ES2218526T3 - Proceso quimico para ampliar y detectar secuencias de acido nucleico. - Google Patents

Proceso quimico para ampliar y detectar secuencias de acido nucleico.

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ES2218526T3 ES94921292T ES94921292T ES2218526T3 ES 2218526 T3 ES2218526 T3 ES 2218526T3 ES 94921292 T ES94921292 T ES 94921292T ES 94921292 T ES94921292 T ES 94921292T ES 2218526 T3 ES2218526 T3 ES 2218526T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION ESTA DIRIGIDA A UN METODO DE AMPLIACION Y DETECCION DE MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO DIANA DE DOBLE FILAMENTO. LA AMPLIACION DE LA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO DIANA ES REALIZADA MEDIANTE LA UTILIZACION DE AL MENOS DOS MUESTRAS DE OLIGONUCLEOTIDO QUIMICAMENTE MODIFICADAS POR MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO DIANA PARA FORMAR UN PRODUCTO OLIGONUCLEOTIDO UNIDO. CADA MUESTRA DE OLIGONUCLEOTIDO ESTA COMPUESTA DE UNA SECUENCIA LARGA Y UNA CORTA. LA SECUENCIA LARGA DE CADA MUESTRA HIBRIDIZA REGIONES ADYACENTES DE LA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO DIANA. LAS SECUENCIAS CORTAS DE CADA MUESTRAS SE HIBRIDIZAN ENTRE SI. GRUPOS DE FUNCIONALIDAD QUIMICA INCORPORADOS A LAS SECUENCIAS CORTAS DE CADA MUESTRA DE OLIGONUCLEOTIDO COMBINAN DE FORMA COVALENTE LA UNION DE LAS MUESTRAS PARA FORMAR UN PRODUCTO DE OLIGONUCLEOTIDO UNIDO. EL PRODUCTO DE OLIGONUCLEOTIDO UNIDO SE FORMA SIN LA UTILIZACION DE ENZIMAS. LA REACTIVIDAD DE LOS GRUPOS DE FUNCIONALIDAD QUIMICA EN CADA MUESTRA DEPENDE DE LA DIANA. SOLOCUANDO LAS SECUENCIAS CORTAS DE LAS MUESTRAS ADYACENTES SE HIBRIDIZAN ENTRE SI LOS GRUPOS DE FUNCIONALIDAD QUIMICA SON PUESTOS EN LO SUFICIENTEMENTE PROXIMOS PARA FORMAR UN ENLACE COVALENTE Y UNIR LAS MUESTRAS PARA FORMAR UN PRODUCTO DE OLIGONUCLEOTIDO UNIDO.

Description

Proceso químico para amplificar y detectar secuencias de ácido nucleico.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para amplificar y detectar secuencias de ácido nucleico existentes en una muestra de ensayo.
Antecedentes de la invención
El método estándar para amplificar y detectar secuencias diana de ácido nucleico es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Véase Saiki et al., en Science 239 487 (1988) y Mullis et al. en la Patente de Estados Unidos 4.683.195). Un problema con la PCR es la polimerización no específica que lleva a señales engañosas.
En el documento WO 93/06240 se detecta la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana poniendo en contacto la muestra con una primera y una segunda sonda, pudiendo hibridarse porciones de tales sondas con la secuencia diana de manera que las sondas están adyacentes o prácticamente adyacentes entre sí, de manera que permiten a otras porciones complementarias de la primera y de la segunda sondas hibridarse entre sí y para tratar la muestra de manera que se provoca la extensión de la cadena de una de las sondas usando parte de una sonda como molde.
En el documento EP 0324616 una secuencia de ácido nucleico diana se detecta poniendo en contacto la muestra con una primera y una segunda sondas cuyos grupos funcionales foto-reactivos pueden unir la primera sonda y la segunda sonda conjuntamente después de la fotoactivación cuando la primera y la segunda sonda se llevan a una posición reactiva uniéndolas a la secuencia de ácido nucleico diana.
Backman et al., en el documento EP 320 308, describen un método alternativo, conocido como la reacción en cadena de la ligasa LCR, para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana. En la LCR se utilizan cuatro sondas de ácido nucleico en exceso. La primera y tercera sondas forman un par oligonucleotídico complementario. La segunda y cuarta sondas forman otro par oligonucleotídico complementario. La primera y segunda sondas se hibridan con secuencias que son contiguas en la primera cadena de la molécula diana. Cuando se hibridan, la primera y segunda sondas se ensamblan entre sí en una relación fosfato 5'-hidroxilo 3', de manera que una ligasa puede unir las dos sondas en un primer producto condensado. También, la tercera y cuarta sondas se hibridan con las secuencias que están contiguas en la segunda cadena de la molécula diana. Cuando se hibridan, la tercera y cuarta sondas se ensamblan entre sí en una relación fosfato 5'-hidroxilo 3', de manera que una ligasa puede unir las dos sondas en un segundo producto condensado.
El primer y segundo productos condensados se separan de las cadenas diana, de hecho duplicando la población diana en la muestra. Después, los productos condensados sirven como moldes para reacciones de LCR posteriores hibridándose a sus sondas complementarias. Como se repite el ciclo de hibridación, unión y desnaturalización, la población de sondas condensadas aumenta con una proporción geométrica. Las sondas condensadas se detectan mediante métodos estándar.
Estas reacciones de amplificación permiten un rápido análisis o caracterización de las secuencias de interés, incluso cuando las cantidades de partida del material son extremadamente pequeñas. Sin embargo, es importante que el proceso de amplificación sea muy específico, ya que la amplificación de secuencias que no son diana con la señal diana perjudica la fiabilidad del proceso de amplificación.
Al igual que con PCR, un problema asociado con LCR es la señal de fondo no deseada provocada por la unión independiente de diana de los pares oligonucleotídicos complementarios. La señal de fondo no deseada se debe a la capacidad de estos pares complementarios, que se añaden en exceso, para hibridarse transversalmente entre sí. Tal hibridación transversal puede conducir a una unión independiente de la sondas para formar productos enlazados en ausencia de la secuencia diana. Estos productos independientes de la diana no pueden distinguirse de la secuencia diana amplificada deseada.
Tanto PCR como LCR tienen inconvenientes adicionales debido a la necesidad de polimerasas o ligasas para conseguir la amplificación. Además de ser caras, tales enzimas presentan variaciones de actividad de un lote a otro y en la concentración de los contaminantes nucleasa no deseados. Tales variaciones también restan valor a la fiabilidad de los métodos.
El problema que quiere resolverse con la presente invención es proporcionar un método de amplificación y detección de secuencias diana que no usa ni polimerasa ni ligasa, y que reduce las señales de fondo engañosas y mejora la fiabilidad.
Sumario de la invención
Estos y otros objetivos, como serán evidentes para los especialistas en la técnica, se han satisfecho proporcionando un proceso para amplificar y detectar, en una muestra, un molécula de ácido nucleico diana monocatenaria que comprende una secuencia diana, o una molécula de ácido nucleico bicatenaria que comprende una secuencia diana y una secuencia diana complementaria, comprendiendo el proceso las etapas de:
(a) proporcionar un primer par oligonucleotídico complementario y un segundo par oligonucleotídico complementario, donde:
(i)
el primer par oligonucleotídico complementario consiste en una sonda 1 y una sonda 1' y el segundo par oligonucleotídico complementario consiste en una sonda 2 y una sonda 2';
(ii)
la sonda 1 comprende una secuencia larga H y una secuencia corta I; la sonda 1' comprende una secuencia corta I y; la sonda 1' comprende una secuencia larga H' y una secuencia corta I';
(iii)
la sonda 2 comprende una secuencia larga J y una secuencia corta K, la sonda 2' comprende una secuencia larga J' y una secuencia corta K';
(iv)
la secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga H' de la sonda 1' son complementarias entre sí;
(v)
la secuencia larga J de la sonda 2 y la secuencia larga J' de la sonda 2' son complementarias entre sí;
(vi)
la secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga J de la secuencia 2 son complementarias a porciones adyacentes de la secuencia diana;
(vii)
la secuencia larga H' de la sonda 1' y la secuencia larga J' de la sonda 2' son complementarias a porciones adyacentes de la secuencia complementaria diana;
(viii)
en la secuencia corta I y la secuencia corta K no se hibridan con la secuencia diana cuando la secuencia larga H y la secuencia larga J se hibridan con la secuencia diana;
(ix)
la secuencia corta I' y la secuencia corta K' no se hibridan con la secuencia complementaria diana cuando la secuencia larga H' y la secuencia larga J' se hibridan con la secuencia complementaria diana.
(x)
la secuencia corta I de la sonda 1 es complementaria a la secuencia corta K de la sonda 2 y la secuencia corta I' de la sonda 1' es complementaria a la secuencia corta K' de la sonda 2';
(xi)
el resto azúcar o base de uno o más nucleótidos de la secuencia I de la sonda 1 está modificado con el grupo químico funcional X_{1}; el resto azúcar o base de uno o más nucleótidos de la secuencia K de la sonda 2 está modificado con el grupo químico funcional Y_{1}; el grupo químico funcional X_{1} es reactivo con el grupo químico funcional Y_{1};
(xii)
el resto azúcar o base de uno o más nucleótidos de la secuencia I' de la sonda I' está modificado con un grupo químico funcional X_{2}; el resto azúcar o base de uno o más nucleótidos de la secuencia K' de la sonda 2' está modificado con el grupo químico funcional Y_{2}; el grupo químico funcional X_{2} es reactivo con el grupo químico funcional Y_{2};
(xiii)
la secuencia corta I se hibrida con la secuencia corta K cuando la secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga J de la sonda 2 se hibridan con porciones adyacentes de la secuencia diana;
(xiv)
cuando la secuencia corta I' se hibrida con la secuencia corta K, el grupo químico funcional X_{1} reacciona con el grupo químico funcional Y_{1} para formar un enlace químico;
(xv)
la secuencia corta I' se hibrida con la secuencia corta K' cuando la secuencia larga H' de la sonda 1' y la secuencia larga J' de la sonda 2' se hibridan con porciones adyacentes de una secuencia complementaria diana;
(xvi)
cuando la secuencia corta I' se hibrida con la secuencia corta K', el grupo químico X_{2} reacciona con el grupo químico funcional Y_{2} para formar un enlace químico;
(b) hibridar, en el caso de que la secuencia diana y la secuencia complementaria diana formen una cadena doble, la secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga J de la sonda 2 con las porciones adyacentes de la secuencia diana de manera que I y K pueden hibridarse entre sí e hibridar la secuencia larga H' de la sonda 1' y la secuencia J' de la sonda 2' con las porciones adyacentes de la secuencia complementaria diana de manera que I' y K' pueden hibridarse entre sí, o
hibridar, en el caso de que la secuencia diana o la secuencia complementaria diana sea monocatenaria, la secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga J de la sonda 2 con porciones adyacentes de la secuencia diana de manera que I y K puedan hibridarse entre sí o hibridar la secuencia larga H' de la sonda 1' y la secuencia larga J' de la sonda 2' con porciones adyacentes de la secuencia complementaria diana de manera que I' y K' puedan hibridarse entre sí,
(c) unir la sonda 1 y la sonda 2, hibridadas después de la etapa (b) con porciones adyacentes de la secuencia diana, entre sí formando un enlace químico entre los grupos químicos funcionales X_{1} e Y_{1}, formándose de esta primera una primer producto oligonucleotídico enlazado que tiene la secuencia complementaria diana;
(d) unir la sonda 1' y la sonda 2', hibridadas después de la etapa (b) con porciones adyacentes de la secuencia complementaria diana, entre sí para formar un enlace químico entre los grupos químicos funcionales X_{2} e Y_{2}, formándose de esta manera un segundo producto oligonucleotídico enlazado que tiene la secuencia diana;
(e) tratar la muestra en condiciones de desnaturalización;
(f) repetir las etapas (b) a (e) el número deseado de veces;
(g) detectar los productos oligonucleotídicos enlazados, sustituyendo al menos uno de los grupos químicos funcionales X_{1}, X_{2}, Y_{1} o Y_{2} al grupo hidroxilo o hidrógeno localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa de un nucleótido en la secuencia corta I, I', K o K', respectivamente.
