ES2247605T3 - Refuerzo de fosfatasa alcalina con la ayuda de sds en sustratos quimioluminiscentes y dosificados de inhibicion de enzimas. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UN METODO DE PREPARACION DE UN CONJUGADO DE SONDA OLIGONUCLEOTIDICA-FOSFATASA ALCALINA, CON ELEVADA ACTIVIDAD ENZIMATICA ESPECIFICA PARA SU UTILIZACION EN ENSAYOS DE HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS. SE DESCRIBEN ASIMISMO METODOS Y COMPOSICIONES PARA INCREMENTAR LA LUMINISCENCIA A PARTIR DE UN 1,2 ON COMPETITIVA DE ACIDO NUCLEICO, QUE EMPLEAN DICHOS METODOS Y COMPOSICIONES.

Description

Refuerzo de fosfatasa alcalina con la ayuda de SDS en sustratos quimioluminiscentes y dosificados de inhibición de enzimas.

Campo técnico

Esta invención se refiere de manera general a ensayos analíticos, en particular a ensayos de hibridación y a la química de ácidos nucleicos. La invención se refiere a métodos para preparar oligonucleótidos marcados que proporcionan una señal con una elevada actividad específica de detección y que generan una señal dependiente de la diana en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos mediante la minimización del ruido de fondo que deriva principalmente de la utilización de una población heterogénea de sondas marcadas. La invención se refiere también a métodos para incrementar la sensibilidad y la rapidez de ensayos analíticos que implican la generación de señales quimioluminiscentes, y a la utilización de tales métodos intensificadores para proporcionar un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos que tiene una señal con una elevada actividad específica de detección y un ruido de fondo mínimo. La invención tiene también aplicaciones en genotipaje, terapéutica con oligonucleótidos antisentido y con aptámeros, análisis de mutaciones y generación de mapas de sondas discontinuas.

Antecedentes

Los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos son utilizados comúnmente en la investigación genética, en la investigación biomédica y en el diagnóstico clínico. En un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos básico, un ácido nucleico analito de hebra sencilla es hibridado con una sonda de ácido nucleico de hebra sencilla marcada y se detectan los dúplices marcados resultantes. Se han desarrollado variaciones de este esquema básico con el fin de incrementar la precisión, facilitar la separación de los dúplices a detectar de los materiales irrelevantes y/o amplificar la señal que es detectada.

Uno de tales ensayos está descrito con detalle en la Patente de EE.UU. Nº 4.868.105 comúnmente asignada a Urdea y col. Ese ensayo implica la utilización de un sistema de captura de dos partes diseñado para unir el analito polinucleotídico a un soporte sólido, y de un sistema de marcaje de dos partes diseñado para unir una marca detectable al analito polinucleotídico que va a ser detectado o cuantificado. El sistema de captura de dos partes implica la utilización de sondas de captura unidas a un soporte sólido y de moléculas extensoras de captura que hibridan con un segmento de las sondas de captura y con un segmento del analito polinucleotídico. El sistema de marcaje de dos partes implica la utilización de moléculas extensoras de marcaje que hibridan con un segmento del analito polinucleotídico y de sondas marcadas que hibridan con las moléculas extensoras de marcaje y contienen, o se unen a, una marca
detectable.

A menudo se utilizan conjugados fosfatasa alcalina-oligonucleótido (ver, por ejemplo, EP 883096976) como el componente generador de una señal de tales ensayos de hibridación. La adición de un sustrato apropiado, por ejemplo un fosfato de dioxetano activado por el enzima (Schaap y col. (1987) Tet. Lett. 28: 1159-1162 y Pub. de EPA Nº 0254051) produce una señal quimioluminiscente detectable. Sin embargo, el nivel de ruido de fondo puede no ser ideal en tales ensayos debido, en parte, a la población heterogénea de moléculas de fosfatasa alcalina disponibles para la conjugación, lo cual contribuye a la unión no específica de sondas marcadas. Proporciones bajas de señal respecto a ruido pueden ser también el resultado de la preparación de sondas marcadas con fosfatasa alcalina mediante la conjugación de oligonucleótidos al enzima bajo condiciones que permitan la conjugación a sitios reactivos en o cerca del sitio activo del enzima, reduciendo de este modo la actividad enzimática específica de la fosfatasa alcalina.

La fosfatasa alcalina se obtiene típicamente de mucosa intestinal bovina o de ternera. Puede obtenerse una fosfatasa alcalina altamente purificada en un proceso de cuatro etapas que produce fracciones hidrofílicas e hidrofóbicas del enzima (Bublitz y col. (1993) Eur. J. Biochem. 217:199-207).

La fosfatasa alcalina intestinal bovina o de ternera puede ser separada en cinco fracciones que corresponden a (I) un dímero sin anclaje, (II) un tetrámero con cuatro moléculas de anclaje de glucosilfosfatidilinositol, (III) un tetrámero como el de (II) con dos ácidos grasos adicionales unidos a inositol en una mitad del tetrámero, (IV) un octámero con dos moléculas de ácido graso por subunidad de fosfatasa alcalina y (V) un octámero con tres moléculas de ácido graso por subunidad de fosfatasa alcalina (Bublitz y col., supra). De este modo, el número de subunidades de fosfatasa alcalina, la ausencia o presencia de moléculas de anclaje de glucosilfosfatidilinositol y la ausencia o presencia de varias moléculas de ácido graso por subunidad, contribuyen a la heterogeneidad de la población de fosfatasas alcalinas utilizada típicamente para preparar sondas oligonucleotídicas marcadas. Se cree que el carácter hidrofóbico de las moléculas de anclaje de glucosilfosfatidilinositol y de los residuos de ácido graso en las fracciones (II) a (V), contribuye al ruido de fondo en los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos.

El ruido de fondo no deseado puede resultar de la utilización de un conjugado fosfatasa alcalina-oligonucleótido preparado bajo condiciones en las que se forman conjugados en varios lugares del enzima, incluyendo el sitio activo del enzima. Esta fuente de heterogeneidad en la población de conjugados enzima-sonda tiene como resultado una sonda de marcaje con una actividad enzimática específica menos que ideal.

La falta de una población homogénea de sondas oligonucleotídicas marcadas de forma detectable con una elevada actividad específica de detección puede limitar la sensibilidad y la precisión de los ensayos típicos de hibridación de ácidos nucleicos.

Además, aunque la utilización de sustratos tales como dioxetanos quimioluminiscentes proporciona un medio muy sensible de detección en métodos de ensayos ligados a enzimas, la sensibilidad y la velocidad de tales ensayos pueden ser incrementadas por la utilización de surfactantes dicatiónicos según está descrito en la Publicación de EPA Nº 0630884. Tales surfactantes incrementan la quimioluminiscencia producida por la descomposición de compuestos quimioluminiscentes, por ejemplo, 1,2-dioxetanos activados por agentes activadores tales como enzimas. Otros intensificadores con efectos similares son los surfactantes policatiónicos según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.145.772. Estos intensificadores policatiónicos son sales de amonio cuaternario poliméricas tales como poli(cloruro de vinilbenciltrimetilamonio).

Los expertos en la técnica reconocerán que mejoras adicionales de la intensidad lumínica detectable producida por la quimioluminiscencia del dioxetano activado químicamente proporcionarán ventajas adicionales a los ensayos que utilizan estos procesos.

EP-A-0 417 841 describe un método para preparar un conjugado covalente de un oligonucleótido y un enzima, tal como peroxidasa. Este conjugado puede ser utilizado como sonda en ensayos de hibridación y en procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa. El método comprende de manera general las etapas de: reacción de un enzima que tenga un grupo amino reactivo con un compuesto orgánico mercaptosustituido para formar un producto intermedio bloqueado, la eliminación del grupo bloqueante para formar un reactivo enzimático y la reacción del reactivo enzimático con un reactivo oligonucleotídico funcionalizado.

US-A-5.254.469 describe un conjugado covalente de un enzima, tal como peroxidasa, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa, y un oligonucleótido. El conjugado puede ser utilizado como sonda en ensayos de hibridación y en procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa.

US-A-0 317 077 describe multímeros oligonucleotídicos lineales o ramificados útiles como amplificadores en ensayos bioquímicos que comprenden (1) al menos una primera unidad oligonucleotídica de hebra sencilla que es complementaria a una secuencia oligonucleotídica de hebra sencilla de interés, y (2) una multiplicidad de segundas unidades oligonucleotídicas de hebra sencilla que son complementarias a un oligonucleótido de hebra sencilla marcado. Se muestran ejemplos de ensayos de hibridación de ácidos nucleicos de tipo sándwich amplificados y de inmunoensayos amplificados que utilizan los multímeros.

Resumen de la invención

Se proporcionan métodos para detectar analitos ácido nucleico en una muestra. En general, los métodos implican un ensayo de hibridación en fase de solución en un formato de ensayo indirecto competitivo que permite la regulación de las condiciones de hibridación, incrementando de este modo la sensibilidad y la especificidad del ensayo.

Se proporcionan también composiciones y métodos para intensificar la quimioluminiscencia de una molécula que es capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente. Se proporcionan también métodos de ensayo para detectar analitos ácido nucleico en una muestra utilizando estas composiciones y métodos. En general, las composiciones incluyen intensificadores de quimioluminiscencia aniónicos hidrofóbicos y los métodos implican la provisión de tales intensificadores en un ensayo o en una técnica analítica en los que se genere una señal quimioluminiscente, incrementando de este modo la sensibilidad y la especificidad del ensayo. Además, los métodos para detectar analitos ácido nucleico en una muestra implican un ensayo de hibridación en fase sólida en un formato de ensayo indirecto, competitivo, que permite la regulación de las condiciones hibridación, intensificando de este modo la sensibilidad y la especificidad del ensayo.

Se describe un método para intensificar la quimioluminiscencia de una molécula que es capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente. El método implica la provisión de una molécula que sea capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente, de un surfactante dicatiónico o policatiónico y de un intensificador aniónico hidrofóbico, y la activación de la molécula.

También se describe en la presente una composición que incluye una molécula que es capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente, un surfactante dicatiónico o policatiónico y un intensificador aniónico hidrofóbico.

Es un objeto de la invención el proporcionar un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos competitivo, indirecto, en el que se utilizan moléculas "extensoras de captura", que se unen a moléculas "extensoras de marcaje" que a su vez se unen a sondas de marcaje que tienen unidas a las mismas una marca detectable que es capaz de generar una señal quimioluminiscente por la activación de una molécula que es capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente. En un formato preferido, los extensores de captura son sondas puente que se unen a "sondas de captura" unidas a un soporte así como a extensores de marcaje y a una secuencia de nucleótidos diana en un analito, y las moléculas extensoras de marcaje son sondas puente que se unen al extensor de captura así como a "sondas de marcaje", esto es, segmentos oligonucleotídicos que tienen unida a los mismos una marca detectable que es capaz de generar una señal quimioluminiscente por la activación de un 1,2-dioxetano estable. En un formato alternativo, los extensores de marcaje son sondas puente que se unen a sondas de marcaje así como a extensores de captura y a una secuencia de nucleótidos diana en un analito, y las moléculas extensoras de captura son sondas puente que se unen a las moléculas extensoras de marcaje así como a las sondas de captura.

