JPH11507531A

JPH11507531A - 化学発光基質におけるｓｄｓを用いたアルカリホスファターゼの増強および酵素阻害アッセイ

Info

Publication number: JPH11507531A
Application number: JP9501991A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．シェリダン，パトリック; シー．ガグン，ジュリオ; エル．アンダーソン，メアリー; エヌ．ルドツク，ダグラス
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-07-06
Also published as: WO1996041015A3; US5853974A; DE69635109D1; AU716770B2; DE69635109T2; ES2315769T3; EP0832296B1; EP1616966A2; EP0832296A2; ES2247605T3; ATE302856T1; WO1996041015A2; AU6266396A; ATE415494T1; DE69637766D1; EP1616966B1; EP1616966A3

Abstract

(57)【要約】核酸ハイブリダイゼーションアッセイに用いる、特異的酵素活性の高い均質なアルカリホスファターゼーオリゴヌクレオチドプローブコンジュゲートを調製する方法を開示する。刺激されて化学発光を生成する安定な1,2-ジオキセタンからの化学発光を、増強するための方法および組成物を開示する。また、これらの方法および組成物を用いる、間接的競合的核酸ハイブリダイゼーションアッセイフォーマットを記載する。

Description

【発明の詳細な説明】化学発光基質におけるＳＤＳを用いたアルカリホスファターゼの増強および酵素阻害アッセイ技術分野本発明は、一般分析アッセイに関し、特にハイブリダイゼーションアッセイおよび核酸化学に関する。本発明は、高い特異的活性の検出を伴うシグナルを提供し、かつ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて標識プローブの不均質な集団(heterogeneous population)の使用に主に起因するバックグラウンドノイズを最小にすることによって標識依存的なシグナルを発生する、標識オリゴヌクレオチドを調製するための方法に関する。本発明はまた、化学発光シグナルの発生を包含する分析アッセイの感度および速度を増強するための方法および、高い特異的活性の検出を伴うシグナルおよび最小限のバックグラウンドノイズを有する核酸ハイブリダイゼーションアッセイを提供するためにそのような増強方法を使用することに関する。本発明はまた、遺伝子型、アンチセンスおよびアプタマー治療剤、変異分析および不連続プローブマッピング(discontinuous probe map ping)に応用可能である。背景核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、遺伝子の研究、バイオメディカルの研究および臨床診断に通常用いられている。基本的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいては、一本鎖核酸分析物を標識一本鎖核酸プローブにハイブリダイズし、得られる標識２重鎖を検出する。精度を高め、検出しようとする２重鎖を外来性物質(extraneous material)から分離することを容易にし、および／またはシグナルを増幅するために、この基本スキームの変形法が開発されている。そのようなアッセイの１つが、共譲渡されたUrdeaらの米国特許第4,868,105号に詳細に記載されており、この開示を本願において援用する。このアッセイは、ポリヌクレオチド分析物を固体支持体に結合するように設計された２段階捕獲システムの使用および、検出可能な標識を検出あるいは定量化したいポリヌクレオチド分析物に結合するための２段階標識システムの使用を包含する。２段階捕獲システムは、固体支持体に結合した捕獲プローブの使用および、捕獲プローブのセグメントにもポリヌクレオチド分析物のセグメントにもハイブリダイズする捕獲延長分子の使用を包含する。２段階標識システムは、ポリヌクレオチド分析物のセグメントにハイブリダイズする標識延長分子の使用および、標識延長分子にハイブリダイズしかつ検出可能な標識を含有するか検出可能な標識に結合する、標識プローブの使用を包含する。そのようなハイブリダイゼーションアッセイのシグナル発生成分として、アルカリホスファターゼーオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えばEP 883096976 号を参照）が、しばしば用いられる。適切な基質、例えば酵素刺激性ジオキセタンホスフェート(enzyme-triggered dioxetane phosphate)（Schaapら、（1987） Tet.Lett.28: 1159-1162およびEPA Pub.No.0254051）を加えることにより、検出可能な化学発光シグナルが得られる。しかし、一部には、コンジュゲーションに利用可能なアルカリホスファターゼ分子の不均質な集団（これは標識プローブの非特異的結合に寄与する）のために、このようなアッセイにおいてバックグラウンドノイズレベルは理想的でないことがある。低いシグナル対ノイズ比はまた、酵素の活性部位またはその近傍における反応性部位へのコンジュゲートが可能な条件下でオリゴヌクレオチドを酵素にコンジュゲートすることによってアルカリホスファターゼ標識プローブを調製することに起因し得、これによってアルカリホスファターゼ特異的酵素活性を減少させる。アルカリホスファターゼは、典型的に、ウシまたは仔ウシの腸粘膜から得られる。高度に精製されたアルカリホスファターゼは、この酵素の親水性画分および疎水性画分を産出する４段階のプロセスによって得られる（Bublitzら、（1993 ）Eur．J．Biochem．217: 199-207）。ウシまたは仔ウシの腸アルカリホスファターゼは、(I)アンカーレスダイマー( anchorless dimer)、(II)４０のグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー分子、(III)(II)と同様なテトラマーに加え、テトラマーの1/2について、２つの脂肪酸がイノシトールに結合したテトラマー、(IV)アルカリホスファターゼサブユニット毎につき２つの脂肪酸分子を有するオクタマー、および(V)アルカリホスファターゼサブユニット毎につき３つの脂肪酸分子を有するオクタマーの５つの画分に分離され得る（Bublitzら、前出）。このように、アルカリホスファターゼサブユニットの数、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー分子の有無、およびサブユニット毎の様々な数の脂肪酸分子の有無が、標識オリゴヌクレオチドプローブを調製するために典型的に用いられるアルカリホスファターゼ集団の不均質性(heterogeneity)に、寄与する。画分(II)〜(V)におけるグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー分子および脂肪酸残基の疎水性が、核酸ハイブリダイゼーションアッセイのバックグラウンドノイズレベルに寄与していると思われる。コンジュゲートが酵素上の酵素活性部位を含む様々な部位において形成されるような条件下で調製されたアルカリホスファターゼオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用に起因して、望ましくないバックグラウンドノイズが発生する可能性がある。酵素−プローブコンジュゲート集団におけるこの不均質性が原因で、標識プローブが理想の特異的酵素活性に満たないものとなる。高い特異的活性の検出を伴う、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブの均質な集団の欠如は、典型的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイの感度および正確さ(precision)を制限し得る。また、化学発光性ジオキセタンなどの基質の使用は酵素結合アッセイ法(enzym e linked assay methods)において高感度な検出手段を提供するが、そのようなアッセイの感度および速度は、本願においてその開示を援用するEPA Publicatio n No．0630884に開示されるようなジカチオン性(dicationic)界面活性剤の使用によって増大することができる。このような界面活性剤は、例えば1,2-ジオキセタンなどの化学発光性化合物の、酵素のような活性化剤によって刺激される分解によって発生する化学発光を、増強する。同様な効果を有する他の増強剤は、本願においてその開示を援用する米国特許第5,145,772号に開示されるような、ポリカチオン性(polycationic)界面活性剤である。これらのポリカチオン性増強剤は、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）などのポリマー状４級アンモニウム塩(polymeric quaternary ammonium salt)である。化学的に刺激されたジオキセタン化学発光によって発生する、検出可能な光強度をさらに改善することにより、これらのプロセスを用いるアッセイにおいてさらなる利点が得られることが、当業者には理解されるであろう。発明の要約サンプル中の核酸分析物を検出するための方法が提供される。これらの方法は一般に、競合的間接的なアッセイフォーマット(format)において、ハイブリダイゼーション条件の調節を可能にすることによってアッセイ感度および特異性を増強する溶液相ハイブリダイゼーションアッセイ(solution phase hybridization assay)を包含する。また、活性化されることによって化学発光シグナルを発生することが可能な分子からの化学発光を増強するための、組成物および方法が提供される。また、これらの組成物および方法を用いて、サンプル中の核酸分析物を検出するためのアッセイ方法が提供される。一般に、これら組成物は、疎水性アニオン性化学発光増強剤を含み、これらの方法は、アッセイまたは分析技術においてそのような増強剤を提供することを包含し、化学発光シグナルが発生されることによりアッセイ感度および特異性を増強する。さらに、サンプル中の核酸分析物を検出するための方法は、競合的間接的なアッセイフォーマットにおいて、ハイブリダイゼーション条件の調節を可能にすることによってアッセイ感度および特異性を増強する溶液相ハイブリダイゼーションアッセイを包含する本発明の目的の１つは、活性化されることによって化学発光シグナルを発生することが可能な分子からの化学発光を増強するための方法を提供することである。本方法は、活性化されることによって化学発光シグナルを発生することが可能な分子、ジカチオン性またはポリカチオン性界面活性剤、および疎水陰イオン性増強剤を提供すること、ならびに、この分子を活性化することを包含する。本発明の別の目的は、活性化されることによって化学発光シグナルを発生することが可能な分子を含む組成物、ジカチオン性またはポリカチオン性界面活性剤、および疎水陰イオン性増強剤を提供することである。本発明の更に別の目的は、間接的競合的核酸ハイブリダイゼーションを提供することであり、このハイブリダイゼーションにおいて「捕獲延長」分子が用いられ、捕獲延長分子は「標識延長」分子に結合し、次に標識延長分子は検出可能な標識が結合した標識プローブに結合する。