JP3366641B2 - 核酸配列を増幅し、検出するための化学的方法 - Google Patents
核酸配列を増幅し、検出するための化学的方法Info
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- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は試験試料中に存在する核酸配列を増幅し、検
出するための方法に関する。
出するための方法に関する。
背景技術
標的核酸配列を増幅し、検出するための標準的方法は
複製連鎖反応（PCR）である。（Saikiら、Science 239
巻、487頁（1988年）及びMullisら、米国特許第4,683,1
95号参照）。PCRに伴う問題点は、偽バックグラウンド
信号をもたらす非特異重合である。
複製連鎖反応（PCR）である。（Saikiら、Science 239
巻、487頁（1988年）及びMullisら、米国特許第4,683,1
95号参照）。PCRに伴う問題点は、偽バックグラウンド
信号をもたらす非特異重合である。
BackmanらのEP 320 308号には、リガーゼ連鎖反応（L
CR）として知られている、標的核酸配列を増幅するため
の別法が開示されている。LCRに於いては、４種の核酸
プローブが過剰に使用されている。第一のプローブと第
三のプローブとは相補的オリゴヌクレオチド対を形成す
る。第二のプローブと第四のプローブは、これとは別の
相補的オリゴヌクレオチド対を形成する。第一のプロー
ブ及び第二のプローブはハイブリダイズして、標的分子
の第一のストランド内に連続した配列を形成する。ハイ
ブリダイズした時、第一のプローブと第二のプローブと
は互いに５′リン酸−３′ヒドロキシルの関係にあっ
て、これによってリガーゼは２個のプローブを接合して
第一の融合産物にすることができる。また、第三のプロ
ーブ及び第四のプローブも、ハイブリダイズして、標的
分子の第二のストランド内に連続する配列を形成する。
ハイブリダイズした時、第三のプローブと第四のプロー
ブとは互いに５′リン酸−３′ヒドロキシルの関係にあ
って、この結果、リガーゼは２個のプローブを接合して
第二の融合産物にすることができる。
CR）として知られている、標的核酸配列を増幅するため
の別法が開示されている。LCRに於いては、４種の核酸
プローブが過剰に使用されている。第一のプローブと第
三のプローブとは相補的オリゴヌクレオチド対を形成す
る。第二のプローブと第四のプローブは、これとは別の
相補的オリゴヌクレオチド対を形成する。第一のプロー
ブ及び第二のプローブはハイブリダイズして、標的分子
の第一のストランド内に連続した配列を形成する。ハイ
ブリダイズした時、第一のプローブと第二のプローブと
は互いに５′リン酸−３′ヒドロキシルの関係にあっ
て、これによってリガーゼは２個のプローブを接合して
第一の融合産物にすることができる。また、第三のプロ
ーブ及び第四のプローブも、ハイブリダイズして、標的
分子の第二のストランド内に連続する配列を形成する。
ハイブリダイズした時、第三のプローブと第四のプロー
ブとは互いに５′リン酸−３′ヒドロキシルの関係にあ
って、この結果、リガーゼは２個のプローブを接合して
第二の融合産物にすることができる。
第一融合産物及び第二融合産物は標的ストランドから
分離しており、実際、試料中の標的集団を倍加してい
る。次いでこの融合産物は、その相補的プローブとハイ
ブリダイズされることによって、更なるLCR反応のため
のテンプレートとして機能する。ハイブリダイゼーショ
ンのサイクルとして、連結と変性が繰り返され、融合プ
ローブの集団は等比速度で増加する。この融合プローブ
は標準的方法によって検出される。
分離しており、実際、試料中の標的集団を倍加してい
る。次いでこの融合産物は、その相補的プローブとハイ
ブリダイズされることによって、更なるLCR反応のため
のテンプレートとして機能する。ハイブリダイゼーショ
ンのサイクルとして、連結と変性が繰り返され、融合プ
ローブの集団は等比速度で増加する。この融合プローブ
は標準的方法によって検出される。
開始時の物質の量が極端に少量である時にも、この増
幅反応によって対象とする配列の迅速な分析及び特徴付
けが可能になる。しかしながら、重要な点は、この増幅
プロセスは高度に特異的でなければならないという点で
ある。なぜなら標的信号に伴う非標的配列の増幅によっ
て増幅プロセスの信頼性が損なわれてしまうためであ
る。
幅反応によって対象とする配列の迅速な分析及び特徴付
けが可能になる。しかしながら、重要な点は、この増幅
プロセスは高度に特異的でなければならないという点で
ある。なぜなら標的信号に伴う非標的配列の増幅によっ
て増幅プロセスの信頼性が損なわれてしまうためであ
る。
PCRの場合と同様、LCRに付随する問題点は、標的とは
独立した相補オリゴヌクレオチド対の連結反応によって
生じる望ましくないバックグラウンド信号である。この
望ましくないバックグラウンドは、過剰に添加されたこ
の相補対が、それら自体の間を交差ハイブリダイズする
能力を有するために起こる。このような交差ハイブリダ
イゼーションによって、プローブの独立連結反応が起こ
り、標的配列の不存在下で結合産物が形成されてしまう
可能性がある。標的とは別のこのような独立産物は所望
の増幅標的配列と区別することができない。
独立した相補オリゴヌクレオチド対の連結反応によって
生じる望ましくないバックグラウンド信号である。この
望ましくないバックグラウンドは、過剰に添加されたこ
の相補対が、それら自体の間を交差ハイブリダイズする
能力を有するために起こる。このような交差ハイブリダ
イゼーションによって、プローブの独立連結反応が起こ
り、標的配列の不存在下で結合産物が形成されてしまう
可能性がある。標的とは別のこのような独立産物は所望
の増幅標的配列と区別することができない。
PCR及びLCRは共に、増幅を行うためにポリメラーゼ又
はリガーゼが必要であるという難点をも有している。高
価であることに加えて、このような酵素は、ロット毎に
活性や望ましくないヌクレアーゼ汚染物質の濃度が変動
する。このような変動はこの方法の信頼性を更に低下さ
せる。
はリガーゼが必要であるという難点をも有している。高
価であることに加えて、このような酵素は、ロット毎に
活性や望ましくないヌクレアーゼ汚染物質の濃度が変動
する。このような変動はこの方法の信頼性を更に低下さ
せる。
本発明により解決すべき問題点は、ポリメラーゼもリ
ガーゼも使用せず、偽バックグラウンド信号が低減し、
信頼性が改善された標的配列の増幅及び検出方法を提供
することである。
ガーゼも使用せず、偽バックグラウンド信号が低減し、
信頼性が改善された標的配列の増幅及び検出方法を提供
することである。
発明の開示
これら及びその他の目的は、当業者に明らかになるよ
うに、試料中で、標的配列を含有する一本鎖標的核酸分
子又は標的配列及び標的相補配列を含有する二本鎖核酸
標的分子を増幅し、検出するための方法であって、 （ａ）第一オリゴヌクレオチド相補対及び第二オリゴヌ
クレオチド相補対を提供する工程［ここで、 （ｉ）第一オリゴヌクレオチド相補対はプローブ１及び
プローブ１′からなり、第二オリゴヌクレオチド相補対
はプローブ２及びプローブ２′からなり、 （ii）プローブ１は長配列Ｈ及び短配列Ｉを含有し、プ
ローブ１′は長配列Ｈ′及び短配列Ｉ′を含有し、 （iii）プローブ２は長配列Ｊ及び短配列Ｋを含有し、
プローブ２′は長配列Ｊ′及び短配列Ｋ′を含有し、 （iv）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ１′の長配列
Ｈ′は互いに相補的であり、 （ｖ）プローブ２の長配列Ｊ及びプローブ２′の長配列
Ｊ′は互いに相補的であり、 （vi）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ２の長配列Ｊ
は標的配列の隣接部分に対して相補的であり、 （vii）プローブ１′の長配列Ｈ′及びプローブ２′の
長配列Ｊ′は標的相補配列の隣接部分に対して相補的で
あり、 （viii）長配列Ｈ及び長配列Ｊが標的配列とハイブリダ
イズした時、短配列Ｉ及び短配列Ｋは標的配列ハイブリ
ダイズせず、 （ix）長配列Ｈ′及び長配列Ｊ′が標的相補配列とハイ
ブリダイズした時、短配列Ｉ′及び短配列Ｋ′は標的相
補配列とハイブリダイズせず、 （ｘ）プローブ１の短配列Ｉはプローブ２の短配列Ｋに
対して相補的であり、プローブ１′の短配列Ｉ′はプロ
ーブ２′の短配列Ｋ′に対して相補的であり、 （xi）プローブ１の配列Ｉの１個又は２個以上のヌクレ
オチドの糖又は塩基部分が化学官能基X1によって変性さ
れており、プローブ２の配列Ｋの１個又は２個以上のヌ
クレオチドの糖又は塩基部分が化学官能基Y1によって変
性されており、化学官能基X1は化学官能基Y1と反応性で
あり、 （xii）プローブ１′の配列Ｉ′の一以上のヌクレオチ
ドの糖又は塩基部分は化学官能基X2によって変性されて
おり、プローブ２′の配列Ｋ′の１個又は２個以上のヌ
クレオチドの糖又は塩基部分が化学官能基Y2によって変
性されており、化学官能基X2は化学官能基Y2と反応性で
あり、 （xiii）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ２の長配列
Ｊが標的配列の隣接部分とハイブリダイズした時、短配
列Ｉは短配列Ｋとハイブリダイズし、 （xiv）短配列Ｉが短配列Ｋとハイブリダイズした時、
化学官能基X1は化学官能基Y1と反応して化学結合を形成
し、 （xv）プローブ１′の長配列Ｈ′及びプローブ２′の長
配列Ｊ′が標的相補配列の隣接部分とハイブリダイズし
た時、短配列Ｉ′は短配列Ｋ′とハイブリダイズし、 （xvi）短配列Ｉ′が短配列Ｋ′とハイブリダイズした
時、化学官能基X2は化学官能基Y2と反応して化学結合を
形成する］と、 （ｂ）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ２の長配列Ｊ
を標的配列の隣接部分とハイブリダイズさせ、プローブ
１′の長配列Ｈ′及びプローブ２′の長配列Ｊ′を標的
相補配列の隣接部分とハイブリダイズさせる工程と、 （ｃ）工程（ｂ）の後で標的配列の隣接部分とハイブリ
ダイズされたプローブ１及びプローブ２を、化学官能基
X1とY1との間の化学結合を形成させることによって互い
に結合させて、標的相補配列を有する第一結合オリゴヌ
クレオチド産物を形成させる工程と、 （ｄ）工程（ｂ）の後で標的相補配列の隣接部分とハイ
ブリダイズされたプローブ１′及びプローブ２′を、化
学官能基X2とY2との間の化学結合を形成させることによ
って互いに結合させて、標的配列を有する第二結合オリ
ゴヌクレオチド産物を形成させる工程と、 （ｅ）変性条件下で試料を処理する工程と、 （ｆ）工程（ｂ）から工程（ｅ）までを所望の回数繰り
返す工程と、さらに （ｇ）結合オリゴヌクレオチド産物を検出する工程と、 からなる方法を提供することによって達成された。
うに、試料中で、標的配列を含有する一本鎖標的核酸分
子又は標的配列及び標的相補配列を含有する二本鎖核酸
標的分子を増幅し、検出するための方法であって、 （ａ）第一オリゴヌクレオチド相補対及び第二オリゴヌ
クレオチド相補対を提供する工程［ここで、 （ｉ）第一オリゴヌクレオチド相補対はプローブ１及び
プローブ１′からなり、第二オリゴヌクレオチド相補対
はプローブ２及びプローブ２′からなり、 （ii）プローブ１は長配列Ｈ及び短配列Ｉを含有し、プ
ローブ１′は長配列Ｈ′及び短配列Ｉ′を含有し、 （iii）プローブ２は長配列Ｊ及び短配列Ｋを含有し、
プローブ２′は長配列Ｊ′及び短配列Ｋ′を含有し、 （iv）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ１′の長配列
Ｈ′は互いに相補的であり、 （ｖ）プローブ２の長配列Ｊ及びプローブ２′の長配列
Ｊ′は互いに相補的であり、 （vi）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ２の長配列Ｊ
は標的配列の隣接部分に対して相補的であり、 （vii）プローブ１′の長配列Ｈ′及びプローブ２′の
長配列Ｊ′は標的相補配列の隣接部分に対して相補的で
あり、 （viii）長配列Ｈ及び長配列Ｊが標的配列とハイブリダ
イズした時、短配列Ｉ及び短配列Ｋは標的配列ハイブリ
ダイズせず、 （ix）長配列Ｈ′及び長配列Ｊ′が標的相補配列とハイ
ブリダイズした時、短配列Ｉ′及び短配列Ｋ′は標的相
補配列とハイブリダイズせず、 （ｘ）プローブ１の短配列Ｉはプローブ２の短配列Ｋに
対して相補的であり、プローブ１′の短配列Ｉ′はプロ
ーブ２′の短配列Ｋ′に対して相補的であり、 （xi）プローブ１の配列Ｉの１個又は２個以上のヌクレ
オチドの糖又は塩基部分が化学官能基X1によって変性さ
れており、プローブ２の配列Ｋの１個又は２個以上のヌ
クレオチドの糖又は塩基部分が化学官能基Y1によって変
性されており、化学官能基X1は化学官能基Y1と反応性で
あり、 （xii）プローブ１′の配列Ｉ′の一以上のヌクレオチ
ドの糖又は塩基部分は化学官能基X2によって変性されて
おり、プローブ２′の配列Ｋ′の１個又は２個以上のヌ
クレオチドの糖又は塩基部分が化学官能基Y2によって変
性されており、化学官能基X2は化学官能基Y2と反応性で
あり、 （xiii）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ２の長配列
Ｊが標的配列の隣接部分とハイブリダイズした時、短配
列Ｉは短配列Ｋとハイブリダイズし、 （xiv）短配列Ｉが短配列Ｋとハイブリダイズした時、
化学官能基X1は化学官能基Y1と反応して化学結合を形成
し、 （xv）プローブ１′の長配列Ｈ′及びプローブ２′の長
配列Ｊ′が標的相補配列の隣接部分とハイブリダイズし
た時、短配列Ｉ′は短配列Ｋ′とハイブリダイズし、 （xvi）短配列Ｉ′が短配列Ｋ′とハイブリダイズした
時、化学官能基X2は化学官能基Y2と反応して化学結合を
形成する］と、 （ｂ）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ２の長配列Ｊ
を標的配列の隣接部分とハイブリダイズさせ、プローブ
１′の長配列Ｈ′及びプローブ２′の長配列Ｊ′を標的
相補配列の隣接部分とハイブリダイズさせる工程と、 （ｃ）工程（ｂ）の後で標的配列の隣接部分とハイブリ
ダイズされたプローブ１及びプローブ２を、化学官能基
X1とY1との間の化学結合を形成させることによって互い
に結合させて、標的相補配列を有する第一結合オリゴヌ
クレオチド産物を形成させる工程と、 （ｄ）工程（ｂ）の後で標的相補配列の隣接部分とハイ
ブリダイズされたプローブ１′及びプローブ２′を、化
学官能基X2とY2との間の化学結合を形成させることによ
って互いに結合させて、標的配列を有する第二結合オリ
ゴヌクレオチド産物を形成させる工程と、 （ｅ）変性条件下で試料を処理する工程と、 （ｆ）工程（ｂ）から工程（ｅ）までを所望の回数繰り
返す工程と、さらに （ｇ）結合オリゴヌクレオチド産物を検出する工程と、 からなる方法を提供することによって達成された。
図面の簡単な説明
図１は、オリゴヌクレオチドプローブ１、１′、２及
び２′の一般化した説明図を示す。この説明図中の垂直
方向の線は、各プローブの官能的に異なるセグメント間
の境界を示す。
び２′の一般化した説明図を示す。この説明図中の垂直
方向の線は、各プローブの官能的に異なるセグメント間
の境界を示す。
図２は、化学官能基Ｚによって変性されたアデニン誘
導体A1、A2、A3及びA4を示す。
導体A1、A2、A3及びA4を示す。
図３は、化学官能基Ｚによって変性されたシチジン誘
導体C1、C2及びC3を示す。
導体C1、C2及びC3を示す。
図４は、化学官能基Ｚによって変性されたグアニン誘
導体G1、G2及びG3を示す。
導体G1、G2及びG3を示す。
図５は、化学官能基Ｚによって変性されたチミジン誘
導体T1、T2及びT3を示す。
導体T1、T2及びT3を示す。
図６は、化学官能基Ｚによって変性されたウリジン誘
導体U1及びU2を示す。
導体U1及びU2を示す。
図７は、それぞれグアニン残基に結合した化学官能基
X1及びY1を有する、プローブ１及び２の短配列Ｉ及びＫ
における２個のヌクレオチドのセグメントを示す。
X1及びY1を有する、プローブ１及び２の短配列Ｉ及びＫ
における２個のヌクレオチドのセグメントを示す。
