA2の構造遺伝子を含
む出発プラスミドはp230であった。ハイブリダイゼーシ
ョンのための連続した20の塩基および443位にメチオニ
ンからロイシンへの置換を導入する置換を含む２つのオ
リゴヌクレオチドプライマーを合成した。さらに、これ
らのプライマーはスクリーニングおよび選択の目的でそ
れぞれ新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を組み入れ、
かつ天然の制限エンドヌクレアーゼ部位を取り除いた。
アクセプターEA22の部位特異的突然変異誘発により突然
変異タンパク質EA45Vを構築した。EA2の構造遺伝子を含
む出発プラスミドはp230であった。ハイブリダイゼーシ
ョンのための連続した20の塩基および443位にメチオニ
ンからロイシンへの置換を導入する置換を含む２つのオ
リゴヌクレオチドプライマーを合成した。さらに、これ
らのプライマーはスクリーニングおよび選択の目的でそ
れぞれ新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を組み入れ、
かつ天然の制限エンドヌクレアーゼ部位を取り除いた。
変性したp230に２つのプライマーをアニーリングさせ
た後、それらをDNAポリメラーゼにより伸長させ、そし
てエレクトロポレーションを使って鎖修復に欠陥のある
mut S E.coli株BMH71−18に形質転換した。これらの細
胞の一夜培養物から得られたプラスミドのプールをlacZ
欠陥株AMA1004に再度形質転換した。個々のコロニーか
ら得られたプラスミドは新たなユニーク制限エンドヌク
レアーゼ部位の導入についてスクリーニングした。陽性
クローンはメチオニン−443からロイシンへの変化の導
入について配列を解析した。最終的な突然変異誘発産物
は、メチオニン−443の位置に突然変異誘発アミノ酸を
有しかつ２つのサイレント変化（１つは突然変異誘発ア
ミノ酸の近くにあり、１つはプラスミド上の他のユニー
ク部位位置にある）を含むプラスミドp230であった。
た後、それらをDNAポリメラーゼにより伸長させ、そし
てエレクトロポレーションを使って鎖修復に欠陥のある
mut S E.coli株BMH71−18に形質転換した。これらの細
胞の一夜培養物から得られたプラスミドのプールをlacZ
欠陥株AMA1004に再度形質転換した。個々のコロニーか
ら得られたプラスミドは新たなユニーク制限エンドヌク
レアーゼ部位の導入についてスクリーニングした。陽性
クローンはメチオニン−443からロイシンへの変化の導
入について配列を解析した。最終的な突然変異誘発産物
は、メチオニン−443の位置に突然変異誘発アミノ酸を
有しかつ２つのサイレント変化（１つは突然変異誘発ア
ミノ酸の近くにあり、１つはプラスミド上の他のユニー
ク部位位置にある）を含むプラスミドp230であった。
実施例３ 酵素アクセプター突然変異タンパク質EA51の構築 挿入カセット突然変異誘発法を用いて酵素アクセプタ
ー突然変異タンパク質EA51を構築した。システイン−76
からロイシンへの変化を含む合成オリゴヌクレオチドを
DNAポリメラーゼKlenow断片で酵素的に二本鎖となし、
そして制限酵素で消化して、それをβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の76位にクローン化させた。
ー突然変異タンパク質EA51を構築した。システイン−76
からロイシンへの変化を含む合成オリゴヌクレオチドを
DNAポリメラーゼKlenow断片で酵素的に二本鎖となし、
そして制限酵素で消化して、それをβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の76位にクローン化させた。
実施例４ 酵素アクセプター突然変異タンパク質EA33およびEA34の
構築 ２つの出発プラスミドp22およびp204からEA33の構造
遺伝子を含むプラスミドを誘導した。プラスミドp22はE