Descripción de los dibujos
La figura 1 muestra una ilustración general de sondas oligonucleotídicas 1, 1', 2 y 2'. Las líneas verticales en la ilustración simplemente describen la demarcación entre segmentos funcionalmente diferentes de cada sonda.
La figura 2 muestra derivados de adenina A_{1}, A_{2}, A_{3} y A_{4} modificados con un grupo químico funcional Z.
La figura 3 muestra derivados de citidina C_{1}, C_{2} y C_{3} modificados con un grupo químico funcional Z.
La figura 4 muestra derivados de guanina G_{1}, G_{2} y G_{3} modificados con un grupo químico funcional Z.
La figura 5 muestra derivados de timidina T_{1}, T_{2} y T_{3} modificado con un grupo químico funcional Z.
La figura 6 muestra derivados de uridina U_{1} y U_{2} modificados con un grupo químico funcional Z.
La figura 7 muestra un segmento de dos nucleótidos a partir de secuencias cortas I y K de las sondas 1 y 2, respectivamente, con grupos químicos funcionales X_{1} e Y_{1} unidos a los restos guanina.
La figura 7.1 muestra un segmento de dos nucleótidos a partir de las secuencias cortas I' y K' de las sonda 1' y 2', respectivamente, con grupos químicos funcionales X_{2} e Y_{2} unidos a los restos guanina.
La figura 8 muestra una ilustración general de un grupo químico funcional X protegido unido al resto azúcar de la base nucleotídica B en la secuencia corta de una sonda. En la figura, X representa un grupo químico funcional, A representa adenina, G representa guanina, C representa citidina, B representa cualquier base nucleotídica y la fila de símbolos con S o P en su interior representa la estructura azúcar-fosfato de la secuencia de ácido nucleico.
La figura 9 muestra una ilustración general de dos secuencias cortas hibridadas con grupos químicos funcionales X e Y unidos a la posición C-2' del anillo de ribosa de ambas bases nucleotídicas B. En la figura, cada X e Y representa un grupo químico funcional, G representa guanina, C representa citosina, B representa cualquier base nucleotídica y la serie de símbolos con S o P en su interior representa la estructura de azúcar-fosfato de la secuencia de ácido nucleico. Las bases nucleotídicas a las que se unen los grupos químicos funcionales no se hibridan entre sí. En lugar de ello, el grupo químico funcional X se une al nucleótido que se hibrida con el nucleótido adyacente al nucleótido al que se une el grupo químico funcional Y. Se entiende que los grupos químicos funcionales X e Y se unen conjuntamente mediante un enlace covalente.
La figura 10 muestra una ilustración general de dos secuencia cortas hibridadas con el grupo químico funcional X unido a la posición C-2' del anillo de ribosa de una base nucleotídica B y el grupo químico funcional Y unido a cualquiera de las posiciones C-5, C-6 o C-8 de una base nucleotídica B. En la figura, cada X e Y representa un grupo químico funcional, G representa guanina, C representa citosina, B representa cualquier base nucleotídica y la serie de símbolos con S o P en su interior representa la estructura de azúcar-fosfato de la secuencia de ácido nucleico. Las bases nucleotídicas a las que se unen los grupos químicos funcionales no se hibridan entre sí. Se entiende que los grupos químicos funcionales X e Y se unen conjuntamente mediante un enlace covalente.
La figura 11 muestra una ilustración general de dos secuencias cortas hibridadas con el grupo químico funcional X unido a la posición C-2' del anillo de ribosa de una base nucleotídica B y el grupo químico funcional de una base nucleotídica B y el grupo químico funcional Y unido a cualquiera de las posiciones C-5, C-6 o C-8 de una base nucleotídica B. En la figura, cada X e Y representa un grupo químico funcional, G representa guanina, C representa citosina, B representa cualquier base nucleotídica y la serie de símbolos con S o P en su interior representa la estructura de azúcar-fosfato de la secuencia de ácido nucleico. Las bases nucleotídicas a las que se unen los grupos químicos funcionales no se hibridan entre sí. Se entiende que los grupos químicos funcionales X e Y se unen conjuntamente mediante un enlace covalente.
La figura 12 muestra una ilustración general de dos secuencias cortas hibridadas con el grupo químico funcional X unido a cualquiera de las posiciones C-5, C-6 o C-8 de una base nucleotídica B y el grupo químico funcional Y unido a cualquiera de la posiciones C-5, C-6 o C-8 de una base nucleotídica B. En la figura, cada X e Y representa un grupo químico funcional, G representa guanina, C representa citosina, B representa cualquier base nucleotídica y la serie de símbolos con S o P en su interior representa la estructura de azúcar-fosfato de la secuencia de ácido nucleico. Las bases nucleotídicas a las que se unen los grupos químicos funcionales no se hibridan entre sí. Se entiende que los grupos químicos funcionales X e Y se unen conjuntamente mediante un enlace covalente.
La figura 13 muestra una ilustración general de dos secuencias cortas hibridadas con el grupo químico funcional X unido a cualquiera de las posiciones C-5, C-6 o C-8 de una base nucleotídica B y el grupo químico funcional Y unida a cualquiera de las posiciones C-5, C-6 o C-8 de una base nucleotídica B. En la figura, cada X e Y representa representan un grupo químico funcional, G representa guanina, C representa citosina, B representa cualquier base nucleotídica y la serie de símbolos con S o P en su interior representa la estructura de azúcar-fosfato de la secuencia de ácido nucleico. Las bases nucleotídicas a las que se unen los grupos químicos funcionales no se hibridan entre sí. Se entiende que los grupos químicos funcionales X e Y se unen conjuntamente mediante un enlace covalente.
La figura 14 muestra una ilustración general de un grupo químico funcional X protegido con un oligonucleótido 1.1.
La figura 15 muestra las etapas de la síntesis de 2'-amino-2'-desoxiguanosina fosforamidita protegida a partir de 2'-amino-2'-desoxiguanina. Reactivos: i, S-etil-trifluorotioacetato en metanol; ii, dimetilformamida dimetil acetal en metanol; iii, cloruro de dimetoxitritilo, trietilamina en piridina; iv, \beta-cianoetil (N,N-diisopropilamino) clorofosforamidita y N,N-diisopropil-etilamina en diclorometano.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un proceso para amplificar y detectar una molécula de ácido nucleico diana en una muestra de ensayo.
Molécula de ácido nucleico diana
El proceso de la presente invención puede producir la amplificación geométrica de una molécula de ácido nucleico diana, con la condición de que al menos parte de la secuencia nucleotídica se conozca con el suficiente detalle que puedan sintetizarse los pares de sondas oligonucleotídicas complementarias. La molécula diana puede estar en forma purificada o no purificada, y puede ser ADN, ARN o un híbrido ADN-ARN monocatenario o bicatenario.
La molécula de ácido nucleico diana contiene las secuencias nucleotídicas específicas que se hibridan con las sondas oligonucleotídicas. Estas secuencias se denominan secuencias diana. Si una molécula de ácido nucleico diana es bicatenaria, contendrá una secuencia diana y su complemento denominado secuencia complementaria diana. La secuencia diana puede ser tan corta como 12 nucleótidos, aunque preferiblemente contiene al menos 16 nucleótidos y más preferiblemente al menos 20 nucleótidos. No hay un número máximo de nucleótidos en la secuencia diana o en la secuencia complementaria diana, que puede constituir una parte de la molécula diana o toda la molécula diana.
Puede utilizarse cualquier fuente de ácido nucleico como fuente de la molécula de ácido nucleico diana. Por ejemplo, con el proceso de la presente invención se puede amplificar el ADN o el ARN aislado de bacterias, virus, algas, protozoos, levaduras, hongos plásmidos, células en cultivo tisular y organismos superiores tales como plantas o animales.
El ADN o ARN de estas fuentes se puede encontrar, por ejemplo, en muestras de un fluido corporal de un animal, incluyendo un ser humano, tal como, aunque no se limita a, sangre, orina, fluido linfático, fluido sinovial, bilis, flemas, saliva, humor acuoso, fluido lacrimal, fluido menstrual y semen. Además, las muestras que contienen ADN o ARN pueden encontrarse, por ejemplo, EN fluidos provenientes de plantas tales como, aunque no se limitan a, fluido xilem, fluido floem y exudados de plantas. Las muestras que contienen ADN o ARN pueden encontrarse, por ejemplo, en fuentes no vivas tales como aunque no se limitan a, alimentos, aguas residuales, muestras forenses, lagos, depósitos, ríos y océanos.
Sondas
El término "par oligonucleotídico complementario" como se usa en este documento significa dos sondas oligonucleotídicas diferentes denominadas, por ejemplo, sonda 1 y sonda 1' o sonda 2 y sonda 2'. La sonda 1 tiene una secuencia de bases complementaria a la sonda 1' y sonda 2 tiene una secuencia base complementaria a la sonda 2'. Cada par de sondas puede tener una longitud igual o diferente. Debe entenderse que pueden usarse más de dos pares complementarios oligonucleotídicos por secuencia diana o secuencia complementaria diana en el proceso de la presente invención.
El término "par oligonucleotídico" como se usa en este documento se refiere a la agrupación de las sondas 1 y 2 en forma de un par y la agrupación de las sondas 1' y 2' en forma de un par.
Cada sonda tiene dos secuencias diferentes. Una secuencia es generalmente más larga que la otra. Las dos secuencias se denominarán secuencia larga y secuencia corta. Las sondas oligonucleotídicas se construyen preferiblemente a partir de desoxirribonucleótidos, aunque los ribonucleótidos son sustitutos aceptables.
Haciendo referencia al primer par oligonucleotídico de la figura 1, la sonda 1 tiene una secuencia larga H y una secuencia corta I. La sonda 1' tiene una secuencia H' y una secuencia corta I'.
Haciendo referencia al segundo par oligonucleotídico complementario en la figura 1, la sonda 2 tiene una secuencia larga J y una secuencia corta K. La sonda 2' tiene una secuencia larga J' y una secuencia corta K'.
La secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga H' de la sonda 1' son complementarias entre sí. La secuencia larga J de la sonda 2 y la secuencia larga J' de la sonda 2' son complementarias entre sí. La secuencia larga H no es complementaria a la secuencia larga J. De manera similar, la secuencia larga H' no es complementaria a la secuencia larga J'.
Si una secuencia de ácido nucleico diana está presente en una muestra de ensayo, las secuencias largas H y J pueden ser totalmente complementarias o suficientemente complementarias a las regiones adyacentes de la secuencia diana para formar un híbrido estable en las condiciones de hibridación seleccionadas.
Si hay presente una cadena complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana en una muestra de ensayo, las secuencias largas H' y J' son totalmente complementarias a la secuencia complementaria diana o son suficientemente complementarias a las regiones adyacentes de la secuencia complementaria diana para formar un híbrido estable en las condiciones de hibridación seleccionadas.