Es un objeto adicional de la invención proporcionar una población homogénea de sondas de marcaje y métodos para su preparación. En una realización de la invención, tales sondas de marcaje son incorporadas al nuevo formato de ensayo descrito y reivindicado en la presente. Tales sondas de marcaje tienen una actividad enzimática específica incrementada y generan una detección incrementada de la señal del ensayo. Un objeto más es proporcionar formatos de ensayo con una sensibilidad y una selectividad incrementadas para la detección del analito, que incorporan sondas de marcaje de una única forma molecular que tienen una actividad enzimática específica incrementada y generan una detección incrementada de la señal del ensayo. Las sondas de marcaje son preparadas mediante un método que implica la purificación de fosfatasa alcalina hidrofílica sin anclaje, la conjugación del enzima a una sonda oligonucleotídica bajo condiciones en las cuales el sitio activo del enzima está protegido de la conjugación y la conjugación del oligonucleótido al enzima está dirigida a un sitio, y la purificación posterior de la sonda de marcaje así preparada.

Se describe en la presente un método para intensificar la quimioluminiscencia generada a partir de un 1,2-dioxetano estable mediante la provisión de un dioxetano, un surfactante dicatiónico o policatiónico y un intensificador aniónico hidrofóbico que tiene la fórmula R^{1}X^{-}A^{+}, en la que R^{1} es un grupo hidrofóbico que puede ser un resto hidrocarburo sustituido o no sustituido seleccionado del grupo que consta de alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y aralquilo, X^{-} es un resto aniónico unido covalentemente al resto R^{1} y A^{+} es un contracatión.

También se describe en la presente una composición que contiene un 1,2-dioxetano estable, un surfactante dicatiónico o policatiónico y un intensificador aniónico hidrofóbico que tiene la fórmula R^{1}X^{-}A^{+}, en la que R^{1} es un grupo hidrofóbico que puede ser un resto hidrocarburo sustituido o no sustituido seleccionado del grupo que consta de alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y aralquilo, X^{-} es un resto aniónico unido covalentemente al resto R^{1} y A^{+} es un contracatión.

En un formato de ensayo, una muestra que contiene, o que se sospecha que contiene, un analito que tiene una secuencia de nucleótido diana es incubada primeramente con un complejo híbrido sonda de captura unida a un soporte/extensor de captura bajo condiciones para una primera hibridación. La mezcla de reacción así producida, que contiene híbridos sonda de captura/extensor de captura sin formar complejos y complejos sonda de captura/extensor de captura/analito, es incubada posteriormente con moléculas del extensor de marcaje y de la sonda de marcaje bajo condiciones para una segunda hibridación. Los complejos formados entre los híbridos sonda de captura/extensor de captura no acomplejados y los híbridos extensor de marcaje/sonda de marcaje son posteriormente detectados mediante métodos estándar o mediante detección de la quimioluminiscencia utilizando el método y la composición anteriormente descritos para intensificar la quimioluminiscencia. La cantidad de señal detectada es inversamente proporcional a la cantidad de analito presente en la muestra.

En otro formato de ensayo, una muestra que contiene, o es sospechosa de contener, un analito con una secuencia de nucleótidos diana es incubada con complejos híbridos sonda de marcaje/extensor de marcaje bajo condiciones para una primera hibridación. La mezcla de reacción así producida que contiene híbridos sonda de marcaje/extensor de marcaje no acomplejados y complejos sonda de marcaje/extensor de marcaje/analito, es posteriormente incubada con un extensor de captura y con moléculas de sonda de captura unidas a un soporte bajo condiciones para una segunda hibridación. Los complejos formados entre los híbridos sonda de marcaje/extensor de marcaje no acomplejados y los híbridos extensor de captura/sonda de captura, son detectados posteriormente mediante métodos estándar o mediante la utilización del método y la composición anteriormente descritos para intensificar la quimioluminiscencia. La cantidad de señal detectada es inversamente proporcional a la cantidad de analito presente en la muestra.

De acuerdo con la invención, se proporciona por tanto una sonda de marcaje que comprende una fosfatasa alcalina hidrofílica purificada conjugada a una sonda oligonucleotídica.

La invención proporciona también:

- un método para preparar una sonda de marcaje de la invención que comprende:

(a) la provisión de una fosfatasa alcalina hidrofílica purificada y

(b) la conjugación de la fosfatasa alcalina hidrofóbica con una sonda oligonucleotídica.

- un método para detectar un oligonucleótido diana en una muestra, que comprende:

(a) la provisión de una sonda de captura (CP) unida a un soporte que contiene una región que tiene una secuencia de ácido nucleico C-3;

(b) la provisión de una sonda de marcaje (LP) que contiene una región que tiene una secuencia de ácido nucleico L-3, donde la sonda de marcaje de la invención contiene un resto de marcaje que es capaz de generar una señal detectable;

(c) la provisión de un extensor de marcaje (LE) que contiene una región que tiene una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico, donde la primera secuencia de ácido nucleico L-2 del LE es complementaria a la secuencia de ácido nucleico L-3 y la segunda secuencia de ácido nucleico L-1 del LE es complementaria a una secuencia de ácido nucleico del analito diana;

(d) la provisión de un extensor de captura (CE) que comprende una región que tiene una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico, donde la primera secuencia de ácido nucleico C-2 del CE es complementaria a la secuencia de ácido nucleico C-3 y la segunda secuencia de ácido nucleico C-1 del CE es complementaria a la segunda secuencia de ácido nucleico L-1 del LE;

(e) la incubación de la muestra con el LE y con la LP bajo condiciones para una primera hibridación con el fin de formar una primera mezcla de reacción que contiene un complejo híbrido LP/LE/diana y un complejo híbrido LP/LE no unido;

(f) la incubación de la primera mezcla de reacción con la superficie de un soporte sólido que contiene un complejo híbrido CE/CP unido a la superficie bajo condiciones para una segunda hibridación, formándose de este modo una segunda mezcla de reacción que contiene un complejo híbrido LP/LE/diana/CE/CP unido a la superficie y un complejo LP/LE/diana no unido;

(g) la separación posterior de los materiales no unidos al soporte sólido de los unidos al soporte sólido y

(h) la detección de la presencia de marca en el complejo híbrido LP/LE/diana/CE/CP unido al soporte; y

- un método para detectar un oligonucleótido diana en una muestra, que comprende:

(a) la provisión de una sonda de captura (CP) unida a un soporte que contiene una región que tiene una secuencia de ácido nucleico C-3;

(b) la provisión de sonda de marcaje (LP) que comprende una región que tiene una secuencia de ácido nucleico L-3, donde la sonda de marcaje de la invención contiene un resto de marcaje que es capaz de generar una señal detectable;

(c) la provisión de un extensor de captura (CE) que comprende una región que tiene una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico, donde la primera secuencia de ácido nucleico C-2 del CE es complementaria a la secuencia de ácido nucleico C-3 y la segunda secuencia de ácido nucleico C-1 del CE es complementaria a una secuencia de ácido nucleico del analito diana;

(d) la provisión de un extensor de marcaje (LE) que comprende una región que tiene una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico, donde la primera secuencia de ácido nucleico L-2 del LE es complementaria a la secuencia de ácido nucleico L-3 y la segunda secuencia de ácido nucleico L-1 del LE es complementaria a la segunda secuencia de ácido nucleico C-1 del CE;

(e) la incubación de la muestra con el CE y la CP bajo condiciones para una primera hibridación con el fin de formar una primera mezcla de reacción conteniendo complejos híbridos CP/CE/diana y complejos híbridos CP/CE no unidos;

(f) la incubación de la primera mezcla de reacción con un complejo híbrido LE/LP bajo condiciones para una segunda hibridación, formándose de este modo una segunda mezcla de reacción que contiene un complejo híbrido LP/LE/diana/CE/CP unido a la superficie y un complejo LP/LE no unido;

(g) la separación posterior de los materiales no unidos al soporte sólido de los unidos al soporte sólido; y

(h) la detección de la presencia de marca en el complejo híbrido LP/LE/diana/CE/CP unido al soporte.

Objetos adicionales, ventajas y nuevas características de la invención serán presentados en parte en la descripción que sigue, y en parte serán obvios para las personas expertas en la técnica después del examen de lo siguiente, o pueden ser aprendidos mediante la práctica de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 es un diagrama de un formato de ensayo de hibridación de sándwich en fase de solución, indirecto, competitivo, en el cual una muestra es incubada primeramente con un complejo híbrido sonda de marcaje/extensor de marcaje.

La Fig. 2 ilustra un ensayo de hibridación de sándwich en fase de solución, indirecto, competitivo, en el que una muestra es incubada primeramente con un complejo híbrido sonda de captura/extensor de captura unido a un soporte.

La Fig. 3 es una gráfica que ilustra la variación a lo largo del tiempo del desarrollo de la señal quimioluminiscente generada en ausencia (triángulos rellenos) o presencia (cuadrados rellenos) del intensificador aniónico hidrofóbico dodecil sulfato de sodio en un ensayo con fosfatasa alcalina soluble.

La Fig. 4A es una gráfica que representa el efecto del intensificador aniónico hidrofóbico dodecil sulfato de sodio sobre la quimioluminiscencia de fondo generada en ausencia (triángulos rellenos) o presencia (cuadrados rellenos) del intensificador en un ensayo con fosfatasa alcalina soluble. La Fig. 4B es una gráfica que muestra el efecto del dodecil sulfato de sodio sobre la quimioluminiscencia generada en ausencia (triángulos rellenos) y presencia (cuadrados rellenos) de fosfatasa alcalina soluble. En la Fig. 4B los datos están representados gráficamente en escala log.

La Fig. 5 es una gráfica que muestra el efecto de la concentración de dodecil sulfato de sodio (cuadrados rellenos) y de Brij-35 (triángulos rellenos) sobre la quimioluminiscencia generada en un ensayo con fosfatasa alcalina soluble en el que la fosfatasa alcalina está conjugada a una sonda oligonucleotídica.

Descripción detallada de la invención Definiciones y nomenclatura

Antes de que la presente invención sea desvelada y descrita con detalle, debe comprenderse que esta invención no está limitada a formatos de ensayo, materiales o reactivos específicos, ya que éstos pueden, por supuesto, variar. Debe comprenderse también que la terminología utilizada en la presente tiene la finalidad de describir solamente realizaciones particulares y no tiene la intención de ser limitante.

Debe señalarse que, según se utilizan en la especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el", y "la", incluyen los referentes plurales a no ser que el contexto lo indique claramente de otro modo. Así, por ejemplo, una referencia a "un grupo hidrofóbico" incluye dos o más de tales grupos hidrofóbicos, la referencia a "un extensor de marcaje" incluye mezclas de tales moléculas, la referencia a "una secuencia de nucleótidos diana" incluye mezclas de dos o más de tales secuencias, y similares.

En esta especificación y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a varios términos que serán definidos con los significados siguientes:

Según son utilizados en la presente, los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" serán genéricos para polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), para polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), para cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N-glucósido de una base purínica o pirimidínica, y para otros polímeros que contengan esqueletos no nucleotídicos (por ejemplo, ácidos nucleicos proteicos y polímeros de ácidos nucleicos sintéticos específicos de una secuencia comercialmente disponibles en el Anti-Gene Development Group, Corvallis, Oregon, como polímeros Neugene\hat{O}), siempre que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita el apareamiento de bases y el apilamiento de bases, según se encuentran en el ADN y en el ARN. No se pretende hacer una distinción en longitud entre el término "polinucleótido" y "oligonucleótido", y estos términos serán utilizados indistintamente. Estos términos se refieren únicamente a la estructura primaria de la molécula. Por tanto, estos términos incluyen ADN de doble hebra y de hebra sencilla, así como ARN de doble hebra y de hebra sencilla e híbridos ADN:ARN, e incluyen también tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo marcas que son conocidas en la técnica, metilación, "casquetes", sustitución de uno o más de los nucleótidos que existen de forma natural por un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, las que tienen enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.) y las que tienen enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquéllas que contienen restos colgantes tales como, por ejemplo, proteínas (incluyendo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquéllas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralén, etc.), las que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), las que contienen alquilantes, las que tienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como las formas no modificadas del polinucleótido u oligonucleótido.