A22をコードし、そしてp204は500位と1021位に部位突然
変異を有するプラスミドである。
構築 ２つの出発プラスミドp22およびp204からEA33の構造
遺伝子を含むプラスミドを誘導した。プラスミドp22はE
A22をコードし、そしてp204は500位と1021位に部位突然
変異を有するプラスミドである。
p204の構築は所望の突然変異を有する２つのプラスミ
ドp201およびp202を切断してつなげることにより行っ
た。プラスミドp201はシステイン−1021をセリンに置換
してあるプラスミドで、エキソヌクレアーゼIII/プライ
ミング法により作製された。すなわち、野生型β−ガラ
クトシダーゼの構造遺伝子をもつ出発プラスミドp200を
ユニーク制限部位で切断して線状化した。切断部位の
３′末端鎖をエキソヌクレアーゼIIIで時間依存的に消
化し、さまざまな長さの一本鎖DNAを生成させた。突然
変異誘発部位を一本鎖にした後、プライマーDNAを添加
し、一本鎖鋳型にハイブリダイズさせた。これをDNAポ
リメラーゼKlenow断片、T4 DNAリガーゼおよびDNAポリ
ヌクレオチドキナーゼにより伸長させ、AMA1004に形質
転換した。正しい突然変異体は突然変異誘発プライマー
により挿入された制限部位の変化により検出した。プラ
スミドp201およびp202は標準的な遺伝子スプライシング
法を用いて結合させた。その後、EA22欠失体を遺伝子ス
プライシングによりp204に移入して、EA33をコードする
p211を作製した。
ドp201およびp202を切断してつなげることにより行っ
た。プラスミドp201はシステイン−1021をセリンに置換
してあるプラスミドで、エキソヌクレアーゼIII/プライ
ミング法により作製された。すなわち、野生型β−ガラ
クトシダーゼの構造遺伝子をもつ出発プラスミドp200を
ユニーク制限部位で切断して線状化した。切断部位の
３′末端鎖をエキソヌクレアーゼIIIで時間依存的に消
化し、さまざまな長さの一本鎖DNAを生成させた。突然
変異誘発部位を一本鎖にした後、プライマーDNAを添加
し、一本鎖鋳型にハイブリダイズさせた。これをDNAポ
リメラーゼKlenow断片、T4 DNAリガーゼおよびDNAポリ
ヌクレオチドキナーゼにより伸長させ、AMA1004に形質
転換した。正しい突然変異体は突然変異誘発プライマー
により挿入された制限部位の変化により検出した。プラ
スミドp201およびp202は標準的な遺伝子スプライシング
法を用いて結合させた。その後、EA22欠失体を遺伝子ス
プライシングによりp204に移入して、EA33をコードする
p211を作製した。
EA34を作るために、エキソヌクレアーゼIII法により
生成した76突然変異誘発部位をp211にスプライスして、
EA34をコードするp212を作製した。
生成した76突然変異誘発部位をp211にスプライスして、
EA34をコードするp212を作製した。
実施例５ 速度論的活性および平衡活性の比較 酵素アクセプター突然変異タンパク質の速度論的およ
び平衡活性を測定する、いくつかの比較実験を行った。
これらの実験はすべて同一条件下で同時に行ったわけで
はないので、得られた結果は１グループとして比較する
ためにEA22活性のパーセンテージとして以下の表に示
す。
び平衡活性を測定する、いくつかの比較実験を行った。
これらの実験はすべて同一条件下で同時に行ったわけで
はないので、得られた結果は１グループとして比較する
ためにEA22活性のパーセンテージとして以下の表に示
す。
実験１（EA22、EA33、EA34） 速度論的活性を測定するために、50mMリン酸ナトリウ
ム、100mM塩化ナトリウム、2mM EDTA、2mM EGTA、5mM酢
酸マグネシウム、3mM ONPG（ｏ−ニトロフェニル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド）および0.03％Tween−20（ポ
