JPH10512448A - コードされた反応カセット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 化学結合が形成および開裂されたことを高感度で検出するために反応カセットが設計された。このシステムは、抗体および他の新規な触媒を探索するにあたって用いられる必携の考案物として採用されうる。また、カセットは、診断薬の設計において、重要な臨床的応用を有する。完全にコードされた様式で、この方法は、化学的事象を検出および解き明かすことが共に可能である。

Description

【発明の詳細な説明】 コードされた反応カセット 技術分野 本発明は、開裂（又は切断）、連結反応およびそれらを促進する触媒性分子の 活性を検出（アッセイ）するための方法並びに試薬に関する。さらに詳しくは、 本発明は、固相マトリックスと、基質を同定するようにコードされ、そしてこの ようなコード配列を増幅するためのポリメリゼーション・チェイン・リアクショ ン（ＰＣＲ）プライマー配列を含むヌクレオチド鎖との両方に共有結合された基 質を用いるアッセイに関する。 政府の権利 本発明は、一部、国立衛生研究院（ザ ナショナル インスティチュート オ ブ ヘルス）からの助成金（ＧＭ４８３５１）に基づく政府の支援によってなさ れた。アメリカ合衆国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。 背景技術 開裂、連結反応は、反応生成物の出現あるいは基質の消滅のいずれかをモニタ ーすることによってアッセイできる。例えば、タンパク質またはペプチドの分解 は、開裂生成物の出現を追跡することによってモニターできる。開裂生成物は、 ゲル電気泳動またはクロマト分離によって、基質から分離され、紫外線吸収また は比色アッセイによりモニターされる。同様に、ポリヌクレオチド連結反応も連 結反応生成物の出現を追跡することによってモニターできる。 開裂または連結反応の活性が低ければ、反応生成物を検出するためには検出シ グナルを増幅することが要求される。例えば、放射性同位体で標識された基質が 合成され、結果得られる反応生成物をラジオイムノアッセイによって検出される 。別法として、基質が比色反応を触媒する酵素にコンジュゲートされているなら ば、結果得られる反応生成物は、エンザイムイムノアッセイを用いて検出できる 。高 感度のエンザイムイムノアッセイが開発されてきた。感度の限界で用いられた時 、反応生成物の存在に対応して、エンザイムイムノアッセイによって発生される シグナルは、背景レベルのシグナルと同程度となる。 触媒性抗体の分野では、触媒活性な抗体を同定する目的で抗体ライブラリーが 日常的にスクリーンされる。有用な触媒性抗体を作り出すには２つの制限がある 。すなわち、第１は、基質又は反応中間体の類似体である産生免疫源を設計し、 そしてこれを用いて抗体ライブラリーを作成することである。第２は、結果得ら れる抗体を所望の触媒活性を求めてスクリーンすることである。要するに、制限 は、表示と検出である。表示の問題は、抗体の多様性を、認識および複製機能が 単一の物に結びつけられ、単なる結合の出来具合でモニターされるファージ中の 組合せライブラリーに変換することによって軽減することができる。しかしなが ら、触媒性抗体分子の少数のみを示すファージ粒子をスクリーンするには、高感 度のアッセイ方法が要求される。 このような例では、示される触媒活性は、背景レベルの活性よりもほんのわず かだけ高いかもしれない。 開裂、連結反応をアッセイするための従来技術での方法には、しばしば少量の 低い活性の抗体を同定するのに必要な感度が欠如している。幾つかの場合には、 低いレベルの触媒活性を有する触媒性抗体が、もしもそれがこのような触媒活性 を有すると確認された唯一の抗体であるか、そして／または、それがより高いレ ベルの触媒活性を有する抗体を作るための「進化論的計画」に用いられるならば 有用でありうる。従って、抗体ライブラリーをスクリーンするために採用される アッセイの感度は、有用な抗体を同定することに関して、制限的な因子となりう る。 アッセイの容易さ、または困難性も、これらのアッセイを実行する者の意欲を 制限するかもしれない。 反応生成物、または基質に対する抗体を得ることができる場合には、イムノ− ＰＣＲアッセイが製作され、そして検出系として採用される。Ｔ．Ｓａｎｏら， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）：２５８巻，１２０−１２２頁。イムノ−ＰＣＲア ッセイは、酵素−抗体コンジュケートがＰＣＲで増幅可能なポリヌクレオチド鎖 にコンジュゲートされた抗体によって置換されている以外は、エンザイムイムノ アッセイと同様である。イムノ−ＰＣＲアッセイは、高感度である。しかしなが ら、非常に低い抗原のレベルでは、イムノ−ＰＣＲアッセイは、抗体−ポリヌク レオチドコンジュゲートの非特異的な結合によって制限される。 必要なのは、開裂または連結反応を検出するための高感度のアッセイである。 そのようなアッセイは、抗体コンジュケートを採用すべきでなく、そして可能な 限り低い背景レベルのシグナルを有するべきである。アッセイは、労働効率がよ く、いかなる開裂反応または連結反応をアッセイするのに適応できるべきである 。 発明の開示 本発明は、開裂反応または連結反応を検出するために使用可能なコードされた 反応カセット並びにこのようなカセットを用いるアッセイに関する。カセットは 、いかなる開裂反応または連結反応をアッセイする目的でも製作されうる。開裂 反応または連結反応は、触媒されるか、あるいは触媒の恩恵なしに瞬間的である 。 反応カセットは、化学結合が形成および開裂されたことを高感度で検出するた めに設計される。この系は、抗体および他の新規な触媒を探索するにあたって用 いられる必携の考案物として採用されうる。また、カセットは、診断薬の設計に おいて、重要な臨床的応用を有する。完全にコードされた様式で、この方法は、 化学的事象を検出、およびデコード（解き明かす）することが共に可能である。 本発明のアッセイは、もともと抗体触媒の分野で応用されるように開発された 。しかしながら、医学分野での診断アッセイに重要なものを含めて、いかなる合 成反応または酵素反応をアッセイするためにも採用できるかもしれない。単一の 反応を探索するためにカセットを用いる時は、一つのＤＮＡ配列のみが必要であ る。しかしながら、完全にコードされた様式では、各々の基質に特異的なポリヌ クレオチド配列を用いることによって複数の基質を同時に調べることができる。 起った反応の性質は、ＰＣＲ反応かＡ．Ｄ．Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ（ＴＩＢＴＥ ＣＨ，１２巻，２７−３２頁，１９９４年）の方法に従ってポリヌクレオチドの クローニングかのいずれかの後で、ポリヌクレオチドの配列によって簡単に決定 できる。要するに、コードされた基質の組み合せライブラリーを作り、反応特異 性につい て知ることができる。触媒の組み合せライブラリーを基質の組み合せライブラリ ーに対してスクリーンして、単一の操作で新しい触媒を見つけ出し、それらの基 質特異性を微調整する系を設計できる。最後に、コードされたカセットを製作す るための開示された方法は、新しい触媒を探しているいかなる実験の座右の備え として、基質カセットが構築される操作手順に適用できる。これは、研究者にと って反応生成物が先行技術の方法によって容易にアッセイできるかどうかに無関 係な実験を計画することを可能にする。このようにして、酵素を探そうと考える 時はいつも、第１の段階は反応性を検出するコードされた反応カセットを製作す ることである。 さらに詳しくは、本発明は、開裂反応をアッセイするためのコードされた反応 カセットに関する。反応カセットは、固相マトリックスに共有結合された基質を 含み、ここで基質は開裂反応による開裂に対して感受性のある型のものである。 基質に結合されているのは、第１のＰＣＲプライマー配列と、コード配列と、第 ２のＰＣＲプライマー配列とを含む第１のポリヌクレオチドである。コード配列 は、第１のＰＣＲ配列と第２のＰＣＲ配列の間に位置する。好適な実施の形態で はコードされた反応カセットが第１および第２のリンカーを含んでもよい。第１ のリンカーは、固相マトリックスを基質へ共有結合する。第２のリンカーは、基 質を第１のポリヌクレオチドに共有結合する。ペプチドが好適な基質である。し かしながら、いかなる開裂されうる基質も使用できる。 別の実施の形態では、コードされた反応カセットは、シグナルをさらに増幅す るための、基質に結合された１つ以上の付加的なポリヌクレオチドを含んでもよ い。これらの付加的なポリヌクレオチドは、また同じ第１のＰＣＲプライマー配 列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含んでおり、そして付加 的なリンカーを介して基質に結合されている。 また、本発明は、開裂剤に晒されたコードされた反応カセットからの開裂生成 物の混合物にも関する。この混合物は、固相開裂生成物および可溶相開裂生成物 を含む。固相開裂生成物は、固相マトリックスに共有結合された基質の第１の開 裂生成物を含む。可溶相開裂生成物は、第１のポリヌクレオチドに共有結合され た基質の第２の開裂生成物を含む。また、本発明は、試料内の開裂剤を検出する 方法にも関する。この方法は、下記の工程を含んでなる。第１の工程に於いては 、試料が、基質の開裂を促進する反応条件下で、コードされた反応カセットと混 合され、開裂生成物を生成する。もし試料が開裂活性を有するならば、開裂生成 物、すなわち固相開裂生成物および可溶相生成物が発生するであろう。第２の工 程に於いて、固相開裂生成物および開裂されていないコードされた反応カセット から可溶相開裂生成物が分離かつ単離される。 第３の工程に於いては、第２の工程で単離された固相開裂生成物のポリヌクレ オチドのコード配列がポリメリゼーション・チェイン・リアクション（ＰＣＲ） 反応を用いて増幅される。第４の工程に於いては、増幅されたコード配列が検出 される。そして、選択できる第５の工程では、第４の工程で得られたシグナルが 定量的な結果を得るために既知の基質および／または開裂剤と関連づけられる。 本発明の別の側面は、連結反応をアッセイするためのコードされた連結反応カ セットを製造する連結されていない反応体の混合物に関する。その混合物は、固 相連結反応成分および可溶相連結反応成分を含む。固相連結反応成分は、固相マ トリックスに共有結合された第１の連結反応用反応体を含む。可溶相連結反応成 分は、第１のポリヌクレオチドと共有結合され第２の連結反応用反応体を含む。 前記のように、第１のポリヌクレオチドは、第２のＰＣＲプライマー配列と第２ のＰＣＲプライマー配列との間に位置するコード配列を含む。第１および第２の 連結反応用反応体は、連結剤の存在下、コードされた連結反応カセットを形成で きるように固相および可溶相連結反応成分を結合することが可能である。好適な 実施の形態では、第１および第２の連結反応用反応体は、連結可能なオリゴヌク レオチドの断片である。しかしながら、連結可能な分子のいかなる対をも使用す ることができる。 コードされた連結反応カセットは、連結反応生成物が固相マトリックスを第１ のポリヌクレオチドから分離すること以外は、コードされた反応カセットと同様 である。しかしながら、コードされた反応カセットと異なって、コードされた連 結反応カセットは、開裂剤による開裂に対して感受性がある必要はない。好適な 連結剤は、第１および第２の連結反応用反応体に関して、連結反応活性を有する 。さらに詳しくは、好適な連結反応剤は、ポリヌクレオチドリガーゼであり、そ し て好適な第１および第２の連結反応用反応体は、連結可能なオリゴヌクレオチド である。 また、本発明は、オリゴヌクレオチド試料内のヌクレオチド連結剤を検出する ための方法にも関する。本方法は幾つかの工程を含む。第１の工程に於いては、 試料が連結反応成分の混合物と一緒にされる。その結果得られる混合物は、コー ドされた連結反応カセットを製造するためにインキュベートされる。第２の工程 に於いては、上記のようにして形成された、コードされた連結反応カセットが、 可溶相連結反応成分の連結されていない部分から、固相連結反応成分の連結され ていない部分とともに分離かつ単離される。コードされた連結反応カセットのポ リヌクレオチドのコード配列は、それからＰＣＲを用いて増幅され、検出され、 そして連結剤の存在と関連づけられる。ポリヌクレオチドリガーゼが好適な連結 剤である。この場合、コードされた連結反応カセット内に含まれた連結反応生成 物は、リガーゼによる連結反応に対して感受性のあるポリヌクレオチドである。 コードされた反応カセットは、増幅そしてデコードされうるポリヌクレオチド の遊離（結合開裂の場合）、または捕捉（結合形成の場合）を介して働く。合成 のための化学的方法およびこの考案物の組み立ては、その感度および実用性に影 響を及ぼすパラメーターの詳しい特定および最適化とともに開示される。結合開 裂の検出様式では、α−キモトリプシンを代表的な触媒として用いて、反応カセ ットの特異性が配列中、ただ一つのアミノ酸のみが異なるペプチド基質（Ａｌａ₂ −Ｔｙｒ−Ａｌａ₂対Ａｌａ₂−Ｐｈｅ−Ａｌａ₂）についての選択的な認識およ び開裂を通して実証される。カセット感度（０．１−１ｐｍｏｌｅ，５−５０ｎ Ｍ）は、０．０１ｍｇ（１ビーズ）、または１０ｍｇ（１００００ビーズ）を使 用するかどうかに関わらず同じであるが、α−キモトリプシンの濃度に対して依 存性がある。しかし、この酵素の量は、もし濃度が５ｎＭ以上に保たれるならば 、２４００分子にまで少なく減少できる。結合形成の検出様式では、α−キモト リプシンで触媒されるペプチド結合形成が邪魔されるという理由から可能ではな かった。一方、化学的に触媒される結合形成（アルデヒドの還元アミノ化反応） は、実施することができた。そして、反応カセットの原理の第２の部分、す なわち化学結合の形成の検出を実証するため原型反応として用いた。 図面の簡単な説明 図１は反応カセットの原理を例示する。 図２は反応カセットの組立てに使用するスペーサーを例示する。 図３はスペーサーIII-VII を製造するための合成計画を例示する。示された合 成段階は以下のとおりである。 （ａ）Ｋ₂ＣＯ₃，ＤＭＦ，９０−１００℃；（ｂ）Ｃｓ₂ＣＯ₃，ＫＩ，ＤＭＦ ，９０−１００℃；（ｃ）Ｃｓ₂ＣＯ₃，ｎ−Ｂｕ₄ＮＩ，ＤＭＦ，８５℃；（ｄ ）Ａｇ₂Ｏ，ｎ−Ｂｕ₄ＮＩ又はＫＩ，ＴＨＦ，および又は音波処理なし，２０℃ ；（ｅ）ＮａＨ，ＴＨＦ，２０℃；（ｆ）Ｎａ，ＴＨＦ，２０℃；（ｇ）ＤＨＰ ，ＭｅＯＨ，濃塩酸１滴；（ｈ）ＤＥＡＤ，ＰＰｈ₃，フタルアミド，ＴＨＦ， ２０℃；（ｉ）ＤＭＴｒＣｌ，ピリジン，２０℃；（ｊ）（ＮＨ₂）₂，エタノー ル，８０℃；（ｋ）ＴｓＣｌ，ピリジン，２０℃；（ｌ）Ｎａ，２３；（ｍ）Ｐ ＤＣ，ＤＭＦ，２０℃；（ｎ）ＦｍｏｃＣｌ，Ｎａ₂ＣＯ₃，ジオキサン−Ｈ₂Ｏ ，０℃ ｔｏ ２０℃；（ｏ）（Ｂｏｃ）₂Ｏ，Ｅｔ₃Ｎ，ＤＭＦ，０℃ ｔｏ ２０℃． 図４は、結合開裂又は形成の検出に於いて研究された基質を例示する。 図５は、α−キモトリプシンで触媒された結合開裂の検出のための反応カセッ トの合成ならびに用途を例示する。最上部の反応は、スペーサVI又はVII、Ｆｍ ｏｃ−Ａｌａ₂，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＳｉｔ−ＢｕＭｅ₂）およびスペーサーＩ とＮｏｖａＳｙｎ ＫＤ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂）マトリックス上でのＳＰＰＳ（溶 液相ペプチド合成）の使用を示す。次の反応は、スペーサーVIIIの取着、それに 続いてβ−シアノエチルホスホラミダイトを用いるＤＮＡ合成によって、完全に 保護された反応カセットを提供し、それが濃アンモニアおよびＴＢＡＦさらに続 く多量の洗浄によって順次脱保護基化されることを示す。それからカセットは、 α−キモトリプシンに晒され、続いてＰＣＲ増幅およびアッセイにかけられ、結 合開裂検出にそのまま使用可能となる。 図６は、酵素的および化学的に触媒された結合形成の検出のための反応カセッ トの東側部分（Ｓ９，Ｓ１０）の合成を例示する。 図７は、酵素で触媒された結合形成の検出のための合成的アプローチを示す。 即ち、西側部分（商業的に入手できる化合物２４又は２５から誘導されるＣ３４ 又はＣ３５）を東側部分（Ｓ９−合成を図６に示す）にカップリングする。それ からカセットは、α−キモトリプシンに晒され、続いて固体支持体上のＰＣＲ増 幅および蛍光アッセイによる検出にかけられ、酵素で触媒された結合形成にその まま使用可能となる。 図８は、化学的に触媒された結合形成の検出のための合成アプローチを示す。 即ち、西側部分（Ｃ３６）を東側部分（Ｓ１０）に６０％ＤＭＳＯ／０．１ホウ 酸塩緩衝液（ｐＨ１０）中でカップリングする。混合物は、シアノホウ水素化ナ トリウムを用いて還元され、続いて多量に洗浄、そしてそれから固体支持体上の ＰＣＲ増幅並びに蛍光アッセイによる検出にかけられる。 図９は、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）を改善するために 研究されたテンプレートを例示する。 図１０は、第１世代の反応カセット（Ｃ１−Ｃ６）の一般的概要を例示する。 図１１は、第２世代の反応カセット（Ｃ７−Ｃ２５）の一般的概要を例示する 。 図１２は、結合開裂の検出を例示する。反応カセットを含む媒質からの試料の ＰＣＲ生成物は、α−キモトリプシンの存在、不存在とともに各レーンの上部に 示されている。レーン１、３、５および７は、α−キモトリプシン（５ｎＭ）、 およびカセットＣ₇、Ｃ₁₀、Ｃ₃₁、そしてＣ₃₂をそれぞれ含む媒質からの試料の ＰＣＲ生成物に対応する。レーン２、４、６および８は、それぞれα−キモトリ プシンなしの同一の実験に対応する。正のコントロール（レーン９）は、ＤＮＡ ４５ｍｅｒの標準品のＰＣＲ生成物に対応する。負のコントロール（レーン１０ ）は、ＤＮＡ４５ｍｅｒなしの同一の実験に対応する。ＴＧ−ＮＨ₂およびＮＳ ＫＤ−ＮＨ₂は、それぞれアミノ末端基を有する官能基化されていないＴｅｎｔ ａＧｅｌおよびＮｏｖａＳｙｎ ＫＤ樹脂に対応する。 図１３は、第３世代の反応カセット（Ｃ２６−Ｃ３２）の一般的概要を例示す る。 図１４は、結合形成の検出を例示する。官能基化された、又はされていない樹 脂（ＮＳＫＤ−VI₂−ＮＨ₂，ＴＧ−ＮＨ₂，Ｃ３４，Ｃ３５，又はＣ３６）を含 み、さらに官能基化されたポリヌクレオチド（Ｓ９，Ｓ１０）を含むか含まない か、そしてα−キモトリプシンを含むか含まない媒質からの１つのビーズのＰＣ Ｒ生成物をそれぞれのレーンの上部に示す。正および負のコントロールも、また 図１２中にある。ＫＳＫＤ-VI₂−ＮＨ₂は、２つのスペーサVIおよびアミノ末端 基を有するＮｏｖａＳｙｎ ＫＤ樹脂に対応し、ＴＧ−ＮＨ₂は、アミノ末端基 を有するＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂に対応する。 図１５は、カセットの組み立てに用いられるスペーサーユニット（Ｌ−Ｉ〜Ｌ −IV）の化学構造を示す。 図１６は、示した蛋白質分解酵素に関するペプチド反応カセットの反応特異性 を示す。 図１７は、図１６のペプチド反応カセットの反応感度を時間の関数として示す 。 発明を実施するための最良の形態 カセットの設計上の特徴 本発明は、２つの先行技術の方法を組み合わせたものである。 即ち、その第１は、固体支持体上でポリマーを合成する手法であり、そして第 ２は、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）である。全体のアプ ローチを図１に例示する。 反応カセットの中心的な操作上の特徴は、２つのプライマーを含むポリヌクレ オチドの遊離（開裂の場合）または捕捉（結合形成の場合）である（図１）。こ のように、適当に官能基化された固体支持体（図１）が基質の接合点で反応カセ ットを選択的に開裂できる触媒、または触媒のライブラリーに晒される時、一本 鎖ＤＮＡ（ポリヌクレオチド）が放出されるであろうし、そしてそれはＰＣＲ法 で増幅できる。さらに、ポリヌクレオチドの配列は、基質の性質を交換するよう に選択されることができ、それによってコードする基質のライブラリーが設計で きる。このような基質ライブラリーが触媒のライブラリーに晒される時、開裂さ れたポリヌクレオチドはコードし、そしてかくしてどの基質配列が開裂されたか を同定するので、触媒のみならず基質もまた同定できる。前記の方法に加えて、 本発明の反応カセット手法は、逆の経路を経て結合形成の場合を追跡することも 可能にする（図１）。この最初の報告で、本発明者らは、酵素で触媒された結合 の開裂の研究について本方法論を応用することを示す。 ３世代の反応カセットを以下に開示する。第１世代は、制御された（サイズを 調整された）細孔ガラス（ＣＰＧ）固体支持体に基づく。第２世代は、ポリエチ レングリコールおよびポリスチレンの７０重量％の共重合体（ＴｅｎｔａＧｅｌ ）に基づく。第３世代は、複合マトリックス（ＮｏｖａＳｙｎ ＫＤ）に基づく 。マトリックス支持体 反応カセットの理想的な支持体は、カセットを組み立てるのに用いられる合成 手法（ペプチドおよびＤＮＡ合成）と機械的および化学的に適合性がある一方、 用いられる触媒（酵素、ａｂｚｙｍｅ等）に接近できうる。 例えば、ポリスチレンを基剤とするマトリックスは、酵素触媒反応に使用する にはあまりにも疎水性でありすぎるが、一方ＣＰＧは、化学的および機械的安定 性に乏しいため不適当であった（ポリヌクレオチド−基質コンジュケートの遊離 は、望ましくない背景反応をもたらす）。ＴｅｎｔａＧｅｌは、機械的に安定で あり、そしてペプチド基質およびＤＮＡ合成と化学的に適合性があることが分か った。