ES2253757T3 - Sonda ramificada y metodo para la deteccion de un analito. - Google Patents
Sonda ramificada y metodo para la deteccion de un analito.Info
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Abstract
UN PROCESO PARA LA DETERMINACION DE UNA SUSTANCIA A ANALIZAR EN UNA MUESTRA MEDIANTE PUESTA EN CONTACTO DE LA MUESTRA CON UNA SONDA CONTENIENDO BASES NUCLEICAS QUE TIENE 2 O MAS GRUPOS NO NUCLEOSIDICOS MEDIADORES DE LA MARCACION EN UNAS CONDICIONES, EN LAS QUE LA SUSTANCIA OBJETO DEL ANALISIS SE UNE DIRECTA O INDIRECTAMENTE A LA SONDA, Y LA DETECCION DEL PRODUCTO DE UNION. SE PREFIERE UNA SONDA RAMIFICADA.
Description
Sonda ramificada y método para la detección de un
analito.
El objetivo de la presente invención es un método
para la detección de un analito en una muestra con ayuda de una
sonda que contiene bases nucleicas.
La detección de analitos en las muestras ha
pasado a ser el centro del interés de la analítica clínica.
Numerosas investigaciones han permitido que el límite de detección
para el analito haya podido reducirse considerablemente en
comparación con ensayos anteriores. Esto se ha notado especialmente
en el sector de la detección de ácidos nucleicos. Sin embargo,
muchos de los sistemas de detección empleados hasta el momento son
muy costosos tanto en lo que se refiere a la realización del método
como a la fabricación de los reactivos adecuados para ello y a
menudo llevan consigo muchos inconvenientes.
En la
US-A-4.683.202 se ha descrito un
método para la detección de ácidos nucleicos, que se basa en la
amplificación de los segmentos de un ácido nucleico original. Este
método se conoce como la reacción en cadena de la polimerasa. Sin
embargo, un inconveniente de este método es la difícil
cuantificación del resultado del análisis.
Mediante el empleo de sondas de ácido nucleico se
consiguen mejores resultados en cuanto a la cuantificación del
análisis, en las cuales en general se realiza una hibridación
estequiométrica. Estos métodos tienen sin embargo el inconveniente
de que son poco sensibles.
En un desarrollo posterior del ensayo
convencional de hibridación se propuso combinar o unir a cada sonda
con una multitud de secuencias idénticas de nucleótidos. El híbrido
del ácido nucleico del analito y la sonda se detectaba mediante la
hibridación de una multitud de sondas secundarias complementarias a
estas secuencias idénticas de nucleótidos. Una diversidad de
documentos tratan actualmente sobre la disposición adecuada de una
multitud de secuencias idénticas de nucleótidos en la sonda o en un
conjunto de sondas de hibridación y por tanto capaces de agregarse
(entre otras, US 5.424.188;EPS 0 248 896 B1; US 5.424.413; US
5.437.977). Por ejemplo en la
US-A-5.424.188 se ha descrito que
las secuencias idénticas de nucleótidos pueden estar suspendidas de
forma lineal. La cadena de secuencias idénticas de nucleótidos
formada puede cerrarse también en un ciclo. En la
US-A-5.124.246 se ha descrito que
las secuencias idénticas de nucleótidos pueden estar enlazadas unas
con otras a través de una estructura ramificada. Aquí se distinguen
entre ramificaciones tipo horquilla y tipo peine. Para la ejecución
técnica de la ramificación se han descrito varias posibilidades
(Nucleic Acids Research 16/11, 4937-4956, Gene 61,
253-264, Nucleic Acids Research 17/17,
6959-6967, Clinical Chemistry 35/8,
1571-1575(1989), Bioorganic and Medicinal
Chemistry Letters 4/8, 1011-1018(1994),
Nucleic Acids Research Symposium 24,
197-200(1991) y Clin. Chem. 39/4,
725-726(1993)). En la WO 9S/01365 también se
ha descrito un método de ramificación, en el cual los brazos
laterales se combinan a través de una reacción entre los tioatos de
fósforo y los grupos haloacilos. Los métodos, en los cuales la sonda
presenta una multitud de secuencias idénticas de nucleótidos para la
hibridación con sondas secundarias, pueden llevar a menudo a un
aumento de la sensibilidad de las curvas de calibración. Las sondas
necesarias para ello se fabrican primero con dificultad y segundo no
se produce ninguna saturación estequiométrica de las secuencias de
ácidos nucleicos en las sondas debido a las sondas marcadas. La
elevada sensibilidad de las pruebas se pone claramente de manifiesto
en el método de PCR (AIDS 7/Suppl.,
11-14(1993); J. Med. Virol. 43,
262-268(1994); J. Infect. Dis. 170,
1172-1179(1994); AIDS Res & Human
Retrovir. 11/3, 353-361(1995).
El objetivo de la invención consistía en mejorar
la técnica actual y en particular en preparar una sonda y un método
de detección sensible y directamente cuantificable.
El objetivo de la invención consistía pues en una
sonda con una parte analítica, una parte que contenga bases
nucleicas en una backbone (columna vertebral) y un método para la
detección de un analito en una muestra mediante el contacto de la
muestra con la sonda en unas condiciones, en las cuales el analito
se une de forma directa o indirecta a la sonda que contiene las
bases nucleicas, y la detección del producto enlazante, en el que la
sonda presenta grupos no nucleosídicos que intervienen en el
marcaje.
Un analito en un sentido del método conforme a la
invención puede ser cualquier sustancia de una muestra. En
particular se trata de una molécula reconocible inmunológicamente o
bien por medio de un apareamiento de bases. Los analitos
reconocibles inmunológicamente son, por ejemplo, los anticuerpos,
antígenos o haptenos. Los analitos reconocibles por un apareamiento
de bases son los ácidos nucleicos, por ejemplo los ácidos
ribonucleicos y desoxirribonucleicos. Dichos analitos pueden ser
detectados en prácticamente todas las muestras con el presente
método. En muchos casos, sin embargo, se ha demostrado que resulta
preferible tratar la muestra previamente de manera que el analito se
presente en una forma más apropiada para la detección. Por ejemplo,
la liberación del analito de los compartimentos, por ejemplo las
células, en las cuales el analito se hallaba originariamente
encerrado. Sin embargo en el caso de algún analito se puede tratar
de un compartimento que presente componentes reconocibles en su
superficie, por ejemplo, antígenos superficiales. Además el propio
analito puede ser amplificado incluso antes del procedimiento
conforme a la invención, por ejemplo mediante el PCR, pero se
prefiere que únicamente sea hasta una medida en la cual todavía se
pueda cuantificar la amplificación. Como líquidos apropiados, a
partir de las cuales se pueden fabricar muestras apropiadas para una
detección, se encuentran la sangre, orina, esputo o los frotis. Como
una etapa previa posible puede preverse la licuefacción de muestras
viscosas o la purificación parcial del analito, por ejemplo mediante
su inmovilización en una fase sólida. El analito puede presentarse
en un líquido, por ejemplo en forma disuelta o suspendida. Sin
embargo, el analito puede estar unido también a una fase sólida.
Como fase sólida se pueden emplear por ejemplo, las partículas de
látex, partículas magnéticas o paredes de vasos.
Como sonda en el sentido de la presente invención
se entiende una molécula, que presenta una primera parte, que
contiene bases nucleicas en una backbone, y una segunda parte,
específica del analito o que interviene en el contacto. Las bases
nucleicas son, por ejemplo, las bases que se presentan de forma
natural A, G, C, T y U o bien bases derivadas de éstas. Como
backbone se considera, por ejemplo, la estructura natural de fosfato
del azúcar. También se han descrito moléculas que poseen una
backbone de poliamida (por ejemplo, WO 91/20702). Con ayuda de la
parte específica del analito la sonda se puede enlazar directa o
indirectamente al analito. Para el caso de un enlace directo, la
naturaleza de la parte específica del analito depende de la
naturaleza del analito. Si se trata de un analito activo
inmunológicamente, el enlace puede ocurrir a través del miembro
inmunológicamente complementario al analito. Así, por ejemplo, para
la detección de un antígeno puede emplearse una sonda que contenga
un anticuerpo contra este antígeno a través de un enlace covalente o
no covalente a la parte tipo ácido nucleico. Si el analito es un
ácido nucleico, la sonda contiene una secuencia de bases nucleicas,
que es complementaria a una parte de la secuencia de bases del
analito. Use puede conseguir un enlace indirecto de la sonda al
analito de manera que la parte específica del analito esté orientada
contra una parte de una sonda mediadora, que pueda enlazarse al
analito. La sonda mediadora contiene preferiblemente una parte
específica del analito y una parte, que es capaz de enlazarse a la
parte de sonda específica del analito. En este caso resulta
preferible que la sonda y la sonda mediadora se unan a través de un
apareamiento de bases. En este caso, la sonda mediadora se elige
preferiblemente de manera que presenta una parte complementaria al
analito y una parte complementaria a la sonda. Esta acción tiene la
ventaja de que para la detección de los distintos analitos debe
emplearse ciertamente una de las sondas mediadoras incorporadas de
un modo relativamente fácil que corresponda al número de analitos
que se van a detectar, pero únicamente una sonda relativamente
compleja.
La parte de la sonda, que contiene las bases
nucleicas en una backbone, tiene tal forma que no puede formar
híbridos con otros ácidos nucleicos que se encuentren en la mezcla
de reacción o mezcla de muestras. Esta parte es exigente desde el
punto de vista estérico, ya que se ramifica varias veces. Esta
ramificación es preferiblemente covalente desde el punto de vista
químico, y se ramifica muy especialmente a través de grupos
funcionales entre las unidades de desoxirribosa. Además se trata
preferiblemente de una parte que contiene una multitud de secuencias
distintas de nucleótidos. La fabricación de dicha molécula
ramificada se ha descrito en la tecnología descrita al principio. A
continuación, deben exponerse algunos conceptos para la fabricación
de las partes ramificadas, que contienen las bases nucleicas en una
backbone.