Se apreciará que, según son utilizados en la presente, los términos "nucleósido" y "nucleótido" incluirán aquellos restos que contengan no sólo las bases purínicas y pirimidínicas conocidas, sino también otras bases heterocíclicas que hayan sido modificadas. Tales modificaciones incluyen purinas o pirimidinas metiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros heterociclos. Los nucleósidos o nucleótidos modificados incluirán también modificaciones en el resto azúcar, por ejemplo, cuando uno o más de los grupos hidroxilo estén sustituidos por halógenos, por grupos alifáticos, o estén funcionalizados como éteres, aminas, o similares.

El término "analito polinucleotídico" se refiere a una molécula de ácido nucleico de hebra sencilla o de doble hebra que contiene una secuencia de nucleótidos diana. Los ácidos nucleicos analito pueden proceder de una variedad de fuentes, por ejemplo de fluidos o sólidos biológicos, de productos alimenticios, de materiales ambientales, etc., y pueden ser preparados para el análisis de hibridación mediante una variedad de medios, por ejemplo, proteinasa K/dodecil sulfato de sodio ("SDS"), sales caotrópicas o similares. El término "analito polinucleotídico" es utilizado en la presente indistintamente con los términos "analito", "ácido nucleico analito", "diana" y "molécula diana".

Según se utiliza en la presente, el término "región diana", "secuencia diana" o "secuencia de nucleótidos diana" se refiere a una región contenida en la molécula diana que se une a una sonda. El término "secuencia diana" se refiere a una secuencia con la cual una sonda formará un híbrido estable bajo las condiciones deseadas.

Según se utiliza en la presente, el término "sonda" se refiere a una estructura compuesta por un polinucleótido, según se definió anteriormente, que contiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos presente en la molécula diana. Las regiones polinucleotídicas de las sondas pueden estar compuestas por ADN y/o ARN y/o análogos sintéticos de nucleótidos.

Se apreciará que las secuencias de unión no necesitan tener una complementariedad perfecta para proporcionar híbridos estables. En muchas situaciones, se formarán híbridos estables cuando menos del 10% aproximadamente de las bases estén desacopladas, ignorando los bucles de cuatro o más nucleótidos. Por consiguiente, según se utiliza en la presente, el término "complementario" se refiere a un oligonucleótido que forma una doble hélice estable con su "complemento" bajo condiciones de ensayo, generalmente cuando hay un 90% aproximadamente o más de homología. Típicamente, tales secuencias de unión complementarias contendrán aproximadamente de 15 a 50 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 30.

Los polinucleótidos de la invención pueden ser ensamblados utilizando una combinación de síntesis oligonucleotídica directa en fase sólida y métodos de ligadura enzimáticos, según está descrito con detalle en la Publicación PCT Nº WO92/02526.

Un "agente protector del sitio activo de la fosfatasa alcalina" se refiere a un compuesto que se une a la fosfatasa alcalina en el sitio activo, protegiendo de este modo a los aminoácidos contenidos en el sitio activo de una modificación química. Tales agentes protectores del sitio activo de la fosfatasa alcalina pueden ser sustratos de la fosfatasa alcalina tales como fosfato, análogos de sustratos tales como ácidos fosfónicos y compuestos de ácido arsónico, que son análogos de fosfato, u otros inhibidores de la fosfatasa alcalina. Los agentes protectores del sitio activo de la fosfatasa alcalina preferidos son inhibidores competitivos u otros compuestos que tengan una afinidad de unión reversible por el sitio activo del enzima.

Según se utiliza en la presente, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de un tejido o fluido aislado de un individuo, incluyendo pero sin limitarse a, por ejemplo, plasma, suero, fluido espinal, semen, fluido linfático, las secciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos y también muestras de constituyentes de un cultivo celular in vitro (incluyendo, pero sin limitarse a, medio condicionado resultante del crecimiento de células en un medio de cultivo, células supuestamente infectadas con un virus, células recombinantes y componentes celulares). Las utilizaciones preferidas del presente método están en la detección y/o cuantificación de polinucleótidos que codifican antígenos víricos, tales como antígenos del virus de la hepatitis B ("VHB"), el virus de la hepatitis C ("VHC"), el virus de la hepatitis D ("VHD"), el virus de la inmunodeficiencia humana ("VIH") y la familia de virus herpes, incluyendo el virus del herpes zóster (varicela), el virus del herpes simple I y II, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr y el recientemente aislado virus Herpes VI, y de polinucleótidos que codifican productos celulares tales como citoquinas.

Según se utiliza en la presente, el término "unión no específica" es utilizado para referirse a aquéllos acontecimientos en los que un polinucleótido se une al soporte sólido, o a otro componente del ensayo, mediante una interacción -que puede ser directa o indirecta- que no implica la formación de enlaces de hidrógeno con los polinucleótidos unidos al soporte.

Por "purificada" u "homogénea" se indica, cuando se hace referencia a una secuencia polipeptídica o de nucleótidos, que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "purificada" u "homogénea" según se utiliza en la presente indica preferiblemente al menos un 90% en peso, más preferiblemente al menos un 95% en peso y muy preferiblemente al menos un 98% en peso, de macromoléculas biológicas del mismo tipo presentes. Así, una "forma molecular singular" de un oligonucleótido, un polipéptido o un conjugado oligonucleótido-polipéptido es una molécula que está presente en forma purificada u homogénea.

Una "población uniforme de sitios" para una fosfatasa alcalina conjugada a un oligonucleótido significa que un 50%, preferiblemente un 75%, más preferiblemente un 80% y todavía más preferiblemente un 90% del oligonucleótido puede ser encontrado en n fragmentos trípticos. Por ejemplo, una población uniforme de sitios para una fosfatasa alcalina conjugada con un único oligonucleótido está indicada por un único fragmento tríptico de la fosfatasa alcalina conjugada que contiene el oligonucleótido.

Por el término fosfatasa alcalina "con una elevada actividad enzimática específica" se indica una actividad enzimática de al menos 2.000 a 3.000 unidades por mg de proteína enzimática aproximadamente. Una unidad de actividad representa la cantidad de enzima capaz de catalizar la conversión de 1 mmol de p-nitrofenil fosfato en p-nitrofenol por minuto en dietanolamina 1 M/HCl, pH 9,8.

El término "1,2-dioxetano estable" tiene la intención de incluir compuestos dioxetano que requieren la aplicación de calor para su descomposición en dos productos cetónicos. La quimioluminiscencia es "activada" cuando la descomposición de un 1,2-dioxetano estable, que produciría por lo demás quimioluminiscencia después de la descomposición térmica, es llevada a cabo por un proceso que no requiere la utilización de calor. Así, la quimioluminiscencia del 1,2-dioxetano puede ser activada por la adición de una base en un solvente orgánico, por iones fluoruro o por la acción de un enzima, tal como fosfatasa alcalina, para convertir catalíticamente el 1,2-dioxetano en una especie quimioluminiscente.

El término "alcohol", según es utilizado en la presente, se refiere a alcoholes primarios, secundarios o terciarios, carbinoles y alcoholes polihídricos en los que los grupos sustituyentes son cadenas de hidrocarburos saturados o no saturados, ramificados o no ramificados, que contienen de 1 a 24 átomos de carbono. El término "alcohol inferior" indica un alcohol con un grupo sustituyente de 1 a 6 átomos de carbono. Los alcoholes preferidos son alcoholes inferiores primarios que contienen un grupo sustituyente hidrocarburo saturado no ramificado.

El término "alquilo" según se utiliza en la presente, se refiere a un grupo hidrocarburo saturado ramificado o no ramificado de 1 a 20 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, octilo, decilo, tetradecilo, hexadecilo, eicosilo y similares. Los grupos alquilo preferidos en la presente contienen de 1 a 12 átomos de carbono. El término "alquilo inferior" indica un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono. El término "cicloalquilo" indica un grupo alquilo cíclico, típicamente de 3 a 6 átomos de carbono, más preferiblemente de 4 a 5 átomos de carbono.

El término "alquileno", según se utiliza en la presente, se refiere a una cadena de hidrocarburo ramificado o no ramificado saturado bifuncional que contiene de 1 a 20 átomos de carbono e incluye, por ejemplo, metileno (-CH_{2})-,
etileno (-CH_{2}-CH_{2}-), propileno (-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-), 2-metilpropileno [-CH_{2}-CH(CH_{3})-CH_{2}-], hexileno [-(CH_{2})_{6}-] y similares. "Alquileno inferior" se refiere a un grupo alquileno de 1 a 6, más preferiblemente de 1 a 4, átomos de carbono.

Los términos "alquenilo" y "alquenileno" se refieren, respectivamente, a una cadena de hidrocarburo ramificada o no ramificada, monofuncional y bifuncional, que contiene de 2 a 24 átomos de carbono y al menos un doble enlace. "Alquenileno inferior" se refiere a un grupo alquenileno de 2 a 6, más preferiblemente de 2 a 5, átomos de carbono.

Los términos "alquinilo" y "alquinileno" se refieren, respectivamente, a una cadena de hidrocarburo ramificado o no ramificado, monofuncional y bifuncional, que contiene de 2 a 20 átomos de carbono y al menos un triple enlace. "Alquenileno inferior" se refiere a un grupo alquenileno de 2 a 6, más preferiblemente de 2 a 5, átomos de carbono.

El término "arilo", según se utiliza en la presente, se refiere a una especie aromática que contiene de 1 a 5 anillos aromáticos, no sustituidos o sustituidos con 1 o más sustituyentes seleccionados típicamente del grupo que consta de alquileno, alquenileno y alquinileno. El término "aralquilo" indica un resto que contiene especies alquilo y arilo, conteniendo típicamente menos de 20 átomos de carbono aproximadamente y más típicamente menos de 12 átomos de carbono aproximadamente en el segmento alquilo del resto, y conteniendo típicamente de 1 a 5 anillos aromáticos. El término "aralquilo" será utilizado normalmente para hacer referencia a grupos alquilo sustituidos con arilo. El término "aralquileno" será utilizado de manera similar para hacer referencia a restos que contienen especies de alquileno y arilo, conteniendo típicamente menos de 20 átomos de carbono aproximadamente en la porción alquileno y de 1 a 5 anillos aromáticos en la porción arilo, y típicamente a un alquileno sustituido con arilo.

"Opcional" u "opcionalmente" significa que el acontecimiento o la circunstancia descritos posteriormente pueden tener lugar o no, y que la descripción incluye casos en los que dicho evento o circunstancia tienen lugar y casos en los que no tienen lugar. Por ejemplo, la frase "lavado opcionalmente" significa que puede tener lugar o no una etapa de lavado y que la descripción del método incluye el proceder con o sin una etapa de lavado.