しかしながら、このマトリックスは、好適ではない。何故ならば、あまり にも疎水的な性質をもち、酵素に最適な接近性を許容しないからである。この理 由から、第３世代のカセットが設計された。それを以下に開示する。ケイソウ土 無機粒子のマクロ細孔構造内に保持されたポリジメチルアクリルアミドケルから 誘導される複合マトリックスであるＮｏｖａＳｙｎ ＫＤ樹脂が使用された。こ のマトリックスはより疎水性であり、機械的および化学的に安定であり、そして 生物触媒により適合する。 Ｍｅｌｄａｌ，Ｍ．；Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，Ｉ．；Ｂｒｅｄｄａｍ，Ｋ．；Ａｕ ｚａｎｎｅａｕ，Ｆ−Ｉ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １ ９９４，９１，３３１４を参照。スペーサー スペーサーは、好適にはヘテロ二官能基性であり、化学的に安定であり、かつ 基質とＤＮＡ合成の両方に適合性がある。一方の端は、基質部分に容易に取り付 け可能であるべきであり、そして他方の端は、ＤＮＡ合成のためのヒドロキシル 官能基を備えるべきである。 カセット上の第１のスペーサーは、マトリックスと基質の間に位置する。とこ ろが第２のスペーサーは、基質とポリヌクレオチド部分の間に位置する（図１） 。両方のスペーサーの長さは、本方法が成功するために極めて重要である。Ｎｉ ｅｌｓｅｎ，Ｊ．；Ｊａｎｄａ，Ｄ．Ｋ．；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃ ｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５，９８１２を参照。ＣＰＧおよびＮｏｖａＳ ｙｎ ＫＤにとって、マトリックス核に近接することに由来するかもしれない障 害を避けるためには、樹脂と基質の間に少なくとも３０−４０Åの距離があるこ とが好適である。 これはスペーサーIIの長さの２倍に相当する距離である。ＴｅｎｔａＧｅｌは 、既に第１のスペーサーとして働く長いポリエチレングリコール鎖を備える。第 ２のスペーサー（基質とポリヌクレオチドの間）の長さは、調べた触媒反応につ いてはあまり重要でないと開示されているが、ＤＮＡ合成（下記参照）について は重要であった。 カセットを製作するためのスペーサーの異なった型および組み合せは、図２に 開示されている。スペーサーＩ−VIIは、合成されたが、VIIIおよびIX（Ｇｌｅ ｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、そしてＸ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、商業的に入手で きる。スペーサーＩおよびIIは、文献の手順に従って合成され、本発明の初期の 設計（第１および第２世代のカセット）に導入された。スペーサーＩの合成は、 Ｓｃｈａｌｌｅｒらに開示されている。Ｓｃｈａｌｌｅｒ，Ｈ．；Ｗｅｉｍａｎ ｎ．Ｇ．；Ｌｅｒｃｈ，Ｂ．；Ｋｈｏｒａｎａ，Ｈ．Ｇ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．１９６３，８５，３８２１を参照。スペーサーIIの合成は、Ｎｉｅｌｓ ｏｎらに開示されている。Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊ．；Ｊａｎｄａ，Ｋ．Ｄ．Ｍｅｔ ｈｏｄｓ １９９４，６，３６１を参照。スペーサーＩは最短のスペーサーであ る。 多くの場合、触媒と基質間の最適の反応性のためにはあまりにも、それはきつ い。好適な用途は、他のスペーサーと配列され用いられることにある。スペーサ ーIIは、ＳＰＰＳ（Ｂｏｃ−アミノ酸化学）およびＤＮＡ合成の夫々で要求され る強酸そして強塩基の条件下、アセトキシ結合のところで化学的に不安定である ことが分かった。Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．；Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａ ｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，１９８４を参照。 スペーサーIIIおよびIVは、自由なアミノ基を有し、そして脱離基又はカルボ キシ末端を備える基質に取り付けることができる。スペーサーＶ−VII が最も長 い。これらはペプチド基質とアミド結合を形成することができ、スペーサーＩ、 III およびIVとは対照的に２つ以上の配列に取り付けることができる。スペーサ ーＶ−VII は、スペーサーＩ、III 又はIVと組み合せて用いられた。これらのス ペーサーの相互変換は、生じた末端水酸基のところでＤＮＡの合成を可能にする 。スペーサーVIIIは基質とＤＮＡ合成機上のポリヌクレオチドの間に自動的に導 入することができるが、これはＩ、III 又はIVがすでにくっつけられているか又 は基質が水酸基型の官能基を有することを前提とする。定量的にＶのアミノ末端 を遊離するために要求される脱保護基工程（ヒドラジン／エタノール（１／１） ）は、樹脂から基質を部分的に開裂することが分かった。 低ヒドラジン濃度（０．２Ｍ）では、反応は遅く（２４時間）そして不完全（ ８０−９０％）である。Ｂｅｒｔｏｚｚｙ，Ｃ．Ｒ．：Ｂｅｄｎａｒｓｋｉ，Ｍ ．Ｄ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９１，５６，４３２６を参照。 このスペーサーは、好適には、より安定な基質に採用される。スペーサーVIII −Ｘは、結合形成の検出についての研究用に、オリゴヌクレオチドを３′末端で 誘導体化（ＤＮＡ合成機でそのまま使用可能）するのに用いた。III −VIII合成 の合成計画は、図３に示されている。基質 反応カセットを実行するための代表的な触媒としてα−キモトリプシンを採用 した。この酵素は、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンのよう な芳香族、疎水性アミノ酸のＣ末端でアミド結合を開裂することが知られている 。 Ｈｅｓｓ，Ｇ．Ｐ．Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ（酵素），Ｂｏｙｅｒ Ｐ．Ｄ． 編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（アカデミック プレス）；Ｎｅｗ Ｙｏｒ ｋ，１９７１，２１３−２４８頁を参照。この酵素はチロシンメチルエステルと アラニンの１級アミン間にペプチド結合の形成を触媒することも知られている。 Ｌａｎｅ，Ｊ．Ｗ．；Ｈｏｎｇ，Ｘ；Ｓｃｈｗａｂａｃｈｅｒ，Ａ．Ｗ．Ｊ．Ａ ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５，２０７８を参照。基質Ｓ１−Ｓ７（ 図４）は、標準的なＢｏｃおよび／又はＦｍｏｃ方法に従って、組み立てられた 。Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ａ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓ ｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（固相ペプチド合成）：Ａ Ｐｒａｃ ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（実際の手引），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（オックスフォード大学出版）：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９を 参照。 ペプチドＳ１およびＳ２は、第１世代のカセットに用いられたが、一方Ｓ３− Ｓ７は、第２世代および第３世代のカセットに用いられた。 同様なペプチドに対して得られたデータから見積ると、α−キモトリプシンは 、基質Ｓ３よりもＳ４を〜１０倍、そして基質Ｓ１よりも〜１０³倍効率よく開 裂する。例えば、Ｂａｕｍａｎｎ．Ｗ．Ｋ．；Ｂｉｚｚｏｚｅｒｏ，Ｓ．Ａ．； Ｄｕｔｌｅｒ，Ｈ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７３，３９，３８１；そ してＦｉｓｈｅｒ，Ｇ．；Ｂａｎｇ，Ｈ．；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｅ．；Ｓｃｈｅｌｌ ｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ａ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔ ａ １９８４，７９１，８７を参照。この特徴は、本発明のカセット系内でα− キモトリプシンの特異性をプローブするのに用いることができる。ペプチドＳ４ は、α−キモトリプシンの最適の基質の１つである。従って、この基質がカセッ ト系の感度の好適な下限を例示するために、ここで採用された。ペプチドＳ７は 、α−キモトリプシンのＰ４、Ｐ５、Ｐ４′およびＰ５′位での相互作用をプロ ーブするために合成された。ペプチドＳ８は標準的な溶液相ペプチド化学を用い て５段階（図７）で合成され（副物質）、そして酵素で触媒された結合形成の検 出に用いられた。カセットを組み立てるのに用いた合成手順は、ＮｏｖａＳｙｎ ＫＤを固体支持体として、スペーサーＩ、VI（又はVII）およびVIIIを用いて 図５に例示されている。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ₂₁₇およびＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＳｉ ｔ−ＢｕＭｅ₂）が合成の組み立てブロックとして用いられたので、この合成ス キームは迅速かつ簡単である。Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ ｅｔｔ．１９９２，３３，７６０５を参照。第１および第２のスペーサーは、標 準的ＳＰＰＳに従って取り付けられる。スペーサーVIIIはポリヌクレオチドを組 み立てるのに用いたのと同一の手法を採用してＤＮＡ合成機上で、自動的に導入 される。実際、このスペーサーは、１つ以上のコピーの配列で取り付けられる。 ＤＮＡ合成が完了すると、ポリヌクレオチドは、脱保護基化され、続いてＴＨＦ 中、１Ｍ ＴＢＡＦと１５分間インキュベーションによってチロシンのシリコン 保護基が除去される。この工程の後、カセットは、そのまま結合の開裂検出モー ドに使用可能となる。 結合形成のために樹脂に取り付けられる基質のユニットは、個別に合成される 。図６は、反応カセットの東側部分、（即ちポリヌクレオチド−ペプチドコンジ ュゲート（Ｓ９）および５′末端でアミノ官能基化されたポリヌクレオチド（Ｓ １０））の合成を示す。ＳＰＰＳの条件に安定なメチルホスホラミダイト（ｍｅ ｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）モノマーを用いる常法のＤＮＡ合 成手順に従って、Ｓ９ユニットを合成した。Ｓ１０ユニットは、同様にして（同 一モノマー）、あるいはより容易に脱保護基化されるエクスパダイト β−シア ノエチルホスホラミダイトモノマー（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ β−ｃｙａｎｏｅｔｈ ｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ ｍｏｎｏｍｅｒｓ；Ｍｉｌｌｉｐｏ ｒｅ（ミリポア））を用いて、合成できる。ＤＮＡ合成法 標準ＤＮＡ合成がＣＰＧ又はポリスチレン固体支持体を用いることにより改善 された。ＣＰＧはより好ましくない化学的、機械的性質を有する（前記を参照） 。ポリスチレン基材のマトリックスは、より好ましくない疎水性の特徴を有する 。 ホスホラミダイト化学を用いる３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ （アプライド バイオシステム）ＤＮＡ合成機の標準的な１マイクロモル手法（ 方法Ａと名付ける）を以前に記載されたように第２世代のカセット用に修正した （方法Ｂと名付ける）。Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（オリゴヌクレオチド合成）：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａ ｐｐｒｏａｃｈ（実際の手引き）：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒ ｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０を参照。 ＣＰＧ、ＮｏｖａＳｙｎ ＫＤおよびＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂に適合させるため に方法Ｂをさらに修正した（方法Ｃと名付ける）。実験の項を参照。表１は、Ｃ ＰＧ（カセットＣ１），ＴｅｎｔａＧｅｌ（カセットＣ１０）およびＮｏｖａＳ ｙｎ ＫＤ（カセットＣ２９）と、それぞれ方法Ａ−Ｃを用いる時の工程毎の平 均収率（ＡＳＷＹ）そして全収率（ＯＡＹ）の改善を示す。 ＤＮＡ合成の成功には、２つの因子が重要な役割を果たした。第１は基質とポ リヌクレオチド間にあるスペーサーの長さであり、第２は樹脂のローディングで ある。一般的に、基質とポリヌクレオチド間のスペーサーが長いほど、そしてロ ーディングが低ければ低いほどＤＮＡ合成のＡＳＷＹが良好な結果となる。表２ −４を参照。例えば、ＴｅｎｔａＧｅｌ上で方法Ｂを用いると、ＡＳＷＹはＩ（ Ｃ１０）について９６．９％、VI（又はVII）およびＩ（Ｃ２０）について９８ ．８％、そして２（VI）およびＩ（Ｃ２１）について９９．８％である。 同一の樹脂上で、Ｉそして方法Ｂを用いると、ローディングが１７２．１μｍ ｏｌｅ／ｇ（Ｃ１２）である時、ＤＮＡ合成は失敗する。ローディングが５９． ９μｍoｌｅ／ｇ（Ｃ１０）である時、ＤＮＡ合成はＡＳＷＹ９６．９％でうま くゆく。高いローディングでは、基質とポリヌクレオチドの間に長いスペーサー があるかないかに関らず、合成は失敗する。 調べたすべての場合、濃アンモニアで脱保護基化した後でのＤＮＡ合成の収率 は、カセットによって２４〜１００％の間で変化する。平均〜７０％であり、表 ３および表４の最後の欄を参照せよ。 基質部分がなければ、脱保護基反応は定量的である。濃アンモニアがＤＮＡ合 成の前に、より少ない程度、マトリックスに影響を及ぼす事実（１０〜２０％ロ ス）を考慮すると、これらの結果は、ＤＮＡ合成の間、不安定な結合、分岐点等 が生成され、これらが濃アンモニアとの処理で除かれるということを示唆する。 この副反応の大きさは、しばしば１つのカセットから別のカセットで変わる。 酵素で触媒された結合形成の検出のための反応カセットの東側部分を構築する のに利用した好適な合成戦略を図６に示す。このユニット（Ｓ９）は、ＤＮＡ合 成するのにより安定なモノマーを用いることを要求する。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ₂と のカップリング段階は、強い塩基（ＤＩＥＡ）の存在下、行われねばならない。 このような条件下、通常のβ−シアノエチル保護基（結合開裂の検出に用いた） は、失われ、かくして望ましくない副反応をもたらす、メチルホスホラミダイト モノマーは、固有の安定性という結果からより適切であることが証明された。化 学的に触媒された結合形成では、この制限はあてはまらない。そしてメチル又は β−シアノエチルホスホラミダイトモノマーはＳ１０を合成するのに用いること ができる（図６）。ＰＣＲプロトコール コードされた反応カセットの２つの重要な側面は、タッグの配列および長さで ある。タッグの長さについて、ＤＮＡ合成でＯＡＹがより良いためには出来る限 り短かくあるべきである。さらに、それは高感度で特異的に増幅されねばならな い。 幾つかのテンプレート（Ａ−Ｆ、図９）は、例えばｐＨ、〔ＭｇＣｌ₂〕、〔 プライマー〕、〔酵素〕、サイクルおよび温度等、様々なＰＣＲ条件下において 特徴づけられた。テンプレートＡ−Ｆは、プライマーの配列およびＧ／Ｃ含量が 異なる。これらの２つの因子は、テンプレートの３次構造およびミスプライミン グに対して責任がある。テンプレート内の３次構造および自己相補的な配列を分 析し、プライマーとコンピューターモデリング（ＤＮＡＳＩＳ，Ａｍｐｌｉｆｙ およびＯＬＩＧＯ）を用いて、効率よい増幅にはプライマー配列が必須の要素で あることが決定された。 この理由は、携わるテンプレートが短かすぎて、ミスプライミングが容易に起 こる低温度で増幅されうるからである。テンプレートＡ（第１および第２世代） 、テンプレートＢ−ＥそしてテンプレートＦ（第３世代）を用いると、非特異的 な増幅生成物を増加させることなしに、以前に報告されたＰＣＲ条件下、感度を テンプレートの１０¹⁴モル以下に改善することはできなかった。 好適なモードでは、第３世代のカセットのためにＴａｑＳｔａｒｔ ＰＣＲ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，クローンテック），Ａｍｐｌｉｗａｘ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ ｌｍｅｒ，パーキンエルマー）およびＨｏｔｗａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，イ ンビトロジェン）のようなＨｏｔ Ｓｔａｒｔ ｐＣＲ手法を用いる。Ｍｕｌｌ ｉｓ，Ｋ．ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐ．１９９１，１，１−４； およびＤ′Ａｑｕｉｌｌａ，Ｒ．；Ｂｅｃｈｔｅｌ，Ｌ．Ｊ．；Ｖｉｄｅｌｅｒ ，Ｊ．Ａ．：Ｅｒｏｎ，Ｊ．Ｊ．； Ｇｏｒｃｚｙｃａ，Ｐ．；Ｋａｐｌａｎ， Ｊ．Ｃ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９１，１３，３７４９を参照。 後者の手法は好ましく、最良の結果をもたらす。その方法はサイクリング前に 反応混合物に添加される、Ｍｇ²⁺を含むワックスに基づく。第１のサイクル前に 、９４℃で３０秒間加熱すると、溶液中にＭｇ²⁺を遊離させ、Ｔａｑポリメラー ゼを進行させることを許容する。このようにして、低温度で起こりうるミスプラ イミングは、Ｍｇ²⁺が高温でのみ遊離されるので増幅されえない。低密度のため 溶融したワックスは水層の表面にとどまり、これはまた溶液の蒸発を防ぐ働きも する。テンプレートＥでは、感度を１０^-17モルに改善できたが、収量および感 度は悪かった（バンドが弱く、そして非特異的生成物が所望の生成物と共に泳動 する）。テンプレートＦは、Ｈｏｔ Ｗａｘおよび修正したＰＣＲプロトコール （実験の項を参照）を用いたＨｏｔ Ｓｔａｒｔ ＰＣＲ条件下、最良の結果を 与えた。 本発明者らは、アガロースゲル上で臭化エチジウム染色によって少なければ６ ０−６００分子のテンプレートで検出することができた。 最後に、このように少量の分子を検出しようとする時、汚染や持ち越しを避け るために厳密な滅菌条件下、操作することが好ましいことを付記すべきである。 Ｒｏｌｆｓ，Ａ．；Ｓｃｈｕｌｌｅｒ，Ｉ．；Ｆｉｎｃｋｈ，Ｕ．；Ｗｅｂｅｒ −Ｒｏｌｆｓ，Ｉ．ＰＣＲ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｎ ｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（臨床診断および研究）；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ ｇ：Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９２ 第５章；そしてＩｎｎｉ ｓ，Ｍ．Ａ．；Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．；Ｗｈｉ ｔｅ，Ｔ．Ｊ．；編 ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＰＣＲプロトコール），Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（方 法および応用の手引き）；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ，１９９０を参照。結合開裂 第１世代のカセット。この世代のものは、標準的な固相ペプチドおよびＤＮＡ 合成を用いて、ＣＰＧ上で（Ｄ）そして（Ｌ）アミノ酸と異なったスペーサーの 組合せで組み立てた。ペプチド合成のＡＳＷＹは９５−９８％であり、ＤＮＡ合 成のは〜９９％であった。表２および図１０を参照。テンプレートＡ（図９）そ してスペーサーＩおよびIIの組合せをこの第１世代のカセットで用いた。 ポリヌクレオチドの通常のアンモニア脱保護基反応は、樹脂からのペプチド− ポリヌクレオチドコンジュゲートの定量的な開裂をもたらす。この結果は、エク スパダイト ホスホラミダイト（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が採用される場合も、同 じであった。この方法は、例えば１６時間のかわりに１時間とほんの短時間濃ア ンモニアに晒らすことを要求する。ＤＮＡが脱保護基化されていないと、カセッ トは酵素によって開裂されない。この結果は、保護されている場合、その疏水性 に起因された。