En una primera posibilidad los ácidos nucleicos a
través de la incorporación de
N^{4}-(N-(6-tri-fluorazetil-amidocaproil)-2-aminoetil)-2'-deoxicitidina
a los ácidos nucleicos fabricados en el ámbito de la reacción de
síntesis de la fosforamidita con ayuda del
p-fenilendiisotiocianato (DITC) son reticulados como
ligantes homo-bifuncionales y se aísla una fracción
adecuada de doble rama de la mezcla del producto, por ejemplo, un
multímero en forma de tronco. La fabricación de estos multímeros se
describe en "Luminiscence-Immunoassay and
Molecular Applications"(1990, Editor: Knox Van Dyke, CRC Press,
Boca Raton, USA). Otra posibilidad de ramificación la ofrecen los
llamados monómeros de ramificación, que presentan un total de 3
grupos hidroxilo por nucleótido. El grupo hidroxilo que existe en
dirección ortogonal a los ejes 5', 3' puede estar enlazado por
ejemplo a una histidina en la posición N4 a través de un grupo
hexametileno. Durante la síntesis de oligonucleótidos según el
procedimiento de la fosforamidita, en la reacción con un nucleósido
fosfo-ramidita no solamente reacciona el grupo
5'-hidroxilo, sino que también el grupo hidroxilo
que se encuentra en la base (dotado asimismo del mismo grupo
protector). Si se emplea un monómero de ramificación, el
oligonucleótido que se encuentra en la estructura se ramifica cada
vez. Variando los grupos protectores es posible sintetizar
inicialmente una rama de ADN lineal, que sin embargo por todas
partes donde se han incorporado dichos monómeros de ramificación
posee puntos de ramificación. La descomposición selectiva siguiente
del grupo protector del segundo grupo hidroxilo facilita la síntesis
aparte de ramas laterales. Estas secuencias secundarias van como las
púas de un peine desde la secuencia primaria en adelante
(estructuras de peine). Estos métodos se describen por ejemplo en
Nucleic Acid Research 17/17, 6959-6967 (1989) y
Nucleic Acids Research Symposium 24,
197-200(1991).
Un punto importante de la invención es que la
sonda dentro de la parte que contiene las bases nucleicas en una
backbone presente grupos no nucleosídicos, mediadores del marcaje.
La invención se distingue de la tecnología actual es que las largas
secuencias idénticas de nucleótidos empleadas hasta el momento como
mediador del marcaje, son sustituidas por grupos de bajo peso
molecular, relativamente pequeños, no nucleosídicos (espaciados de
forma flexible del backbone), incorporados a unas distancias
comparativamente muy próximas. Estos grupos mediadores son poco
exigentes desde el punto de vista estérico. Los grupos mediadores
del marcaje preferidos son radicales reconocibles desde el punto de
vista inmunológico, como por ejemplo, los haptenos. Se prefieren en
el sentido de la presente invención los haptenos que reaccionan bien
en un proceso de solvatación, que presentan un determinante antígeno
fuerte. Candidatos para ello son, por ejemplo, la digoxigenina
(US-A-5.344.757), los nitrofenoles
(como por ejemplo el dinitrofenol o nitroiodofenol), azúcares
especiales, como por ejemplo, la lactosamina o medicamentos
adecuados. Por ejemplo, puede mencionarse el grupo
4-hidroxi-3-nitro-fenacetilo
(NP), por ejemplo, acoplado como carboxamida a través del EDC a un
espaciador amino como el ácido aminocaprónico y ser activado de
nuevo por la esterificación con NHS para dar
(N-hidroxisuccinimidil)-\varepsilon-aminocaproil-NP-carboxamida
(con ello, por ejemplo, puentes de fosfonato derivatizados del
aminoalquilo pueden ser atacados por bases nucleicas o azúcar), el
grupo
4-hidroxi-3-iodo-5-nitro-fenacetilo
(NIP), por ejemplo, acoplado como carboxamida a través del EDC a un
espaciador amino como el ácido aminocaprónico y ser activado de
nuevo por la esterificación con NHS para dar
(N-hidroxisuccinimidil)-\varepsilon-aminocaproil-NIP-carboxamida
(con lo que los puentes de fosfonato derivatizados del aminoalquilo
pueden ser atacados por bases nucleicas o azúcar; se describen
anticuerpos <NIP> específicos), y la
1-dimetoxitritil-3-O-((N-(2,4-dinitrofenil)-3-aminopropil)-trietilenglicol)-gliceril-2-O-(cianoetil)-(N,N-diisopropil)-fosforamidita
(DNP-TEG)(DNP-TEG puede ser
incorporado directamente por medio del proceso de fosfito en el
transcurso de la síntesis del ADN; se describen anticuerpos
específicos <DNP>).
Los grupos mediadores del marcaje pueden ser
introducidos en la parte que contiene las bases nucleicas en una
backbone, en relación a su síntesis. Esto puede ocurrir, por
ejemplo, mediante la reacción de la parte específica del ácido
nucleico con los compuestos que son capaces de establecer un enlace
covalente de los radicales con los ácidos nucleicos. Se trata de
aquellos reactivos que son adecuados con radicales funcionales del
ácido nucleico, por ejemplo, de los grupos amino exocíclicos de las
bases. Un método adecuado se ha descrito, por ejemplo, en
EP-A-O 173 251. Además es posible
sintetizar el grupo mediador de marcaje a través del
fotoacoplamiento del ácido nucleico con un reactivo fotoactivable.
Dicho método se ha descrito en
US-A-5.344.757. Aquí se ha descrito
el marcaje con un radical de digoxigenina.
Sin embargo también es posible introducir el
grupo mediador del marcaje en la forma enlazada al mononucleótido
empleado durante la síntesis de la parte que contiene la base
nucleica en una backbone. Por ejemplo, se pueden emplear
fosforamiditas en la síntesis de fosforamidita, a las que se unen
grupos mediadores de marcación o radicales protegidos a los grupos
amino exocíclicos de una base, o a los fosfodiésteres
internucleosídicos formados.
En las sondas conforme a la invención se trata
preferiblemente de compuestos sintetizados químicamente y de una
sola ramificación.
Otro procedimiento posible de fabricación se basa
en la vía de síntesis, como la descrita en WO 95/01365. La base es
un acoplamiento muy eficaz del tiofosfato o de los grupos de
ditiofosfato y de los grupos de haloazilo o haloalquilo. Se prefiere
el empleo de funciones de tiofosfato y de betabromacetamido que se
acoplan por el enlace de los puentes de tiofosforilacetamido. Los
multímeros ramificados que se pueden emplear como parte que contiene
bases nucleicas en una backbone, pueden ser fabricados del modo
siguiente. En una primera etapa un primer
oligonucleótidoderivatizado del grupo amino o aminoalquilo en
posición 5' reacciona con el acetato de
N-hidroxisuccinimedilbetabromo formando una función
beta-bromo-acetamido terminal. En
una segunda etapa reacciona un segundo oligonucleótido en la
posición 3' como éster
3'-O-fosforil-(2-aminometil)-etil-tiofosfato.
El grupo tiofosfato terminal del segundo óligonucleótido reacciona
luego por el ataque nucleófilo al átomo beta-C
bromo sustituido en un extremo 5' del primer óligonucleótido por la
unión de ambos oligonucleótidos. Seguidamente se activa la función
aminometilo para dar una función
beta-bromo-acetamido por
condensación con acetato de
N-hidroxisuccinimidil-beta-bromo.
A través de las correspondientes
funcionalizaciones en los extremos 3' y 5' de varios
oligonucleótidos y tras seguir los pasos anteriormente mencionados
se pueden crear unos trozos o piezas de oligonucleótidos mayores,
que presentarán cualquiera de los múltiples grupos
beta-bromo-acetamido
funcionalizados, que representan los puntos de ramificación
potenciales. Los grupos amino activables también pueden ser
incorporados a la rama del oligonucleótido en el ámbito de una
síntesis de fosforamidita con ayuda de derivados de
aminoalquilfosfito. Esto tiene la ventaja de que puede sintetizarse
la secuencia primaria con puntos de ramificación potenciales en un
soporte de CPG. En un paso posterior, un tercer oligonucleótido, que
se ha sintetizado al incorporar nucleótidos funcionalizados a través
de un grupo mediador de marcaje, se transforma en el éster de
tiofosfato en el extremo 5'. Por reacción de este oligonucleótido
con las funciones
beta-bromo-acetamido incorporadas se
pueden sintetizar ahora de forma directa (sin matrices) multímeros
ramificados, que equivalen a la base de la amplificación de la señal
deseada sobre el número de puntos de ramificación y el número de
marcajes detectables por ramificación. Contrariamente al método
descrito en WO 95/01365, puede incorporarse un tercer
oligonucleótido relativamente corto al método conforme a la
invención. Tal como se ha descrito, estos se marcan ya en su
acoplamiento a los puntos de ramificación a través de un grupo
mediador del marcaje,
por ejemplo, durante su síntesis a través del proceso de la fosforamidita (por ejemplo, según EP-A-0 399 330).
por ejemplo, durante su síntesis a través del proceso de la fosforamidita (por ejemplo, según EP-A-0 399 330).
El grupo mediador del marcaje se detecta
preferiblemente de un modo indirecto. Preferiblemente a través de un
conjugado de un radical afín al grupo mediador del marcaje y de un
componente indicador. Dichos radicales afines son por ejemplo
grupos, que reaccionan inmunológicamente con el grupo mediador del
marcaje formando el conjugado con el grupo mediador de marcaje. En
el caso de los haptenos se pueden emplear anticuerpos que se dirijan
contra este hapteno. En el caso de que el hapteno sea la
digoxigenina, se dispondrá de anticuerpos contra la digoxigenina
para la formación de conjugados.