この標識プローブは、活性化された化学発光シグナルを発生し得る分子を活性化することによって、化学発光シグナルを発生し得る。好適なフォーマットにおいて、捕獲延長は、支持体に結合した(s upport-bound)「捕獲プローブ」ならびに標識延長および分析物中の標的ヌクレオチド配列に結合する、橋渡しプローブ(bridging probe)であり、そして標識延長分子は、捕獲延長ならびに、「標識プローブ」（すなわち、安定な1,2-ジオキセタンを刺激することによって化学発光シグナルを発生することが可能な検出可能な標識が結合されたオリゴヌクレオチドセグメント）に結合する、橋渡しプローブ(bridging probe)である。別のフォーマットにおいて、標識延長は、標識プローブならびに捕獲延長および分析物中の標的ヌクレオチド配列に結合する、橋渡しプローブであり、捕獲延長分子は、標識延長分子ならびに捕獲プローブに結合する、橋渡しプローブである。本発明のさらなる目的は、標識プローブの均質な集団、およびその調製方法を提供することである。発明の一実施態様において、そのような標識プローブを、本願において開示および請求の範囲に記載される新規なアッセイフォーマットに導入する(incorporate)。このような標識プローブは、増強された特異的酵素活性を有しており、増強されたアッセイシグナルの検出を生じる。更なる目的は、増強された分析物検出感度および選択性を有し、増強された特異的酵素活性を有しかつ増強されたアッセイシグナルの検出を生じる単分子形態(single molecula r form)標識プローブを導入する、アッセイフォーマットを提供することである。標識プローブは、アンカーレスで疎水性のアルカリホスファターゼの精製と、酵素活性部位がコンジュゲーションから保護されかつオリゴヌクレオチドの酵素へのコンジュゲーションが位置指定(site-directed)である条件下における、酵素のオリゴヌクレオチドプローブへのコンジュゲーションと、このような調製された標識プローブをさらに精製することとを包含する方法によって調製される。一実施態様において、本発明は、ジオキセタン、ジカチオン性またはポリカチオン性界面活性剤および、式Ｒ¹Ｘ^-Ａ⁺を有する疎水性陰イオン性増強剤を提供することによって、安定な1,2-ジオキセタンから発生される化学発光を増強するための方法に関する。ここで、Ｒ¹は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択された、置換されたまたはされていない炭化水素部分(moiety)であり得る疎水性基である。Ｘ^- はＲ¹部分に共有結合した陰イオン性部分である。Ａ⁺は対陽イオン(countercati on)である。本発明の別の実施態様において、安定な1,2-ジオキセタン、ジカチオン性またはポリカチオン性界面活性剤および、式Ｒ¹Ｘ^-Ａ⁺を有する疎水性陰イオン性増強剤を含有する組成物が提供される。ここで、Ｒ¹は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群より選択された、置換されたまたはされていない炭化水素部分(moiety)であり得る疎水性基である。Ｘ^-はＲ¹部分に共有結合した陰イオン性部分である。Ａ⁺は対陽イオンである。アッセイフォーマットの一実施態様において、標的ヌクレオチド配列を有する分析物を含有するあるいは含有すると疑わしきサンプルを、支持体に結合した捕獲プローブ／捕獲延長のハイブリッド錯体を用いて、第１のハイブリダイゼーション条件下でまずインキュベートする。このように生成された、非錯体化状態の (uncomplexed)捕獲プローブ／捕獲延長ハイブリッドおよび捕獲プローブ／捕獲延長／分析物錯体を含有する反応混合物を次に、標識延長および標識プローブ分子を用いて第２のハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする。非錯体化状態の捕獲プローブ／捕獲延長ハイブリッドと、標識延長／標識プローブハイブリッドとの間に形成された錯体を次に、標準的な方法または、上述の化学発光を増強するための方法および組成物を用いて化学発光を検出することにより、検出する。検出されたシグナルの量は、サンプル中に存在する分析物の量に反比例する。アッセイフォーマットの別の実施態様において、標的ヌクレオチド配列を含む分析物を含有するあるいは含有すると疑わしきサンプルを、標識プローブ／標識延長のハイブリッド錯体を用いて、第１のハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする。このように生成された、非錯体化状態の標識プローブ／標識延長ハイブリッドおよび標識プローブ／標識延長／分析物錯体を含有する反応混合物を次に、捕獲延長および支持体に結合した捕獲プローブ分子を用いて第２のハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする。非錯体化状態の標識プローブ／標識延長ハイブリッドと、捕獲延長／捕獲プローブハイブリッドとの間に形成された錯体を次に、標準的な方法または、上述の化学発光を増強するための方法および組成物を用いて、検出する。検出されたシグナルの量は、サンプル中に存在する分析物の量に反比例する。本発明のその他の目的、効果および新規な特徴は、あるいは以下の説明において述べられ、あるいは以下を精査すること当業者に理解され、または本発明を実施することによりわかるであろう。図面の簡単な説明図１は、サンプルをまず標識プローブ／標識延長ハイブリッド錯体を用いてインキュベートする、間接的競合的溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイフォーマットの図である。図２は、サンプルをまず支持体に結合した捕獲プローブ／捕獲延長ハイブリッド錯体を用いてインキュベートする、間接的競合的溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイの図である。図３は、可溶アルカリホスファターゼアッセイにおける、疎水陰イオン性増強剤ナトリウムドデシルスルフェートの不在下（黒三角形）および存在下（黒四角形）における、化学発光シグナルの進展の時間経過を示すグラフである。図４Ａは、可溶アルカリホスファターゼアッセイにおける、疎水陰イオン性増強剤ナトリウムドデシルスルフェートのバックグラウンド化学発光に対する効果を、増強剤の不在下（黒三角形）および存在下（黒四角形）において示したグラフである。図４Ｂは、ナトリウムドデシルスルフェートの、可溶アルカリホスファターゼの不在下（黒三角形）および存在下（黒四角形）において発生する化学発光に対する効果を、示したグラフである。図４Ｂにおいて、データは対数スケールでプロッティングしている。図５は、アルカリホスファターゼをオリゴヌクレオチドプローブにコンジュゲートする可溶アルカリホスファターゼアッセイにおいて発生する化学発光に対する、ナトリウムドデシルスルフェート（黒四角形）およびBrij-35（黒三角形）の濃度の効果を示したグラフである。発明の詳細な説明定義および用語本発明を開示し詳細に説明する前に、本発明は特定のアッセイフォーマット、材料、試薬に限定されるものではなく、これらは当然変化し得ることが理解されるべきである。また、本願において用いる用語は、特定の実施態様を説明するためのものであり、何らの限定を意図するものではないことが理解されるべきである。本明細書および付属の請求項において用いられるように、単数形「a」「an」および「the」は、文脈ではっきりそうでないことを明示している場合以外は、複数の対象を含むことに留意されたい。従って、「a hydrophobic group」に言及するとき、これは２つ以上のそのような疎水性基(hydrophobic groups)を含み、「a label extender」に言及するときはそのような分子の混合物を含み、「a target nucleotide sequence」に言及するときは２つ以上のそのような配列の混合物を含む、といった具合である。本明細書および以下の請求項において、いくつかの用語に言及するが、これらは以下の意味を有するものと定義する：本願において、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」の用語は、ポリマーがDNAおよびRNAに見られるような塩基対および塩基スタックを可能にするような構成で核酸塩基(nucleobase)を含有している限り、ポリデオキシヌクレオチド（2-デオキシ-D-リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（D-リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン基のN-グリコシドである他の任意のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー（例えば、タンパク質核酸および、オレゴン州CorvallisのAnti-Gene Development G r ての上位概念を規定する。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオテド」の用語に関して何ら長さの差を意図しているわけではなく、これらの用語は同様に用いている。これらの用語は、分子の１次構造にのみ言及するものである。従って、これらの用語は２重鎖および一本鎖DNAならびに、２重鎖および一本鎖RNA およびDNA:RNAハイブリッドを包含し、また、公知のタイプの修飾例を含む。例えば、当該分野において公知の標識、メチル化(methylation)、「キャップ」、天然に生じる１つ以上のヌクレオチドをアナログで置換すること、ヌクレオチド間修飾（例えば無電荷連鎖(uncharged linkage)を有するもの（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および帯電連鎖(charged linkage)を有するもの（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分(pendant moiety)を含有するもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L- リジンなど）など、インターカレーター（アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート化剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾連鎖を有するもの（アルファアルマー核酸など））、ならびにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの非修飾形態である。本明細書において、「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」の用語は、公知のプリンおよびピリミジン基だけでなく他の修飾されたヘテロシクリック基をも含有する部分も、含む。このような修飾は、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、もしくは他のヘテロ環を含む。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、糖部分の修飾、例えば水酸基をハロゲン、脂肪族基によって置換したものあるいはエーテル、アミンなどによって官能化したものを含む。用語「ポリヌクレオチド分析物」は、標的核酸配列を含有する一本鎖または２重鎖核酸分子を指す。