CN101189347A

CN101189347A - 反转探针及其用于核酸检测的用途

Info

Publication number: CN101189347A
Application number: CNA2006800153161A
Authority: CN
Inventors: 詹姆斯·M·库尔; 劳伦斯·A·哈夫; 乔舒亚·A·比特科; 李小玉; 亚历山大·F·洛瑟博格; 拉里·W·麦克劳克林
Original assignee: Ensemble Discovery Corp
Current assignee: Ensemble Discovery Corp
Priority date: 2005-05-03
Filing date: 2006-05-03
Publication date: 2008-05-28
Also published as: WO2007008276A3; EP1885892A2; IL187130A0; US20090280477A1; US7968289B2; JP2008541698A; WO2007008276A2

Abstract

本发明提供了用于多种检测试验(例如用于核酸检测试验)的反转探针。另外，本发明提了供使用这类反转探针的试验，例如核酸检测试验。

Description

反转探针及其用于核酸检测的用途

相关申请

本申请要求2005年5月3日递交的美国专利申请No.60/677,056的利益和优先权，其整体公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明一般地涉及探针及其在检测试验中的用途，更具体地，本发明涉及反转探针及其在检测试验中的用途。

背景技术

寡核苷酸探针已在多种不同的体内和体外诊断试验中使用多年并用作研究工具。在试验中，所述探针已被用作例如感兴趣的寡核苷酸序列连接可检测标签(例如酶、荧光团、放射性标签或其他报告基团)的检测剂。另外，寡核苷酸探针可附着在载体(例如颗粒或固体表面)上用于捕获和/或拣选核酸的目的。另外，寡核苷酸探针可被用作扩增、连接或其他酶催化的反应的引物或调节物。

诊断试验(例如用于检测测试样品中靶核酸存在与否的诊断试验)典型地分为一个或两个通用类型。在一个类型中，靶核酸被直接或间接地扩增产生靶标或靶标代用品的拷贝，其均可通过任何方法检测。靶标扩增方法的实例包括聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、滚环扩增(RCA)和连接酶链式反应(LCR)及其他。在另一类型中，靶核酸序列不被扩增。更精确地，靶标被直接检测，典型地使用一种或多种杂交探针。这种类型的试验存在许多形式，其包括例如直接(共价地)标记的杂交探针，或用报告基团或以一些方式可被检测的固相(如珠)间接标记的杂交探针。

一般地，其中靶标被扩增(例如通过PCR)的试验被认为比直接检测试验既更特异又更灵敏。然而，直接试验通常被认为更易于操作，经常不需要复杂的仪器。尽管简单性使得直接试验更吸引人，但是存在改进它们灵敏性的需要。直接试验的灵敏性可能受到限制，因为每个互补的靶核酸仅与单一的经标记的探针结合。已经使用多种途径解决该限制，所述途径包括例如使用多种探针“涂布”靶标，使用含有多个报告基团的支链的探针或接头延伸的探针，或构建含有大量报告子的大“圣诞树”探针(例如可得自Chiron Corporation的Urdea b-DNA试验)。

一种吸引人的途径是使靶核酸(例如DNA或RNA分子)“反转”互补探针或与靶标结合的探针。在这种类型的试验中，探针反转或转化与检测体系连接。文献已报导构建这类体系的尝试。

例如Abe et al.(J.Am.Chem.Soc.(2004)126：13980-13986)描述一种途径，其中探针反转导致24小时内信号的92倍扩增。如Abe等所述，当两个相邻探针被化学或酶连接时可能遇到的一个问题在于被连接的复合物常常比起始复合物更加稳定，导致“产物抑制”。实质上，连接事件使得更难完成探针反转。尽管Abe等试图通过选择性地使连接产物失稳定(通过向两个探针之间引入若干个原子长度的弹性接头从而中断与靶标上相邻位置互补的两个互补半区段)而解决该问题。认为该种类型的复合物比不上两个半探针之间具有直接的键。然而就将该体系用于检测生物学重要靶标的观点看来，Abe等报导的92倍扩增可能不足以造成显著的改进。该途径或其他途径用于商业可能要求30分钟内1000倍或更大的反转。

Fong等(J.Clin.Microbiol.(2000)38：2525-2529)描述了基于“循环探针技术”(CBT)的试验，其包括酶调节的反转体系。在该试验中，当感兴趣的样品中存在靶标时，含有位于中央的核糖核苷酸键的混合DNA-RNA-DNA探针与互补的靶序列杂交。RNA酶H被添加后识别所产生的杂交物并切割双链体的RNA部分。结果探针被切割，产生的被切割的复合物解离，因为其比起始的杂交物不稳定。然后靶序列自由结合另一DNA-RNA-DNA探针分子，该循环重复。置于被切割探针片段末端的标签可以被捕获和/或直接检测。

Dirks等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2004)101：15275-15278)描述了“杂交链反应”，其中以如下方式合成两个发夹(hairpin)探针：它们以重叠(交错)的方式彼此互补。结果它们彼此杂交产生长双链体DNA。这些发夹首次混合时形成双链体的速度非常小，因为发夹中的序列限于双链体构象中，所述构象使得它们不能彼此结合。添加触发分子(即靶序列)后，触发分子与发夹之一粘末端的杂交引起发夹打开。打开的发夹随后打开另一发夹，依此类推，直到所有的发夹被消耗。因此，在加入触发物之前，所述体系实质上含有高度势能，其通过特异触发序列的添加被释放。

已经公认：为了让试验在受控的实验室环境之外由不熟练的工作人员进行，和/或不需要使用复杂的敏感仪器，试验必需是简单的但仍然灵敏。典型地，这类试验被开发用于健康诊断(遗传和传染性疾病测试)，在环境、食物、水和其他饮料中细菌和病毒的检测，以及生物威胁检测。存在如下重要的需要：用于这类应用的试验需要很少的样品制备或不需要样品制备。同样，典型地在临床或规定的环境(例如医院和标准实验室)中进行的复合物试验(例如PCR和TMA)几乎不可能转换为要求更高的不受控制的环境。

尽管如前文所述，但是仍然存在对特异反转探针的需要，所述探针用于体内和体外诊断试验时能够提供必需的敏感性。

发明概述

本发明部分基于下述发现：有可能产生一种反转探针，其能在检测步骤之前不必扩增靶序列的核酸试验中提供必需的灵敏度。设计本文描述的核酸探针，使得形成探针-核酸复合物后，探针被改变，使得其显示产生发夹结构的倾向。一旦形成发夹结构，探针从复合物解离，留下可以结合另一探针的靶核酸。当与检测体系偶联时，探针反转可用于扩增信号，这随后可增强试验的灵敏度。