Con referencia ahora a las realizaciones preferidas representadas en la Fig. 1 y en la Fig. 2, los términos siguientes son aplicables al ensayo de hibridación representado en las mismas.

Las "sondas marcadas (LPs)" son diseñadas para que se unan a un extensor de marcaje y contienen un resto de marcaje que es capaz de generar una señal detectable. Se han descrito en la literatura varios medios para proporcionar marcas unidas a una secuencia de ácido nucleico. Ver, por ejemplo: Leary y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045; Renz y col. (1984) Nucl. Acids Res. 12:3435; Richardson y col. (1983) Nucl. Acids Res. 11:6167; Smith y col. (1985) Nucl. Acids Res. 13:2399; Meinkoth y col. (1984) Anal. Biochem. 138:267; Klibanov y col. (1989) Applied Biochem. Biotechnol. 22:45; Grumbach y col. (1991) J. Immunol. Meth. 140:205; Forgac y col. (1992) Chemicke Listy 86:253; Sehgal y col. (1994) Anal. Biochem. 218:87 y Lewis y col. (1994) Bioconjugate Chem. 5:565. Las marcas pueden ser unidas covalentemente o no covalentemente (por ejemplo, iónicamente o a través de complejo de alta afinidad tal como un enlace biotina-avidina) a la secuencia complementaria. Las marcas que pueden ser empleadas incluyen radionúclidos, sustancias fluorescentes, quimioluminiscentes, colorantes, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, subunidades enzimáticas, iones metálicos y similares. Marcas específicas ilustrativas incluyen fluoresceína, rodamina, Rojo Texas, ficoeritrina, umbeliferona, luminol, NADPH, a-b-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.

Dependiendo de la naturaleza de la marca, pueden emplearse varias técnicas para detectar la presencia de la marca. Para los agentes fluorescentes, están disponibles un gran número de diferentes fluorímetros. Para los quimioluminiscentes, están disponibles luminómetros o películas. Con los enzimas, puede proporcionarse un producto fluorescente, quimioluminiscente o coloreado y ser determinado fluorimétricamente, luminométricamente, espectrofotométricamente o visualmente. Las diferentes marcas que han sido empleadas en inmunoensayos y las técnicas aplicables a inmunoensayos pueden ser empleadas con los presentes ensayos.

Un resto de marcaje preferido es fosfatasa alcalina. Los métodos para utilizar un sustrato de fosfatasa alcalina con fosfatasa alcalina como resto de marcaje son conocidos en el oficio (Schaap y col., Tet. Lett. 28:1159-1162 (1987) y Pub. de EPA Nº 0254051).

Las LPs contienen una región que tiene una secuencia de ácido nucleico L-3 complementaria a una secuencia de ácido nucleico L-2 presente en un extensor de marcaje y están unidas a, o estructuradas para que se unan a, una marca que proporciona directamente o indirectamente una señal detectable. La secuencia L-3 está diseñada para que sea complementaria solamente a L-2 y viceversa, y no a ninguna secuencia de cualquier otro componente del sistema de ensayo. La LP puede tener regiones no complementarias adicionales, tales como regiones separadoras que flanqueen la secuencia L-3.

Las "moléculas extensoras de la sonda de marcaje (LEs)", referidas también en la presente como "moléculas extensoras de marcaje" o "extensores de marcaje", contienen regiones de complementariedad con respecto al polinucleótido analito y/o, dependiendo del formato de ensayo, al extensor de captura (L-1) y a la sonda de marcaje (L-2). Por tanto, las moléculas extensoras de marcaje son cadenas polinucleotídicas de hebra sencilla que contienen una primera región con una secuencia de ácido nucleico L-1 complementaria a una secuencia del polinucleótido analito y/o a una secuencia del extensor de captura, y una segunda región que tiene una secuencia L-2 de reconocimiento de la sonda de marcaje complementaria a un segmento L-3 de la sonda de marcaje. El LE puede tener regiones no complementarias adicionales tales como una región separadora entre L-1 y L-2.

Dependiendo del formato de ensayo, "las moléculas extensoras de la sonda de captura (CEs)", referidas también en la presente como "moléculas extensoras de captura" o "extensores de captura", se unen al polinucleótido analito y/o a la molécula extensora de marcaje y a las sondas de captura (CPs), que están a su vez unidas a un soporte sólido. Por tanto, las moléculas extensoras de captura son cadenas polinucleotídicas de hebra sencilla que contienen una primera región que tiene una secuencia de ácido nucleico C-1 que es complementaria a una secuencia del analito o a una secuencia del extensor de marcaje, y una segunda región no complementaria que tiene una secuencia C-2 de reconocimiento de la sonda de captura. El CE puede tener regiones no complementarias adicionales tales como una región separadora entre C-1 y C-2.

En los formatos de ensayos descritos y reivindicados en la presente, se utilizará una secuencia de ácido nucleico L-1 o C-1 que sea complementaria a una secuencia de ácido nucleico del analito, pero no ambas. En cualquiera de los formatos, L-1 y C-1 son secuencias de ácido nucleico complementarias.

Las "sondas de captura (CPs)" se unen a los extensores de captura y a un soporte sólido. Así, según está ilustrado en la Fig. 1 y en la Fig. 2, las sondas de captura contienen una primera región que tiene una secuencia de ácido nucleico C-3 complementaria a C-2 y una segunda región mediante la cual las CPs se unen covalentemente a (o son capaces de ser unidas covalentemente a) un soporte sólido. La secuencia C-3 está diseñada para que sea complementaria solamente a C-2, y viceversa, y no a ninguna secuencia de cualquier otro componente del sistema de ensayo. Las CPs pueden tener regiones no complementarias adicionales tales como regiones separadoras flanqueantes de la secuencia C-2. Las sondas de captura pueden ser unidas soportes sólidos según está descrito en la Publicación PCT Nº WO93/13224, con el fin de crear un soporte sólido para la hibridación.

De manera general, los ensayos de hibridación en fase de solución llevados a cabo utilizando el sistema ilustrado en la Fig. 1 proceden según sigue. Una muestra que contenga o que sea sospechosa de contener un ácido nucleico de hebra sencilla que incluya la secuencia diana, es incubada bajo condiciones para una primera hibridación con la sonda de marcaje y los extensores de marcaje. En este formato, el extensor de marcaje es diseñado para que sea capaz de formar un puente entre la sonda de marcaje y la secuencia diana o el extensor de captura. El producto resultante es una mezcla de complejos de ácidos nucleicos del polinucleótido analito unido a híbridos sonda de marcaje/extensor de marcaje y de híbridos sonda de marcaje/extensor de marcaje no unidos. Esta mezcla es añadida posteriormente bajo condiciones para una segunda hibridación a una fase sólida que tiene extensores de captura hibridados a sondas de captura unidas a la superficie de la misma. Los híbridos sonda de marcaje/extensor de marcaje no unidos están disponibles para hibridar con los híbridos sonda de captura/extensor de captura unidos al soporte.

En este formato de ensayo, la presencia de la secuencia diana en la muestra disminuye la población de sondas de marcaje que son capaces de hibridar con el extensor de la sonda de captura unido al soporte. Por tanto, la señal detectable que se une al soporte sólido está relacionada cuantitativamente con el inverso de la cantidad de secuencia diana en la muestra.

La cantidad de secuencia diana en la muestra, según está reflejada por la señal detectable generada según se describió anteriormente, puede ser calculada a partir de una curva estándar. Puede construirse una curva estándar mediante la preparación de una formulación estándar que contenga una cantidad conocida de un oligonucleótido que comprenda una secuencia de ácido nucleico que sea idéntica a la secuencia diana. Se realiza una serie de diluciones utilizando el estándar, de tal manera que la cantidad de oligonucleótido en la serie de diluciones del estándar corresponda al rango anticipado de las cantidades de secuencia diana en la muestra. La serie de diluciones del estándar puede ser utilizada en el formato de ensayo descrito anteriormente para generar una serie de señales detectables que correspondan a las cantidades conocidas de oligonucleótido en la serie de diluciones del estándar. La cantidad de secuencia diana en la muestra puede ser luego calculada comparando la señal generada por la muestra con las señales generadas por la serie de diluciones del estándar.

Un formato de ensayo alternativo, y preferible, está mostrado en forma de diagrama en la Fig. 2. En este formato, el extensor de captura está diseñado para que sea capaz de formar un puente entre la sonda de captura y la secuencia diana del extensor de marcaje. La muestra es incubada inicialmente bajo condiciones para una primera hibridación con moléculas extensoras de captura hibridadas a moléculas de la sonda de captura unidas a un soporte, produciéndose de este modo una mezcla de híbridos sonda de captura/extensor de captura/analito unidos al soporte e híbridos sonda de captura/extensor de captura libres. Los híbridos sonda de captura/extensor de captura libres están disponibles para hibridar con complejos de híbridos sonda de marcaje/extensor de marcaje añadidos posteriormente. Después de la adición de los complejos híbridos sonda de marcaje/extensor de marcaje, la mezcla resultante es incubada bajo condiciones para una segunda hibridación con el fin de producir híbridos sonda de captura/extensor de captura/extensor de marcaje/sonda de marcaje detectables y lavada para eliminar los complejos híbridos sonda de marcaje/extensor de marcaje no unidos. La fase sólida con los complejos detectables unidos es posteriormente separada de los materiales no unidos y leída.

En este formato de ensayo, la presencia de la secuencia diana en la muestra disminuye la población de moléculas del extensor de captura unidas al soporte que son capaces de hibridar con los híbridos sonda de marcaje/extensor de marcaje. Por tanto, igual que en el formato representado en forma de diagrama en la Fig. 1, la señal detectable que se une al soporte sólido está inversamente relacionada con la cantidad de secuencia diana en la muestra.

La cantidad de secuencia diana en la muestra, según es reflejada por la señal detectable generada según se describió anteriormente, puede ser calculada a partir de una curva estándar según se describió anteriormente.

Típicamente, la proporción del híbrido sonda de marcaje/extensor de marcaje o del híbrido sonda de captura/extensor de captura respecto a los moles anticipados de analito, será mayor de 1:1 aproximadamente, preferiblemente de al menos 10:1 aproximadamente, más preferiblemente de al menos 25:1 aproximadamente y posiblemente tan elevada como 100:1 o superior. Las concentraciones de cada una de las sondas variarán generalmente de 10^{-9} M a 10^{-6} M aproximadamente, con concentraciones de ácido nucleico en la muestra variando desde 10^{-21} M aproximadamente a 10^{-12} M aproximadamente.

Las etapas de la hibridación en los formatos de ensayo de la invención reivindicada son realizadas bajo condiciones de rigurosidad apropiadas. La rigurosidad puede ser controlada mediante la alteración de un parámetro que sea una variable termodinámica. Tales variables son bien conocidas en la técnica e incluyen la concentración de formamida, la concentración de sales, la concentración de sales caotrópicas, el pH, el contenido de solventes orgánicos y la temperatura. Los controles de rigurosidad preferidos son el pH y la concentración de sales. La rigurosidad será variada dependiendo de la longitud y de la naturaleza de la secuencia diana.

Las concentraciones de la primera hibridación en la que se forma un híbrido sonda-diana son ajustadas para que proporcionen la rigurosidad deseada para el ensayo. Típicamente, las condiciones de la primera hibridación son condiciones de alta rigurosidad con el fin de incrementar la especificidad de la reacción de hibridación sonda-diana.