リオキシエチレンソルビタンのICI Americas社の登録商
標）を含む酵素アッセイ緩衝液（pH7.0,25℃）に５μｇ
の相応の酵素アクセプターと0.6μｇのED4を加え、この
反応を405nmでモニターした。15分の反応にわたる平均
ΔA/minを活性の指標として用いた。１単位＝平均ΔA/m
in×1000 平衡活性を測定するために、相応の酵素アクセプター
とED4を0.1mlの容量中それぞれ4.4μＭ（0.5mg/ml）お
よび8.8μＭの最終濃度で室温にて24時間インキュベー
トした。10μg/mlのEAに相当する希釈液25μｌを用い
て、活性アッセイ緩衝液に加えることにより25℃でβ−
ガラクトシダーゼ活性を測定した。
ム、100mM塩化ナトリウム、2mM EDTA、2mM EGTA、5mM酢
酸マグネシウム、3mM ONPG（ｏ−ニトロフェニル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド）および0.03％Tween−20（ポ
リオキシエチレンソルビタンのICI Americas社の登録商
標）を含む酵素アッセイ緩衝液（pH7.0,25℃）に５μｇ
の相応の酵素アクセプターと0.6μｇのED4を加え、この
反応を405nmでモニターした。15分の反応にわたる平均
ΔA/minを活性の指標として用いた。１単位＝平均ΔA/m
in×1000 平衡活性を測定するために、相応の酵素アクセプター
とED4を0.1mlの容量中それぞれ4.4μＭ（0.5mg/ml）お
よび8.8μＭの最終濃度で室温にて24時間インキュベー
トした。10μg/mlのEAに相当する希釈液25μｌを用い
て、活性アッセイ緩衝液に加えることにより25℃でβ−
ガラクトシダーゼ活性を測定した。
１単位の活性＝平均ΔA/min×1000 実験２（EA22、EA51、EA500V） 速度論的活性の測定は実験１のごとく行ったが、アッ
セイあたり3.75μｇのEAと0.45μｇのED4を用いた。平
衡活性を測定するために、EAの濃度を全容量0.09ml中0.
22mg/ml（1.96μＭ）とし、ED4を3.6μＭとした。アッ
セイのために、8.8μg/mlのEAに相当する希釈液20μｌ
を用いた。
セイあたり3.75μｇのEAと0.45μｇのED4を用いた。平
衡活性を測定するために、EAの濃度を全容量0.09ml中0.
22mg/ml（1.96μＭ）とし、ED4を3.6μＭとした。アッ
セイのために、8.8μg/mlのEAに相当する希釈液20μｌ
を用いた。
実験３（EA22、EA45） 速度論的活性の測定は実験１のごとく行ったが、反応
を10分間モニターした。平衡活性を測定するために、EA
の濃度を全容量0.1ml中1mg/ml（8.8μＭ）とし、ED4を3
5.2μＭとした。インキュベーションを室温で６時間行
った。アッセイのために、５μg/mlのEAに相当する希釈
液20μｌを用いた。
を10分間モニターした。平衡活性を測定するために、EA
の濃度を全容量0.1ml中1mg/ml（8.8μＭ）とし、ED4を3
5.2μＭとした。インキュベーションを室温で６時間行
った。アッセイのために、５μg/mlのEAに相当する希釈
液20μｌを用いた。
実施例６ 相補反応の速度の測定 酵素ドナーED4を用いて、EA45から再形成されたβ−
ガラクトシダーゼ酵素の速度論的活性と、「野生型」親
EA22から再形成されたものの活性とを比較した。
ガラクトシダーゼ酵素の速度論的活性と、「野生型」親
EA22から再形成されたものの活性とを比較した。
次の組成を有する活性アッセイ緩衝液を調製した。
50mM リン酸Na,pH7.0 100mM NaCl 5mM 酢酸Mg 2mM エチレングリコール四酢酸（EGTA） 2mM EDTA 0.03％ Tween−20 1mg/ml CPRG（クロルフェニルレッド−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド） 速度論的β−ガラクトシダーゼ活性の測定は、β−ガ