在一个发明，本发明提供一种将核酸探针从靶核酸序列解离的方法。所述方法包含步骤：(a)将核酸探针与怀疑含有所述靶核酸序列的样品在下述条件下组合，如果所述样品中存在所述靶核酸，则所述条件允许所述探针与所述靶核酸序列退火，其中所述核酸探针包含化学基团(chemical moiety)，所述化学基团被修饰或去除时允许所述核酸探针或其片段形成发夹结构并从所述复合物解离；和(b)提供能够修饰或去除所述化学基团的试剂，从而如果所述样品中存在复合物，则所述核酸探针或其片段形成发夹结构并从所述复合物解离。

所述方法任选地包含检测步骤(b)所产生的、指示复合物存在的产物的额外步骤。使用该途径可以测定感兴趣的样品中是否存在靶核酸。

在另一方面，本发明提供一种检测样品中靶核酸序列存在与否的方法。所述方法包含步骤：(a)将能够与所述靶核酸序列退火形成复合物的核酸探针与怀疑含有所述靶核酸序列的样品组合，其中所述核酸探针包含化学基团，所述化学基团被修饰或去除时允许所述核酸探针或其片段形成发夹结构并从所述复合物解离；(b)提供能够修饰或去除所述化学基团的试剂，从而如果样品中存在复合物，则核酸探针或其片段形成发夹结构并从所述复合物解离；和c)检测步骤(b)所产生的、指示复合物存在的产物，从而测定所述样品中是否存在所述靶核酸。

在另一方面，本发明提供一种扩增指示样品中靶核酸的存在的信号的方法。所述方法包含步骤：(a)将怀疑含有靶核酸的样品与第一核酸探针在下述条件下孵育，如果样品中存在所述靶核酸，则所述条件允许所述第一核酸探针与所述靶核酸退火，其中所述第一核酸探针包含(i)能够生产可检测事件的信号产生基团和(ii)与所述靶核酸退火的核苷酸序列；(b)提供非酶的反转诱导试剂，所述试剂与所述第一核酸探针反应，以促进所述第一核酸探针从所述靶核酸分离并引起可检测的事件；和(c)当所述第一核酸探针从所述靶核酸分离后，允许第二核酸探针与所述靶核酸结合并产生另一可检测的事件。

在另一方面，本发明提供一种适用于检测测试样品中靶核酸存在与否的反转探针。所述探针含有以下特征(i)与靶核酸互补的核酸序列，(ii)与核酸序列结合的化学基团，所述化学基团被化学试剂修饰或去除后允许探针形成发夹结构并从复合物解离，和(iii)与核酸序列结合的可检测标签。探针任选地包括与核酸序列结合的猝灭剂。使用猝灭剂时，存在猝灭剂时产生很少信号或不产生信号。然而，一旦化学基团被修饰或去除并产生发夹结构，猝灭剂剂将不再能够猝灭可检测的标签。结果，在某些环境中，发夹形成可导致信号产生，例如有色信号或荧光信号，所述信号可用于测定感兴趣的样品中是否存在靶核酸。

在另一方面，本发明提供使用本发明反转探针时存在于典型的核酸检测试验中的组合物。具体地，所述组合物包含靶核酸序列和能够与靶核酸序列退火形成复合物的核酸探针。所述核酸探针包含化学基团，所述化学基团被修饰或去除时允许核酸探针形成发夹结构并从复合物解离。

参考下图、详细描述和权利要求书可更详尽地理解本发明之前的方面和实施方案。

附图概述

根据下图可进一步理解本发明。

图1是代表核酸检测试验的流程图，其中反转探针被切割，产生发夹结构。

图2是代表核酸检测试验的流程图，其中反转探针被修饰，产生发夹结构。

图3是代表使用两个不同反转探针的核酸检测试验的流程图，其中第一探针(xu探针)含有修饰第二探针(zy探针)的试剂，从而第二探针形成发夹结构并从与靶核酸形成的双链体解离，新的第二探针与靶核酸结合时含有修饰第一探针的试剂，从而第一探针从与靶核酸形成的双链体解离。

图4是代表示范性的核酸检测试验的流程图，其中切割探针与靶核酸退火后在检测探针与靶核酸退火时切割检测(反转)探针。

图5A-5E是显示图4的检测探针和切割探针在切割前和切割后的熔解曲线的图，例如检测探针切割之前与靶标结合的示范性检测探针(图5A)；检测探针切割后检测探针的短片段(图5B)；检测探针切割后的检测探针发夹(图5C)；检测探针切割之前与靶标结合的示范性切割探针(图5D)；和检测探针切割后与靶标结合的切割探针(图5E)。

图6是代表示范性核酸检测试验的流程图，其中解封闭探针与靶核酸退火后在检测探针与靶核酸退火时修饰(例如解封闭)与检测(反转)探针结合的封闭探针二硫化物。

图7是显示连接封闭探针和检测探针的二硫键被破坏后图6的解封闭探针、封闭探针和检测探针熔解曲线的图。

图8是阐述亚磷酰胺单体合成的示范性化学流程图，其可用于将可切割的接头整合进寡核苷酸中。

发明详述

本发明提供促进核酸试验中必需灵敏度的反转探针，所述核酸试验中检测步骤之前靶序列不必被扩增。设计本文描述的核酸探针使得形成探针-核酸复合物后探针被改变而形成发夹结构。形成发夹结构后探针开始从复合物解离，留下能够结合另一探针的靶核酸。当与合适的信号产生基团偶联时，探针反转可用于放大信号，这随后增强试验的灵敏度。通过使用适当构建的发夹和通过提供合适的途径来化学地、酶促地或催化地切割或解封闭发夹，作为其结合模板(靶标)的结果，可以达到就诊断和研究试验观点来看有意义的反转率。

本发明允许技术人员创造可用于核酸检测试验的反转探针。但是，探针可用于其他目的，例如药物输送。事实上，探针与靶核酸结合后可从靶核酸释放，允许另一探针结合相同或相似的序列。结果，探针反转可用于在核酸检测试验中放大信号。

解离核酸探针的方法包含步骤：(a)将核酸探针与怀疑含有靶核酸序列的样品在下述条件下组合，如果所述样品中存在所述靶核酸，则所述条件允许所述探针与所述靶核酸序列退火，其中所述核酸探针包含化学基团，所述化学基团被修饰或去除时允许所述核酸探针或其片段形成发夹结构并从所述复合物解离；和(b)提供能够修饰或去除所述化学基团的试剂，从而如果所述样品中存在复合物，则所述核酸探针或其片段形成发夹结构并从所述复合物解离。考虑到探针用于核酸检测试验，本方法可包含检测步骤(b)所产生的、指示所述复合物存在的产物的额外步骤。该步骤能够用于测定所述样品中是否存在靶核酸。

在该方法中，发夹结构可包含茎和环。步骤(b)中提供的试剂能够修饰或去除化学基团，从而如果样品中存在复合物，则核酸探针或其片段形成发夹结构并从复合物解离。化学基团存在于探针中或与探针结合时，阻止发夹形成。化学基团可以选自例如：碱基、经修饰的碱基、寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、核苷酸间键、经修饰的核苷酸间键、保护性基团、肽、蛋白质、多聚体、珠和纳米粒子。化学基团的修饰或去除导致探针形成发夹结构并从靶核酸解离。