図7.1は、それぞれグアニン残基に結合した化学官能
基X2及びY2を有する、プローブ１′及び２′の短配列
Ｉ′及びＫ′における２個のヌクレオチドのセグメント
を示す。
基X2及びY2を有する、プローブ１′及び２′の短配列
Ｉ′及びＫ′における２個のヌクレオチドのセグメント
を示す。
図８は、プローブの短配列のヌクレオチド塩基Ｂの糖
単位に結合した保護化学官能基Ｘの一般化した説明図を
示す。この図に於いて、Ｘは化学官能基を表し、Ａはア
デニンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｃはシチジンを表
し、Ｂは全てのヌクレオチド塩基を示し、中にＳ又はＰ
を有する記号の列は核酸配列の糖−リン酸主鎖を表す。
単位に結合した保護化学官能基Ｘの一般化した説明図を
示す。この図に於いて、Ｘは化学官能基を表し、Ａはア
デニンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｃはシチジンを表
し、Ｂは全てのヌクレオチド塩基を示し、中にＳ又はＰ
を有する記号の列は核酸配列の糖−リン酸主鎖を表す。
図９は、両ヌクレオチド塩基Ｂのリボース環のＣ−
２′位に結合した化学官能基Ｘ及びＹを有する２個のハ
イブリダイズされた短配列の一般化した説明図を示す。
この図に於いて、Ｘ及びＹはそれぞれ化学官能基を表
し、Ｇはグアニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｂは全
てのヌクレオチド塩基を表し、中にＳ又はＰを有する記
号の列は核酸配列の糖−リン酸主鎖を示す。化学官能基
が結合しているヌクレオチド塩基は互いにハイブリダイ
ズされていない。その代わり、化学官能基Ｘは、化学官
能基Ｙが結合しているヌクレオチドに隣接するヌクレオ
チドとハイブリダイズしているヌクレオチドに結合して
いる。化学官能基Ｘ及びＹは共有結合で結合していると
理解される。
２′位に結合した化学官能基Ｘ及びＹを有する２個のハ
イブリダイズされた短配列の一般化した説明図を示す。
この図に於いて、Ｘ及びＹはそれぞれ化学官能基を表
し、Ｇはグアニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｂは全
てのヌクレオチド塩基を表し、中にＳ又はＰを有する記
号の列は核酸配列の糖−リン酸主鎖を示す。化学官能基
が結合しているヌクレオチド塩基は互いにハイブリダイ
ズされていない。その代わり、化学官能基Ｘは、化学官
能基Ｙが結合しているヌクレオチドに隣接するヌクレオ
チドとハイブリダイズしているヌクレオチドに結合して
いる。化学官能基Ｘ及びＹは共有結合で結合していると
理解される。
図10は、ヌクレオチド塩基Ｂのリボース環のＣ−２′
位に結合した化学官能基Ｘ及びヌクレオチド塩基ＢのＣ
−５、Ｃ−６又はＣ−８位の何れかに結合した化学官能
基Ｙを有する２個のハイブリダイズ短配列の一般化した
説明図を示す。この図に於いて、Ｘ及びＹはそれぞれ化
学官能基を表し、Ｇはグアニンを表し、Ｃはシトシンを
表し、Ｂは全てのヌクレオチド塩基を表し、中にＳ又は
Ｐを有する記号の列は核酸配列の糖−リン酸主鎖を表
す。化学官能基が結合しているヌクレオチド塩基は互い
にハイブリダイズされていない。化学官能基Ｘ及びＹは
共有結合で結合していると理解される。
位に結合した化学官能基Ｘ及びヌクレオチド塩基ＢのＣ
−５、Ｃ−６又はＣ−８位の何れかに結合した化学官能
基Ｙを有する２個のハイブリダイズ短配列の一般化した
説明図を示す。この図に於いて、Ｘ及びＹはそれぞれ化
学官能基を表し、Ｇはグアニンを表し、Ｃはシトシンを
表し、Ｂは全てのヌクレオチド塩基を表し、中にＳ又は
Ｐを有する記号の列は核酸配列の糖−リン酸主鎖を表
す。化学官能基が結合しているヌクレオチド塩基は互い
にハイブリダイズされていない。化学官能基Ｘ及びＹは
共有結合で結合していると理解される。
図11は、ヌクレオチド塩基Ｂのリボース環のＣ−２′
位に結合した化学官能基Ｘ及びヌクレオチド塩基ＢのＣ
−５、Ｃ−６又はＣ−８位の何れかに結合した化学官能
基Ｙを有する２個のハイブリダイズ短配列の一般化した
説明図を示す。この図に於いて、Ｘ及びＹはそれぞれ化
学官能基を表し、Ｇはグアニンを表し、Ｃはシトシンを
表し、Ａはアデニンを表し、Ｔはチミジンを表し、Ｂは
全てのヌクレオチド塩基を表し、中にＳ又はＰを有する
記号の列は核酸配列の糖−リン酸主鎖を示す。化学官能
基が結合しているヌクレオチド塩基は互いにハイブリダ
イズされている。化学官能基Ｘ及びＹは共有結合で結合
していると理解される。
位に結合した化学官能基Ｘ及びヌクレオチド塩基ＢのＣ
−５、Ｃ−６又はＣ−８位の何れかに結合した化学官能
基Ｙを有する２個のハイブリダイズ短配列の一般化した
説明図を示す。この図に於いて、Ｘ及びＹはそれぞれ化
学官能基を表し、Ｇはグアニンを表し、Ｃはシトシンを
表し、Ａはアデニンを表し、Ｔはチミジンを表し、Ｂは
全てのヌクレオチド塩基を表し、中にＳ又はＰを有する
記号の列は核酸配列の糖−リン酸主鎖を示す。化学官能
基が結合しているヌクレオチド塩基は互いにハイブリダ
イズされている。化学官能基Ｘ及びＹは共有結合で結合
していると理解される。
図12は、ヌクレオチド塩基ＢのＣ−５、Ｃ−６又はＣ
−８位の何れかに結合した化学官能基Ｘ及びヌクレオチ
ド塩基ＢのＣ−５、Ｃ−６又はＣ−８位の何れかに結合
した化学官能基Ｙを有する２個のハイブリダイズ短配列
の一般化した説明図を示す。この図に於いて、Ｘ及びＹ
はそれぞれ化学官能基を表し、Ｇはグアニンを表し、Ｃ
はシトシンを表し、Ａはアデニンを表し、Ｔはチミジン
を表し、Ｂは全てのヌクレオチド塩基を表し、中にＳ又
はＰを有する記号の列は核酸配列の糖−リン酸主鎖を表
す。化学官能基が結合しているヌクレオチド塩基は互い
にハイブリダイズされている。化学官能基Ｘ及びＹが共
有結合で結合していると理解される。
−８位の何れかに結合した化学官能基Ｘ及びヌクレオチ
ド塩基ＢのＣ−５、Ｃ−６又はＣ−８位の何れかに結合
した化学官能基Ｙを有する２個のハイブリダイズ短配列
の一般化した説明図を示す。この図に於いて、Ｘ及びＹ
はそれぞれ化学官能基を表し、Ｇはグアニンを表し、Ｃ
はシトシンを表し、Ａはアデニンを表し、Ｔはチミジン
を表し、Ｂは全てのヌクレオチド塩基を表し、中にＳ又
はＰを有する記号の列は核酸配列の糖−リン酸主鎖を表
す。化学官能基が結合しているヌクレオチド塩基は互い
にハイブリダイズされている。化学官能基Ｘ及びＹが共
有結合で結合していると理解される。
図13は、ヌクレオチド塩基ＢのＣ−５、Ｃ−６又はＣ
−８位の何れかに結合した化学官能基Ｘ及びヌクレオチ
ド塩基ＢのＣ−５、Ｃ−６又はＣ−８位の何れかに結合
した化学官能基Ｙを有する２個のハイブリダイズ短配列
の一般化した説明図を示す。この図に於いて、Ｘ及びＹ
はそれぞれ化学官能基を表し、Ｇはグアニンを表し、Ｃ
はシトシンを表し、Ｂは全てのヌクレオチド塩基を表
し、中にＳ又はＰを有する記号の列は核酸配列の糖−リ
ン酸主鎖を表す。化学官能基が結合しているヌクレオチ
ド塩基は互いにハイブリダイズされていない。化学官能
基Ｘ及びＹは共有結合で結合していると理解される。
−８位の何れかに結合した化学官能基Ｘ及びヌクレオチ
ド塩基ＢのＣ−５、Ｃ−６又はＣ−８位の何れかに結合
した化学官能基Ｙを有する２個のハイブリダイズ短配列
の一般化した説明図を示す。この図に於いて、Ｘ及びＹ
はそれぞれ化学官能基を表し、Ｇはグアニンを表し、Ｃ
はシトシンを表し、Ｂは全てのヌクレオチド塩基を表
し、中にＳ又はＰを有する記号の列は核酸配列の糖−リ
ン酸主鎖を表す。化学官能基が結合しているヌクレオチ
ド塩基は互いにハイブリダイズされていない。化学官能
基Ｘ及びＹは共有結合で結合していると理解される。
図14は、オリゴヌクレオチド1.1で保護された化学官
能基Ｘの一般化した説明図を示す。
能基Ｘの一般化した説明図を示す。
図15は、２′−アミノ−２′−デオキシグアニンから
の保護２′−アミノ−２′−デオキシグアノシンホスホ
ラミダイト（phosphoramidite）の合成の工程を示す。
試薬:i、メタノール中のＳ−エチルトリフルオロチオア
セテート;ii、メタノール中のジメチルホルムアミドジ
メチルアセタール;iii、ピリジン中のジメトキシチチル
クロリド、トリエチルアミン;iv、ジクロロメタン中の
β−シアノエチル（N,N−ジイソプロピルアミノ）クロ
ロホスホラミダイト及びN,N−ジイソプロピル−エチル
アミン。
の保護２′−アミノ−２′−デオキシグアノシンホスホ
ラミダイト（phosphoramidite）の合成の工程を示す。
試薬:i、メタノール中のＳ−エチルトリフルオロチオア
セテート;ii、メタノール中のジメチルホルムアミドジ
メチルアセタール;iii、ピリジン中のジメトキシチチル
クロリド、トリエチルアミン;iv、ジクロロメタン中の
β−シアノエチル（N,N−ジイソプロピルアミノ）クロ
ロホスホラミダイト及びN,N−ジイソプロピル−エチル
アミン。
発明の詳細な説明
本発明の試験試料中の標的核酸分子を増幅し、検出す
るための方法に関する。
るための方法に関する。
標的核酸分子：
本発明の方法は、標的核酸分子の等比増幅を行うこと
ができる。但し、ヌクレオチド配列の少なくとも一部は
相補オリゴヌクレオチドプローブ対を合成できるほど十
分詳細に知られているものとする。この標的分子は精製
された形態又は精製されない形態であってよく、一本鎖
又は二本鎖のDNA、RNA又はDNA−RNAハイブリッドであっ
てよい。
ができる。但し、ヌクレオチド配列の少なくとも一部は
相補オリゴヌクレオチドプローブ対を合成できるほど十
分詳細に知られているものとする。この標的分子は精製
された形態又は精製されない形態であってよく、一本鎖
又は二本鎖のDNA、RNA又はDNA−RNAハイブリッドであっ
てよい。
標的核酸分子には、オリゴヌクレオチドプローブとハ
イブリダイズしている特異ヌクレオチド配列が含まれて
いる。この配列を標的配列と呼ぶ。標的核酸分子が二本
鎖であると、この分子は標的配列と標的相補配列と呼ば
れるその補体を含有する。この標的配列は12個のヌクレ
オチドのように短くてもよいが、好ましくは少なくとも
16個のヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも20個の
ヌクレオチドが含有される。標的配列又は標的相補配列
中のヌクレオチドの最大数は存在しない。このヌクレオ
チドは標的分子の一部又は標的分子全体を構成すること
ができる。
イブリダイズしている特異ヌクレオチド配列が含まれて
いる。この配列を標的配列と呼ぶ。標的核酸分子が二本
鎖であると、この分子は標的配列と標的相補配列と呼ば
れるその補体を含有する。この標的配列は12個のヌクレ
オチドのように短くてもよいが、好ましくは少なくとも
16個のヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも20個の
ヌクレオチドが含有される。標的配列又は標的相補配列
中のヌクレオチドの最大数は存在しない。このヌクレオ
チドは標的分子の一部又は標的分子全体を構成すること
ができる。
どのような核酸源も標的核酸分子源として使用するこ
とができる。例えば、細菌、ウイルス、藻類、原生動
物、酵母、菌類、プラスミド、組織培養中の細胞、及び
植物又は動物のような高級生物から単離されたDNA又はR
NAを、本発明の方法で増幅させることができる。
とができる。例えば、細菌、ウイルス、藻類、原生動
物、酵母、菌類、プラスミド、組織培養中の細胞、及び
植物又は動物のような高級生物から単離されたDNA又はR
NAを、本発明の方法で増幅させることができる。
これらのソースからのDNA又はRNAは、例えば、血液、
尿、リンパ液、滑液、胆汁、粘液、唾液、眼房水、涙
液、経血及び精液のような、ヒトを含む動物からの体液
の試料中に見出すことができるが、これらに限定されな
い。更に、DNA又はRNAを含有する試料は、例えば、木部
液、師部液及び植物浸出物のような植物からの液体中に
見出すことができるがこれらに限定されない。DNA又はR
NAを含有する試料はまた、食物、下水、法廷試料、糊、
溜池、川及び海洋などの非生物ソースに見出すことがで
きるがこれらに限定されない。
尿、リンパ液、滑液、胆汁、粘液、唾液、眼房水、涙
液、経血及び精液のような、ヒトを含む動物からの体液
の試料中に見出すことができるが、これらに限定されな
い。更に、DNA又はRNAを含有する試料は、例えば、木部
液、師部液及び植物浸出物のような植物からの液体中に
見出すことができるがこれらに限定されない。DNA又はR
NAを含有する試料はまた、食物、下水、法廷試料、糊、
溜池、川及び海洋などの非生物ソースに見出すことがで
きるがこれらに限定されない。
プローブ：
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド相補
対」は、例えばプローブ１及びプローブ１′又はプロー
ブ２及びプローブ２′などの２種の異なったオリゴヌク
レオチドプローブを意味する。プローブ１はプローブ
１′に対して相補的な塩基配列を有し、プローブ２はプ
ローブ２′に対して相補的な塩基配列を有する。プロー
ブの各対は長さが等しくても等しくなくてもよい。標的
配列又は標的相補配列１個当たり３個以上のオリゴヌク
レオチド相補対を本発明の方法で使用できることが理解
されるべきである。
対」は、例えばプローブ１及びプローブ１′又はプロー
ブ２及びプローブ２′などの２種の異なったオリゴヌク
レオチドプローブを意味する。プローブ１はプローブ
１′に対して相補的な塩基配列を有し、プローブ２はプ
ローブ２′に対して相補的な塩基配列を有する。プロー
ブの各対は長さが等しくても等しくなくてもよい。標的
配列又は標的相補配列１個当たり３個以上のオリゴヌク
レオチド相補対を本発明の方法で使用できることが理解
されるべきである。
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド対」
は、対としてのプローブ１及び２のグループ、及び対と
してのプローブ１′及び２′のグループを指す。
は、対としてのプローブ１及び２のグループ、及び対と
してのプローブ１′及び２′のグループを指す。
各プローブは２種の別個の配列を有する。一方の配列
は一般的に他方よりも長い。この２種の配列を長配列及
び短配列と言う。このオリゴヌクレオチドプローブは好
ましくはデオキシリボヌクレオチドから構成されるが、
リボヌクレオチドは許容できる代替物である。
は一般的に他方よりも長い。この２種の配列を長配列及
び短配列と言う。このオリゴヌクレオチドプローブは好
ましくはデオキシリボヌクレオチドから構成されるが、
リボヌクレオチドは許容できる代替物である。
図１の第一オリゴヌクレオチド相補対を参照すると、
プローブ１は長配列Ｈ及び短配列Ｉを有する。プローブ
１′は長配列Ｈ′及び短配列Ｉ′を有する。
プローブ１は長配列Ｈ及び短配列Ｉを有する。プローブ
１′は長配列Ｈ′及び短配列Ｉ′を有する。
図１の第二オリゴヌクレオチド相補対を参照すると、
プローブ２は長配列Ｊ及び短配列Ｋを有する。プローブ
２′は長配列Ｊ′及び短配列Ｋ′を有する。
プローブ２は長配列Ｊ及び短配列Ｋを有する。プローブ
２′は長配列Ｊ′及び短配列Ｋ′を有する。
プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ１′の長配列Ｈ′
は互いに相補的である。プローブ２の長配列Ｊ及びプロ
ーブ２′の長配列Ｊ′は互いに相補的である。長配列Ｈ
は長配列Ｊに対して相補的ではない。同様に、長配列
Ｈ′は長配列Ｊ′に対して相補的ではない。
は互いに相補的である。プローブ２の長配列Ｊ及びプロ
ーブ２′の長配列Ｊ′は互いに相補的である。長配列Ｈ
は長配列Ｊに対して相補的ではない。同様に、長配列
Ｈ′は長配列Ｊ′に対して相補的ではない。
標的核酸配列が試験試料中に存在すると、長配列Ｈ及
びＪは標的配列の隣接領域に対して完全に相補的である
か又は十分に相補的であるので、選択されたハイブリダ
イズ条件下で安定なハイブリッドを形成する。
びＪは標的配列の隣接領域に対して完全に相補的である
か又は十分に相補的であるので、選択されたハイブリダ
イズ条件下で安定なハイブリッドを形成する。
標的核酸配列に相補的なストランドが試験試料中に存
在すると、長配列Ｈ′及びＪ′は標的相補配列に対して
完全に相補的であるか又は標的相補配列の隣接領域に対
して十分に相補的であるので、選択されたハイブリダイ
ズ条件下で安定なハイブリッドを形成する。