ホスフェートバックボーン上のポリヌクレオチドを穏やかに脱保 護基化（無水ＤＭＦ中、ＤＢＵ０．５Ｍと一晩中インキュベーション）しても、 反応カセットに影響を与えない。この部分的脱保護基反応は、カセットをより親 水性にし、そしてα−キモトリプシンがカセットのペプチド基質に達し、開裂す るのを許容する。これは、溶液中にポリヌクレオチドを遊離することになる。残 念ながら、背景反応（自動的な開裂）が反応の２５％を占め、そしてこの第１世 代カセットを実用的でなくする。第２世代のカセット この世代のものは、ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂に基づく。 （Ｌ）および（Ｄ）アミノ酸の両方と、異なった組合せのスペーサーおよび異 なったローディングとで幾つかのカセットがここで開示される。図１１および表 ３を参照。ＣＰＧおよびＮｏｖａＳｙｎ ＫＤに基づくカセットと対照的に、Ｔ ｅｎｔａＧｅｌは既に長いポリエチレングリコール側鎖を備える。樹脂と基質の 間にスペーサーを導入する必要はない。カセットを良好な収量で組み立てること ができなかったので、ローディングが８０μｍｏｌｅ／ｇ以上であるすべてのＴ ｅｎｔａＧｅｌに基づく樹脂は、本発明者らの研究から除外した（表３）。 基質のα−キモトリプシン開裂、すなわちａ）スペルミンの存在下（１ｍＭ） 、ｂ）スペルミンなしで、ｃ）ＤＭＳＯ（２０％）と、又はｄ）ＤＭＳＯなしで 、ｅ）ＢＳＡ（１％）と、又はｆ）ＢＳＡなしで、ｇ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパ ク質（最終濃度３．２μＭ，Ｐｒｏｍｅｇａ）と、又はｈ）一本鎖ＤＮＡ結合タ ンパク質なしで、ｉ）反応カセットの異なった濃度で、ｊ）異った酵素濃度で、 そしてｋ）様々なインキュベーション期間にわたって、以上がここで開示される 。スペルミンおよび一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、α−キモトリプシン（全電 荷＋５〜＋６）とポリヌクレオチド（全電荷−４５）との相互作用を最小にする と期待された。Ｂｌｏｗ，Ｄ．Ｗ．Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ；Ｂｏｙｅｒ Ｐ． Ｄ．（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１，１ ８５−２１２頁を参照。スペルミンは反応の感度に影響を及ぼさなかったが、一 方一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は反応を阻害した。この後者の発見は、おそらく ポリヌクレオチドへの結合の際に基質への接近が妨げられているためであろう。 反応カセットの濃度並びにインキュベーション時間は、感度を改善しなかったが 、背景反応を増加させただけであった。マトリックスとの非特異的な相互作用を 最小にすると期待されたＤＭＳＯおよびＢＳＡも感度に影響を与えなかった。予 期したように、（Ｄ）アミノ酸に基づくカセットは開裂されなかった。第２のス ペーサーの長さは、反応カセットの感度に影響を及ぼさなかった。ここで調べた すべての例で、感度は以前に報告された、α−キモトリプシン０．１−１ｐｍｏ ｌｅ（５−５０ｎＭ）を超えなかった。電荷相互作用が重要ならば、正に帯電さ れたα−キモトリプシンは、負に帯電された基質−ポリヌクレオチドのコンジュ ゲートの極く近傍に封鎖されるであろう。こうしてその局部的濃度が上昇する。 そこでこれは妨害効果を補償できうる。この世代のカセットを用いると、Ｃ１０ はＣ．が存在しない条件のもと開裂される（図 レーン１−４）。明らかに反応 カセットは、ただ１つのアミノ酸に関してのみ異なる２つの非常に似かよった基 質（（Ｌ）Ａｌａ₂−（Ｌ）Ｔｙｒ−（Ｌ）Ａｌａ₂対（Ｌ）Ａｌａ₂−（Ｌ）Ｈ ｅ −（Ｌ）Ａｌａ₂）を識別する。溶液中のこれら２つの基質に対するα−キモ トリプシンの反応性の違いは、〜１０（上記参照）と見積もられる。この結果は 、 コードされた反応カセットライブラリーの作製に関連がある。 反応カセット系の感度がα−キモトリプシン０．１−１ｐｍｏｌｅで止まる事 実は、触媒されていない反応が０．１−１ｐｍｏｌｅ α−キモトリプシンの反 応とほとんど同じくらい速いことを意味する。第１の近似として、感度がこのレ ベルの最小値に達するという明らかな理由がない。この質問に対して、いくつか の可能な答がある。ａ）樹脂によって作り出された微細環境又は基質の配座によ って、Ｋｍが影響が受け得る。これは酵素の基質に対する親和性を減少させる。 ｂ）この反応カセット系内で触媒されていない反応が異常に速い。ｃ）基質が完 全には酵素に接近できない（すなわち、マトリックスが疎水性すぎるか又は基質 がＤＮＡによって妨害されている）。ｄ）ＰＣＲ条件が最適でない。 反応が起きるためには、基質が触媒によって認識されねばならない。Ｋｍはか くして直接的に反応カセットの感度に影響を及ぼすであろう。固体支持体上の基 質に対してＫｍ（最良で１０^-5Ｍ）¹⁶が１００倍高いと仮定すると（Ｋｍａｐｐ ＝１０^-3Ｍ）、用いた最も好適な濃度条件下（１２５１０^-3Ｍ反応カセット、５ ５１０^-9Ｍα−キモトリプシン）形成される錯体の分率は０．９２（４．６２５ １０^-9Ｍ）であるだろう。Ｋｃａｔ（最良で１００ｓ^-1）が微細環境によって影 響を受けず、そして形成されたすべての錯体が生産的であると仮定すると、酵素 の速度は４．６２５１０^-7Ｍｓ^-1（４．６２５１０^-9Ｍ５ １００ｓ^-1）である だろう。同一の濃度条件のもとで背景反応（ペプチドの加溶媒分解）の速度は３ ．６５１０^-11Ｍｓ^-1（３５１０^-9ｓ^-1５ １２５１０^-3Ｍ）と概算される。Ｋ ａｈｎ，Ｄ．；Ｓｔｉｌｌ，Ｗ．Ｃ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８８， １１０，７５２９を参照。 酵素がある、なしでの速度比は１０⁴以上である。この粗い見積りによれば、 これらのコードされた反応カセットは、少なくとも１０^-17ｍｏｌｅのα−キモ トリプシン（０．１５１０^-12ｍｏｌｅ ５ １０^-4）を検出できるはずである 。従って、感度はＫｍによって制限されるべきではない。第２の可能性は、不活 性化されたペプチド結合の加溶媒分解の速度定数が３．８５１０^-5ｓ^-1（４．６ ２５１０^-7Ｍｓ^-1／１２５１０^-3Ｍ）であろうと仮定し、これは単なる微細環境 効果で説明できないので、除外されうる。基質の酵素に対する接近しやすさに関 す る第３の可能性はＣ２５（表３）およびＣ３３（表４）を用いて調べた。 これらのカセットはポリヌクレオチド部分を欠いており、そしてこのユニット に由来するかもしれない障害をプローブするために用いた。また、これらのカセ ットは、第２世代の反応カセットに於いて酵素の基質への接近しやすさを調べる ために選択された。何故ならば、Ｃ３３は、生物触媒と適合性があることが示さ れているＮｏｖａＳｙｎ ＫＤ樹脂に基づいているからである。 これらのカセットがα−キモトリプシンとインキュベートされた時、Ｃ３３は 定量的に基質の部位で開裂され、溶液中にＨＯ−（Ｌ）Ｔｙｒ−（Ｌ）Ａｌａ₄ −Ｉ−ＯＨを遊離する（λｍａｘ＝２７６ｎｍ，ε＝１４５０Ｍ^-1ｃｍ^-1，０． １Ｍ塩酸）。一方、Ｃ２５は溶液中紫外線で検出されうるいかなる物質をも生じ なかった。 これは実際、おそらく疏水性のため酵素がＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上の基質に対 して完全には接近しやすさを有しないことを示唆する。ＴｅｎｔａＧｅｌに基づ くカセットでアガロースゲル上開裂を認めた事実は、単にＰＣＲの強力な増幅効 果によるものである。第４の可能性は、本研究で用いた減少する濃度でのテンプ レートＡ（図９）を採用して調べた。感度はテンプレート１０^-14ｍｏｌｅで水 平になった。第３世代のカセット 第３世代のカセットはいくつかの改善点を取り入れている。即ち、ａ）感度を 向上するために設計およびテンプレートＦの使用によって、ＰＣＲ条件そしてプ ライマー配列が改善されている。ｂ）さらに感度を改善するために用いる触媒と 適合性があるようにマトリックス物質が選択された。ＮｏｖａＳｙｎ ＫＤのよ うな親水性のマトリックスが好適な物質である。 第３世代のカセットを組み立てるための、標準的ＳＰＰＳおよびホスホラミダ イト化学を用いる合成方法は、図５に示されている。２つのプライマおよびＡｌ ａ₂Ｔｙｒ−Ａｌａ₂のコード配列を含むテンプレートＦは、この世代のカセット にとってタッグの役割を果たす。 α−キモトリプシンの存在下、Ｃ２６−Ｃ３２をインキュベーションすると基 質部分の開裂並びに、増幅できそしてアガロースゲル上で可視化できるポリヌク レオチドの遊離をもたらす。図面、Ｃ３１については、例えばレーン５および６ を参照。Ｃ３１およびＣ３２は同じ効率で開裂される。これは本発明のカセット 系がＰ３，Ｐ４，Ｐ３′およびＰ４′位で異なる基質間を識別しないことを示す 。そこでこれはこの世代のカセットの特異性に制限を課す。図面中、レーン７お よび８を参照。この情報は組合せのコードされた反応カセットの設計に極めて重 要である。予期しないことにすべてのパラメーター（インキュベーション時間、 ＰＣＲ感度、樹脂の選択、スペーサーの長さ、ＤＮＡ合成等）を本研究で最適化 したにもかかわらず、感度の下限は、再びＴｅｎｔａＧｅｌで得られたα−キモ トリプシン０．１−１ｐｍｏｌｅを超えなかった。より一層予期しなかったこと は、Ｃ３０についての本発明者らの発見であった。即ち、ａ）検出限界は反応カ セット〜０．０１ｍｇ（１つのビーズ）、又は〜１０ｍｇを用いようが同一であ る。この段階で説明することは難しいが、１つのビーズが１００００ビーズと同 じ感度を導く事実は、基質および触媒の組合せライブラリーをスクリーニングす るのに極めて有用でかつ経済的利点がある。ｂ）反応完了後、カセットとα−キ モトリプシンとを含む１μｌの反応媒質は１０⁹倍まで希釈することができ、そ れでもなおＰＣＲの後、アガロースゲル上でポリヌクレオチドタッグに対応する バンドを与える。対照的に、触媒されていない反応媒質からの１μｌは、１０³ 倍希釈の後、もはやいかなる検出できる物質をも与えない。０．１−１ｐｍｏｌ ｅの酵素は溶液中、背景反応よりも〜１０⁶倍も多くポリヌクレオチドを産生し 、そしてにもかかわらず背景反応に対して検出されうるのがより低濃度のα−キ モトリプシンであることを、この実験は明らかにはっきりとさせる。 数字的には、４５１０^-21ｍｏｌｅ以上（０．１５１０^-12ｍｏｌｅ ５ １／ １０⁶５ １／２５≒２４００分子）の酵素量を検出することが可能であるはず だが、実験的には、α−キモトリプシンが５ｎＭ以上の濃度にとどまっていない とこの量は検出できない。０．１５１０^-12ｍｏｌｅは、α−キモトリプシンの 検出しうる最低の量に対応し、１／１０⁶はアガロースゲル上で背景に対してシ グナルをなお生成できる反応媒質の希釈倍率に対応する。１／２５は反応媒質（ ２５μｌ）の１μｌのみがＰＣＲによる増幅に用いられたという事実からくる。 おそらく、酵素はポリヌクレオチドを強く相互作用し、そしてすべての部位が飽 和されるまで基質に到達することができない。結合形成の検出 反応カセットの東側（Ｓ９）および西側（Ｓ３４）成分は図６、７にそれぞれ 示されているようにして合成された。 半有機媒質中、α−キモトリプシンは、チロシンメチルエステルと自由なアミ ンとの間のアミド結合形成を触媒する。反応は、半有機媒質中、アミンによって 攻撃される、アシル−酵素の形成を経て進行する。Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．；Ｗｈ ｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒ ｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（合成有機化学に於ける酵素）；Ｂａｌｄｗｉ ｎ，Ｊ．Ｅ．，ＦＲＳ；Ｍａｇｎｕｓ，Ｐ．Ｄ．，ＦＲＳ；（編）；Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ；１２巻； Ｐｅｒｇａｍｏｎ：Ｏｘｆｏｒｄ；１９９４を参照。図１４は、α−キモトリプ シンの存在下、Ｃ３４（又はＣ３５）とＳ９との反応から取られた１つのビーズ のＰＣＲ生成物のアガロースゲルを示す。 ＮｏｖａＳｙｎ ＫＤ（Ｃ３４）がマトリックスとして用いられる時、背景反 応が触媒反応を曇らせる（図１４，レーン７−９）。 樹脂のみ（基質部分なし）を用いるコントロール（対照）実験は、同じ結果を 与え、これは背景反応が実際、ポリヌクレオチドのマトリックスへの吸着による ものであることを示している。吸着は多量に洗浄した後でも完全には除去するこ とはできないが、高温でのＰＣＲ反応媒体なら放出させることができる（レーン １−３）。ＴｅｎｔａＧｅｌに基づく樹脂（Ｃ３５）では背景反応は多量の洗浄 後（レーン４−６）なくすことができた。触媒存在下の反応は、背景反応（触媒 されていないアミド結合形成）（レーン１０−１２）と比較すると、弱いバンド を与える。この傾向は本発明者らの期待とは矛盾しているが、次のように説明で きる。即ち、ａ）α−キモトリプシンはＣ３４（又はＣ３５）のチロシンメチル エステルの加水分解を触媒し、ポリヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートと反 応するのに利用される基質の濃度を低下させる。触媒されていない反応はこの事 実によって阻害されないので、より強いシグナル（レーン１０）を与える。ｂ） α−キモトリプシンは、最も接近しやすい部位と安定なアシル−酵素中間体を形 成し、ポリヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートと樹脂に結合された基質との 間の触媒されていない反応への通路を遮断する。 理由がどうであれ、ここに開示されたコードされた反応カセットを用いて遅い 触媒されていないペプチド結合の形成を検出できることが記載される。同時に、 コードされた反応カセットが化学結合の形成を検出することができることも記載 される。これらの結果は、本発明の設計では触媒の大きさが本方法を不利にする ようであることも示している。この理由から以下に開示するように、ＮａＣＮＢ Ｈ₃を用いる化学的に触媒された結合形成を採用することができる。イミン結合形成の検出 合成計画を図８に示す。論じた理由から（上記を参照）本発明者らはＴｅｎｔ ａＧｅｌを用いた。マトリックスは、まずグルタルアルデヒドで活性化され、そ れからＳ１０と結合されＮａＣＮＢＨ₃還元が続く。多量に洗浄した後、１つの ビーズをＰＣＲにかけた。図１４はイミン結合の形成を実証するアガロースゲル を示す。グルタルアルデヒドで前処理した樹脂は、４５−ｍｅｒバンド（レーン １３）を与えたが、一方予期されたようにこの前処理を施さなかった樹脂は４５ −ｍｅｒ（レーン１４）を与えなかった。反応カセットの原理の第２の部分を証 明するための用途とは別に、この合成方法は直交する合成図式を経由して予め得 られたペプチド−ポリヌクレオチドコンジュゲートライブラリーから反応カセッ トのコードされたライブラリーを構築するのに使用することができる。このよう にして得られたライブラリーは、結合開裂の検出モードに使用できる。 方 法 略号 ＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）、ＭＭＴｒ（モノメトキシトリチル）、Ｆｍ ｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチロキシカル ボニル）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ＤＭＦ（ジメチルフォルムアミド）、Ｄ ＭＡ（ジメチルアセトアミド）、ＡＳＷＹ（工程あるいは段階毎の平均収率）、 ＯＡＹ（全収率）、ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、ＴＢＡＦ（テト ラブチルアンモニウムフルオライド）、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ＭｅＯ Ｈ（メタノール）、ｄＨ₂Ｏ（蒸留水）、ＡｃＯＮａ（酢酸ナトリウム）、ＳＰ ＰＳ（固相ペプチド合成）、ｔ−Ｂｕ（ｔｅｒｔ−ブチル）、ｃｏｎｃｄ（濃縮 ）、ＣＰＧ（細孔のサイズをそろえたガラス）一般 ＮＭＲスペクトルは、溶媒を内部基準として、 ¹ＨＮＭＲについては、Ｂｒ ｕｋｅｒ（ブルッカー）３００ＭＨｚで、そして¹³ＣＮＭＲについてはＢｒｕｋ ｅｒ５００ＭＨｚで記録した。Ｄ₂Ｏ中のすべての¹ＨＮＭＲおよび¹³ＣＮＭＲの 測定は、（２−メチル）２−プロパノールを内部基準（ＣＨ ₃，１．３６ｐｐｍ ；ＨＯＣ（ＣＨ₃）₃，６８．７および３１．６ｐｐｍ）に用いて実施した。融点 はＦｉｓｈｅｒ−Ｊｏｈｎｓ（フィッシャージョーンズ）融点測定装置で測定し た。クロマトグラフ支持体は、Ｓｉｌｉｃａ ｆｌａｓｈ Ｍｅｒｃｋ（シリカ フラッシュ メルク）６０（０．０４０−０．０６３ｍｍ）であった。質量ス ペクトルは、Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ザ スクリップス リサーチ インスティテュート）の質量スペクトロメトリ ー施設で測定した。図４に例示された基質の合成 Ｆｍｏｃ−Ａｌａ₂およびＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＳｉｔ−ＢｕＭｅ₂）は、Ａｔ ｈｅｒｔｏｎ，Ａ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐ ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ ｈ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８ ９，４７−５３頁に記載された方法に従って合成した。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ₂につ いては、付録を、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＳｉｔ−ＢｕＭｅ₂）については、Ｆｉ ｓｈｅｒ，Ｐ．Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９２，３３，７６ ０５を参照せよ。他のアミノ酸、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１イル− Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート） およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物）は、Ｎｏｖａｂｉ ｏｃｈｅｍ（ノヴアバイオケム）から商業的に入手できる。無水グルタル酸、Ｄ ＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、無水ＤＭＡ（ジメチルアミン）および ＤＭＦ（ジメチルフォルムアミド）は、Ａｌｄｒｉｃｈ（アルドリッチ）から商 業的に入手できる。 溶媒であるＤＣＭ（メチレンクロライド）、ＭｅＯＨ（メタノール）、ＴＨＦ （テトラヒドロフラン）はＢａｘｔｅｒ（バクスター）から商業的に入手でき、 すべて低含水量（＜０．００１％）のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー） 等級であった。使用の前に、樹脂を１０分間、３％Ｃｌ₃ＣＣＯ₂Ｈ／ＤＣＭ処理 で予め適当な条件とし、続いてＤＣＭ，ＤＭＦ，１０％ＤＴＥＡ／ＤＭＦ，ＤＭ ＦおよびＤＣＭで多量に洗浄する。図４に例示される基質（Ｓ１−Ｓ７；配列番号１−５）の合成 標準的Ｆｍｏｃおよび／またはＢｏｃ方法（Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，１９８４；Ａ ｔｈｅｒｔｏｎら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓ ｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９）に従って、５００ÅＣＰＧ （細孔のサイズをそろえたガラス）（〜５０μｍｏｌｅ／ｇ、Ｓｉｇｍａ又はＣ ＰＧ Ｉｎｃ．），ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｓ−ＮＨ₂支持体（〜２６０μｍｏｌｅ ／ｇ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ又はＲａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）、又はＮｏｖ ａＳｙｎ ＫＤ（〜１００μｍｏｌｅ／ｇ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）のいずれ かの上で、手作業によりペプチド基質（Ｓ１−Ｓ７；配列番号１−５）を組み立 てた。４０−６０μｍoｌｅ／ｇの最終装填量（ローディング）を得るために、 合成の第１工程はアミノ酸モノマーに対して過剰の固体支持体を用いて実施する 。全ての最終洗浄の後、未反応のアミノ基をキャップする（０．２５体積の２， ６−ルチジン中の無水酢酸４．２３Ｍ，０．７５体積のＴＨＦ中のＮ，Ｎ−ジメ チルアミノピリジン０．５３Ｍ，３分間）。 同じ手順の部分官能基化およびキャッピングが他のローディングに応用される 。ペプチド合成のＡＳＷＹは、９５−９８％であった。