分析物核酸は、様々な供給源(source)からのもの、例えば生物学的液体または固体、食料品(food stuff)、環境材料(environmental mater ial)などであり得、例えば、プロテナーゼＫ／ナトリウムドデシルスルフェート（「SDS」）、カオトロピック塩(chaotropic salt)などの、様々な手段によってハイブリダイゼーション分析用に調製し得る。「ポリヌクレオチド分析物」の用語は、本願において、「分析物」、「分析物核酸」、「標的」、および「標的分子」の用語と同様に用いられる。本願において、「標的領域」、「標的配列」または「標的ヌクレオチド配列」の用語は、標的分子内に含有されるプローブ結合領域を指す。「標的配列」の用語は、プローブが所望の条件下で安定なハイブリッドを形成し得る対象の配列を指す。本願において、「プローブ」の用語は、上記に定義するように、標的分子中に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含有する、ポリヌクレオチドからなる構造を指す。プローブのポリヌクレオチド領域は、DNAおよび／またはRNAおよび／または合成ヌクレオチドアナログからなり得る。安定なハイブリッドを提供するために、結合配列は完全な相補性を有している必要はないことが理解されるであろう。多くの状況において、４つ以上のヌクレオチドからなるループを無視した場合、約10％よりも少ない塩基がミスマッチである場合に安定なハイブリッドが形成される。従って、本願において、「相補性」の用語は、一般に約90％以上の相同性が存在するアッセイ条件下において、その「相補物」と安定な２重鎖を形成するオリゴヌクレオチドを指す。典型的には、そのような相補性結合配列は、約15〜50個、好ましくは15〜30個のヌクレオチドを含有している。本発明のポリヌクレオチドは、PCT Publication No.WO92/024526に詳細に記載されているような、固相直接オリゴヌクレオチド合成および酵素的ライゲーション法の組み合わせを用いて組み立てられ得る。「アルカリホスファターゼ活性部位保護剤」は、アルカリホスファターゼの活性部位に結合することにより、活性部位に含有されるアミノ酸を化学的修飾から保護する、化合物を指す。このようなアルカリホスファターゼ活性部位保護剤は、ホスフェートのようなアルカリホスファターゼ基質、ホスフェートアナログであるホスホン酸およびヒ酸(arsonic acid)化合物などのような基質アナログ、またはその他のアルカリホスファターゼインヒビタである。好適なアルカリホスファターゼ活性部位保護剤は、酵素の活性部位に対して可逆的結合親和性を有する、競合的インヒビタまたはその他の化合物である。本願において、「生物学的サンプル」とは、個体(individual)から単離された組織または液体のサンプルを指し、例えば、血漿、血清、脊髄液(spinal fluid) 、精液、リンパ液、皮膚の外部、呼吸経路、腸経路、および尿生殖経路、涙、唾液、乳、血球、腫瘍、臓器、ならびにインビトロ細胞培養構成物（これに限定されないが、細胞培養培地における細胞成長の結果得られる条件付け培地(conditi oned medium)、ウィルスに感染していると推定される細胞、組換え細胞、および細胞成分を含む）のサンプルを含むが、これらに限定されない。本方法の公的な用途(use)は、例えばＢ型肝炎ウィルス（「HBV」）、Ｃ型肝炎ウィルス（「HCV 」）、Ｄ型肝炎ウィルス（「HDV」）ウィルス、ヒト免疫不全症候群ウィルス(「 HIV」)、およびヘルペス科のウィルス（帯状疱疹（水痘）、単純疱疹ウィルスＩおよびII、サイトメガロウィルス、エプスタイン・バーウイルス、ならびに細菌単離されたヘルペスVIウィルスを含む）由来の、ウィルス抗原をコードするポリヌクレオチドならびにサイトカインなどの細胞産物をコードするポリヌクレオチドの検出および／または定量化にある。本願において、「非特異的結合」とは、ポリヌクレオチドが、支持体に結合したポリヌクレオチドに対する水素結合を含まない直接または間接の相互作用を通じて、固体支持体その他のアッセイ成分に結合する場合(occurrence)を指す。「精製された」または「均質な」とは、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列に言及するときは、言及された分子が、他の同じタイプの生物学的マクロ分子が実質的な不在の中で存在することを、意味する。本願で用いられる用語「精製された」または「均質な」は、好ましくは少なくとも90重量％、より好ましくは少なくとも95重量％、最も好ましくは少なくとも98重量％の、同じタイプの生物学的マクロ分子が存在することを意味する。従って、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドポリペプチドコンジュゲートの「単分子形態(s ingular molecular form)」とは、精製されたあるいは均質な形態で存在する分子である。オリゴヌクレオチドコンジュゲート化アルカリホスファターゼにおける「均質な部位の集団」とは、オリゴヌクレオチドの50％、好ましくは75％、より好ましくは80％、さらにより好ましくは90％が、ｎ個のトリプシン断片中に見いだされることを意味する。例えば、単一のオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされたアルカリホスファターゼの均質な部位の集団は、コンジュゲートされたアルカリホスファターゼの、単一のオリゴヌクレオチドを含有するトリプシン断片によって示される。「高特異性酵素活性(high specific enzym eactivity」アルカリホスファターゼとは、酵素タンパク質mgにつき少なくとも約2,000〜3,000ユニットの酵素活性を意味する。１ユニットの活性とは、１Ｍジエタノアラミン/HCl、pH 9.8中において、毎分１モルのp-ニトロフェニルホスフェートからp-ニトロフェニルへの変換を触媒することができる酵素の量を、表す。「安定な1,2-ジオキセタン」の用語は、２つのケトン化物に分解するためには加熱される必要があるジオキセタン化合物を包含することを意図している。化学発光が「刺激される」のは、本来熱分解時において化学発光を発する安定な1,2- ジオキセタンの分解が、熱の使用を必要としないプロセスによって行われたときとする。1,2-ジオキセタン化学発光は、有機溶剤への塩基の追加、フッ化物イオン、またはアルカリホスファターゼなどの酵素が1,2-ジオキセタンを化学発光性の種へ触媒的変換する作用によって、刺激され得る。本願において「アルコール」の用語は、置換基が１〜24個の炭素原子を含む分岐または非分岐、飽和または不飽和の炭化水素鎖である、１級、２級、または３級アルコール、カルビノール、および多水酸基(polyhydric)アルコールを指す。用語「低級アルコール」とは、１〜６個の炭素原子の置換基を有するアルコールを意図している。好適なアルコールは、非分岐飽和炭化水素置換基を含有する１級アルコールである。本願において「アルキル」の用語は、１〜20個の炭素原子の、分岐または非分岐の飽和炭化水素基を指しており、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘクサデシル、エイコシルなどである。本願において好ましいアルキル基は、１〜12個の炭素原子を含有する。「低級アルキル」の用語は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子のアルキル基を意図している。「シクルアルキル」の用語は、典型的には３〜６個の炭素原子、より好ましくは４〜５個の炭素原子のシクリックアルキル基を意図している。本願において「アルキレン」の用語は、２官能性の(bifunctional)飽和かつ分岐または非分岐の炭化水素鎖を指し、例えば、メチレン（-CH₂-）、エチレン(-C H₂-CH₂-)、プロピレン（-CH₂-CH₂-CH₂-）、2-メチルプロピレン[-CH₂-CH(CH₃)-C H₂-]、ヘキシレン[-(CH₂)₆-]などを含む。「低級アルキレン」は、１〜６個、より好ましくは１〜４個の炭素原子のアルキレン基を指す。「アルケニル」および「アルケニレン」の用語はそれぞれ、２〜24個の炭素原子および少なくとも１つの２重結合を含む、単官能性および２官能性の分岐または非分岐の炭化水素鎖を指す。「アルキニル」および「アルキニレン」の用語はそれぞれ、２〜20個の炭素原子および少なくとも１つの３重結合を含む、単官能性および２官能性の分岐または非分岐の炭化水素鎖を指す。本願において「アリール」の用語は、典型的にはアルキレン、アルケニレン、およびアルキニレンからなる群より選択される、１つ以上の置換基で置換されたあるいはされていない、１〜５個の芳香環を含有する芳香族種を指す。「アラルキル」の用語は、部分のアルキルセグメント中に典型的には約２０個未満の炭素原子、より典型的には約１２未満の炭素原子を含有し、典型的には１〜５個の芳香環を含有する、アルキル種およびアリール種の両方を含有する部分を意図する。「アラルキル」の用語は通常、アリール置換されたアルキル基を指して用いられる。「アラルキレン」の用語は、同様に、アルキレン部分(portion)中に典型的には約２０個未満の炭素原子、かつアリール部分(portion)中に１〜５個の芳香環を含有する、アルキレン種およびアリール種の両方を含有する部分を指して用いられ、典型的にはアリール置換されたアルキレンである。「オプションの」または「オプションとして」は、そのことに続いて説明される事柄または状況が起こるかも起こらないかもしれず、当該説明が、上記事柄または状況が起こる場合も起こらない場合も包含することを意味する。例えば、「オプションとして洗浄される」という字句は、洗浄工程が起こるかも起こらないかもしれず、当該方法の説明は洗浄工程ありで進行する場合となしで進行する場合の両方を含むことを、意味する。次に、図１および図２に示す好適な実施態様に関して、ここで記述するハイブリダイゼーションアッセイに以下の用語が適用される。「標識プローブ(LP)」は、標識延長に結合し、検出可能なシグナルを発生し得る標識部分を含有するように設計される。核酸配列に結合した標識を提供するための様々な手段が文献に報告されている。例えば、Learyら、（1983）Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 80: 4045；Renzら、（1984）Nucl．Acids Res．12: 3435；R ichardsonら、（1983）Nucl．Acids Res．11: 6167；Smithら、（1985）Nucl．A cids Res．13: 2399；Meinkothら、（1984）Anal．Biochem．138:267；Klibanov ら、（1989）Applied Biochem．Biotechnol．22: 45；Grumbachら、（1991）J． Immunol．Meth．140: 205；Forgacら（1992）Chemicke Listy 86: 253；Sehgal ら、（1994）Anal．Biochem．218: 87；および Lewisら、（1994）Bioconjugate Chem．5: 565を参照のこと。標識は、共有結合的または非共有結合的に（例えばイオン的、またはビオチン−アビジン連鎖などの高親和性錯体を通じて）に、相補的配列に結合し得る。使用可能な標識は、放射性核種、蛍光体(fluorescer) 、化学発光体(chemiluminescer)、染料、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素インヒビタ、酵素サブユニット、金属イオンなどを含む。