ラクトシダーゼの色素原基質CPRGの存在下に0.3nMのα
ドナーED4を含むアッセイ緩衝液中で300nMの相応の酵素
アクセプターを用いて全容量1.0mlにて行った。次い
で、その後の酵素活性の速度を10分間にわたり574nmで
の吸光度を25℃でモニターすることにより分光光度的に
測定した。得られた結果を図１に示す。
クトピラノシド） 速度論的β−ガラクトシダーゼ活性の測定は、β−ガ
ラクトシダーゼの色素原基質CPRGの存在下に0.3nMのα
ドナーED4を含むアッセイ緩衝液中で300nMの相応の酵素
アクセプターを用いて全容量1.0mlにて行った。次い
で、その後の酵素活性の速度を10分間にわたり574nmで
の吸光度を25℃でモニターすることにより分光光度的に
測定した。得られた結果を図１に示す。
実施例７ 平衡活性の測定 酵素ドナーED4を用いて、EA45から再形成されたβ−
ガラクトシダーゼ酵素の平衡活性と、「野生型」親EA22
から再形成されたものの活性とを比較した。
ガラクトシダーゼ酵素の平衡活性と、「野生型」親EA22
から再形成されたものの活性とを比較した。
次の組成を有する活性アッセイ緩衝液を調製した。
50mM リン酸Na,pH7.0 100mM NaCl 5mM 酢酸Mg 2mM EGTA 2mM EDTA 0.03％ Tween−20 3mM ONPG 平衡活性の測定は、60mMリン酸カリウム、40mM塩化ナ
トリウム、10mM EGTA、2mM酢酸マグネシウム、20mMアジ
化ナトリウム、0.05％Tween−20を含む緩衝液（pH6.9）
中で0.1μＭの相応の酵素アクセプターと0.2μＭのαド
ナーED4をインキュベートすることにより行った。示し
た時点で、980μｌのアッセイ緩衝液に20μｌのインキ
ュベーション混合物を加えた。次いで、その後の酵素活
性のレベルを405nmでの吸光度の変化率を測定すること
により分光光度的に測定した。吸光度の変化／分×1000
として得られた結果を図２に示す。
トリウム、10mM EGTA、2mM酢酸マグネシウム、20mMアジ
化ナトリウム、0.05％Tween−20を含む緩衝液（pH6.9）
中で0.1μＭの相応の酵素アクセプターと0.2μＭのαド
ナーED4をインキュベートすることにより行った。示し
た時点で、980μｌのアッセイ緩衝液に20μｌのインキ
ュベーション混合物を加えた。次いで、その後の酵素活
性のレベルを405nmでの吸光度の変化率を測定すること
により分光光度的に測定した。吸光度の変化／分×1000
として得られた結果を図２に示す。
実施例８ 平衡活性の比較 酵素ドナーED4を用いて、EA33、EA34、EA51およびEA5
00Vの平衡活定を「野生型」親EA22の活性と比較した。
00Vの平衡活定を「野生型」親EA22の活性と比較した。
次の組成を有する活性アッセイ緩衝液を調製した。
50mM リン酸Na,pH7.0 100mM 塩化ナトリウム 5mM 酢酸Mg 2mM EGTA 2mM EDTA 0.03％ Tween−20 3mM ONPG 平衡活性の測定は、100mMリン酸ナトリウム、2mM EDT
A、2mM EGTA、5mM酢酸マグネシウム、0.02％アジ化ナト
リウム、0.03％Tween−20を含む緩衝液（pH7.0）中で0.
1μＭの相応の酵素アクセプターと0.2μＭのED4を室温
でインキュベートすることにより行った。示した時点
で、980μｌのアッセイ緩衝液に20μｌのインキュベー
ション混合物を加えた。次いで、その後の酵素活性の速
度を405nmでの吸光度の変化率を測定することにより分
光光度的に測定した。吸光度単位／分×1000として得ら
れた結果を図３に示す。
A、2mM EGTA、5mM酢酸マグネシウム、0.02％アジ化ナト
リウム、0.03％Tween−20を含む緩衝液（pH7.0）中で0.