各カップリング工程の後 で、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄する。反応の完了は、Ｋａｉｓ ｅｒ試験で調べる（Ｋａｉｓｅｒら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７０，３ ４， ５９５）。ＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）陽イオンアッセイ（Ｇａｉｔら，Ｏ ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘ ｆｏｒｄ，１９９０，４８頁）又はフルベン−ピペリジン付加物アッセイ（Ｆｍ ａｃアッセイ；ε_302nm＝７８００Ｍ^-1ｃｍ^-1，ピペリジン／ＤＭＦ２０％中； Ａｔｈｅｒｔｏｎら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅ ｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ ｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９）のいずれかを用いて可能 なかぎりローディングを決定する。 図５に示すように、チロシン上の水酸基のｔ−ＢｕＭｅ₂Ｓｉ保護基をカセッ ト組み立ての終わりにＴＨＦ中１Ｍ ＴＢＡＦで処理し、続いてＴＨＦ，ＭｅＯ Ｈ，ｄＨ₂Ｏ，トリス−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ８，ＮａＣｌ １６０ｍ Ｍ）およびｄＨ₂Ｏで多量に洗浄することにより除去した。この工程後、反応カ セットは、結合開裂検出モードに於いて使用可能である。 基質Ｓ８（配列番号６，図４）は、標準的な溶液相ペプチド化学（下記を参照 ）を用いて５段階で合成した。この化合物は、かなりの希薄溶液中でゲルを形成 する傾向があるので、ＴｅｎｔａＧｅｌ又はＮｏｖａＳｙｎ ＫＤへのカップリ ングは次のようにして行った。すなわち、ＮｏｖａＳｙｎ ＫＤ（０．５ｇ，５ ０μｍｏｌｅ），ＨＢＴＵ（５０ｍＭ）（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１イル−Ｎ ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、 ＨＯＢｔ（５０ｍＭ）（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物），ＤＩＥＡ （２００ｍＭ），およびＳ８（配列番号６）（５０ｍＭ）：以上の混合物をＤＭ Ａ（３ｍｌ）中、２０℃で８−１６時間、振盪する。これらの条件は、２−４倍 に希釈した標準条件に対応する。その後、樹脂をＤＭＡ（ジメチルアミン）、Ｍ ｅＯＨ（メタノール）およびＤＣＭ（メチレンクロライド）で洗浄する。Ｔｙｒ （ｏ−ｔ−Ｂｕ）をＴＦＡ／ＤＣＭ（トリフルオロ酢酸／メチレンクロライド） （１／４）で１０分間、脱保護基化する。樹脂をＤＣＭ，ＤＭＦ，ＭｅＯＨおよ びＤＣＭで洗浄し、高真空下乾燥する。樹脂は、図７に例示された基質の他の部 分と組み合せて結合形成検出モードに使用可能である。ＴｅｎｔａＧｅｌについ ては、カップリングを次のようにして行った。すなわち、ＴｅｎｔａＧｅｌ（０ ．２５ｇ，６５μｍｏｌｅ），ＨＢＴＵ（６５ｍＭ），ＨＯＢｔ（６５ｍＭ）， Ｓ８（配列番号６）（６５ｍＭ），およびＤＩＥＡ（２６０ｍＭ）：以上の混合 物を、ＤＭＡ（３ｍｌ）中、２０℃で１６時間振盪する。Ｓ９（配合番号６）お よびＳ１０（図６）の合成については、下記のＤＮＡ合成を参照。ＤＮＡ合成 ＤＮＡ合成のためのすべてのモノマー、試薬および溶媒は、特に記載していな いかぎりＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（アプライド バイオシステム， ＡＢＩ）又はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（グレンリサーチ）から購入した。エ キスパダイト β−シアノエチル ホスホラミダイト（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ミ リポア）は、アデニン、グアニンおよびシチジンのアミノ基上で、ｔ−ブチルフ ェノキシアセチルによって保護される。チミジンは保護されない。これらのモノ マーから生じるホスフェートバックボーンは、β−シアノエチルエステルとして 保護される。いくつかの第２世代カセットとともに用いられるホスホラミダイト モノマーは、濃アンモニア中、封止管で、５５℃、１６−２０時間のインキュベ ーションを要する。この条件にさらすのを最小にするために、ほとんどの反応カ セットで、迅速な脱保護基化（濃アンモニア中、５５℃で１時間）を可能にする エキスパダイト ホスホラミダイトを使用した。 標準のホスホラミダイト化学（Ｇａｉｔら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｏｘｆｏ ｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０）を用 いて、３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＤＮＡ合成機上でＤＮＡ 合成を実施した。ＴｅｎｔａＧｅｌの合成について以前に記載されたように（方 法Ｂ，９７段階と名付けて、Ｆｅｎｎｉｒｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２，２２７８に記載）、標準１μｍｏｌｅサイ クル（方法Ａ）９７段階と名付ける）を修正した。 これをＴｅｎｔａＧｅｌおよびＮｏｖａＳｙｎ ＫＤ樹脂の両方に適合させる ためにさらに下記のように修正した（方法Ｃ，９９段階と名付ける）。順番に、 ａ）ＤＣＭ（メチレンクロライド）ボトル（ボトル１９）を無水ＤＭＦで置き換 えた；ｂ）キャップＡ（ボトル１１）をエキスパダイトキャップＡ（Ｍｉｌｌｉ ｐｏｒｅ）で置き換えた；ボトル１５（ヨウ素０．１Ｍ）をより濃度の低いもの （０．０２Ｍ）で置き換えた；ｄ）モニターモード（段階７７）で、ボトル１８ からカラム（１０秒間）をボトル１９からカラム（３５秒間）に置き換えた；ｅ ）非モニターモードで、洗浄を一段階追加した、ボトル１９からカラム（３５秒 間）（段階８０）；ｆ）非モニターモードで、別の洗浄段階を追加した、ボトル １９からカラム（３５秒間）（段階９４）；ｇ）非モニターモード（段階８４， ８７および９０）を５秒から１０秒に延長した；ｈ）すべての洗浄段階３，５９ ，６１，６６および９６を１０秒から３０秒に延長した；ｉ）ホスホラミダイト およびテトラゾールとのインキュベーション（段階４５）を２５秒から１２０秒 に延長した；スペーサーVIIIの導入について、この段階を９００秒に延長した； ｊ）ＤＮＡ合成機で用いたすべてのモノマーの濃度は、無水アセトニトリル中、 ０．１Ｍであった；ｋ）合成は、３−５カップリング毎にモニターした。 ポリヌクレオチドは、濃アンモニアと５５℃で１時間処理して脱保護基化した 。ＤＣＭ中、３％Ｃｌ₃ＣＣＯ₂Ｈ（５分間）で処理し、続いてＤＣＭ，ＴＨＦ， ＭｅＯＨ，トリス−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ８，ＮａＣｌ １６０ｍＭ） およびｄＨ₂Ｏで多量に洗浄して、ＤＭＴｒ基を除去する。チロシン含有カセッ トをＴＨＦ中、１Ｍ ＴＢＡＦで１５分間、処理して、フェノール性水酸基保護 基であるＳｉＭｅ₂ｔ−Ｂｕを除去し、そして上記のように洗浄する。この工程 の後、カセットは結合開裂検出モードに使用可能である。酵素的触媒された結合形成の検出に用いられる基質Ｓ９（図６） 酵素触媒結合形成の検出のために、第１のメチルホスホラミダイトを含む長鎖 のアルキルアミノ基を備えるＣＰＧ１０００Å（１μｍｏｌｅスケール）上で、 Ｓ９を下記のようにして構築した。 すなわち、３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＤＮＡ合成機の標 準１μｍｏｌｅサイクル（方法Ａ）をメチルホスホラミダイトおよび標準ＡＢＩ 試薬とともに使用した。ＤＮＡ合成の後で、スペーサーVIIIを、続いてスペーサ ーIX又はＸ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を導入した。 ＭＭＴｒアミノ保護基は、８０％酢酸と２０℃で１時間、処理し、続いてｄＨ₂ Ｏ、トリス−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ８，ＮａＣｌ １６０ｍＭ）、ｄ Ｈ₂Ｏ，ＭｅＯＨ，ＤＣＭで洗浄することによって除去し、そしてこれを高真空 下で乾燥した。このようにして得られた官能基化されたポリヌクレオチドをさら に下記の濃度条件下、標準的なＳＰＰＳ法に従って、まだ固体支持体にある間に Ｆｍｏｃ−Ａｌａ₂で誘導体とする。 樹脂に結合されたポリヌクレオチド４μｍｏｌｅに対して、ＤＭＡ（０．５ｍ ｌ）中、ＨＢＴＵ（２５ｍＭ）、ＤＩＥＡ（１００ｍＭ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ₂ （２５ｍＭ）を２０℃で２時間、振盪する。樹脂をＤＭＦ，ＭｅＯＨ，ＤＣＭで 洗浄し、高真空下、乾燥する。この工程の後、４５分間チオフェノール／Ｅｔ₃ Ｎ／ジオキサン（１／１／２）の混合物を用いて、ホスフェートバックボーンを 脱保護基化し、そしてジオキサンおよびＭｅＯＨで洗浄する。ペプチド−ポリヌ クレオチドコンジュゲートを樹脂から脱離させ、末端Ｆｍｏｃ−アミノ酸基上で 、脱保護基化（濃アンモニア中、５５℃で１時間）し、そして０．８μｍの使い 捨てシリンジフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通して濾過する。 この工程の後、ポリヌクレオチド−ペプチドコンジュケートを４５−５０℃で １８時間処理して核塩基上で脱保護基化する。溶液を凍結乾燥し、３Ｍ ＡｃＯ Ｎａ，ｐＨ５．２から３回エタノール沈澱し、そしてさらに精製することなく、 酵素触媒ペプチドカップリングに使用する。酵素的に触媒された結合形成の検出に用いられる基質Ｓ１０（図６） 化学的に触媒された結合形成の検出のために、Ｓ１０（ポリヌクレオチド-VII I−IX又はポリヌクレオチド-VIII−Ｘ）は、１μｍｏｌｅスケールで、エクスパ ダイトβ−シアノエチルホスホラミダイトモノマーとともに５００ÅＣＰＧを用 いて組み立てた。 末端アミノ基を、８０％酢酸と２０℃で１時間、処理し、続いてｄＨ₂Ｏ、Ｍ ｅＯＨおよびｄＨ₂Ｏで多量に洗浄することによって、遊離させる。ポリヌクレ オチドを濃アンモニアと５５℃で１時間処理することにより脱保護基化した。上 澄み液を回収し、凍結乾燥する。固体を３Ｍ ＡｃＯＮａ，ｐＨ５．２からエタ ノール沈澱し、そしてさらに精製することなくカップリング反応に使用した。酵素的に触媒された結合開裂（図５） カセット（０．０１−１０ｍｇ，５．９−３０．１μｍｏｌｅ／ｇ）を、１、 １０^-1、１０^-2、１０^-3、１０^-4、１０^-5、１０^-6又は０ユニットのα−キモト リプシンを含む２５μｌのトリス−ＨＣｌ緩衝液（２ｍＭ，ｐＨ８，ＮａＣｌ １６ｍＭ）中に、懸濁し、そして混合物を２０℃で振盪した。 ３０分、１、２、３、４、１２、２４および４８時間後、上澄み液（１−２μ ｌ）を採取し、そしてＰＣＲ法に供した。酵素的に触媒された結合形成（図７） ９６ウェル濾過プレートアセンブリー（０．６５ｍｍ，Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉ ｃ Ｄｕｒａｐｏｒｅ，Ｌｏｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ；親水性デ ュラポア、低タンパク質，親和性，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のいくつかのウェルに 数百ビーズ（〜５ｍｇ）のＣ３４又はＣ３５を載置し、そして１、０．１又は０ 単位のα−キモトリプシン（最終体積２００μｌ）の存在下、トリス−ＨＣｌ １００ｍＭ ｐＨ８／ＤＭＳＯ（４０／６０，最終ｐＨ８．７５）中で、Ｓ９（ ０．３２ｍＭ）とインキュベートした。プレートを１時間、振盪し、そしてＭｕ ｌｔｉｓｃｒｅｅｎ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（マルチスクリーン フィルトレーション システム；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に適合させる。これは 装置を真空にし、続いてＤＭＳＯ／ｄＨ₂Ｏ ６０％，ｄＨ₂Ｏ，ＡｃＯＨ ８０ ％（１０分間），ｄＨ₂Ｏ，濃アンモニア（１０分間），ｄＨ₂Ｏ，ＴＦＡ２％（ １０分間），濃アンモニア，ｄＨ₂Ｏ ８０℃，ＭｅＯＨで多量に洗浄すること によって、反応を停止させることを可能にする。 ＰＣＲ増幅のために各ウェルからビーズを１つずつ取り出す。化学的に触媒された結合形成（図８）−西側部分のカップリング（Ｃ３６を東側 部分Ｓ１０へ） ９６ウェル濾過プレートアセンブリー（０．６５ｍｍ，Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉ ｃ Ｄｕｒａｐｏｒｅ，Ｌｏｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ，Ｍｉｌｌ ｉｐｏｒｅ）のいくつかのウェルに数百ビーズのＴｅｎｔａＧｅｌ（〜５ｍｇ） を載置し、そして２０体積％のグルタルアルデヒド／０．１Ｍリン酸塩緩衝液、 ｐＨ８．５とインキュベートした。プレートを室温で３時間、振盪し、そしてそ れからビーズをｄＨ₂Ｏおよび０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８．５で多量に洗浄 した。６０％ＤＭＳＯを含む０．０５Ｍホウ酸塩緩衝液、ｐＨ１０中に、アミノ 官能基化したポリヌクレオチドＳ１０（０．１５ｍＭ）を添加した。 プレートを３７℃で２０時間、振盪し、そしてＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ Ｆｉ ｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍに適合させた。これは装置を真空にし、続いて ０．１Ｍホウ酸塩緩衝液、ｐＨ１０で多量に洗浄することによって反応を停止さ せることを可能にする。それから、０．１Ｍリン酸塩緩衝液，ｐＨ８．５および ０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ８．５中０．２Ｍ ＮａＣＮＢＨ₃２００μｌを各 ウェルに添加し、プレートを２０℃で３時間振盪し、そして振盪せずに一晩中、 ４℃で保管した。Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅ ｍを用いて、ウェルから液相を濾過し除いた。 そして樹脂をｄＨ₂Ｏ、８０％酢酸（２ ５ １０分間）、濃アンモニア（２ ５ １０分間）、ＴＦＡ２％（２ ５ １０分間）、濃アンモニア（２ ５１ ０分間）、ｄＨ₂Ｏ ８０℃、およびＭｅＯＨで多量に洗浄した。ＰＣＲ増幅の ために各ウェルからビーズを１つずつ取り出した。ＰＣＲ実験 すべてのテンプレート（配列番号８−１４、Ａ−Ｇ、図９）および対応するプ ライマーは、Ｏｐｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（オペロン社）を通じて注 文製造した。テンプレートＡ（配列番号１）を備える反応カセットについては、 反応混合物からのアリコート（１μｌ）をＰＣＲ成分と混合した。ＭｇＣｌ₂２ ．５ｍＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ，プロメガ）１．２μｌ、Ｔａｑ緩衝液（Ｐｒｏｍｅ ｇａ）２μｌ、デオキシヌクレオチド トリホスフェート２．５ｍＭ（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ，ファルマシア）１．６μｌ、プライマーＩ １００ｐｍｏｌｅ／μ ｌ １μｌ，プライマーII １００ｐｍｏｌｅ／μｌ １μｌ，ｄＨ₂Ｏ １７ ．７μｌ，Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μｌ（２．５Ｕ）を第 １のＰＣＲサイクルを始める前に添加した。正のコントロール（ＰＣＲ成分のみ ）は、この研究で用いた１ｐｍｏｌｅのポリヌクレオチド配列を含むｄＨ₂Ｏと と もに実施した。負のコントロールは、ポリヌクレオチド配列なしで同一の条件下 、実施した。ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ（パーキン エ ルマー シータス）９６００装置で、次のサイクルプログラム、すなわち、９４ ℃、３０秒間変性反応、５５℃、３０秒間アニーリング、７２℃、３０秒間エク ステンションを用いて実施した。３５サイクル後、結果をアガロースゲル（１％ Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ アガロース，２％ＦＭＣ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ ア ガロースと９０ｍＭ トリス／６４．６ｍＭ ホウ酸塩／２．５ｍＭ ＥＤＴＡ ，ｐＨ８．３（１５ＴＢＥ），１０３ｍＶで）上で分析した。テンプレートＥ（ 配列番号１３）（表４）を備える反応カセットについては、Ｈｏｔ Ｗａｘ低濃 度Ｍｇ⁺⁺ビーズ（最終体積５０μｌ中、１．５ｍＭの最終濃度，Ｉｎｖｉｔｒｏ ｇｅｎ（インビトロジェン），Ｔａｇ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）５μｌ，ｄＮＴ Ｐ ２．５ｍＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）４μｌ，プライマーＩ １００ｐｍｏｌ ｅ／μｌ ２．５μｌ，プライマーII １００ｐｍｏｌｅ／μｌ ２．５μｌ， Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１μｌ（５Ｕ），反応上澄み液１μｌ， ｄＨ₂Ｏ ３４μｌを用いた。サイクルプログラムに先立って、９４℃、３０秒 間の予熱工程が行われ、そして７２℃、１０分間のエクステンションで終了した 。３５サイクルは次のようにプログラムされた。即ち、９４℃、３０秒間変性反 応、４９℃、１分間アニーリング、７２℃、３０秒間エクステンションであった 。正および負のコントロール並びにアガロースゲル上での分析も前記のごとく実 施した。結合形成の検出のために、テンプレートＦ（配列番号１４）をＴａｇ（ タッグ）として用い、そしてＰＣＲ条件は、前記の条件と同様であったが、この テンプレートでは２５サイクルのみであった。スペーサー分子（従来技術に記載および／又は商業的に入手可能な化合物）の合 成 化合物Ｉ（Ｓｈａｌｌｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５ ，３８２１）、化合物II（Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９４，６， ３６１），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＳｉｔ−ＢｕＭｅ₂）（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐ．Ｍ ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９２，３３，７６０５）、化合物２ ，２１（Ｍｏｒｉｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８，９２７７） 、 および化合物３，２２（Ｐｒａｋａｓｈら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉ ｎ Ｔｒａｎｓ．１ １９９１，１２７３）は、以前に報告された方法に従って 合成される。化合物１９、２０、２３、２４、２５、すべての試薬並びに溶媒は Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手できる。 様々な条件下、化合物１、５および９を化合物１９、２０、２１又は２２で誘 導体化しようとしたいくつかの試みは完全に失敗するか、所望の生成物を低収量 でしか与えなかった。この項では、スペーサーIII−VIIをかなりの高収量でもた らす反応を記載する（図３）。スペーサーIX（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）お よびＸ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）は、商業的に入手できた。１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２イロキシ）−１７−ヒドロキシ−３，６ ．９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン（５）（図３）の合成 化合物５：化合物１（２５．０ｇ，８９ｍＭｏｌ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，シグマケミカルカンパニー）および３，４−ジヒドロ− ２Ｈ−ピラン（７．５ｇ，８９ｍＭｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ）をメチレンクロライ ド（５００ｍｌ）中、０℃に冷却し、そして数滴の濃塩酸とともに１時間撹拌し た。