例示的な特定の標識としては、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド(Texas red)、フィコエリトリン、アンベリフェロン(umbelliferone)、ルミノール、NADPH、a-b-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどがある。標識の性質に応じ、様々な技術を用いて標識の存在を検出し得る。蛍光体については、多くの異なる蛍光計が利用可能である。化学発光体については、輝度計（luminometer）またはフィルムが利用可能である。酵素については、蛍光、化学発光、または着色生成物が得られ、蛍光測定的、輝度測定的、分光光度測定的、または視覚的に決定を行うことができる。イムノアッセイに用いられてきた様々な標識およびイムノアッセイに利用可能な技術を、本アッセイに用いることができる。好適な標的部分の１つとして、アルカリホスファターゼがある。アルカリホスファターゼ基質を標識部分としてのアルカリホスファターゼとともに用いる方法は、当該分野において公知である（Schaapら、Tet．Lett．28: 1159-1162(1987) および EPA Pub．No.0254051）。 LPは、標識延長中に存在する核酸配列L-2に相補的な核酸配列L-3を有する領域を有しており、検出可能シグナルを直接的または間接的に提供する標識に結合しているか、あるいは結合するような構造を有している。L-3配列はL-2にのみ相補的であるかまたはその逆であるように設計されており、アッセイ系中の他のいかなる成分中の配列に対しても相補的でないように設計されている。LPは、配列L- 3に隣接して、スペーサ領域などの追加的な非相補的領域を有していてもよい。「標識プローブ延長分子（LE）」（本願において「標識延長分子」または「標識延長」とも呼ぶ）は、分析物ポリヌクレオチド、および／またはアッセイフォーマットに応じて捕獲延長(L-1)および標識プローブ(L-2)に対して、相補的な領域を含有している。このように、標識延長分子は、分析物ポリヌクレオチドの配列および／または捕獲延長の配列に相補的な核酸配列L-1を有する第１の領域ならびに、標識プローブのセグメントL-3に相補的な標識プローブ認識配列L-2を有する第２の領域を有する、一本鎖ポリヌクレオチド鎖である。LEは、L1およびL2 の間のスペーサー領域などのような、追加的な非相補的領域を有していてもよい。アッセイフォーマットに応じて、「捕獲プローブ延長分子（CE）」（本願において「捕獲延長分子」または「捕獲延長」とも呼ぶ）は、分析物ポリヌクレオチドおよび／または標識延長分子および固体支持体に結合した捕獲プローブ(CP)に結合する。このように、捕獲延長分子は、分析物の配列または標識延長の配列に対して相補的な核酸配列C-1を有する第１の領域、ならびに、捕獲プローブ認識配列C-2を有する第２の非相補的領域を有する、一本鎖ポリヌクレオチド鎖である。CEは、C-1およびC-2の間のスペーサー領域などのような、追加的な非相補的領域を有していてもよい。本願で開示され、請求の範囲に記載されたアッセイフォーマットにおいて、分析物中の核酸配列に相補的なL-1核酸配列またはC-1核酸配列の、両方ではなくいずれかが、使用される。いずれのフォーマットにおいても、L-1およびC-1は相補的核酸配列である。「捕獲プローブ(CP)」は、捕獲延長および固体支持体に結合する。従って、図１および図２に示すように、捕獲プローブは、C-2に相補的な核酸配列C-3を有する第１の領域および、CPが固体支持体に共有結合する（あるいは共有結合する能力を有する）部分である第２の領域を有する。C-3配列はC-2のみに相補的であるかその逆であるように設計され、アッセイ系中の他の成分中の配列には相補的でないように設計される。CPは、配列C-2に隣接するスペーサ領域などの追加的な非相補的領域を有していてもよい。捕獲プローブは、ハイブリダイゼーション用の固体支持体を作成するために、PCT Publication No．WO93/13224（本願にその開示を援用する）に記載されるような固体支持体に結合してもよい。一般に、図１に示した系を用いて行われる溶液相ハイブリダイゼーションアッセイは、以下のように進行する。標的配列を含む一本鎖核酸を含有するあるいは含有すると疑わしきサンプルを、第１のハイブリダイゼーション条件下において標的プローブおよび標識延長を用いてインキュベートする。このフォーマットにおいて、標識延長は、標識プローブと標的配列または捕獲延長との間にブリッジ (bridge)を形成することが可能なように設計される。得られる生成物は、分析物ポリヌクレオチドが標識プローブ／標識延長ハイブリッドに結合した核酸錯体と、未結合の標識プローブ／標識延長ハイブリッドとの混合物である。この混合物を次に、第２のハイブリダイゼーション条件下において、捕獲プローブにハイブリダイズした捕獲延長を表面に有する固相に、添加する。未結合の標識プローブ／標識延長ハイブリッドは、支持体に結合した捕獲プローブ／捕獲延長ハイブリッドとのハイブリダイゼーションに供され得る(available)。このアッセイフォーマットにおいて、サンプル中の標的配列の存在は、支持体に結合した捕獲プローブ延長にハイブリダイズすることができる標識プローブの集団を、欠乏させる。従って、固体支持体に結合する検出可能なシグナルは、サンプル中の標的配列の量の逆数に定量的に関連している。上述のように検出可能なシグナルによって反映される、サンプル中の標的配列の量は、標準曲線から計算され得る。標準曲線は、標的配列と同一の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドの含有量がわかっている標準製剤(standard formulat ion)を調製することにより、構築され得る。この標準を用いて一連の希釈物を作成し、一連の標準希釈物中のオリゴヌクレオチドの量が、サンプル中の標的配列量の予想範囲(anticipated range)に対応するようにする。一連の標準希釈物を上述のアッセイフォーマット中で用いて、一連の標準希釈物中の既にわかっているオリゴヌクレオチドの量に対応する、一連の検出可能なシグナルを生成することができる。次に、サンプルによって生成されたシグナルを一連の標準希釈物によって生成されたシグナルと比較することにより、サンプル中の標的配列の量を計算し得る。別態様かつ好適な態様であるアッセイフォーマットを図２に図示する。このフォーマットにおいて、捕獲延長は、捕獲プローブと標識延長の標的配列との間にブリッジを形成することができるように設計されている。サンプルをまず、支持体に結合した捕獲プローブ分子にハイブリダイズした捕獲延長分子を用いて、第１のハイブリダイゼーション条件下でインキュベートすることにより、支持体に結合した捕獲プローブ／捕獲延長／分析物ハイブリッドと、遊離捕獲プローブ／捕獲延長ハイブリッドとの混合物を生成する。遊離捕獲プローブ／捕獲延長ハイブリッドは、後に加えられる標識プローブ／標識延長ハイブリッド錯体とのハイブリダイゼーションに供され得る(available)。標識プローブ／標識延長ハイブリッド錯体を加えた後、得られた混合物を第２のハイブリダイゼーション条件下でインキュベートすることにより、検出可能な捕獲プローブ／捕獲延長／標識延長／標識プローブハイブリッドを生成し、未結合の標識プローブ／標識延長ハイブリッド錯体を除去するために洗浄される。検出可能な錯体が結合した固相を次に、未結合の材料から分離して、読み取る。このアッセイフォーマットにおいて、サンプル中の標的配列の存在は、標識プローブ／標識延長ハイブリッドにハイブリダイズ可能な、支持体に結合した捕獲延長分子の集団を、欠乏させる。従って、図１に図示したフォーマットと同様に、固体支持体に結合する検出可能なシグナルは、サンプル中の標的配列の量の逆数に定量的に関連している。上述のように検出可能なシグナルによって反映される、サンプル中の標的配列の量は、標準曲線から計算され得る。典型的には、標識プローブ／標識延長ハイブリッドまたは捕獲プローブ／捕獲延長ハイブリッドの、分析物の予想されるモル数に対する比は、約１:１より大きく、好ましくは少なくとも約10:１、より好ましくは少なくとも約25:１、そして可能性としては100:１以上にも高くなる。各プローブの濃度は、一般に約10^-9 Ｍ〜10^-6Ｍの範囲であり、サンプル核酸濃度は、約10^-21Ｍ〜約10^-12Ｍの範囲である。請求の範囲に記載した発明のアッセイフォーマットのハイブリダイゼーション工程は、適切なストリンジェント条件下で行われる。ストリンジェンシーは、熱動学的変数(thermodynamic variable)であるパラメータを変更することによって、制御され得る。そのような変数は当該分野において周知であり、ホルムアミド濃度、食塩濃度、カオトロピック塩濃度、pH、有機溶剤含有量、および温度を含む。好ましいストリンジェンシーコントロールは、pHおよび食塩濃度である。ストリンジェンシーは、標的配列の長さおよび性質に依存して変化する。プローブ−標的ハイブリッドを形成するための第１のハイブリダイゼーション条件は、アッセイの所望のストリンジェンシーを提供するように調節される。典型的には、プローブ−標的ハイブリダイゼーション反応の特異性を高めるために、第１のハイブリダイゼーション条件は、高ストリンジェンシーである。第２のハイブリダイゼーション条件は、例えば標識プローブ／標識延長ハイブリッドまたは捕獲プローブ／捕獲延長ハイブリッドを形成する際など、互いにハイブリダイズするように設計された配列間でハイブリッドが形成される際に用いられる。従って、第２のハイブリダイゼーション条件は、第１のハイブリダイゼーション条件ほどストリンジェントである必要はない。好ましい第２のハイブリダイゼーション条件は、生理的条件に近似し、37℃、0.15Ｍ単価カチオン、16mM Mg、および1mMスペルミジン(spermidine)である。アッセイの分離工程に用いられる手順は、固相の性質に応じて変化する。粒子の場合は、遠心分離または濾過により、粒子の分離が行われ、上澄みを破棄あるいは上澄みを単離できる。粒子をアッセイする場合は、粒子を通常１〜５回、適切にバッファされた媒体、例えばなどの洗浄剤を含有するホスフェートバッファ化食塩水(PBS)を用いてよく洗浄する。分離手段が壁部または支持体である場合、上澄みを分離または破棄し、壁部を粒子の場合に示した場合と同様に洗浄してもよい。本発明の更なる焦点は、非特異的結合を減少させることによりアッセイ特異性、およびアッセイ感度（すなわち、異なる核酸配列を区別する能力）の両方を増強することである。これらの目的は、その一部、標識高い特異的活性の検出を伴う標識プローブの均質な集団を提供することによって達成される。そのような標識プローブを調製することは、まず、高い特異的活性の検出を伴う精製された親水性アルカリホスファターゼ分子を提供することを包含する。精製されたアルカリホスファターゼを次に、L-3核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブに、コンジュゲートに供され得る酵素上の部位を制御する条件下で、コンジュゲートする。オプションとして、このように形成されたアルカリホスファターゼーオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、更に精製してもよい。精製された親水性アルカリホスファターゼの調製は、前出Bublitzらの手順を用いて行うことができ、その開示を本願において援用する。Bublitzらは、典型的なアルカリホスファターゼ調製物は酵素的に99％純粋であり得るが、１画分以上の酵素からなっている場合があることを報告している。