Las expresiones "regiones adyacentes de una secuencia diana" o "regiones adyacentes de una secuencia complementaria diana", como se usan en este documento, se refieren a secuencias en estas moléculas de ácido nucleico que son inmediatamente adyacentes y que se yuxtaponen entre sí o que están separadas mediante una o dos bases nucleotídicas.
El número mínimo de nucleótidos en la secuencia larga es el menor número que da una selectividad suficiente en el proceso de amplificación y detección de la presente invención. Por ejemplo, es adecuada una secuencia larga que comprende al menos seis, preferiblemente al menos doce y más preferiblemente al menos veinte desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos.
La máxima longitud de la secuencia corta de una sonda está limitada sólo por la longitud de la secuencia de ácido nucleico diana en la muestra de ensayo. La secuencia larga debería tener una longitud suficiente para formar un híbrido estable con la secuencia diana, aunque preferiblemente no es demasiado larga como para necesitar tiempos de hibridación excesivos. Algunas longitudes máximas adecuadas de las secuencias largas son 200 nucleótidos, preferiblemente 150 nucleótidos y más preferiblemente 100 nucleótidos.
Algunas longitudes adecuadas de la secuencia larga son 6-100 nucleótidos, preferiblemente 10-70 nucleótidos, más preferiblemente 16-50 nucleótidos y más preferiblemente 18-30 nucleótidos.
Las secuencias cortas I y K de las sondas 1 y 2, respectivamente, son complementarias entre sí. Las secuencias cortas I' y K' de las sondas 1' y 2', respectivamente, son complementarias entre sí.
Las secuencias cortas I e I' de las sondas 1 y 1', respectivamente pueden ser complementarias entre sí o no. De manera similar, las secuencias cortas K y K' de las sondas 2 y 2', respectivamente pueden ser complementarias entre sí o no.
La secuencia corta de cada sonda se diseña de manera que no se hibrida con la secuencia diana cuando las secuencias largas de las sondas se han hibridado con la secuencia diana o la secuencia complementaria diana. Por lo tanto, la secuencia corta I se hibrida con la secuencia corta K cuando la secuencia larga H y la secuencia larga J se hibridan con porciones adyacentes de la secuencia diana. Igualmente, la secuencia corta I' se hibrida con la secuencia corta K' cuando la secuencia larga H' y la secuencia larga J' se hibridan con porciones adyacentes de la secuencia complementaria diana.
La longitud de la secuencia corta es tan corta como sea posible para evitar la hibridación entre las secuencias cortas I y K cuando las secuencias largas H y J no se hibridan con la secuencia diana o entre las secuencias cortas I' y K' cuando las secuencias largas H' y J' no se hibridan con la secuencia complementaria diana.
La longitud máxima de la secuencia corta depende de la proporción de la secuencia larga a la secuencia corta. La proporción de la secuencia larga a la secuencia corta debería ser tan grande como sea posible, preferiblemente en el intervalo 2:1, a 50:1. Por ejemplo, proporción debería ser al menos 2:1, preferiblemente al menos 5:1, más preferiblemente al menos 10:1 y más preferiblemente al menos 20:1. Por ejemplo, si la secuencia larga contiene 30 nucleótidos, la secuencia corta debería contener al menos diez nucleótidos, preferiblemente al menos seis nucleótidos, más preferiblemente al menos 3 nucleótidos y más preferiblemente dos nucleótidos.
Cada secuencia corta tiene un grupo químico funcional, denominado X o Y, unido covalentemente al resto azúcar y/o base de uno o más nucleótidos de la secuencia. Cuando las secuencias cortas de las sondas 1 y 2 o las sondas 1' y 2' se han hibridado entre sí, los grupos químicos funcionales de cada secuencia reaccionan químicamente para formar un enlace covalente que une las sondas para formar un producto oligonucleotídico enlazado. Cuando las secuencias cortas de las sondas 1 y 2 o de la sondas 1' y 2' no se hibridan entre sí, el nucleótido al que está unido el grupo químico funcional y los nucleótidos próximos en la sonda protegen al grupo químicamente funcional en la sonda de que reaccione con el grupo químico funcional de otra sonda.
En las condiciones de hibridación usadas en el método, la secuencia larga debe tener una temperatura de fusión suficientemente alta para formar un híbrido estable con una secuencia diana o una secuencia complementaria diana. La secuencia corta debe tener una temperatura de fusión suficientemente baja de manera que, en las mismas condiciones de hibridación, no se hibridará con la secuencia complementaria corta de otra sonda a menos que las sondas largas se hayan hibridado con la secuencia diana o la secuencia complementaria diana.
El término "temperatura de fusión" como se usa en este documento se refiere a la temperatura a la que un oligonucleótido se hibrida con una secuencia de ácido nucleico complementaria para formar un complejo estable. El término se abrevia "Tf". La Tf de un oligonucleótido dado es una función del tamaño de la composición del oligonucleótido, la concentración del oligonucleótido y la composición del disolvente de reacción.
Las características de hibridación de la sonda de la presente invención se analizan en este documento en términos de las longitudes larga y corta de los segmentos de las sondas. Como las características de hibridación de una sonda se determina en gran medida mediante la longitud y la composición de la sonda, se entiende que es más preciso caracterizar los segmentos largos y cortos de las sondas en términos de sus temperaturas de fusión respectivas. En consecuencia, se entiende que la secuencia larga de una sonda es el segmento de la sonda que tiene una temperatura de fusión mayor, con respecto a su secuencia complementaria, que la secuencia corta de la sonda, con respecto a su secuencia complementaria. De manera similar, se entiende que la secuencia corta de una sonda es el segmento de la sonda que tiene una temperatura de fusión menor, con respecto a su secuencia complementaria, que la secuencia larga de la sonda, con respecto a su secuencia complementaria. Por lo tanto, la caracterización más correcta de los dos segmentos diferentes de una sonda se hace en términos de sus temperaturas de fusión respectivas. Sin embargo, la relación general entre la longitud de una secuencia nucleotídica y la temperatura de fusión de la secuencia permite analizar los diferentes segmentos de las sondas en términos tanto de sus longitudes así como de sus temperaturas de fusión.
Los pares de sondas oligonucleotídicas pueden sintetizarse químicamente a partir de los cuatro nucleótidos en todo o en parte mediante métodos conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen los descritos en Caruthers in Science 230, 281-285 (1985) y por Beaucage et al., en Tetrahedron Letters 22, 1859-1862 (1981).
Grupos químicos funcionales
Los grupos químicos funcionales X e Y (X = X_{1} o X_{2} e Y = Y_{1} o Y_{2}) son pares de átomos y/o grupos que son reactivos entre sí para formar enlaces covalentes cuando se ponen cerca unos de otros mediante la hibridación de las secuencias cortas de las sondas 1 y 2, respectivamente. Se entiende que la distancia de los grupos químicos funcionales debe ser aproximadamente de 4 \ring{A} o menor para que tenga lugar la reacción entre los grupos.
Un grupo químico funcional se une a la base o al resto azúcar de al menos un nucleótido en cada secuencia corta. Como se observa en la figura 1, el grupo químico funcional X_{1} se une a un nucleótido de la secuencia corta I. Como también se observa en la figura 1, el grupo químico funcional X_{2} se une a un nucleótido de la secuencia corta I'. De manera similar, el grupo químico funcional Y_{1}, se une a un nucleótido de la secuencia corta K y el grupo químico funcional Y_{2} se une a un nucleótido a la secuencia corta K'.
Los grupos químicos funcionales X_{1} e X_{2} pueden ser iguales o diferentes y los grupos químicos funcionales Y_{1} e Y_{2} pueden ser iguales o diferentes siempre y cuando X_{1} pueda formar un enlace covalente con Y_{1} y X_{2} pueda formar un enlace covalente con Y_{2} cuando las secuencias cortas I y K y I' y K' se hibridan entre sí, respectivamente.
Un grupo químico funcional se une covalentemente a un nucleótido de la secuencia corta en un sitio tolerado estéricamente. Un sitio tolerado estéricamente se define como una posición en una base nucleotídica o en un resto azúcar en la que el grupo químico funcional puede unirse sin provocar interferencias significativas con la hibridación de las secuencias cortas entre sí o en la hibridación de las secuencias largas a la secuencia diana o la secuencia complementaria diana. Los sitios tolerados estéricamente incluyen posiciones en las bases de purina y pirimidina y en los heteroátomos polivalentes de la base o en la parte de ribosa de los nucleótidos o nucleótidos modificados.
Los ejemplos de sitios tolerados estéricamente incluyen el grupo metilo unido en la posición C-5 de timidina, el grupo amino unido a la posición C-6 de adenina o citidina, la posición C-8 de adenina o guanina, la posición C-2' del anillo de ribosa de cada tipo de nucleótido y el grupo hidroxilo unido en la posición C-2' del anillo de ribosa de un ribonucleótido.
La modificación de las bases de purina y pirimidina, por ejemplo, puede realizarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos por Ruth en el documento EP 135 587. La modificación de un ribonucleótido en la posición C-2' del anillo de ribosa del nucleótido puede realizarse, por ejemplo, de acuerdo con el método descrito por Yamana, K. et al. en Bioconjugate Chemistry, 1, 319-324 (1990).
Un ejemplo de nucleótidos modificados con un grupo químico funcional en cada uno de los sitios tolerados estéricamente mencionados anteriormente se muestra en las figuras 2-6. Aunque en las figuras 2-6 se muestran desoxirribonucleótidos modificados, se entiende que los ribonucleótidos son sustitutos aceptables. A continuación se proporciona una lista de denominaciones de nucleótidos modificados.
A_{1} representa adenina con un grupo químico funcional Z que sustituye a un hidrógeno del grupo amino localizado en la posición C-6.
A_{2} representa adenina con un grupo químico funcional Z unido al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
A_{3} representa adenina con un grupo químico funcional Z que sustituye al hidrógeno localizado en la posición C-8.
A_{4} representa adenina con un grupo químico funcional Z que sustituye al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
C_{1} representa citidina con un grupo químico funcional Z que sustituye al hidrógeno del grupo amino localizado en la posición C-6.
C_{2} representa citidina con un grupo químico funcional Z unido al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo ribosa.
C_{3} representa citidina con un grupo químico funcional Z que sustituye al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
G_{1} representa guanina con un grupo químico funcional Z que sustituye al hidrógeno localizado en la posición C-8.
G_{2} representa guanina con un grupo químico funcional Z unido al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
G_{3} representa guanina con un grupo químico funcional Z que sustituye al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
T_{1} representa timidina con un grupo químico funcional Z sustituyendo a un hidrógeno del grupo metilo localizado en la posición C-5.
T_{2} representa timidina con un grupo químico funcional Z unido al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
T_{3} representa timidina con un grupo químico funcional Z que sustituye al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
U_{1} representa uridina con un grupo funcional Z que sustituye al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
U_{2} representa uridina con un grupo químico funcional Z unido al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
Z representa los grupos químicos funcionales X_{1}, X_{2}, Y_{1} o Y_{2}.
Es evidente que anteriormente se han definido un número de términos bastante grande, para describir las diversas secuencias, nucleótidos modificados y grupos químicos funcionales usados en la presente invención. A continuación se definen algunos términos adicionales. Para la comodidad del lector, se proporciona un glosario al final de la sección de ejemplos a continuación donde se recogen todos estos términos en un solo lugar.