Las condiciones de la segunda hibridación son utilizadas cuando se forman híbridos entre secuencias que han sido diseñadas para que hibriden entre sí, por ejemplo para formar híbridos sonda de marcaje/extensor de marcaje o sonda de captura/extensor de captura. Por consiguiente, las condiciones de la segunda hibridación no necesitan ser tan rigurosas como las condiciones de la primera hibridación. Las condiciones preferidas para la segunda hibridación, que se aproximan a condiciones fisiológicas, son 37ºC, catión monovalente 0,15 M, Mg^{++} 16 mM y espermidina 1 mM.

El procedimiento utilizado en las etapas de separación del ensayo variará dependiendo de la naturaleza de la fase sólida. Para partículas, la centrifugación o la filtración proporcionarán la separación de las partículas, desechando el sobrenadante o aislando el sobrenadante. Cuando se ensayen las partículas, las partículas serán lavadas completamente, normalmente de una a cinco veces, con un medio tamponado apropiado, por ejemplo solución salina tamponada con fosfato (PBS) conteniendo un detergente tal como SDS. Cuando el medio de separación sea una pared o un soporte, el sobrenadante puede ser aislado o desechado y la pared lavada de la misma manera que la indicada para las partículas.

Un objetivo adicional de la presente invención es incrementar la especificidad del ensayo, mediante la disminución de la unión no específica, y la sensibilidad del ensayo, esto es, la capacidad para distinguir entre secuencias de ácido nucleico diferentes. Estos objetivos son conseguidos, en parte, mediante la provisión de una población homogénea de sondas de marcaje que tengan una elevada actividad específica de detección de la marca.

La preparación de tales sondas de marcaje implica, en principio, la provisión de moléculas de fosfatasa alcalina hidrofílicas, purificadas, que tengan una elevada actividad enzimática específica. La fosfatasa alcalina purificada es posteriormente conjugada a una sonda oligonucleotídica que contiene la secuencia de ácido nucleico L-3 bajo condiciones que controlen los sitios del enzima que están disponibles para conjugación. Opcionalmente, el conjugado fosfatasa alcalina-oligonucleótido así formado puede ser purificado posteriormente.

Una preparación de fosfatasa alcalina hidrofílica purificada puede ser obtenida utilizando los procedimientos de Bublitz y col., supra. Bublitz y col. informaron que aunque una preparación de fosfatasa alcalina típica puede ser un 99% enzimáticamente pura, puede constar de más de una fracción del enzima. De este modo, puede prepararse un dímero de fosfatasa alcalina sin anclaje, hidrofílico, a partir de mucosa intestinal o quimo bovinos o de ternera mediante extracción con un alcohol inferior tal como butanol, purificando el enzima mediante cromatografía de inmunoafinidad y separando la fracción dimérica hidrofílica sin anclaje de la fracción de glucosilfosfatidilinositol-fosfatasa alcalina por cromatografía de interacción hidrofóbica, utilizando por ejemplo una columna de fenil Sepharose®. El dímero de fosfatasa alcalina hidrofílica, sin anclaje, puede ser también preparado a partir de la fracción de glucosilfosfatidilinositol-fosfatasa alcalina mediante tratamiento con fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol o con fosfalipasa D de glucosilfosfatidilinositol seguido por separación de las fracciones hidrofílica e hidrofóbica mediante cromatografía de fase reversa (por ejemplo, octil Sepharose®).

La fosfatasa alcalina puede ser también obtenida y purificada de otras fuentes y especies, incluyendo hígado, placenta y riñón bovinos, mucosa intestinal, placenta y riñón porcinos, mucosa intestinal ovina, así como de bacterias tales como Escherichia coli.

La preparación de sondas marcadas con elevada actividad específica de detección implica la conjugación de un éster oligonucleotídico altamente purificado con aminas reactivas de la fosfatasa alcalina en presencia de una molécula que proteja al sitio activo del enzima de la conjugación. Por tanto, durante la reacción de conjugación, el sitio activo del enzima puede ser protegido mediante coincubación con sustratos del enzima, por ejemplo fosfatos, con análogos de sustratos o con inhibidores tales como ácidos fosfónicos. Las técnicas para la preparación y purificación de ésteres oligonucleotídicos son bien conocidas en el oficio. Ver, por ejemplo, Moller y col. (1995) Bioconjugate Chem. 6:174 e Ivanovskaya y col. (1994) Molecular Biol. 28:754.

Preferiblemente, el conjugado fosfatasa alcalina-oligonucleótido es producido utilizando modificaciones de los métodos descritos en la Patente de EE.UU. Nº 4.868.105 para Urdea y col., supra, y en Urdea y col. (1988) Nucl. Acids Res. 16:4937-4955.

El método implica generalmente una primera etapa de reacción del agente de entrecruzamiento con el oligonucleótido para producir un oligonucleótido "activado". En particular, se prefieren agentes de entrecruzamiento solubles en agua, por ejemplo bis(sulfosuccinimidil)suberato. La proporción de agente de entrecruzamiento respecto al oligonucleótido puede ser variada independientemente para optimizar el producto de reacción. En general, el agente de entrecruzamiento puede estar presente en un exceso suficiente para evitar la formación de dímeros oligonucleotídicos entrecruzados. Por consiguiente, la relación agente de entrecruzamiento:oligonucleótido estará en el rango de 5 a 100 aproximadamente, preferiblemente de 5 a 25 aproximadamente y muy preferiblemente de 5 a 10.

La preparación de una población homogénea de sondas de marcaje implica la etapa siguiente de conjugación de la fosfatasa alcalina al oligonucleótido activado bajo condiciones en las que la reactividad de las aminas del enzima puede ser modulada para dirigir la conjugación a una población uniforme de sitios reactivos en el enzima. Debido a los microentornos de los grupos amina de la fosfatasa alcalina, la reactividad de las aminas puede ser controlada variando el pH de las condiciones de la reacción de conjugación, dirigiendo de este modo la conjugación a una población uniforme de sitios reactivos. Además, puede variarse la proporción de oligonucleótido activado respecto a la fosfatasa alcalina entre 5 y 100 o superior. Esto produce una sonda de marcaje en la que un oligonucleótido está conjugado a una población uniforme de aminas.

El pH de la reacción de conjugación puede ser variado para producir un conjugado enzima-oligonucleótido que tenga la actividad enzimática deseada (por ejemplo, máxima) mediante la alteración de la composición del tampón de la solución de reacción. Por ejemplo, con el fin de tamponar la reacción de conjugación en el rango apropiado de pH fisiológico, esto es en el rango de pH 6,6 a pH 8,0 aproximadamente, más típicamente en el rango de pH 7,2 a pH 7,8 aproximadamente, puede utilizarse un tampón fosfato. El fosfato, como sustrato de la fosfatasa alcalina, proporciona protección al sitio activo del enzima. Composiciones tamponantes alternativas capaces de proporcionar una mezcla de reacción a un pH deseado, son bien conocidas en la técnica y pueden ser encontradas en, por ejemplo, el CRC Handbook of Chemistry and Physics, D.R. Lide, ed., 1994. La reactividad diferencial de los grupos amina de proteínas como función del pH en reacciones que utilizan agentes de entrecruzamiento ha sido informada por Grumbach y col., supra. La dependencia diferencial del pH de las reacciones de hidrólisis y aminolisis de los agentes de entrecruzamiento con proteínas ha sido descrita por Anjaneyulu y col. (1987) Int. J. Peptide Protein Res. 30:117-124.

La proporción de oligonucleótido respecto a fosfatasa alcalina en la sonda de marcaje (esto es, el número de sitios conjugados en el enzima) puede ser determinada mediante electroforesis analítica en gel utilizando técnicas bien conocidas en el oficio. Además, la población de sitios de fosfatasa alcalina conjugados a oligonucleótidos puede ser determinada mediante digestión del enzima conjugado al oligonucleótido y la realización de análisis de aminoácidos en el digesto utilizando técnicas bien conocidas en el oficio. La actividad enzimática de la sonda de marcaje puede ser determinada y comparada con la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina purificada. Sondas de marcaje con elevada actividad específica, teniendo preferiblemente del 75% al 100%, más preferiblemente del 80% al 100% y muy preferiblemente del 90% al 100% de la actividad enzimática de los materiales de partida, son utilizadas posteriormente en los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos.

Opcionalmente, la sonda de marcaje puede ser purificada posteriormente utilizando cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica (por ejemplo, fenil Sepharose®), cromatografía de fase reversa (por ejemplo, octil Sepharose®), cromatoenfoque o similares. Alternativamente, y en general preferiblemente, la sonda de marcaje es purificada posteriormente utilizando cromatografía de afinidad según está descrito en, por ejemplo, Landt y col. (1978) Biochem. 17:915-919. La cromatografía de afinidad utilizando sustratos de la fosfatasa alcalina o análogos de sustratos tiene el beneficio añadido de proporcionar sondas de marcaje que tienen sitios de unión de la fosfatasa alcalina intactos.

Este procedimiento puede ser utilizado para proporcionar sondas de marcaje de elevada actividad específica para ser utilizadas en virtualmente cualquier tipo de ensayo de hibridación en el que sean utilizadas moléculas de sonda de marcaje, incluyendo un amplio rango de ensayos de hibridación en fase de solución, ensayos de amplificación, métodos de hibridación en filtro, ensayos que implican la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") y similares. Un ejemplo de ensayo de hibridación con el cual es útil la presente técnica es el descrito en la Patente de EE.UU. Nº 4.868.105 para Urdea y col., o, preferiblemente, el descrito anteriormente junto con la configuración ilustrada en la Fig. 1 y en la Fig. 2.

Una composición de sustrato para fosfatasa alcalina incluye un 1,2-dioxetano quimioluminiscente estable; tales compuestos quimioluminiscentes son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.145.772 para Voyta y col. y la Publicación de Patente Europea Nº 0630884). Una composición de sustrato preferida incluye un fosfato de dioxetano activado enzimáticamente. Una composición de sustrato más preferida incluye fosfato de dioxetano en presencia de un surfactante dicatiónico o policatiónico para intensificar la quimioluminiscencia de los dioxetanos, siendo el más preferido un dioxetano en presencia de un surfactante dicatiónico y un intensificador de quimioluminiscencia aniónico hidrofóbico.

Según está descrito en la Publicación de EPA Nº 0630884, un surfactante dicatiónico preferido tiene la fórmula estructural Z^{-}(R^{2})_{3}B^{+}CH_{2}-Y-CH_{2}B^{+}(R^{3})_{3}Z^{-}, en la cual B puede ser fósforo, nitrógeno o una combinación de los mismos; Z es un contraión aniónico; R^{2} y R^{3} pueden ser iguales o diferentes y pueden ser alquilo o aralquilo sustituido o no sustituido conteniendo de 1 a 20 átomos de carbono e Y puede ser un dialquilenarilo, arilo, alquileno, alquenileno o alquinileno conteniendo de 4 a 20 átomos de carbono.