従って、親水性アンカーレスアルカリホスファターゼダイマーは、ウシまたは仔ウシ腸粘膜またはキームス(chyme)から、ブタノールなどの低級アルコールを用いて抽出し、酵素をイムノアフィニティークロマトグラフィーで精製し、アンカーレス親水性ダイマーフィーによってグリコシルホスファチジルイノシトール−アルカリホスファターゼ画分から分離することによって、調整され得る。アンカーレス親水性ダイマー画分はまた、グリコシルホスファチジルイノシトール−アルカリホスファターゼ画分から、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣまたはグリコシルホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＤによって処理し、続いて逆相ク分を分離することによっても、調製することができる。アルカリホスファターゼはまた、ウシ肝臓、胎盤および腎臓、ブタ腸粘膜、胎盤および腎臓、ヒツジ腸粘膜、ならびに大腸菌などのバクテリアを含む、他の供給源(source)および種から得て精製することができる。高い特異的活性の検出を伴う標識プローブの調製は、高度に精製されたオリゴヌクレオチドエステルを、酵素活性部位をコンジュゲーションから保護する分子の存在下において、アルカリホスファターゼ上で反応性アミンにコンジュゲートすることを包含する。このように、コンジュゲーション反応中において、酵素活性部位は、例えばホスフェート、基質アナログまたはホスホン酸などのインヒビタなどの酵素基質とのコインキュベーションから保護され得る。にリゴヌクレオチドエステルの調製および精製技術は当該分野において周知である。例えば、Mo llerら、（1995）Bioconjugate Chem．6: 174およびIvanovskayaら、(1994)Mole cular Biol．28: 754を参照のこと。好ましくは、アルカリホスファターゼーオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、本願においてその開示を援用する、前出Urdeaらの米国特許第4,868,105号およびUrdeaら、（1988）Nucl．Acids Res．16: 4937-4955に記載された方法の変形例を用いて、作成される。本方法は一般に、「活性化」オリゴヌクレオチドを生成するためにクロスリンカーをオリゴヌクレオチドと反応させる、第１の工程を包含する。特に、例えばビス（スルホサクシニミジル）スベレート水溶性架橋剤が好ましい。クロスリンカーのオリゴヌクレオチドに対する比は、反応生成物を最適化するために独立に変化させ得る。一般に、クロスリンカーは、架橋化オリゴヌクレオチドダイマーの形成を避けるのに十分な過剰量存在し得る。従って、クロスリンカー：オリゴヌクレオチド比は、約５対100、好ましくは約５対25、最も好ましくは５対10の範囲である。標識プローブの均質な集団の調製は、次の工程として、アルカリホスファターゼを、酵素上のアミンの反応性が酵素中の反応性部位の均一な(uniform)集団へのコンジュゲーショを導く(direct)ように変調される(modified)条件下において、活性化オリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることを包含する。アルカリホスファターゼ中のアミン基のマイクロ環境(microenvironment)のため、アミンの反応性は、コンジュゲーション反応条件を変化させて、コンジュゲーションを反応性部位の均一な集団に導くことにより、制御され得る。また、活性化オリゴヌクレオチドのアルカリホスファターゼに対する比は、５と100以上の間で変化させ得る。これにより、オリゴヌクレオチドがアミンの均一な集団にコンジュゲートされた標識プローブが産出される。所望の（例えば最大の）酵素活性を有する酵素−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを産出するために、反応溶液のバッファ組成を変更することにより、コンジュゲーション反応のpHを変化させ得る。例えば、コンジュゲーション反応を適切な範囲の生理的pH、すなわち約pH 6.6からpH 8.0、より典型的には約pH 7.2からpH 7.8の範囲にバッファするために、ホスフェートバッファを用い得る。アルカリホスファターゼ基質としてのホスフェートは、酵素活性部位の保護を提供する。反応混合物を所望のpHで提供できる別のバッファ組成は、当該分野において周知であり、例えば、CRC Handbook of Chemistry and Physics、D.R．Lide編、 1994に見いだすことができる。架橋剤を用いた反応においてタンパク質アミン基の反応性がpHの関数として変化することが、前出Grumbachらに報告されている。架橋剤のタンパク質との加水分解反応およびアミノ分解反応のpH依存性の変化は、Anjaneyuluら、（1987）Int．J．Peptide Protein Res．30: 117-124に記載されている。標識プローブ中のオリゴヌクレオチドのアルカリホスファターゼに対する比（すなわち酵素上のコンジュゲート化部位の数）は、当該分野において周知の技術を用いて、分析的ゲル電気泳動によって決定され得る。また、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたアルカリホスファターゼ部位の集団は、当該分野において周知の技術を用い、オリゴヌクレオチドコンジュゲート化酵素を消化して消化物にアミノ酸分析を行うことによって決定することができる。標識プローブの酵素活性を決定し、精製されたアルカリホスファターゼの酵素活性と比較し得る。開始材料の酵素活性の好ましくは70％〜100％、より好ましくは80％〜100％、そして最も好ましくは90％〜100％を有する高特異活性を有する標識プローブを、次に核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いる。オプションとして、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトに精製してもよい。または、そして一般に好ましくは、例えば本願においてその開示を援用するLa ndtら、（1978）Biochem．17: 915-919に記載されたアフィニティークロマトグラフィーを用いて、標識プローブを更に精製する。アルカリホスファターゼ基質または基質アナログを用いたアフィニティークロマトグラフィーは、アルカリホスファターゼ結合部位がインタクトな標識プローブを提供できるという追加的な利点を有する。広範囲の溶液相ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅アッセイ、フィルタハイブリダイゼーション法、ポリメラーゼチェイン反応（「PCR」）を包含するアッセイなどの、標識プローブ分子を用いた実質的にいかなるタイプのハイブリダイゼーションアッセイにおいても使用し得る、高特異活性標識プローブを提供するために、この手順を用い得る。本方法が有用であるハイブリダイゼーションアッセイの一例は、Urdeaらの米国特許第4,868,105号に記載されたもの、または好ましくは、図１および図２に示して上述した構成に関連して説明したものである。アルカリホスファターゼ用の基質組成物は、化学発光性の安定な1,2-ジオキセタンを含む。そのような化学発光性化合物は当該分野において周知である（Voyt aらの米国特許第5,145,772号および欧州特許公報第0630884号などを参照）。好ましい基質組成物は、酵素刺激性ジオキセタンホスフェートを含む。より好ましい基質組成物は、ジオキセタンの化学発光を増強するための２価カチオン性またはポリカチオン性界面活性剤の存在下におけるジオキセタンホスフェートを含み、最も好ましいのは、２価カチオン性界面活性剤および疎水性アニオン性化学発光増強剤の存在下におけるジオキセタンである。 EP A Publication No.0630884に開示されるように、好ましい２価カチオン性界面活性剤は、構造式Z^-(R²)₃B⁺CH₂-Y-CH₂B⁺(R³)₃Z^-を有する。ここで、Bはリン、窒素またはその組み合わせでもよく、Zはアニオン性対イオン(counterion)であり、R²およびR³は、同一でも異なっていてもよく、１〜20個の炭素原子を含有する置換されたまたはされていないアルキルまたはアラルキルであり得、Yは４〜20個の炭素原子を含有するジアルキレンアリール、アリール、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレンであり得る。刺激された1,2-ジオキセタン反応からの化学発光を増幅するために用い得る、好ましい２価カチオン性界面活性剤は、以下の構造を有するものを含む：ベンゼン環上の置換基X^-(R³)₃A⁺CH₂-は、オルト、メタ、またはパラ位置であり得、Aはリンまたは窒素であり得、R²およびR³は約１〜20個の炭素原子を含有するアルキルまたはアラルキルであり得、X^-は、フッ化物、塩化物、臭化物またはヨウ化物である。より好ましくは、２価カチオン性界面活性剤は、EPA Publicat ion No.0630884に記載されたように4-(クロロメチル)ベンジルトリ-n-ブチルホスホニウムクロリドをトリ-n-オクチルホスフィンと反応させることによって調整され得る、1-(トリ-n-オクチルホスホニウムメチル-4-(トリ-n-ブチルホスホニウムメチル)ベンゼンジクロリドである：米国特許第5,125,772号に開示されるように、好ましいポリカチオン性界面活性剤は、ポリ(ビニルベンジル４級アンモニウム塩)などの、ポリ(ビニルアリール４級アンモニウム塩)である。特に好ましいポリカチオン性塩は、ポリ(ビニルベンジルメチルアンモニウムクロリド)（TMQ）およびポリ[ビニルベンジル(ベンジルジメチルアンモニウムクロリド]（BDMQ）である。これらの界面活性剤は、典型的には、例えば酸、塩基、塩、酵素、無機および有機触媒および電子供与体などの化学試薬によって化学発光を刺激され得る、安定な1,2-ジオキセタンと組み合わせて用いる。そのような安定なジオキセタンは、当該分野において周知であり、好ましいジオキセタンはEPA Publication No.063 0884に開示されている。界面活性剤による化学発光の増幅は、約0.001％と約10 ％との間、好ましくは約0.01％と約0.5％との間の界面活性剤濃度で観察され得る。疎水性アニオン性化学発光増強剤は、R¹X^-A⁺の式を有していてもよい。ここで、R¹は約１〜20個の炭素原子、好ましくは約４〜18個の炭素原子、より好ましくは約６〜18個の炭素原子を有する置換されたまたはされていない炭化水素部分であり得、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキルおよび同様な官能基を含む。X^-は、R¹部分に共有結合したアニオン性部分である。X^-は、スルフェート、スルファイト(sulfite)、スルフォネート(sulfon ate)、アセテート、ブチレート、ホスフェート、ホスファイト、ホスフォネート、カーボネート、カルボキシレート、アーセネートなどである。A⁺は対カチオンであり、ナトリウム、カリウム、銀、アンモニウム、IA族アルカリ金属カチオン、他の単価金属カチオンなどである。好ましい疎水性アニオン性化学発光増強剤は、疎水性成分を供給するアルキルまたはアラルキル基および、アニオン性基を含む。また、増強剤は、アンモニオ、アミノなどのカチオン性部分を含むことによって、疎水双極性イオン(zwitterionic)増強剤を提供し得る。