在すると、長配列Ｈ′及びＪ′は標的相補配列に対して
完全に相補的であるか又は標的相補配列の隣接領域に対
して十分に相補的であるので、選択されたハイブリダイ
ズ条件下で安定なハイブリッドを形成する。
本明細書において、用語「標的配列の隣接領域」又は
「標的相補配列の隣接領域」はこれらの核酸分子中の配
列を示す。この配列は互いに直接隣接並置されるか又は
１個又は２個のヌクレオチド塩基によって分離されてい
る。
「標的相補配列の隣接領域」はこれらの核酸分子中の配
列を示す。この配列は互いに直接隣接並置されるか又は
１個又は２個のヌクレオチド塩基によって分離されてい
る。
長配列中のヌクレオチドの最小数は、本発明の増幅及
び検出方法で十分な選択性を与える最小数である。例え
ば、少なくとも６個、好ましくは少なくとも12個、更に
好ましくは少なくとも20個のデオキシリボヌクレオチド
又はリボヌクレオチドを含有する長鎖が適している。
び検出方法で十分な選択性を与える最小数である。例え
ば、少なくとも６個、好ましくは少なくとも12個、更に
好ましくは少なくとも20個のデオキシリボヌクレオチド
又はリボヌクレオチドを含有する長鎖が適している。
プローブの長配列の最大長さは試験試料中の標的核酸
配列の長さによってのみ制限される。長配列は標的配列
と共に安定なハイブリッドを形成するために十分な長さ
のものでなくてはならないが、好ましくは過剰のハイブ
リダイズ時間を必要とするほど長すぎない。長配列の幾
つかの適当な最大長さは200個のヌクレオチド、好まし
くは150個のヌクレオチド、更に好ましくは100個のヌク
レオチドである。
配列の長さによってのみ制限される。長配列は標的配列
と共に安定なハイブリッドを形成するために十分な長さ
のものでなくてはならないが、好ましくは過剰のハイブ
リダイズ時間を必要とするほど長すぎない。長配列の幾
つかの適当な最大長さは200個のヌクレオチド、好まし
くは150個のヌクレオチド、更に好ましくは100個のヌク
レオチドである。
長配列の適当な長さとしては、６〜100個のヌクレオ
チド、好ましくは10〜70個のヌクレオチド、更に好まし
くは16〜50個のヌクレオチド、最も好ましくは18〜30個
のヌクレオチドである。
チド、好ましくは10〜70個のヌクレオチド、更に好まし
くは16〜50個のヌクレオチド、最も好ましくは18〜30個
のヌクレオチドである。
プローブ１及び２の短配列Ｉ及びＫはそれぞれ互いに
相補的である。プローブ１′及び２′の短配列Ｉ′及び
Ｋ′はそれぞれ互いに相補的である。
相補的である。プローブ１′及び２′の短配列Ｉ′及び
Ｋ′はそれぞれ互いに相補的である。
プローブ１及び１′の短配列Ｉ及びＩ′はそれぞれ互
いに相補的であっても相補的でなくてもよい。同様に、
プローブ２及び２′の短配列Ｋ及びＫ′はそれぞれ互い
に相補的であっても相補的でなくてもよい。
いに相補的であっても相補的でなくてもよい。同様に、
プローブ２及び２′の短配列Ｋ及びＫ′はそれぞれ互い
に相補的であっても相補的でなくてもよい。
各プローブの短配列は、プローブの長配列が標的配列
又は標的相補配列とハイブリダイズした時、短配列が標
的配列とハイブリダイズしないように設計されている。
即ち、長配列Ｈ及び長配列Ｊが標的配列の隣接部分とハ
イブリダイズした時、短配列Ｉは短配列Ｋとハイブリダ
イズする。同様に、長配列Ｈ′及び長配列Ｊ′が標的相
補配列の隣接部分とハイブリダイズした時、短配列Ｉ′
は短配列Ｋ′とハイブリダイズする。
又は標的相補配列とハイブリダイズした時、短配列が標
的配列とハイブリダイズしないように設計されている。
即ち、長配列Ｈ及び長配列Ｊが標的配列の隣接部分とハ
イブリダイズした時、短配列Ｉは短配列Ｋとハイブリダ
イズする。同様に、長配列Ｈ′及び長配列Ｊ′が標的相
補配列の隣接部分とハイブリダイズした時、短配列Ｉ′
は短配列Ｋ′とハイブリダイズする。
短配列の長さは、長配列Ｈ及びＪが標的配列とハイブ
リダイズしない時には、短配列ＩとＫとの間のハイブリ
ダイズを妨げ、また、長配列Ｈ′及びＪ′が標的相補配
列とハイブリダイズしない時には短配列Ｉ′とＫ′との
間のハイブリダイズを妨げることができるよう、可能な
限り短い。
リダイズしない時には、短配列ＩとＫとの間のハイブリ
ダイズを妨げ、また、長配列Ｈ′及びＪ′が標的相補配
列とハイブリダイズしない時には短配列Ｉ′とＫ′との
間のハイブリダイズを妨げることができるよう、可能な
限り短い。
短配列の最大長さは長配列の短配列に対する比率に依
存している。長配列の短配列に対する比率は、できるだ
け大きく、好ましくは2:1〜50:1の範囲内である。例え
ば、この比は少なくとも2:1、好ましくは少なくとも5:
1、更に好ましくは少なくとも10:1、最も好ましくは少
なくとも20:1である。例えば、長配列に30個のヌクレオ
チドが含有されていると、短配列には高々10個のヌクレ
オチド、好ましくは高々６個のヌクレオチド、更に好ま
しくは高々３個のヌクレオチド、最も好ましくは２個の
ヌクレオチドが含有される。
存している。長配列の短配列に対する比率は、できるだ
け大きく、好ましくは2:1〜50:1の範囲内である。例え
ば、この比は少なくとも2:1、好ましくは少なくとも5:
1、更に好ましくは少なくとも10:1、最も好ましくは少
なくとも20:1である。例えば、長配列に30個のヌクレオ
チドが含有されていると、短配列には高々10個のヌクレ
オチド、好ましくは高々６個のヌクレオチド、更に好ま
しくは高々３個のヌクレオチド、最も好ましくは２個の
ヌクレオチドが含有される。
各短配列は、配列の１個又は２個以上のヌクレオチド
の糖及び／又は塩基単位に共有結合している、Ｘまたは
Ｙと命名した化学官能基を有している。プローブ１及び
２又はプローブ１′及び２′の短配列が互いにハイブリ
ダイズしている時、各配列の化学官能基は化学的に反応
して共有結合を形成する。この共有結合はプローブ同士
を結合して結合オリゴヌクレオチド産物を形成する。プ
ローブ１及び２又はプローブ１′及び２′の短配列が互
いにハイブリダイズしていない時、化学官能基が結合し
ているヌクレオチドと、プローブ中の隣接するヌクレオ
チド又はヌクレオチド群とは、プローブの化学官能基が
他のプローブの化学官能基と反応しないよう保護してい
る。
の糖及び／又は塩基単位に共有結合している、Ｘまたは
Ｙと命名した化学官能基を有している。プローブ１及び
２又はプローブ１′及び２′の短配列が互いにハイブリ
ダイズしている時、各配列の化学官能基は化学的に反応
して共有結合を形成する。この共有結合はプローブ同士
を結合して結合オリゴヌクレオチド産物を形成する。プ
ローブ１及び２又はプローブ１′及び２′の短配列が互
いにハイブリダイズしていない時、化学官能基が結合し
ているヌクレオチドと、プローブ中の隣接するヌクレオ
チド又はヌクレオチド群とは、プローブの化学官能基が
他のプローブの化学官能基と反応しないよう保護してい
る。
この方法で使用されるハイブリダイズ条件下におい
て、長配列は十分に高い溶融温度を有し、標的配列又は
標的相補配列と共に安定なハイブリッドを形成しなくて
はならない。短配列は十分に低い溶融温度を有していな
くてはならない。この溶融温度は、同じハイブリダイズ
条件下で、長プローブが標的配列又は標的相補配列とハ
イブリダイズしない限り、短配列が他のプローブの短相
補配列とハイブリダイズしないような温度である。
て、長配列は十分に高い溶融温度を有し、標的配列又は
標的相補配列と共に安定なハイブリッドを形成しなくて
はならない。短配列は十分に低い溶融温度を有していな
くてはならない。この溶融温度は、同じハイブリダイズ
条件下で、長プローブが標的配列又は標的相補配列とハ
イブリダイズしない限り、短配列が他のプローブの短相
補配列とハイブリダイズしないような温度である。
本明細書において、用語「溶融温度」は、オリゴヌク
レオチドが相補的核酸配列とハイブリダイズして安定な
錯体を形成する温度を指す。この用語を「Tm」と略記す
る。所定のオリゴヌクレオチドのTmは、オリゴヌクレオ
チドのサイズ及び組成、オリゴヌクレオチドの濃度並び
に反応溶媒の組成の関数である。
レオチドが相補的核酸配列とハイブリダイズして安定な
錯体を形成する温度を指す。この用語を「Tm」と略記す
る。所定のオリゴヌクレオチドのTmは、オリゴヌクレオ
チドのサイズ及び組成、オリゴヌクレオチドの濃度並び
に反応溶媒の組成の関数である。
本発明のプローブのハイブリダイゼーションの特徴
を、プローブのセグメントの長短によって本明細書に記
載する。プローブのハイブリダイゼーションの特徴はプ
ローブの長さ及び組成の両方によって大きく決定される
ので、それぞれの溶融温度によってプローブの長セグメ
ント及び短セグメントを特徴付けるのがより正確であ
る。従って、プローブの長配列は、その相補配列に関し
てプローブの短配列よりも、その相補配列に関して高い
溶融温度を有するプローブのセグメントである。同様
に、プローブの短配列は、その相補配列に関してプロー
ブの長配列よりも、その相補配列に関して低い溶融温度
を有するプローブのセグメントである。即ち、プローブ
の２種の異なったセグメントの特徴付けは、それらのそ
れぞれの溶融温度によってこれを行った時に、より正確
となる。しかしながら、ヌクレオチド配列の長さとこの
配列の溶融温度との間の一般的関係によって、プローブ
の異なるセグメントを溶融温度と同様に長さについて議
論することが容認される。
を、プローブのセグメントの長短によって本明細書に記
載する。プローブのハイブリダイゼーションの特徴はプ
ローブの長さ及び組成の両方によって大きく決定される
ので、それぞれの溶融温度によってプローブの長セグメ
ント及び短セグメントを特徴付けるのがより正確であ
る。従って、プローブの長配列は、その相補配列に関し
てプローブの短配列よりも、その相補配列に関して高い
溶融温度を有するプローブのセグメントである。同様
に、プローブの短配列は、その相補配列に関してプロー
ブの長配列よりも、その相補配列に関して低い溶融温度
を有するプローブのセグメントである。即ち、プローブ
の２種の異なったセグメントの特徴付けは、それらのそ
れぞれの溶融温度によってこれを行った時に、より正確
となる。しかしながら、ヌクレオチド配列の長さとこの
配列の溶融温度との間の一般的関係によって、プローブ
の異なるセグメントを溶融温度と同様に長さについて議
論することが容認される。
オリゴヌクレオチドプローブ対は、その全体又は部分
を、当該技術分野で公知の方法によって、４種のヌクレ
オチドから化学的に合成することができる。このような
方法としては、CaruthersによってScience 230巻、281
−285頁（1985年）に記載されたもの及びBeaucageらに
よってTetrahedron Letters 22巻、1859−1862頁（1981
年）に記載されたものなどが挙げられる。
を、当該技術分野で公知の方法によって、４種のヌクレ
オチドから化学的に合成することができる。このような
方法としては、CaruthersによってScience 230巻、281
−285頁（1985年）に記載されたもの及びBeaucageらに
よってTetrahedron Letters 22巻、1859−1862頁（1981
年）に記載されたものなどが挙げられる。
化学官能基：
化学官能基Ｘ及びＹ（Ｘ＝X1又はX2、Ｙ＝Y1又はY2）
は原子及び／又は基の対であって、それぞれプローブ１
及び２の短配列のハイブリダイズによって化学官能基が
互いに密に近接する状態とされた場合、これらの化学官
能基は互いに反応して共有結合を形成する。この基の間
の反応が生じるために、化学官能基の距離は約４オング
ストローム以下にすべきである。
は原子及び／又は基の対であって、それぞれプローブ１
及び２の短配列のハイブリダイズによって化学官能基が
互いに密に近接する状態とされた場合、これらの化学官
能基は互いに反応して共有結合を形成する。この基の間
の反応が生じるために、化学官能基の距離は約４オング
ストローム以下にすべきである。
化学官能基は各短配列中に少なくとも１個のヌクレオ
チドの塩基又は糖単位に結合している。図１に示すよう
に、化学官能基X1は短配列Ｉのヌクレオチドに結合して
いる。また図１に示すように、化学官能基X2は短配列
Ｉ′のヌクレオチドに結合している。同様に、化学官能
基Y1は短配列Ｋのヌクレオチドに結合しており、化学官
能基Y2は短配列Ｋ′のヌクレオチドに結合している。
チドの塩基又は糖単位に結合している。図１に示すよう
に、化学官能基X1は短配列Ｉのヌクレオチドに結合して
いる。また図１に示すように、化学官能基X2は短配列
Ｉ′のヌクレオチドに結合している。同様に、化学官能
基Y1は短配列Ｋのヌクレオチドに結合しており、化学官
能基Y2は短配列Ｋ′のヌクレオチドに結合している。
化学官能基X1及びX2は同じか又は異なっていてよく、
化学官能基Y1及びY2は、短配列ＩとＫ及びＩ′とＫ′が
それぞれ互いにハイブリダイズしている時X1がY1と共有
結合を形成することができ、X2がY2と共有結合を形成す
ることができる限り、同一か又は異なっていてよい。
化学官能基Y1及びY2は、短配列ＩとＫ及びＩ′とＫ′が
それぞれ互いにハイブリダイズしている時X1がY1と共有
結合を形成することができ、X2がY2と共有結合を形成す
ることができる限り、同一か又は異なっていてよい。
化学官能基は立体的に許容される部位で短配列のヌク
レオチドに共有結合する。立体的に許容される部位は、
ヌクレオチド塩基又は糖単位上の位置であって、化学官
能基が短配列同士のハイブリダイズ又は標的配列若しく
は標的相補配列に対する長配列のハイブリダイズと顕著
な干渉を起こさないで結合することができる位置と定義
される。立体的に許容される部位としては、プリン及び
ピリミジン塩基並びにヌクレオチド又は変性ヌクレオチ
ドの塩基又はリボース部分の多価ヘテロ原子の位置が挙
げられる。
レオチドに共有結合する。立体的に許容される部位は、
ヌクレオチド塩基又は糖単位上の位置であって、化学官
能基が短配列同士のハイブリダイズ又は標的配列若しく
は標的相補配列に対する長配列のハイブリダイズと顕著
な干渉を起こさないで結合することができる位置と定義
される。立体的に許容される部位としては、プリン及び
ピリミジン塩基並びにヌクレオチド又は変性ヌクレオチ
ドの塩基又はリボース部分の多価ヘテロ原子の位置が挙
げられる。
立体的に許容される部位の例としては、チミジンのＣ
−５位に結合しているメチル基、アデニン又はシチジン
のＣ−６位に結合しているアミノ基、アデニン又はグア
ニンのＣ−８位、各種のヌクレオチドのリボース環のＣ
−２′位及びリボヌクレオチドのリボース環のＣ−２′
位に結合しているヒドロキシル基が挙げられる。
−５位に結合しているメチル基、アデニン又はシチジン
のＣ−６位に結合しているアミノ基、アデニン又はグア
ニンのＣ−８位、各種のヌクレオチドのリボース環のＣ
−２′位及びリボヌクレオチドのリボース環のＣ−２′
位に結合しているヒドロキシル基が挙げられる。
プリン及びピリミジン塩基の変性は、例えば、EP 135
587号にRuthによって記載されているもののような当該
技術分野で公知の方法によって行うことができる。リボ
ヌクレオチドのリボース環のＣ−２′位でのリボヌクレ
オチドの変性は、例えば、Bioconjugate Chemistry 1
巻、319−324頁（1990年）にYamana,Kらによって記載さ
れている方法によって行うことができる。
587号にRuthによって記載されているもののような当該
技術分野で公知の方法によって行うことができる。リボ
ヌクレオチドのリボース環のＣ−２′位でのリボヌクレ
オチドの変性は、例えば、Bioconjugate Chemistry 1
巻、319−324頁（1990年）にYamana,Kらによって記載さ
れている方法によって行うことができる。
上記の立体的に許容される部位のそれぞれに於いて化
学官能基で変性されたヌクレオチドの例を図２〜６に示
す。図２〜６中で変性デオキシリボヌクレオチドが示さ
れている場合、リボヌクレオチドは受容できる置換基で
ある。変性ヌクレオチドの名称のリストを以下に示す。
学官能基で変性されたヌクレオチドの例を図２〜６に示
す。図２〜６中で変性デオキシリボヌクレオチドが示さ
れている場合、リボヌクレオチドは受容できる置換基で
ある。変性ヌクレオチドの名称のリストを以下に示す。
A1は、Ｃ−６位にあるアミノ基の水素に代えて化学官能
基Ｚを有するアデニンを表す。
基Ｚを有するアデニンを表す。