作为例子，化学基团可以是由于位阻而阻止发夹形成的大基团，例如寡核苷酸、化学侧链、多聚体、肽、蛋白质、珠或纳米粒子等等。化学基团可与探针共价或非共价结合。当与探针共价结合时，可以经由例如化学键或接头。化学键或接头的切割导致化学基团被从探针切割。没有化学基团时，具有产生发夹的天然倾向的探针形成发夹结构。作为发夹形成的结果，探针开始从靶标解离，允许另一探针结合相同或相似的靶标序列。

在另一实例中，化学基团可包含核苷酸间键，其将例如碱基、经修饰的碱基、寡核苷酸序列或经修饰的寡核苷酸与反转探针连接。与反转探针连接后，所述碱基、经修饰的碱基、寡核苷酸序列或经修饰的寡核苷酸序列与靶序列退火。然而，取决于对适当条件的选择，一旦核苷酸间键被切割，碱基、经修饰的碱基、寡核苷酸或经修饰的寡核苷酸可从靶标解离。这些元件的缺失允许反转探针形成发夹结构并从靶序列解离。

在另一实例中，化学基团可包含碱基、经修饰的碱基、核苷酸间键、经修饰的寡核苷酸键，其为反转探针的一部分。然而，取决于对适当条件的选择，一旦碱基、经修饰的碱基、寡核苷酸或经修饰的寡核苷酸、核苷酸间键或经修饰的寡核苷酸键被修饰，反转探针的剩余部分可随后形成发夹结构并从靶序列解离。或者，一旦碱基、经修饰的碱基、寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、核苷酸间键或经修饰的寡核苷酸键被从反转探针切割，反转探针的剩余部分可形成发夹结构并从靶序列解离。

假设反转探针连接、结合或含有信号产生基团，当探针形成发夹并开始从靶序列解离时可能产生可检测的信号。不管化学基团是被修饰或者还是从反转探针的剩余部分去除，都适用同样的原理。另外，反转探针可与感兴趣的配体偶联，将配体输送至靶序列。发夹形成后，该探针开始从靶标解离并可被另一反转探针取代。

修饰或去除化学基团的试剂(在本文中也称作反转诱导试剂)可以是在溶液中提供游离的化学试剂。然后该试剂发挥作用，修饰或去除与探针结合的化学基团。或者，修饰化学基团的试剂可以是与靶核酸序列的互补核酸序列偶联或结合的化学试剂。假设所述试剂和能够与靶核酸序列退火的第二核酸序列连接，当第二核酸序列与靶核酸序列退火时，该试剂修饰或去除核酸探针中含有的或结合的化学基团，所述核酸探针和与靶核酸退火。在该实施方案中，第二核酸序列与靶核酸序列的第一位置退火，核酸探针与靶核酸序列在第二位置退火。第一和第二位置可以彼此相邻。

有用的试剂可包含选自以下试剂组的试剂：金属、还原剂、螯合剂、亲核体、亲核化合物、亲电体、亲电化合物、催化肽、催化小分子(如咪唑)、蛋白酶、核酶或能够影响化学转化的其他蛋白质。

另外，本发明提供放大信号的方法，所述信号指示样品中靶核酸的存在。该方法包含步骤：(a)将怀疑含有靶核酸的样品与第一核酸探针在下述条件下孵育，如果样品中存在靶核酸，则所述条件允许第一核酸探针与靶核酸退火，其中所述第一核酸探针包含(i)能够生产可检测事件的信号产生基团和(ii)与所述靶核酸退火的核苷酸序列；(b)提供非酶的反转诱导试剂，所述试剂与第一核酸探针反应，以促进第一核酸探针从靶核酸分离并引起可检测的事件；和(c)当第一核酸探针从靶核酸分离后，允许第二核酸探针与所述靶核酸结合并产生另一可检测的事件

在该途径中，信号产生基团可以共价附着在第一核酸探针上。信号产生基团可以是能够导致可检测信号的另一反应的催化剂。例如，信号产生基团可以是发光基团，其中可检测的事件是光学事件。或者，信号产生基团可以包含一个或多个化学基团，其自身产生可检测的信号。另外，反转诱导试剂可附着在另一个核苷酸序列上，所述核苷酸序列与靶核酸在探针与靶核酸退火位置附近的位置退火。

反转诱导试剂与第一核酸探针反应，引起第一核酸探针或其片段产生发夹结构。一旦第一核酸探针或其片段产生发夹结构，则第一核酸探针或其片段开始从靶标解离，允许第二核酸探针结合靶核酸，产生另一可检测的事件。

示范性的反转探针包含(i)与靶核酸互补的核酸序列；(ii)与核酸序列结合的化学基团，当其被化学试剂修饰或去除时允许探针形成发夹结构并从复合物解离；(iii)与核酸序列结合的信号产生基团；和任选地(iv)与核酸序列结合的猝灭剂剂。

在一个实施方案中，化学基团可置于核酸序列内。因此，化学基团可以是化学键，或可以由至少一个原子定义。在另一实施方案中，化学基团例如通过共价键附着在核酸序列上。在这些实施方案中，化学基团可选自碱基、经修饰的碱基、寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、经修饰的核苷酸间键、保护基团、肽和可切割的接头。

在本文所述方法的实践中，该方法导致下述组合物的形成，所述组合物包含靶核酸序列和能够与靶核酸序列退火形成双链体的核酸探针，其中核酸探针包含化学基团，所述化学基团被修饰或去除时允许核酸探针形成发夹结构并从复合物解离。核酸探针还任选地包含可检测的标签。取决于所使用的检测体系，核酸探针还可包含猝灭剂，其能够猝灭来自可检测标签的信号。

现在参考图1-3讨论本发明反转探针的设计及使用。

图1显示使用本发明反转探针的示范性试验。在该系统中，发夹形成所释放的能量被用于清除检测器探针的靶标。“缩短”探查区段后，作为主链切割的结果，发夹形成释放出势能。更具体地，反转探针最初与靶序列在下述条件下混合：如果样品中存在靶序列，则所述条件允许探针与靶序列退火。假设靶序列存在于样品中，反转探针与靶序列杂交。此后，化学试剂被应用于样品时在化学基团(在图1中标注为”X”)切割探针。在图1中，示范性化学基团(X)是探针中的可切割键。切割该键后，探针裂为两条，其中至少一条能够形成发夹结构。例如在图1中，键的切割产生短片段和发夹片段。作为发夹结构形成的结果，探针开始从靶标解离，留下靶标可用于另一杂交事件。解离事件任选地与信号产生系统偶联，从而当探针在试验中反转时产生离散信号(例如荧光的增强或减弱)。解离事件任选地与生物活性化合物(例如药物、微生物、辅因子、毒素、免疫原或等等)的释放偶联。