そのような疎水性アニオン性増強剤および市販入手源の例は、3-[(3-コラミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシプロパンスルフォネート（「CHAPSO」、Sigma社製）、2-[N-シクロヘキシルアミノ)エタン-スルフォネート（「CHES」、Sigma社製）、4-フェニルブチレート（「4-PBA」、Aldrich社製）、ケノデオキシコレート（「CDC」、Sigma社製）、タウロデヒドロコレート（「TDHC」、Calbiochem社製）、タウロリソコレート（「TLCA」、Sigma社製）、デオキシコレート（「DC」、Sigma社製）、4-スルフォベンゾエート（「4-SBA」、Aldrich社製）、コレート（「CA」、Sigma社製）、ヘキサンスルフォネート（「HSA」、Sigma社製）、タウロコレート（「TCA」、Sigma社製）、グリココレート（「GCA」、Sigma社製）、グリコデオキシコレート（「GDCA」、Sigma社製）、ベンゼンスルフォネート（「BSA」、Sigma社製）、タウロウルソデオキシコレート（「TSDC」、Sigma 社製）、タウロデオキシコレート（「TDC」、Sigma社製）、p-トルエンスルフォネート（「PTSA」、Sigma社製）、タウロケノデオキシコレート（「TCDC」、Sigma社製）、およびナトリウムドデシルスルフェート（「SDS」、Sigma社製）を含む。疎水性アニオン性増強剤を、２価カチオン界面活性剤の存在下で化学発光が生成される反応中に含めることにより、化学発光は、表１に示すように、増強剤の不在下で活性剤の存在下でジオキセタンによって生成される化学発光よりも増大する。疎水性アニオン性増強剤は、発光のバックグラウンドレベルを増大させることなく、1,2-ジオキセタン化学発光の相対光強度を増大させる（図４Ａおよび図４Ｂを参照）。化学発光反応に加えられる増強剤の濃度は、ジオキセタンおよび界面活性剤の濃度に依存する。例えば、酵素−触媒反応（例えばアルカリホスファターゼ）においては、ジオキセタンホスフェートの濃度は、酵素が完全に飽和するように(fully saturated)調節される。このように、ジオキセタン濃度は、酵素のK_mよりも約２倍〜１０倍の範囲大きく、あるいはジオキセタンの可溶性に応じてそれよりも高くなり得る。界面活性剤対ジオキセタンの重量比は、約0.1:１と約100:１の間であり得、好ましくは約１:１と約20:１の間であり得る。最後に、疎水性アニオン性増強剤の界面活性剤に対するモル比は、約0.1:１と約10:１の間であり得、好ましくは約0.5:１と約３:１の間であり得、より好ましくは約0 .5:１と約1.5:１の間であり得、る。このように、本発明は、下記に詳述し本明細書において実施例１および５として例示するように、アルカリホスファターゼを担持する(carrying)標識プローブを用いた、溶液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける化学発光を検出するための改善された方法に関する。さらに、本発明の疎水性アニオン性増強剤組成物および方法は、界面活性剤増強化化学発光アッセイを用いる他の手順においても有用性を有し得ることが、当業者には明らかであろう。そのようなアッセイの例は、酵素結合イムノアドゾーベントアッセイ（ELISA）、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、アルカリホスファターゼ型検出システムを用いる他のアッセイなどを含む。本発明はまた、特異的（例えば分析物核酸配列間の１個のヌクレオチド差を認識することができるような）、高感度（例えば分析物核酸のアットモル(attomol e)量を定量化できるような）、かつ容易に自動化できる、新規なアッセイを提供する。このように、本発明は、ゲノムDNAまたはRNAの変異分析および、核酸の他の構造的分析に特に適している。さらに、本発明は、遺伝子治療またはアンチセンス薬をモニターするため、ならびに、1995年12月５日出願の「ハイブリトープマッピング(hybritope mapping)を用いた不連続プローブ設計」の名称を有し共譲渡された、CollinsのPCT Application No.PCT/US95/15779に記載されるような、診断薬またはアンチセンス治療剤に使用する核酸標的に堅く結合する不連続プローブをマッピングするために、用い得る。実験本発明の実施は、特に断らない限り、従来技術における合成有機化学、生化学、分子生物学などを用いるが、これらは当業者の技術範囲内である。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook、FritschおよびManiatr is 、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 、第２版(1989)；Oligonucleotid e Synthesis （M.J．Gait編、1984）；Nucleic Acid Hybridization（B.D．Hames およびS.J．Higgins編、1984）；およびシリーズMethods in Enzymology（Acade mic Press，Inc.）を参照せよ。前出および後出の全ての特許、特許出願および出版物を、本願において援用する。本発明をその好適な特定実施態様について説明してきたが、前記記載ならびに以下の実施例は、本発明を例示することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されなければならない。発明の範囲内にあるその他の局面、効果および変形例は、本発明の当該分野の当業者には明らかであろう。以下の実施例は、本発明の化合物を作成および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するように記載されており、発明者が発明と考える主題の範囲を制限することを意図するものではない。数字（例えば量、温度など）に関して正確さを期しているが、ある程度の誤りおよび逸脱は考慮されるべきである。特に断らない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、圧力は大気圧あるいはその近傍である。実施例１および５において、上付添字「c」のマークの付されたオリゴヌクレオチドは、そのマークが付されていないオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを表す。従って、「標的^c」は、「標的」に相補的な標的配列を含有するオリゴヌクレオチドである。上付添字「c'」のマークの付されたオリゴヌクレオチドは、上付添字「c」のマークの付されたオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを表す。従って、「標的^c'」は、「標的^c」に相補的な核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドである。実施例１アルカリホスファターゼおよびアルカリホスファターゼ標識プローブの調製アルカリホスファターゼのアンカーレス疎水性調製物を用いて、オリゴヌクレオチドプローブを調製した。オリゴヌクレオチドプローブのコンジュゲートプロセスは、酵素上の活性部位がコンジュゲーショに供されることのないように、コンジュゲーションを酵素上の部位の均一な集団に選択的に導く条件下かつホスフエートの存在下で行った。追加的なクロマトグラフィー工程を用いたコンジュゲートの更なる精製の後、アルカリホスファターゼーオリゴヌクレオチドコンジュゲートの均質な集団が生成された。Ａ．アルカリホスファターゼの精製。以下のように、アルカリホスファターゼを市販入手源から精製して、アンカーレス疎水性調製物を生成した。アルカリホスファターゼアフィニティーカラムを、前出Landtらの方法に基づいて調製した。アルカリホスファターゼのmg毎につき約１mlのL-ヒスチジルジアゾベンジルホスホン酸樹脂懸濁液（Sigma社製）を用いて、カラムを注いだ(pour ed)。注がれたカラムを、10mM Tris HCl、pH 8.0を約10〜20ml/hr.の割合で流すことにより、パックした。カラム流出物の光学濃度を280nmにおいて、OD₂₈₀が約 0.00になるまでモニターした。洗浄されて濃縮された可溶性アルカリホスファターゼを、以下のように調製した。アルカリホスファターゼ（Boehringer Mannheim社製）を濃縮し、酵素を元々供給したバッファを、10mM Tris HCl、pH 8.0でリンスしたCentricon-308（Am icon社製）コンセントレーター中で、10mM Tris HCl、pH 8.0と交換した(exchan ged)。酵素および10mM Tris HCl、pH 8.0を加え、コンセントレーターを3000〜4 000×gで遠心分離にかけた。このプロセスを２度繰り返した。洗浄され濃縮されたアルカリホスファターゼを、パックされたカラムに10〜20 ml/hr.の割合で塗布した(applied)。カラムを10mM Tris HClを用いて洗浄することにより、樹脂に特異的に結合しない不純物を除去した。残った(retained)アルカリホスファターゼを、10mM Tris HCl、pH 8.0中、10mM Na₂HPO₄によって溶出した。回収されたアルカリホスファターゼを含有する画分を、Centripep-30（Amicon ）またはCentricon-30、あるいはその両方を用いて上述のように濃縮した。濃縮されたアルカリホスファターゼを100 mMホスフェートバッファ、pH 4.2中に４℃ にて、または３Mの塩化ナトリウム、１mMの塩化マグネシウム、0.1mMの塩化亜鉛、30mMのトリエチルアミン、pH7.4を含有するアルカリホスファターゼ保存バッファ(storage buffer)中に、洗浄した。Ｂ．標識プローブを形成するためのアルカリホスファターゼのオリゴヌクレオチドプローブへのコンジュゲーション。bla3オリゴヌクレオチド（5'-AAGTACGAC AACCACATCX-3'）の3'-長鎖アミン（「LCA」）部分(portion)（Ｘ）（ここでＸは N⁴-(6-アミノカプロイル-2-アミノエチル)-シトシンである）を、ビス(スルフォサクシニミジル)スベレート（「BS³」）（Pierce社製）をbla3: BS³を１:10の比で用いて活性化した。このようにして、BS³(21.5mg)およびbla3(274nmol/ml)を1 00mMホスフェートバッファ、pH 7.8に加え、室温で30分間インキュベートした。反応混合物を、予め100mMホスフェートバッファ、pH6.5、４℃で平衡させたNA P-5カラム（Pharmacia社製）に塗布した。ショもをの生成物を100mMホスフェートバッファ、pH6.5、４℃を用いて溶出する。所望であれば、活性化されたオリゴヌクレオチドを、エタノール沈殿工程を用いて更に精製する。本発明の方法に基づいて標識プローブを提供するために、コンジュゲーション反応を様々なpHおよびDNA:酵素比で行うことにより所望のコンジュゲーション条件を決定することができる。活性化された精製bla3を、100mMホスフェートバッファ、pH 7.2またはpH 7.8、４℃中にて、DNA:酵素比５:１、25:１または100:１でアフィニティー精製アルカリホスファターゼ約100nmol/mlに加え、４℃で30分間インキュベートした。Centricon-30を用いて、反応生成物を濃縮してアルカリホスファターゼ保存バッファ中に洗浄する。未反応のDNAがフィルタ膜を通過して生成物中で最小限にされるように、洗浄工程を３回繰り返す。必要であれば、アルカリホスファターゼオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆そうクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングまたはアフィニティークロマトグラフィーを用いて、更に精製してもよい。