A2は、リボース環のＣ−２′位にあるヒドロキシル基に
結合した化学官能基Ｚを有するアデニンを表す。
結合した化学官能基Ｚを有するアデニンを表す。
A3は、Ｃ−８位にある水素に代えて化学官能基Ｚを有す
るアデニンを表す。
るアデニンを表す。
A4は、リボース環のＣ−２′位にあるヒドロキシル基に
代えて化学官能基Ｚを有するアデニンを表す。
代えて化学官能基Ｚを有するアデニンを表す。
C1は、Ｃ−６位にあるアミノ基の水素に代えて化学官能
基Ｚを有するシチジンを表す。
基Ｚを有するシチジンを表す。
C2は、リボース環のＣ−２′位にあるヒドロキシル基に
結合した化学官能基Ｚを有するシチジンを表す。
結合した化学官能基Ｚを有するシチジンを表す。
C3は、リボース環のＣ−２′位にあるヒドロキシル基に
代えて化学官能基Ｚを有するシチジンを表す。
代えて化学官能基Ｚを有するシチジンを表す。
G1は、Ｃ−８位にある水素に代えて化学官能基Ｚを有す
るグアニンを表す。
るグアニンを表す。
G2は、リボース環のＣ−２′位にあるヒドロキシル基に
結合した化学官能基Ｚを有するグアニンを表す。
結合した化学官能基Ｚを有するグアニンを表す。
G3は、リボース環のＣ−２′位にあるヒドロキシル基に
代えて化学官能基Ｚを有するグアニンを表す。
代えて化学官能基Ｚを有するグアニンを表す。
T1は、Ｃ−５位にあるメチル基の水素に代えて化学官能
基Ｚを有するチミジンを表す。
基Ｚを有するチミジンを表す。
T2は、リボース環のＣ−２′位にあるヒドロキシル基に
結合した化学官能基Ｚを有するチミジンを表す。
結合した化学官能基Ｚを有するチミジンを表す。
T3は、リボース環のＣ−２′位にあるヒドロキシル基に
代えて化学官能基Ｚを有するチミジンを表す。
代えて化学官能基Ｚを有するチミジンを表す。
U1は、リボース環のＣ−２′位にあるヒドロキシル基に
代えて化学官能基Ｚを有するウリジンを表す。
代えて化学官能基Ｚを有するウリジンを表す。
U2は、リボース環のＣ−２′位にあるヒドロキシル基に
結合した化学官能基Ｚを有するウリジンを表す。
結合した化学官能基Ｚを有するウリジンを表す。
Ｚは化学官能基X1、X2、Y1又はY2を表す。
本発明で使用される種々の配列、変性ヌクレオチド及
び化学官能基を記載するためにかなり多くの用語が前記
のように定義されたことは明白である。幾つかの追加の
用語を以下に定義する。読者の便宜上、用語解説を下記
実施例部分の後に記載する。そこにはこれらの用語の全
てを一個所に集約している。
び化学官能基を記載するためにかなり多くの用語が前記
のように定義されたことは明白である。幾つかの追加の
用語を以下に定義する。読者の便宜上、用語解説を下記
実施例部分の後に記載する。そこにはこれらの用語の全
てを一個所に集約している。
化学官能基Ｘ及びＹはそれぞれのヌクレオチドの同じ
位置に結合していないことに注目することが重要であ
る。例えば、制限無しに、基Ｘはプローブ１の短配列の
ヌクレオチドの位置Ｃ−２′に結合することができ、基
Ｙはプローブ２の短配列の適当なヌクレオチドの位置Ｃ
−６に結合することができる。
位置に結合していないことに注目することが重要であ
る。例えば、制限無しに、基Ｘはプローブ１の短配列の
ヌクレオチドの位置Ｃ−２′に結合することができ、基
Ｙはプローブ２の短配列の適当なヌクレオチドの位置Ｃ
−６に結合することができる。
化学官能基がプローブの短配列のヌクレオチドに結合
している位置によって、短配列の最小長さを決定するこ
とができる。例えば、化学官能基がオリゴヌクレオチド
対の両方の構成要素の短配列のヌクレオチドのＣ−２′
位に結合している時、短配列は２〜３個のヌクレオチド
のように短くてよい。しかしながら、オリゴヌクレオチ
ド対の一方の構成要素がその短配列のヌクレオチドのＣ
−２′位に結合した化学官能基を有し、対の他方の構成
要素がその短配列のヌクレオチドのＣ−２′位以外の位
置に結合した化学官能基を有する場合、短配列は１〜３
個のヌクレオチドのように短くてよい。同様に、オリゴ
ヌクレオチド対の何れの構成要素もその短配列のヌクレ
オチドのＣ−２′位に結合した化学官能基を有しない場
合、短配列は１〜３個のヌクレオチドのように短くてよ
い。
している位置によって、短配列の最小長さを決定するこ
とができる。例えば、化学官能基がオリゴヌクレオチド
対の両方の構成要素の短配列のヌクレオチドのＣ−２′
位に結合している時、短配列は２〜３個のヌクレオチド
のように短くてよい。しかしながら、オリゴヌクレオチ
ド対の一方の構成要素がその短配列のヌクレオチドのＣ
−２′位に結合した化学官能基を有し、対の他方の構成
要素がその短配列のヌクレオチドのＣ−２′位以外の位
置に結合した化学官能基を有する場合、短配列は１〜３
個のヌクレオチドのように短くてよい。同様に、オリゴ
ヌクレオチド対の何れの構成要素もその短配列のヌクレ
オチドのＣ−２′位に結合した化学官能基を有しない場
合、短配列は１〜３個のヌクレオチドのように短くてよ
い。
化学官能基をヌクレオチドに結合させるための好まし
い位置は、ヌクレオチドのリボース環のＣ−２′位であ
る。例えば、Moffattら、J.Org.Chem.36巻、250頁（197
1年）及びRuthのEP 135 587号に記載されているプロト
コルによって、リボース環のＣ−２′位のヒドロキシル
基をアミノ基で置換することが便利である。このアミノ
基は化学官能基として機能するか又は化学官能基をリボ
ース環に結合させるための架橋基として機能し得る。
い位置は、ヌクレオチドのリボース環のＣ−２′位であ
る。例えば、Moffattら、J.Org.Chem.36巻、250頁（197
1年）及びRuthのEP 135 587号に記載されているプロト
コルによって、リボース環のＣ−２′位のヒドロキシル
基をアミノ基で置換することが便利である。このアミノ
基は化学官能基として機能するか又は化学官能基をリボ
ース環に結合させるための架橋基として機能し得る。
化学官能基には任意に架橋基が含まれていてよく、こ
の架橋基を介して化学官能基がヌクレオチドに結合す
る。架橋基の例として、アミノ、アミド、チオ、カルボ
ニル、カルボキシル並びに任意に全ての位置でアミド、
カルボニル、カルボキシル、アミノ及びチオのような基
で置換された、アルキル基、アリール基、アルキルアリ
ール基及びアリールアルキル基が挙げられるが、これら
に限定されない。アルキル基は全体的に又は部分的に環
状であってよい。アルキル基の例として、メチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘ
キシル、シクロヘキシル等を挙げることができるが、こ
れらに限定されない。アリール基の例として、フェニ
ル、ナフチル、イミダゾリル、インジル（indyl）等を
挙げることができるが、これらに限定されない。更に、
例示する目的で、本明細書において用語「Ph」はフェニ
ル基を指す。例えば、１位及び３位で置換されたフェニ
ル基は1,3Phと記載する。
の架橋基を介して化学官能基がヌクレオチドに結合す
る。架橋基の例として、アミノ、アミド、チオ、カルボ
ニル、カルボキシル並びに任意に全ての位置でアミド、
カルボニル、カルボキシル、アミノ及びチオのような基
で置換された、アルキル基、アリール基、アルキルアリ
ール基及びアリールアルキル基が挙げられるが、これら
に限定されない。アルキル基は全体的に又は部分的に環
状であってよい。アルキル基の例として、メチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘ
キシル、シクロヘキシル等を挙げることができるが、こ
れらに限定されない。アリール基の例として、フェニ
ル、ナフチル、イミダゾリル、インジル（indyl）等を
挙げることができるが、これらに限定されない。更に、
例示する目的で、本明細書において用語「Ph」はフェニ
ル基を指す。例えば、１位及び３位で置換されたフェニ
ル基は1,3Phと記載する。
本発明の方法に適した化学反応の幾つかの特別の実施
例を以下に示す。これらの実施例では、Ｄは変性ヌクレ
オチドA4、C3、G3、T3又はU1を表し、Ｅは変性ヌクレオ
チドA1又はC1を表し、Ｆは変性ヌクレオチドA3又はG1を
表し、そしてＬは変性リボヌクレオチドA2、C2、G2、T2
又はU2を表す。これらの変性ヌクレオチドを図２〜６に
示す（実施例部分の終わりの「用語解説」も参照された
い）。
例を以下に示す。これらの実施例では、Ｄは変性ヌクレ
オチドA4、C3、G3、T3又はU1を表し、Ｅは変性ヌクレオ
チドA1又はC1を表し、Ｆは変性ヌクレオチドA3又はG1を
表し、そしてＬは変性リボヌクレオチドA2、C2、G2、T2
又はU2を表す。これらの変性ヌクレオチドを図２〜６に
示す（実施例部分の終わりの「用語解説」も参照された
い）。
所定の一対の相補短配列に於いて、例えば、対の一方
の構成要素は求核化学官能基を有し、対の他方の構成要
素は求電子化学官能基を有する（即ち、図１のＸが求核
性であると、Ｙは求電子性であり、逆もまた然り）。
の構成要素は求核化学官能基を有し、対の他方の構成要
素は求電子化学官能基を有する（即ち、図１のＸが求核
性であると、Ｙは求電子性であり、逆もまた然り）。
求核基の幾つかの例として、−SH、−NH2、−NHA（但
し、Ａはメチル、エチル、プロピル、ブチル等のような
アルキル基又はフェニル、ナフチル、イミダゾリル、イ
ンジル等のようなアリール基である）が挙げられる。求
電子基は求核基からの電子移動を介して単結合又は二重
結合を形成することができる。求核基と求電子基との間
の反応には、電子求引性基に結合した二重結合を横切る
求核基の付加又は求電子離脱基の求核基による置換が含
まれていてよい。
し、Ａはメチル、エチル、プロピル、ブチル等のような
アルキル基又はフェニル、ナフチル、イミダゾリル、イ
ンジル等のようなアリール基である）が挙げられる。求
電子基は求核基からの電子移動を介して単結合又は二重
結合を形成することができる。求核基と求電子基との間
の反応には、電子求引性基に結合した二重結合を横切る
求核基の付加又は求電子離脱基の求核基による置換が含
まれていてよい。
マレイミド単位の二重結合へのチオール基の付加を含
む二重結合を横切る求核基の付加の例を以下に示す。こ
の反応の一般的概要は下記の通りである。ここでＲ−Ｚ
及びＲ′−Ｚは図２〜６に示す変性ヌクレオチドのいず
れかを表す。
む二重結合を横切る求核基の付加の例を以下に示す。こ
の反応の一般的概要は下記の通りである。ここでＲ−Ｚ
及びＲ′−Ｚは図２〜６に示す変性ヌクレオチドのいず
れかを表す。
マイケル反応の一般式は次の通りである。
求電子離脱基を求核基に代える置換を含む反応の一般
式は次の通りである。
式は次の通りである。
化学官能基の間の他のタイプの反応としては、例え
ば、ディールス−アルダー反応やペリサイクリック反応
等一以上の新たな共有結合を生み出す反応が挙げられ
る。ディールス−アルダー反応の一般式は次の通りであ
る。
ば、ディールス−アルダー反応やペリサイクリック反応
等一以上の新たな共有結合を生み出す反応が挙げられ
る。ディールス−アルダー反応の一般式は次の通りであ
る。
化学官能基間におけるディールス−アルダー反応の他
の例としては、以下のものが挙げられる。
の例としては、以下のものが挙げられる。
化学官能基としてはまた、［２＋２］光−シクロダイ
マー化や他のタイプの光環化等の光化学反応によって共
有結合を形成するものも選択できる。［２＋２］光−シ
クロダイマー化反応の例を以下に示す。
マー化や他のタイプの光環化等の光化学反応によって共
有結合を形成するものも選択できる。［２＋２］光−シ
クロダイマー化反応の例を以下に示す。
化学官能基間における［２＋２］光−シクロダイマー
化反応の更なる例を以下に示す。この反応の一般式は以
下のとおりである。
化反応の更なる例を以下に示す。この反応の一般式は以
下のとおりである。
化学官能基間における光化学反応の別の例を以下に示
す。ここでフェニル基は２−位でNO2基と、また４−位
でOCH3基と置換されている。置換フェニル基は（２、NO
2、４、OCH3−Ph）と表記される。ＲとR'は天然に出現
するデオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチ
ドを表わす。
す。ここでフェニル基は２−位でNO2基と、また４−位
でOCH3基と置換されている。置換フェニル基は（２、NO
2、４、OCH3−Ph）と表記される。ＲとR'は天然に出現
するデオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチ
ドを表わす。
化学増幅と検出プロセスの記載：
本発明においては、標的核酸配列の増幅は、標的核酸
分子の各ストランドに対する二以上の化学修飾されたオ
リゴヌクレオチドプローブを結合して、結合オリゴヌク
レオチド産物を形成することによって達成される。一旦
形成された結合オリゴヌクレオチド産物はさらに結合オ
リゴヌクレオチド産物を産生するためのテンプレートと
して働く。このプロセスの各段階を十分な回数繰り返す
ことによって、検出可能な量の結合オリゴヌクレオチド
産物が生成される。本発明のプロセスの各段階の個々の
繰り返しをサイクルと呼ぶ。検出可能な量の結合オリゴ
ヌクレオチド産物を産生するのに必要なサイクルの回数
は、多くの場合、試料中に最初に存在する標的分子の数
に依存する。試料中の標的分子数が多ければ多いほど、
検出可能な量の結合オリゴヌクレオチド産物を産するの
に必要なサイクル数は低減する。必要量の結合オリゴヌ
クレオチド産物が形成されれば、それは検出可能であ
る。本発明の新規な様相の一つは、結合オリゴヌクレオ
チド産物から、オリゴヌクレオチドプローブを形成する
方法である。本発明では、DNAポリペラーゼもDNAリガー
ゼも、結合オリゴヌクレオチド産物を形成するためには
用いない。
分子の各ストランドに対する二以上の化学修飾されたオ
リゴヌクレオチドプローブを結合して、結合オリゴヌク
レオチド産物を形成することによって達成される。一旦
形成された結合オリゴヌクレオチド産物はさらに結合オ
リゴヌクレオチド産物を産生するためのテンプレートと
して働く。このプロセスの各段階を十分な回数繰り返す
ことによって、検出可能な量の結合オリゴヌクレオチド
産物が生成される。本発明のプロセスの各段階の個々の
繰り返しをサイクルと呼ぶ。検出可能な量の結合オリゴ
ヌクレオチド産物を産生するのに必要なサイクルの回数
は、多くの場合、試料中に最初に存在する標的分子の数
に依存する。試料中の標的分子数が多ければ多いほど、
検出可能な量の結合オリゴヌクレオチド産物を産するの
に必要なサイクル数は低減する。必要量の結合オリゴヌ
クレオチド産物が形成されれば、それは検出可能であ
る。本発明の新規な様相の一つは、結合オリゴヌクレオ
チド産物から、オリゴヌクレオチドプローブを形成する
方法である。本発明では、DNAポリペラーゼもDNAリガー
ゼも、結合オリゴヌクレオチド産物を形成するためには
用いない。
本発明プロセスで用いられるプローブ１、1'、２、お
よび2'は以下に記載のもので一本鎖あるいは二本鎖の核
酸分子中の標的配列を増幅する。
よび2'は以下に記載のもので一本鎖あるいは二本鎖の核
酸分子中の標的配列を増幅する。
上記の様に、標的配列が試験試料中に存在すれば、注
意深く制御されたハイブリダイゼーション条件下で、オ
リゴヌクレオチドプローブ１と２それぞれの長配列Ｈと
Ｊのみが標的配列における隣り合った領域とハイブリダ
イズする。この時、プローブ１と２それぞれの短配列Ｉ
とＫは、標的配列とはハイブリダイズされないまま残さ
れる。長配列ＨとＪが、標的配列と共に安定なハイブリ
ッド複合体を形成完了すると、短配列ＩとＫは互いに接
近させられると共に、相補的であることによって互いに
ハイブリダイズされる。短配列ＩとＫが互いにハイブリ
ダイズすると、化学官能基X1とY1は十分接近し、共有結
合を形成する。化学官能基X1とY1の間の結合はプローブ
１と２を結合させ、第一結合オリゴヌクレオチド産物を
形成する。一旦これが形成されると、この第一結合オリ
ゴヌクレオチド産物の二つの配列は、“標的相補配列”
を構成し、標的配列の隣り合う配列に相補的となる。
意深く制御されたハイブリダイゼーション条件下で、オ
リゴヌクレオチドプローブ１と２それぞれの長配列Ｈと
Ｊのみが標的配列における隣り合った領域とハイブリダ
イズする。この時、プローブ１と２それぞれの短配列Ｉ
とＫは、標的配列とはハイブリダイズされないまま残さ
れる。長配列ＨとＪが、標的配列と共に安定なハイブリ