1μＭの相応の酵素アクセプターと0.2μＭのED4を室温
でインキュベートすることにより行った。示した時点
で、980μｌのアッセイ緩衝液に20μｌのインキュベー
ション混合物を加えた。次いで、その後の酵素活性の速
度を405nmでの吸光度の変化率を測定することにより分
光光度的に測定した。吸光度単位／分×1000として得ら
れた結果を図３に示す。
実施例９ バルビツール酸のアッセイ サンプル検体中のアナライトを検出するEA45の能力を
実証するために、さまざまな濃度のバルビツール酸用量
（セコバルビタール）を、アナライト結合性タンパク質
としてバルビツール酸に特異的なモノクローナル抗体を
用いて測定した。用量反応曲線をEA45について作成し、
それを図４に示す。
実証するために、さまざまな濃度のバルビツール酸用量
（セコバルビタール）を、アナライト結合性タンパク質
としてバルビツール酸に特異的なモノクローナル抗体を
用いて測定した。用量反応曲線をEA45について作成し、
それを図４に示す。
EA試薬 100mM PIPES（1,4−ピペラジンジエタンスルホン
酸）,pH6.8 600mM NaCl 10mM 酢酸Mg 10mM EGTA 20mM アジ化Na 0.1mg/ml EA45 10mM Ｌ−メチオニン 0.5％ ウシ胎児血清 希釈率1:800のモノクローナルバルビツール酸抗体
（腹水） ED試薬 100mM PIPES,pH6.8 600mM NaCl 10mM EGTA 1mM EDTA 20mM アジ化Na 2mg/ml ウシ血清アルブミン断片 1mg/ml CPRG 0.93nM ED28−バルビツール酸結合体 バルビツール酸の測定 等量のED試薬とEA試薬を用いてHitachi717自動アナラ
イザ（Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,IN）
によりアッセイを行った。セコバルビタールの用量をEA
試薬を加えて５分間インキュベートし、その後ED試薬を
加えた。ED試薬を添加後４′00″−５′00″での１分の
読取り間隔を用いて570nmで吸光度を測定した。この特
定の実験では、用いた試薬の容量をそれぞれ134μｌと
し、サンプルの容量を９μｌとした。用量はAlltechセ
コバルビタール較正物質（10,000ng/ml）から調製し
た。
酸）,pH6.8 600mM NaCl 10mM 酢酸Mg 10mM EGTA 20mM アジ化Na 0.1mg/ml EA45 10mM Ｌ−メチオニン 0.5％ ウシ胎児血清 希釈率1:800のモノクローナルバルビツール酸抗体
（腹水） ED試薬 100mM PIPES,pH6.8 600mM NaCl 10mM EGTA 1mM EDTA 20mM アジ化Na 2mg/ml ウシ血清アルブミン断片 1mg/ml CPRG 0.93nM ED28−バルビツール酸結合体 バルビツール酸の測定 等量のED試薬とEA試薬を用いてHitachi717自動アナラ
イザ（Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,IN）
によりアッセイを行った。セコバルビタールの用量をEA
試薬を加えて５分間インキュベートし、その後ED試薬を
加えた。ED試薬を添加後４′00″−５′00″での１分の
読取り間隔を用いて570nmで吸光度を測定した。この特
定の実験では、用いた試薬の容量をそれぞれ134μｌと
し、サンプルの容量を９μｌとした。用量はAlltechセ
コバルビタール較正物質（10,000ng/ml）から調製し
た。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 クレヴォリン，マーク アメリカ合衆国 94564 カリフォルニ ア州 ピノール，デ ラ ブライアンダ イス コート 2732番地 (72)発明者 ボガスロースキー，ソフィー ジェイ. アメリカ合衆国 46260 インディアナ 州 インディアナポリス，サイカモア グローブ コート 7580番地 (72)発明者 レデン，デイヴィッド ジェイ. アメリカ合衆国 46236 インディアナ 州 インディアナポリス，ベイ リッジ ドライブ 7654番地 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 9/38 G01N 33/535 G01N 33/542 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (12)
- 【請求項１】下記の置換のうち少なくとも１つを有す
る、β−ガラクトシダーゼの酵素アクセプターポリペプ