標識対DNAの比は、分析的ゲル電気泳動を用いて決定される。酵素活性を、従来のアッセイ技術を用いて決定する（前出La ndtらを参照）。コンジュゲート化アルカリホスファターゼを消化し、従来技術を用いてアミノ酸分析を行うことにより、標識反応性アミンを決定する。実施例２化学発光生成の時間経過に対するナトリウムドデシルスルフェートの効果洗浄され濃縮されたアルカリホスファターゼを実施例１で説明したように調製した。濃縮されたアルカリホスファターゼを、0.2M 2-メチル-2-アミノ-1-プロパノールバッファpH 9.6中の基質溶液((3-(2'-スピロアダマンタン)-4-メトキシ-4-( 3"-ホスホリルオキシ)-フェニル-1,2-ジオキセタン(二ナトリウム塩)(0.33 mM) ₂および1.0mg/ml 1-(トリ-n-オクチルホスホニウムメチル)-4-（トリ-n-ブチルホスホニウムメチル）ベンゼンジクロリド（EPA Publication No.0630884を参照）または0.03％SDS基質溶液を４℃で用いて、１アットモル/マイクロリットルに希釈した。いずれかの溶液の50マイクロリットルアリコートを、輝度計に移し、 37℃でインキュベートした。溶液において発生した化学発光を、図３に示す時間、モニターした。アルカリホスファターゼに触媒された化学発光シグナルの、0. 03％SDSによる増強が、試験した全てのポイントにおいて観察された。実施例３ナトリウムドデシルスルフェートのバックグラウンド化学発光に対する効果 SDSによって増強された化学発光の時間経過および濃度依存性、ならびにアルカリホスファターゼの不在下において発生するバックグラウンド化学発光に対するSDSの効果を決定するために、以下の実験を行った。Ａ．50マイクロリットルの基質溶液または、基質溶液と実施例１および２に説明したように調製された0.03％SDSとを、輝度計にて37℃でインキュベートし、図４Ａに示す時間、化学発光をモニターした。図４Ａに示す結果は、SDSによる化学発光シグナル発生の増強効果が、酵素触媒されたシグナルに特異的であることを示している。Ｂ．様々な濃度のSDSを含有する基質溶液、または様々な濃度のSDSおよび１アットモル/マイクロリットルのアルカリホスファターゼを４℃で含有する基質溶液を、実施例１および２に説明するように調製した。各溶液におけるSDSの最終濃度を図４Ｂに示す。各溶液の50マイクロリットルアリコートを、輝度計にて37 ℃でインキュベートした。60分間のインキュベーションの後に化学発光を測定した。図４Ｂに示す結果は、与えられたSDS濃度における酵素触媒された化学発光生成のピーク増強を示す。加えて、これらの結果は、より高いSDS濃度においてさえも、酵素の不在下においては増強剤の効果がないことを示している。実施例４ SDS およびBrij-35の化学発光増強に対する効果この実験の目的は、アニオン性増強剤であるSDSの、アルカリホスファターゼの発生する化学発光に対する効果を、非イオン性洗浄剤であるBrij-35のそれと比較することである。実施例１に説明したようにアルカリホスファターゼを調製し、オリゴヌクレオチドプローブにコンジュゲートした。オリゴヌクレオチドプローブにコンジュゲートしたアルカリホスファターゼを、実施例２に説明したように調製され様々な濃度のSDSまたはBrij-35を４℃で含有する基質溶液中、１アットモル/マイクロリットルのアルカリホスファターゼに希釈した。SDSまたはBrij-35最終濃度を図５に示す。各溶液の50マイクロリットルアリコートを輝度計にて37℃でインキュベートし、60分間のインキュベーションの後に化学発光を測定した。この実験の結果を図５に示しており、この図から、SDSによる化学発光の増強とともにBrij-35による増強の不在がわかる。これらの結果は、可溶性アルカリホスファターゼに対して、これがオリゴヌクレオチドプローブにコンジュゲートしているか否かに関わらず、アルカリホスファターゼの発生する化学発光の増強が観察されることを示している。実施例５ HIV Rev 反応要素プローブ #8730の検出図２に図示したアッセイフォーマットを用いて、配列5'-TCCTGCTGCTCCCAAGAA-3' を有するヒト免疫不全症候群ウィルスRev反応要素プローブ（「RREプローブ」）の存在を検出するために、このアッセイを行った。MOLT-3細胞（ATCC CRL 155 2）（細胞質または核の）の抽出物を、遠心分離によって分離して様々な量のRRE プローブを加える(spike)ことにより、細胞内の治療的アンチセンス分子の定量化をシミュレーションした。捕獲延長「PSCP^c-標的^c」（5'-TTCTTGGGAGCAGCAGGACTCTTGGAAAGAAAGTGAAGTG-3 '）１fmol/ウェルを含有する、amp希釈物50ml（50％ウマ血清、0.05％ナトリウムアザイド、1.3％SDS、5×SSC（20×SSCならば175gm/lの塩化ナトリウムおよび 88g/lクエン酸ナトリウムを含有する）、0.5mg/mlプロテナーゼＫ、６mM Tris-H フォニルフルオライド）を、捕獲プローブ「PSCP」（5'-XCACTTCACTTTCTTTCCAAG AG-3'）（ここでＸは上述の定義を有する）が結合したマイクロタイターウェルに加えた。37℃で30分間の後、ウェルを洗浄バッファＡ（0.1％SDS、0.1×SSC、よびに示すデータについては、０、２、４、６または８fmolのRREプローブを含有する、０、24,000、48,000または72,000個のMOLT-3細胞に対応する細胞抽出物 50mlが、ウェルに加えられた。表３に示すデータについては、０、２、４、６または８fmolのRREプローブを含有する、０、60,000、120,000または180,000個のM OLT-3細胞に対応する細胞抽出物50mlが、ウェルに加えられた。反応混合物を37 ℃で30分間インキュベートした。ウェルを洗浄バッファＡで２回洗浄した。実施例４に説明した方法に基づいて調製されたアルカリホスファターゼ-bla3 標識プローブを、標識延長bla3^c-標識^c'（5'-GATGTGGTTGTCGTACTTTCCTGCTGCTCCC AAGAA-3'）を含有するamp希釈物に、最終体積が100mlになるように加えた。反応混合物を37℃で30分間インキュベートした。反応混合物を標識希釈物で希釈し、最終濃度が50mlにつき５fmolになるように、ウェルに加えた。反応混合物を37℃で１時間インキュベートした後、マイクロタイターウェルを洗浄バッファＡで２回、次に洗浄バッファＤ（0.1％Brij-35、5mM 塩化マグネシで２回、洗浄した。0.2M 2-メチル-2-アミノ-1-プロパノールバッファpH9.6中50 mlの(3-(2'-スピロアダマンタン)-4-メトキシ-4-(3"-ホスホリルオキシ)-フェ社製、ミシガン州Southfield)を、0.88mM MgCl₂および1.0mg/ml 1-(トリ-n-オクチルホスホニウムメチル)-4-（トリ-n-ブチルホスホニウムメチル）ベンゼンジクロリド（EPA Publication No.0630884を参照）および0.03％SDSとともに、洗浄されたマイクロタイターウェルに加えた。マイクロタイタープレートを37℃で 30分間インキュベートし、発生したシグナルを検出した。表２および３にまとめたデータは、試験したプローブ濃度範囲にわたってアッセイがリニアであり、精度（％C.V.に反映される）が非常に高く、MOLT-3細胞の核抽出物の存在はプローブの検出に干渉しないことを示している。実施例６他の化学発光系におけるSDSの効果この実験の目的は、アニオン性増強剤であるSDSの効果の、他の化学発光シグナル系における効果を同定することである。本例において活性化されることによキセタン-3,2'-(5'-クロロ)トリシクロ[3,3,1,1,^3.7]デカン}-4yl)フェニルモノホスフェートエステル二ナトリウム塩、Tropix社製、マサチューセッツ州Bedfor 剤分子は、蛍光増強剤とともにあるいは蛍光増強剤高分子性なしで製剤された４級アンモニウム塩である、Emerald-II^TMおよびSapphire-II^TM（両方ともTropix 社製、マサチューセッツ州Bedford）である。洗浄バッファ（0.1M Tris、pH 8.0、10mM MgCl₂、0.1mM ZnCl₂、0.1％Brij-35 ）５マイクロリットル中において、アルカリホスファターゼを、上記に列挙した化学発光性剤の様々な組み合わせの50マイクロリットルおよび主要増強剤とともに、0.03％SDSを加えてあるいはSDSなしで、様々な濃度でマイクロウェルに加えた。ウェルを温度制御された輝度計にて、37℃で30分間インキュベートし、相対光単位(RLU)を決定した。アルカリホスファターゼによって生成したRLUを、希釈物によって生成したRLU で除算することにより、シグナル対バックグラウンド比（S/B）を決定した。表４のデータは、CSPD-Sapphire II系にSDSを添加することによってS/B比が増大することを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ (72)発明者アンダーソン，メアリーエル. アメリカ合衆国カリフォルニア 94507, アラモ，ダンビルブールバードナンバー202 1392 (72)発明者ルドツク，ダグラスエヌ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02081，ワルポール，オークストリート 136

Claims

【特許請求の範囲】１．オリゴヌクレオチドプローブにコンジュゲートした、精製された親水性アルカリホスファターゼを含む、標識プローブ。２．アルカリホスファターゼおよびオリゴヌクレオチドを含む標識プローブであって、該オリゴヌクレオチドは、該アルカリホスファターゼ上の部位の均一な集団にコンジュゲートされた、標識プローブ。３．アルカリホスファターゼによって標識された、オリゴヌクレオチド標識プローブを調製するための方法であって、（a）精製された親水性アルカリホスファターゼを提供する工程と、（b）該親水性アルカリホスファターゼをオリゴヌクレオチドプローブにコンジュゲートする工程と、を包含する方法。４．アルカリホスファターゼによって標識された、オリゴヌクレオチド標識プローブを調製するための方法であって、（a）アルカリホスファターゼを提供する工程と、（b）該アルカリホスファターゼをオリゴヌクレオチドプローブにコンジュゲートする工程であって、該コンジュゲーション反応を該アルカリホスファターゼ上の部位の均一な集団に導くのに有効な条件下で行われる工程と、を包含する方法。５．前記アルカリホスファターゼは、アルカリホスファターゼ活性部位保護剤の存在下で前記オリゴヌクレオチドプローブにコンジュゲートされる、請求項３または４に記載の方法。６．前記アルカリホスファターゼ活性部位保護剤は、アルカリホスファターゼ基質およびアルカリホスファターゼ基質アナログならびにアルカリホスファターゼインヒビタからなる群より選択される、請求項３または４に記載の方法。７．