Es importante observar que los grupos químicos funcionales X e Y no tienen que estar unidos a las mismas posiciones en sus nucleótidos respectivos. Por ejemplo, sin limitación, el grupo X puede estar unido a la posición C-2' en un nucleótido de una secuencia corta de la sonda 1 y el grupo Y puede estar unido a la posición C-6 en un nucleótido apropiado de la secuencia corta de la sonda 2.
La posición a la que se unen los grupos químicos funcionales a un nucleótido de la secuencia corta de una sonda puede determinar la longitud mínima de la secuencia corta. Por ejemplo, cuando los grupos químicos funcionales se unen a la posición C-2' de un nucleótido a la secuencia corta de ambos miembros de un par oligonucleotídico, las secuencias cortas pueden ser tan cortas como 2-3 nucleótidos. Sin embargo, cuando un miembro de un par oligonucleotídico tiene un grupo químico funcional unido en la posición C-2' de un nucleótido en su secuencia corta y el otro miembro del par tiene un grupo químico funcional unido a una posición distinta de la posición C-2' de un nucleótido en su secuencia corta, las secuencias cortas pueden ser tan cortas como 1-3 nucleótidos. De manera similar, cuando ninguno de los miembros de un par oligonucleotídico tiene un grupo químico funcional unido a la posición C-2' de un nucleótido en su secuencia corta, la secuencia corta puede ser tan corta como 1-3 nucleótidos.
La posición preferida de unión para los grupos químicos funcionales a un nucleótido es la posición C-2' del anillo de ribosa del nucleótido. Por ejemplo, es conveniente sustituir el grupo hidroxilo en la posición C-2' del anillo de ribosa con un grupo amino mediante, por ejemplo, el protocolo descrito en Moffatt, et al., J. Org. Chem. 36. 250 (1971) y Ruth en el documento EP 135 587. El grupo amino puede servir también como grupo químico funcional, o como grupo de unión para la unión de los grupos químicos funcionales al anillo de ribosa.
Los grupos químicos funcionales pueden contener opcionalmente un grupo de unión mediante el cual se unen al nucleótido. Los ejemplos de grupo de unión incluyen, aunque no se limitan a, amino, amido, tio, carbonilo, carboxilo, grupos alquilo, grupos arilo, grupos alquilarilo, grupos arilalquilo opcionalmente sustituido en cualquier posición con grupos tales como amido, carbonilo, carboxilo, amino y tio. Los grupos alquilo pueden ser cíclicos totalmente o en parte. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, aunque no se limitan a metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, ciclopentilo, hexilo, ciclohexilo, etc. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, aunque no se limitan a fenilo, naftilo, imidazolilo, indilo, etc. Además, para propósitos de ilustración, al término "Ph" como se usa en este documento se refiere a un grupo fenilo. Un fenilo sustituido, por ejemplo, en las posiciones 1 y 3 se denomina 1,3 Ph.
A continuación se muestran algunos ejemplos específicos de reacciones químicas adecuadas para el presente método. En estos ejemplos, D representa los nucleótidos modificados a A_{4}, C_{3}, G_{3}, T_{3} o U_{1}; E representa los nucleótidos modificados A_{1} o C_{1}; F representa los nucleótidos modificados A_{3} o G_{1} y L representa los nucleótidos modificados A_{2}, C_{2}, G_{2}, T_{2} y U_{2} descritos en las figuras 2-6. (Véase también el "glosario" a continuación al final de la sección de ejemplos).
En un par dado de secuencias cortas complementarias, por ejemplo, un miembro del par tiene un grupo químico funcional nucleófilo y el otro miembro tiene un grupo químico funcional electrófilo (es decir, si X en la figura 1 es nucleófilo, entonces Y es un electrófilo y viceversa).
Algunos ejemplos de nucleófilos incluyen -SH, -NH_{2}-, -NHA (donde A es un grupo alquilo, tal como metilo, etilo, propilo, butilo, etc., o un grupo arilo tal como fenilo, naftilo, imidazolilo, indilo, etc.). Los electrófilos pueden formar enlaces sencillos o dobles mediante transferencia de electrones desde un nucleófilo. La reacción entre el nucleófilo y el electrófilo pueden implicar la adición del nucleófilo a través del doble enlace unido a un grupo aceptor de electrones o la sustitución de un nucleófilo por un grupo saliente electrófilo.
A continuación se muestran ejemplos de la adición de un nucleófilo a través del doble enlace implica en la adición de un grupo tiol al doble enlace de un resto maleimido. El esquema general de la reacción es el siguiente, donde R-Z y R'-Z representan cualquiera de los nucleótidos modificados mostrados en las figuras-2-6:
1 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
2 
\vskip1.000000\baselineskip
200
El esquema general de la reacción de Michael es el siguiente:
R-NH_{2} 
\hskip0.5cm
+ 
\hskip0.5cm
CH_{2}=CH---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---(NH)_{n}---R' 
\hskip0.5cm
\rightarrow 
\hskip0.5cm
R---NH---CH_{2}---CH_{2}---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---(NH)_{n}---R'
3
El esquema general de una reacción que implica la sustitución de un nucleófilo por un grupo saliente electrófilo es el siguiente:
R-SH 
\hskip0.5cm
+ 
\hskip0.5cm
I---H_{2}C---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---R' 
\hskip0.5cm
\rightarrow 
\hskip0.5cm
R---S---CH_{2}---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---R' 
\hskip0.5cm
+ 
\hskip0.5cm
HI
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
Otros tipos de reacciones entre los grupos químicos funcionales son, por ejemplo, la reacción de Diels-Alder o cualquier reacción pericíclica que produce uno o más enlaces covalentes nuevos. El esquema general de la reacción de Diels-Alder es el siguiente:
6 
\vskip1.000000\baselineskip
7
Son ejemplos adicionales de las reacciones de Diels-Alder entre grupos químicos funcionales los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
8
9
Los grupos químicos funcionales se pueden seleccionar también de manera que formen enlaces covalentes mediante reacción fotoquímica tal como [2+2] foto-ciclodimerización u otro tipo de fotociclación. A continuación se muestra un ejemplo de una reacción de [2+2] foto-ciclodimerización.
R R'
D- -D
E- -D
F -D
L- -D
T_{1}- -D
A continuación se muestran ejemplos adicionales de una reacción [2+2] foto-ciclodimerización entre grupos químicos funcionales. El esquema general de la reacción es el siguiente:
10
100 
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se muestra otro ejemplo de una reacción fotoquímica entre grupos químicos funcionales, donde un grupo fenilo se sustituye en la posición 2 con un grupo NO_{2} y en la posición 4 con un grupo OCH_{3}. El grupo fenilo sustituido se denomina (2, NO_{2}, 4, OCH_{3}-Ph). R y R' representan cualquier desoxirribonucleótido o ribonucleótido de origen natural.
R-NH_{2} + CH_{3}O-(2, NO_{2}, 4, OCH_{3}-Ph)-NH-R' \rightarrow R-NH-(2, NO_{2}, 4, OCH_{3}-Ph)-NH-R' + CH_{3}OH
Descripción del proceso de amplificación y detección
La amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana se consigue en la presente invención uniendo dos o más sondas oligonucleotídicas modificadas químicamente para cada cadena de una molécula de ácido nucleico diana para formar un producto oligonucleotídico enlazado. Una vez formado, el producto oligonucleotídico enlazado sirve como molde para la producción posterior de productos oligonucleotídicos enlazados. Las etapas del proceso se repiten un número de veces suficiente para producir cantidades detectables del producto oligonucleotídico enlazado. Cada repetición de las etapas del proceso de la presente invención se denomina un ciclo. El número de ciclos necesario para producir cantidades detectables del producto oligonucleotídico enlazado depende en gran parte del número de moléculas diana presentes inicialmente en una muestra. Cuanto mayor sea el número de moléculas diana en la muestra, menor será el número de ciclos necesario para producir cantidades detectables del producto oligonucleotídico enlazado. Cuando se forma una cantidad deseada de producto oligonucleotídico enlazado, se detecta. Un nuevo aspecto de la presente invención es la manera en la que las sondas oligonucleotídicas forman el producto oligonucleotídico enlazado. No se usa ni ADN polimerasa ni ADN ligasa en la presente invención para formar el producto oligonucleotídico enlazado.
Las sondas 1, 1', 2 y 2' se usan en el proceso de la presente invención de la siguiente manera para amplificar las secuencias diana en una molécula de ácido nucleico mono o bicatenaria.
Como se ha descrito anteriormente, cuando una secuencia diana está presente en una muestra de ensayo, en condiciones de hibridación controladas cuidadosamente, sólo las secuencias largas H y J de las sondas oligonucleotídicas 1 y 2, respectivamente, se hibridan con las regiones adyacentes de la secuencia diana. Esto deja a las secuencias cortas I y K de las sondas 1 y 2, respectivamente, sin hibridar con la secuencia diana. Cuando las secuencias largas H y J han formado complejos híbridos estables con la secuencia diana, la secuencias cortas I y K se fuerzan a aproximarse entre sí, y como son complementarias, se hibridan entre sí. Cuando las secuencia I y K se hibridan entre sí, los grupos químicos funcionales X_{1} y Y_{1} se acercan lo suficiente como para formar un enlace covalente. El enlace entre los grupos químicos funcionales X_{1} y Y_{1} une la sonda 1 a la sonda 2, formando un primer producto oligonucleotídico enlazado. Una vez formado, las dos secuencias del primer producto oligonucleotídico enlazado constituyen una "secuencia complementaria diana" y son complementarias a las secuencias adyacentes de la secuencia diana.
De manera similar, cuando las secuencias largas H' y J' de las sondas 1' y 2', respectivamente, se hibridan con regiones adyacentes de la secuencia complementaria diana, la secuencias I' y K' de las sonda 1' y 2', respectivamente, se hibridan entre sí. La hibridación de las secuencias cortas I' y K' hace que el grupo químico funcional X_{2} de la secuencia I' y el grupo químico funcional Y_{2} de la secuencia K' estén lo suficientemente próximos como para formar un enlace covalente que une las sondas 1' y 2' para producir un segundo producto oligonucleotídico enlazado. Una vez formadas, las dos secuencias del segundo producto oligonucleotídico enlazado constituye una "secuencia diana" y son complementarias a las secuencias adyacentes de la secuencia complementaria diana.
Los grupos químicos funcionales de cada sonda están protegidos y resguardados, mediante nucleótidos de las secuencias cortas a los que están unidos los grupos y sus nucleótidos próximos, del acceso de grupos químicos funcionales de otras sondas cuando la secuencia corta de una sonda no está hibridada con la secuencia corta de otra sonda. En la figura 9 se muestra una ilustración general de un grupo químico funcional protegido unido a una secuencia corta.
Como resultado de la protección del grupo químico funcional mediante los nucleótidos de la secuencia corta, se evita que cada grupo químico funcional reaccione con los grupos químicos funcionales de las otras sondas a menos que los grupos químicos funcionales se pongan lo suficientemente cerca mediante la hibridación de las secuencias cortas entre sí.
En las figuras 10-14 se muestran las ilustraciones generales de las dos secuencias cortas e hibridadas con los grupos químicos funcionales unidos a las bases nucleotídicas descritos en las figuras 2-6. Se entiende que en las figuras 10-14, los grupos químicos funcionales X e Y se unen conjuntamente mediante enlaces covalentes.
Como puede observarse en la figura 10, los grupos químicos funcionales X e Y pueden unirse a la posición
C-2' del anillo de ribosa de cada nucleótido B. Las bases nucleotídicas a las que los grupos químicos funcionales se unen no se hibridan entre sí. En lugar de ello, el grupo químico funcional X se une al nucleótido que se hibrida con el nucleótido adyacente al nucleótido al cual se une el grupo químico funcional Y.