图2显示使用本发明反转探针的另一示范性试验。在该体系和图1所示的体系中，发夹形成所释放的能量被用于清除检测探针的靶标。作为部分序列解掩蔽(使得不能参与茎形成的残基现在能够参与茎形成)的结果，通过发夹形成释放出势能。更具体地，反转探针最初与靶序列在下述条件下混合：如果样品中存在靶样品，则所述条件允许探针与靶序列退火。假设样品中存在靶核酸，则反转探针与靶序列杂交。此后，化学试剂被用于样品时将掩蔽基团解掩蔽，所述掩蔽基团在图2中标注为”X”。掩蔽基团(X)是预防发夹形成的可去除基团，其可以是例如能够从探针切割的共价连接的短寡核苷酸。封闭寡核苷酸可以通过可切割的寡核苷酸间主链或通过一些其他类型的接头结合。掩蔽基团也可是与一个核碱基杂环结合的巨大的、但非寡核苷酸的取代基，从而破坏序列的杂交能力。一旦掩蔽基团(X)被去除，探针随后可形成发夹结构。作为发夹结构形成的结果，探针开始从靶标解离，留下靶标能够用于另一杂交事件。解离事件任选地与信号产生体系偶联，使得探针在试验中反转时产生离散信号(例如荧光的增强或减弱)。解离事件任选地与生物活性化合物(例如药物、维生素、辅因子、毒素、免疫原等)的释放偶联。

认为例如切割图1的键或例如解掩蔽图2的序列所需的化学、酶或催化活性可来自于与待切割或解掩蔽(分别见例如图4和图6)的探针相邻的额外试剂探针。可以设计使用这类探针的试验使得试剂探针的过量处于或接近与靶复合物的单位平衡，以保证靶标上存在足够的试剂反转，以便于恒定提供针对靶标的活性试剂探针。另外，在试验中试剂探针提供额外的特异性，因为其必需与邻近检测探针的序列杂交使得反应发生。

图3示出两个反转探针互相解掩蔽，其中两个探针均具有形成发夹结构的倾向。在该流程图中，每种被掩蔽的探针也含有会解掩蔽另一探针的试剂。任一探针上的试剂可在解掩蔽过程中被消耗，或其可以是催化的而不被消耗。图3中，探针上的试剂被消耗，使得一旦探针解掩蔽相邻探针，则被化学消耗的探针必需等待杂交新的相邻探针，从而使其可以被解掩蔽并从靶标释放。新的第一探针分子随后杂交，所述循环自身重复。通过扩展这些原则，可以设计相似的试验，其中探针对儿中一个成员切割探针对儿的另一成员。

更具体地，图3显示含有两个发夹探针的体系。第一个探针(标注为xu-探针)包含预防发夹形成的、可去除的封闭基团(标注为″X″)和解掩蔽第二探针中可去除的封闭基团(标注为″Y″)的功能基团(标注为″U″)。第二探针(标注为zy-探针)包含可去除的封闭基团Y和解掩蔽第一探针中可去除的封闭基团X的功能基团(标注为″Z″)。在初始阶段(标注为″1″)，两种探针均与靶序列退火。在下一阶段(标注为″2″)，第一探针的功能基团U将第二探针的可去除的封闭基团Y解掩蔽。结果第二探针随后形成发夹结构并从靶标解离，使得新的第二探针能够结合靶序列。

在下一阶段(由″3″标注)，第二zy-探针与靶标退火。在下一阶段(由″4″标注)，第二探针的功能基团Z将第一探针的可去除的封闭基团X解掩蔽。结果第一探针随后形成发夹结构并从靶标解离，使得新的第一探针能结合靶序列。第一探针和第二探针的发夹形成可与适当的信号产生系统偶联以放大产生的信号。

本发明反转探针的一个关键特征在于：当被修饰或切割时，探针形成发夹结构。发夹结构典型地包含彼此互补并能彼此退火的第一和第二序列。第一和第二序列彼此退火时产生茎结构。在产生的发夹结构中，第一序列的第一个末端与第二序列的第一个末端通过碱基彼此不退火的接头序列连接。

为了在化学基团被切割或修饰时能够产生发夹结构，将探针设计为包括三个区段(见图4)。第一区段由与靶核酸序列互补的第一核酸序列定义。第一区段包含例如长度为5到25、5到20或10到25的残基。第二区段由能够与第一核酸序列分子内退火的第二核酸定义。第二区段包含例如长度为2到25、5到25或2到20的残基。第三区段由例如长度为0到5个残基的接头序列定义，所述接头序列不与第一或第二核酸序列任一序列退火。第一和第二核酸彼此退火产生发夹结构的茎。当检测探针形成发夹时，接头序列产生发夹接头的环或头部分。

多种探针的选择应取决于例如待分析的靶序列、靶标和反转探针的浓度、试验条件(例如温度、pH、盐、盐浓度、缓冲液和缓冲液浓度，以及其他试剂如醇和甲酰胺)、探针第一区段和第二区段之间的互补性或稳定性、发夹环的尺寸和靶标的序列。多种示范性探针的设计将参考图4-7更详细地讨论。

图4是表示示范性核酸试验的流程图，其中化学试剂(作为图4中切割探针的一部分)切割反转探针(在图4中标注为“检测探针”)的化学基团。图4中，检测探针具有序列5′-CTGGTGGCGTGGAACGCCACCAGCTCCAACTAC-3′(SEQ ID NO：1)。检测探针第二区段中碱基的数量n_区段2为10，并代表了探针5’端的前十个碱基。切割探针具有序列5′-CACAAGTTTATATTCAGTC-S′(SEQ ID NO：2)，切割探针中的碱基数量n_切割为19。靶标具有序列5′-ATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGA-3′(SEQ ID NO：3)。切割探针和检测探针均显示与靶序列退火。检测探针的一部分(第一区段)显示与靶序列退火，检测探针的一部分(第二区段)不与靶序列退火。检测探针中化学基团切割后，第二区段开始能够与第一区段退火形成发夹结构。第三区段是检测探针形成发夹结构时环的一部分。

检测探针第二区段长度改变对结合探针的函数通过使用可商业购得(DNA Software，Ann Arbor MI)的OMP(Oligonucleotide ModelingProgram)，进行模拟来探测，其中切割前阶段(两个探针和一个靶标)和切割后阶段(一个探针、两个探针片段和一个靶标)用各自的参数值彼此独立地模拟。结果显示在图5A-5E中，图5A是显示与靶标结合的检测探针百分比对n_区段2(检测探针切割前检测探针区段2中碱基数)的函数。结果指出，通常当n_区段2长度增长时，与靶序列结合的未切割探针的数量降低，直到n_区段2为10到11个残基时无更多探针结合。相反，在该实施例中，当n_区段2少于10时，几乎所有未切割的探针与靶序列结合。图5A中的虚曲线表示使用突变靶标时的模拟值。靶序列识别位点末端的点突变对结合在靶位点上的探针量有影响。另外，当n_区段2大于7个残基时，靶标中间的点突变对与靶标结合的探针量具有更显著的影响。结果显示对一定n_区段2值范围而言，检测探针以序列特异的形式与靶标退火，错误配对对于检测探针结合的不利影响允许杂交反应中的特异性。