温度を２０℃まで上昇させ、撹拌を一晩中、継続した。炭酸ナトリウム（３ ｇ）を加え、懸濁液を１時間撹拌し、それから濾過した。続いて、溶媒を乾燥状 態にまで蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル／メチ レンクロライド０−１００％）にかけると無色粘稠性オイルとして得られる化合 物５（Ｃ₁₇Ｈ₃₄Ｏ₈，９．８ｇ，３０％）を与えた。 Ｒｆ＝０．１（シリカ，酢酸エチル）。 ¹H NMR(CDCl₃)δ：4.56(t,³J(H,H)=2.9Hz,1H,OCHO); 3.9-3.3(m,28H,CH₂OCH₂ and CH ₂OH); 1.65-1.42(m,6H,CH₂CH₂CH₂of THP)． ¹³C NMR(CDCl₃)δ：98.1(OCHO);72.1，70.1，70.0，69.9，69.8，66.1，61.5 ，61.0，(CH₂OCH₂ and CH₂OH);29.7,24.5，18.4(CH ₂CH ₂CH ₂CH₂O)． FAB+MS(NBA/NaI): 367(M+H⁺)/z; 389(M+Na⁺)/z．１−ヒドロキシ−１７−フタルイミド−３，６，９．１２，１５−ペンタオキサ ヘプタデカン（９）（図３）の合成 化合物９：化合物１（２５．０ｇ，８９ｍＭｏｌ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、フタルアミド（１２．９ｇ，８９ｍＭｏｌ）、ＰＰｈ₃ （２３．０ｇ，８９ｍＭｏｌ）および無水ＴＨＦ（４５０ｍｌ，ナトリウム上 で蒸留）を不活性雰囲気下、２０℃で撹拌した。ＤＥＡＤ（１５．３ｇ，８９ｍ Ｍｏｌ；ジエチルアゾジカルボキシレートはＡｌｄｒｉｃｈから商業的に入手で きる。）無水ＴＨＦ中を２０℃で２時間にわたって滴下し、そして反応混合物を 一晩中撹拌した。溶媒を乾燥状態にまで蒸発させ、残渣を沸騰するｄＨ₂Ｏに取 った。冷却後、沈澱物を濾過し、そして水溶液を高真空下、乾燥状態にまで蒸発 させた。このようにして得られた粘稠性オイルをクロマトグラフ（シリカ フラ ッシュ，酢酸エチル／ヘキサン５０−１００％）にかけると、化合物９を無色粘 稠性オイルとして与えた（Ｃ₂₀Ｈ₂₉ＮＯ₈，２２．０ｇ，６０％）。 Ｒｆ＝０．１３（シリカ，酢酸エチル）。 ¹H NMR(CDCl₃)δ：7.82(m,2H,Ar); 7.69(m,2H,Ar); 3.88(t,³J(H,H)=6.1Hz,2H ,NCH₂); 3.72(t,³J(H,H)=5.4Hz,2H,NCH ₂CH₂O); 3.69-3.54(m,22H,CH₂OCH₂ and C H₂OH)． ¹³C NMR(CDCl₃)δ：167.9(CO); 133.7,131.7,122.9(Ar); 72.2,70.3,70.2,70. 1,70.0,69.95,69.7(OCH₂CH₂O); 67.5(OCH₂CH₂N); 61.2(OCH₂ CH₂OH); 36.9(CH₂N) ． FAB+MS(NBA/NaI); 予想される正確な質量(M+H⁺)/z 412.1971，実測値 412.198 3; 434(M+Na⁺)/z．１−フタルイミド−１７−〔（４，４′−ビスメトキシ−トリチル）−オキシ〕 −３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン（１２）（図３）の合成 化合物１２：化合物９（１．８ｇ，４．４ｍＭｏｌ）、ＤＭＴｒＣｌ（４，４ −ジメトキシトリチルクロライドは、Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手できる） （２．２ｇ，６．６ｍＭｏｌ）をピリジン（２０ｍｌ）中、２０℃で４０時間、 撹拌した。Ｅｔ₃Ｎ（１２ｍＭｏｌ，トリエチルアミン）を加えて、そして溶媒 を乾燥状態にまで蒸発させた。フラッシユクロマトグラフィー（シリカ，エチル アセテート／ＤＣＭ ０−５０％）の後で、化合物１２（Ｃ₄₁Ｈ₄₇ＮＯ₁₀，２． ８ｇ，８８％）を黄色粘稠性オイルとして得た。 Ｒｆ＝０．１５（シリカ，酢酸エチル／ヘキサン５０％）。 ¹H NMR(CDCl₃)δ：7.83(m,2H,フタルイミド); 7.68(m,2H，フタルイミド); 7. 47(d,³J(H,H)=7.1Hz,2H,Ph DMTr); 7.34(d,³J(H,H)=8.9Hz,4H,p-MeOPh DMTr); 7 .26(t,³J(H,H)=7.6Hz,2H,Ph,DMTr); 7.18(t,³J(H,H)=7.3Hz,1H,Ph DMTr); 6.81( d,³J(H,H)=8.9Hz,4H,p-MeOPh DMTr); 3.88(t,³J(H,H)=5.9Hz,2H,CH₂N); 3.77(s, 6H,CH₃O); 3.75-3.5(m,20H,CH₂OCH₂); 3.21(t,³J(H,H)=5.4Hz,2H,CH₂ODMTr)． ¹³C NMR(CDCl₃)δ: 168.2(CO); 158.3,145.0,136.3,130.0,128.1,127.7,126.6 ,123.2,113.0(DMTr Ar); 133.9,132.2,123.2(フタルイミドAr); 85.8((p-MeOPh)₂ PhCO);70.7,70.6,70.55,70.5,70.45,70.0,67.8(CH₂OCH₂); 63.1(CH₂ODMTr);55. 1(CH₃O); 37.2(CH₂N)． FAB+MS(NBA/NaI):予想される正確な質量(M+Na⁺)/z 736.3098，実測値 736.312 3．１−アミノ−１７〔（４，４′−ビスメトキシトリチル）オキシ〕−３，６，９ １２，１５−ペンタオキサヘプタデカン（III）（図３）の合成 化合物III ：化合物１２（１．７ｇ，２．３ｍＭｏｌ），（ＮＨ₂）₂（ヒドラ ジン）（２３．４ｍＭｏｌ，０．７３ｍｌ）およびエタノール（１００ｍｌ）を ３時間還流した。冷却した後、沈澱物を濾過し、そして溶媒を乾燥状態にまで蒸 発させた。残ったオイルをジエチルエーテルに取り、そして沈澱物を濾過した。 有機相を乾燥状態にまで蒸発させると化合物III （Ｃ₃₃Ｈ₄₅ＮＯ₈，１．２ｇ， ８９％）を淡黄色粘稠性オイルとして与え、これをさらに精製することなく使用 した。 ¹H NMR(CDCl₃)δ：7.45(d,³J(H,H)=7.3Hz,2H,Ph DMTr); 7.33(d,³J(H,H)=8.8H z,4H,p-MeOPh DMTr); 7.27(t,³J(H,H)=7.0Hz,2H,Ph DMTr);7.18(t,³J(H,H)=7.0H z,1H,Ph DMTr); 6.81(d,³J(H,H)=8.8Hz,4H,p-MeOPh DMTr); 3.77(s,6H,CH₃O); 3 .73-3.59(m,18H,OCH₂CH₂O); 3.48(t,³J(H,H)=5.1Hz,2H,CH ₂CH₂NH₂); 3.21(t,³J( H,H)=5.2Hz,2H,CH₂ODMTr); 2.84(t,³J(H,H)=5.1Hz,2H,CH₂CH ₂NH₂)． ¹³C NMR(CDCl₃)δ: 158.3,145.0,136.3,130.0,128.1,127.7,126.6,113.0(Ar); 85.8((p-MeOPh)₂PhCO); 73.4,70.7,70.6,70.5,70.2(CH₂OCH₂); 63.1(CH₂ODMTr) ; 55.2(CH₃O); 41.7(CH₂NH₂)． FAB+MS(NBA/NaI):584(M+H⁺)/z;予想される正確な質量(M+Na⁺)/z 606.3043，実 測値 606.3072．１−ヒドロキシ−１７−〔（４，４′−ビスメトキシトリチル）オキシ〕−３， ６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン（１３）の合成（図３の工程ｉ で形成される；化合物は中間体であり示されていない） 化合物１３：化合物１（５ｇ，１７．７ｍＭｏｌ）およびＤＭＴｒＣｌ（ジメ トキシトリチルクロライド６．３ｇ，１７．７ｍＭｏｌ）をピリジン（１７ｍｌ ）中、不活性雰囲気下、２０℃で４８時間、撹拌した。Ｅｔ₃Ｎ（４ｍｌ）を加 えて、そして溶媒を乾燥状態にまで蒸発させた。このようにして得たオイル状残 渣をエーテル（１００ｍｌ）に取り、ｄＨ₂Ｏ（１００ｍｌ）で抽出した。有機 層 を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、乾燥状態にまで蒸発させ、そして高真空 下で乾燥した。 フラッシュクロマトグラフィーの後（シリカ，酢酸エチル／ヘキサン５０−１ ００％）、化合物１３（Ｃ₃₃Ｈ₄₄Ｏ₉，３．３ｇ，３２％）を黄色オイルとして 得た。 Ｒｆ＝０．１２（シリカ，エチルアセテート） ¹H NMR(CDCl₃，塩基性アルミナ上を濾過）δ：7.46(d,³J(H,H)=7.2Hz,2H,Ph D MTr); 7.34(d,³J(H,H)=8.8Hz,4H,p-MeOPh DMTr); 7.27(t,³J(H,H)=7.8Hz,2H,PhD MTr);7.19(t,³J(H,H)=7.2Hz,1H,Ph DMTr); 6.82(d,³J(H,H)=8.9Hz,4H,p-MeOPh D MTr); 3.78(s,6H,CH₃O);3.7-3.57(m,22H,CH₂OCH₂ and CH₂OH); 3.22(t,³J(H,H)= 5.3Hz,2H,CH₂ODMTr)． ¹³C NMR(CDCl₃，塩基性アルミナ上を濾過)δ: 158.3,145.1,136.3,130.1,128. 2,127.7,126.6,113.0(Ar);85.9((p-MeOPh)₂PhCO); 72.5,70.7,70.68,70.65,70.6 2,70.58,70.52,70.48,70.45,70.42,70.3(CH₂OCH₂); 63.1(CH₂ODMTr);61.7(CH₂OH ); 55.2(CH₃O)． FAB+MS(NBA/CsI)：予想される正確な質量(M+Cs⁺)/z 717.2040，実測値 717.20 22．１，１７−ビス〔（ｐ−トルエンスルホニル）オキシ〕−３，６，９，１２，１ ５−ペンタオキサヘプタデカン（１４）の合成（図３の工程ｋ；化合物は中間体 であり示されていない） 化合物１４：化合物１（２５．０ｇ，８９ｍＭｏｌ）、ｐ−トルエンスルホニ ルクロライド（５０．９ｇ，２６７ｍＭｏｌ）を乾燥ピリジン（７５ｍｌ）中、 不活性雰囲気下、０℃で４時間撹拌した。それから反応媒体を氷上（８００ｍｌ ）に注ぎ、そして激しく撹拌した。ＤＣＭ（３００ｍｌ）を加え、水層を３Ｍ塩 酸で注意深くｐＨ≒１に酸性化した。水層をさらにＤＣＭ（２ ５ ３００ｍｌ ）で抽出し、有機層を合せ、そして飽和塩化アンモニウム（２ ５ ３００ｍｌ ）、ｄＨ₂Ｏ（２ ５ ３００ｍｌ）で抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、 濾過し、乾燥状態にまで蒸発させ、そして残ったオイルを高真空下、乾燥した。 フラッシュクロマトグラフィー（シリカ，ＭｅＯＨ／ＤＣＭ ０−１％）の後、 化合 物１４（Ｃ₂₆Ｈ₃₈Ｓ₂Ｏ₉，４０ｇ，７６％）を無色粘稠性オイルとして得た。 Ｒｆ＝０．４９（シリカ，酢酸エチル）。 ¹H NMR(CDCl₃)δ：7.75(d,³J(H,H)=8.3Hz,4H,Ar);7.31(d,³J(H,H)=8.1Hz,4H,A r); 4.10(t,³J(H,H)=4.7Hz,4H,CH₂OTs);3.65-3.53(m,20H,CH₂OCH₂);2.40(s,6H,C H₃Ts)． ¹³C NMR(CDCl₃)δ：144.7,132.7,129.7,127.8(Ar);77.0,76.8,71.2,70.5,70.4 ,70.3,69.2,68.5(CH₂O);21.5(CH₃Ts)． FAB+MS(NBA/NaI):予想される正確な質量(M+Na⁺)/z 613.1753，実測値 613.174 0．１，２７−ビス−（ヒドロキシ）−５，８，１１，１４，１７，２０，２３−ヘ プタオキサヘプタドデカン（１５）の合成（図３の工程１：化合物は中間体であ 示されていない） 化合物１５：化合物２３（１４６．５ｇ，１．６３Ｍｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ）およびナトリウム（５．１ｇ，０．２２Ｍｏｌ）を不活性雰囲 気下、２０℃で撹拌し、それからナトリウムが完全に溶解するまで６５℃に加熱 した。混合物をさらに４５℃で２時間撹拌し、それからカニューレを通して化合 物１４（６０．０ｇ，０．１０２Ｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２４０ｍｌ）へ移した 。化合物２３／ナトリウム溶液は高粘度であるため、それは６５℃に保たれ、化 合物１４／ＴＨＦ溶液が０℃に冷却されている間に、６５℃で移された。 移送が完全に終了（１時間）した後、温度を０℃に３時間保ち、それから一晩 中、２０℃に保った。反応を塩化アンモニウム飽和溶液（２５０ｍｌ）で停止し た。ＴＨＦを蒸発させ、残った水層をＤＣＭ（３ ５ ２５０ｍｌ）で抽出し、 硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして乾燥状態にまで蒸発させた。 フラッシュクロマトグラフィー（シリカ，ＭｅＯＨ／酢酸エチル ０−１０％ ）後、純度の高い化合物１５（Ｃ₂₀Ｈ₄₂Ｏ₉，２５．２ｇ，５８％）を無色粘稠 性オイルとして得た。 Ｒｆ＝０．１７（シリカ，ＭｅＯＨ／ＥＡ） ¹H NMR(CDCl₃)δ：3.61-3.52(m,28H,CH₂OCH₂);3.45(t,³J(H,H)=6.0Hz,4H,CH ₂O H);1.59(_m,8H,CH ₂CH ₂CH₂OH)． ¹³C NMR(CDCl₃)δ：71.2，71.1，70.4，70.3，70.25,70.2,69.9(CH₂OCH₂); 62 .2(CH₂OH); 29.8,26.4(CH ₂CH ₂CH₂OH)． FAB+MS(NBA/NaI):予想される正確な質量(M+Na⁺)/z 449.2727，実測値 449.273 8．１−フタルイミド−２７−ヒドロキシ−５，８，１１，１４，１７，２０．２３ −ヘプタオキサヘプタドデカン（１６）の合成 化合物１６：化合物１５（２３．６ｇ，５５．３ｍＭｏｌ）、フタルアミド（ ６．３ｇ，４２．５ｍＭｏｌ）、ＰＰｈ₃（１１．２ｇ，４２．５ｍＭｏｌ）お よび無水ＴＨＦ（２９０ｍｌ、ナトリウム上で蒸留）を不活性雰囲気下、撹拌し た。ＤＥＡＤ（ジエチルアゾジカルボキシレート、７．４ｇ，４２．５ｍＭｏｌ ）無水ＴＨＦ（５０ｍｌ）中を２０℃でシリンジポンプ（８．４ｍｌ／ｈ）を用 いてゆっくりと添加した。添加が終了した後、反応混合物を２０℃で一晩中、撹 拌した。溶媒を乾燥状態にまで蒸発させ、そして残った固体を沸騰するｄＨ₂Ｏ に取った。冷却後、沈澱物を濾過し、そして水溶液を高真空下、乾燥状態にまで 蒸発させた。このようにして得られたオイルをクロマトグラフ（シリカ フラッ シュ ａ）ＤＣＭ，ｂ）ＭｅＯＨ／ＥＡ ０−１０％）にかけると、化合物１６ を無色粘稠性オイルとして与えた（Ｃ₂₈Ｈ₄₅ＮＯ₁₀，１１．６ｇ，回収された化 合物１５を基準にして９５．２％）。 Ｒｆ＝０．１（シリカ，ＭｅＯＨ／酢酸エチル２％） ¹H NMR(CDCl₃)δ：7.81(m,2H,Ar); 7.70(m,2H,Ar); 3.69(t,³J(H,H)=6.9Hz,2H ,CH₂N); 3.63-3.45(m,30H,CH₂OCH₂ and CH₂OH); 1.74-1.60(m,8H,CH ₂CH ₂CH₂O)． ¹³C NMR(CDCl₃)δ：168.4(CO); 133.9,132.1,123.1(Ar); 71.3,70.6,70.5,70. 4,70.1,70.0(CH₂OCH₂); 62.6(CH₂OH); 37.7(CH₂N); 30.2,26.9,26.6,25.3(CH ₂CH ₂ CH₂O)． FAB+MS(NBA/NaI): 556(M+H⁺)/z;予想される正確な質量(M+Na⁺)/z 578.2941， 実測値 578.2963．１−フタルイミド−２７−〔（４，４′−ビスメトキシトリチル）オキシ〕−５ ８，１１，１４．１７，２０，２３−ヘプタオキサヘプタドデカン（１７）の合 成（図３の工程ｉ；化合物１７は中間体であり、そのため示されていない） 化合物１７：化合物１６（１．４ｇ，２．５７ｍＭｏｌ）およびＤＭＴｒＣｌ （１．７４ｇ，５．１ｍＭｏｌ）をピリジン中（１０ｍｌ）、２０℃で４８時間 撹拌した。Ｅｔ₃Ｎ（１ｍｌ）を加えて、そして溶媒を乾燥状態にまで蒸発させ た。このようにして得られたオイル状残渣をＤＣＭ（２０ｍｌ）に取り、ｄＨ₂ Ｏ（２ ５ ２０ｍｌ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過 し、乾燥状態にまで蒸発させ、そして高真空下、乾燥した。フラッシュクロマト グラフィー（シリカ，酢酸エチル／ヘキサン５０−７５％）の後、化合物１７（ Ｃ₄₉Ｈ₆₃Ｏ₁₂Ｎ，１．９ｇ，８６％）を淡黄色オイルとして得た。 Ｒｆ＝０．３３（シリカ，ＥＡ）． ¹H NMR(CDCl₃)δ：7.84(_m,2H,フタルイミド); 7.71(m,2H，フタルイミド);7.4 4(d,³J(H,H)=7.2Hz,2H,Ph DMTr); 7.32(d,³J(H,H)=8.8Hz,4H,p-MeOPh DMTr);7.2 8(t,³J(H,H)=7.7Hz,2H,Ph DMTr); 7.20(t,³J(H,H)=7.1Hz,1H,Ph DMTr); 6.82(d,³ J(H,H)=8.8Hz,4H,p-MeOPh DMTr); 3.79(s,6H,CH₃O); 3.71(t,³J(H,H)=6.9Hz,2H ,CH₂N); 3.64-3.42(m,28H,CH₂OCH₂); 3.06(t,³J(H,H)=5.9Hz,2H,CH₂ODMTr); 1.8 0-1.59(m,8H,CH ₂CH ₂CH₂O)． ¹³C NMR(CDCl₃)δ：168.5(CO); 158.2,145.3,136.6,130.0,128.2,127.7,126.5 ,112.9(DMTr Ar);133.9,132.1,123.2（フタルイミド Ar）；85.8((p-MeOPh)₂PhC O);71.3,70.6,70.55,70.2,70.0(CH₂OCH₂); 63.0(CH₂ODMTr); 55.2(CH₃O); 37.7( CH₂N); 26.9,26.7,26.6,25.3(CH ₂CH ₂CH₂O)． FAB+MS(NBA/CsI):予想される正確な質量(M+Cs⁺)/z 990.3405，実測値 990.338 2．１−アミノ−２７〔（４，４′−ビスメトキシトリチル）オキシ〕−５，８，１ １，１４，１７．２０，２３−ヘプタオキサヘプタドデカンIV（図３，工程ｊ） の合成 化合物（IV）：化合物１７（１．１ｇ，２．３ｍＭｏｌ）、（ＮＨ₂）₂（０． ４ｍｌ，１２．８ｍＭｏｌ）およびエタノール（４０ｍｌ）を２時間還流した。 冷却した後、沈澱物を濾過し、そして溶媒を乾燥状態にまで蒸発させた。残った オイルをジエチルエーテルに取り、そして沈澱物を濾過し除いた。有機相を乾燥 状態にまで蒸発させると化合物IV（Ｃ₄₁Ｈ₆₁ＮＯ₁₀，０．８５ｇ，９１％）を与 えた。これをさらに精製することなく次の工程で使用した。 ¹H NMR(CDCl₃)δ：7.44(d,³J(H,H)=7.1Hz,2H,Ph DMTr); 7.32(d,³J(H,H)=8.9H z,4H,p-MeOPh DMTr);7.28(t,³J(H,H)=7.4Hz,2H,Ph DMTr); 7.20(t,³J(H,H)=7.1H z,1H,Ph DMTr); 6.82(d,³J(H,H)=8.9Hz,4H,p-MeOPh DMTr); 3.79(s,6H,CH₃O);3. 65-3.40(m,28H,CH₂OCH₂); 3.05(t,³J(H,H)=60Hz,2H,CH₂ODMTr); 2.70(t,³J(H,H) =6.5Hz,2H,CH ₂NH₂); 1.7-1.45(m,8H,CH ₂CH ₂CH₂O)． ¹³C NMR(CDCl₃)δ：158.2,145.3,136.6,130.0,128.1,127.7,126.5,112.9(Ar); 85.6((p-MeOPh)₂PhCO);71.3,71.2,70.5,70.1,70.0(CH₂OCH₂); 63.0(CH₂ODMTr);5 5.2(CH₃O);42.0(CH₂NH₂); 30.4,27.0,26.6,26.5(CH ₂CH ₂CH₂O)． FAB+MS(NBA/CsI):予想される正確な質量(M+H⁺)/z 728.4374，実測値 728.4351 ;860(M+Cs⁺)/z．２７−フタルイミド−５．８．１１，１４．１７．２０、２３−ヘプタオキサヘ プタドデカノン酸（Ｖ）（図３，工程ｍ）の合成 化合物（Ｖ）：化合物１６（８．６ｇ，１５．５ｍＭｏｌ）および二クロム酸 ピリジニウム（２９．２ｇ、７７．５ｍＭｏｌ）をＤＭＦ（１４５ｍｌ）中、不 活性雰囲気下２０℃で１２時間撹拌した。ｄＨ₂Ｏ（１５００ｍｌ）を加え、反 応媒体をＤＣＭ（４ ５ １５００ｍｌ）で抽出した。 有機層を合せ、５００ｍｌ最終体積にまで蒸発させ、硫酸マグネシウム上で乾 燥し、濾過し、そして乾燥状態にまで蒸発させた。残渣をジエチルエーテル（５ ００ｍｌ）に取り、そして不溶物質を取り除くためにＣｅｌｉｔｅ上で濾過した 。溶媒を蒸発させた後、得られたオイルをクロマトグラフ（シリカ フラッシュ ，ＭｅＯＨ／酢酸エチル０−１０％）にかけると、無色粘稠性オイルとして純度 の高い化合物Ｖ（Ｃ₂₈Ｈ₄₃ＮＯ₁₁，７．２ｇ、８２％）を与えた。 Ｒｆ＝０．４（シリカ，ＭｅＯＨ／酢酸エチル１０％）。 ¹H NMR(CDCl₃)δ：7.82(m,2H,Ar); 7.70(m,2H,Ar);3.67(t,³J(H,H)=6.9Hz,2H, CH₂N); 3.62-3.44(m,28H,CH₂OCH₂);2.41(t,³J(H,H)=7.2Hz,2H,CH ₂CO₂H);1.87(m, 2H,CH ₂CH₂CO₂H); 1.71(m,2H,NCH₂CH ₂); 1.61(m,2H,NCH₂CH₂CH ₂)． ¹³C NMR(CDCl₃)δ：176.8(CO₂H); 168.4(CO); 133.9,132.1,123.2(Ar);70.6,7 0.5,70.1(CH₂OCH₂); 37.7(CH₂N);31.0(CH₂CO₂H); 26.9(CH₂CH₂CO₂H); 25.3,24.. 8(CH ₂CH ₂CH₂N)． FAB+MS(NBA/NaI); 570(M+H⁺)/z;予想される正確な質量(M+Na⁺)/z 592.2734， 実測値 592.2748; 614(M-H⁺ 2Na⁺)/z．２７−アミノ−５，８．１１，１４，１７，２０，２３−ヘプタオキサヘプタド デカノン酸（１８）（図３，工程ｊ）の合成 化合物１８：化合物Ｖ（２．７ｇ，４．７ｍＭｏｌ）、（ＮＨ₂）₂ヒドラジン （１．５ｍｌ，４８．０ｍＭｏｌ）およびエタノール（１２０ｍｌ）を３時間還 流した。冷却した後（１時間）、沈澱物を濾過し、そして溶媒を乾燥状態にま で蒸発させた。残ったオイルを１Ｍ塩酸に取り、紙の上を濾過し、乾燥状態にま で蒸発させ、そして高真空下で乾燥した。これをＭｅＯＨ／ジエチルエーテル３ ０％に取り、濾過し、乾燥状態にまで蒸発させると、化合物１８を塩酸塩の形態 で与えた（Ｃ₂₀Ｈ₄₂ＮＯ₉Ｃｌ、２．０ｇ、８９．４％）。出発物質（Ｖ）が注 意深く精製されていないならば、この化合物は、さらにＤｏｗｅｘ ＡＧ１Ｘ８ （ＯＨ^-）上で精製しかつ１Ｍ塩酸で溶離させることができる。 ¹H NMR(D₂O)δ：3.82-3.72(m,24H,OCH₂CH₂O); 3.70-3.66(m,4H,CH₂CH₂CH ₂O); 3.15(t,³J(H,H)=6.6Hz,2H,CH ₂NH₃Cl); 2.58(t,³J(H,H)=7.4Hz,2H,CH ₂CO₂H); 2.0 3(m,2H,CH ₂CH₂CO₂H); 1.85(m,4H,ＣH ₂CH ₂CH₂NH₃Cl)． ¹³C NMR(D₂O)δ：184.2(CO₂H); 72.1,71.8,71.5,71.1(CH₂OCH₂); 41.2(CH₂NH₃ Cl); 32.5(CH₂CO₂H); 27.6(CH₂CH₂CO₂H); 26.0,25.7(CH ₂CH ₂CH₂NH₃Cl)． FAB+MS(NBA):予想される正確な質量(M-Cl^-)/z 440.2860，実測値 440.2850．２７−Ｆｍｏｃ−アミド−５，８，１１，１４，１７．２０，２３−ヘプタオキ サヘプタドデカノン酸（VI）（図３，工程ｎ）の合成 化合物１８（１．０ｇ，２．１ｍＭｏｌ）の塩酸塩および１０％炭酸ソーダ（ ７．８ｍｌ，７．４ｍＭｏｌ）をジオキサン（５．７ｍｌ）およびｄＨ₂Ｏ（７ ．４ｍｌ）中で、０℃撹拌した。ジオキサン（５．７ｍｌ）中ＦｍｏｃＣｌ（０ ．６ｇ，２．３ｍＭｏｌ）を１５分間にわたって滴下した。温度を４時間、４℃ に保ちさらに２０℃に１時間保った。０．０１Ｍ塩酸（１３５ｍｌ）を加え、そ の混合物をＤＣＭ（３ ５ ７０ｍｌ）で抽出した。 有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして減圧下、乾燥状態にま で蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル）の後、化 合物VI（Ｃ₃₅Ｈ₅₁ＮＯ₁₁，１．２ｇ，８７％）を純度の高い無色粘稠性オイルと して得た。 Ｒｆ＝０．２（シリカ，酢酸エチル）。 ¹H NMR(CDCl₃)δ：7.79(d,³J(H,H)=7.4Hz,2H,Ar); 7.63(d,³J(H,H)=7.4Hz,2H, Ar); 7.42(t,³J(H,H)=7.3Hz,2H,Ar); 7.34(t,³J(H,H)=7.4Hz,2H,Ar); 5.23(t,³J (H,H)=5.3HZ,1H,OCONH); 4.43(t,³J(H,H)=6.8Hz,2H,CH ₂OCONH); 4.24(t,³J(H,H) =6.7Hz,1H,CHCH₂OCONH); 3.70-3.45(m,28H,CH₂OCH₂); 3.26(m,2H,OCONHCH ₂); 2. 43(t,³J(H,H)=7.4Hz,2H,CH ₂CO₂H); 1.92(m,2H,CH ₂CH₂CO₂H); 1.63(m,4H,NCH₂CH ₂ CH ₂)． ¹³C NMR(CDCl₃)δ：173.9(CO₂H); 156.4(OCONH); 143.9,141.2,127.5,127.0,1 25.0,119.8(Ar); 70.8,70.5,70.0,66.2(CH₂OCH₂); 51.5(CHCH₂OCONH); 47.2(CHC H₂OCONH); 40.7(OCONHCH₂); 30.6(CH₂CO₂H); 26.7(CH₂CH₂CO₂H); 26.6,24.8(OCO NHCH₂CH ₂CH ₂)． FAB+MS(NBA/CsI):予想される正確な質量(M+Cs⁺)/z 794.2516，実測値 794.252 7．２７−Ｂｏｃ−アミド−５，８，１１，１４，１７，２０．２３−ヘプタオキサ ヘプタドデカノン酸（VII）（図３，工程ｏ）の合成 化合物１８の塩酸塩（０．８４ｇ，１．７６ｍＭｏｌ）およびＥｔ₃Ｎ（１． ０ｍｌ，７．３ｍＭｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍｌ）中、０℃不活性雰囲気下、撹拌 した。ＤＭＦ（１０ｍｌ）中Ｂｏｃ₂Ｏ（０．４６ｇ，２．１ｍＭｏｌ）を１５ 分間にわたって滴下した。温度を２０℃に上昇し、そして混合物を３時間、さら に撹拌した。ｄＨ₂Ｏ（４ｍ）を加えて、過剰のＢｏｃ₂Ｏを潰し、そして高真空 下乾燥状態にまで溶媒を蒸発させた。残ったオイルを０．０１Ｍ塩酸（２５ｍｌ ）に取り、そして酢酸エチル（３ ５ ２５ｍｌ）で抽出した。有機層を合せ、 硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、そして乾燥状態にまで蒸発させた。フ ラッシュクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル）の後、化合物VII（Ｃ₂₅Ｈ₄₉ ＮＯ₁₁，０．８ｇ，８４％）を純度の高い無色粘稠性オイルとして得た。 Ｒｆ＝０．２６（シリカ，ＭｅＯＨ／ＤＣＭ １０％）。 ¹H NMR(CDCl₃)δ：3.70-3.40(m,28H,CH₂OCH₂); 3.09(m,2H,CH ₂NHCO); 2.42(t,³ J(H,H)=7.1Hz,2H,CH ₂CO₂H); 1.88(m,2H,CH ₂CH₂CO₂H); 1.55(m,4H,CONHCH₂CH ₂CH ₂ ); 1.41(s,9H,(CH ₃)₃C)． ¹³C NMR(CDCl₃)δ：176.9(CO₂H); 156.0(OCONH); 70.8,70.5,70.4,70.0,69.9( CH₂OCH₂ and（CH₃)₃ C);40.2(OCONHCH₂); 30.8(CH₂CO₂H); 28.3(CH₃)₃C); 26.7,2 6.65(OCONHCH₂ CH₂ CH₂); 24.8(CH₂CH₂CO₂H)． FAB+MS(NBA/CsI):予想される正確な質量(M+Cs⁺)/z 672.2360，実測値 672.238 5;804(M-H⁺ +2Cs⁺)/z． FAB+MS(NBA):予想される正確な質量(M+H⁺)/z 540.3384，実測値 540.3405．図４に示される（Ｓ８）のためのＦｍｏｃ−Ａｌａ₂中間体の合成 本化合物は、Ａｔｈｅｒｔｏｎら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｏｘｆｏ ｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９，４７−５ ３頁に記載されている方法に従って合成された。 典型的な手順は下記の通りである。Ｈ₂ＮＡｌａ₂ＯＨ（５．０ｇ，３１．２ｍ Ｍｏｌ，Ｓｉｇｍａから商業的に入手できる）および１０％炭酸ナトリウム（８ ３ｍｌ，７８．０ｍＭｏｌ）をジオキサン（５５ｍｌ）およびｄＨ₂Ｏ（５７ｍ ｌ）中、０℃で撹拌した。ＦｍｏｃＣｌ（９−フルオレニルメチルクロロフォー メート）（８．５ｇ，３２．８ｍＭｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）ジオキサン（５５ｍｌ）中を３０分間にわたって滴下した。温 度を０℃に１時間、２０℃に１時間維持した。反応の経過中に現われた沈澱物は 、ｄＨ₂Ｏ（３６０ｍｌ）およびジオキサン（２１０ｍｌ）を添加し、続いて２ ０℃で１時間撹拌することによって溶解させた。 反応媒体を注意深くｐＨ２〜３に酸性化し、生成した沈澱物を濾過し、そして 液相を酢酸エチル（３ ５ ２５０ｍｌ）で抽出した。有機層を減圧下、乾燥状 態になるまで蒸発させると、白い固体を残し、これは濾過によって得られた沈澱 物と合せてそしてｄＨ₂Ｏ（２５０ｍｌ）に懸濁した。それから濾過し、ｄＨ₂ Ｏ（５００ｍｌ）で洗浄し、そして高真空下、乾燥した。このようにして得られ た固体をジエチルエーテル（２５０ｍｌ）に懸濁して濾過し、ジエチルエーテル （５００ｍｌ）で洗浄し、そして高真空下、乾燥するとＦｍｏｃＡｌａ₂（Ｃ₂₁ Ｈ₂₂Ｎ₂Ｏ₅，９．３ｇ，７７．５％）を白色固体として与えた。融点１９２℃ Ｒｆ＝０．３５（シリカ，クロロホルム／ＭｅＯＨ／ＣＨ₃ＣＯ₂Ｈ ８５／１０ ／５）． ¹H NMR(DMF,d₇)δ：8.18(d,³J(H,H)=7.3Hz,1H,OCONH);7.94(d,³J(H,H)=7.5Hz, 2H,Ar);7.77(t,³J(H,H)=7.5Hz,2H,Ar);7.53(d,³J(H,H)=7.8Hz,1H,CONH);7.44(t,³ J(H,H)=7.5Hz,2H,Ar);7.35(t,³J(H,H)=7.4Hz,2H,Ar);4.45-4.20(m,5H,CHCH ₂OCO NH,CHCH₃); 1.37;(d,³J(H,H)=7.2Hz,6H,CH₃)． ¹³C NMR(DMF d₇)δ:174.8(CO₂H);173.2(CONH);156.7(OCONH);145.0,144.9,141 .8,128.4,127.8,126.2,126.1,120.8(Ar);67.0(CH₂OCONH);51.0(CHCH₂OCONH);48. 5,47.7(CHCH₃);18.7,17.8(CH₃)． FAB+MS(NBA):予想される正確な質量(M+H⁺)/z 383.1607，実測値 383.1618．図４に示される（Ｓ８）のためのＺ−（Ｌ）Ａｌａ₂−（Ｌ）Ｔｙｒ（Ｏｔ−Ｂ ｕ）ＯＭｅ（２６）中間体の合成 化合物２６：化合物２４（２．３５ｇ，８ｍＭｏｌ：Ａｌｄｒｉｃｈから商業 的に入手できる）、化合物２５の塩酸塩（２．３ｇ，８ｍＭｏｌ；Ａｌｄｒｉｃ ｈから商業的に入手できる）およびＥｔ₃Ｎ（４．５ｍｌ，３２ｍＭｏｌ）をＤ ＭＦ（８０ｍｌ）中、０℃で撹拌した。ＨＢＴＵ（６．０ｇ，１６ｍＨＣｌ）Ｄ ＭＦ（８０ｍｌ）中を１時間にわたって滴下し、反応混合物を２０℃で３時間、 撹拌し、そして０℃で一晩中保管した。ｄＨ₂Ｏ（２０ｍｌ）を添加して、過剰 のＨＢＴＵを潰し、そして高真空下、乾燥状態になるまで溶媒を蒸発させた。こ のようにして得られた固体をクロマトグラフィー（シリカ フラッシュ，酢酸エ チル／ＤＣＭ ０−５０％）にかけると、化合物２６が白い固体として得られた （Ｃ₂₈Ｈ₃₇Ｎ₃Ｏ₇，３．７５ｇ，９１．５％）。 融点１６７℃ Ｒｆ＝０．３８（シリカ，酢酸エチル／ＤＣＭ ５０％）． ¹H NMR(CDCl₃)δ：7.34(m,5H,Ph,Z); 6.98(d,³J(H,H)=9Hz,2H,Tyr Ar); 6.89( d,³J(H,H)=8.5Hz,2H,Tyr Ar); 6.80(d,³J(H,H)=7.5Hz,1H,CONH); 6.73(d,³J(H,H )=7.5Hz,1H,CONH); 5.54(d,³J(H,H)=7.1Hz,1H,OCONH); 5.10(d,³J(H,H)=3.0Hz,2 H,CH ₂Ph Z); 4.78(m,1H,CHCH₂,Tyr); 4.49(m,1H,CHCH₃);4.26(m,1H,CHCH₃); 3.6 5(s,3H,CO₂CH₃); 3.04(d,³J(H,H)=6.1Hz,2H,CHCH ₂Tyr)，1.40-1.20(m,15H，(CH₃ )₃C and CH₃)． ¹³C NMR(CDCl₃)δ:172.1,171.7,171.5(CO₂CH₃,CONH); 156.0(OCONH); 154.5,1 36.1,130.4,129.6,128.5,128.2,128.1,124.2(Ar);78.4((CH₃)₃ C); 67.0(CH₂OCON H); 53.4,52.3,48.9(NHCHRCO); 50.5(CO₂ CH₃); 37.2(CHCH₂Tyr); 28.8((CH₃)₃C) ;18.7,18.3(CH₃CH)． FAB+MS(NBA/CsI):予想される正確な質量(M+Cs⁺)/z 660.1686，実測値 660.166 4．図４に示される（Ｓ８）のためのＨ₂Ｎ−（Ｌ）Ａｌａ₂−（Ｌ）Ｔｖｒ（Ｏｔ− Ｂｕ）ＯＭｅ（２７）中間体の合成 化合物２７：化合物２６（３．６ｇ，７ｍＭｏｌ），Ｐｄ／Ｃ １０％（０． ３６ｇ，１０重量％）をエタノール（１７５ｍｌ）中に懸濁し、５０ｐｓｉの水 素圧下に置いた。反応混合物を２０℃、３時間激しく振盪した。懸濁液をそれか らシーライト上で濾過し、そしてシーライトをＤＣＭ（２００ｍｌ）で洗浄した 。有機層を合せ、そして乾燥状態になるまで蒸発させた。化合物２７を淡黄色の オイルとして得た（Ｃ₂₀Ｈ₃₁Ｎ₃Ｏ₅，２．７ｇ、定量的収率）、そしてこれをさ らに精製することなしに次の工程で用いた。 Ｒｆ＝０．２８（シリカ，クロロホルム／ＭｅＯＨ／Ｅｔ₃Ｎ ８８／１０／ ２） ¹H NMR(CDCl₃)δ：7.70(d,³J(H,H)=6.8Hz,1H,CONH); 7.00(d,³J(H,H)=8.4Hz,2 H,Ar); 6.86(m,3H,Ar and CONH); 4.78(m,1H,CHCH₂,Tyr); 4.43(m,1H,CHCH₃);3. 67(s,3H,CO₂CH₃); 3.45(brd,1H,H₂NCHCH₃); 3.04(m,2H,CHCH ₂Tyr); 2.16(brd,2H ,NH₂); 1.40-1.15(m,15H,(CH₃)₃C and CH₃)． ¹³C NMR(CDCl₃)δ:175.5,171.9,171.85(CONH); 154.3,130.7,129.7,124.1(Ar) ;78.4((CH₃)₃ C); 53.3,52.3,48.3(NHCHRCO); 50.4(CO₂ CH₃);37.1(CHCH₂Tyr); 2 8.8((CH₃)₃C); 21.2,17.5(CH₃CH)． FAB+MS(NBA):予想される正確な質量(M+H⁺)/z 394.2342，実測値 394.2330．図４に示される（Ｓ８）のためのＺ−（Ｌ）Ａｌａ₄−（Ｌ）Ｔｖｒ（Ｏｔ−Ｂ ｕ）ＯＭｅ（２８）中間体 化合物２８：化合物２７（２．６ｇ，６．６ｍＭｏｌ）、化合物２４（１．９ ５ｇ，６．６ｍＭｏｌ）およびＥｔ₃Ｎ（３．７ｍｌ，２６．４ｍＭｏｌ）をＤ ＭＦ（６０ｍｌ）中、０℃で撹拌した。ＨＢＴＵ（４．９ｇ，１３．２ｍＭｏｌ ）ＤＭＦ（６０ｍｌ）中を１時間かけて滴下し、そして反応混合物を２０℃で３ 時間、撹拌し、そして４℃で一晩中、保管した。ｄＨ₂Ｏ（２０ｍｌ）を添加し て過剰のＨＢＴＵを潰し、そして溶媒を高真空下、乾燥状態になるまで蒸発させ た。化合物２８を沸騰するＤＣＭから白色結晶状固体として得た（Ｃ₃₄Ｈ₄₇Ｎ₅ Ｏ₉，３．８ｇ，８７％）。 分解点２３２℃ ¹H NMR(DMSO d₆)δ：8.24(d,³J(H,H)=7.4Hz,1H,CONH); 8.02(d,³J(H,H)=7.3Hz ,1H,CONH); 7.92(d,³J(H,H)=7.5Hz,1H,CONH); 7.89(d,³J(H,H)=7.7Hz,1H,CONH) ；7.49(d,³J(H,H)=7.4Hz,1H,CONH); 7.37-7.30(m,5H,Ph Z); 7.11(d,³J(H,H)=8. 5Hz,2H,Tyr Ar); 6.86(d,³J(H,H)=8.4Hz,2H,Tyr Ar); 5.02(s,2H,PhCH₂Z); 4.42 (m,1H,CHCH₂Tyr); 4.25(m,3H,CHCH₃); 4.04(m,1H,CHCH₃); 3.55(s,3H,CO₂CH₃)； 2.93(m,2H,CHCH ₂Tyr)，1.25(s,9H,(CH₃)₃C); 1.17(m,12H,CHCH ₃)． ¹³C NMR(DMSO d₆)δ:172.4,172.2,171.9,171.6(CO₂CH₃ and CONH);155.8(OCON H);153.7,137.1,131.6,129.7,128.4,127.9,127.8,123.6(Ar);77.8((CH₃)₃ C); 65 .4(CH₂OCONH); 53.7,51.8,48.1,48.0,47.8(NHCHRCO); 50.0(CO₂ CH₃); 36.0(CHCH₂ Tyr); 28.6((CH₃)₃C);18.3,18.1(CH₃CH)． FAB+MS(NBA):予想される正確な質量(M+H⁺)/z 670.3452，実測値 670.3483．図４に示される（Ｓ８）のためのＨ₂Ｎ−（Ｌ）Ａｌａ₄−（Ｌ）Ｔｙｒ（Ｏｔ− Ｂｕ）ＯＭｅ（２９）中間体の合成 化合物２９：化合物２８（３．５ｇ，５．２ｍＭｏｌ）、Ｐｄ／Ｃ １０％（ ０．３５ｇ，１０重量％）をエタノール／ＤＭＦ１／１（１７５ｍｌ）中、化合 物２８が完全に溶解する（１５−３０分）まで音波処理し、それから５０ｐｓｉ の水素圧下に置いた。懸濁液を室温で５時間激しく振盪し、シーライト上で濾過 し、それからシーライトをエタノール／ＤＭＦ１／１（１００ｍｌ）で洗浄した 。有機層を高真空下乾燥状態になるまで蒸発させた。得られた固体は、すべての 通常の有機溶媒中でゲルを形成する強い傾向がある。 純度の高い化合物２９（Ｃ₂₆Ｈ₄₁Ｎ₅Ｏ₇，２．７ｇ，定量的収率）を沸騰アセ トニトリルから黄色の泡状体として得た。 融点１９８℃ Ｒｆ＝０．１２（シリカ，アセトニトリル） ¹H NMR(DMF d₇)δ：8.29(brd,1H,CONH); 8.20(d,³J(H,H)=7.0Hz,1H,CONH); 8. 15(d,³J(H,H)=7.6Hz,1H,CONH); 7.91(d,³J(H,H)=7.5Hz,1H,CONH); 7.20(d,³J(H, H)=8.5Hz,2H,Ar); 6.93(d,³J(H,H)=8.4Hz,2H,Ar); 4.57(m,1H,CHCH₂,Tyr);4.38( m,3H,CHCH₃); 3.64(s,3H,CO₂CH₃); 3.57(m,1H,H₂NCHCH₃); 3.04(m,2H,CHCH ₂,Tyr ); 1.40-1.20(m,21H,(CH₃)₃C and CH₃)． ¹³C NMR(DMF d₇)δ:175.8,173.3,173.1,172.7,172.6(CONH and CO₂CH₃); 155. 0,132.6,130.5,124.5(Ar);78.4((CH₃)₃ C);54.8,51.2,49.6,49.5,49.2(NHCHRCO); 52.2(CO₂ CH₃);37.2(CHCH₂Tyr);29.0((CH₃)₃C);21.1,18.6,18.4,18.1(CH₃CH)． FAB+MS(NBA):予想される正確な質量(M+H⁺)/z 536.3084，実測値 536.3070．図４に示されるグルタレートー（Ｌ）Ａｌａ₄−（Ｌ）Ｔｖｒ（Ｏｔ−Ｂｕ）Ｏ Ｍｅ（Ｓ８）の合成 化合物Ｓ８：化合物２９（１ｇ，１．９ｍＭｏｌ）およびＥｔ₃Ｎ（１．０ｍ ｌ，７．６ｍＭｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍｌ）中、０℃で撹拌した。無水グルタ ル酸（０．２３ｇ，１．９ｍＭｏｌ）ＤＭＦ（５０ｍｌ）中を、４５分間かけて 滴下した。その後で温度を２０℃（３時間）に上昇した。反応媒体を４℃で一晩 中、保管した。高真空下、溶媒を乾燥状態になるまで蒸発させ、そして得られた 固体を０．１Ｍ塩酸（５０ｍｌ）に懸濁し、そして音波処理（１０分間）した。 白色沈澱物を濾過し、０．１Ｍ塩酸、ｄＨ₂Ｏ、ＤＭＦ、ｄＨ₂Ｏおよびエタノー ル（各１００ｍｌ）で洗浄し、そして高真空下乾燥すると、Ｓ８を白色粉末（Ｃ₃₁ Ｈ₄₇Ｎ₅Ｏ₁₀，０．９６ｇ，７８％）として与えた。融点２６３℃ ¹H NMR(DMSO d₆)δ：8.22(d,³J(H,H)=7.4Hz,1H,CONH); 8.04(d,³J(H,H)=6.6Hz ,1H,CONH); 8.02(d,³J(H,H)=6.7Hz,1H,CONH); 7.88(d,³J(H,H)=6.7Hz,1H,CONH); 7.86(d,³J(H,H)=7.1Hz,1H,CONH); 7.10(d,³J(H,H)=8.4Hz,2H,Ar); 6.86(d,³J(H ,H)=8.4Hz,2H,Ar); 4.41(m,1H,CHCH₂Tyr); 4.22(m,4H,CHCH₃); 3.54(s,3H,CO₂CH₃ ); 2.92(m,2H,CHCH ₂Tyr)，2.19(t,³J(H,H)=7.4Hz,2H,CH ₂CO₂H); 2.13(t,³J(H,H )=7.4Hz,2H,CH₂CONH);1.68(m,2H,HO₂CCH₂CH ₂); 1.25(s,9H,(CH₃)₃C); 1.22-1.10 (m,12H,CH₃)． ¹³C NMR(DMF d₇)δ:174.9,174.3,173.7,173.6,173.0,172.7,172.65(CONH,CO₂H ,CO₂CH₃);155.0,132.7,130.6,124.5(Ar); 78.6((CH₃)₃ C); 54.8,50.6,50.4,49.8 ,49.4(NHCHRCO); 52.2(CO₂ CH₃);37.3(CHCH₂Tyr);35.1,33.8(HO₂CCH₂CH₂ CH₂CONH) ; 29.0((CH₃)₃C);21.5,18.2,17.8,18.7(HO₂CCH₂ CH₂,CHCH₃)． FAB+MS(NBA/CsI):予想される正確な質量(M+Cs⁺)/z 782.2377，実測値 782.239 7; 914(M-H⁺ +2Cs⁺)/z．