Como puede observarse en la figura 11, el grupo químico funcional X puede unirse a la posición C-2' del anillo de ribosa de una base nucleotídica B y el grupo químico funcional Y puede unirse a cualquiera de las posiciones C-5, C-6 o C-8 de una base nucleotídica B. En la realización mostrada en la figura 11, las bases nucleotídicas a las que se unen los grupos químicos funcionales no se hibridan entre sí.
Como puede observarse en la figura 12, el grupo químico funcional X puede unirse a la posición C-2' del anillo de ribosa de una base nucleotídica B y el grupo químico funcional Y puede unirse a cualquiera de las posiciones C-5, C-6 o C-8 de una base nucleotídica B. En la realización mostrada en la figura 12, las bases nucleotídicas a las que se unen los grupos químicos funcionales no se hibridan entre sí.
Como puede observarse en la figura 13, el grupo químico funcional x puede unirse a cualquiera de las posiciones C-5, C-6 o C-8 de una base nucleotídica B y el grupo químico funcional Y puede unirse a cualquiera de las posiciones C-5, C-6 o C-8 de una base nucleotídica B. En la realización mostrada en la figura 13, las bases nucleotídicas a las que se unen los grupos químicos funcionales no se hibridan entre sí.
Como puede observarse en la figura 14, el grupo químico funcional X puede unirse a cualquiera de las posiciones C-5, C-6 o C-8 de una base nucleotídica B y el grupo químico funcional Y puede unirse a cualquiera de las posiciones C-5, C-6 o C-8 de una base nucleotídica B. En la realización mostrada en la figura 14, las bases nucleotídicas a las que se unen los grupos químicos funcionales no se hibridan entre sí.
A continuación se muestra una ilustración general de ambos pares de sondas nucleotídicas hibridadas con una molécula diana bicatenaria y unidas mediante grupos químicos funcionales para formar un primer y un segundo producto oligonucleotídico enlazado. Se entiende que en las realizaciones preferidas de la presente invención, no hay ningún hueco entre las sondas, aunque puede permitirse un hueco de uno o dos nucleótidos.
11
En una muestra que contiene una molécula diana monocatenaria, el segundo producto oligonucleotídico enlazado se forma después del primer ciclo. Para formar un segundo producto oligonucleotídico enlazado en ausencia de una molécula complementaria diana, un primer producto oligonucleotídico enlazado debe formarse en el primer ciclo del proceso. El primer producto oligonucleotídico enlazado tiene la secuencia complementaria diana y funciona como molde con el que se hibridan las sondas 1' y 2'. Las sondas 1' y 2' forman un segundo producto oligonucleotídico enlazado que tiene la secuencia diana en el segundo ciclo y en los ciclos posteriores del
proceso.
Una vez formado el primer producto oligonucleotídico enlazado en el primer ciclo del proceso, el producto se separa de la secuencia diana mediante desnaturalización. Los términos "desnaturalizar" o "desnaturalización" como se usan en este documento, significan la pérdida reversible de la estructura de orden superior y la separación de los ácidos nucleicos hibridados en cadenas sencillas, producida mediante condiciones fisiológicas o no fisiológicos tales como, por ejemplo, enzimas, pH, temperatura, sales o disolventes orgánicos.
El segundo producto oligonucleotídico enlazado también se separa de la secuencia complementaria diana o del primer producto oligonucleotídico enlazado mediante desnaturalización una vez que se ha formado. La molécula diana y el primer y segundo productos oligonucleotídicos enlazados sirven como moldes para los ciclos repetidos del proceso.
A continuación se muestra una ilustración general de primer ciclo del proceso de amplificación para una secuencia monocatenaria.
Etapa 1
12
A continuación se muestra una ilustración general del primer ciclo del proceso de amplificación para una secuencia bicatenaria.
Etapa 1
13
Una vez finalizado el primer ciclo del proceso, se consigue una amplificación adicional de la secuencia diana mediante ciclos repetidos de desnaturalización de los productos oligonucleotídicos enlazados, hibridando los pares de sondas a los productos oligonucleotídicos enlazados y formando enlaces covalentes entre los grupos químicos funcionales en las secuencias cortas para producir más productos oligonucleotídicos enlazados. Todos los ciclos después del primer ciclo necesariamente tienen tanto la secuencia diana (moléculas diana mono y bicatenarias y el segundo producto oligonucleotídico enlazado) como la secuencia complementaria diana (molécula diana bicatenaria y primer producto oligonucleotídico).
A continuación se muestra una ilustración general de la capacidad del primer y del segundo producto oligonucleotídico enlazado para actuar como moldes para la formación de un primer y segundo productos oligonucleotídicos enlazados adicionales durante el segundo y todos los ciclos posteriores del proceso de amplificación para una secuencia diana mono y bicatenaria.
Etapa 2
14
15
Se evita la hibridación independiente de la diana de las secuencias cortas manteniendo una temperatura de reacción suficientemente por debajo de la temperatura de fusión (Tf) de las secuencias largas (H, H', J y J') para permitir una hibridación estable de las secuencias largas a la secuencia diana o la secuencia complementaria diana, aunque por encima de la Tf de las secuencias cortas (I, I', K y K') para evitar que las secuencias cortas se hibriden de manera estable entre sí cuando las sondas no se hibridan completamente con la secuencia diana o la secuencia complementaria diana. En unas condiciones tan estrictas, las secuencias cortas complementarias (I y K; I' y K') se hibridan entre sí cuando las secuencias largas de las sondas se han hibridado con las porciones adyacentes de la secuencia diana o de la secuencia complementaria diana. Las secuencias cortas pueden formar entonces híbridos suficientemente estables para permitir que los grupos químicos funcionales reaccionen y formen productos oligonucleotídicos enlazados. En consecuencia, la longitud de las secuencias cortas debe elegirse de manera que en las condiciones de reacción usadas, sus Tf sean suficientemente bajas para evitar la hibridación independiente de la diana de las secuencias cortas mientras que la longitud de las secuencias largas debe elegirse de manera que puedan formar eficazmente híbridos estables con la secuencia diana o con la secuencia complementaria diana.
En otra realización de la presente invención, la amplificación lineal de una secuencia diana o una secuencia complementaria diana, si estuviera presente, puede conseguirse usando únicamente las sondas 1 y 2 o las sondas 1' y 2' en el proceso descrito anteriormente.
En una realización preferida de la presente invención, un tampón de hibridación estándar tal como por ejemplo formamida desionizada al 30% en agua (vol/vol), NaCl 0,54 M, fosfato sódico 0,03 M (pH 7,4), EDTA 0,003 M, sulfato de dextrano al 5%, 500K m.w. (Sigma) (p/vol) y Triton X-100 al 0,1%, se usa con oligonucleótidos de cualquier longitud de seis a cien nucleótidos. Sólo la temperatura de desnaturalización y la temperatura de hibridación cambian cuando cambia la longitud (más precisamente, la Tf) de las sondas oligonucleotídicas. La temperatura de hibridación y la temperatura de desnaturalización son ambas funciones de la longitud de las sondas oligonucleotídicas. La siguiente tabla muestra una relación media preferida de la longitud de las ondas oligonucleotídicas con las temperaturas de hibridación y desnaturalización.
Longitud de las Temperatura de Temperatura de
sondas hibridación desnaturalización
6 nucleótidos 20ºC 40ºC
12 nucleótidos 30ºC 60ºC
16 nucleótidos 45ºC 64ºC
24 nucleótidos 55ºC 85ºC
32 nucleótidos 65ºC 90ºC
Generalmente, los pares oligonucleotídicos estarán presentes en un exceso molar de aproximadamente 10^{5}-10^{15}, preferiblemente 10^{9}-10^{15}, pares por secuencia diana de ácido nucleico o secuencia complementaria diana. La cantidad exacta de pares que se tiene que usar con propósito de diagnóstico puede no ser conocida debido a la incertidumbre de la cantidad de ácido nucleico diana en una muestra. Sin embargo, puede usarse una cantidad media de 10^{15} pares oligonucleotídicos en un formato de ensayo de diagnóstico típico. En cualquier caso, se prefiere un gran exceso molar para mejorar la eficacia del proceso de la invención.
Como está prohibido que los grupos químicos funcionales reaccionen y que unan conjuntamente las sondas si las secuencias largas de ambas sondas no se han hibridado con la secuencia diana y las secuencias cortas de las sondas no se han hibridado entre sí, se evita la formación de un producto oligonucleotídico enlazado independiente de la diana.
Una vez que se ha producido una cantidad suficiente de productos oligonucleotídicos enlazados, puede detectarse mediante métodos rutinarios en la técnica tales como por ejemplo, inmovilizando un miembro de un producto oligonucleotídico enlazado (es decir 1 o 1') y marcando el otro miembro (es decir 2 o 2'), por ejemplo con una o más señales radiactivas, cromogénicas, quimioluminiscentes o fluorescentes, o midiendo el tamaño de los productos oligonucleotídicos enlazados en un gel.
Los métodos para marcar las sondas oligonucleotídicas se han descrito, por ejemplo en Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:4045, Renz y Kurz, Nucl. Acids Res (1984) 12:3435; Richardson y Gumport, Nucl. Acids. Res. (1983) 11:6167, Smith et al., Nucl. Acids. Res. (1985) 13:2399; y Meinkorth y Wahl, Anal. Biochem. (1984) 138:267.
La marca puede ser radioactiva. Algunos ejemplos de marcas radioactivas útiles incluyen ^{32}P, ^{125}I, ^{131}I y ^{3}H. El uso de marcas radioactivas se ha descrito en los documentos U.K. 2.034.323, U.S. 4.358.535, y U.S. 4.302.204.
Algunos ejemplos de marcas no radiactivas incluyen enzimas, cromóforos, átomos y moléculas detectables mediante microscopia electrónica, e iones metálicos detectables por sus propiedades magnéticas.
Algunas marcas enzimáticas útiles incluyen enzimas que provocan un cambio detectable en un sustrato. Algunas enzimas útiles y sus sustratos incluyen, por ejemplo, peroxidasa del rábano (pirogalol y o-fenilendiamina), beta-galactosidasa (fluoresceína beta D-galactopiranósido) y fosfatos alcalinos (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/azul de nitro-tetrazolio). El uso de marcas enzimáticas se ha descrito en los documentos U.K. 2.019.404, EP 63.879 y por Rotman, Proc. Natl. Acad. Sci., 47, 1981-1991 (1961).
Los cromóforos útiles incluyen, por ejemplo, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes y bioluminiscentes así como colorantes. Algunos cromóforos específicos útiles en la presente invención incluyen, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, rojo de Texas, ficoeritrina, umbeliferona y luminol.
La detección del producto oligonucleotídico enlazado se realiza mediante métodos conocidos en la técnica tales como con una marca radiactiva o mediante un ensayo de captura no radioactiva. Por ejemplo, los productos oligonucleotídicos enlazados con una marca radiactiva se detectan siguiendo mediante autoradiografía el tamaño de los productos oligonucleotídicos enlazados en un gel. Alternativamente los productos oligonucleotídicos enlazados se detectan en un ensayo de captura no radiactiva uniéndolos a un receptor tal como por ejemplo, biotina a la sonda 1 y uniendo una marca enzimática tal como por ejemplo fosfatasa alcalina a la sonda 2. Se usa una placa de microtitulación cubierta con un ligando para el receptor tal como avidina para capturar la sonda 1 mediante la biotina unida a la sonda. La marca enzimática unida a la sonda 2 se expone a un sustrato cromogénico, tal como 5-bromo-4-cloro-3-indolilo fosfato/azul de nitro-tetrazolio, por ejemplo y se detecta un cambio colorimétrico en el sustrato midiendo la densidad óptica (O.D.) de la solución.