ッド複合体を形成完了すると、短配列ＩとＫは互いに接
近させられると共に、相補的であることによって互いに
ハイブリダイズされる。短配列ＩとＫが互いにハイブリ
ダイズすると、化学官能基X1とY1は十分接近し、共有結
合を形成する。化学官能基X1とY1の間の結合はプローブ
１と２を結合させ、第一結合オリゴヌクレオチド産物を
形成する。一旦これが形成されると、この第一結合オリ
ゴヌクレオチド産物の二つの配列は、“標的相補配列”
を構成し、標的配列の隣り合う配列に相補的となる。
同様に、プローブ1'と2'それぞれの長配列H'とJ'が標
的相補配列の隣り合う領域にハイブリダイズすると、プ
ローブ1'と2'それぞれの短配列I'とK'が互いにハイブリ
ダイズする。短配列I'とK'のハイブリダイゼーションに
よって配列I'の化学官能基X2と配列K'の化学官能基Y2は
十分接近し、共有結合を形成し、これによってプローブ
1'と2'は結合して第二結合オリゴヌクレオチド産物を産
生する。第二結合オリゴヌクレオチド産物の二つの配列
が一旦形成されると、これらは“標的配列”を構築する
が、これは標的相補配列の隣接配列に対して相補的であ
る。
的相補配列の隣り合う領域にハイブリダイズすると、プ
ローブ1'と2'それぞれの短配列I'とK'が互いにハイブリ
ダイズする。短配列I'とK'のハイブリダイゼーションに
よって配列I'の化学官能基X2と配列K'の化学官能基Y2は
十分接近し、共有結合を形成し、これによってプローブ
1'と2'は結合して第二結合オリゴヌクレオチド産物を産
生する。第二結合オリゴヌクレオチド産物の二つの配列
が一旦形成されると、これらは“標的配列”を構築する
が、これは標的相補配列の隣接配列に対して相補的であ
る。
あるプローブの短配列が他のプローブの短配列にハイブ
リダイズしない場合、各プローブの化学官能基は、それ
が結合している短配列のヌクレオチドによって保護され
るとともに、隣接するヌクレオチドによって他のプロー
ブ上の化学官能基が接近しないよう守られている。短配
列に結合した保護された化学官能基の一般的な図示を図
９に示す。
リダイズしない場合、各プローブの化学官能基は、それ
が結合している短配列のヌクレオチドによって保護され
るとともに、隣接するヌクレオチドによって他のプロー
ブ上の化学官能基が接近しないよう守られている。短配
列に結合した保護された化学官能基の一般的な図示を図
９に示す。
短配列のヌクレオチドによる化学官能基の保護の結
果、ハイブリダイゼーションによって化学官能基が短配
列の近傍に互いに十分接近しない限り、各化学官能基は
他のプローブ上の化学官能基との反応を阻害される。
果、ハイブリダイゼーションによって化学官能基が短配
列の近傍に互いに十分接近しない限り、各化学官能基は
他のプローブ上の化学官能基との反応を阻害される。
図２〜６に示すヌクレオチド塩基に結合した化学官能
基を有する二つの短配列の一般的な図示を図10〜14に示
す。図10〜14において、化学官能基ＸとＹは共有結合に
よって結合している。
基を有する二つの短配列の一般的な図示を図10〜14に示
す。図10〜14において、化学官能基ＸとＹは共有結合に
よって結合している。
図10から判るように、化学官能基ＸとＹは、各ヌクレ
オチドＢのリボース環のＣ−２′位に結合できる。これ
らの化学官能基が結合するヌクレオチド塩基は互いにハ
イブリダイズしない。一方、化学官能基Ｘが結合するヌ
クレオチドは、化学官能基Ｙが結合しているヌクレオチ
ドに隣接するヌクレオチドにハイブリダイズする。
オチドＢのリボース環のＣ−２′位に結合できる。これ
らの化学官能基が結合するヌクレオチド塩基は互いにハ
イブリダイズしない。一方、化学官能基Ｘが結合するヌ
クレオチドは、化学官能基Ｙが結合しているヌクレオチ
ドに隣接するヌクレオチドにハイブリダイズする。
図11から判るように、化学官能基Ｘはヌクレオチド塩
基Ｂのリボース環のＣ−2'位に結合でき、化学官能基Ｙ
はヌクレオチド塩基ＢのＣ−５、Ｃ−６、あるいはＣ−
８位のいずれかの位置に結合できる。図11に示す態様に
おいては、化学官能基が結合したヌクレオチド塩基は互
いにハイブリダイズしていない。
基Ｂのリボース環のＣ−2'位に結合でき、化学官能基Ｙ
はヌクレオチド塩基ＢのＣ−５、Ｃ−６、あるいはＣ−
８位のいずれかの位置に結合できる。図11に示す態様に
おいては、化学官能基が結合したヌクレオチド塩基は互
いにハイブリダイズしていない。
図12から判るように、化学官能基Ｘはヌクレオチド塩
基Ｂのリボース環のＣ−2'位に結合でき、化学官能基Ｙ
はヌクレオチド塩基ＢのＣ−５、Ｃ−６、あるいはＣ−
８位のいずれかの位置に結合できる。図12に示す態様で
は、化学官能基が結合したヌクレオチド塩基は互いにハ
イブリダイズしている。
基Ｂのリボース環のＣ−2'位に結合でき、化学官能基Ｙ
はヌクレオチド塩基ＢのＣ−５、Ｃ−６、あるいはＣ−
８位のいずれかの位置に結合できる。図12に示す態様で
は、化学官能基が結合したヌクレオチド塩基は互いにハ
イブリダイズしている。
図13から判るように、化学官能基Ｘはヌクレオチド塩
基ＢのＣ−５、Ｃ−６、あるいはＣ−８位のいずれかの
位置に結合でき、化学官能基Ｙはヌクレオチド塩基Ｂの
Ｃ−５、Ｃ−６、あるいはＣ−８位のいずれかの位置に
結合できる。図13に示す態様では、化学官能基が結合し
たヌクレオチド塩基は互いにハイブリダイズしている。
基ＢのＣ−５、Ｃ−６、あるいはＣ−８位のいずれかの
位置に結合でき、化学官能基Ｙはヌクレオチド塩基Ｂの
Ｃ−５、Ｃ−６、あるいはＣ−８位のいずれかの位置に
結合できる。図13に示す態様では、化学官能基が結合し
たヌクレオチド塩基は互いにハイブリダイズしている。
図14から判るように、化学官能基Ｘはヌクレオチド塩
基ＢのＣ−５、Ｃ−６、あるいはＣ−８位のいずれかの
位置に結合でき、化学官能基Ｙはヌクレオチド塩基Ｂの
Ｃ−５、Ｃ−６、あるいはＣ−８位のいずれかの位置に
結合できる。図14に示す態様では、化学官能基が結合し
たヌクレオチド塩基は互いにハイブリダイズしていな
い。
基ＢのＣ−５、Ｃ−６、あるいはＣ−８位のいずれかの
位置に結合でき、化学官能基Ｙはヌクレオチド塩基Ｂの
Ｃ−５、Ｃ−６、あるいはＣ−８位のいずれかの位置に
結合できる。図14に示す態様では、化学官能基が結合し
たヌクレオチド塩基は互いにハイブリダイズしていな
い。
二本鎖の標的分子にハイブリダイズし、化学官能基に
よって連結されて第一及び第二の結合オリゴヌクレオチ
ド産物を形成する、オリゴヌクレオチドプローブの両対
の一般化した図式を下に示す。本発明の好ましい実施態
様においては、プローブ間にはギャップはない。但し、
１ないし２ヌクレオチドの程度のギャップは許容され
る。
よって連結されて第一及び第二の結合オリゴヌクレオチ
ド産物を形成する、オリゴヌクレオチドプローブの両対
の一般化した図式を下に示す。本発明の好ましい実施態
様においては、プローブ間にはギャップはない。但し、
１ないし２ヌクレオチドの程度のギャップは許容され
る。
一本鎖標的分子を含有する試料においては、第二結合
オリゴヌクレオチド産物は、最初のサイクル後に形成さ
れる。標的相補分子の不存在下で第二結合オリゴヌクレ
オチド産物を形成するためには、プロセスの最初のサイ
クルにおいて第一結合オリゴヌクレオチド産物を形成す
る必要がある。第一結合オリゴヌクレオチド産物は標的
相補配列を有し、プローブ1'と2'がハイブリダイズする
テンプレートとして機能する。プローブ1'と2'は、プロ
セスにおける次のサイクルおよび引き続くサイクルにお
いて標的配列を有する第二結合オリゴヌクレオチド産物
を形成する。
オリゴヌクレオチド産物は、最初のサイクル後に形成さ
れる。標的相補分子の不存在下で第二結合オリゴヌクレ
オチド産物を形成するためには、プロセスの最初のサイ
クルにおいて第一結合オリゴヌクレオチド産物を形成す
る必要がある。第一結合オリゴヌクレオチド産物は標的
相補配列を有し、プローブ1'と2'がハイブリダイズする
テンプレートとして機能する。プローブ1'と2'は、プロ
セスにおける次のサイクルおよび引き続くサイクルにお
いて標的配列を有する第二結合オリゴヌクレオチド産物
を形成する。
プロセスの最初のサイクルで一旦第一結合オリゴヌク
レオチド産物が形成されると、当該産物は変性によって
標的配列から分離される。本明細書で用いる用語“変性
させる”あるいは“変性”とは、高次構造の可逆的喪失
およびハイブリダイズされた核酸を一本鎖に分離するこ
とを意味し、酵素、pH、温度、塩、あるいは有機溶剤な
どの生理学的もしくは非生理学的条件で達成される。
レオチド産物が形成されると、当該産物は変性によって
標的配列から分離される。本明細書で用いる用語“変性
させる”あるいは“変性”とは、高次構造の可逆的喪失
およびハイブリダイズされた核酸を一本鎖に分離するこ
とを意味し、酵素、pH、温度、塩、あるいは有機溶剤な
どの生理学的もしくは非生理学的条件で達成される。
第二結合オリゴヌクレオチド産物も標的相補配列か
ら、また、第一結合オリゴヌクレオチド産物が一旦形成
された場合にはこの第一結合オリゴヌクレオチド産物か
ら、変性によって分離される。標的分子並びに第一及び
第二結合オリゴヌクレオチド産物は、本プロセスにおい
て、反復サイクルのテンプレートとして機能する。
ら、また、第一結合オリゴヌクレオチド産物が一旦形成
された場合にはこの第一結合オリゴヌクレオチド産物か
ら、変性によって分離される。標的分子並びに第一及び
第二結合オリゴヌクレオチド産物は、本プロセスにおい
て、反復サイクルのテンプレートとして機能する。
一本鎖配列を得るための、本発明増幅プロセスの最初
のサイクルの一般化した図式を以下に示す。
のサイクルの一般化した図式を以下に示す。
段階１
標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションおよび
第一結合オリゴヌクレオチド産物を形成するための化学
官能基を介したプローブの結合 二本鎖配列を得るための、増幅プロセスの最初のサイ
クルの一般化した図式を以下に示す。
第一結合オリゴヌクレオチド産物を形成するための化学
官能基を介したプローブの結合 二本鎖配列を得るための、増幅プロセスの最初のサイ
クルの一般化した図式を以下に示す。
段階１
標的配列と標的相補配列に対するプローブのハイブリダ
イゼーションおよび結合オリゴヌクレオチド産物を形成
するための化学官能基を介したプローブの結合 標的相補配列 一旦プロセスの最初のサイクルが完了すると、標的配
列のさらなる増幅は、結合オリゴヌクレオチド産物を用
いて変性を繰り返し、プローブ対を結合オリゴヌクレオ
チド産物に対してアニールし、短鎖上の化学官能基間に
共有結合を形成して新たな結合オリゴヌクレオチド産物
を生成することによって達成することができる。最初の
サイクル後の全サイクルにおいて、標的配列（一本鎖お
よび二本鎖の標的分子と第二結合オリゴヌクレオチド産
物）及び標的相補配列（二本鎖標的分子および第一オリ
ゴヌクレオチド産物）の両者が存在しなければならな
い。
イゼーションおよび結合オリゴヌクレオチド産物を形成
するための化学官能基を介したプローブの結合 標的相補配列 一旦プロセスの最初のサイクルが完了すると、標的配
列のさらなる増幅は、結合オリゴヌクレオチド産物を用
いて変性を繰り返し、プローブ対を結合オリゴヌクレオ
チド産物に対してアニールし、短鎖上の化学官能基間に
共有結合を形成して新たな結合オリゴヌクレオチド産物
を生成することによって達成することができる。最初の
サイクル後の全サイクルにおいて、標的配列（一本鎖お
よび二本鎖の標的分子と第二結合オリゴヌクレオチド産
物）及び標的相補配列（二本鎖標的分子および第一オリ
ゴヌクレオチド産物）の両者が存在しなければならな
い。
一本鎖および二本鎖標的配列を得るための増幅プロセ
ス中における二回目およびそれ以降の全サイクルにおい
て、付加的な第一および第二結合オリゴヌクレオチド産
物群の形成に際して上記の第一および第二結合オリゴヌ
クレオチド産物がテンプレートとして作用する能力を示
す一般的図式を以下に記す。
ス中における二回目およびそれ以降の全サイクルにおい
て、付加的な第一および第二結合オリゴヌクレオチド産
物群の形成に際して上記の第一および第二結合オリゴヌ
クレオチド産物がテンプレートとして作用する能力を示
す一般的図式を以下に記す。
段階２
前段階で得た第一および第二結合オリゴヌクレオチド産
物からの標的配列と標的相補配列に対するプローブのハ
イブリダイゼーションおよび、新たな結合オリゴヌクレ
オチド産物を形成するためのプローブの結合 第一結合オリゴヌクレオチド産物 標的とは独立した短配列のハイブリダイゼーションの
回避は、反応温度を長配列（Ｈ、H'、Ｊ、およびJ'）の
融点（Tm）よりも十分低く保持することによって長配列
を標的配列または標的相補配列に安定にハイブリダイズ
させるとともに、短配列（Ｉ、I'、Ｋ、およびK'）の融
点（Tm）よりも高く保持して、プローブが標的配列ある
いは標的相補配列に十分ハイブリダイズしない場合に短
配列が互いに安定にハイブリダイズすることを防止する
ことによって回避する。このような厳しい条件の下で
は、相補的短配列（ＩとK;I'とK'）が互いにハイブリダ
イズするのは、プローブの長配列が標的配列あるいは標
的相補配列の隣接部にハイブリダイズしている場合のみ
である。短配列はそこで、十分に安定なハイブリッドを
形成し、化学官能基の反応を進行させて結合オリゴヌク
レオチド産物を形成させる。従って、短配列の長さは、
使用する反応条件の下で、Tmが十分低いように選択され
なければならない。そうすることによって、短配列が標
的とは独立してハイブリダイズすることを防止できる。
一方、長配列の長さは、標的配列や標的相補配列と安定
なハイブリッドを効率的に形成できるように選択されな
ければならない。
物からの標的配列と標的相補配列に対するプローブのハ
イブリダイゼーションおよび、新たな結合オリゴヌクレ
オチド産物を形成するためのプローブの結合 第一結合オリゴヌクレオチド産物 標的とは独立した短配列のハイブリダイゼーションの
回避は、反応温度を長配列（Ｈ、H'、Ｊ、およびJ'）の
融点（Tm）よりも十分低く保持することによって長配列
を標的配列または標的相補配列に安定にハイブリダイズ
させるとともに、短配列（Ｉ、I'、Ｋ、およびK'）の融
点（Tm）よりも高く保持して、プローブが標的配列ある
いは標的相補配列に十分ハイブリダイズしない場合に短
配列が互いに安定にハイブリダイズすることを防止する
ことによって回避する。このような厳しい条件の下で
は、相補的短配列（ＩとK;I'とK'）が互いにハイブリダ
イズするのは、プローブの長配列が標的配列あるいは標
的相補配列の隣接部にハイブリダイズしている場合のみ
である。短配列はそこで、十分に安定なハイブリッドを
形成し、化学官能基の反応を進行させて結合オリゴヌク
レオチド産物を形成させる。従って、短配列の長さは、
使用する反応条件の下で、Tmが十分低いように選択され
なければならない。そうすることによって、短配列が標
的とは独立してハイブリダイズすることを防止できる。
一方、長配列の長さは、標的配列や標的相補配列と安定
なハイブリッドを効率的に形成できるように選択されな
ければならない。
本発明の他の態様においては、標的配列または標的相
補配列が存在する場合には、その線形増幅は、上記のプ
ロセスにおいてはプローブ１と２、あるいはプローブ1'
と2'のみを用いて達成することが出来る。
補配列が存在する場合には、その線形増幅は、上記のプ
ロセスにおいてはプローブ１と２、あるいはプローブ1'
と2'のみを用いて達成することが出来る。
本発明の好ましい実施例においては、例えば30％脱イ
オンホルムアミド水溶液（vol/vol）、0.54MのNaClの0.
03Mのリン酸ナトリウム（pH7.4）、0.003MのEDTA、５％
デキストラン硫酸500Km.w.（シグマ社）（w/vol）、あ
るいは0.1％TritonX−100などの標準ハイブリダイゼー
ションバッファーを６〜100ヌクレオチド長のオリゴヌ
クレオチドとともに使用する。変性の温度とハイブリダ
イゼーションの温度のみが、オリゴヌクレオチドのプロ
ーブ（より正確にはTm）の長さの変更によって変化す
る。ハイブリダイゼーション温度と変性温度は、両者と
もオリゴヌクレオチドプローブ長の関数である。以下の
表に、オリゴヌクレオチド長とハイブリダイゼーション
温度および変性温度との好ましい平均的関係を示す。
オンホルムアミド水溶液（vol/vol）、0.54MのNaClの0.