Los componentes indicadores o que emiten una
señal en el sentido de la invención son grupos, que o bien pueden
ser detectados directamente, o bien de un modo preferible, pueden
ser convertidos en un componente detectable en una reacción química.
Los componentes emisores de una señal especialmente preferidos son
las proteínas relativamente pequeñas, en particular las
fotoproteínas activables por calcio. Bajo el término de
fotoproteínas activables por Ca^{2-} se engloba una familia de
sistemas moleculares luminiscentes que presenta las características
comunes siguientes.
- -
- complejo de reacción recién formado a base de un catalizador proteinoso (=apo-fotoproteína), un sustrato orgánico-químico, que está formando un enlace rígido pero no covalente y representa el propio emisor (= luminóforo), y asimismo oxígeno molecular bien fijado (enlace proteínico probablemente covalente como hidroperoxido), que se precisa para el inicio de la reacción de luminiscencia (=oxidante).
- -
- Diferenciación de sistemas enzimáticos a través de su unión a los componentes necesarios para la reacción de luminiscencia
- -
- Masa molar relativa del orden de 22000 dalton
- -
- "coelenterazina" ([2-(p-hidroxibenzil)-6-(p-hidroxifenil)-8-benzil-7-hidro-imidazopirazin-3-ona] como luminóforo
- -
- Longitud de onda del pico de emisión (\lambda_{max}) en la región azul (aprox. 470 nm)
- -
- Desencadenamiento de la reacción de luminiscencia por el enlace de los iones 2-3 Ca^{2+} a la apo-fotoproteína
- -
- Existencia de dominios de enlace del Ca^{2+} en la apo-proteína en forma de estructuras EF (=helix-lazo-helix)
- -
- Independencia de la reacción de luminiscencia del oxígeno del ambiente, es decir la fotoproteína completa presenta la reacción de luminiscencia tanto en presencia como en ausencia de O_{2}, en la atmósfera que la rodea
- -
- La reacción de la fotoproteína transcurre en forma de una técnica de rayo, es decir, emisión de luz concertada como consecuencia de la adición de iones de Ca^{2+}.
(ver aquí Blinks J R y cols., Pharmacological
Reviews 28/1, 1-93, 1976)
De esta familia de fotoproteínas activables por
el Ca^{2+} se ha estudiado en los últimos años todo acerca de su
aplicación en el campo de los ensayos de enlace
receptor-ligando. Las proteínas preferidas son por
ejemplo la obelina, haliestaurina (=mitrocomina), fialidina
(=clitina) o ecuorina. Estas proteínas tienen la propiedad de que
emiten una señal luminosa cuando son activadas, de manera que su
cantidad o presencia puede ser determinada midiendo la intensidad
del rayo. La utilización de dichas fotoproteínas en los ensayos
convencionales y el mecanismo que conduce a la formación de la
señal, se ha descrito por ejemplo en Cormier, M.L. y cols,
Photochem&Photobiol 49/4, 509-512(1989) o
bien Smith, D.F y cols., en `` Bioluminiscence and
Chemiluminiscence: Current Status (P. Stanley & L. Krick,
eds.), John Wiley and Sons, Chichester, U.K. 1991,
529-532. Las ventajas de estos componentes emisores
de una señal son un tiempo de medición corto, un rendimiento elevado
de cuantos frente a otros sistemas de marcaje de la luminiscencia y
un fondo reducido debido al reactivo, es decir un margen de medición
técnicamente mejor aprovechado del luminómetro o bien un margen de
medición más dinámico. A través de un consumo ambiental
relativamente escaso de las fotoproteínas activables por el calcio y
de sus cofactores se reduce fuertemente el tamaño del complejo de
sonda formado tras el enlace del conjugado. Además dichas
fotoproteínas activables por el calcio no interaccionan con las
estructuras de ADN, como es el caso en sales de acridinio o
distintos cromóforos.
Mediante la combinación del enlace mínimo poco
específico de pequeños conjugados de ecuorina, el ruido químico
mínimo de marcador y estimulador, la elevada actividad específica
fotoproteica así como una medición muy precisa de rayos de luz de
ecuorina a un nivel elevado de señal /ruido puede más que compararse
sorprendentemente la errónea multiplicación de la señal catalizada
enzimáticamente frente al marcaje enzimático, y contraria a la
opinión global extendida.
Los componentes emisores de una señal y los
componentes afines al grupo mediador del marcaje se unen
preferiblemente por medio de un conector o enlace que presenta una
buena reacción de solvatación con una longitud de cómo mínimo 4,
preferiblemente al menos 8 átomos. Esto significa un incremento del
grado de libertad de conformación y por tanto menos impedimento
estérico. Esto puede significar de nuevo que las reacciones de
enlace pueden transcurrir más rápidamente. Un punto importante de la
invención es que la distancia entre los componentes vecinos,
emisores de una señal unidos a la sonda, puede ser muy pequeña en la
presente invención. Esto se consigue de manera que las secuencias
idénticas de nucleótidos empleadas en la tecnología actual son
sustituidas por mononucleósidos marcados con un grupo mediador del
marcaje. La distancia entre los puntos centrales de dos grupos
mediadores del marcaje colindantes a una rama de nucleótido es menor
a 18 nucleótidos en la invención, preferiblemente menor a 15
nucleótidos, sin embargo preferiblemente mayor a 3 nucleótidos.
La distancia entre los puntos de ramificación en
el caso de moléculas multímeras ramificadas que forman un enlace
químico covalente es preferiblemente inferior a 7 nucleótidos; sin
embargo es como mínimo de 1 nucleótido.
El grupo mediador del marcaje está unido por
medio de un espaciador, es decir un elemento o miembro puente de 4 o
más átomos. Los grupos mediadores del marcaje pueden ser
intercalados en sondas ramificadas, es decir sondas que contienen
una secuencia primaria central con varios puntos de ramificación y
secuencias secundarias periféricas unidas a los puntos de
ramificación, o bien a la secuencia primaria o a la secundaria o a
ambas secuencias. Se prefiere que se incorporen en ambas.
El método conforme a la invención puede emplearse
especialmente bien en los ensayos de ácidos nucleicos, es decir si
el analito es un ácido nucleico. Las ventajas del método conforme a
la invención se verifican incluso en un método bien simple, por
ejemplo, para la detección de moléculas en una superficie, por
ejemplo de estreptavidina, que está unida a la superficie de una
pared de un tubo. En este caso puede emplearse como sonda un
oligonucleótido que contiene como parte específica del analito una
molécula de biotina. El oligonucleótido es la parte, que contiene
las bases nucleicas en una backbone, que están unidas a los grupos
mediadores del marcaje, por ejemplo, digoxigenina. En un proceso se
llena un tubo recubierto de estreptavidina de una solución, que
contiene la sonda en exceso sobre los puntos de unión de la biotina
de estreptavidina. Tras la incubación se elimina el exceso como
sonda y se incuba un conjugado de anticuerpo frente a digoxigenina y
ecuorina en un tubo con la sonda inmovilizada. Se elimina asimismo
un exceso del conjugado. A continuación se añaden los reactivos
requeridos para la determinación de ecuorina y se mide tras el
estímulo del rayo de luz. De la intensidad del rayo se obtiene la
cantidad relativa de ecuorina y por tanto de sonda conectada y por
tanto de estreptavidina en la superficie.
Una ventaja del método conforme a la invención es
que la sonda para una intensidad de señal comparable puede ser mucho
más pequeña que en los conceptos con zonas de hibridación mediadoras
de una señal. Hay se tiene que considerar que la solubilidad de los
ácidos nucleicos ramificados disminuye muy intensamente con el
aumento del tamaño. De este modo, que la sonda conforme a la
invención pueda ser claramente más pequeña que las sondas conocidas
hasta el momento para un número similar de grupos mediadores del
marcaje, permite conseguir una solubilidad mayor o bien una
densidad de marcaje elevada para un tamaño de molécula y solubilidad
similar. Se ha demostrado que en la utilización de grupos de hapteno
no nucleosídicos y componentes relativamente pequeños emisores de
una señal y por tanto conjugados (a ser posible menores de 100 kD),
puede conseguirse una estequiometría claramente mejorada de la unión
de conjugados a la sonda, es decir, el marcaje múltiple introducido
será incluso más fácil desde el punto de vista funcional. Los
motivos para ello son por un lado menos relleno de espacio que en
la sonda oligomérica de detección marcada por enzimas (por ejemplo,
fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa-), por
otro lado mayor grado de libertad de conformación, es decir, una
orientación espacial más flexible debido al espacio entre el
hapteno y la backbone así como entre el componente
anti-hapteno y el componente emisor de la señal del
conjugado. Esto facilita la cuantificación del análisis. Además en
dicho ensayo inmunológico de hibridación, contrariamente a un ensayo
de hibridación puro, la incubación del conjugado a una temperatura
comparativamente moderada, por ejemplo 37ºC, equivale a una ventaja
considerable en la retención de la actividad específica del
conjugado. En un ensayo de hibridación puro, las exigencias respecto
a especificidad (temperatura tan alta como sea posible) y respecto
a la actividad del marcaje (temperatura más bien baja) se
contradicen diametralmente. La destrucción térmica de la función del
conjugado reduce directamente la sensibilidad del ensayo analítico
alcanzada. El marcaje múltiple de la sonda conforme a la invención
se realiza más fácilmente de un modo preparatorio según el método
conforme a la invención. Además se pueden incorporar a la secuencia
primaria de la backbone, según el método conforme a la invención,
frente a las zonas de hibridación, marcajes sin un aumento
significativo de la molécula. El método conforme a la invención es
adecuado también para el control de la terapia.
En la figura 1 se muestra un complejo que se
puede formar en el transcurso de un proceso conforme a la invención
para detectar un ácido nucleico.
En la figura 2 se ha descrito un método para la
detección de ácidos ribonucleicos a partir de células.
En la figura 3 se describe un proceso para la
detección del DNS a partir de las células.
En la figura 4 se muestra la estructura de un
péptido empleada en los ejemplos (MDP).