图5B是显示切割检测探针后与靶标结合的检测探针“短片段”(见图1)百分比作为n_区段2的函数的图。该图指出在检查的条件下，仅当n_区段 ₂小于7个残基时探针短片段保持与靶标结合，当n_区段2大于7个残基时，短探针和形成发夹的探针均不再与靶标退火。该模拟指出检测探针切割后，来自被切割的检测探针的、产生的两个碎片会从靶标解离，从而使得靶标能够与另一全长检测探针杂交。

图5C是是显示切割检测探针后与靶标结合的检测探针“发夹片段”(见图1)百分比作为n_区段2的函数的图。该图指出在检查的条件下，仅当n_区段2小于7个残基时探针发夹片段保持与靶标结合。换言之，在检查的条件下，当n_区段2大于7个残基时，探针的发夹片段几乎完全从靶标解离。

图5D是切割检测探针前与靶标结合的“切割探针”百分比作为n_区段2的函数的图。该图指出在检查的条件下，对所有的n_区段2长度而言，多于50％的切割探针与靶标结合。

图5E是显示切割检测探针后与靶标结合的“切割探针”百分比作为的函数的n_区段2图。该图指出在检查的条件下，对所有的n_区段2长度而言，多于50％的切割探针与靶标结合。

图4和图5A-E结合指出：作为形成发夹的检测探针切割的结果，含有下述(i)和(ii)的体系能够引起检测探针的探针反转，其中(i)为切割探针，其带有能够促进邻近适当构型的检测探针切割的化学试剂，(ii)为具有适当构型的切割位点的检测探针。

图6是表示另一核酸试验的流程图，其中封闭探针与反转探针(在图6中标注为“检测探针”)结合后阻止检测探针形成发夹结构。在该图中，封闭探针与检测探针通过二硫键(如图6中虚线所示)共价连接。封闭探针具有序列5′-ACGCCACCA-3′(SEQ ID NO：4)，封闭探针中碱基的数量n_封闭为9。检测探针具有序列5′-TGGAGCTGGTGGCGTGGAACGCCACCAGCTCCAACTAC-3′(SEQ IDNO：5)，检测探针第二部分中碱基的数量n_区段2为15，并代表了探针5’端前十五个碱基。靶标具有序列5′-TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTG ACGATACAGCTAATTCAGAATCAT-3′(SEQ ID NO：6)。解封闭探针具有序列5′-TATCGTCAAGGCACTCT-3′(SEQ ID NO：7)，解封闭探针中碱基的数量n_解封闭为17。

在该试验中，化学试剂(如图6中“解封闭探针”的部分)还原二硫键，使得封闭探针能够开始从检测探针解离。解封闭探针和检测探针均显示与靶序列退火。检测探针的一部分(第一区段)显示与靶序列退火，检测探针的一部分(第二区段)不与靶序列退火。二硫键还原后，封闭基团开始从检测探针的第二区段解离。结果检测探针的第二区段开始能够与检测探针的第一区段退火形成发夹结构。当检测探针形成发夹结构时，检测探针的第三区段成为环的一部分。该类型的试验描述于实施例3。

图7显示二硫键断裂后，与靶标结合的封闭探针、解封闭探针和检测探针的百分比作为封闭探针长度的函数。在检查的条件下，与靶标结合的已结合解封闭探针(n_解封闭＝17)百分比为约60-70％，与n_区段2和n_封闭无关，这表明其将与靶标杂交，并将能够破坏检测探针和封闭探针之间的二硫键。此外，当二硫键断裂后，对任何n_封闭和n_区段2而言所释放的检测探针(n_区段2＝6-12)不与靶标退火。如果封闭探针足够短(例如少于10个残基)，其也将不与靶标退火，从而使得靶标能够与新检测探针(n_区段2＝6-12)杂交。对所示值而言，结合的封闭探针百分比不受n_区段2影响。

应理解反转探针可从DNA、RNA、LNA、PNA及其类似物和混合物构建。应理解术语“核酸”包含DNA、RNA、LNA、PNA及其类似物和混合物。接头可从核苷酸或从线性非核苷酸多聚体如PEG、PPG、脂肪族链、多肽、聚烷基磷酸盐(polyalkylphosphate)等构建，在该情况下将第一和第二序列连接的多聚体长度应从2到50个原子。应当注意第一和第二核酸序列可以分别位于探针的5’和3’端，或相反。

探针还含有与核酸序列结合的化学基团，所述化学基团被化学试剂修饰或去除后允许探针形成发夹结构并从复合物解离。有用的化学基团可选自化学键(例如核苷酸间键)，原子，碱基，经修饰的碱基，寡核苷酸，经修饰的寡核苷酸，大取代基如肽、分支多肽、环状多肽或其他大取代基如卟啉、树状聚合物等。在某些情况下，化学基团置于核酸序列中。在其他情况下，化学基团例如通过共价键与核酸序列结合。

存在大量可用于在这些体系中切割、封闭或解掩蔽探针的化学基团和/或掩蔽基团。例如，多种含硫的核苷酸间键可被金属还原或切割，以破坏探针主链(参阅例如Kuimelis & McLaughlin Nucl.Acids Res.(1995)23，4753、Mag et al.，Nucl.Acids Res.(1991)19，1437、Metelev，et al，Nucl.Acids Res.(2001)29，4062)。金属或还原剂可由结合了螯合基团或还原基团的相邻探针输送至可切割探针内的硫键。带有悬挂螯合剂和还原化合物的寡核苷酸已描述于美国专利Nos.6,831,166和5,980,861中。

存在大量可能用于探针主链切割的其他化学品。例如，可使用膦来还原叠氮化物(例如下文所示的叠氮化物)以产生胺。胺随后攻击邻近的羰基，形成酰胺或脲杂环并导致主链切割。或者，适当保护的胺官能团也可被脱保护以产生亲核体，其会攻击并切割主链。

被掩蔽的巯基键也可用于主链切割，因为已知它们脱保护时有助于链分裂。参阅例如Fidanza and McLaughlin，J.Amer.Chem.Soc.(1992)57，2340。被掩蔽的巯基的许多可能的构型之一如下显示，这类键易于制备。当巯基掩蔽基团为二硫键时，可使用例如膦的还原剂将巯基解掩蔽。解掩蔽的巯基随后可分子内反应以如下所示切割链。