03Mのリン酸ナトリウム（pH7.4）、0.003MのEDTA、５％
デキストラン硫酸500Km.w.（シグマ社）（w/vol）、あ
るいは0.1％TritonX−100などの標準ハイブリダイゼー
ションバッファーを６〜100ヌクレオチド長のオリゴヌ
クレオチドとともに使用する。変性の温度とハイブリダ
イゼーションの温度のみが、オリゴヌクレオチドのプロ
ーブ（より正確にはTm）の長さの変更によって変化す
る。ハイブリダイゼーション温度と変性温度は、両者と
もオリゴヌクレオチドプローブ長の関数である。以下の
表に、オリゴヌクレオチド長とハイブリダイゼーション
温度および変性温度との好ましい平均的関係を示す。
一般に、オリゴヌクレオチド対は、核酸標的配列また
は核酸標的相補配列の一配列毎に約105〜1015モル好ま
しくは約109〜1015モル過剰に存在する。診断目的のた
めに用いられるべきオリゴヌクレオチド対の正確な量
は、試料中の核酸標的の量が不明確であるために知りえ
ないであろう。しかしながら、典型的な診断アッセイ方
式においては、平均量として1015のオリゴヌクレオチド
対の使用が適用される。本発明のプロセスの効率を改善
するためには過剰モルである程好ましい。
は核酸標的相補配列の一配列毎に約105〜1015モル好ま
しくは約109〜1015モル過剰に存在する。診断目的のた
めに用いられるべきオリゴヌクレオチド対の正確な量
は、試料中の核酸標的の量が不明確であるために知りえ
ないであろう。しかしながら、典型的な診断アッセイ方
式においては、平均量として1015のオリゴヌクレオチド
対の使用が適用される。本発明のプロセスの効率を改善
するためには過剰モルである程好ましい。
もし二つのプローブの長配列が標的配列にハイブリダ
イズせず、当該両プローブの短配列が互いにハイブリダ
イズしていない場合には、化学官能基は当該プローブと
の反応、結合を阻止されるので、標的とは独立した結合
オリゴヌクレオチド産物の生成が回避される。
イズせず、当該両プローブの短配列が互いにハイブリダ
イズしていない場合には、化学官能基は当該プローブと
の反応、結合を阻止されるので、標的とは独立した結合
オリゴヌクレオチド産物の生成が回避される。
一旦、結合オリゴヌクレオチド産物が十分な量産生さ
れると、当該産物は本技術分野における日常的方法によ
って検出される。そのような方法としては、例えば、結
合オリゴヌクレオチド産物の一メンバー（即ち１あるい
は1'）を不動化するとともに他のメンバー（即ち２ある
いは2'）を例えば一以上の放射性、発色性、化学発光
性、あるいは蛍光性の信号で標識するかまたはゲル上で
結合オリゴヌクレオチド産物をサイジングする。
れると、当該産物は本技術分野における日常的方法によ
って検出される。そのような方法としては、例えば、結
合オリゴヌクレオチド産物の一メンバー（即ち１あるい
は1'）を不動化するとともに他のメンバー（即ち２ある
いは2'）を例えば一以上の放射性、発色性、化学発光
性、あるいは蛍光性の信号で標識するかまたはゲル上で
結合オリゴヌクレオチド産物をサイジングする。
オリゴヌクレオチドプローブの標識方法は、例えばLe
aryら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1983）80:4045;Renz
およびKurz、Nucl.Acids Res.（1984）12:3435;Rishar
dsonおよびGumport、Nucl.Acids Res.（1983）11:616
7;Smithら、Nucl.Acids Res.（1985）13:2399;およびM
einkothおよびWahl、Anal.Biochem.（1984）138:267に
記載されている。
aryら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1983）80:4045;Renz
およびKurz、Nucl.Acids Res.（1984）12:3435;Rishar
dsonおよびGumport、Nucl.Acids Res.（1983）11:616
7;Smithら、Nucl.Acids Res.（1985）13:2399;およびM
einkothおよびWahl、Anal.Biochem.（1984）138:267に
記載されている。
標識は放射性であってよい。好ましい放射性標識の例
としては、12P、125I、131Iおよび3Hが挙げられる。放
射性標識の使用については、英国特許第2034323号、米
国特許第4358535号、および米国特許第4302204号に記載
されている。
としては、12P、125I、131Iおよび3Hが挙げられる。放
射性標識の使用については、英国特許第2034323号、米
国特許第4358535号、および米国特許第4302204号に記載
されている。
非放射性標識の例としては、酵素、発色団、電子顕微
鏡で検出可能な原子および分子、さらに磁性を有するこ
とで検出可能な金属イオンが挙げられる。
鏡で検出可能な原子および分子、さらに磁性を有するこ
とで検出可能な金属イオンが挙げられる。
有用な酵素標識としては、基質中に検出可能な変化を
もたらす酵素が挙げられる。有用な酵素およびその基質
の例としては、ホースラディッシュペロキシダーゼ（ピ
ロガロールおよびｏ−フェニレンジアミン）、β−ガラ
クトシダーゼ（フルオレセインβ−ガラクトピラノシ
ド）、およびアルカリフォスファターゼ（５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル・フォスフェート／ニトロ
ブルー・テトラゾリウム）が挙げられる。酵素標識の使
用については、英国特許第2019404号、ヨーロッパ特許
第63879号、およびRotmanによるProc.Natl.Acad.Sci.、
47、1981−1991（1961）に記載されている。
もたらす酵素が挙げられる。有用な酵素およびその基質
の例としては、ホースラディッシュペロキシダーゼ（ピ
ロガロールおよびｏ−フェニレンジアミン）、β−ガラ
クトシダーゼ（フルオレセインβ−ガラクトピラノシ
ド）、およびアルカリフォスファターゼ（５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル・フォスフェート／ニトロ
ブルー・テトラゾリウム）が挙げられる。酵素標識の使
用については、英国特許第2019404号、ヨーロッパ特許
第63879号、およびRotmanによるProc.Natl.Acad.Sci.、
47、1981−1991（1961）に記載されている。
有用な発色団の例としては、蛍光分子、化学発光分
子、および生物発光分子とともに色素が挙げられる。本
発明において有用な発色団の具体例としては、フルオレ
セイン、ローダミン、テキサスレッド、紅藻素、ウンベ
リフェロン、ルミノールが挙げられる。
子、および生物発光分子とともに色素が挙げられる。本
発明において有用な発色団の具体例としては、フルオレ
セイン、ローダミン、テキサスレッド、紅藻素、ウンベ
リフェロン、ルミノールが挙げられる。
結合オリゴヌクレオチド産物の検出は、当技術分野で
知られた方法によって行う。例えば放射標識アッセイや
非放射性捕捉アッセイが適用される。例えば、放射性標
識を付した結合オリゴヌクレオチド産物は、結合オリゴ
ヌクレオチド産物をゲル上でサイジングした後にオート
ラジオグラフィーによって検出される。あるいは、結合
オリゴヌクレオチド産物は、非放射性の捕捉アッセイに
おいて、例えばビオチンなどのレセプターをプローブ１
に結合させ、例えばアルカリフォスファターゼなどの酵
素標識をプローブ２に結合させることによって検出され
る。レセプターとして例えばアビジンなどのリガンドで
コーティングされたマイクロタイタープレートを用い、
プローブに結合したビオチンを介してプローブ１を捕捉
することもできる。プローブ２に結合した酵素標識を５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル・フォスフェー
ト／ニトロブルー・テトラゾリウムなどの発色物質に暴
露し、基質における色の変化を溶液の光学濃度（O.D.）
を測光することもできる。
知られた方法によって行う。例えば放射標識アッセイや
非放射性捕捉アッセイが適用される。例えば、放射性標
識を付した結合オリゴヌクレオチド産物は、結合オリゴ
ヌクレオチド産物をゲル上でサイジングした後にオート
ラジオグラフィーによって検出される。あるいは、結合
オリゴヌクレオチド産物は、非放射性の捕捉アッセイに
おいて、例えばビオチンなどのレセプターをプローブ１
に結合させ、例えばアルカリフォスファターゼなどの酵
素標識をプローブ２に結合させることによって検出され
る。レセプターとして例えばアビジンなどのリガンドで
コーティングされたマイクロタイタープレートを用い、
プローブに結合したビオチンを介してプローブ１を捕捉
することもできる。プローブ２に結合した酵素標識を５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル・フォスフェー
ト／ニトロブルー・テトラゾリウムなどの発色物質に暴
露し、基質における色の変化を溶液の光学濃度（O.D.）
を測光することもできる。
標識は抗体やヌクレオチドプローブに本分野でよく知
られた方法によって接合させることができる。標識は、
プローブ上の官能基を介して直接的に結合させることが
できる。プローブは、そのような官能基を含有している
か若しくは含有するようにさせることができる。好適な
官能基の例としては、アミノ基、カルボキシル基、スル
フォヒドリル基、マレイミド基、イソシアネート基、イ
ソチオシアネート基が挙げられる。
られた方法によって接合させることができる。標識は、
プローブ上の官能基を介して直接的に結合させることが
できる。プローブは、そのような官能基を含有している
か若しくは含有するようにさせることができる。好適な
官能基の例としては、アミノ基、カルボキシル基、スル
フォヒドリル基、マレイミド基、イソシアネート基、イ
ソチオシアネート基が挙げられる。
あるいは、酵素は発色団分子等の標識をカップリング
剤を用いて抗体やヌクレオチドに接合することもでき
る。カップリング剤としてはジアルデヒド、カルボジイ
ミド、ジマレイミドなどが挙げられる。
剤を用いて抗体やヌクレオチドに接合することもでき
る。カップリング剤としてはジアルデヒド、カルボジイ
ミド、ジマレイミドなどが挙げられる。
標識はまた、上記の方法によってプローブに結合した
リガンド並びに、標識に結合したリガンドのためのレセ
プターによっても、プローブと結合することができる。
どのようなリガンド−レセプターの組合せも好ましく適
用できる。好適なリガンド−レセプター対の例として
は、ビオチン−アビジンやビオチン−ストレプトアビジ
ン、抗体−抗原を挙げることができる。ビオチン−アビ
ジンの組合せが好ましい。
リガンド並びに、標識に結合したリガンドのためのレセ
プターによっても、プローブと結合することができる。
どのようなリガンド−レセプターの組合せも好ましく適
用できる。好適なリガンド−レセプター対の例として
は、ビオチン−アビジンやビオチン−ストレプトアビジ
ン、抗体−抗原を挙げることができる。ビオチン−アビ
ジンの組合せが好ましい。
結合オリゴヌクレオチド産物の検出に標識を用いる場
合には、標識を一方或いは両方のプローブの長配列ある
いは短配列に結合させることができる。
合には、標識を一方或いは両方のプローブの長配列ある
いは短配列に結合させることができる。
標的核酸分子一分子に対して３以上のオリゴヌクレオ
チドプローブを本発明プロセスに使用して、同一の標的
核酸分子における異なる標的配列を検出することができ
る。同一の標的核酸分子における異なる配列からの結合
オリゴヌクレオチド産物は、異なる標識を用いるかある
いは明確に異なる長さのプローブを使用することによっ
て互いに区別することができる。
チドプローブを本発明プロセスに使用して、同一の標的
核酸分子における異なる標的配列を検出することができ
る。同一の標的核酸分子における異なる配列からの結合
オリゴヌクレオチド産物は、異なる標識を用いるかある
いは明確に異なる長さのプローブを使用することによっ
て互いに区別することができる。
本発明の他の態様においては、オリゴヌクレオチドプ
ローブの短配列は自己相補（パリンドローム）的であ
る。これによって、パリンドロームの相補配列は互いに
ハイブリダイズして、プローブの長配列と短配列が上記
のように適切にハイブリダイズしていない場合には、さ
らに化学官能基が他の化学官能基と反応するのを防ぐこ
とができる。この実施態様の例を、プローブ１について
二つ示す。（下図において鉛直方向の二重線は単に各プ
ローブの長配列と短配列の間の境界を示したものであ
る。） 本発明の更に他の実施態様においては、オリゴヌクレ
オチド1.1、1.1'、2.1、および2.1'が提供される。これ
らはプローブ１、1'、２、および2'の各プローブの短配
列にのみ相補的なものである。オリゴヌクレオチド1.
1、1.1'、2.1、および2.1'は、それらの配列に結合した
化学官能基を有しない。非化学的に修飾されたオリゴヌ
クレオチドである1.1、1.1'、2.1、および2.1'がそれぞ
れプローブ１、1'、２、および2'にハイブリダイズされ
ると、非化学的に修飾されたプローブはプローブ上の化
学官能基が互いに反応しないように保護する。
ローブの短配列は自己相補（パリンドローム）的であ
る。これによって、パリンドロームの相補配列は互いに
ハイブリダイズして、プローブの長配列と短配列が上記
のように適切にハイブリダイズしていない場合には、さ
らに化学官能基が他の化学官能基と反応するのを防ぐこ
とができる。この実施態様の例を、プローブ１について
二つ示す。（下図において鉛直方向の二重線は単に各プ
ローブの長配列と短配列の間の境界を示したものであ
る。） 本発明の更に他の実施態様においては、オリゴヌクレ
オチド1.1、1.1'、2.1、および2.1'が提供される。これ
らはプローブ１、1'、２、および2'の各プローブの短配
列にのみ相補的なものである。オリゴヌクレオチド1.
1、1.1'、2.1、および2.1'は、それらの配列に結合した
化学官能基を有しない。非化学的に修飾されたオリゴヌ
クレオチドである1.1、1.1'、2.1、および2.1'がそれぞ
れプローブ１、1'、２、および2'にハイブリダイズされ
ると、非化学的に修飾されたプローブはプローブ上の化
学官能基が互いに反応しないように保護する。
本発明の変性段階においては、プローブ１、1'、２、
および2'はそれぞれオリゴヌクレオチド1.1、1.1'、2.
1、および2.1'から変性され、プローブ１、1'、２、お
よび2'の短配列に結合した化学官能基はもはやオリゴヌ
クレオチドによって保護されない。プローブ１と２が標
的配列にハイブリダイズして、プローブ1'と2'が標的相
補配列にハイブリダイズすると、化学官能基は上記のよ
うに反応して結合オリゴヌクレオチド産物を生成する。
この態様の例を下に示す。（下図において鉛直方向の二
重線は単に各プローブの長配列と短配列の間の境界を示
したものである。） 図14に、修飾されていない短配列で保護されている化
学官能基を示す本実施態様の他の一般化した図を示す。
および2'はそれぞれオリゴヌクレオチド1.1、1.1'、2.
1、および2.1'から変性され、プローブ１、1'、２、お
よび2'の短配列に結合した化学官能基はもはやオリゴヌ
クレオチドによって保護されない。プローブ１と２が標
的配列にハイブリダイズして、プローブ1'と2'が標的相
補配列にハイブリダイズすると、化学官能基は上記のよ
うに反応して結合オリゴヌクレオチド産物を生成する。
この態様の例を下に示す。（下図において鉛直方向の二
重線は単に各プローブの長配列と短配列の間の境界を示
したものである。） 図14に、修飾されていない短配列で保護されている化
学官能基を示す本実施態様の他の一般化した図を示す。
実施例
実施例１
本実施例は、ヒトパピローマウイルス・タイプ16（HP
V−16）ゲノムに含有される48塩基対のDNA配列を増幅・
検出するための、本発明による増幅および検出方法を示
す。増幅される領域はヌクレオチド塩基番号の6634〜66
91に渡り、次の配列を有する： （Seedof,K.ら、“Virology"145、181−185（1985）お
よび配列認識番号１〜２参照） １、1'、２、および2'と表記される四つのオリゴヌク
レオチドプローブを用いて上記の標的配列を増幅する。
これらのプローブは次の配列を有する（それぞれ配列認
識暗号３〜６参照）。鉛直方向の二重線は単に各プロー
ブの長配列と短配列の間の境界を示したものである。鉛
直方向の一重線は、各プローブの短配列における一ヌク
レオチドの上の置換基に化学官能基を結合する化学結合
を示す。
V−16）ゲノムに含有される48塩基対のDNA配列を増幅・
検出するための、本発明による増幅および検出方法を示
す。増幅される領域はヌクレオチド塩基番号の6634〜66
91に渡り、次の配列を有する： （Seedof,K.ら、“Virology"145、181−185（1985）お
よび配列認識番号１〜２参照） １、1'、２、および2'と表記される四つのオリゴヌク
レオチドプローブを用いて上記の標的配列を増幅する。
これらのプローブは次の配列を有する（それぞれ配列認
識暗号３〜６参照）。鉛直方向の二重線は単に各プロー
ブの長配列と短配列の間の境界を示したものである。鉛
直方向の一重線は、各プローブの短配列における一ヌク
レオチドの上の置換基に化学官能基を結合する化学結合
を示す。
本例のオリゴヌクレオチドプローブは、次のようにし
て合成される。まず、グアニン残基を、希望する化学官
能基が後で共有結合的に結合するように修飾する。次い
で従来法によりオリゴヌクレオチドプローブを製作す
る。オリゴヌクレオチド合成の間、修飾グアニン残基
を、化学官能基が配置される短配列の位置に置く。一旦
オリゴヌクレオチドプローブが合成されれば、適切な化
学官能基をオリゴヌクレオチドの短配列中の修飾グアニ
ン残基に結合させる。
て合成される。まず、グアニン残基を、希望する化学官
能基が後で共有結合的に結合するように修飾する。次い
で従来法によりオリゴヌクレオチドプローブを製作す
る。オリゴヌクレオチド合成の間、修飾グアニン残基
を、化学官能基が配置される短配列の位置に置く。一旦
オリゴヌクレオチドプローブが合成されれば、適切な化
学官能基をオリゴヌクレオチドの短配列中の修飾グアニ
ン残基に結合させる。
本実施例では、プローブ１と1'それぞれの官能基X1お
よびX2は、2,4,5−トリクロロ−３−チオフェエン1,1−
ジオキサイドアセチルである。プローブ２と2'それぞれ
の官能基Y1およびY2は、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ
−ヒドロキシスルフォスクシニミル・エステルである。
これら両化学官能基は、各オリゴヌクレオチドプローブ
の短配列中の2'−アミノ−2'−デオキシグアニンにそれ
ぞれのＮ−ヒドロキシスクシニミド誘導体を介して結合
する。
よびX2は、2,4,5−トリクロロ−３−チオフェエン1,1−
ジオキサイドアセチルである。プローブ２と2'それぞれ
の官能基Y1およびY2は、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ
−ヒドロキシスルフォスクシニミル・エステルである。
これら両化学官能基は、各オリゴヌクレオチドプローブ
の短配列中の2'−アミノ−2'−デオキシグアニンにそれ
ぞれのＮ−ヒドロキシスクシニミド誘導体を介して結合
する。
修飾グアニン残基は、Benseler,F.ら、“Nucleosides
and Nucleotides"11、1333−1351（1992）に記載の
方法に従って2'−アミノ−2'デオキシグアニンから修飾
フォスフォラミダイトを調製することによって得ること
ができる。2'−アミノ−2'デオキシグアニンからの修飾
フォスフォラミダイトの合成の各段階は、同書、1348ペ
ージの図16に示されている。
and Nucleotides"11、1333−1351（1992）に記載の
方法に従って2'−アミノ−2'デオキシグアニンから修飾
フォスフォラミダイトを調製することによって得ること
ができる。2'−アミノ−2'デオキシグアニンからの修飾
フォスフォラミダイトの合成の各段階は、同書、1348ペ
ージの図16に示されている。
実施例１に記載のオリゴヌクレオチドは全て、以下の
手続で合成、精製される。
手続で合成、精製される。
I.自動化合成手続
２−シアノエチルフォスフォラミダイトをアプライト
・バイオシステムズ社から購入した。本手続は、ヌクレ
オシド・フォスフォラミダイトを、アプライド・バイオ
システムズ社のDNA合成器タイプ380−02を用いて、30mg
のヌクレオシド由来の制御された多孔ガラス（CPG）ビ
ース支持体（孔径500Å）に凝結させることを含む。ま
た反応サイクルは、トリクロロ酢酸のジクロロメタン溶
液（２％）による脱トリチル化、テトラゾールを活性化
プロトン供与体として用いる凝縮、無水酢酸とジメチル
アミノピリジンによるキャッピング、トリクロロ酢酸の
ジクロロメタン溶液（２％）による脱トリチル化、およ
び0.1MのI2/H2O/ルチジン／テトラヒドロフランによる
亜リン酸塩の酸化を含むものである。サイクル時間は約
30分である。各段階での収率は、基本的に定量的であっ
て、脱トリチル化の段階で遊離されたジメトキシトリチ
ルアルコールを集めて分光試験することによって決定す
ることができる。
・バイオシステムズ社から購入した。本手続は、ヌクレ
オシド・フォスフォラミダイトを、アプライド・バイオ
システムズ社のDNA合成器タイプ380−02を用いて、30mg
のヌクレオシド由来の制御された多孔ガラス（CPG）ビ
ース支持体（孔径500Å）に凝結させることを含む。ま
た反応サイクルは、トリクロロ酢酸のジクロロメタン溶
液（２％）による脱トリチル化、テトラゾールを活性化
プロトン供与体として用いる凝縮、無水酢酸とジメチル
アミノピリジンによるキャッピング、トリクロロ酢酸の
ジクロロメタン溶液（２％）による脱トリチル化、およ
び0.1MのI2/H2O/ルチジン／テトラヒドロフランによる
亜リン酸塩の酸化を含むものである。サイクル時間は約
30分である。各段階での収率は、基本的に定量的であっ
て、脱トリチル化の段階で遊離されたジメトキシトリチ
ルアルコールを集めて分光試験することによって決定す