La figura 5 muestra esquemáticamente la
reorganización del oligonucleótido 1, de un oligonucleótido
ramificada según la presente invención.
Las figuras 6-11 muestra la
secuencia de otros oligonucleótidos, que pueden ser empleados o bien
como productos finales o intermedios según la presente
invención.
La figura 12 muestra la estructura de un reactivo
empleado en los ejemplos para introducir los grupos de marcaje.
La figura 13 muestra mediciones comparativas de
la señal para los oligonucleótidos sintetizados y empleados en el
proceso de detección de ácidos nucleicos.
En la figura 1 se reconoce que los ácidos
nucleicos que se van a detectar (4) pueden estar enlazados a través
de las denominadas sondas colectoras (3) a una fase sólida
universal, que se compone de, por ejemplo, una sonda de fase sólida
biotinilizada y una pared soporte de prueba revestida de
estreptavidina. Alternativamente a ello puede renunciarse a una
sonda de fase sólida especial e inmovilizarse directamente el
complejo de reacción sobre las sondas colectoras biotinilizadas. El
ácido nucleico que se va a detectar y está enlazado de esta forma
se detectará en la fase sólida sobre una sonda mediadora (5) y la
sonda conforme a la invención (6). El enlace del ácido nucleico a
la fase sólida puede producirse al mismo tiempo en varios lugares.
El enlace de la sonda conforme a la invención con el ácido nucleico
que se va a detectar puede asimismo producirse varias veces. Aquí la
ventaja será que únicamente debe emplearse un único tipo de sondas
para la detección de distintos ácidos nucleicos. Las sondas
intermedias (5) juegan un papel que garantiza la universalidad. La
sonda que se muestra en la figura 1 está reorganizada a base de una
secuencia primaria, que presenta 16 puntos de ramificación y 16
secuencias secundarias unidas a ellos. En la secuencia primaria se
intercalan grupos (7) mediadores del marcaje, no nucleosídicos, que
no se solapan con los puntos de ramificación. Además cada una de las
secuencias secundarias contiene 3 grupos no nucleosídicos mediadores
del marcaje. Debido a las condiciones estéricas de la sonda conforme
a la invención se requiere una saturación casi estequiométrica de
los grupos no nucleosídicos, mediadores del marcaje mediante el
enlace de conjugados de un anticuerpo dirigido contra el grupo
mediador del marcaje y una fotoproteína dependiente del calcio.
En la figura 2 se muestra de forma esquemática la
evolución de un proceso de determinación para un ácido ribonucleico
(ARN) de una célula. Al comienzo del proceso, el ácido ribonucleico
está presente en la célula. En una primera etapa A la célula se
destruye (según un método conocido, por ejemplo lisis con ayuda de
proteasas), se descomponen las ARNasas de forma eventual y se libera
el ARN. En una etapa B posterior, los oligonucleótidos (5), la sonda
colectora (3) y la muestra que contiene ARN se purifican e incuban
en una microplaca de valoración. De este modo, los ácidos nucleicos
así como las sondas añadidas se unen a la fase sólida. En una etapa
C se incuban (tras el lavado de componentes de muestra no enlazados
y de sondas colectoras en exceso así como de oligonucleótidos (5))
las sondas (6) conforme a la invención en exceso por encima de la
cantidad esperada de oligonucleótidos enlazados (5) en unas
condiciones en las que el porcentaje universal de nucleótido de la
sonda puede ser hibridado con el porcentaje universal de
oligonucleótido (5). Un exceso de sondas conforme a la invención no
enlazadas se eliminará mediante una etapa de lavado. En una etapa D,
las moléculas de la sonda enlazadas a la fase sólida a través del
ácido nucleico que se va a detectar o bien a los grupos no
nucleosídicos mediadores del marcaje que en ellas se encuentran, se
equipan mediante la adición de un conjugado (8) y la incubación.
Aquí también se lavará el exceso de conjugado. En una etapa E
posterior, se añaden los reactivos requeridos para la detección de
componentes emisores de una señal, en un caso especial como iones de
calcio como estimulador. En una etapa F se indica el rayo de luz
formado G como señal de medida, que aparece en unidades de
luminiscencia relativa (RLU) respecto a la cuantificación directa de
la cantidad de ácido nucleico que se va a detectar medida y
evaluada. Puesto que la intensidad de la señal del rayo es
directamente proporcional al número de conjugados enlazados y por
tanto es proporcional a la cantidad de ácido nucleico enlazada que
se va a detectar, a partir de la intensidad del rayo puede
averiguarse directamente la cantidad de ácido nucleico.
En la figura 3 se visualiza esquemáticamente el
mismo método pero utilizando el ADN como ácido nucleico que se va a
detectar. También aquí las células son destruidas inicialmente para
liberar el ADN. El primer paso A contiene además una
desnaturalización del ADN presente eventualmente de rama doble. Esto
por ejemplo puede ocurrir a través de una etapa de calentamiento o
en condiciones alcalinas.
Las características preferidas de la invención
pueden ser las siguientes:
- 1.
- La unidad de amplificación no se forma en el transcurso del ensayo a través de la hibridación/agregación de alguna sonda, sino que es un reactivo preformado, definido en el sentido de un compuesto químico con una constitución y configuración especialmente planificadas.
- 2.
- No se emplea ninguna zona de hibridación para las posteriores sondas de detección, sino que moléculas indicadoras de bajo peso molecular a una distancia una de otra que es inferior a las longitudes habituales de las zonas de hibridación (16-26 nucleótidos), es decir, un acceso más simple preparatorio para tener una intensidad de señal superior para un tamaño de molécula similar.
- 3.
- Se emplearán grupos indicadores, pequeños, flexibles en conexión con conjugados unidos asimismo de forma flexible a través de un enlace, y pequeñas sustancias impulsoras que desencadenen la señal sin aditivos de elevado peso molecular. Esto produce una reacción funcional mejor debido a las ventajas estéricas en la orientación espacial.
- 4.
- La elevada densidad de grupos indicadores altera una capacidad eventual de (auto)-hibridación de la parte mediadora de la señal, que contiene bases nucleicas en una backbone, de la sonda, es decir, ningún requisito especial en la secuencia de nucleótidos o propiedades simétricas correspondientes de la parte mediadora de la señal.
- 5.
- Utilización del principio de un ensayo inmunológico de hibridación, es decir, mejor retención de la actividad específica del reactivo detector.
- 6.
- Se prefiere en particular el uso de una sonda de amplificación junto con un sistema de detección inerte frente al ADN, poco exigente desde el punto de vista estérico, que apoya la elevada sensibilidad del ensayo no a través de una amplificación adicional cíclica de la señal, sino de un cociente muy elevado señal-ruido, como el del sistema de la ecuorina.
- 7.
- El margen de medición técnico del luminómetro es por tanto totalmente aprovechable, es decir, se trata de un margen de medición ampliamente dinámico.
Los siguientes ejemplos deben aclarar la
invención:
La ecuorina recombinante (AquaLife^{TM}, Fa
SeaLite Sciences, Inc) se presenta en una concentración de 2,4 mg/ml
en una solución tampón de la siguiente composición:
HEPES 10 mM, NaCl 200 mM, EDTA 2 mM, DTT 2 mM, pH
8,0.
Mediante la reacción (30 min /25ºC/ agitando) con
un exceso 15 veces molar de 2-iminotiolano
(=reactivo de Traut) se introducen aproximadamente 12 hasta 16
grupos SH adicionales. La reacción se interrumpe mediante la adición
de L-lisina (\geq 15 min /25ºC/ agitando,
concentración final 10 mM) y la solución de reacción se mezcla con
una solución tampón del conjugado y se concentra.
Mediante cromatografía de afinidad (inmunosorción
positiva) el fragmento Anti-DIG-Fab
purificado (que se obtiene como antisuero de oveja) se disuelve en
una concentración \geq 5 mg/dl en un tampón de fosfato sódico 30
mM pH 7,1 y se hace reaccionar con un exceso 1.3 hasta 1.7 veces
molar de MHS (succinimidato de
maleinimido-hexanoil-N-hidroxi)
o bien SMCC
(succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato),
disuelto en DMSO (60 min /25ºC/ agitando). Aquí se incorpora aprox.
un grupo de MH por fragmento de Fab. La reacción se interrumpe
mediante la adición de L-lisina (30 min /25ºC/
agitando, concentración final 10 mM) y la solución de reacción se
estabiliza en cuanto a su pH en un solución amortiguadora de
conjugación y se concentra.
Ambos componentes activados se añadirán a la
reacción finalmente en una estequiometría de acoplamiento de
ecuorina-SH:Fab-MH =
2,5-1 en HEPES 2,5 mM, EDTA 3 mM, pH 7,5. Con ello
la concentración de ecuorina-SH resulta de
aproximadamente 1 mg/ml. La reacción se lleva a cabo durante 60 min.
a 25ºC agitando. La reacción se interrumpe mediante la adición de
cisteina o bien ditiotreitol (concentración final 2 mM o 5 mM).
El conjugado de
<DIG>-Fab-ecuorina formado se purifica a
continuación mediante una combinación de separación tras carga
(columna de intercambio iónico, Q Sepharosa FF o DEAE 5 PW) y
separación conforme al tamaño de la molécula (columna de filtración
por gel, Sephacryl S 200-HR), se concentra y se
almacena en un tampón HEPES a –70ºC.
La secuencia de las etapas de separación no puede
invertirse.
Respecto a los ensayos, las partes alícuotas se
descongelan, se diluyen en tampón de ensayo a una concentración de
la solución de trabajo, y se emplean el mismo día.
Fabricación de un oligonucleótido de fórmula
5'-X TTT TTT TAT AYG GGC ATY TGG
TGG YCT-3'(SEQ ID NO 1)
con X = biotinhexapropanolfosfato y
Y =
3-amino-1,2-propanodiolfosfato,
donde Y se marca más tarde con éster de
N-hidroxi-succinimida del ácido
digoxigenin-3-O-metilcarbonil-6-aminocaprónico.