Los surfactantes dicatiónicos preferidos que pueden ser utilizados para amplificar la quimioluminiscencia procedente de las reacciones del 1,2-dioxetano activado incluyen aquéllos que tienen la estructura siguiente:

1

en la cual el sustituyente X^{-}(R^{3})_{3}A^{+}CH_{2}- en el anillo de benceno puede estar en posición orto, meta o para, A puede ser fósforo o nitrógeno, R^{2} y R^{3} pueden ser alquilo o aralquilo conteniendo de 1 aproximadamente a 20 átomos de carbono aproximadamente y X^{-} es un fluoruro, cloruro, bromuro o yoduro. Más preferiblemente, el surfactante dicatiónico es dicloruro de 1-(tri-n-octilfosfoniometil)-4-(tri-n-butilfosfoniometil)benceno:

2

que puede ser preparado mediante la reacción de cloruro de 4-(clorometil)bencil tri-n-butilfosfonio con tri-n-octil-
fosfina, según está descrito en la Publicación de EPA Nº 0630884.

Según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.125.772, los surfactantes policatiónicos preferidos son poli(sales de amonio cuaternario de vinilarilo), tales como las poli(sales de amonio cuaternario de vinilbencilo). Sales policatiónicas particularmente preferidas son poli(cloruro de vinilbenciltrimetil amonio) (TMQ) y poli[vinilbencil(cloruro de bencildimetil amonio)] (BDMQ).

Estos surfactantes son utilizados típicamente en combinación con 1,2-dioxetanos estables que pueden ser activados por reactivos químicos, por ejemplo, ácidos, bases, sales, enzimas, catalizadores inorgánicos y orgánicos y donadores de electrones, para generar quimioluminiscencia. Tales dioxetanos estables son bien conocidos en la técnica y dioxetanos preferidos están descritos en la Publicación de EPA Nº 0630884. La amplificación de la quimioluminiscencia por los surfactantes puede ser observada con concentraciones de surfactante de entre 0,001% aproximadamente y 10% aproximadamente, preferiblemente de entre 0,01% aproximadamente y 0,5% aproximadamente.

El intensificador de quimioluminiscencia aniónico hidrofóbico puede tener la fórmula R^{1}X^{-}A^{+}, en la que R^{1} es un grupo hidrofóbico que puede ser un resto hidrocarburo sustituido o no sustituido que tenga entre 1 y 20 átomos de carbono aproximadamente, preferiblemente entre 4 y 18 átomos de carbono aproximadamente, más preferiblemente entre 6 y 18 átomos de carbono aproximadamente, incluyendo grupos alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo y grupos funcionales similares. X^{-} es un resto aniónico unido covalentemente al resto R^{1}. X^{-} puede ser sulfato, sulfito, sulfonato, acetato, butirato, fosfato, fosfito, fosfonato, carbonato, carboxilato, arsenato y similares. A^{+} es un contracatión que puede ser sodio, potasio, plata, amonio, cationes de metales alcalinos del Grupo IA, otros cationes metálicos monovalentes y similares. Los intensificadores de quimioluminiscencia aniónicos hidrofóbicos preferidos incluyen un grupo alquilo o aralquilo que proporcione un componente hidrofóbico y un grupo aniónico. Además, el intensificador puede incluir un resto catiónico, tal como amonio, amino y similares, proporcionando de este modo un intensificador zwitteriónico hidrofóbico. Ejemplos de tales intensificadores aniónicos hidrofóbicos, y de las fuentes comerciales de las que pueden ser obtenidos, incluyen 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-2-hidroxipropanosulfonato ("CHAPSO"; Sigma), 2-(N-ciclohexilamino)etano-sulfonato ("CHES"; Sigma), 4-fenilbutirato ("4-PBA"; Aldrich), quenodesoxicolato ("CDC"; Sigma), taurodeshidrocolato ("TDHC"; Calbiochem), taurolitocolato ("TLCA"; Sigma), desoxicolato ("DC"; Sigma), 4-sulfobenzoato ("4-SBA"; Aldrich), colato ("CA"; Sigma), hexano sulfonato ("HSA"; Sigma), taurocolato ("TCA"; Sigma), glicocolato ("GCA"; Sigma), glicodesoxicolato ("GDCA"; Sigma), benceno sulfonato ("BSA"; Sigma), tauroursodesoxicolato ("TSDC"; Sigma), taurodesoxicolato ("TDC"; Sigma), p-tolueno sulfonato ("PTSA"; Sigma), tauroquenodesoxicolato ("TCDC"; Sigma) y dodecil sulfato de sodio ("SDS"; Sigma).

Mediante la inclusión de un intensificador aniónico hidrofóbico en una reacción en la que se genera quimioluminiscencia a partir de dioxetano en presencia de un surfactante dicatiónico, se incrementa la quimioluminiscencia sobre la quimioluminiscencia producida por el dioxetano en presencia de un surfactante en ausencia del agente intensificador, según se muestra en la Tabla 1.

TABLA 1

Intensificación Máxima de la Quimioluminiscencia
	Intensidad
Compuesto	Quimioluminiscente	Concentración % (p/p)
	Relativa
(Sin intensificador)	1,00
CHAPSO	2,37	0,25
CHES	3,24	0,25
4-PBA	3,42	0,25
CDC	4,73	0,0625
TDCH	5,81	0,25
TLCA	6,39	0,25
DC	6,84	0,125
4-SBA	7,34	0,125
CA	8,17	0,125
HSA	8,85	0,125
TCA	9,28	0,125
GCA	9,36	0,125
GDCA	10,55	0,0625
BSA	12,23	0,25
TSDC	12,92	0,125
TDC	14,90	0,125
PTSA	16,75	0,125
TCDC	19,88	0,125
SDS	23,02	0,0625

Los intensificadores aniónicos hidrofóbicos incrementan la intensidad lumínica relativa de la quimioluminicencia del 1,2-dioxetano sin incrementar el nivel de fondo de generación lumínica (ver la Fig. 4A y la Fig. 4B). La concentración de intensificador añadida a una reacción quimioluminiscente depende de la concentración de dioxetano y de surfactante. Por ejemplo, en una reacción catalizada por un enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina), la concentración de fosfato de dioxetano es ajustada de tal manera que el enzima esté totalmente saturado. Por tanto, la concentración de dioxetano puede estar en el rango de 2 a 10 veces mayor que la K_{m} del enzima aproximadamente, o superior, dependiendo de la solubilidad del dioxetano. La proporción en peso de surfactante respecto a dioxetano puede estar entre 0,1:1 aproximadamente y 100:1 aproximadamente, preferiblemente entre 1:1 y 20:1 aproximadamente. Finalmente, la relación molar del intensificador aniónico hidrofóbico respecto al surfactante puede estar entre 0,1:1 y 10:1 aproximadamente, preferiblemente entre 0,5:1 aproximadamente y 3:1 aproximadamente y más preferiblemente entre 0,5:1 y 1,5:1 aproximadamente.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método mejorado para detectar quimioluminiscencia en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos en fase de solución en los que se utilizan sondas de marcaje que llevan fosfatasa alcalina, según se describe posteriormente con detalle y se ejemplifica en la presente en los Ejemplos 1 y 5. Además, será obvio para aquellas personas con experiencia habitual en la técnica que las composiciones de intensificadores aniónicos hidrofóbicos y los métodos de la presente invención pueden ser útiles en otros procedimientos que empleen ensayos de quimioluminiscencia incrementada por surfactantes. Ejemplos de tales ensayos incluyen ensayos sobre inmunoabsorbente con enzima unido (ELISAs), Transferencia Western, Transferencia Southern, otros ensayos que utilicen sistemas de detección basados en fosfatasa alcalina y similares.

La invención proporciona también nuevos ensayos que son específicos (por ejemplo, capaces de reconocer diferencias de un solo nucleótido entre secuencias de ácido nucleico de analitos), sensibles (por ejemplo, capaces de cuantificar cantidades de attomoles de los ácidos nucleicos analito) y fácilmente automatizados. Por tanto, la invención es particularmente útil en ensayos de selección en sangre y en ensayos para la determinación de genotipos o subtipos. La invención es particularmente adecuada para el análisis de mutaciones de ADN genómico o ARN y para otros análisis estructurales de ácidos nucleicos. Además, la invención puede ser utilizada para monitorizar terapia génica o terapia con fármacos antisentido y para la generación de mapas de sondas discontinuas que se unen estrechamente a dianas de ácido nucleico para utilización en diagnóstico o como agentes terapéuticos antisentido, según está descrito en la Solicitud PCT Nº PCT/US95/15779 comúnmente asignada a Collins, registrada el 5 de Diciembre de 1995 y titulada "Discontinuous Probe Design Using Hybritope Mapping".

Parte experimental

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique de otro modo, técnicas convencionales de química orgánica de síntesis, de bioquímica, de biología molecular y similares, que están todas ellas dentro de la experiencia habitual en el oficio. Tales técnicas están explicadas con todo detalle en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds., 1984) y una serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).

Debe comprenderse que aunque la invención ha sido descrita junto con las realizaciones específicas preferidas de la misma, la descripción anterior así como los ejemplos que siguen están destinados a ilustrar la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del ámbito de la invención serán obvios para aquellas personas con experiencia en la técnica a la que pertenece la invención.

Los ejemplos siguientes se han puesto para proporcionar a aquellas personas con experiencia habitual en la técnica una explicación y una descripción completas de cómo producir y utilizar los compuestos de la invención, y no tienen la intención de limitar el ámbito de lo que los inventores consideran como su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero algunos errores y desviaciones estarían justificados. A no ser que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, la temperatura es en ºC y la presión es, o está próxima a, la presión atmosférica.

En los Ejemplos 1 y 5, un oligonucleótido marcado con un superíndice "c" indica un oligonucleótido que es complementario al oligonucleótido que no está marcado así. Por tanto, "diana^{c}" es un oligonucleótido que contiene una secuencia diana que es complementaria a "diana". Un oligonucleótido marcado con un superíndice "c'" indica un oligonucleótido que es complementario a un oligonucleótido marcado con un superíndice "c". Por tanto, "diana^{c'}" indica un oligonucleótido que contiene una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a "diana^{c}".

Ejemplo 1 Preparación de Fosfatasa Alcalina y de una Sonda Marcada con Fosfatasa Alcalina

Se prepararon sondas oligonucleotídicas utilizando una preparación de fosfatasa alcalina hidrofóbica, sin anclaje. El proceso de conjugación de la sonda oligonucleotídica fue llevado a cabo bajo condiciones que dirigían selectivamente la conjugación a una población uniforme de sitios en el enzima y en presencia de fosfato para asegurar que el sitio activo del enzima no estuviera disponible para conjugación. Se produjo una población homogénea de conjugados fosfatasa alcalina-oligonucleótido después de la purificación posterior del conjugado utilizando etapas de cromatografía adicionales.

A. Purificación de Fosfatasa Alcalina. La fosfatasa alcalina fue purificada a partir de una fuente comercialmente disponible para producir una preparación hidrofílica, sin anclaje, según sigue.

Se preparó una columna de afinidad de fosfatasa alcalina de acuerdo con el método de Landt y col., supra. La columna fue llenada utilizando 1 ml aproximadamente de suspensión de resina de ácido L-histidildiazobencilfosfónico (Sigma) por mg de fosfatasa alcalina. La columna con el vertido fue rellenada haciendo correr a través de la misma Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, a una velocidad de 10-20 ml/hora aproximadamente. La densidad óptica del efluente de la columna fue monitorizada a 280 nm hasta que la DO_{280} fue de 0,00 aproximadamente.

Se preparó fosfatasa alcalina soluble lavada y concentrada según sigue. La fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim) fue concentrada, y el tampón en el que el enzima había sido suministrado originalmente fue cambiado por Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, en un concentrador Centricon-30 (Amicon) que había sido lavado con Tris-HCl 10 mM, pH 8,0. Se añadieron el enzima y Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, y el concentrador fue centrifugado a 3000-4000 x g. Este proceso fue repetido dos veces.