探针与多种信号产生体系结合。信号产生后被报告反转反应过程的检测体系所检测。例如，可在探针内放置染料和猝灭剂，使得当探针被切割和/或解掩蔽时产生或破坏荧光共振能量转移(FRET)。适用于本发明实践的具体荧光基团和FRET技术的实例描述于美国专利Nos.6,485,901和6,103,476。掩蔽基团可以是化学基团，其在从探针上去除掩蔽基团后成为发荧光的或有色的。掩蔽基团也可以是酶辅因子如NADH、吡哆醛、黄素单核苷酸(FMN)等，其释放后补充酶使其具有活性。酶随后可作用于底物，所述底物产生色、光、荧光或其他可测量的信号；或酶可以是产生可测量信号的酶级联反应的一部分。适用于本发明实践的酶体系的实例包括diaphorease、醇脱氢酶、FMN氧化还原酶及其他。掩蔽基团也可以是肽或蛋白质，其被释放后开始具有活性或补充另一肽、蛋白质或分子，产生可测量的活性。例如，掩蔽基团可以是S-肽，其能够补充S-蛋白质产生S-RNAse(Richards and Logue，J.Biol.Chem.(1962)V 249，pp 2285-2293)。还存在能与本发明的探针和试验连接的、许多其他可能的报告体系。

这里所描述体系具有显著优点。这些优点包括与Cycling ProbeTechnology或本领域已知的探针反转体系相比，靶标(模板)以更快(利用发夹势能)和更特异(利用两个相邻的探针以及所需化学成分)的方式引起探针反转的能力。认为使用合适的探针设计可能在30分钟的时间段内达到显著大于1,000个循环的反转。

因为探针完全是合成的，所以它们制造便宜、可以大规模制造并在需要时可容易地重新设计。该体系还可根据反转方面所给予的所有附加益处，灵活应用于检测非核酸靶标，例如通过将模板与抗体或其他结合分子(例如小分子、辅因子、聚糖、肽等)偶联。

从以下的非限制性实施例会更全面地理解本发明的实践，所述实施例在本文中仅用于阐述的目的而不应当理解为以任何方式用于限制。

实施例1

以下实施例描述本发明的一个实施方案，其中第一寡核苷酸探针可被第二寡核苷酸探针切割，以检测第三寡核苷酸的存在。

具有序列3′-CATCAACCTCxGACCACCGCAAGGTGCGGTGGTC-5′(SEQ ID NO：1)的第一寡核苷酸(Oligo1)根据Mag et al，Nucleic AcidsResearch(1991)V.19，pp 1437-1441制备，其中(x)表示桥接的硫代磷酸酯键。

具有序列3′-CTGACTTATATTTGAACACy-5′(SEQ ID NO：2)的第二寡核苷酸(Oligo2)根据Morocho et al，Bioconjugate Chem(2004)V.15，pp 569-575通过合成5’-胺衍生的寡核苷酸合成来制备，其中(y)表示通过56个原子的间隔区与寡核苷酸连接的胺。根据Schmidt et al，Biochemical andBiophysical Research Communications(1972)Vol 48(2)pp 461-456和Levy，Biochimica et Biophysica Acta(1973)Vol 317(2)pp 473-481，将经切割的、纯化的、胺衍生的寡核苷酸与NHS或对氯汞苯甲酸的对硝基苯基酯反应，以在HPLC纯化后提供具有悬挂的苯基汞基团(Oligo2Hg)的寡核苷酸。

具有序列5′-ATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGC-3′(SEQ IDNO：3)的第三寡核苷酸(Oligo3)购自Integrated DNA Technologies(Coralville，Iowa USA)。

在含有氯化钠和磷酸钠、任选地含有氯化镁和任选地含甲酰胺的水性缓冲液中将Oligo3与Oligo2Hg和Oligo1组合。为了确定Oligo1和Oligo2与Oligo3杂交时促进Oligo2对Oligo1切割的缓冲液和反应条件，进行独立的反应，其中每种寡核苷酸的浓度在1nM和1,000nM之间变化，氯化钠浓度从0.05M到1M变化，磷酸盐浓度固定在0.05M，pH在4和10之间变化，氯化镁浓度在0mM和10mM之间变化，以占总体积百分比计的甲酰胺量在0％和70％之间变化。一些反应的温度也从10℃到70℃变化。

反应过程可通过凝胶电泳监测Oligo1切割产物的存在。省略多种成分(最值得注意的是Oligo3)的对照反应用于确定切割是由于Oligo1和Oligo2对Oligo3的杂交。通过凝胶电泳或通过HPLC来定量地确定切割产物的量。

实施例2

如实施例1所述制备Oligo1和Oligo3。带有氨基酸基团的Oligo2如实施例1中所述制备，然后使用可得自Dojindo Molecular Technologies(Gaithersburg MD，USA)的试剂Isothiocyanato-EDTA根据制造商说明书，用螯合剂来衍生胺。带有螯合剂的、经纯化的寡核苷酸(Oligo2Ch)的等分试样与多种二价金属阳离子盐酸盐(值得注意的是MgCl₂、CaCl₂、MnCl₂、CoCl₂、ZnCl₂、CdCl₂和HgCl₂)在pH 7.0的Tris-HCl中孵育，以实现悬挂的螯合基对金属的配位。将寡核苷酸透析或脱盐(通过结合、洗涤然后从C18反向柱中洗脱)来去除过量的金属。

然后在实施例1所述的多种条件下将带有二价阳离子的寡核苷酸与Oligo1和Oligo3组合，以确定促进带有金属的Oligo2Ch对Oligo1切割的反应条件。

实施例3

以下实施例描述本发明的一个实施方案，其中交联的寡核苷酸对儿可被另一寡核苷酸切割，以检测寡核苷酸靶标的存在。

具有序列5′-ACGCCA*CCA-3′(SEQ ID NO：4)的寡核苷酸(Oligo4)根据Ferentz et al.(1991)J.Amer.Chem.Soc，V 113，pp 4000-4002来制备，其中(*)代表对腺嘌呤残基的巯基修饰。

具有序列3′-CATCAACCTCGACCACCGCAAGGTGCGGT*GGTCGAGGT-5′(SEQ ID NO：5)的另一寡核苷酸(Oligo5)如下制备：首先使用Carboxy dT(Glen Research，Sterling VA，USA)根据制造商说明书合成5-羧基修饰的DNA，然后根据Glen Research User Giude of DNAModifications(1999，pp 37)通过将羧基与氨基乙硫醇二硫化物反应首先形成酰胺来将所述羧基转化为巯基，其中(*)代表对胸腺嘧啶残基5-位置的巯基修饰。根据Bischoff et al.(1987)Analytical Biochemistry 164，336-344切割二硫键和纯化寡核苷酸。

根据Ferentz et al.将Oligo4和Oligo5杂交并通过形成二硫键交联。通过凝胶电泳和反向HPLC纯化交联的产物(Oligo6)。

具有序列3′-TCTCACGGAACTGCTAT-5′(SEQ ID NO：7)、带有3’-末端膦的寡核苷酸(Oligo7)根据Sakurai et al.(2005)J.Amer.Chem.Soc，V 127，pp 1600-1661制备。

在含有氯化钠和磷酸钠、任选地氯化镁和任选地甲酰胺的水性缓冲液中将Oligo6与Oligo7和Oligo3组合。为了确定当Oligo6和Oligo7与Oligo3杂交时促进Oligo7对Oligo6解离的缓冲液和反应条件，进行独立的反应，其中每种寡核苷酸的浓度在1nM和1,000nM之间变化，氯化钠浓度从0.05M到1M变化，磷酸盐浓度固定在0.05M，pH在4和10之间变化，氯化镁浓度在0mM和10mM之间变化，以占总体积百分比计的甲酰胺量在0％和70％之间变化。一些反应的温度也从10℃到70℃变化。