Las marcas pueden conjugarse al anticuerpo o a la sonda nucleotídica mediante métodos que son bien conocidos en la técnica. Las marcas se pueden unir directamente mediante un grupo funcional de la sonda. La sonda contiene o puede hacerse que contenga tal grupo funcional. Algunos ejemplos de grupos funcionales adecuados incluyen, por ejemplo, amino, carboxilo, sulfhidrilo, isocianato, isotiocianato.
Como alternativa, las marcas tales como enzimas y moléculas cromóforas pueden conjugarse con los anticuerpos o nucleótidos mediante agentes de acoplamiento, tales como dialdehídos, carbodiimidas, maleimidas y similares.
La marca puede conjugarse también con la sonda mediante un ligando unido a la sonda mediante un método descrito anteriormente y un receptor para dicho ligando unido a la marca. Es adecuada cualquiera de las combinaciones ligandos-receptor conocidas. Algunos pares ligando-receptor adecuados incluyen, por ejemplo, biotina-avidina y biotina-estreptavidina y anticuerpo-antígeno. La combinación de biotina-avidina es la preferida.
Si se usa una marca para detectar el producto oligonucleotídico enlazado, las marcas pueden unirse a la secuencia larga o a la secuencia corta de una o ambas sondas.
Se pueden usar más de dos sondas oligonucleotídicas por molécula de ácido nucleico diana en el proceso de la presente invención para detectar diferentes secuencias diana en la misma molécula de ácido nucleico diana. Los productos oligonucleotídicos enlazados de diferentes secuencias de la misma molécula de ácido nucleico diana pueden distinguirse entre sí por ejemplo, con marcas diferentes o usando sondas con longitudes que puedan diferenciarse.
En otra realización de la presente invención, la secuencia corta de la sonda oligonucleotídica es palindrómica. Esto permite que las secuencias complementarias del palíndromo se hibriden entre sí y protejan adicionalmente al grupo químico funcional de reaccionar con otros grupos químicos funcionales cuando la secuencia larga y corta de las sondas no se hibriden adecuadamente como se ha descrito anteriormente. A continuación se ilustran dos ejemplos de esta realización para la sonda 1. (Las líneas verticales dobles de la ilustración a continuación únicamente describen la demarcación entre la secuencia corta y la secuencia larga de cada sonda).
16
En otra realización de la presente invención, los oligonucleótidos 1.1, 1,1', 2.1 y 2.1' se proporcionan de manera que son complementarios únicamente a lassecuencias cortas de las sondas 1, 1', 2 y 2', respectivamente. Los oligonucleótidos 1.1, 1.1', 2.1 y 2.1' no tienen grupos químicos funcionales unidos a las secuencias. Cuando los oligonucleótidos 1.1, 1.1', 2.1 y 2.1' no modificados químicamente se hibridan con las secuencias cortas de las sondas 1, 1', 2 y 2', respectivamente, las sondas no modificadas químicamente protegen adicionalmente a los grupos químicos funcionales de las sondas de reaccionar entre sí.
Durante la etapa de desnaturalización de la presente invención, las sonda 1, 1', 2 y 2' se desnaturalizan a partir de los oligonucleótidos 1.1, 1.1', 2.1 y 2.1', respectivamente y los grupos químicos funcionales unidos a las secuencia cortas de las sondas 1, 1', 2 y 2' no se protegen más por los oligonucleótidos. Cuando las sondas 1 y 2 se hibridan con la secuencia diana y las sondas 1 y 2 se hibridan con la secuencia complementaria diana, los grupos químicos funcionales reaccionan para formar productos oligonucleotídicos enlazados como se ha descrito anteriormente. A continuación se ilustra un ejemplo de esta realización. (Las líneas verticales en la siguiente ilustración únicamente describen la demarcación entre la secuencia corta y la secuencia larga de cada sonda.)
17
En la figura 14, se muestra otra ilustración general de esta realización describiendo un grupo químico funcional protegido con una secuencia corta no modificada.
Ejemplos Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra el método de amplificación y detección de la presente invención para amplificar y detectar una secuencia de ADN con 48 pares de bases contenido en el genoma del Papillomavirus Humano tipo 16 (HPV-16). La región a amplificar abarca desde las bases nucleotídicas números 6634 a 6681 que tiene la secuencia:
5' -TTGTTGATACTACACGCAGTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATAT-3'
3' -AACAACTATGATGTGCGTCATGTTTATACAGTAATACACGACGGTATA-5'
(Véase Seedorf, K., et al, Virology 145, 181-185 (1985) y SEC. ID. Nº 1-2).
Se usan cuatro sondas oligonucleotídicas, denominadas 1, 1', 2 y 2', para amplificar la secuencia diana anterior. Las sondas tienen las siguientes secuencias. (Véase SEC. ID. Nº 3-6, respectivamente). Las líneas verticales dobles simplemente describen la demarcación entre las secuencias corta y larga de cada sonda. Las líneas verticales sencillas indican un enlace químico que une un grupo químico funcional con un grupo sustituyente en uno de los nucleótidos en la secuencia corta de cada sonda.
18
Las sondas oligonucleotídicas de este ejemplo se sintetizan de la siguiente manera. En primer lugar, se modifica un resto guanina de manera que posteriormente pueda unirse un grupo químico funcional deseado. Después se usan métodos convencionales para sintetizar las sondas oligonucleotídicas. Durante la síntesis del oligonucleótido, el resto guanina modificado se pone en la posición de la secuencia corta donde se tiene que localizar el grupo químico funcional. Una vez sintetizada la sonda oligonucleotídica, el grupo químico funcional se une al resto guanina modificado en la secuencia corta del oligonucleótido. En este ejemplo, los grupos funcionales X_{1} y X_{2} de las sondas 1 y 1', respectivamente, son 1,1-dióxido acetilo de 2,4,5-tricloro-3-tiofeno. Los grupos funcionales Y_{1} e Y_{2} de las sondas 2 y 2', respectivamente, son éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfo-succinimilo. Ambos grupos químicos funcionales se unen a 2'-amino-2'-desoxiguanina en la secuencia corta de cada sonda oligonucleotídica mediante sus derivados N-hidroxisuccinimido respectivos.
El resto guanina modificado se obtiene preparando una fosforamidita modificada a partir de 2'-amino-2'-desoxiguanina de acuerdo con el método descrito por Benseler, F., et al., en Nucleosides and Nucleotides 11, 1333-1351 (1992). Las etapas de la síntesis de la fosforamidita modificada a partir de 2'-amino-2'-desoxiguanina se muestran en la figura 16. Igual en 1348.
Todos los oligonucleótidos descritos en el ejemplo 1 se sintetizan y purifican mediante el siguiente procedimiento.
I. Procedimientos automatizados de síntesis
Las 2-cianoetil fosforamiditas se compran en Applied Biosystems Inc. El procedimiento incluye la condensación de las nucleósido fosforamiditas con 30 mg de un soporte (diámetro de poro 500 Angstrom) de perlas de vidrio con tamaño de poro controlado (CPG) de nucleósido derivatizado, usando un sintetizador de ADN de Applied Biosystems Inc., Tipo 380B-02. Los ciclos incluyen destritilación con ácido tricloroacético al 2% en diclorometano; condensación usando tetrazol como dador de protones activante; cubrir con anhídrido acético y dimetilaminopiridina; destritilar usando ácido tricloroacético al 2% en diclorometano; y oxidación del fosfito a fosfato con I_{2} 0,1 M/H_{2}O/lutidina/tetrahidrofurano. El ciclo temporal es de aproximadamente 30 minutos. Los rendimientos en cada etapa son prácticamente cuantitativos y se determinan recogiendo y examinando espectroscópicamente el alcohol dimetoxitritilo liberado durante la destritilación.
II. Procedimientos de desprotección y purificación de oligodesoxirribonucleótido
El soporte sólido se retira de la columna y se expone a 1 ml de hidróxido amónico concentrado a 60ºC durante 16 horas en un tubo cerrado. El amoniaco se retira y el residuo se aplica a un gel preparativo de poliacrilamida al 12% usando un tampón tris-borato (pH 8) que contiene urea 7 M. La electroforesis se realiza a 20 voltios/cm durante 5 horas después de lo cual se identifica una banda que contiene el producto iluminando con luz UV una placa fluorescente. La banda se separa y se eluye con 1 ml de agua destilada doble durante una noche a temperatura ambiente. Esta solución se filtra y se extrae el sobrenadante (3 x 300 microlitros) con n-butanol. La fase acuosa se pone en una columna Sephadex G50 (Pharmacia) (1 x 10 cm). La elución se controla mediante la absorbancia UV a 260 nm y la fracción apropiada se recoge, se cuantifica mediante absorbancia UV en un volumen fijo y se evapora hasta sequedad a temperatura ambiente en una centrífuga de vacío.
El resto químico usado para formar los grupos químicos funcionales X_{1} y X_{2}, ácido 2,4,5-tricloro-3-tiofen 1,1-dióxido acético, se prepara de acuerdo con Brown et al., EP 340.010.
Para unir covalentemente el ácido 2,4,5-tricloro-3-tiofen 1,1-dióxido acético con el grupo sustituyente 2'-NH_{2} de 2'-amino-2'-desoxiguanina, se debe modificar el ácido 2,4,5-tricloro-3-tiofen 1,1-dióxido acético con N-hidroxisuccinimida para dar N-hidroxisuccinimida del ácido 2,4,5-tricloro-3-tiofen 1,1-dióxido acético.
La N-hidroxisuccinimida del ácido 2,4,5-tricloro-3-tiofen 1,1-dióxido acético se prepara de la siguiente manera. Se disuelven 2,45 g (0,01 mol) de ácido 2,4,5-tricloro-3-tiofen 1,1-dióxido acético en 100 ml de tetrahidrofurano (THF). A esta solución se le añaden 1,3 g (0,015 mol) de N-hidroxisuccinimida (Aldrich) y 2,26 g (0,011 mol) de 1,3-diciclohexil-carbodiimida (Sigma). La solución se agita durante una noche a temperatura ambiente. Después de filtrar la solución, el disolvente se retira a presión reducida y el producto sólido blanco se lava con THF y se evapora hasta sequedad.
El resto químico usado para formar los grupos químicos Y_{1} e Y_{2}, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfo-succinimida, está disponible en el mercado (Pierce).
La modificación química del resto 2'-amino-2'-desoxiguanina de cada una de las sondas oligonucleotídicas para la unión de los grupos funcionales X_{1}, X_{2}, Y_{1} e Y_{2} se realiza de la siguiente manera.
Se liofilizan hasta sequedad alícuotas de las cuatro sondas oligonucleotídicas que contienen 2'-amino-2'-desoxiguanina que tiene una densidad óptica de 5,0 (5,0 O.D.) en viales desechables de 2 ml. Cada preparación de sonda se reconstituye en 0,75 ml de tampón borato sódico 0,2 M pH 9,3.
Para unir los grupos químicos funcionales X_{1} y X_{2}, se añaden 0,25 ml de N-hidroxisuccinimida del ácido 2,4,5-tricloro-3-tiofen 1,1-dióxido acético (véase la síntesis anterior) disuelta en N,N-dimetilformamida (DMF) a 20 mg/ml a cada uno de los viales que contienen las sondas modificadas 1 y 1'.