La fosfatasa alcalina concentrada, lavada, fue aplicada a la columna rellenada a una velocidad de 10-20 ml/hora. La columna fue lavada utilizando Tris-HCl 10 mM para eliminar las impurezas que no se unían específicamente a la resina. La fosfatasa alcalina retenida fue eluida con Na_{2}HPO_{4} 10 mM en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0.

Las fracciones recogidas que contenían fosfatasa alcalina fueron concentradas utilizando un Centriprep-30 (Amicon) o un Centricon-30, o ambos, según se describió anteriormente. La fosfatasa alcalina concentrada fue lavada en tampón fosfato 100 mM, pH 7,2, a 4ºC o en tampón de almacenamiento de fosfatasa alcalina que contenía cloruro de sodio 3 M, cloruro de magnesio 1 mM, cloruro de zinc 0,1 mM, trietilamina 30 mM, pH 7,4.

B. Conjugación de la Fosfatasa Alcalina a una Sonda Oligonucleotídica para Formar la Sonda de Marcaje. La porción (X) amina de cadena larga 3' ("LCA") del oligonucleótido bla3 (5'-AAGTACGACAACCACATCX-3'), en el que X es N^{4}-(6-aminocaproil-2-aminoetil)-citosina, es activada utilizando bis(sulfosuccinimidil)suberato ("BS^{3}") (Pierce) en una proporción 1:10 de bla3:BS^{3}. De este modo, BS^{3} (21,5 mg) y bla3 (274 nmoles/ml) son añadidos a tampón fosfato 100 mM, pH 7,8, e incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente.

La mezcla de reacción es aplicada a una columna NAP-5 (Pharmacia) previamente equilibrada con tampón fosfato 100 mM, pH 6,5, a 4ºC. El producto deseado es eluido utilizando tampón fosfato 100 mM, pH 6,5, a 4ºC. Si se desea, el oligonucleótido activado puede ser purificado adicionalmente utilizando una etapa de precipitación con etanol.

Con el fin de proporcionar una sonda de marcaje de acuerdo con el método de la invención, la reacción de conjugación puede ser llevada a cabo a varios pHs y a varias proporciones de ADN:enzima para determinar las condiciones deseadas para la conjugación. El bla3 purificado, activado, es añadido a aproximadamente 100 nmoles/ml de la fosfatasa alcalina purificada por afinidad en tampón fosfato 100 mM, pH 7,2 o pH 7,8, a 4ºC, a una proporción ADN:enzima de 5:1, 25:1 ó 100:1, e incubado durante 30 minutos a 4ºC. El producto de reacción es concentrado y lavado en tampón de almacenamiento de fosfatasa alcalina utilizando un Centricon-30. La etapa de lavado se repite tres veces para asegurar que el ADN no reaccionado fluye a través de la membrana del filtro y está minimizado en el producto.

Si es necesario, el conjugado fosfatasa alcalina-oligonucleótido puede ser purificado adicionalmente utilizando, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de fase reversa, cromatoenfoque o cromatografía de afinidad. La proporción de marca respecto al ADN es determinada utilizando electroforesis analítica en gel. La actividad enzimática es determinada utilizando técnicas de ensayo convencionales (ver Landt y col., supra). Las aminas reactivas marcadas son determinadas mediante digestión de la fosfatasa alcalina conjugada y la realización de un análisis de aminoácidos utilizando técnicas convencionales.

Ejemplo 2 Efecto del Dodecil Sulfato de Sodio Sobre la Variación con el Tiempo de la Generación de Quimioluminiscencia

Se preparó fosfatasa alcalina concentrada, lavada, según se describió en el Ejemplo 1.

La fosfatasa alcalina concentrada fue diluida hasta 1 attomol/microlitro en solución de sustrato ((3-(2'-espiroadamantano)-4-metoxi-4-(3''-fosforiloxi)-fenil-1,2-dioxetano (sal disódica) (0,33 mM) (Lumigen® PPD, Lumigen, Inc., Southfield, MI) en tampón 2-metil-2-amino-1-propanol 0,2 M, pH 9,6, con MgCl_{2} 0,88 mM y 1,0 mg/ml de dicloruro de 1-(tri-n-octilfosfoniometil)-4-(tri-n-butilfosfoniometil) benceno (ver, la Publicación de EPA Nº 0630884)) o en solución de sustrato con SDS 0,03% a 4ºC. Una alícuota de 50 microlitros de cada una de las soluciones fue transferida a un luminómetro e incubada a 37ºC. La quimioluminiscencia generada en las soluciones fue monitorizada durante los tiempos indicados en la Fig. 3. Se observó una intensificación de la señal de quimioluminiscencia catalizada por fosfatasa alcalina producida por el SDS 0,03% en todos los puntos de tiempo analizados.

Ejemplo 3 Efecto del Dodecil Sulfato de Sodio Sobre la Quimioluminiscencia de Fondo

Estos experimentos fueron realizados para determinar la variación a lo largo del tiempo y la dependencia de la concentración de la quimioluminiscencia intensificada por SDS y el efecto del SDS sobre la quimioluminiscencia de fondo generada en ausencia de fosfatasa alcalina.

A. Cincuenta microlitros de solución de sustrato o de solución de sustrato con SDS al 0,03%, preparadas según se describió en los Ejemplos 1 y 2, fueron incubados a 37ºC en un luminómetro y se monitorizó la quimioluminiscencia a los tiempos indicados en la Fig. 4A. Los resultados representados en la Fig. 4A indican que el efecto del SDS, intensificador de la generación de la señal quimioluminiscente, es específico para la señal catalizada por el enzima.

B. Se prepararon soluciones de sustrato que contenían varias concentraciones de SDS o soluciones de sustrato que contenían varias concentraciones de SDS y 1 attomol/microlitro de fosfatasa alcalina a 4ºC, según se describió en los Ejemplos 1 y 2; la concentración final de SDS en cada solución está indicada en la Fig. 4B. Alícuotas de cincuenta microlitros de cada solución fueron incubadas 37ºC en un luminómetro. La quimioluminiscencia fue medida después de una incubación de 60 minutos. Los resultados representados en la Fig. 4B muestran el incremento máximo de generación de quimioluminiscencia catalizada por el enzima a una concentración dada de SDS. Además, estos resultados muestran que, incluso a concentraciones mayores de SDS, no hay ningún efecto del intensificador en ausencia del enzima.

Ejemplo 4 Comparación del Efecto de SDS y Brij-35 Sobre la Intensificación de la Quimioluminiscencia

La finalidad de este experimento era comparar el efecto del SDS, un intensificador aniónico, con el de Brij-35, un detergente no iónico, sobre la quimioluminiscencia generada por la fosfatasa alcalina.

La fosfatasa alcalina fue preparada y conjugada a una sonda oligonucleotídica según se describió en el Ejemplo 1.

La fosfatasa alcalina conjugada a la sonda oligonucleotídica fue diluida hasta 1 attomol/microlitro de fosfatasa alcalina en solución de sustrato preparada según se describió en el Ejemplo 2 y que contenía varias concentraciones de SDS o de Brij-35 a 4ºC; la concentración final de SDS o de Brij-35 está indicada en la Fig. 5. Alícuotas de cincuenta microlitros de cada una de las soluciones fueron incubadas a 37ºC en un luminómetro y la quimioluminiscencia fue medida después de una incubación de 60 minutos.

Los resultados de este experimento están representados en la Fig. 5, en la que puede observarse la intensificación de la quimioluminiscencia por SDS y la ausencia de intensificación por Brij-35. Estos resultados indican que la intensificación de la quimioluminiscencia generada por fosfatasa alcalina puede ser observada con fosfatasa alcalina soluble esté o no conjugada a una sonda oligonucleotídica.

Ejemplo 5 Detección de la Sonda #8730 del Elemento de Respuesta Rev del VIH

Este ensayo fue realizado utilizando el formato de ensayo esquematizado en forma de diagrama en la Fig. 2 para detectar la presencia de una sonda del elemento de respuesta Rev del virus de la inmunodeficiencia humana ("la sonda RRE") que tiene la secuencia 5'-TCCTGCTGCTCCCAAGAA-3'. Extractos de células MOLT-3 (ATCC CRL 1552), citoplásmicos o nucleares, fueron separados por centrifugación y a los mismos se añadieron varias cantidades de la sonda RRE para estimular la cuantificación de moléculas antisentido terapéuticas en las células.

Se añadieron 50 ml de diluyente amp (suero de caballo 50%, azida de sodio 0,05%, SDS 1,3%, SSC 5X (SSC 20X contiene 175 g/l de cloruro de sodio y 88 g/l de citrato de sodio), 0,5 mg/ml de proteinasa K, Tris-HCl 6 mM, Proclin 300® (Rolm-Haas) 0,05% y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,006 mM) que contenía 1 fmol/pocillo del extensor de captura "PSCP^{c}-diana^{c}" (5'-TTCTTGGGAGCAGCAGGACTCTTGGAAAGAAAGTGAAGTG-3') a los pocillos de una placa de microvaloración a los que se había unido la sonda de captura "PSCP" (5'-XCACTTCACTTTCTTTCCAAGAG-3'), donde X es según se definió anteriormente. Después de 30 minutos a 37ºC, los pocillos fueron lavados 2 veces con tampón de lavado A (SDS 0,1%, SSC 0,1X, azida de sodio 0,05% y Proclin 300® 0,05%). Para los datos mostrados en las Tablas 2 y 3, se añadieron a los pocillos 50 ml de extractos celulares correspondientes a 0, 24.000, 48.000 ó 72.000 células MOLT-3 que contenían 0, 2, 4, 6 u 8 fmoles de la sonda RRE. Para los datos mostrados en la Tabla 3, se añadieron a los pocillos 50 ml de extractos celulares correspondientes a 0, 60.000, 120.000 ó 180.000 células MOLT-3 que contenían 0, 2, 4, 6 u 8 fmoles de la sonda RRE. La mezcla de reacción fue incubada durante 30 minutos a 37ºC. Los pocillos fueron lavados dos veces con tampón de lavado A.

La sonda de marcaje fosfatasa alcalina-bla3 preparada de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 4, fue añadida a diluyente amp que contenía el extensor de marcaje bla3^{c}-diana^{c'} (5'-GATGTGGTTGTCGTACTTTCCTGCT-
GCTCCCAAGAA-3') en un volumen final de 100 ml. La mezcla de reacción fue incubada durante 30 minutos a 37ºC. La mezcla de reacción fue diluida con diluyente de marca y añadida a los pocillos a una concentración final de 5 fmoles por 50 ml.

Después de incubar la mezcla de reacción durante 1 hora a 37ºC, los pocillos de microvaloración fueron lavados dos veces con tampón de lavado A y posteriormente dos veces con tampón de lavado D (Brij-35 0,1%, cloruro de magnesio 5 mM, Tris-HCl 0,1 M, azida de sodio 0,01% y Proclin 300® 0,01%). Posteriormente se añadieron a los pocillos de microvaloración lavados 50 ml de (3-(2'-espiroadamantano)-4-metoxi-4-(3''-fosforiloxi)-fenil-1,2-dioxetano (sal disódica) (0,33 mM) (Lumigen® PPD, Lumigen, Inc., Southfield, MI) en tampón 2-metil-2-amino-1-propanol 0,2 M, pH 9,6, con MgCl_{2} 0,88 mM y 1,0 mg/ml de dicloruro de 1-(tri-n-octilfosfoniometil)-4-(tri-n-butilfosfoniometil)benceno (ver, la Publicación de EPA Nº 0630884) y SDS 0,03%. Las placas de microvaloración fueron incubadas durante 30 minutos a 37ºC y se detectó la señal generada.