反应过程可通过凝胶电泳Oligo4和Oligo5的形成和Oligo6的消失来监测。省略多种成分(最值得注意的是Oligo3)的对照反应用于确定切割是由于Oligo6和Oligo7对Oligo3的杂交。通过凝胶电泳或任选地通过HPLC来定量地确定切割产物的量。

实施例4

含有被掩蔽的巯基的亚磷酰胺根据图8所示的合成流程图制备。根据Iranpoor and Kazemi，Tetrahedron(1997)V.53，pp 11377-11382，将缩水甘油转化为3-羟基-1，2-亚丙基硫杂丙环(3-hydroxy-1，2-propylene thiirane)。然后将羟基保护为二甲氧基三苯甲基醚(dimethoxytrityl ether，DMT)。通过用链烯基亚磺酰溴化物(alkenylsulfenyl bromide)处理、然后用醋酸银置换溴化物、并使用甲氧基甲醇钠(methanolic sodium methoxide)去除醋酸基团来完成硫杂丙环开环。上述最后三步如Silvestri and Wong，J.Org.Chem.(2001)V.66，pp 910-914所述完成。然后如Sinha et al，Nuc.Acids.Res.，(1984)V 12，pp 4539所述将产生的醇转化为β-氰乙基亚磷酰胺。

使用亚磷酰胺化学(参阅Chapter 1，Oligonucleotides and Analogues；APractical Approach，Eckstein，F.ed.，IRL Press，(1991)))，根据寡核苷酸合成的标准方法，用前段所述的亚磷酰胺制备含有序列3′-CCATCAACCTxGACCACCGCAAGGTGCGGTGGTC-5′(SEQ ID NO：8)的第八个寡核苷酸(Oligo8)，其中(x)表示被掩蔽的含有二硫键的基团。

根据Morocho et al，Bioconjugate Chem(2004)V.15，pp 569-575，通过合成5’胺衍生的寡核苷酸制备具有序列3′-ACTGACTTATATTTGAACAy-5′(SEQ ID NO：9)的第九个寡核苷酸(Oligo9)，其中(y)表示通过56个原子的间隔区与寡核苷酸连接的三苯膦部分。通过使用Sakurai et al.(2005)J.Amer.Chem.Soc，V 127，pp 1600-1661的方法，去除5’-胺保护基团，并将与树脂结合的、胺衍生的寡核苷酸与对-羧基苯基-联苯膦反应用于制备3’-三苯膦标记的寡核苷酸。然后从载体上切割Oligo9，将其去保护并按照Sakurai的方法纯化。

在含有氯化钠和磷酸钠、任选地氯化镁和任选地甲酰胺的水性缓冲液中，将实施例1制备的Oligo3与Oligo8和Oligo9组合。为了确定当Oligo8和Oligo9与Oligo3杂交时促进Oligo9对Oligo8切割的缓冲液和反应条件，进行独立的反应，其中每种寡核苷酸的浓度在1nM和1,000nM之间变化，氯化钠浓度从0.05M到1M变化，磷酸盐浓度固定在0.05M，pH在4和10之间变化，氯化镁浓度在0mM和10mM之间变化，以占总体积百分比计的甲酰胺量在0％和70％之间变化。一些反应的温度也从10℃到70℃变化。

反应过程可通过凝胶电泳Oligo1切割产物的存在来监测。省略多种成分(最值得注意的是Oligo3)的对照反应用于确定切割是由于Oligo8和Oligo9对Oligo3的杂交。通过凝胶电泳或任选地通过HPLC来定量地确定切割产物的量。

通过引用并入

本文提到的每个出版物和专利文件的整体公开内容就所有目的而言以其整体通过引用并入本文，等同于每个单独的出版物或专利文件被单独引用。

等效物

本发明可包含在其他具体的形式中而不偏离本发明思想或主要特征。前述实施方案因此应被认为关于所有的方面是说明性的，而非限制本文所述的发明。本发明的范围因此由附带的权利要求书指明而非由前述说明指明。属于权利要求书等效物的含义和范围内的任何改变都被本文包括。

序列表

<110>通信探索公司

詹姆斯·M·库尔

劳伦斯·A·哈夫

乔舒亚·A·比特科

李小玉

亚历山大·F·洛瑟博格

拉里·W·麦克劳克林

<120>反转探针及其用途

<130>ENS-004PC

<150>60/677,056

<151>2005-05-03

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>示范性检测探针

<400>1

ctggtggcgt ggaacgccac cagctccaac tac 33

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>示范性切割探针

<400>2

cacaagttta tattcagtc 19

<210>3

<211>80

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>示范性靶标序列

<400>3

attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctggtggcgt 60

a9gcaagagt gccttgacga 80

<210>4

<211>9

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>示范性封闭探针

<400>4

acgccacca 9

<210>5

<211>38

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>示范性检测探针

<400>5

tggagctggt ggcgtggaac gccaccagct ccaactac 38

<210>6

<211>80

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>示范性靶标

<400>6

tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctggtggcgt aggcaagagt gccttgacga 60

tacagctaat tcagaatcat 80

<210>7

<211>17

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>示范性解封闭探针

<400>7

tatcgtcaag g cactct 17

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>oligo8

<400>8

ctggtggcgt ggaacgccac cagtccaact acc 33

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>oligo9

<400>9

acaagtttat attcagtca 19

Claims

1.将核酸探针从靶核酸序列中分离的方法，所述方法包含步骤：

(a)将核酸探针与怀疑含有所述靶核酸序列的样品在下述条件下组合，如果所述样品中存在所述靶核酸，则所述条件允许所述探针与所述靶核酸序列退火，其中所述核酸探针包含化学基团，所述化学基团被修饰或去除时允许所述核酸探针或其片段形成发夹结构并从所述复合物解离；和

(b)提供能够修饰或去除所述化学基团的试剂，从而如果所述样品中存在复合物，则所述核酸探针或其片段形成发夹结构并从所述复合物解离。

2.权利要求1的方法，其包含检测步骤(b)所产生的、指示所述复合物存在的产物，从而测定所述样品中是否存在所述靶核酸的额外步骤。

3.权利要求1的方法，其中所述发夹结构含有一个茎。

4.权利要求1、2或3任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述试剂去除所述化学基团。

5.权利要求1、2或3任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述试剂修饰化学基团。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中核酸探针在所述化学基团附近被切割。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述核酸探针包含一个被屏蔽的巯基键。

8.权利要求7的方法，其中所述核酸探针包含一个被含二硫键基团屏蔽的巯基键。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述试剂包含与所述靶核酸序列互补的核酸序列。

10.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述试剂与能够与所述靶核酸序列退火的第二核酸序列连接，使得当所述第二核酸序列与所述靶核酸序列退火时，所述试剂修饰或去除所述核酸探针中含有的所述化学基团。