Para unir los grupos químicos funcionales Y_{1} e Y_{2}, se añaden 0,25 ml de éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfo-succinimida a 20 mg/ml a cada uno de los viales que contiene las sondas 2 y 2'.
La mezcla de reacción en cada uno de los viales se agita vigorosamente a temperatura ambiente (RT) durante aproximadamente 12 horas. Después, las mezclas se centrifugan y cada una de ellas se hace pasar a través de una columna Pharmacia Sephadex NAP-10 diferente para desalar las soluciones y retirar el exceso de reactivo de grupos químicos funcionales. Cada una de las soluciones resultantes se purifica con una columna FPLC (Pharmacia). El sistema FPLC está equipado con una columna Pro PRC HR 10/10 (100 mm x 10 mm de diámetro, rellena con una matriz C2/C8 de 13 \mum con base de sílice con un tamaño de poro de 300 \ring{A}). Las soluciones se purifican usando un gradiente lineal de acetonitrilo/acetato de trietilamonio 10 mM 1:1 (v/v) contra acetato de trietilamonio 10 mM que varía de 0 a 35% durante 45 minutos a una velocidad de 2 ml/min.
Las fracciones se recogen y se combinan para cada una de las sondas oligonucleotídicas. Cada una de las sondas 1, 1', 2 y 2', se liofiliza hasta sequedad y se almacena a 4ºC hasta su uso.
En la figura 7 se muestra una ilustración de los restos de guanina modificados y del resto de citosina adyacente de las secuencias cortas de las sondas 1, 1', 2 y 2'.
La amplificación de la secuencia de HPV-16 mostrada anteriormente (SEC. ID Nº 1-2) se realiza de la siguiente manera.
La secuencia de HPV-16 está contenida en un plásmido. El plásmido se prepara clonando la secuencia de HPV-16 publicada por Seedorf et al., en Virology 145, 181-185 (1985) en un vector blue script (Stratagene). Una vez clonada la secuencia de HPV-16 en el plásmido, el plásmido se disuelve en agua destilada doble a una concentración de 20 ng/ml.
Se reconstituyen 10^{11} moléculas de cada una de las sondas oligonucleotídicas en tampón de hibridación a un volumen final de 200 \mul. El tampón de hibridación contiene formamida desionizada al 30% en agua (vol/vol), NaCl 0,54 M, fosfato sódico 0,03 M (pH 7,4), EDTA 0,003 M, sulfato de dextrano al 5%, 500K m.w. (Sigma) (p/vol) y Triton X-100 al 0,1%.
La formamida desionizada se prepara añadiendo 1 gm de un lecho de resina Bio-Rad AG 501-X8(D) de malla 20-50 a 50 ml de formamida (Sigma Chemical Co.) y mezclando durante 30 minutos a temperatura ambiente. La formamida se filtra dos veces a través de papel de filtro Whatman del Nº 1.
Se usan dos tubos eppendorf, 1 y 2 (Perkin Elmer) para la reacción de amplificación. El tubo 1 se usa para el control y el tubo 2 se usa para la reacción de ensayo. El tubo 1 no contiene la secuencia diana. El tubo 2 contiene una muestra de la secuencia diana de HPV-16.
Se añaden 100 \mul de tampón de hibridación que contiene las cuatro sondas oligonucleotídicas 1, 1', 2 y 2', a cada tubo. Se añade 1 \mul de la solución que contiene el plásmido con la secuencia de HPV-16, descrito anteriormente, al tubo 2. Se añade 1 \mul de agua destilada triple al tubo 1 como control. Las soluciones en cada tubo se mezclan brevemente agitando suavemente los tubos. Se añaden lentamente 100 \mul de aceite mineral a cada tubo para formar una capa en la parte superior de la mezcla de reacción para evitar la evaporación de las soluciones durante la repetición de los ciclos de calor de la reacción de amplificación.
Ambos tubos se ponen en un ciclador térmico de ADN (Perkin Elmer, Cetus) y se someten a 40 ciclos de calentamiento y enfriamiento. Cada ciclo consiste en una incubación de 65 segundos a 90ºC y una incubación de 240 segundos a 40ºC.
Después de los ciclos, se añaden 20 \mul de cada solución a una mezcla de 2 \mul de azul de bromofenol y 40% glicerol en TBE 1 M (Tris Borato EDTA). Cada tubo se agita suavemente mezclando con vórtice.
La secuencia diana de HPV-16 amplificada se detecta tiñendo con bromuro de etidio el producto oligonucleotídico enlazado en un gel. Se cargan 20 \mul de cada solución en un gel de poliacrilamida al 12% usando tampón tris-borato (pH 8,0).
La electroforesis se realiza a 20 voltios/cm durante tres horas, después de las cuales el gel se sumerge en una solución de 100 ml de bromuro de etidio, 0,5 \mug/ml H_{2}O, durante 45 minutos a temperatura ambiente.
El gel se expone a una película fotográfica Polaroid, tipo 57 o 667 (ASA 3000) con una fuente de luz ultravioleta (UV) eficaz (72.500 \muW/cm^{2}). La película fotográfica se expone durante 0,5 segundos a f8 para detectar bandas de producto oligonucleotídico enlazado en cantidades tan pequeñas como 10 ng.
Glosario
A_{1} representa adenina con un grupo químico funcional Z que sustituye a un hidrógeno del grupo amino localizado en la posición C-6.
A_{2} representa adenina con un grupo químico funcional Z unido al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
A_{3} representa adenina con un grupo químico funcional Z que sustituye al hidrógeno localizado en la posición C-8.
A_{4} representa adenina con un grupo químico funcional Z que sustituye al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
B representa cualquier base nucleotídica.
C_{1} representa citidina con un grupo químico funcional Z que sustituye al hidrógeno del grupo amino localizado en la posición C-6.
C_{2} representa citidina con un grupo químico funcional Z unido al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo ribosa.
C_{3} representa citidina con un grupo químico funcional Z que sustituye al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
D representa los nucleótidos A_{4}, C_{3}, G_{3}, T_{3} o U_{1} modificados.
E representa los nucleótidos A_{1} o C_{1} modificados.
F representa los nucleótidos A_{3} o G_{1} modificados.
G_{1} representa guanina con un grupo químico funcional Z que sustituye al hidrógeno localizado en la posición C-8.
G_{2} representa guanina con un grupo químico funcional Z unido al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
G_{3} representa guanina con un grupo químico funcional Z que sustituye al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
H y H' representan la secuencia larga de las sondas 1 y 1', respectivamente.
I e I' representan la secuencia corta de las sondas 1 y 1', respectivamente.
J y J' representan la secuencia larga de las sondas 2 y 2', respectivamente.
K y K' representan la secuencia corta de las sondas 2 y 2', respectivamente.
L representa los nucleótidos A_{4}, C_{2}, G_{2}, T_{2} y U_{2} modificados.
R y R' representan cualquiera de los nucleótidos modificados mostrados en las figuras 2-6.
T_{1} representa timidina con un grupo químico funcional Z sustituyendo a un hidrógeno del grupo metilo localizado en la posición C-5.
T_{2} representa timidina con un grupo químico funcional Z unido al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
T_{3} representa timidina con un grupo químico funcional Z que sustituye al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
U_{1} representa uridina con un grupo funcional Z que sustituye al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
U_{2} representa uridina con un grupo químico funcional Z unido al grupo hidroxilo localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa.
X representa los grupos químicos funcionales X_{1} o X_{2}.
X_{1} representa un grupo químico funcional unido a la secuencia corta de la sonda 1.
X_{2} representa un grupo químico funcional unido a la secuencia corta de la sonda 1'.
Y representa los grupos químicos funcionales Y_{1} o Y_{2}.
Y_{1} representa un grupo químico funcional unido a la secuencia corta de la sonda 2.
Y_{2} representa un grupo químico funcional unido a la secuencia corta de la sonda 2'.
Z representa los grupos químicos funcionales X_{1}, X_{2}, Y_{1} o Y_{2}.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: Segev, David
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proceso Químico Para Amplificar y Detectar Secuencias de Ácido Nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: ImClone Systems Incorporated
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 180 Varick Street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 10014
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, versión Nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Feit, Irving N.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 28.601
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: SEG-3
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 212-645-1405
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 212-645-2054
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: papillomavirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CADENA: tipo 16
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGTTGATAC TACACGCAGT ACAAATATGT CATTATGTGC TGCCATAT 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: papillomavirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CADENA: tipo 16
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATATGGCAGC ACATAATGAC ATATTTGTAC TGCGTGTAGT ATCAACAA 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATAGCATTG TACTGCGTGT AGTATCAACA A 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATATGGCAGC ACATAATGAC ATATTGCTAT T 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGTTGATAC TACACGCAGT ACAATGCTAT T 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATAGCAATA TGTCATTATG TGCTGCCATA T 
\hfill
31

Claims (24)

1. Un proceso para amplificar y detectar, en una muestra, una molécula de ácido nucleico diana monocatenaria que comprende una secuencia diana o una molécula diana de ácido nucleico bicatenaria que comprende una secuencia diana y una secuencia complementaria diana, comprendiendo el proceso las etapas de:
(a) proporcionar un primer par oligonucleotídico complementario y un segundo par oligonucleotídico complementario, donde:
(i)
el primer par oligonucleotídico complementario consta de una sonda 1 y una sonda 1' y el segundo par oligonucleotídico complementario consta de una sonda 2 y una sonda 2';
(ii)
la sonda 1 comprende una secuencia larga H y una secuencia corta I; la sonda 1' comprende una secuencia larga H' y una secuencia corta I';
(iii)
la sonda 2 comprende una secuencia larga J y una secuencia corta K; la sonda 2' comprende una secuencia larga J' y una secuencia corta K';
(iv)
la secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga H' de la sonda 1' son complementarias entre sí;
(v)
la secuencia larga J de la sonda 2 y la secuencia larga J' de la sonda 2' son complementarias entre sí;
(vi)
la secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga J de la sonda 2 son complementarias a porciones adyacentes de la secuencia diana;
(vii)
la secuencia larga H' de la sonda 1' y la secuencia larga J' de la sonda 2' son complementarias a porciones adyacentes de la secuencia complementaria diana;
(viii)
la secuencia corta I y la secuencia corta K no se hibridan con la secuencia diana cuando la secuencia larga H y la secuencia larga J se hibridan con la secuencia diana;
(ix)
la secuencia corta I' y la secuencia corta K' no se hibridan con la secuencia complementaria diana cuando la secuencia larga H' y la secuencia larga J' se hibridan con la secuencia complementaria diana;
(x)
la secuencia corta I de la sonda 1 es complementaria a la secuencia corta K de la sonda 2 y la secuencia corta I' de la sonda 1' es complementaria a la secuencia corta K' de la sonda 2';
(xi)
el resto azúcar o base de uno o más nucleótidos de la secuencia I de la sonda 1 se modifica con el grupo químico funcional X_{1}; el resto azúcar o base de uno o más nucleótidos de la secuencia K de la sonda 2 se modifica con el grupo químico funcional Y_{1}; el grupo químico funcional X_{1} es reactivo con el grupo químico funcional Y_{1};
(xii)
el resto azúcar o base de uno o más nucleótidos de la secuencia I' de la sonda 1' se modifica con el grupo químico funcional X_{2}; el resto azúcar o base de uno o más nucleótidos de la secuencia K' de la sonda 2' se modifica con el grupo químico funcional Y_{2}; el grupo químico funcional X_{2} es reactivo con el grupo químico funcional Y_{2};
(xiii)
la secuencia corta I se hibrida con la secuencia corta K cuando la secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga J de la sonda 2 se hibridan con porciones adyacentes de la secuencia diana;
(xiv)
cuando la secuencia corta I se hibrida con la secuencia corta K, el grupo químico funcional X_{1} reacciona con el grupo químico funcional Y_{1} para formar un enlace químico;
(xv)
la secuencia corta I' se hibrida con la secuencia corta K' cuando la secuencia larga H' de la sonda 1' y la secuencia larga J' de la sonda 2' se hibridan con porciones adyacentes de una secuencia complementaria diana;
(xvi)
cuando la secuencia corta I' se hibrida con la secuencia corta K', el grupo químico funcional X_{1} reacciona con el grupo químico funcional Y_{1} para formar un enlace químico;
(b) hibridar, en el caso de que la secuencia diana y la secuencia complementaria diana formen una cadena doble, la secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga J de la sonda 2 con porciones adyacentes de la secuencia diana de manera que I y K pueden hibridarse entre sí e hibridar la secuencia larga H' de la sonda 1' y la secuencia larga J' de la sonda 2' con porciones adyacentes de la secuencia complementaria diana de manera que I' y K' pueden hibridarse entre sí, o
hibridar, en el caso de que la secuencia diana o la secuencia complementaria diana sea monocatenaria, la secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga J de la sonda 2 con porciones adyacentes de la secuencia diana de manera que I y K pueden hibridarse entre si o hibridar la secuencia larga H' de la sonda 1' y la secuencia larga J' de la sonda 2' con porciones adyacentes de la secuencia complementaria diana de manera que I' y K' pueden hibridarse entre sí,
(c) unir la sonda 1 y la sonda 2, hibridadas después de la etapa (b) con porciones adyacentes de la secuencia diana, entre sí formando un enlace químico entre los grupos químicos funcionales X_{1} e Y_{1}, formándose de esta manera un primer producto oligonucleotídico enlazado que tiene una secuencia complementaria diana;
(d) unir la sonda 1' y la sonda 2', hibridadas después de la etapa (b) con porciones adyacentes de la secuencia diana, entre sí formando un enlace químico entre los grupos químicos funcionales X_{2} e Y_{2}, formándose de esta manera un segundo producto oligonucleotídico enlazado que tiene una secuencia complementaria diana;
(e) tratar la muestra en condiciones de desnaturalización;
(f) repetir las etapas (b) a (e) un número de veces deseado; y
(g) detectar los productos oligonucleotídicos enlazados, sustituyendo al menos uno de los grupos químicos funcionales X_{1}, X_{2}, Y_{1} o Y_{2} al grupo hidroxilo o al hidrógeno localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa de un nucleótido en la secuencia corta I, I', K o K', respectivamente.