コードされた反応カセットの初期の実施の形態 マトリックス： この技術を実施するための初期の試みで、本発明者らは種々な問題に遭遇した 。第１に、ＣＰＧ（細孔のサイズをそろえたガラス）のようなある種のマトリッ クス材料は、不安定であった。そしてポリヌクレオチド−基質混成物を遊離し、 望まない背景反応をもたらした。本発明者らは、固体支持体と第１のリンカーと の間の結合がこの問題を引き起こすと推定した。不安定性の問題に加えて、ＣＰ Ｇはポリヌクレオチド合成（２５）の間にポリヌクレオチド鎖が上でのばせる自 由な水酸基を有しており、これが望ましくない不安定な結合に導いた。第２の困 難 はカセットの酵素的開裂が、マトリックスおよび／又はポリヌクレオチドによる 基質の立体障害のために遅く、不完全（データを示さず）であるということであ った。この理由から、本発明者らは、固体支持体と基質の間および／または基質 とポリヌクレオチドの間のいずれかのリンカーの長さを延ばさざるを得なかった 。本目的のためには、ＴｅｎｔａＧｅｌがより良い機械的および化学的性質を有 することが分かった。さらに、それは障害の問題を弱める長いポリオキシエチレ ンアームを持つ。最後に、合成はカセットが短時間に容易に合成できるように簡 単でなければならなかった。これらすべての考慮は、図式１に示す戦略を導びい た。 【図式１】 ＴｅｎｔａＧｅｌはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）とＰＳ（ポリスチレン ）のテンタクル共重合体である。それは、固相ペプチド合成で成功裏に用いられ てきた。例えば、Ｂ．Ｇ．ｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅ，Ｂ．Ｇ．ら Ｔｅｔｒａｈ ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９４：３５巻，２７３３−２７３６頁；Ｊ．Ｈａｒ ａｌａｍｂｉｄｉｓら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９８７）；２ ６巻，５１９９−５２０２頁；Ｇ．Ｂａｒａｎｙら Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏ ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｗｅｌｆｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐ ｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（第１２回アメリカンペプチドシンポジウム会報 ）（１９９２）：Ｅｓｃｏｎ，Ｌｅｉｄｅｎ，６０４頁を参照。それは固相ＤＮ Ａ合成に成功裏に用いられてきた。例えば、Ｈ．Ｇａｏら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ ｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９１）：３２巻，５４７７−５４８０頁およびＰ．Ｗｒ ｉｇｈｔら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９３）；３４巻，３３ ７３−３３７６頁を参照。ＴｅｎｔａＧｅｌは、また生物触媒と適合性があるこ とも示された。例えば、Ｌ．Ｍｅｌｄａｌら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅ ｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９４），１８４９頁を参照。 それは極端なｐＨにも安定であり、種々の溶媒中で用いることができる。普通 のすべての溶媒中での高い膨潤性（４−７倍）は、生物触媒を含む反応にそれを 使用するのに興味があるものとする付加的な特徴である。このポリマーは、オリ ゴヌクレオチド合成のための可溶性支持体として使用されてきたポリエチレング リコールと同じ移動度および動特性を持つ。例えば、Ｅ．Ｂａｙｅｒ，Ａｎｇｅ ｗ，Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９１）：３２巻，５４７７ 〜５４８０頁を参照。それは高い拡散係数、収着および機械的安定性を有する。 官能基が完全に溶媒和されているので（上記参照）、反応速度は溶液中にあるの と同程度である。樹脂のポリエチレングリコール部（７０−８０重量％）が物理 化学的な挙動を支配するので、その上に成長した基質−ポリヌクレオチド混成物 は、有機又は水性溶液に可溶化されるであろう。最後に、このマトリックスは異 った官能基（ＯＨ、ＮＨ₂、ＳＨ、ＣＯ₂Ｈ、ＣＨＯ、Ｂｒ）を持つものとして商 業的に入手でき、これは異なった型の基質の導入を容易にする。カセットの基質部の合成 本発明のカセット法を研究するために選ばれた触媒は、化学的、物理的によく 定義されていなければならなかった。α−キモトリプシンは、この目的のために 理想的な酵素と考えられた。カセットの基質部は、α−キモトリプシンに対して 最良の基質であることが知られているＬ−Ａｌａ₂−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−Ａｌａ₂で あった。例えば、Ｗ．Ｋ．Ｂａｕｍａｎｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（ １９７３）：３９巻，３８１−３９１を参照。この基質の選択は、これら初期の 研究に於ける本発明者らの目標は系の感度の下限を探すことであったという事実 に基づいてなされたものであった。 ＴｅｎｔａＧｅｌマトリックスは、カセット基質の直接取り付けを許す末端官 能基を持つ延びたポリエチレングリコールアームを備えているので、固体支持体 と基質の間にスペーサーを導入する必要はなかった（図式１）。マトリックスの ローディングは約２８０ｍｍｏｌｅ／ｇである。障害のある部位の発生を避ける ために、合成の第１段階で大過剰のマトリックスを加え、そして未反応基をキャ ップすることにより最もむき出しにされたもののみを官能基化した（４０−６０ ｍｍｏｌ／ｇ）。 基質とＤＮＡタッグの間の間隔がカセットの非常に重要な設計特徴であると本 発明者らは予想した。そこで４つの異なったリンカーを合成した（図１５）、リ ンカーＬ−Ｉは、ゆっくりとＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル） 保護基を失い、純粋な化合物から分離するのが実用的でない副生成物の生成を誘 起する。 そこで、ＣＢＺ（ベンジルオキシカルボニル）保護基を持つより安定な誘導体 Ｌ−IIを合成した。残念ながら、Ｌ−ＩおよびＬ−IIの両方のアセトキシ基は、 基質の脱保護基反応に要求される強酸性条件下（ＣＦ₃ＣＯ₂Ｈ／エタンジチオー ル９５％，２時間）、不安定であることが見い出された。従って、不安定なアセ トキシ基を持たない、より長いＬ−Ｉ、Ｌ−IIIを合成することが好ましい。し かしながら、Ｌ−IIIは樹脂上のペプチドと効率よくカップリングしなかった。 その代り、自由なアミノ基（マトリックス−ペプチド）はリンカーのＦｍｏｃと 非可逆的に反応した。例えば、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ． Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．（１９９０）Ｌ ３５巻，１６１−２１４を参照。 従って、これらの結果はＬ−IVが好適な連結剤であることを教示する。ここに 報告されたすべてのデータは、この連結剤を備えるカセットを採用する。上記の ３つの連結剤のみが今まで試験されたので、末だ試されていない他の付属の連結 剤がより優れているという可能性もある。 代表的な基質として選択されたペプチド配列は、チロシン−Ｏ−ｔ−Ｂｕにお いてトリフルオロ酢酸／エタンジチオール９５％、２時間との脱保護基反応を必 要とする。 ポリヌクレオチド合成の後でこの脱保護基反応を実施することができないので （強酸はポリヌクレオチド上多くの副反応をもたらす）、チロシンの保護基をｔ −Ｂｕから、ＤＮＡの脱保護基反応と同時に取り除くことができる塩基に不安定 な保護基に変更する必要があった。図式２に保護基の交換並びにリンカーの導入 に用いられた経路を例示する。本発明の実験に於ける用途とは別に、この系が種 々な基質と適合できるように、容易に変換され、そして化学的に修正されうるこ とをこの合成は示す。 【図式２】 カセットのポリヌクレオチド部の合成 ポリヌクレオチド配列を図１６に示す。それは２つのプライマーと基質を確認 する１つのコード配列を有し、この場合基質は各々のアミノ酸が恣意的にトリプ レットヌクレオチド配列を割当てられたペンタペプチドである。自明のことなが ら、基質の性質をコードするのにいかなるヌクレオチド配列を用いてもよく、そ してコードの性質の選択は試験基質の数と複雑さに依存するであろう。 ３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＤＮＡ合成機で、ＣＰＧ固体 支持体を用いる標準的なホスホラミダイト法は、ＴｅｎｔａＧｅｌマトリックス では効率がよくなかった。例えば、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編（１９９０）Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｂｌｅ Ａ ｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。 段階あたりの収率は〜９８％から〜８５％に落ちた。４５段階の後では、ＣＰ Ｇでの全収率は〜４０％、そしてＴｅｎｔａＧｅｌではわずか〜０．０７％であ った。古典的な方法の修正が要求された。数多くの試みの後、方法の３つの主な 修正（材料および方法の項を参照）が段階あたりの収率を〜８５％から〜９７％ （これは全収率に於いて〜０．０７％から〜２５％への増加に対応する）へ増加 することが見い出された。このようにして得られたペプチドをコードするポリヌ クレオチドは、ポリヌクレオチドおよびペプチドを脱保護基化するために濃アン モニアに晒され、続いてジメトキシトリチル保護基を取り除くために、３％ジク ロロメタン−トリクロロ酢酸処理に供された。反応特異性 カセットは酵素開裂に供され、そして遊離されたポリヌクレオチドのＰＣＲに よる増幅の後での結果は、図１７に示されている。 トリプシン、ペプシン、パパイン、カルボキシペプチダーゼＡ、プロテイナー ゼＫ、α−キモトリプシン、α−キモトリプシン＋Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ（ボ ーマン−バーク）阻害剤、および酵素なしを用いての２０℃、３０分間のインキ ュベート後の結果をレーン１−８が示す。例えば、Ｙ．Ｂｉｒｋ，Ｙ．Ｉｎｔ． Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．（１９８５）：第２５巻，１１ ３−１３１頁を参照。レーン９は正のコントロール、レーン１０は負のコントロ ールに対応する。 レーン６のデータは、α−キモトリプシンの存在下、４５ヌクレオチドに対応 するバンドが存在することを示し、これはこの酵素による基質の最終的な開裂を 示唆する。さらに、この解釈はコントロール実験によっても支持される。カセッ トがトリプシン、ペプシン、パパイン、又はカルボキシペプチダーゼＡとともに インキュベートされた時、バンドがアガロースゲル上に検出されなかった。これ は、これらの酵素の特異性と一致している。Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤がα −キモトリプシン（レーン７）に添加された時、開裂が検出されなかった。予期 されたように、プロティナーゼＫの存在下、バンドが検出され、これはこの酵素 による最終的な開裂を示唆する。バンドの強度は、プロティナーゼＫによる開裂 がα−キモトリプシンによって達成される開裂よりも弱いことを示す。この結果 は、α−キモトリプシンが本研究に用いた基質に対して特異的である事実と一致 する。いかなる酵素も存在しない場合（レーン８）、３０分後でも開裂が検出さ れない。 本研究に用いた反応条件下、α−キモトリプシンの１ｐｍｏｌｅの酵素活性が 容易に検出された。本実験に用いた基質濃度（２９．５ｍＭ）はかなり飽和状態 （３２）以下であったので、検出の感度を改善することができるはずである。さ らに、基質とポリヌクレオチドの間にあるより長いリンカーは酵素の基質に対す る接近し易さを増すことを予備的な実験が示した（データは示さず）。 アガロースゲル上でＰＣＲ生成物を分析するのは、触媒のライブラリーがスク リーンされる場合には、骨がおれる仕事になりうるが、その代りに反応混合物に 単にＤＮＡに挿入（インターカレーション）されると蛍光の増強を起こす蛍光プ ローブを加えることができる。図１７の差し込みは、ＹＯＹＯ−１の存在ととも に、反応媒質の紫外線光（２５４ｎｍ）下で取られた写真を示す。第１のウェル はレーン６の実験に、第２のウェルはレーン８の実験に、そして第３のウェルは 、いかなる添加物も加えない緩衝液中でのプローブに対応する。最大の蛍光の増 強は、増幅されたＤＮＡを含む第１のウェルにある。第２のウェルは、プローブ とプライマーとの相互作用の結果として生じる背景蛍光を示す。予期されたよう に、 第３のウェルは検出できるいかなる蛍光をも示さない。ＹＯＹＯ−１プローブの 別の利点は、ＰＣＲ生成物の量（直接的に酵素開裂の効率に関連があるべきであ る）が定量化できることである。例えば、Ｍ．Ｏｇｕｒａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｉｑｕｅｓ（１９９４）：１６巻，１０３２−１０３３頁を参照。反応感度 α−キモトリプシンが存在しなければ、２４時間後ＤＮＡ４５ｍｅｒに対応す るバンドが検出されたことに興味深く気が付いた（データは示さず）。この背景 反応は、固体支持体とポリヌクレオチドの第１の塩基との間のどこかでの結合の 加溶媒分解か、あるいは単にマトリックスからの漏れによるであろう。開裂部位 （単数または複数）を定義する試みとして、基質単位を欠く同一のカセット（ポ リヌクレオチドが直接、混成ホスホジエステル結合を介してマトリックスに結合 されている）を合成した。このマトリックスと標準カセットが別々に、酵素なし でインキュベートされた時、１６時間の後、背景反応を検出できる。この触媒さ れていない反応の検出し易さは、２９時間および５１時間の間に増加する。 もしこの触媒されていない反応がマトリックスからの漏れ又はホスホジエステ ル結合の加溶媒分解反応から生じたならば、カセットが基質単位を含んでいたか どうかに関わらず４５ｍｅｒＤＮＡが同時に検出されたであろう。１６時間後の 検出可能な開裂がペプチド基質を含むカセットに限定されているという事実は、 結合の加溶媒分解が基質の配列で、最もありそうにはペプチド結合で起こること を示唆している。ペプチド結合の背景反応開裂が観察される時すなわち１６時間 後、ホスホジエステル結合の加溶媒分解は検出されない。しかしながら、２９時 間後までには、ホスホジエステル結合の加溶媒分解が検出される。 ペプチド結合の加水分解の速度定数が〜３×１０^-9Ｓ^-1（ｔ_1/2〜７年）と仮 定すると、２９．５ｍＭのカセット濃度でペプチド結合の加水分解の速度は、〜 ９×１０^-14 Ｍ／ｓとなる。例えば、Ｄ．Ｋａｈｎ及びＷ．Ｃ．Ｓｔｉｌｌ，Ｊ ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８８）：１１０巻，７５２９−７５３４頁を 参照。１５時間後、溶液中に〜５ｎｍｏｌｅの遊離ポリヌクレオチドがあること を予測するであろう。この量はＰＣＲで容易に検出可能であることが知られてい る。ホスホジエステル結合の加水分解の速度定数（５．７×１０^-14 ｓ^-1）は、 ペプ チド結合の加水分解の定数よりも非常に遅いので、基質単位を欠くカセットの背 景反応は長いインキュベーション時間の後でのみ検出されるであろう。例えば、 Ｅ．Ｈ．Ｓｅｒｐｅｒｓｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８７）：２６巻 ，１２８９−１３００頁を参照。コードされたカセット系の実用性 カセット系が再現性よく働き、そして全カセットが通常の合成化学を用いて４ ８時間以内に組み立てることができることを開示した。本方法の簡便さおよび融 通性の理由から、多数の可能性ある触媒の分析が４時間以内で実施できる。現在 の検出限界は約〜１ｐｍｏｌｅであるが、この系の感度および効率は容易に改善 されうる。これらの改善は、基質の濃度を増加するか、および／または固体支持 体上のローディングを増加するか、および／または基質とポリヌクレオチドの間 により長いリンカーを導入するかのいずれかによって達成されるかもしれない。 この系は結合の開裂又は形成が最初の出来事である変換反応に限定されない。 ただ１つの要求は化学的変換が結合を他の試薬に対して不安定にするということ である。例えば、ジハイドロキシレーション触媒の探索に於いて、オレフィンを 基質として用いることができる。何故ならば、それがジヒドロキシル化された時 、過ヨウ素酸塩によって選択的に開裂されうるからである。さらに、カセットが 既知の酵素の基質となるように変換反応がカセットを修飾する系を想像すること ができる。例えば、Ｋ．Ｍｏｒｉｋａｗａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（ １９９３）：１１５巻，８４６３−６４頁を参照。 最後に、未だ最適化されていないＰＣＲ条件を使用してさえ、何年もの半減期 を持つ触媒されていない化学反応を数時間で検出できることがここで実証された 。実質的にいかなる触媒的結合開裂又は形成の事象も原理的には非常に短時間で 容易に検出できることをこれは証明する。本方法は、酵素が劣るためか、又は、 より重要に、触媒が大きいライブラリーのほんの一員であり、そしてそのため低 濃度で存在するためか、のいずれかの理由から低効率である事象の検出に応用可 能であるべきである。材料および方法 化学薬品は、ペプチド合成について、ＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍおよびＡｌｄｒ ｉｃｈから、ＤＮＡ合成について、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから、そしてＰＣＲ実験 について、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。ＹＯＹＯ−１プローブは、Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．（モレキュラー プローブス インク．）か ら購入した。溶媒は、ＦｉｓｈｅｒまたはＢａｘｔｅｒから購入した（水含量が ０．００１％末満）。リンカーの合成のための化学薬品は、Ａｌｄｒｉｃｈから 購入し、そしてさらに精製することなく使用した。基質合成 ＴｅｎｔａＧｅｌは、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ又はＲａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒ ｅ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から商業的に入手できる。ペプチドは標準的Ｆｍｏｃ方法 に従って組み立てた。例えば、Ａ．ＡｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａ ｒｄ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｓｉｓ：Ａ Ｐｒ ａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８９）：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒ ｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照。典型的な手順では、３等量のアミド結合形成用の カップリング試薬、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３ ，３テトラメチルウロニウム ヘキサフルオローホスフェート（ＨＢＴＵ）、３ 等量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、６等量のＮ，Ｎ−ジイ ソプロピル−エチルアミン（ＤＩＥＡ）および３等量のＮ−α（９−フルオレニ ルメトキシカルボニル）−アミノ酸（Ｆｍｏｃ−ａａ）（ジメチルアセトアミド 中）をジクロロメタン（ＤＣＭ）中で膨潤した樹脂に加える。Ｋａｉｓｅｒ試験 で判定するとカップリング反応は１時間以内で完結する。例えば、Ｅ．Ｋａｉｓ ｅｒら，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７０）：３４巻，５９５頁およ びＶ．Ｋ．