サンプル中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法であって、 a）核酸配列C-3を有する領域を含む、支持体に結合した捕獲プローブ(CP)を提供する工程と； b）核酸配列L-3を有する領域を含む標識プローブ(LP)を提供する工程であって、該標識プローブは検出可能なシグナルを発生可能な標識部分を含有している工程と； c）第１および第２の核酸配列を有する領域を含む標識延長(LE)を提供する工程であって、該第１のLE核酸配列L-2は核酸配列L-3に相補的であり、該第２のLE 核酸配列L-1は標的分析物中の核酸配列に相補的である工程と； d）第１および第２の核酸配列を有する領域を含む捕獲延長(CE)を提供する工程であって、該第１のCE核酸配列C-2は核酸配列C-3に相補的であり、該第２のCE 核酸配列C-1は第２のLE核酸配列L-1に相補的である工程と； e）該サンプルを該LEおよび該LPとともに第１のハイブリダイゼーション条件下でインキュベートすることによって、LP／LE／標的ハイブリッド錯体および未結合のLP／LEハイブリッド錯体を含有する第１の反応混合物を形成する工程と； f）該第１の反応混合物を、表面に結合したCE／CPハイブリッド錯体を含有する固体支持体表面とともに第２のハイブリダイゼーション条件下でインキュベートすることによって、表面に結合したLP／LE／標的／CE／CPハイブリッド錯体および、未結合のLP／LE／標的錯体を含有する第２の反応混合物を形成する工程と； g）その後に該固体支持体に結合していない材料を、該固体支持体に結合している材料から分離する工程と； h）該支持体に結合したLP／LE／標的／CE／CPハイブリッド錯体中の標識の存在を検出する工程と；を包含する方法。８．サンプル中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法であって、 a）核酸配列C-3を有する領域を含む、支持体に結合した捕獲プローブ(CP)を提供する工程と； b）核酸配列L-3を有する領域を含む標識プローブ(LP)を提供する工程であって、該標識プローブは検出可能なシグナルを発生可能な標識部分を含有している工程と； c）第１および第２の核酸配列を有する領域を含む捕獲延長(CE)を提供する工程であって、該第１のCE核酸配列C-2は核酸配列C-3に相補的であり、該第２のCE 核酸配列C-1は標的分析物中の核酸配列に相補的である工程と； d）第１および第２の核酸配列を有する領域を含む標識延長(LE)を提供する工程であって、該第１のLE核酸配列L-2は核酸配列L-3に相補的であり、該第２のLE 核酸配列L-1は第２のCE核酸配列C-1に相補的である工程と； e）該サンプルを該CEおよび該CPとともに第１のハイブリダイゼーション条件下でインキュベートすることによって、CP／CE／標的ハイブリッド錯体および未結合のCP／CEハイブリッド錯体を含有する第１の反応混合物を形成する工程と； f）該第１の反応混合物を、LE／LPハイブリッド錯体とともに第２のハイブリダイゼーション条件下でインキュベートすることによって、表面に結合したLP／ LE／標的／CE／CPハイブリッド錯体および、未結合のLP／LE／標的錯体を含有する第２の反応混合物を形成する工程と； g）その後に該固体支持体に結合していない材料を、該固体支持体に結合している材料から分離する工程と； h）該支持体に結合したLP／LE／標的／CE／CPハイブリッド錯体中の標識の存在を検出する工程と；を包含する方法。９．活性化されることによって化学発光シグナルを生成することが可能な分子からの化学発光を増強するための方法であって、（a）活性化されることによって化学発光シグナルを生成することが可能な分子、２価カチオン性またはポリカチオン性界面活性剤、およびR¹X^-A⁺の式を有する疎水性アニオン性増強剤であって、R¹は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群より選択される置換されたまたはされていない炭化水素部分であり得る疎水性基であり、X^-は、R¹部分に共有結合したアニオン性部分であり、A⁺は対カチオンである疎水性アニオン性増強剤を、提供する工程と；（b）活性化されることによって化学発光シグナルを生成することが可能な該分子を活性化する工程と；を包含する方法。１０．活性化されることによって化学発光シグナルを生成することが可能な前記分子は、刺激されることによって化学発光を発生し得る安定な1,2-ジオキセタンであり、前記疎水性アニオン性増強剤は、3-[(3-コラミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシプロパンスルフォネート、2-[N-シクロヘキシルアミノ) エタンースルフォネート、4-フェニルブチレート、ケノデオキシコレート、タウロデヒドロコレート、タウロリソコレート、デオキシコレート、4-スルフォベンゾエート、コレート、ヘキサンスルフォネート、タウロコレート、グリココレート、グリコデオキシコレート、ベンゼンスルフォネート、タウロウルソデオキシコレート、タウロデオキシコレート、p-トルエンスルフォネート、タウロケノデオキシコレート、およびナトリウムドデシルスルフェートからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。１１．活性化されることによって化学発光シグナルを生成することが可能な前記分子は、刺激されることによって化学発光を発生し得る安定な1,2-ジオキセタンであり、前記界面活性剤は構造式Z^-(R²)₃B⁺CH₂-Y-CH₂B⁺(R³)₃Z^-を有する２価カチオン性界面活性剤であり、Bはリン、窒素またはその組み合わせであり得、Zはアニオン性対イオンであり、R²およびR³は、同一でも異なっていてもよく、約１〜約20個の炭素原子を含有する置換されたまたはされていないアルキルまたはアラルキルであり得、Yは約４〜約20個の炭素原子を含有するジアルキレンアリール、アリール、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレンであり得る、請求項９に記載の方法。１２．（a）活性化されることによって化学発光シグナルを生成することが可能な分子と；（b）２価カチオン性またはポリカチオン性界面活性剤と；（c）R¹X^-A⁺の式を有する疎水性アニオン性増強剤であって、R¹は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群より選択される置換されたまたはされていない炭化水素部分であり得る疎水性基であり、X^-は、R¹部分に共有結合したアニオン性部分であり、A⁺は対カチオンである疎水性アニオン性増強剤と；を含む組成物。１３．活性化されることによって化学発光シグナルを生成することが可能な前記分子は、刺激されることによって化学発光を発生し得る安定な1,2-ジオキセタンであり、前記疎水性アニオン性増強剤は、3-[(3-コラミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシプロパンスルフォネート、2-[N-シクロヘキシルアミノ) エタンースルフォネート、4-フェニルブチレート、ケノデオキシコレート、タウロデヒドロコレート、タウロリソコレート、デオキシコレート、4-スルフォベンゾエート、コレート、ヘキサンスルフォネート、タウロコレート、グリココレート、グリコデオキシコレート、ベンゼンスルフォネート、タウロウルソデオキシコレート、タウロデオキシコレート、p-トルエンスルフォネート、タウロケノデオキシコレート、およびナトリウムドデシルスルフェートからなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。１４．活性化されることによって化学発光シグナルを生成することが可能な前記分子は、刺激されることによって化学発光を発生し得る安定な1,2-ジオキセタンであり、前記界面活性剤は構造式Z^-(R²)₃B⁺CH₂-Y-CH₂B⁺(R³)₃Z^-を有する２価カチオン性界面活性剤であり、Bはリン、窒素またはその組み合わせであり得、Zはアニオン性対イオンであり、R²およびR³は、同一でも異なっていてもよく、約１〜約 20個の炭素原子を含有する置換されたまたはされていないアルキルまたはアラルキルであり得、Yは約４〜約20個の炭素原子を含有するジアルキレンアリール、アリール、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレンであり得る、請求項１２に記載の組成物。１５．サンプル中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法であって、 a）核酸配列C-3を有する領域を含む、支持体に結合した捕獲プローブ(CP)を提供する工程と； b）核酸配列L-3を有する領域を含む標識プローブ(LP)を提供する工程であって、該標識プローブは、安定な1,2-ジオキセタンを刺激することによって化学発光シグナルを発生可能な標識部分を含有している工程と； c）第１および第２の核酸配列を有する領域を含む標識延長(LE)を提供する工程であって、該第１のLE核酸配列L-2は核酸配列L-3に相補的であり、該第２のLE 核酸配列L-1は標的分析物中の核酸配列に相補的である工程と； d）第１および第２の核酸配列を有する領域を含む捕獲延長(CE)を提供する工程であって、該第１のCE核酸配列C-2は核酸配列C-3に相補的であり、該第２のCE 核酸配列C-1は第２のLE核酸配列L-1に相補的である工程と； e）該サンプルを該LEおよび該LPとともに第１のハイブリダイゼーション条件下でインキュベートすることによって、LP／LE／標的ハイブリッド錯体および未結合のLP／LEハイブリッド錯体を含有する第１の反応混合物を形成する工程と； f）該第１の反応混合物を、表面に結合したCE／CPハイブリッド錯体を含有する固体支持体表面とともに第２のハイブリダイゼーション条件下でインキュベートすることによって、表面に結合したLP／LE／標的／CE／CPハイブリッド錯体および、未結合のLP／LE／標的錯体を含有する第２の反応混合物を形成する工程と； g）その後に該固体支持体に結合していない材料を、該固体支持体に結合している材料から分離する工程と； h）該支持体に結合したLP／LE／標的／CE／CPハイブリッド錯体中の標識の存在を請求項９の方法に従って検出する工程と；を包含する方法。１６．サンプル中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法であって、 a）核酸配列C-3を有する領域を含む、支持体に結合した捕獲プローブ(CP)を提供する工程と； b）核酸配列L-3を有する領域を含む標識プローブ(LP)を提供する工程であって、該標識プローブは、安定な1,2-ジオキセタンを刺激することによって化学発光シグナルを発生可能な標識部分を含有している工程と； c）第１および第２の核酸配列を有する領域を含む捕獲延長(CE)を提供する工程であって、該第１のCE核酸配列C-2は核酸配列C-3に相補的であり、該第２のCE 核酸配列C-1は標的分析物中の核酸配列に相補的である工程と； d）第１および第２の核酸配列を有する領域を含む標識延長(LE)を提供する工程であって、該第１のLE核酸配列L-2は核酸配列L-3に相補的であり、該第２のLE 核酸配列L-1は第２のCE核酸配列C-1に相補的である工程と； e）該サンプルを該CEおよび該CPとともに第１のハイブリダイゼーション条件下でインキュベートすることによって、CP／CE／標的ハイブリッド錯体および未結合のCP／CEハイブリッド錯体を含有する第１の反応混合物を形成する工程と； f）該第１の反応混合物を、LE／LPハイブリッド錯体とともに第２のハイブリダイゼーション条件下でインキュベートすることによって、表面に結合したLP／ LE／標的／CE／CPハイブリッド錯体および、未結合のLP／LE／標的錯体を含有する第２の反応混合物を形成する工程と； g）その後に該固体支持体に結合していない材料を、該固体支持体に結合している材料から分離する工程と； h）該支持体に結合したLP／LE／標的／CE／CPハイブリッド錯体中の標識の存在を請求項９の方法に従って検出する工程と；を包含する方法。