2. Un proceso para la amplificación lineal y detección, en una muestra, de una molécula de ácido nucleico diana monocatenario que comprende una secuencia diana o una molécula diana de ácido nucleico bicatenaria que comprende una secuencia diana y una secuencia complementaria diana, comprendiendo el proceso las etapas de:
(a) proporcionar un par oligonucleotídico, donde:
(i)
el par oligonucleotídico consta de una sonda 1 y una sonda 2 o una sonda 1' y una sonda 2';
(ii)
la sonda 1 comprende una secuencia larga H y una secuencia corta I; la sonda 2 comprende una secuencia larga J y una secuencia corta K;
(iii)
la sonda 1' comprende una secuencia larga H' y una secuencia corta I'; la sonda 2' comprende una secuencia larga J' y una secuencia corta K';
(iv)
la secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga J de la sonda 2 son complementarias a porciones adyacentes de la secuencia diana;
(v)
la secuencia larga H' de la sonda 1' y la secuencia larga J' de la sonda 2' son complementarias a porciones adyacentes de la secuencia complementaria diana;
(vi)
la secuencia corta I y la secuencia corta K no se hibridan con la secuencia diana cuando la secuencia larga H y la secuencia larga J se hibridan con la secuencia diana;
(vii)
la secuencia corta I' y la secuencia corta K' no se hibridan con la secuencia complementaria diana cuando la secuencia larga H' y la secuencia larga J' se hibridan con la secuencia complementaria diana;
(viii)
la secuencia corta I de la sonda 1 es complementaria a la secuencia corta K de la sonda 2 y la secuencia corta I' de la sonda 1' es complementaria a la secuencia corta K' de la sonda 2';
(ix)
el resto azúcar o base de uno o más nucleótidos de la secuencia I de la sonda 1 se modifica con el grupo químico funcional X_{1}; el resto azúcar o base de uno o más nucleótidos de la secuencia K de la sonda 2 se modifica con el grupo químico funcional Y_{1}; el grupo químico funcional X_{1} es reactivo con el grupo químico funcional Y_{1};
(x)
el resto azúcar o base de uno o más nucleótidos de la secuencia I' de la sonda 1' se modifica con el grupo químico funcional X_{2}; el resto azúcar o base de uno o más nucleótidos de la secuencia K' de la sonda 2' se modifica con el grupo químico funcional Y_{2}; el grupo químico funcional X_{2} es reactivo con el grupo químico funcional Y_{2};
(xi)
la secuencia corta I se hibrida con la secuencia corta K cuando la secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga J de la sonda 2 se hibridan con porciones adyacentes de la secuencia diana;
(xii)
cuando la secuencia corta I se hibrida con la secuencia corta K, el grupo químico funcional X_{1} reacciona con el grupo químico funcional Y_{1} para formar un enlace químico;
(xiii)
la secuencia corta I' se hibrida con la secuencia corta K' cuando la secuencia larga H' de la sonda 1' y la secuencia larga J' de la sonda 2' se hibridan con porciones adyacentes de una secuencia complementaria diana;
(xiv)
cuando la secuencia corta I' se hibrida con la secuencia corta K', el grupo químico funcional X_{2} reacciona con el grupo químico funcional Y_{2} para formar un enlace químico;
(b) hibridar, en el caso de que la secuencia diana y la secuencia complementaria diana formen una cadena doble, la secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga J de la sonda 2 con porciones adyacentes de la secuencia diana de manera que I y K pueden hibridarse entre sí e hibridar la secuencia larga H' de la sonda 1' y la secuencia larga J' de la sonda 2' con porciones adyacentes de la secuencia complementaria diana de manera que I' y K' pueden hibridarse entre sí, o
hibridar, en el caso de que la secuencia diana o la secuencia complementaria diana sea monocatenaria, la secuencia larga H de la sonda 1 y la secuencia larga J de la sonda 2 con porciones adyacentes de la secuencia diana de manera que I y K pueden hibridarse entre si o hibridar la secuencia larga H' de la sonda 1' y la secuencia larga J' de la sonda 2' con porciones adyacentes de la secuencia complementaria diana de manera que I' y K' pueden hibridarse entre
sí,
(c) unir la sonda 1 y la sonda 2, hibridadas después de la etapa (b) con porciones adyacentes de la secuencia diana, entre sí formando un enlace químico entre los grupos químicos funcionales X_{1} e Y_{1}, formándose de esta manera un producto oligonucleotídico enlazado que tiene la secuencia complementaria diana; o
(d) unir la sonda 1' y la sonda 2', hibridadas después de la etapa (b) con porciones adyacentes de la secuencia diana, entre sí formando un enlace químico entre los grupos químicos funcionales X_{2} e Y_{2}, formándose de esta manera un producto oligonucleotídico enlazado que tiene una secuencia diana;
(e) tratar la muestra en condiciones de desnaturalización;
(f) repetir las etapas (b) a (e) un número de veces deseado; y
(g) detectar los productos oligonucleotídicos enlazados, sustituyendo al menos uno de los grupos químicos funcionales X_{1}, X_{2}, Y_{1} o Y_{2} al grupo hidroxilo o al hidrógeno localizado en la posición C-2' del anillo de ribosa de un nucleótido en la secuencia corta I, I', K o K', respectivamente.
3. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el grupo químico funcional X_{1} es un electrófilo y el grupo químico funcional Y_{1} es un nucleófilo.
4. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el grupo químico funcional X_{1} es un nucleófilo y el grupo químico funcional Y_{1} es un electrófilo.
5. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el grupo químico funcional X_{2} es un electrófilo y el grupo químico funcional Y_{2} es un nucleófilo.
6. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el grupo químico funcional X_{2} es un nucleófilo y el grupo químico funcional Y_{2} es un electrófilo.
7. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el grupo químico funcional X_{1}, X_{2}, Y_{1} o Y_{2} sustituye al hidrógeno del grupo amino localizado en la posición C-6 de un resto adenina o histidina en la secuencia corta I, I', K o K', respectivamente.
8. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el grupo químico funcional X_{1}, X_{2}, Y_{1} o Y_{2} sustituye al hidrógeno localizado en la posición C-8 de un resto adenina o histidina en la secuencia corta I, I', K o K', respectivamente.
9. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el grupo químico funcional X_{1}, X_{2}, Y_{1} o Y_{2} sustituye al hidrógeno del grupo metilo localizado en la posición C-5 de un resto timidina en la secuencia corta I, I', K o K', respectivamente.
10. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la secuencia del ácido nucleico de la secuencia corta I, I', K o K' es palindrómica.
11. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el grupo químico funcional X_{1}, X_{2}, Y_{1} o Y_{2} de la secuencia corta I, I', K o K', respectivamente, de las sondas 1, 2, 1' o 2', respectivamente, está protegido adicionalmente de reaccionar entre sí mediante sondas oligonucleotídicas no modificadas químicamente, hibridándolo con dichas secuencias cortas de las sondas 1, 2, 1' o 2', respectivamente.
12. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la proporción de la longitud de la secuencia larga a la longitud de la secuencia corta de las sondas 1, 2, 1' o 2' es de 2:1 a 50:1.
13. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la proporción de la longitud de la secuencia larga a la longitud de la secuencia corta es 2:1.
\newpage
14. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la proporción de la longitud de la secuencia larga a la longitud de la secuencia corta es 3:1.
15. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la proporción de la longitud de la secuencia larga a la longitud de la secuencia corta es 5:1.
16. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la proporción de la longitud de la secuencia larga a la longitud de la secuencia corta es 10:1.
17. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la proporción de la longitud de la secuencia larga a la longitud de la secuencia corta es 20:1.
18. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la reacción entre los grupos químicos funcionales X_{1} y Y_{1} o X_{2} e Y_{2} es la sustitución de un nucleófilo por un grupo saliente electrófilo.
19. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la reacción entre los grupos químicos funcionales X_{1} y Y_{1} o X_{2} e Y_{2} es una reacción de adición de Michael.
20. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la reacción entre los grupos químicos funcionales X_{1} y Y_{1} o X_{2} e Y_{2} es una reacción de Diels-Alder.
21. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la reacción entre los grupos químicos funcionales X_{1} y Y_{1} o X_{2} e Y_{2} es la adición de un grupo tiol al doble enlace de un resto maleimido.
22. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la reacción entre los grupos químicos funcionales X_{1} y Y_{1} o X_{2} e Y_{2} es una reacción fotoquímica.
23. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la reacción entre los grupos químicos funcionales X_{1} y Y_{1} o X_{2} e Y_{2} es una reacción de [2+2] fotociclodimerización.
24. El proceso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que los pares oligonucleotídicos están presentes en un exceso molar en el intervalo de 10^{5} a 10^{15} pares por secuencia diana o secuencia complementaria diana de ácido nucleico.
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