Los datos tabulados en las Tablas 2 y 3 indican que el ensayo es lineal a lo largo del rango de concentraciones de la sonda analizadas, que la precisión es muy elevada (según está reflejado por el %C.V.) y que la presencia de un extracto nuclear de células MOLT-3 no interfiere con la detección de la sonda.

TABLA 2

Adición de Extractos Citoplásmicos de Células MOLT-3
Sonda (fmoles)	Señal Media	Desviación Estándar	%C.V.	Señal - Ruido
0 Células
0	779,65	26,22	0,03	775,47
2	641,68	45,26	0,07	637,50
4	496,43	15,73	0,03	492,25
6	361,13	12,53	0,03	356,95
8	317,53	11,12	0,04	313,35
24.000 Células
0	823,48	10,10	0,01	818,99
2	680,75	47,93	0,07	676,26
4	480,45	18,41	0,04	475,96
6	369,28	16,43	0,04	364,79
8	279,28	17,08	0,06	274,79
48.000 Células
0	824,13	10,93	0,01	819,74
2	678,98	69,74	0,10	674,59
4	485,32	20,68	0,04	480,94
6	384,33	5,76	0,01	379,94
8	280,63	6,07	0,02	276,24
72.000 Células
0	787,48	24,82	0,03	782,08
2	666,93	64,31	0,10	661,53
4	481,65	29,15	0,06	476,25
6	389,28	10,63	0,03	383,88
8	292,98	13,27	0,05	287,58

TABLA 3

Sonda (fmoles)	Extracto Nuclear Añadido (Número de Células)
	0	60.000	120.000	180.000
0	788,4	771,6	815,4	777,6
2	625,0	614,9	644,5	664,7
4	436,5	468,4	456,2	455,9
6	335,4	352,1	357,7	347,0
8	266,1	263,8	269,1	307,9

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Ejemplo 6 Efecto del SDS sobre Otros Sistemas Quimioluminiscentes

La finalidad de este experimento era identificar el efecto del SDS, un intensificador aniónico, sobre otros sistemas de señales quimioluminiscentes. Las moléculas de este ejemplo que pueden ser activadas para producir una señal quimioluminiscente son CSPD® (sal disódica del éster monofosfato de 3-(4-metoxiespiro{1,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)tricloro[3.3.1.1^{3,7}]decan}-4-il)fenilo, Tropix, Bedford, MA) y CDP-Star® (Tropix, Bedford, MA). Las moléculas intensificadoras primarias son Emerald-II^{TM} y Sapphire-II^{TM} (ambas de Tropix, Bedford, MA), que son sales de amonio cuaternario poliméricas formuladas con o sin un intensificador fluorescente.

Se añadió fosfatasa alcalina a los micropocillos a varias concentraciones en cinco microlitros de tampón de lavado (Tris 0,1 M, pH 8,0, MgCl_{2} 10 mM, ZnCl_{2} 0,1 mM, Brij-35 0,1%) con 50 microlitros de varias combinaciones de los agentes quimioluminiscentes y de los intensificadores primarios anteriormente enumerados, con y sin SDS 0,03%. Los pocillos fueron incubados durante 30 minutos a 37ºC en un luminómetro con temperatura controlada, y posteriormente se determinaron las unidades relativas de luz (URLs).

Se determinó la relación de la señal respecto al fondo (S/B) dividiendo las RLUs producidas por la fosfatasa alcalina entre las RLUs producidas por el diluyente. Los datos de la Tabla 4 muestran que la adición de SDS al sistema de CSPD-Sapphire II incrementa la relación S/B.

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TABLA 4

Fosfatasa Alcalina	CSPD SAPPHIRE II
(Moléculas/ml)
	Sin SDS	+ SDS 0,03%
	Señal	S/B	Señal	S/B
1,2 x 10^{7}	861	6.726	2.914	14.570
1,5 x 10^{6}	167	1.304	801	4.005
1,9 x 10^{5}	22,1	173	86,5	433
1,2 x 10^{4}	1,83	14,3	6,88	34,4
Diluyente	0,128	-	0,2	-

TABLA 4 (continuación)

Fosfatasa Alcalina	CDP STAR + EMERALD II
(Moléculas/ml)
	Sin SDS	+ SDS 0,03%
	Señal	S/B	Señal	S/B
1,2 x 10^{7}	949	3.340	4.741	3.560
1,5 x 10^{6}	132	465	610	459
1,9 x 10^{5}	16,5	58,5	92,5	69,5
1,2 x 10^{4}	1,58	5,6	7,31	5,5
Diluyente	0,284	-	1,33	-
	CDP STAR + SAPPHIRE II
	Sin SDS	+ SDS 0,03%
	Señal	S/B	Señal	S/B
1,2 x 10^{7}	694	6.310	8.222	5.555
1,5 x 10^{6}	106	964	1.135	767
1,9 x 10^{5}	15,5	141	158,5	107
1,2 x 10^{4}	1,20	10,9	14,7	9,9
Diluyente	0,11	-	1,48	-

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: CHIRON CORPORATION

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Intensificación de Fosfatasa Alcalina con SDS en Sustratos Quimioluminiscentes y Ensayos de Inhibición en Enzimática

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

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(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Chiron Corporation

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(B)

CALLE: 4560 Horton Street

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(C)

CIUDAD: Emeryville

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAÍS: Estados Unidos

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(F)

ZIP: 94608

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE REGISTRO:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Goldman Esq., Kenneth M.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34.174

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 1014.100

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(ix)

INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: (510) 601-2719

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(B)

TELEFAX: (510) 655-3542

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(ix)

CARACTERÍSTICAS:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: características varias

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(B)

LOCALIZACIÓN: 19

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(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nombre estándar= "N4-(6-aminocaproil-2-aminoetil)citosina"

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGTACGACA ACCACATCN

\hfill

19

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTGCTGCT CCCAAGAA

\hfill

18

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTTGGGAG CAGCAGGACT CTTGGAAAGA AAGTGAAGTG

\hfill

40

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(ix)

CARACTERÍSTICAS:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: características varias

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(B)

LOCALIZACIÓN: 1

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(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nombre estándar= "N4-(6-aminocaproil-2-aminoetil)citosina"

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NCACTTCACT TTCTTTCCAA GAG

\hfill

23

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGTGGTTG TCGTACTTTC CTGCTGCTCC CAAGAA

\hfill

36

Claims (10)

1. Una sonda de marcaje que comprende una fosfatasa alcalina hidrofílica purificada conjugada a una sonda oligonucleotídica.

2. Una sonda de marcaje de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el oligonucleótido está conjugado a una población uniforme de sitios en la fosfatasa alcalina.

3. Una sonda de marcaje de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que la fosfatasa alcalina hidrofílica purificada consta esencialmente de un dímero de fosfatasa alcalina.

4. Un método para preparar una sonda de marcaje de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, que comprende:

(a) la provisión de una fosfatasa alcalina hidrofílica purificada y

(b) la conjugación de la fosfatasa alcalina hidrofílica con una sonda oligonucleotídica.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la fosfatasa alcalina es conjugada a la sonda oligonucleotídica en presencia de un agente protector del sitio activo de la fosfatasa alcalina.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, en el que el agente protector del sitio activo de la fosfatasa alcalina es seleccionado del grupo que consta de sustratos de la fosfatasa alcalina, análogos de sustratos de la fosfatasa alcalina e inhibidores de la fosfatasa alcalina.

7. Un método para detectar un oligonucleótido diana en una muestra, que comprende:

(a) la provisión de una sonda de captura (CP) unida a un soporte que contiene una región que tiene una secuencia de ácido nucleico C-3;

(b) la provisión de una sonda de marcaje (LP) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que contiene una región que tiene una secuencia de ácido nucleico L-3;

(c) la provisión de un extensor de marcaje (LE) que contiene una región que tiene una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico, donde la primera secuencia de ácido nucleico L-2 del LE es complementaria a la secuencia de ácido nucleico L-3 y la segunda secuencia de ácido nucleico L-1 del LE es complementaria a una secuencia de ácido nucleico del analito diana;

(d) la provisión de un extensor de captura (CE) que contiene una región que tiene una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico, donde la primera secuencia de ácido nucleico C-2 del CE es complementaria a la secuencia de ácido nucleico C-3 y la segunda secuencia de ácido nucleico C-1 del CE es complementaria a la segunda secuencia de ácido nucleico L-1 del LE;

(e) la incubación de la muestra con el LE y con la LP bajo condiciones para una primera hibridación con el fin de formar una primera mezcla de reacción que contiene un complejo híbrido LP/LE/diana y un complejo híbrido LP/LE no unido;

(f) la incubación de la primera mezcla de reacción con la superficie de un soporte sólido que contiene un complejo híbrido CE/CP unido a la superficie bajo condiciones para una segunda hibridación, formándose de este modo una segunda mezcla de reacción que contiene un complejo híbrido LP/LE/diana/CE/CP unido a la superficie y un complejo LP/LE/diana no unido;

(g) la separación posterior de los materiales no unidos al soporte sólido de los unidos al soporte sólido y

(h) la detección de la presencia de marca en el complejo híbrido LP/LE/diana/CE/CP unido al soporte.

8. Un método para detectar un oligonucleótido diana en una muestra, que comprende:

(a) la provisión de una sonda de captura (CP) unida a un soporte que contiene una región que tiene una secuencia de ácido nucleico C-3;

(b) la provisión de una sonda de marcaje (LP) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que contiene una región que tiene una secuencia de ácido nucleico L-3;

(c) la provisión de un extensor de captura (CE) que contiene una región que tiene una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico, donde la primera secuencia de ácido nucleico C-2 del CE es complementaria la secuencia de ácido nucleico C-3 y la segunda secuencia de ácido nucleico C-1 del CE es complementaria a una secuencia de ácido nucleico del analito diana;

(d) la provisión de un extensor de marcaje (LE) que contiene una región que tiene una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico, donde la primera secuencia de ácido nucleico L-2 del LE es complementaria a la secuencia de ácido nucleico L-3 y la segunda secuencia de ácido nucleico L-1 del LE es complementaria a la segunda secuencia de ácido nucleico C-1 del CE;

(e) la incubación de la muestra con el CE y la CP bajo condiciones para una primera hibridación con el fin de formar una primera mezcla de reacción que contiene complejos híbridos CP/CE/diana y complejos híbridos CP/CE no unidos;

(f) la incubación de la primera mezcla de reacción con un complejo híbrido LE/LP bajo condiciones para una segunda hibridación, formándose de este modo una segunda mezcla de reacción que contiene un complejo híbrido LP/LE/diana/CE/CP unido a la superficie y un complejo LP/LE no unido;

(g) la separación posterior de los materiales no unidos al soporte sólido de los unidos al soporte sólido; y

(h) la detección de la presencia de marca en el complejo híbrido LP/LE/diana/CE/CP unido al soporte.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que la marca es detectada por una señal quimioluminiscente.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la señal quimioluminiscente es generada por la activación de un 1,2-dioxetano estable.