La síntesis se lleva a cabo en un Gene Assembler
Plus de la empresa Pharmacia según los protocolos estándar de las
instrucciones de servicio. Como base nucleótido se emplean
fosforamidita estándar
5'-dimetoxitritil-N-benzoil-2'-deoxiadenosina,
la
3'-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita,
5'dimetoxitritil-N-isobutiril-2-desoxi
guanosina,
3'-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita
y
5'-dimetoxitritil-2'-desoxitimidina,
[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita
(de la empresa AB). En la posición X se emplea la
biotinfosforamidita (ABI401395) y en la posición Y la
9-fluorenil-metoxicarbonil-3-amino-1-dimetoxitritil-2-propanodiol-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita.
La escala de síntesis es de 1,3 \mumol en un alquilamino
5'-dimetoxitritil-2'-desoxi-timidina-3-succinoilo
de cadena larga (Soporte de vidrio poroso controlado). Al cabo de 20
horas a 37ºC en una solución amoniacal del 32% se descompone el
oligonucleótido del soporte y simultáneamente los grupos
beta-cianoetilo así como los grupos protectores de
los radicales amino libres. El producto bruto se purifica mediante
HPLC (Lichrosorb RP 18,8 x 250 mm, de
CS-Chromatographie Service) sobre un gradiente 0,1 m
de acetato de trietilamonio/acetonitrilo y se desaliniza mediante
diálisis. Tras la eliminación del disolvente al vacío se marca el
oligonucleótido según el protocolo de Boehringer Mannheim (EP 0 371
262) con éster N-hidroxisuccinimida del ácido
digoxigenina-3-O-metilcarbonil-5-aminocaprónico.
Tras la reacción de marcaje el oligonucleótido se dializa, concentra
y se purifica mediante cromatografía (HPLC Lichrosorb RP 18,8 x 250
mm, CS-Chromatographie Service) sobre un gradiente
0,1 M de acetato de trietilamonio/acetonitrilo y se desaliniza
mediante diálisis. La detección del marcaje con digoxigenina se
realiza según Gebevechu. G etal (1987), Nucl Acids Res 15, 4513.
Soporte de ensayo: Microplacas de
valoración blancas de Fa. Nunc, tipo MaxiSorb, revestidas con
tRSA-SA(termo-RSA-estreptavidina)
en Fa MicroCoat.
Volúmenes: 25 \mul de reactivo DIG
(mono-biotina-mono-digoxigenina-heptapéptido,
Fig 4, (MDP), en distintas concentraciones) + 50 \mul de
conjugado de <DIG>-ecuorina del ejemplo 1 en amortiguador o
estabilizador del pH de ensayo (aprox. 4 x 10^{6} RLU
/ensayo).
Formato de ensayo: incubación simultánea
de 15 min. (ensayo de la etapa I).
Separación b/f: Arandela de placa SLT SW
812 A2, prog 2 (= 4x lavado).
Amortiguador o estabilizador del pH de
ensayo: HEPES 25 mM, Kcl 150 mM, EDTA 10 mM, 2 mg/ml de RSA, 15
mg/ml RSA-c, 0,05% (v/v) Tween20,
0,1%(w/v)NaN_{3}, pH 7,0
Aparato medidor: Lector de placa Dynatech
ML 3000, Modo máximo (0,1 seg antes del intervalo máximo + 2,0 seg
después del intervalo máximo).
| pmol/l de reactivo-DIG | Señal enlazada (RLU) | Pendiente (S/N) |
| (Valor medio \pm desv.stand.) | ||
| 0,0 | 3346 \pm 457 | |
| 0,2 | 9079 | 2,71 |
| 2, | 53405 | 15,96 |
| 20, | 611900 | 182,86 |
| 200,0 | 5290000 | 1581,00 |
| 1000,0 | 26400000 | 7890,00 |
Por límite de detección* =0,032
pmol/l=8x10^{-19}moles/cavidad = aprox. 48 x 10^{5} moléculas
de analito
* calculado en base al valor nulo + 2 veces la
desviación estándar de la medición del replicado
Soporte de ensayo: Microplacas de
valoración blancas de Fa. Nunc, tipo MaxiSorb, revestidas con
tRSA-SA(termo-RSA-estreptavidina)
en Fa MicroCoat.
Volúmenes: 25 \mul de reactivo DIG
(mono-biotina-mono-digoxigenina-heptapéptido,
en distintas concentraciones) + 50 \mul de conjugado de
<DIG>-ecuorina del ejemplo 1 en amortiguador o estabilizador
del pH de ensayo (aprox. 4x10^{6} RLU /ensayo).
Formato de ensayo: incubación simultánea
de 15 min. (ensayo de la etapa 1).
Separación b/f: Arandela de placa SLT SW
812 A3, prog 2 (= 4 x lavado).
Amortiguador o estabilizador del pH de
ensayo: HEPES 25 mM, KCl 150 mM, EDTA 10 mM, 2 mg/ml de RSA, 15
mg/ml RSA-c, 0,05% (v/v) Tween20,
0,1%(w/v)NaN_{3}, pH 7,0.
Aparato medidor: Lector de placa Dynatech
ML 3000, Modo de integración.
\newpage
| Señal enlazada | |||||
| Reactivo | (RLU)-TDN | (RLU)-MDP | Factor TDN/MDP | ||
| DIG(pmol/l) | |||||
| Exp 1 | Exp 2 | Exp 1 | Exp 2 | ||
| 0,0 | 378 | 383 | 143 | 119 | |
| (170 | 182) | (200 | 196) | ||
| 0,1 | 498 | -173 | 109 | 115 | |
| 1,0 | 1075 | 1150 | 323 | 289 | 3,33 |
| 399 | |||||
| 10,0 | 7055 | 7150 | 1895 | 1935 | 3 72 |
| 3 70 | |||||
| 100,0 | 60850 | 54350 | 19250 | 19250 | 3 11 |
| 2 82 |
En este experimento se trabajó intensamente con
el MDP y TDN. Debido a una reacción de reticulación posterior en la
solución de trabajo del conjugado se llegaba a una cierta formación
de agregado, para el TDN(posterior^{1}) mayor que para el
MDP, y con ello a un enlace no específico distinto. Esta diferencia
es sin embargo demasiado pequeña para falsear de un modo
significativo los niveles de señales específicamente elevados.
En un experimento posterior se pudo observar que
mientras se trabajaba el enlace poco específico para ambos reactivos
DIG es casi idéntico (ver valores nulos para TDN y MDP en
paréntesis). En un experimento adicional con únicamente placas
revestidas de una solución de bloqueo pudo mostrarse que el enlace
poco específico para ambos reactivos DIG es prácticamente idéntico
en todo el margen de concentración.
Para aclarar este ejemplo se hace referencia a
las figuras (Fig 5-12). En la Fig. 5 X equivale a
puntos de ramificación a través del
3-amino-1,2-propanodiolfosfato,
Y equivale a puntos de marcaje a través de la
DNP-TEG-fosforamidita y Z el
acoplamiento a través del mercaptohexilo.
Para los oligonucleótidos lineales y de una sola
rama las secuencias se han de extraer de los protocolos de
secuencia. Pero para los oligonucleótidos ramificados de una sola
rama las secuencias se extraen de las figuras. Las síntesis se
realizan en un Gene Assembler Plus de la empresa Pharmacia según los
protocolos estándar de las instrucciones y los datos del fabricante
de fosforamidita.
Como piezas clave de los nucleótidos se emplean
las fosforamiditas estándar
5'-dimetoxitritil-N-benzoil-2-deoxiadenosina,
3-[(2-hexanoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita,
5'-dimetoxitritil-N-benzoil-2'-desoxicitidina,
3-[(2-hexanoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita,
5'-dimetoxitritil-N-isobutiril-2'-desoxiguanosina,
3-[(2-cianoetil)-
(N,N-diisopropil)]-fosforamidita y 5'-dimetoxitritil-2'-desoxitimidina, [(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita (de la empresa ABI). En la posición X se emplea 3-(N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)-6-aminocaprónico)-amino-1-(4,4'-dimetoxitritil)-1,2-propanodiol-2-[(cianoetil)-(N,N'-diisopropil)]fosforamidita para la bifurcación, en la posición Y el DNP-TEG-fosforamidita (Fig. 12, Glen Research 10-1985-, ver también Nucleic Acids Research 21, 1993, 1705-1712) para el marcaje y en la posición Z el 5'-tiol-modificador C6 (Glen Research 10-1926-) para el acoplamiento. La escala de síntesis es de 1,3 \mumoles en una 5'-dimetoxitritil-2'-desoxitimidina 3'-succinolalquilamino de cadena larga (soporte de vidrio de poro controlado). Al cabo de 5 horas a 55ºC en una solución amoniacal al 32%, los oligonucleótidos del soporte y al mismo tiempo los grupos \beta-cianoetilo así como los grupos amino protectores se descomponen. Los productos brutos se purifican a través de la HPLC (Lichrosorb RP 18,8 x 250 mm, de CS-Chromatographie Service) sobre un gradiente 0,1M de acetato de trietilamonio/acetonitrilo y se desalinizan mediante diálisis. El grupo tiol del oligonucleótido 2 queda desprotegido según Glen Research User Guide y luego se extrae 5 veces con éster acético y se liofiliza en Speedvac.