チドの突然変異タンパク質： （ｉ）500位にシステイン以外のアミノ酸； （ii）443位にメチオニン以外のアミノ酸；または （iii）76位にシステイン以外のアミノ酸。 - 【請求項２】500位のアミノ酸がグリシン、アラニン、
バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン
およびメチオニンよりなる群から選ばれる、請求項１に
記載の突然変異タンパク質。 - 【請求項３】500位のアミノ酸がセリンまたはバリンで
ある、請求項１に記載の突然変異タンパク質。 - 【請求項４】443位のアミノ酸がグリシン、アラニン、
バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオ
ニンよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の突然変
異タンパク質。 - 【請求項５】443位のアミノ酸がロイシンである、請求
項１に記載の突然変異タンパク質。 - 【請求項６】76位のアミノ酸がグリシン、アラニン、バ
リン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンお
よびメチオニンよりなる群から選ばれる、請求項１に記
載の突然変異タンパク質。 - 【請求項７】76位のアミノ酸がロイシンまたはセリンで
ある、請求項１に記載の突然変異タンパク質。 - 【請求項８】請求項１〜７のいずれかに記載のβ−ガラ
クトシダーゼの酵素アクセプターポリペプチドの突然変
異タンパク質を生産する方法であって、 （ａ）プラスミドに含まれている、β−ガラクトシダー
ゼの酵素アクセプターポリペプチドのポリヌクレオチド
コード配列の下記の領域： （ｉ）通常はシステインであるアミノ酸500のコドン； （ii）通常はメチオニンであるアミノ酸443のコドン；
または （iii）通常はシステインであるアミノ酸76のコドン、 の少なくとも１つに突然変異を導入し、それによって突
然変異プラスミドを作製し、そして （ｂ）該突然変異プラスミドを発現させて上記の突然変
異タンパク質を生産させる、 工程を含んでなる該方法。 - 【請求項９】サンプル中のアナライトをイムノアッセイ
によって定量するための試薬組成物であって、請求項１
〜７のいずれかに記載のβ−ガラクトシダーゼの酵素ア
クセプターポリペプチドの突然変異タンパク質を水性溶
媒中に含む該試薬組成物。 - 【請求項１０】サンプル中のアナライトをイムノアッセ
イによって定量するための試薬系の製造のための、請求
項１〜７のいずれかに記載のβ−ガラクトシダーゼの酵
素アクセプターポリペプチドの突然変異タンパク質の使
用。 - 【請求項１１】サンプル中のアナライトを定量するため
のキットであって、下記の試薬のうち１つ以上のものと
共にパッケージされた、請求項１〜７のいずれかに記載
のβ−ガラクトシダーゼの酵素アクセプターポリペプチ
ドの突然変異タンパク質を含む該キット： （ｉ）アナライトに特異的なアナライト結合性タンパク
質； （ii）該アナライト結合性タンパク質との結合について
該アナライトと競合することができ、かつ該アナライト
結合性タンパク質と結合していない場合には上記酵素ア
クセプターポリペプチドと結合してβ−ガラクトシダー
ゼ活性を有する活性な酵素複合体を形成することができ
る、酵素ドナーポリペプチド結合体；または （iii）該活性な酵素複合体によって生成物に変換され
うる基質。 - 【請求項１２】サンプル中のアナライトを定量するため
のイムノアッセイ法であって、 （ａ）該サンプルを次の成分： （ｉ）アナライトに特異的なアナライト結合性タンパク
質； （ii）該アナライト結合性タンパク質との結合について
該アナライトと競合することができる酵素ドナーポリペ
プチド結合体； （iii）該酵素ドナーポリペプチド結合体が該アナライ
ト結合性タンパク質と結合していない場合に該酵素ドナ
ーポリペプチドと結合してβ−ガラクトシダーゼ活性を
有する活性な酵素複合体を形成することができる酵素ア
クセプターポリペプチド、および （iv）該活性な酵素複合体によって生成物に変換されう
る基質； と接触させ、 （ｂ）該基質の変換を測定し；そして （ｃ）上記工程（ｂ）で測定した該基質の変換を該サン
プル中に該アナライトの存在、不在または量と相関させ
る、 工程を含んでなり、上記酵素アクセプターポリペプチド
が請求項１〜７のいずれかに記載の突然変異タンパク質
である、該イムノアッセイ法。
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