ることができる。
II.オリゴデオキシリボヌクレオチドの脱保護および精
製手続 固体支持体をカラムから外し、1mの濃縮水酸化アン
モニウムに60℃で16時間密閉チューブ中で接触させる。
アンモニアを除去し、残差は、7Mの尿素を含有するTris
緩衝液（pH8）を使用して、分離用12％ポリアクリルア
ミドゲルに付す。20ボルト/cmで５時間電気泳動を実施
し、その後、精製物を含有するバンドを蛍光プレートで
の紫外線陰影法で同定する。バンドを切断し、1mの蒸
留水x2で一夜、室温下で溶出させる。この溶液を濾過
し、上清をｎ−ブタノールで抽出する（3x300μ）。
水相をセファデックスG50カラム（ファルマシア）（1x1
0cm）に付す。溶出液は、260nmで吸光度を監視しつつ、
適切な分画を集め、一定容積中でUV吸光度を測定する。
さらに、室温下、真空遠心に付して蒸発乾燥させる。
製手続 固体支持体をカラムから外し、1mの濃縮水酸化アン
モニウムに60℃で16時間密閉チューブ中で接触させる。
アンモニアを除去し、残差は、7Mの尿素を含有するTris
緩衝液（pH8）を使用して、分離用12％ポリアクリルア
ミドゲルに付す。20ボルト/cmで５時間電気泳動を実施
し、その後、精製物を含有するバンドを蛍光プレートで
の紫外線陰影法で同定する。バンドを切断し、1mの蒸
留水x2で一夜、室温下で溶出させる。この溶液を濾過
し、上清をｎ−ブタノールで抽出する（3x300μ）。
水相をセファデックスG50カラム（ファルマシア）（1x1
0cm）に付す。溶出液は、260nmで吸光度を監視しつつ、
適切な分画を集め、一定容積中でUV吸光度を測定する。
さらに、室温下、真空遠心に付して蒸発乾燥させる。
化学官能基X1とX2を形成するために用いられる化学物
質である2,4,5−トリクロロ−３−チオフェン1,1−ジオ
キシド酢酸は、Brownらによるヨーロッパ特許第340010
号の記述に従って調製される。
質である2,4,5−トリクロロ−３−チオフェン1,1−ジオ
キシド酢酸は、Brownらによるヨーロッパ特許第340010
号の記述に従って調製される。
化学官能基X1とX2を形成するために用いられる化学物
質である2,4,5−トリクロロ−３−チオフェン1,1−ジオ
キシド酢酸は、Brownらによるヨーロッパ特許第340010
号の記述に従って調製される。
質である2,4,5−トリクロロ−３−チオフェン1,1−ジオ
キシド酢酸は、Brownらによるヨーロッパ特許第340010
号の記述に従って調製される。
2,4,5−トリクロロ−３−チオフェン1,1−ジオキシド
酢酸を2'−アミノ−2'−デオキシグアニンの2'−NH2置
換基に共有結合的に結合させるためには、2,4,5−トリ
クロロ−３−チオフェン1,1−ジオキシド酢酸は、Ｎ−
ヒドロキシスクシニミドで修飾して2,4,5−トリクロロ
−３−チオフェン1,1−ジオキシド酢酸・Ｎ−ヒドロキ
シスクシニミドとすることが必要である。
酢酸を2'−アミノ−2'−デオキシグアニンの2'−NH2置
換基に共有結合的に結合させるためには、2,4,5−トリ
クロロ−３−チオフェン1,1−ジオキシド酢酸は、Ｎ−
ヒドロキシスクシニミドで修飾して2,4,5−トリクロロ
−３−チオフェン1,1−ジオキシド酢酸・Ｎ−ヒドロキ
シスクシニミドとすることが必要である。
2,4,5−トリクロロ−３−チオフェン1,1−ジオキシド
酢酸・Ｎ−ヒドロキシスクシニミドは次のようにして調
製される。2.45g（0.01モル）の2,4,5−トリクロロ−３
−チオフェン1,1−ジオキシド酢酸を100mのテトラヒ
ドロフラン（THF）に溶解する。この溶液に、1.3g（0.0
15モル）のＮ−ヒドロキシスクシニミド（アルドリッヒ
社）と2.26g（0.011モル）の1,3−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（シグマ社）を溶解する。溶液を一夜室温
で攪拌する。溶液を濾過し、溶媒を減圧下除去して白色
の固体生成物をTHFで洗浄し、蒸発乾燥させる。
酢酸・Ｎ−ヒドロキシスクシニミドは次のようにして調
製される。2.45g（0.01モル）の2,4,5−トリクロロ−３
−チオフェン1,1−ジオキシド酢酸を100mのテトラヒ
ドロフラン（THF）に溶解する。この溶液に、1.3g（0.0
15モル）のＮ−ヒドロキシスクシニミド（アルドリッヒ
社）と2.26g（0.011モル）の1,3−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（シグマ社）を溶解する。溶液を一夜室温
で攪拌する。溶液を濾過し、溶媒を減圧下除去して白色
の固体生成物をTHFで洗浄し、蒸発乾燥させる。
化学官能基Y1とY2を形成するために用いられる化学物
質であるｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシス
ルフォ−サクシニミドエステルは、市販されている（ピ
アス社）。
質であるｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシス
ルフォ−サクシニミドエステルは、市販されている（ピ
アス社）。
各オリゴヌクレオチドプローブの2'−アミノ−2'−デ
オキシグアニン残基を化学修飾して官能基X1、X2、Y1、
Y2に結合させるには以下の手続を用いる。
オキシグアニン残基を化学修飾して官能基X1、X2、Y1、
Y2に結合させるには以下の手続を用いる。
光学濃度が5.0（5.0O.D.）である2'−アミノ−2'−デ
オキシグアニン残基を含有する四つのオリゴヌクレオチ
ドプローブのアリコートを、別々に2mの使い捨て容器
に入れて凍結乾燥する。各プローブ調製物を、0.75m
の0.2Mホウ酸ナトリウムバッファー（pH9.3）中で再構
築する。
オキシグアニン残基を含有する四つのオリゴヌクレオチ
ドプローブのアリコートを、別々に2mの使い捨て容器
に入れて凍結乾燥する。各プローブ調製物を、0.75m
の0.2Mホウ酸ナトリウムバッファー（pH9.3）中で再構
築する。
化学官能基X1、X2を結合させるために、0.25mの2,
4,5−トリクロロ−３−チオフェン1,1−ジオキシド酢酸
・Ｎ−ヒドロキシスクシニイミド（上記合成法参照）を
N,N−ジメチルホルムアミド（DMF）中に20mg/mとなる
ように溶解したものを、修飾プローブ１と1'を含有する
各容器に添加する。
4,5−トリクロロ−３−チオフェン1,1−ジオキシド酢酸
・Ｎ−ヒドロキシスクシニイミド（上記合成法参照）を
N,N−ジメチルホルムアミド（DMF）中に20mg/mとなる
ように溶解したものを、修飾プローブ１と1'を含有する
各容器に添加する。
化学官能基Y1、Y2を結合させるために、0.25mのｍ
−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルフォ−サ
クシニミドエステル20mg/mを、修飾プローブ２と2'を
含有する各容器に添加する。
−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルフォ−サ
クシニミドエステル20mg/mを、修飾プローブ２と2'を
含有する各容器に添加する。
各容器中の反応混合物を、室温下（RT）、約12時間激
しく攪拌する。混合物は次いで遠心分離に付し、それぞ
れ別個のファルマシア社セファデックスNAP−10カラム
を通過させて溶液を脱塩するとともに過剰の化学官能基
試薬を除去する。得られる溶液のそれぞれをFPLCカラム
（ファルマシア）で精製する。FPLCシステムには、PorR
PC HR10/10カラム（100mm×10mm径、シリカベースの13
μｍのC2/C8マトリックスで300Åの孔径のものを充填）
が備えられている。溶液は、アセトニトリル/10mMトリ
エチル酢酸アンモニウム1:1（v/v）を、０〜35％の範囲
の10mMトリエチル酢酸アンモニウム1:1（v/v）に対し、
速度2m／分で45分間かけて線形勾配で精製する。
しく攪拌する。混合物は次いで遠心分離に付し、それぞ
れ別個のファルマシア社セファデックスNAP−10カラム
を通過させて溶液を脱塩するとともに過剰の化学官能基
試薬を除去する。得られる溶液のそれぞれをFPLCカラム
（ファルマシア）で精製する。FPLCシステムには、PorR
PC HR10/10カラム（100mm×10mm径、シリカベースの13
μｍのC2/C8マトリックスで300Åの孔径のものを充填）
が備えられている。溶液は、アセトニトリル/10mMトリ
エチル酢酸アンモニウム1:1（v/v）を、０〜35％の範囲
の10mMトリエチル酢酸アンモニウム1:1（v/v）に対し、
速度2m／分で45分間かけて線形勾配で精製する。
分画を集め、各精製オリゴヌクレオチドプローブ毎に
プールする。各プローブ、１、1'2、および2'は凍結乾
燥して使用時まで４℃で保存する。
プールする。各プローブ、１、1'2、および2'は凍結乾
燥して使用時まで４℃で保存する。
プローブ、１、1'2、および2'の各短配列の修飾グア
ニン残基と隣接するシトシン残基を図７に示す。
ニン残基と隣接するシトシン残基を図７に示す。
上記のHPV−16配列（配列認識番号１〜２）の増幅
は、以下のようにして行う。
は、以下のようにして行う。
HPV−16配列はプラスミドに含有される。プラスミド
はHPV−16配列をSeedorfらが“Virology"145、181−185
（1985）に記載した方法によってブルースクリプトベク
ター（ストラタジーン）にクローニングすることによっ
て調製する。HPV−16のプラスミドへのクローニングが
完了すれば、プラスミドを２倍量の蒸留水中に濃度20ng
/mで溶解する。
はHPV−16配列をSeedorfらが“Virology"145、181−185
（1985）に記載した方法によってブルースクリプトベク
ター（ストラタジーン）にクローニングすることによっ
て調製する。HPV−16のプラスミドへのクローニングが
完了すれば、プラスミドを２倍量の蒸留水中に濃度20ng
/mで溶解する。
各オリゴヌクレオチドプローブの1011個の分子を最終
体積が20μとなるようにハイブリダイゼーションバッ
ファー中で再構築する。このハイブリダイゼーションバ
ッファーは、30％脱イオン化ホルムアミド水溶液（vol/
vol）、0.54MのNaCl、0.03Mのリン酸ナトリウム（pH7.
4）、0.003MのEDTA、５％のデキストラン硫酸500K m.w.
（シグマ社）および0.1％のTritonX−100を含有する。
体積が20μとなるようにハイブリダイゼーションバッ
ファー中で再構築する。このハイブリダイゼーションバ
ッファーは、30％脱イオン化ホルムアミド水溶液（vol/
vol）、0.54MのNaCl、0.03Mのリン酸ナトリウム（pH7.
4）、0.003MのEDTA、５％のデキストラン硫酸500K m.w.
（シグマ社）および0.1％のTritonX−100を含有する。
脱イオンホルムアミドは、1gのBio−Rad AG 501−X
8（Ｄ）20−50メッシュの混合ベッド樹脂を50mのホル
ムアミド（シグマ・ケミカル社）に添加して、室温で30
分間混合することによって調製する。ホルムアミドはワ
ットマンNo.1濾紙を２回通して濾過する。
8（Ｄ）20−50メッシュの混合ベッド樹脂を50mのホル
ムアミド（シグマ・ケミカル社）に添加して、室温で30
分間混合することによって調製する。ホルムアミドはワ
ットマンNo.1濾紙を２回通して濾過する。
増幅反応には、エッペンドルフ・チューブの１と２
（パーキン・エルマー社）を使用する。チューブ１はコ
ントロールのために使用し、チューブ２は試験反応のた
めに使用する。チューブ１には標的配列は含有されな
い。チューブ２はHPV−16標的配列試料を含有する。
（パーキン・エルマー社）を使用する。チューブ１はコ
ントロールのために使用し、チューブ２は試験反応のた
めに使用する。チューブ１には標的配列は含有されな
い。チューブ２はHPV−16標的配列試料を含有する。
四つのオリゴヌクレオチドプローブ、１、1'、２、2'
を含有する100μのハイブリダイゼーションバッファ
ーを各チューブに添加する。上記したHPV−16を有する
プラスミドを含有する１μの溶液をチューブ２に加え
る。３倍量の蒸留水をコントロールとしてチューブ１に
入れる。各チューブの溶液を手短に静かに回転させて混
合する。鉱物油100μをゆっくり各チューブに加え、
反応混合物の上に油層を形成させて、増幅反応における
反復加熱サイクル中に溶液が蒸発するのを防止する。
を含有する100μのハイブリダイゼーションバッファ
ーを各チューブに添加する。上記したHPV−16を有する
プラスミドを含有する１μの溶液をチューブ２に加え
る。３倍量の蒸留水をコントロールとしてチューブ１に
入れる。各チューブの溶液を手短に静かに回転させて混
合する。鉱物油100μをゆっくり各チューブに加え、
反応混合物の上に油層を形成させて、増幅反応における
反復加熱サイクル中に溶液が蒸発するのを防止する。
両チューブをDNAサーマルサイクラー（パーキン・エ
ルマー社、Cetus）に載置し、40回の加熱・冷却サイク
ルに付す。各サイクルは90℃で65秒のインキュベーショ
ンと40℃で240秒のインキュベーションからなる。
ルマー社、Cetus）に載置し、40回の加熱・冷却サイク
ルに付す。各サイクルは90℃で65秒のインキュベーショ
ンと40℃で240秒のインキュベーションからなる。
熱サイクルの後、20μの各溶液を、２μのブロム
フェノールブルーと1MのTBE（Trisホウ酸EDTA）に溶解
した40％グリセロールの混合溶液に添加する。各チュー
ブを回転混合によって穏やかに混合する。
フェノールブルーと1MのTBE（Trisホウ酸EDTA）に溶解
した40％グリセロールの混合溶液に添加する。各チュー
ブを回転混合によって穏やかに混合する。
増幅されたHPV−16標的配列は、ゲル上で結合オリゴ
ヌクレオチド産物の臭化エチジウム染色によって検出す
る。20μの各溶液を、Trisホウ酸バッファー（pH8.
0）を用いて12％のポリアクリルアミドゲル上に載荷す
る。
ヌクレオチド産物の臭化エチジウム染色によって検出す
る。20μの各溶液を、Trisホウ酸バッファー（pH8.
0）を用いて12％のポリアクリルアミドゲル上に載荷す
る。
20v/cmで３時間電気泳動を行い、続いてゲルを室温下
45分間、臭化エチジウムの0.5μg/mH2O溶液100mに
浸漬する。
45分間、臭化エチジウムの0.5μg/mH2O溶液100mに
浸漬する。
ゲルをタイプ57または667（ASA3000）のポロライド写
真フィルム上に有効紫外光（UV）光源（72500μW/cm2）
で露光する。この写真フィルムの露光条件はf8で0.5秒
間であり、10ngの微量レベルで結合オリゴヌクレオチド
産物のバンドを検出する。
真フィルム上に有効紫外光（UV）光源（72500μW/cm2）
で露光する。この写真フィルムの露光条件はf8で0.5秒
間であり、10ngの微量レベルで結合オリゴヌクレオチド
産物のバンドを検出する。
用語集
A1は、化学官能基Ｚを有するアデニンであって、化学
官能基ＺがＣ−６位に位置するアミノ基の水素と置換し
たものを表す。
官能基ＺがＣ−６位に位置するアミノ基の水素と置換し
たものを表す。
A2は、化学官能基Ｚを有するアデニンであって、化学
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基に結合したものを表す。
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基に結合したものを表す。
A3は、化学官能基Ｚを有するアデニンであって、化学
官能基ＺがＣ−８位に位置する水素と置換したものを表
す。
官能基ＺがＣ−８位に位置する水素と置換したものを表
す。
A4は、化学官能基Ｚを有するアデニンであって、化学
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基と置換したものを表す。
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基と置換したものを表す。
Ｂはヌクレオチド塩基を表す。
C1は、化学官能基Ｚを有するシチジンであって、化学
官能基ＺがＣ−６位に位置するアミノ基の水素と置換し
たものを表す。
官能基ＺがＣ−６位に位置するアミノ基の水素と置換し
たものを表す。
C2は、化学官能基Ｚを有するシチジンであって、化学
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基に結合したものを表す。
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基に結合したものを表す。
C3は、化学官能基Ｚを有するシチジンであって、化学
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基と置換したものを表す。
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基と置換したものを表す。
Ｄは修飾ヌクレオチドA4、C3、G3、T3、またはU1を表
す。
す。
Ｅは修飾ヌクレオチドA1またはC1を表す。
Ｆは修飾ヌクレオチドA3またはG1を表す。
Ｄは修飾ヌクレオチドA4、C3、G3、T3、またはU1を表
す。
す。
G1は、化学官能基Ｚを有するグアニンであって、化学
官能基ＺがＣ−８位に位置する水素と置換したものを表
す。
官能基ＺがＣ−８位に位置する水素と置換したものを表
す。
G2は、化学官能基Ｚを有するグアニンであって、化学
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基に結合したものを表す。
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基に結合したものを表す。
G3は、化学官能基Ｚを有するグアニンであって、化学
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基と置換したものを表す。
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基と置換したものを表す。
ＨおよびH'は、プローブ１と1'それぞれの長配列を表
す。
す。
ＩおよびI'は、プローブ１と1'それぞれの短配列を表
す。
す。
ＪおよびJ'は、プローブ２と2'それぞれの長配列を表
す。
す。
ＫおよびK'は、プローブ２と2'それぞれの短配列を表
す。
す。
Ｌは修飾ヌクレオチドA2、C2、G2、T2、およびU2を表
す。
す。
ＲとR'は、図２〜６に示す修飾ヌクレオチドのいずれ
かを表す。
かを表す。
T1は、化学官能基Ｚを有するチミジンであって、化学
官能基ＺがＣ−５位に位置するメチル基の水素と置換し
たものを表す。
官能基ＺがＣ−５位に位置するメチル基の水素と置換し
たものを表す。
T2は、化学官能基Ｚを有するチミジンであって、化学
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基に結合したものを表す。
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基に結合したものを表す。
T3は、化学官能基Ｚを有するチミジンであって、化学
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基と置換したものを表す。
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基と置換したものを表す。
U1は、化学官能基Ｚを有するウリジンであって、化学
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基と置換したものを表す。
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基と置換したものを表す。
U2は、化学官能基Ｚを有するウリジンであって、化学
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基に結合したものを表す。
官能基Ｚがリボース環のＣ−2'位に位置するヒドロキシ
ル基に結合したものを表す。
Ｘは、化学官能基X1またはX2を表す。
X1はプローブ１の短配列に結合した化学官能基を表
す。
す。
X2はプローブ1'の短配列に結合した化学官能基を表
す。
す。
Ｙは、化学官能基Y1またはY2を表す。
Y1はプローブ２の短配列に結合した化学官能基を表
す。
す。
Y2はプローブ2'の短配列に結合した化学官能基を表
す。
す。
Ｚは、化学官能基X1、X2、Y1、あるいはY2を表す。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：セゲブ、デイビッド
（ii）発明の名称：核酸配列を増幅し、検出する化学
的方法 （iii）配列の数:6 （iv）連絡住所： （Ａ）名宛人：インクローン・システムズ・インコ
ーポレイテッド （Ｂ）ストリート:180 ヴァリック・ストリート （Ｃ）市：ニューヨーク （Ｄ）州：ニューヨーク （Ｅ）国:U.S.A. （Ｆ）ジップコード:10014 （ｖ）コンピュータ可読型式： （Ａ）媒体のタイプ：フロッピー・ディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PC互換 配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人：セゲブ、デイビッド （ii）発明の名称：核酸配列を増幅し、検出する化学
的方法 （iii）配列の数:6 （iv）連絡住所： （Ａ）名宛人：インクローン・システムズ・インコ
ーポレイテッド （Ｂ）ストリート:180 ヴァリック・ストリート （Ｃ）市：ニューヨーク （Ｄ）州：ニューヨーク （Ｅ）国:U.S.A. （Ｆ）ジップコード:10014 （ｖ）コンピュータ可読型式： （Ａ）媒体のタイプ：フロッピー・ディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PC互換 （Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−D
OS （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃1.