(N,N-diisopropil)]-fosforamidita y 5'-dimetoxitritil-2'-desoxitimidina, [(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita (de la empresa ABI). En la posición X se emplea 3-(N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)-6-aminocaprónico)-amino-1-(4,4'-dimetoxitritil)-1,2-propanodiol-2-[(cianoetil)-(N,N'-diisopropil)]fosforamidita para la bifurcación, en la posición Y el DNP-TEG-fosforamidita (Fig. 12, Glen Research 10-1985-, ver también Nucleic Acids Research 21, 1993, 1705-1712) para el marcaje y en la posición Z el 5'-tiol-modificador C6 (Glen Research 10-1926-) para el acoplamiento. La escala de síntesis es de 1,3 \mumoles en una 5'-dimetoxitritil-2'-desoxitimidina 3'-succinolalquilamino de cadena larga (soporte de vidrio de poro controlado). Al cabo de 5 horas a 55ºC en una solución amoniacal al 32%, los oligonucleótidos del soporte y al mismo tiempo los grupos \beta-cianoetilo así como los grupos amino protectores se descomponen. Los productos brutos se purifican a través de la HPLC (Lichrosorb RP 18,8 x 250 mm, de CS-Chromatographie Service) sobre un gradiente 0,1M de acetato de trietilamonio/acetonitrilo y se desalinizan mediante diálisis. El grupo tiol del oligonucleótido 2 queda desprotegido según Glen Research User Guide y luego se extrae 5 veces con éster acético y se liofiliza en Speedvac.
Después de esta etapa previa, se sintetizan los
oligonucleótidos 1XDNP (=1Xlin), 2XDNP(=2Xlin) y
2X'DNP
(=2'Xlin) así como los oligonucleótidos 1 y 2.
(=2'Xlin) así como los oligonucleótidos 1 y 2.
El oligonucleótido 1 liofilizado se disuelve en
350 \mul de solución amortiguadora de bicarbonato sódico 0,1
mol/l, pH 8,5. Se añade una solución de 1 mg de éster de
maleinimido-hexil-N-hidroxisuccinimida
en 50 \mul de acetonitrilo. La solución de reacción se agita
durante la noche en un agitador térmico a 20ºC. El oligonucleótido
se separa en una columna de NAP-25 (Pharmacia) del
maleinimida libre y de la sal, luego se concentra y se purifica
mediante cromatografía (HPLC Lichrosorb RP 18,8 x 250 mm,
CS-Chromatographie Service) sobre un gradiente 0,1 M
de acetato de trietilamonio /acetonitrilo y se desaliniza por medio
de una diálisis.
10 OD de oligonucleótido 1 se disuelve en 50
\mul de solución amortiguadora de fosfato pH 6,0 0,1M y se añaden
a 30 OD de oligonucleótido 2. La solución de reacción se agita
durante 3 días a 20ºC en un agitador térmico. La purificación se
efectúa sobre un gel de poliacrilamida al 8% separándose del
8XDNP-oligonucleótido(=8xbNA) deseado el
eductoligonucleótido y en particular el producto intermedio
6xDNP(=6XbNA). El 6XDNP-oligonucleótido se obtiene a
partir de un simple acoplamiento del oligonucleótido 2 en el
oligonucleótido 1. Se obtienen 6,6 OD de
8XDNP-oligonucleótido y 4,8 OD de
6XDNP-oligonucleótido. La pureza se determinaba
mediante HPLC (RP 18 Hypersil ODS 4,5 x 250 mm de
CS-Chromatographie Service) sobre un gradiente 0,1 M
de trietilamonioacetato/acetonitrilo.
Las sondas indicador descritas en el ejemplo 5
han sido ahora analizadas en comparación con el ensayo inmunológico
de hibridación.
Aquí
1X lin = 31 mer de oligo de ADN lineal con un
marcaje DNP 5' terminal y una secuencia 20 complementaria
3'-terminal al
HBV-oligo#33-1(Fig 7)
2X lin(también 2Xeng en Fig 13)= 41 mer de
oligo de ADN lineal con dos marcajes DNP (Pos 1 y
11.5'-3', es decir se separan una de otra por un
espaciador 9) y una secuencia 20 3' terminal complementaria al
HBV-oligo#33-1.
2X' lin(también 2Xweit en Fig 13) = 51 mer
de oligo de ADN lineal con dos marcajes DNP (Pos 1 y
21,5'-3', es decir se separan una de otra por un
espaciador 19) y una secuencia 20 3' terminal complementaria al
HBV-oligo#33-1.
6X bNA= 83 mer de oligo de ADN ramificado con un
total de seis marcajes DNP, 2 en la secuencia de origen y 2 en las
tres secuencias de ramificación, conforme a la Fig. 11.
8X bNA= 104 mer de oligo de ADN ramificado con un
total de ocho marcajes DNP, 2 en la secuencia de origen y 2 en las
tres secuencias de ramificación, conforme a la Fig. 11.
Como reactivo inmovilizador y al mismo tiempo
analito a detectar servían distintas concentraciones de un oligómero
20 nt biotinilizado en 5', complementario a la secuencia HBV.
- Soporte de ensayo: Microplacas blancas
MaxiSorp^{TM} de Fa.Nunc, revestidas de SA, o bien Microplacas
blancas no revestidas MicroLite^{TM} de Fa. Dynatech.
- Inmovilización vía
20nt-oligo-5'-biotina
(Fig 7) en un margen de concentración de 0,1-10000
pmol/l, que actúa al mismo tiempo como analito que se va a
detectar.
- Solución amortiguadora del ensayo para
experimentos de hibridación
Hepes 25 mM pH 7,4
NaCl 150 mM
EGTA 10 mM
RSA 0,5%(p/v)
Tween-20 0,5%(p/v)
NaN_{2} 0,1%
Aditivos opcionales RSA-c 0,15%
(v/v) (preparado de RSA parcialmente linealizado y acetilado de Fa.
Aurion/NL)o bien Na_{2}-tartrato x
2H_{2}O 200 mM.
- Formato de ensayo: Ensayo de fase sólida de 3
capas.
- Etapas del ensayo: Hibridación en una solución
de 20nt-oligo-biotina y
respectivamente una de las sondas indicador marcadas con DNP
descritas para una agitación de 60 min a temperatura ambiente en
Microplacas de valoración no revestidas, luego transferencia a
microplacas revestidas de SA a través de pipeta multicanal e
incubación durante 15 min. agitando a temperatura ambiente con el
fin de inmovilizar a través de la acción del
SA-biotina. Lavado (es decir separación de complejos
de reacción no ligados y ligados a la fase sólida) y seguidamente 30
min. de incubación agitando a temperatura ambiente con el fin de
reaccionar los complejos de hibridación ligados a la fase sólida con
un conjugado
MAK<DNP>M-Fab-ecuorina
(fabricado análogamente a la <DIG>-ecuorina del ejemplo 1).
Después del lavado se realiza la medición de la bioluminiscencia de
ecuorina, la intensidad de la señal es directamente proporcional a
la concentración de analito.
- Volumen de reacción: 50 \mul de 20nt
oligo-5'-biotina(=analito) + 50
\mul de sonda indicador, de ello transferencia de 50 \mul de
solución reactiva por cavidad; 50 \mul de conjugado.
- Arandela de placa Waschmodul SLT Columbus.
- Módulo de medición Dynatech ML 3000 Plate
Luminometer.
- Estimulador Tns 10 mM, pH 7,4, con CaCl_{2}
100 mM.
- Modo de medición: modo de flash integrado 0,1
seg. Antes del pico + 1,0 seg. Después del pico.
Ejemplo
6A
En las condiciones de ensayo mencionadas se medía
aquí un margen de concentración en
20nt-HBV-oligo-5'-biotina
de 0-1000 pmol/l. Las sondas marcadas con DNP se
empleaban en una concentración de 10 nmol/l. El conjugado de
<DNP>ecuorina en una concentración de aprox. 1x10^{6} RLU /
ensayo. La tabla 1 muestra los resultados.
| Ensayo inmunológico de hibridación del ADN con sondas indicador marcadas con DNP | |||||
| Analito = 20nt-Oligo-5'-Biotin [pmol/l] | Señales enlazadas [RLU] | ||||
| 1X lin | 2X lin | 2X' lin | 6X bNA | 8X bNA | |
| 0 | 3,38E+03 | 5,27E+03 | 4,02E+03 | 9,13E+03 | 1,58E+04 |
| 1 | 3,78E+03 | 2,26E+04 | 2,17E+04 | 3,84E+04 | 6,39E+04 |
| 10 | 4,52E+03 | 8,83E+04 | 8,43E+04 | 1,36E+05 | 1,91E+05 |
| 100 | 4,51E+04 | 3,58E+05 | 4,23E+05 | 4,95E+05 | 5,46E+05 |
| 500 | 3,62E+05 | 7,06E+05 | 6,90E+05 | 1,07E+06 | 1,28E+06 |
| 1000 | 5,51E+05 | 8,82E+05 | 1,00E+06 | 1,59E+06 | 1,85E+06 |
| Cocientes de señal (aumento de dinámica) normalizado a 1X lin | |||||
| Analito = 20nt-Oligo-5'-Biotin [pmol/l] | Señales enlazadas [RLU] | ||||
| 1X lin | 2X lin | 2X' lin | 6X bNA | 8X bNA | |
| 0 | 1,00 | 1,56 | 1,19 | 2,70 | 4,6 |
| 1 | 1,00 | 5,98 | 5,74 | 10,16 | 16,90 |
| 10 | 1,00 | 19,54 | 18,65 | 30,09 | 42,2 |
| 100 | 1,00 | 7,94 | 9,38 | 10,98 | 12,11 |
| 500 | 1,00 | 1,95 | 1,91 | 2,96 | 3,54 |
| 1000 | 1,00 | 1,60 | 1,81 | 2,89 | 3,36 |
| Crecimiento absoluto de la señal, respecto a 1X lin | |||||
| Analito = 20nt-Oligo-5'-Biotin [pmol/l] | Señales enlazadas [RLU] | ||||
| 1X lin | 2X lin | 2X' lin | 6X bNA | 8X bNA | |
| 0 | 1,89E+03 | 6,40E+02 | 5,75E+03 | 1,24E+04 | |
| 1 | 1,88E+04 | 1,79E+04 | 3,46E+04 | 6,01E+04 | |
| 10 | 8,38E+04 | 7,98E+04 | 1,31E+05 | 1,86E+05 | |
| 100 | 3,13E+05 | 3,78E+05 | 4,50E+05 | 5,01E+05 | |
| 500 | 3,44E+05 | 3,28E+05 | 7,08E+05 | 9,18E+05 | |
| 1000 | 3,31E+05 | 4,49E+05 | 1,04E+06 | 1,30E+06 |
El enlace o unión no específico aumenta
moderadamente a medida que crece el DNP, pero sobre todo se registra
un enorme incremento del enlace específico como función de la
intensidad del marcaje con DNP, en particular en un margen de
concentración bajo. Cuanto mayor es la cantidad de DNP, mejor es la
pendiente de la curva. En otras palabras, la amplificación de la
señal conforme a la invención permite una diferenciación básicamente
mejor de las concentraciones de analito más pequeñas respecto al
"cero", como demuestran tanto los cocientes de señal como
también los crecimientos absolutos de señal respecto a 1X lin.