11.权利要求10的方法，其中第二核酸序列与所述靶核酸序列的第一位置退火，所述核酸探针在靶核酸序列的第二位置退火。

12.权利要求11的方法，其中所述第一和第二位置彼此相邻。

13.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述试剂包含与所述核酸探针互补的核酸序列。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述试剂包含选自以下试剂组的试剂：金属、还原剂、螯合剂、亲核体、亲核化合物、亲电体、亲电化合物、催化肽、催化小分子、蛋白酶、核酶或诱导化学转化的蛋白质。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述化学基团选自碱基、经修饰的碱基、寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、核苷酸间键、经修饰的核苷酸间键、保护性基团、肽、蛋白质、多聚体、珠和纳米粒子。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述核酸探针还包含可检测的标签。

17.权利要求16的方法，其中步骤(b)中所述化学基团的修饰或去除引起所述可检测的标签产生可检测的信号。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述核酸探针或所述靶核酸与一配体偶联。

19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述化学基团是含硫的核苷酸间键。

20.检测样品中靶核酸序列存在与否的方法，所述方法包含步骤：

(a)将能够与所述靶核酸序列退火形成复合物的核酸探针与怀疑含有所述靶核酸序列的样品组合，其中所述核酸探针包含化学基团，所述化学基团被修饰或去除时允许所述核酸探针或其片段形成发夹结构并从所述复合物解离；和

(b)提供能够修饰或去除所述化学基团的试剂，从而如果所述样品中存在复合物，则所述核酸探针或其片段形成发夹结构并从所述复合物解离；和

c)检测步骤(b)所产生的、指示所述复合物存在的产物，从而测定所述样品中是否存在所述靶核酸。

21.权利要求20的方法，其中发夹结构包含茎。

22.权利要求20或21的方法，其中在步骤(b)中，所述试剂去除所述化学基团。

23.权利要求20或21的方法，其中在步骤(b)中，所述试剂修饰所述化学基团。

24.权利要求20-23中任一项的方法，其中所述核酸探针在所述化学基团附近被切割。

25.权利要求20-24中任一项的方法，其中所述试剂包含与所述靶核酸序列互补的核酸序列。

26.权利要求20-24中任一项的方法，其中所述试剂与能够与所述靶核酸序列退火的第二核酸序列连接，使得当所述第二核酸序列与所述靶核酸序列退火时，所述试剂修饰或去除所述核酸探针中含有的所述化学基团。

27.权利要求26的方法，其中第二核酸序列与所述靶核酸序列的第一位置退火，所述核酸探针在靶核酸序列的第二位置退火。

28.权利要求27的方法，其中其中所述第一和第二位置彼此相邻。

29.权利要求20-28中任一项的方法，其中所述试剂包含与所述核酸探针互补的核酸序列。

30.权利要求20-29中任一项的方法，其中所述试剂包含选自以下试剂组的试剂：金属、还原剂、螯合剂、亲核体、亲核化合物、亲电体、亲电化合物、催化肽、催化小分子、蛋白酶、核酶或诱导化学转化的蛋白质。

31.权利要求20-30中任一项的方法，其中所述化学基团选自碱基、经修饰的碱基、寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、核苷酸间键、经修饰的核苷酸间键、保护性基团、肽、蛋白质、多聚体、珠和纳米粒子。

32.权利要求20-31中任一项的方法，其中所述核酸探针还包含可检测的标签。

33.权利要求20的方法，其中步骤(b)中所述化学基团的修饰或去除引起所述可检测的标签产生可检测的信号。

34.一种组合物，所述组合物包含能够与靶核酸退火形成复合物的核酸探针，其中所述探针包含

(i)与所述靶核酸互补的核酸序列；

(ii)与所述核酸序列结合的化学基团，其被化学试剂修饰或去除时允许所述探针形成发夹结构并从所述复合物解离；

(iii)与所述核酸序列结合的信号产生基团；和

(iv)任选地，与所述核酸序列结合的信号猝灭剂。

35.权利要求34的组合物，其中所述化学基团位于所述核酸序列中。

36.权利要求35的组合物，其中所述化学基团是化学键。

37.权利要求36的组合物，其中所述化学基团由至少一个原子定义。

38.权利要求34的组合物，其中所述化学基团附着在所述核酸序列上。

39.权利要求38的组合物，其中所述化学基团共价结合所述核酸序列。

40.权利要求34-39中任一项的方法，其中所述化学基团选自碱基、经修饰的碱基、寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、经修饰的核苷酸间键、保护性基团、肽、蛋白质、多聚体、珠和纳米粒子。

41.一种组合物，所述组合物包含靶核酸序列和能够与所述靶核酸序列退火形成复合物的核酸探针，其中所述核酸探针包含化学基团，所述化学基团被修饰或去除时允许所述核酸探针形成发夹结构并从所述复合物解离。

42.权利要求41的组合物，其中所述核酸探针还包含信号产生基团。

43.权利要求41或42的组合物，其中所述核酸探针还包含能够猝灭剂来自可检测标签的信号的猝灭剂。

44.一种扩增指示样品中靶核酸存在的信号的方法，所述方法包含步骤：

(a)将怀疑含有靶核酸的样品与第一核酸探针在下述条件下孵育，如果样品中存在所述靶核酸，则所述条件允许所述第一核酸探针与所述靶核酸退火，其中所述第一核酸探针包含

(i)能够生产可检测事件的信号产生基团和

(ii)与所述靶核酸退火的核苷酸序列；

(b)提供非酶的反转诱导试剂，所述试剂与所述第一核酸探针反应，以促进所述第一核酸探针从所述靶核酸分离并引起可检测的事件；和

(c)当所述第一核酸探针从所述靶核酸分离后，允许第二核酸探针与所述靶核酸结合并产生另一可检测的事件。

45.权利要求44的方法，其中所述信号产生基团共价结合所述靶核酸。

46.权利要求44的方法，其中所述信号产生基团是催化剂。

47.权利要求44的方法，其中所述信号产生基团是发光基团。

48.权利要求44的方法，其中所述可检测的事件是光学事件。

49.权利要求48的方法，其中所述光学事件包括荧光事件。

50.权利要求44的方法，其中反转诱导试剂附着在不同的核苷酸序列上，所述核苷酸序列在所述探针与所述靶核酸退火处附近的位置与所述靶核酸退火。

51.权利要求44的方法，其中反转诱导试剂与所述第一核酸探针反应，引起所述第一核酸探针或其片段产生发夹结构。

52.权利要求51的方法，其中所述可检测事件在发夹形成后发生。

53.权利要求8的方法，其中被屏蔽的含二硫键基团包含图8所示的亚磷酰胺(化合物I)，其中R是线性的或分支的C_1-6烷基基团。

54.权利要求34-43中任一项的组合物，其中所述化学基团包含图8所示的亚磷酰胺(化合物I)，其中R是线性的或分支的C_1-6烷基基团。