0、バージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号：米国 （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）代理人情報： （Ａ）氏名：フェイト、アーヴィン エヌ． （Ｂ）登録番号:28,601 （Ｃ）参照／整理番号:SEG−３ （ix）通信情報： （Ａ）電話:212−645−1405 （Ｂ）テレファックス:212−645−2054 （２）配列認識番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:48塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （iii）仮説：なし （iv）アンチセンス：なし （vi）由来源： （Ａ）生物：ヒト・パピローマウイルス （Ｂ）株：タイプ16 （xi）配列の記載：配列認識番号1: （２）配列認識番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:48塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （iii）仮説：なし （iv）アンチセンス：なし （vi）由来源： （Ａ）生物：ヒト・パピロマヴィルス （Ｂ）株：タイプ16 （xi）配列の記載：配列認識番号2: （２）配列認識番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:31塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子のタイプ:cDNA （iii）仮説：なし （iv）アンチセンス：なし （xi）配列の記載：配列認識番号3: （２）配列認識番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:31塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子のタイプ:cDNA （iii）仮説：なし （iv）アンチセンス：なし （xi）配列の記載：配列認識番号4: （２）配列認識番号５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:31塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子のタイプ:cDNA （iii）仮説：なし （iv）アンチセンス：なし （xi）配列の記載：配列認識番号5: （２）配列認識番号６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:31塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子のタイプ:cDNA （iii）仮説：なし （iv）アンチセンス：なし （xi）配列の記載：配列認識番号6:
的方法 （iii）配列の数:6 （iv）連絡住所： （Ａ）名宛人：インクローン・システムズ・インコ
ーポレイテッド （Ｂ）ストリート:180 ヴァリック・ストリート （Ｃ）市：ニューヨーク （Ｄ）州：ニューヨーク （Ｅ）国:U.S.A. （Ｆ）ジップコード:10014 （ｖ）コンピュータ可読型式： （Ａ）媒体のタイプ：フロッピー・ディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PC互換 配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人：セゲブ、デイビッド （ii）発明の名称：核酸配列を増幅し、検出する化学
的方法 （iii）配列の数:6 （iv）連絡住所： （Ａ）名宛人：インクローン・システムズ・インコ
ーポレイテッド （Ｂ）ストリート:180 ヴァリック・ストリート （Ｃ）市：ニューヨーク （Ｄ）州：ニューヨーク （Ｅ）国:U.S.A. （Ｆ）ジップコード:10014 （ｖ）コンピュータ可読型式： （Ａ）媒体のタイプ：フロッピー・ディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PC互換 （Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−D
OS （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース＃1.
0、バージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号：米国 （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）代理人情報： （Ａ）氏名：フェイト、アーヴィン エヌ． （Ｂ）登録番号:28,601 （Ｃ）参照／整理番号:SEG−３ （ix）通信情報： （Ａ）電話:212−645−1405 （Ｂ）テレファックス:212−645−2054 （２）配列認識番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:48塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （iii）仮説：なし （iv）アンチセンス：なし （vi）由来源： （Ａ）生物：ヒト・パピローマウイルス （Ｂ）株：タイプ16 （xi）配列の記載：配列認識番号1: （２）配列認識番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:48塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （iii）仮説：なし （iv）アンチセンス：なし （vi）由来源： （Ａ）生物：ヒト・パピロマヴィルス （Ｂ）株：タイプ16 （xi）配列の記載：配列認識番号2: （２）配列認識番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:31塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子のタイプ:cDNA （iii）仮説：なし （iv）アンチセンス：なし （xi）配列の記載：配列認識番号3: （２）配列認識番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:31塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子のタイプ:cDNA （iii）仮説：なし （iv）アンチセンス：なし （xi）配列の記載：配列認識番号4: （２）配列認識番号５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:31塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子のタイプ:cDNA （iii）仮説：なし （iv）アンチセンス：なし （xi）配列の記載：配列認識番号5: （２）配列認識番号６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:31塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子のタイプ:cDNA （iii）仮説：なし （iv）アンチセンス：なし （xi）配列の記載：配列認識番号6:
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平２−5898（ＪＰ，Ａ)
特開 平２−135100（ＪＰ，Ａ)
特表 平６−510669（ＪＰ，Ａ)
特表 平３−505971（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12Q 1/68 - 1/70
C07H 21/00 - 21/04
ＰｕｂＭｅｄ
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (26)
- 【請求項１】標的配列を含有する一本鎖標的核酸分子又
は標的配列及び標的相補配列を含有する二本鎖核酸標的
分子を試料中で増幅し、検出するための方法であって、 （ａ）第一オリゴヌクレオチド相補対及び第二オリゴヌ
クレオチド相補対を提供する工程［ここで、 （ｉ）第一オリゴヌクレオチド相補対はプローブ１及び
プローブ１′からなり、第二オリゴヌクレオチド相補対
はプローブ２及びプローブ２′からなり、 （ii）プローブ１は長配列Ｈ及び短配列Ｉを含有し、プ
ローブ１′は長配列Ｈ′及び短配列Ｉ′を含有し、 （iii）プローブ２は長配列Ｊ及び短配列Ｋを含有し、
プローブ２′は長配列Ｊ′及び短配列Ｋ′を含有し、 （iv）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ１′の長配列
Ｈ′は互いに相補的であり、 （ｖ）プローブ２の長配列Ｊ及びプローブ２′の長配列
Ｊ′は互いに相補的であり、 （vi）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ２の長配列Ｊ
は標的配列の隣接部分に対して相補的であり、 （vii）プローブ１′の長配列Ｈ′及びプローブ２′の
長配列Ｊ′は標的相補配列の隣接部分に対して相補的で
あり、 （viii）長配列Ｈ及び長配列Ｊが標的配列とハイブリダ
イズした時、短配列Ｉ及び短配列Ｋは標的配列とハイブ
リダイズせず、 （ix）長配列Ｈ′及び長配列Ｊ′が標的相補配列とハイ
ブリダイズした時、短配列Ｉ′及び短配列Ｋ′は標的相
補配列とハイブリダイズせず、 （ｘ）プローブ１の短配列Ｉはプローブ２の短配列Ｋに
対して相補的であり、プローブ１′の短配列Ｉ′はプロ
ーブ２′の短配列Ｋ′に対して相補的であり、 （xi）プローブ１の配列Ｉの１個又は２個以上のヌクレ
オチドの糖又は塩基部分が化学官能基X1によって変性さ
れており、プローブ２の配列Ｋの１個又は２個以上のヌ
クレオチドの糖又は塩基部分が化学官能基Y1によって変
性されており、化学官能基X1は化学官能基Y1と反応性で
あり、 （xii）プローブ１′の配列Ｉ′の一以上のヌクレオチ
ドの糖又は塩基部分は化学官能基X2によって変性されて
おり、プローブ２′の配列Ｋ′の１個又は２個以上のヌ
クレオチドの糖又は塩基部分が化学官能基Y2によって変
性されており、化学官能基X2は化学官能基Y2と反応性で
あり、 （xiii）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ２の長配列
Ｊが標的配列の隣接部分とハイブリダイズした時、短配
列Ｉは短配列Ｋとハイブリダイズし、 （xiv）短配列Ｉが短配列Ｋとハイブリダイズした時、
化学官能基X1は化学官能基Y1と反応して化学結合を形成
し、 （xv）プローブ１′の長配列Ｈ′及びプローブ２′の長
配列Ｊ′が標的相補配列の隣接部分とハイブリダイズし
た時、短配列Ｉ′は短配列Ｋ′とハイブリダイズし、 （xvi）短配列Ｉ′が短配列Ｋ′とハイブリダイズした
時、化学官能基X2は化学官能基Y2と反応して化学結合を
形成する］と、 （ｂ）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ２の長配列Ｊ
を標的配列の隣接部分とハイブリダイズさせ、プローブ
１′の長配列Ｈ′及びプローブ２′の長配列Ｊ′を標的
相補配列の隣接部分とハイブリダイズさせる工程と、 （ｃ）工程（ｂ）の後で標的配列の隣接部分とハイブリ
ダイズされたプローブ１及びプローブ２を、化学官能基
X1とY1との間の化学結合を形成させることによって互い
に結合させて、標的相補配列を有する第一結合オリゴヌ
クレオチド産物を形成させる工程と、 （ｄ）工程（ｂ）の後で標的相補配列の隣接部分とハイ
ブリダイズされたプローブ１′及びプローブ２′を、化
学官能基X2とY2との間の化学結合を形成させることによ
って互いに結合させて、標的配列を有する第二結合オリ
ゴヌクレオチド産物を形成させる工程と、 （ｅ）変性条件下で試料を処理する工程と、 （ｆ）工程（ｂ）から工程（ｅ）までを所望の回数繰り
返す工程と、さらに （ｇ）結合オリゴヌクレオチド産物を検出する工程と、 からなる方法。 - 【請求項２】標的配列を含有する一本鎖標的核酸分子又
は標的配列及び標的相補配列を含有する二本鎖核酸標的
分子を試料中で線形増幅し、検出するための方法であっ
て、 （ａ）オリゴヌクレオチド対を提供する工程［ここで、 （ｉ）オリゴヌクレオチド対はプローブ１及びプローブ
２、又はプローブ１′及びプローブ２′からなり、 （ii）プローブ１は長配列Ｈ及び短配列Ｉを含有し、プ
ローブ２は長配列Ｊ及び短配列Ｋを含有し、 （iii）プローブ１′は長配列Ｈ′及び短配列Ｉ′を含
有し、プローブ２′は長配列Ｊ′及び短配列Ｋ′を含有
し、 （iv）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ２の長配列Ｊ
は標的配列の隣接部分に対して相補的であり、 （ｖ）プローブ１′の長配列Ｈ′及びプローブ２′の長
配列Ｊ′は標的相補配列の隣接部分に対して相補的であ
り、 （vi）長配列Ｈ及び長配列Ｊが標的配列とハイブリダイ
ズした時、短配列Ｉ及び短配列Ｋは標的配列とハイブリ
ダイズせず、 （vii）長配列Ｈ′及び長配列Ｊ′が標的相補配列とハ
イブリダイズした時、短配列Ｉ′及び短配列Ｋ′は標的
相補配列とハイブリダイズせず、 （xiii）プローブ１の短配列Ｉはプローブ２の短配列Ｋ
に対して相補的であり、プローブ１′の短配列Ｉ′はプ
ローブ２′の短配列Ｋ′に対して相補的であり、 （ix）プローブ１の配列Ｉの１個又は２個以上のヌクレ
オチドの糖又は塩基部分が化学官能基X1によって変性さ
れており、プローブ２の配列Ｋの１個又は２個以上のヌ
クレオチドの糖又は塩基部分が化学官能基Y1によって変
性されており、化学官能基X1は化学官能基Y1と反応性で
あり、 （ｘ）プローブ１′の配列Ｉ′の一以上のヌクレオチド
の糖又は塩基部分は化学官能基X2によって変性されてお
り、プローブ２′の配列Ｋ′の１個又は２個以上のヌク
レオチドの糖又は塩基部分が化学官能基Y2によって変性
されており、化学官能基X2は化学官能基Y2と反応性であ
り、 （xi）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ２の長配列Ｊ
が標的配列の隣接部分とハイブリダイズした時、短配列
Ｉは短配列Ｋとハイブリダイズし、 （xii）短配列Ｉが短配列Ｋとハイブリダイズした時、
化学官能基X1は化学官能基Y1と反応して化学結合を形成
し、 （xiii）プローブ１′の長配列Ｈ′及びプローブ２′の
長配列Ｊ′が標的相補配列の隣接部分とハイブリダイズ
した時、短配列Ｉ′は短配列Ｋ′とハイブリダイズし、 （xiv）短配列Ｉ′が短配列Ｋ′とハイブリダイズした
時、化学官能基X2は化学官能基Y2と反応して化学結合を
形成する］と、 （ｂ）プローブ１の長配列Ｈ及びプローブ２の長配列Ｊ
を標的配列の隣接部分とハイブリダイズさせ、プローブ
１′の長配列Ｈ′及びプローブ２′の長配列Ｊ′を標的
相補配列の隣接部分とハイブリダイズさせる工程と、 （ｃ）工程（ｂ）の後で標的配列の隣接部分とハイブリ
ダイズされたプローブ１及びプローブ２を、化学官能基
X1とY1との間の化学結合を形成させることによって互い
に結合させて、標的相補配列を有する結合オリゴヌクレ
オチド産物を形成させるか、若しくは （ｄ）工程（ｂ）の後で標的相補配列の隣接部分とハイ
ブリダイズされたプローブ１′及びプローブ２′を、化
学官能基X2とY2との間の化学結合を形成させることによ
って互いに結合させて、標的配列を有する結合オリゴヌ
クレオチド産物を形成させる工程と、 （ｅ）変性条件下で試料を処理する工程と、 （ｆ）工程（ｂ）から工程（ｅ）までを所望の回数繰り
返す工程と、さらに （ｇ）結合オリゴヌクレオチド産物を検出する工程と、 からなる方法。 - 【請求項３】化学官能基X1が求電子基であり、化学官能
基Y1が求核基である、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】化学官能基X1が求核基であり、化学官能基
Y1が求電子基である、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項５】化学官能基X2が求電子基であり、化学官能
基Y2が求核基である、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項６】化学官能基X2が求核基であり、化学官能基
Y2が求電子基である、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項７】化学官能基X1、X2、Y1又はY2が、短配列
Ｉ、I'、Ｋ又はK'の中のヌクレオチドのリボース環のＣ
−2'位置に位置するヒドロキシル基をそれぞれ置換す
る、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項８】化学官能基X1、X2、Y1又はY2が、短配列
Ｉ、I'、Ｋ又はK'の中のヌクレオチドのリボース環のＣ
−2'位置に位置するヒドロキシル基の水素をそれぞれ置
換する、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項９】化学官能基X1、X2、Y1又はY2が、短配列
Ｉ、I'、Ｋ又はK'の中のアデニン又はシチジン残基のＣ
−６位置に位置するアミノ基の水素をそれぞれ置換す
る、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項１０】化学官能基X1、X2、Y1又はY2が、短配列
Ｉ、I'、Ｋ又はK'の中のアデニン又はグアニン残基のＣ
−８位置に位置する水素をそれぞれ置換する、請求項１
又は２に記載の方法。 - 【請求項１１】化学官能基X1、X2、Y1又はY2が、短配列
Ｉ、I'、Ｋ又はK'の中のチミジン残基のＣ−５位置に位
置するメチル基からの水素をそれぞれ置換する、請求項
１又は２に記載の方法。 - 【請求項１２】短配列Ｉ、I'、Ｋ又はK'の核酸配列は自
己相補性性である、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項１３】各プローブ１、２、1'又は2'の短配列
Ｉ、I'、Ｋ又はK'中の化学官能基X1、X2、Y1又はY2は、
オリゴヌクレオチド1.1、2.1、1.1'又は2.1'によってそ
れぞれ保護されている、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項１４】プローブ１、２、1'又は2'の短配列の長
さに対する長配列の長さの割合は2:1〜50:1である、請
求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項１５】短配列の長さに対する長配列の長さの割
合は2:1である、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項１６】短配列の長さに対する長配列の長さの割
合は3:1である、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項１７】短配列の長さに対する長配列の長さの割
合は5:1である、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項１８】短配列の長さに対する長配列の長さの割
合は10:1である、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項１９】短配列の長さに対する長配列の長さの割
合は20:1である、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項２０】化学官能基X1とY1、又はX2とY2の間の反
応は求電子基離脱基を求核基で置換することである、請
求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項２１】化学官能基X1とY1、又はX2とY2の間の反
応はマイケル付加反応である、請求項１又は２に記載の
方法。 - 【請求項２２】化学官能基X1とY1、又はX2とY2の間の反
応はディールス・アルダー反応である、請求項１又は２
に記載の方法。 - 【請求項２３】化学官能基X1とY1、又はX2とY2の間の反
応はマレイミド部分の二重結合へのチオール基の付加で
ある、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項２４】化学官能基X1とY1、又はX2とY2の間の反
応は光化学反応である、請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項２５】化学官能基X1とY1、又はX2とY2の間の反
応は［２＋２］光−シクロダイマー化反応である、請求
項１又は２に記載の方法。 - 【請求項２６】オリゴヌクレオチド対が、核酸標的配列
または標的相補配列の一配列当たり105〜1015対の範囲
で過剰モル存在する、請求項１又は２に記載の方法。
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| PCT/US1994/006690 WO1994029485A1 (en) | 1993-06-15 | 1994-06-15 | Chemical process for amplifying and detecting nucleic acid sequences |
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|---|---|---|---|
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| US5616464A (en) * | 1994-12-27 | 1997-04-01 | Naxcor | Nucleic acid sequence detection employing amplification probes |
| US6277570B1 (en) | 1993-04-13 | 2001-08-21 | Naxcor | Nucleic acid sequence detection employing probes comprising non-nucleosidic coumarin derivatives as polynucleotide-crosslinking agents |
| US5843650A (en) * | 1995-05-01 | 1998-12-01 | Segev; David | Nucleic acid detection and amplification by chemical linkage of oligonucleotides |
| CA2223050A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Abbott Laboratories | Probe masking method of reducing background in an amplification reaction |
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