Esto queda resaltado a través de los cálculos de
la sensibilidad analítica correspondiente a través de la regresión
lineal entre 0-10 pmol/l a base de la desviación
estándar doble sobre el valor medio de una determinación por
cuadruplicado del valor nulo.
| Pendiente 0-10 pM [RLU] | Precisión del valor nulo [% VK] | UNG [pmol/l] | |
| 1X lin | 1140 | 11.23 | 6.65 |
| 2X lin | 83030 | 16.32 | 0.21 |
| 2X' lin | 80280 | 40.01 | 0.40 |
| 6X bNA | 126870 | 2 83 | 0.04 |
| 8X bNA | 175200 | 9 30 | 0.167 |
El extraordinariamente bueno UNG(=límite de
detección inferior) para 6x bNA se debe en este caso a la
extremadamente buena precisión del valor nulo. En total ocurre que
UNG = f^{-1}.(X DNP)
Además de la tabla 1 se puede deducir que la
elevada generación específica de la señal pasa por encima de toda la
curva de calibración como una función de la intensidad del marcaje
con DNP.
El concepto conforme a la invención se confirma
adicionalmente mediante el hecho de que el enlace específico con
sondas 2X lin y 2X' lin no se diferencia de forma significativa, es
decir, los marcajes con 2 hapteno conducen a través de la reacción
con MAK<DNP>Fab-ecuorina 1,1) a un incremento
de la señal casi idéntico frente a 1X lin, si ambos marcajes 9 ó 19
nt se colocan separados uno de otro. En otras palabras: un espaciado
más flexible de los marcajes del hapteno (aquí espaciador de
3-aminopropil-trietilenglicol-glicerilo
con DNP-TEG) y conjugado antihapteno poco exigente
desde el punto de vista estérico (aquí
<DNP>Fab-ecuorina(1,1),M, aprox. 70 kF
unido de un modo flexible sobre el conector de 14 átomos) pueden
disponerse de forma funcional los puntos de marcaje muy
próximos.
Ejemplo
6B
Ejecución del ensayo como en el ejemplo 6A, sin
embargo con un margen de medición ampliado en un factor de 10 a
10000 pmol/l y una solución amortiguadora de dilución del conjugado
con un 0,15% de RSA-c
De nuevo los resultados (tabla 2) confirman por
duplicado el concepto conforme a la invención
- -
- sondas de 2X lin y 2X'lin no son diferenciables con respecto a la generación de enlace específico, es decir, la densidad de marcaje elevada es totalmente aplicable
- -
- el enlace específico es estrictamente una función del número de marcajes DNP introducidos, es decir la diversidad de puntos de marcaje es totalmente aplicable
| Ensayo inmunológico de hibridación del ADN con sondas indicador marcadas con DNP | |||||
| Analito = 20nt-Oligo-5'-Biotin [pmol/l] | Señales enlazadas [RLU] | ||||
| 1X lin | 2X lin | 2X' lin | 6X bNA | 8X bNA | |
| 0 | 4,38E+03 | 6,47E+03 | 4,76E+03 | 7,82E+03 | 1,45E+04 |
| 1 | 4,07E+03 | 1,12E+04 | 1,26E+04 | 1,89E+04 | 3,02E+04 |
| 10 | 5,07E+03 | 7,05E+04 | 7,49E+04 | 9,68E+04 | 1,53E+05 |
| 100 | 3,98E+04 | 3,57E+05 | 3,63E+05 | 4,78E+05 | 4,87E+05 |
| 500 | 4,78E+05 | 8,36E+05 | 8,72E+05 | 1,34E+06 | 1,61E+06 |
| 1000 | 2,05E+06 | 3,26E+06 | 3,28E+06 | 4,27E+06 | 5,02E+06 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Cocientes de señal (aumento de dinámica) normalizado a 1X lin | |||||
| Analito = 20nt-Oligo-5'-Biotin [pmol/l] | Señales enlazadas [RLU] | ||||
| 1X lin | 2X lin | 2X' lin | 6X bNA | 8X bNA | |
| 0 | 1 | 1,48 | 1,09 | 1,79 | 3,31 |
| 1 | 1 | 2,75 | 3,10 | 4,64 | 7,42 |
| 10 | 1 | 13,91 | 14,77 | 19,09 | 30,18 |
| 100 | 1 | 8,97 | 9,12 | 12,01 | 12,24 |
| 1000 | 1 | 1,75 | 1,82 | 2,80 | 3,37 |
| 10000 | 1 | 1,59 | 1,60 | 2,08 | 2,45 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Crecimiento absoluto de la señal, respecto a 1X lin | |||||
| Analito = 20nt-Oligo-5'-Biotin [pmol/l] | Señales enlazadas [RLU] | ||||
| 1X lin | 2X lin | 2X' lin | 6X bNA | 8X bNA | |
| 0 | 2,09E+03 | 3,80E+02 | 3,44E+03 | 1,01E+04 | |
| 1 | 7,13E+03 | 8,53E+03 | 1,48E+04 | 2,61E+04 | |
| 10 | 6,54E+04 | 6,98E+04 | 9,17E+04 | 1,48E+05 | |
| 100 | 3,17E+05 | 3,23E+05 | 4,38E+05 | 4,47E+05 | |
| 1000 | 3,58E+05 | 3,94E+05 | 8,62E+05 | 1,13E+06 | |
| 10000 | 1,21E+06 | 1,23E+06 | 2,22E+06 | 2,97E+06 |
Ejemplo
6C
El margen de medición era aquí de nuevo
0-1000 pmol/l, para la reducción del enlace no
específico se empleaba la solución amortiguador de ensayo de
Na_{2}-tartrato x 2 H_{2}O 200 mM (medio
estabilizador del pH rico en sales) y la concentración de la sonda
de DNP se reducía a 5 nmol/l. Efectivamente, el enlace no específico
se reducía más de la mitad con respecto al enlace específico y ello
es corroborado por los resultados anteriormente descritos; ver
también tabla 3.
| Ensayo inmunológico de hibridación del ADN con sondas indicador marcadas con DNP | |||||
| Analito = 20nt-Oligo-5'-Biotin [pmol/l] | Señales enlazadas [RLU] | ||||
| 1X lin | 2X lin | 2X' lin | 6X bNA | 8X bNA | |
| 0 | 2,72E+03 | 2,54E+03 | 4,02E+03 | 4,58E+03 | 6,86E+03 |
| 1 | 2,65E+03 | 7,54E+03 | 6,88E+03 | 1,04E+04 | 1,54E+04 |
| 10 | 2,72E+03 | 4,04E+04 | 3,66E+04 | 6,25E+04 | 9,66E+04 |
| 50 | 5,79E+03 | 1,56E+05 | 1,72E+05 | 2,50E+05 | 3,17E+05 |
| 100 | 1,49E+04 | 2,37E+05 | 2,59E+05 | 3,74E+05 | 3,93E+05 |
| 1000 | 3,12E+05 | 5,85E+05 | 6,25E+05 | 8,35E+05 | 9,29E+05 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Cocientes de señal (aumento de dinámica) normalizado a 1X lin | |||||
| Analito = 20nt-Oligo-5'-Biotin [pmol/l] | Señales enlazadas [RLU] | ||||
| 1X lin | 2X lin | 2X' lin | 6X bNA | 8X bNA | |
| 0 | 1 | 0,93 | 1,48 | 1,68 | 2,52 |
| 1 | 1 | 2,85 | 2,60 | 3,92 | 5,81 |
| 10 | 1 | 14,85 | 13,46 | 22,98 | 35,50 |
| 50 | 1 | 26,94 | 29,71 | 43,18 | 54,66 |
| 100 | 1 | 15,91 | 17,38 | 25,10 | 26,34 |
| 1000 | 1 | 1,88 | 2,00 | 2,68 | 2,98 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Crecimiento absoluto de la señal, respecto a 1X lin | |||||
| Analito =20nt-Oligo-5'-Biotin [pmol/l] | Señales enlazadas [RLU] | ||||
| 1X lin | 2X lin | 2X' lin | 6X bNA | 8X bNA | |
| 0 | -1,80E+02 | 1,30E+03 | 1,86E+03 | 4,14E+03 | |
| 1 | 4,89E+03 | 4,23E+03 | 7,75E+03 | 1,28E+04 | |
| 10 | 3,77E+04 | 3,39E+04 | 5,98E+04 | 9,38E+04 | |
| 50 | 1,50E+05 | 1,66E+05 | 2,44E+05 | 3,11E+05 | |
| 100 | 2,22E+05 | 2,44E+05 | 3,59E+05 | 3,78E+05 | |
| 1000 | 2,73E+05 | 3,13E+05 | 5,23E+05 | 6,17E+05 |
Ejemplo
6D
La ejecución del ensayo es análoga al ejemplo 6C,
pero con reactivos almacenados 4 días a +2-8ºC y una
sonda indicador 10 nM (diluida de la dilución previa 100 nM
almacenada asimismo 4d a +2-8ºC, que ha sido
preparada a partir de la solución reactivo 5 nM del ejemplo 6C).