Ｓａｒｉｎら，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８１）：１１ ７巻，１４７を参照。各段階の後で、樹脂をＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド、 メタノールおよびＤＣＭで洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基は、Ｎ，Ｎ−ジメチルフオ ルムアミド中、２０％ピペリジン（２×１０分）と処理することによって除去さ れた。各段階の収量は、少量の試料からのＦｍｏｃ基の滴定によって決定された 。例えば、Ａ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ａ．＆Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ． ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａ ｃｔｉｃａｂｌｅ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８９）：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉ ｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１０７頁を参照。４０−６０ｍｍｏｌｅ／ｇの最終ローディ ングを得るために、合成の最初の段階は、Ｆｍｏｃ−ａａに対して固体支持体の ４倍過剰で実施した。すべての最終洗浄の後、未反応のアミノ基をキャップした （０．２５体積の無水酢酸４．２３Ｍ，２，６−ルチジン中；０．７５体積のＮ ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン０．５３Ｍ，ＴＨＦ中；２×１０分）。ペプチド 合成の全収率は〜９８％であった。 チロシン上の水酸基のためのｔ−ブチル保護基は、トリフルオロ酢酸／エタン ジオール９５％と２時間処理し、続いてＤＣＭＮメタノールおよびＮ，Ｎ−ジメ チルフォルムアミドで多量に洗浄することにより除去された。Ｆｍｏｃ保護基は リンカーにカップリングする前に除去された（図式IIを参照）。チロシン−Ｏ− Ｌ−IVを含むマトリックスは、フェノール環の選択的脱保護基化（濃アンモニア ３時間）およびキャッピング（０．２５体積の無水酢酸４．２３Ｍ，２，６−ル チジン中；０．７５体積のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン０．５３Ｍ，ＴＨＦ 中，３０分間）の後でチロシン−Ｏ−アセチルに変換された。各工程後の収量は 、ジメトキシトリチル陽イオンアッセイによって決定した。例えば、Ｍ．Ｊ．Ｇ ａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃ ｔｉｃａｂｌｅ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９０）：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒ ｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，４８頁を参照。 リンカーＬ−IVは、ピリジン中、４−ヒドロキシブチレートのナトリウム塩お よびジメトキシトリチルクロライドから一段階で合成された。例えば、Ｈ．Ｓｃ ｈａｌｌｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６３）：８５巻，３８２ １−３８２７頁を参照。ＤＮＡ合成 ＤＮＡ合成は、３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＤＮＡ合成機 で実施された。標準的な１ｍｍｏｌｅサイクルを以下のように修正した。すなわ ち、１）すべての洗浄段階３、５９、６１、６６、７７および９４を３０秒に延 長した。より長いか、より短かい時間を用いると収量を減少させた。２）ホスホ ラミダイトおよびテトラゾールとのインキュベーション時間（段階４５）を２５ 秒から１２０秒に延長した。３）ホスホラミダイトの濃度を０．１Ｍから０．２ Ｍに増加した。塩基は、５５℃で２０時間、濃アンモニアで処理することにより 脱保護基化された。ジメトキシトリチル基はＤＣＭ中、３％トリクロロ酢酸と処 理し（５分間）、続いてＤＣＭ、テトラヒドロフラン、メタノール、トリス−塩 酸緩衝液（２０ｍｍｏｌｅ，ｐＨ８，ＮａＣｌ １６０ｍｍｏｌｅ）、そしてｄ Ｈ₂Ｏ（脱イオン水）で多量に洗浄することによって除去した。この工程の後、 カセットはそのまま使用可能である。酵素的開裂および阻害実験 カセット（１ｍｇ，５．９ｍｍｏｌｅ／ｇ）を２０ｍｌトリス−塩酸緩衝液（ ２０ｍｍｏｌｅ，ｐＨ８，ＮａＣｌ １６０ｍｍｏｌｅ）および１７０ｍｌ ｄ Ｈ₂Ｏに懸濁した。０．８５ｎｍｏｌｅのトリプシン、ペプシン、パパイン、カ ルボキシペプチダーゼＡ、α−キモトリプシン、又はα−キモトリプシン＋１ｍ ｇ Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤（１９）（すべて１０ｍｌ ｄＨ₂Ｏ中）を 、反応媒質に加え、そして混合物を２０℃で振盪した。３０分後、上澄み液（１ ８．７ｍｌ）を取り出し、ＰＣＲ試験に供した。ＰＣＲ実験 反応混合物からのアリコート（１８．７ｍｌ）をＰＣＲ成分（ＭｇＣｌ₂２． ５ｍｍｏｌ，１．２ｍｌ；Ｔａｑ緩衝液２ｍｌ；デオキシヌクレオチドトリフォ スフェート２．５ｍｍｏｌｅ １．６ｍｌ；プライマー１００ｐｍｏｌｅ／ｍｌ １ｍｌ）と混合した。Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ，０．５ｍｌ）を第１Ｐ ＣＲサイクルを開始するほんの少し前に添加した。正のコントロール（ＰＣＲ成 分のみ）は、本研究に用いたポリヌクレオチド配列の１ｐｍｏｌｅを含むｄＨ₂ Ｏで行った。負のコントロールは、同一条件下、ポリヌクレオチド配列なしで行 った。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ ９６００装置で次のサ イクルプログラム（変性反応９４℃，３０秒；アニーリング５５℃，３０秒；エ クステンション７２℃，３０秒）を用いて行った。３５サイクルの後、結果をア ガロースゲル（１％Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，２％Ｎｕ Ｓｉｅｖｅ ＧＴＧ，ＴＢ ＥＩＸ，１０３ｍＶ）上で分析した。蛍光アッセイ ＰＣＲの後、反応上澄み液（２５ｍｌ）を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに 移し、そしてｄＨ₂Ｏ（１７５ｍｌ）およびメタノール（５０ｍｌ）で２５０ｍ ｌに希釈した。プローブ（１ｍｌ，ＹＯＹＯ−１）をこの媒質に加え、そして結 果を紫外光（２５４ｎｍ）の下で分析した。触媒されていない反応 基質ユニットを欠くカセットを以下のようにして合成した。 ヒドロキシ官能基を有するＴｅｎｔａＧｅｌ（１ｇ）をピリジン（４ｍｌ）中 、室温で３日間、ジメトキシトリチルクロライド（１０等量，８５ｍｇ）と振盪 した。ジメトキシトリチル基の滴定は、３２ｍｍｏｌｅ／ｇのローディングを示 した。未反応ヒドロキシル基をアセチル化した（０．２５体積の無水酢酸４．２ ３Ｍ，２，６−ルチジン中；０．７５体積のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン０ ．５３Ｍ，ＴＨＦ中，３０分間）。前記の方法に従って、このマトリックス上で ＤＮＡ合成を実施した。 基質を欠くカセット（０．５ｍｇ，１２．２ｍｍｏｌｅ／ｇ）および基質単位 を備えるカセット（１ｍｇ，６．２ｍｍｏｌｅ／ｇ）を２０ｍｌトリス−塩酸緩 衝液（２０ｍｍｏｌｅ，ｐＨ８，ＮａＣｌ １６０ｍｍｏｌｅ）および１８０ｍ ｌｄＨ₂Ｏ中に別々に懸濁した。混合物を２０℃で振盪し、そして２時間後、１ ６時間後、２９時間後、および５１時間後に取ったアリコート（１８．７ｍｌ） をＰＣＲ試験に供した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ラーナー，リチャード，エー. アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ラ ホヤ イースト ローズランド ドライヴ 7750

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 固相マトリックス； 前記固相マトリックスに共有結合され、開裂反応による開裂に対して感受性の ある基質；および 前記基質に結合され、第１のＰＣＲプライマー配列と、コード配列と、第２の ＰＣＲプライマー配列とを含む第１のポリヌクレオチドであって、該コード配列 は前記第１のＰＣＲ配列と前記第２のＰＣＲ配列との間に配置されている第１の ポリヌクレオチド； を含んでなることを特徴とする、開裂反応をアッセイするためのコードされた 反応カセット。 ２． 前記固相マトリックスを前記基質に共有結合する第１のリンカーおよ び前記基質を前記第１のポリヌクレオチドに共有結合する第２のリンカーをさら に含んでなることを特徴とする請求項１に記載のコードされた反応カセット。 ３． 前記基質がポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のコ ードされた反応カセット。 ４． 前記固相マトリックスを前記基質に共有結合する第１のリンカーおよ び前記基質を前記第１のポリヌクレオチドに共有結合する第２のリンカーをさら に含んでなり、そして前記基質がポリペプチドであることを特徴とする請求項１ に記載のコード化された反応カセット。 ５． 前記基質に結合され、前記第１のＰＣＲプライマー配列と、前記コー ド配列と、前記第２のＰＣＲプライマー配列とを含む、第２のポリヌクレオチド をさらに含んでなることを特徴とする請求項１に記載のコードされた反応カセッ ト。 ６． 前記基質を前記第２のポリヌクレオチドに共有結合する第３のリンカ ーをさらに含んでなることを特徴とする請求項２に記載のコードされた反応カセ ット。 ７． 前記基質がプロテアーゼによるタンパク質分解性開裂に対して感受性 を有するポリペプチドであり、そして前記コード配列が該ポリペプチドをコード することを特徴とする請求項１に記載のコードされた反応カセット。 ８． 固相開裂生成物および該固相開裂生成物とともに混合物を形成する可 溶相開裂生成物を含んでなり、 前記固相開裂生成物は、固相マトリックスと、固相マトリックスに共有結合さ れた基質の第１の開裂生成物とを含み、 前記可溶相開裂生成物は、第１のポリヌクレオチドに共有結合された基質の第 ２の開裂生成物を含み、該第１のポリヌクレオチドは第１のＰＣＲプライマー配 列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含み、該コード配列は、 前記第１のＰＣＲ配列と前記第２のＰＣＲ配列とを分離している、 ことを特徴とする、コードされた反応カセットからの開裂生成物の混合物。 ９． 前記固相マトリックスを前記第１の開裂生成物に共有結合する第１の リンカーを含む前記固相開裂生成物、および前記第２の開裂生成物を前記第１の ポリヌクレオチドに共有結合する第２のリンカーを含む前記可溶相開裂生成物を さらに含んでなることを特徴とする請求項８に記載のコードされた反応カセット からの開裂生成物の混合物。 １０． 前記第１および第２の開裂生成物が部分ポリペプチドであることを 特徴とする請求項８に記載のコードされた反応カセットからの開裂生成物の混合 物。 １１． 前記固相マトリックスを前記第１の開裂生成物に共有結合する第１ のリンカーを含む前記固相開裂生成物および前記第２の開裂生成物を前記第１の ポリヌクレオチドに共有結合する第２のリンカーを含む前記可溶相開裂生成物を さらに含んでなり、そして前記第１および第２の開裂生成物がポリペプチドの断 片であることを特徴とする請求項８に記載のコードされた反応カセットからの開 裂生成物の混合物。 １２． 前記基質の第２の開裂生成物に結合され、前記第１のＰＣＲプライ マー配列と、前記コード配列と、前記第２のＰＣＲプライマー配列とを含む、第 ２のポリヌクレオチドをさらに含んでなることを特徴とする請求項８に記載のコ ードされた反応カセットからの開裂生成物の混合物。 １３． 前記第２の開裂生成物を前記第２のポリヌクレオチドに共有結合す る第３のリンカーをさらに含んでなることを特徴とする請求項８に記載のコード された反応カセットからの開裂生成物の混合物。 １４． 工程Ａ：試料と、開裂生成物の混合物を生成するためのコードされ た反応カセットとを混合すること、ここで前記開裂生成物の混合物は、潜在的に 、固相マトリックスと、固相マトリックスに共有結合された基質の第１の開裂生 成物とを含む固相開裂生成物；第１のポリヌクレオチドに共有結合された基質の 第２の開裂生成物を含み、該第１のポリヌクレオチドは、第１のＰＣＲプライマ ー配列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含み、該コード配列 は、前記第１のＰＣＲ配列と前記第２のＰＣＲ配列とを分離している、可溶相開 裂生成物；および開裂されていないコードされた反応カセット；を含む、 工程Ｂ：固相開裂生成物および開裂されていないコードされた反応カセットか ら可溶相開裂生成物を分離かつ単離すること、 工程Ｃ：前記工程Ｂにおいて、分離かつ単離された可溶相開裂生成物のポリヌ クレオチドのコード配列をＰＣＲを用いて増幅すること、それから 工程Ｄ：前記工程Ｃにおいて増幅されたコード配列を検出すること、 以上の工程を含んでなることを特徴とする、試料内の開裂剤を検出するための 方法。 １５．前記工程Ｄの後で、前記工程Ｄでの増幅されたコード配列の検出を、 開裂剤の存在と関連づける工程Ｅをさらに含んでなることを特徴とする請求項１ ４に記載の試料内の開裂剤を検出するための方法。 ２０．前記開裂剤がプロテアーゼであり、そして前記工程Ａにおいて、コー ドされた反応カセット内に含まれた基質がプロテアーゼによる開裂に対して感受 性のあるポリペプチドであることを特徴とする請求項１８に記載の試料内の開裂 剤を検出するための方法。 ２１．固相連結反応成分および該固相連結反応成分とともに混合物を形成す る可溶相連結反応成分を含んでなり、前記固相連結反応成分は、固相マトリック スと、該固相マトリックスに共有結合された第１の連結反応用反応体とを含み、 前記可溶相連結反応成分は、第１のポリヌクレオチドに共有結合された第２の連 結反応用反応体を含み、該第１のポリヌクレオチドは、第１のＰＣＲプライマー 配列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含み、該コード配列は 、前記第１のＰＣＲ配列と前記第２のＰＣＲ配列との間に配置され、さらに前記 第１と第２の連結反応用反応体は、前記固相連結反応成分を前記可溶相連結反応 成分に結合させ、そしてコードされた連結反応カセットを形成するように連結可 能であることを特徴とする、連結反応をアッセイするためのコードされた連結反 応カセットを製造する連結されていない反応体の混合物。 ２２． 前記固相マトリックスを前記第１の連結反応用反応体に共有結合す る第１のリンカーを含む前記固相連結反応成分、および前記第２の連結反応用反 応体を前記第１のポリヌクレオチドに共有結合する第２のリンカーを含む前記可 溶相連結反応成分をさらに含んでなることを特徴とする請求項２１に記載の連結 反応成分の混合物。 ２３． 前記第１および第２の連結反応用反応体が連結可能なオリゴヌクレ オチドの断片であることを特徴とする請求項２１に記載の連結反応成分の混合物 。 ２４． 前記固相マトリックスを前記第１の連結反応用反応体に共有結合す る第１のリンカーを含む前記固相連結反応成分、および前記第２の連結反応用反 応体を前記第１のポリヌクレオチドに共有結合する第２のリンカーを含む前記可 溶相連結反応成分をさらに含んでなり、そして前記第１および第２の連結反応用 反応体が連結可能なオリゴヌクレオチドの断片であることを特徴とする請求項２ １に記載の連結反応成分の混合物。 ２５． 前記連結反応生成物に結合され、前記第１のＰＣＲプライマー配列 と、前記コード配列と、前記第２のＰＣＲプライマー配列とを含む、第２のポリ ヌクレオチドをさらに含んでなることを特徴とする請求項２１に記載の連結反応 成分の混合物。 ２６． 前記第２の連結反応用反応体を前記第２のポリヌクレオチドに共有 結合する第３のリンカーをさらに含んでなることを特徴とする請求項２１に記載 の連結反応成分の混合物。 ２７． 固相マトリックス； 前記固相マトリックスに共有結合された連結反応生成物；および 前記連結反応生成物に結合され、第１のＰＣＲプライマー配列と、コード配列 と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含み、該コード配列は、前記第１のＰＣＲ 配列と前記第２のＰＣＲ配列とを分離している、第１のポリヌクレオチド； を含んでなることを特徴とする、連結反応をアッセイするためのコードされた 連結反応カセット。 ２８． 前記固相マトリックスを前記連結反応生成物に共有結合する第１の リンカーおよび前記連結反応生成物を前記第１のポリヌクレオチドに共有結合す る第２のリンカーをさらに含んでなることを特徴とする請求項２７に記載のコー ドされた連結反応カセット。 ２９． 前記連結反応生成物がオリゴヌクレオチドであることを特徴とする 請求項２７に記載のコードされた連結反応カセット。 ３０． 前記固相マトリックスを前記連結反応生成物に共有結合する第１の リンカーおよび前記連結反応生成物を前記第１のポリヌクレオチドに共有結合す る第２のリンカーをさらに含んでなり、そして前記連結反応生成物がオリゴヌク レオチドであることを特徴とする請求項２７に記載のコードされた連結反応カセ ット。 ３１． 前記連結反応生成物に結合され、前記第１のＰＣＲプライマー配列 と、前記コード配列と、前記第２のＰＣＲプライマー配列とを含む、第２のポリ ヌクレオチドをさらに含んでなることを特徴とする請求項２７に記載のコードさ れた連結反応カセット ３２． 前記連結反応生成物を前記第２のポリヌクレオチドに共有結合する 第３のリンカーをさらに含んでなることを特徴とする請求項２７に記載のコード された連結反応カセット。 ３３． 前記連結反応生成物がリガーゼによる連結反応に対して感受性を有 するポリヌクレオチドであり、そして前記コード配列がオリゴヌクレオチドをコ ードすることを特徴とする請求項２７に記載のコードされた連結反応カセット。 ３４． 連結剤を連結反応成分の混合物とインキュベートすることによって 製造されるコードされた連結反応カセットであって、連結されていない反応体の 混合物は、固相連結反応成分および該固相連結反応成分とともに混合物を形成す る可溶相連結反応成分を含んでなり、前記固相連結反応成分は、固相マトリック スと、固相マトリックスに共有結合された第１の連結反応用反応体とを含み、前 記可溶相連結反応成分は、第１のポリヌクレオチドに共有結合された第２の連結 反応用反応体を含み、該第１のポリヌクレオチドは、第１のＰＣＲプライマー配 列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含み、該コード配列は、 前記第１のＰＣＲ配列と前記第２のＰＣＲ配列との間に配置され、前記第１と第 ２の連結反応用反応体は、前記固相連結反応成分を前記可溶相連結反応成分に結 合させ、そしてコードされた連結反応カセットを形成するように連結可能であり 、さらに前記連結剤は、前記第１および第２の連結反応用反応体に対して連結反 応活性を有することを特徴とする、コードされた連結反応カセット。 ３５． 前記第１および第２の連結反応用反応体が連結可能なオリゴヌクレ オチドであり、そして前記連結剤がヌクレオチドリガーゼであることを特徴とす る請求項３４に記載のコードされた連結反応カセット。 ３６． 工程Ａ：試料と、コードされた連結反応カセットを製造するための 連結反応成分の混合物とを混合すること、ここで前記連結反応成分の混合物は、 固相マトリックスと、該固相マトリックスに共有結合された第１の連結反応用反 応体とを含む固相連結反応成分；および第１のポリヌクレオチドに共有結合され た第２の連結反応用反応体を含み、該第１のポリヌクレオチドは、第１のＰＣＲ プライマー配列と、コード配列と、第２のＰＣＲプライマー配列とを含み、該コ ード配列は、前記第１のＰＣＲ配列と前記第２のＰＣＲ配列との間に配置される 可溶相連結反応成分；を含む、 工程Ｂ；可溶相連結反応成分の連結されていない部分から、前記工程Ａで形成 されたコードされた連結反応カセットを固相連結反応成分の連結されていない部 分とともに分離かつ単離すること、 工程Ｃ：前記工程Ｂにおいて、分離かつ単離されたコードされた連結反応カセ ットのポリヌクレオチドのコード配列をＰＣＲを用いて増幅すること、それから 工程Ｄ：前記工程Ｃにおいて増幅されたコード配列を検出すること、 以上の工程を含んでなることを特徴とする、試料内の連結剤を検出するための 方法。 ３７． 前記工程Ｄの後で、工程Ｄでの増幅されたコード配列の検出を、連 結剤の存在と関連づける工程Ｅをさらに含んでなることを特徴とする請求項３６ に記載の試料内の連結剤を検出するための方法。 ３８． 前記連結剤がリガーゼであり、そして前記工程Ａにおいて、コード された連結反応カセット内に含まれた連結反応生成物がリガーゼによる連結反応 に対して感受性のあるポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項３６に記 載の試料内の連結剤を検出するための方法。