Los resultados se recogen en la tabla 4
| Ensayo inmunológico de hibridación del ADN con sondas indicador marcadas con DNP | |||||
| Analito = 20nt-Oligo-5'-Biotin [pmol/l] | Señales enlazadas [RLU] | ||||
| 1X lin | 2X lin | 2X' lin | 6X bNA | 8X bNA | |
| 0 | 1,85E+03 | 2,36E+03 | 1,23E+03 | 1,33E+03 | 4,94E+03 |
| 1 | 2,17E+03 | 4,27E+03 | 3,26E+03 | 6,00E+03 | 7,96E+03 |
| 10 | 2,38E+03 | 1,16E+04 | 1,21E+04 | 2,00E+04 | 2,75E+04 |
| 50 | 2,94E+03 | 4,49E+04 | 4,81E+04 | 9,49E+04 | 1,28E+05 |
| 100 | 3,41E+03 | 7,83E+04 | 8,90E+04 | 1,69E+05 | 2,07E+05 |
| 1000 | 1,00E+05 | 3,63E+05 | 3,33E+05 | 5,24E+05 | 5,42E+05 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Cocientes de señal (aumento de dinámica) normalizado a 1X lin | |||||
| Analito = 20nt-Oligo-5'-Biotin [pmol/l] | Señales enlazadas [RLU] | ||||
| 1X lin | 2X lin | 2X' lin | 6X bNA | 8X bNA | |
| 0 | 1 | 1,28 | 0,68 | 0,72 | 2,67 |
| 1 | 1 | 1,97 | 1,50 | 2,76 | 3,67 |
| 10 | 1 | 4,87 | 5,08 | 8,40 | 11,55 |
| 50 | 1 | 15,27 | 16,36 | 32,28 | 43,54 |
| 100 | 1 | 22,96 | 26,10 | 49,56 | 60,70 |
| 1000 | 1 | 3,63 | 3,33 | 5,24 | 5,42 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Crecimiento absoluto de la señal, respecto a 1X lin | |||||
| Analito =20nt-Oligo-5'-Biotin [pmol/l] | Señales enlazadas [RLU] | ||||
| 1X lin | 2X lin | 2X' lin | 6X bNA | 8X bNA | |
| 0 | 5,10E+02 | -6,20E+02 | -5,20E+02 | 3,09E+03 | |
| 1 | 2,10E+03 | 1,09E+03 | 3,83E+03 | 5,79E+03 | |
| 10 | 9,22E+03 | 9,72E+03 | 1,76E+04 | 2,51E+04 | |
| 100 | 4,20E+04 | 4,52E+04 | 9,20E+04 | 1,25E+05 | |
| 500 | 7,49E+04 | 8,56E+04 | 1,66E+05 | 2,04E+05 | |
| 1000 | 2,63E+05 | 2,33E+05 | 4,24E+05 | 4,42E+05 |
Resultado: El marcaje múltiple a través
del hapteno y la elevada densidad de marcaje no conducen en ningún
caso a una estabilidad reducida en la solución, sino más bien lo
contrario. En otras palabras; el concepto conforme a la invención de
una amplificación de la señal no presenta ninguna limitación en
cuanto a la estabilidad ni practicabilidad.
| Enlace específico máximo (10000 pmol/l de analito) | |
| 1X lin | 32% recuperación relativa al ejemplo 6C(=reciente) |
| 2X lin | 62% |
| 2X' lin | 53% |
| 6X bNA | 62% |
| 8X bNA | 60% |
También aquí, con reactivos cargados, la ventaja
de la amplificación de la señal conforme a la invención no es
solamente clara con ayuda de los cocientes y crecimientos de la
señal (observada en particular en los aumentos en el paso de 6X bNA
a 8X bNA), sino que también viene resaltada por los cálculos del UNG
(análogamente al ejemplo 6A), en los cuales la precisión del valor
nulo retrocede a medida que avanza la pendiente de la curva:
| Sensibilidad analítica = UNG(pmol/l) | |
| 1X lin | 21,80 |
| 2X lin | 0,89 |
| 8X bNA | 0,39 |
\vskip1.000000\baselineskip
- DNP
- dinitrofenilo
- HBV
- Virus de hepatitis B
- SA
- estreptavidina
- RSA
- albúmina de suero ovino
- RT
- Temperatura ambiente
- MAK<X>
- anticuerpo monoclonal ante X
- DIG
- digoxigenina
- RLU
- Unidades luminosas relativas
- VK
- Coeficiente de variación
\vskip1.000000\baselineskip
1. Suelo o pared de una microplaca de
valoración.
2. Fase sólida activa, que consta de un
revestimiento de estreptavidina de la pared soporte de ensayo, mas
una sonda de fase sólida biotinilizada inmovilizada, cuya secuencia
es complementaria a una secuencia parcial de la sonda (3).
3. Sonda colectora con una secuencia parcial de
nucleótido complementaria al ácido nucleico que se va a detectar y
una secuencia parcial complementaria a la sonda de fase sólida.
4. Ácido nucleico que se va a detectar.
5. Oligonucleótido que contiene una parte
complementaria a una parte del ácido nucleico a detectar y una parte
universal complementaria a una parte de la sonda(6) que
contiene base nucleica.
6. Sonda conforme a la invención con brazos
laterales sobre una estructura de base en forma de peine.
7. Grupo mediador de marcaje no nucleosídico
ligado a la secuencia primaria o secuencias secundarias (por
ejemplo, digoxigenina).
8. Conjugado de un elemento enlazante del grupo
mediador del marcaje no nucleosídico y una fotoproteína dependiente
del calcio (por ejemplo,
antidigoxigenin-ecuorina).
(1) DATOS GENERALES
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- NOMBRE: Boehringer Mannheim GMBH
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Calle: Sandhoferstr 116
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Lugar: Mannheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- País: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (e)
- Código postal : 68298
\vskip0.500000\baselineskip
- (f)
- Teléfono: 06217594348
\vskip0.500000\baselineskip
- (g)
- Telefax: 06217594457
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: Método para detectar un analito
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- VERSIÓN LEGIBLE EN ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- soporte de datos: Floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Ordenador: IBM PC comparable
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Sistema de funcionamiento: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Software: PatentIn Release #1 versión #1.30(EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS RESPECTO A SEC ID NO 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Longitud: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Tipo: Nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Forma de rama: Monorama
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Descripción = "oligodesoxirribonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- hipotéticamente no
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Lugar: 1.27
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Otros datos/nota="El nucleótido en posición I contiene biotina ligada a Y (3-amino-1,2-propanodiol), alargada con el ácido 6-aminohexanoico y marcada con éster de digoxigenina-N-hidroxisuccinimida"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia SEQ ID NO 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTTTTATA YGGGCATYTG GTGGYCT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS RESPECTO A LA SEC ID NO 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia
\vskip0.500000\baselineskip
- (e)
- Longitud: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (f)
- Tipo: Nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (g)
- Forma de rama: Monorama
\vskip0.500000\baselineskip
- (h)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Descripción = "oligodesoxirribonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (e)
- Lugar: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (f)
- Otros datos/nota="Y significa DNP unido con ayuda de DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia SEQ ID NO 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipYTTTTTTTTT TATAGGGGCA TTTGGTGGTCT
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS RESPECTO A LA SEC ID NO 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia
\vskip0.500000\baselineskip
- (i)
- Longitud: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (j)
- Tipo: Nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (k)
- Forma de rama: Monorama
\vskip0.500000\baselineskip
- (l)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Descripción = "oligodesoxirribonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (g)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (h)
- Lugar: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (i)
- Otros datos/nota="en el extremo 5' la biotina está enlazada sobre el conector amino AMII(Boehringer Mannheim)"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia SEQ ID NO 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGACCACCAA ATGCCCCTAT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS RESPECTO A LA SEC ID NO 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia
\vskip0.500000\baselineskip
- (m)
- Longitud: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (n)
- Tipo: Nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (o)
- Forma de rama: Monorama
\vskip0.500000\baselineskip
- (p)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Descripción = "oligodesoxirribonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (j)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (k)
- Lugar: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (l)
- Otros datos/nota="En el extremo 5' DNP está unido con ayuda de DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (m)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (n)
- Lugar: 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (o)
- Otros datos/nota="Y significa DNP unido sobre DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia SEQ ID NO 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipYTTTTTTTTT YTTTTTTTTT TATAGGGGCA TTTGGTGGTCT
\hfill41
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS RESPECTO A LA SEC ID NO 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia
\vskip0.500000\baselineskip
- (q)
- Longitud: 51 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (r)
- Tipo: Nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (s)
- Forma de rama: Monorama
\vskip0.500000\baselineskip
- (t)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (e)
- Descripción = "oligodesoxirribonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (p)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (q)
- Lugar: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (r)
- Otros datos/nota="Y significa DNP unido sobre DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (s)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (t)
- Lugar: 21
\vskip0.500000\baselineskip
- (u)
- Otros datos/nota="Y significa DNP unido sobre DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia SEQ ID NO 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipYTTTTTTTTT TTTTTTTTTT YTTTTTTTTT TATAGGGGCA TTTGGTGGTCT
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS RESPECTO A LA SEC ID NO 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia
\vskip0.500000\baselineskip
- (u)
- Longitud: 65 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (v)
- Tipo: Nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (w)
- Forma de rama: Monorama
\vskip0.500000\baselineskip
- (x)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (f)
- Descripción = "oligodesoxirribonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Lugar: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Otros datos/nota="Y significa que DNP está unido sobre DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Lugar: 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Otros datos/nota="Y significa DNP unido sobre DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Lugar: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Otros datos/nota="Y significa DNP unido sobre DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Lugar: 29
\newpage
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Otros datos/nota="Y significa aquí AM W maleinimido o AM III-maleinimido-S-TTTTTTTTTYTTTTTTTTTYT-3' donde Y es DNP montado sobre DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Lugar: 34
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Otros datos/nota="Y significa DNP unido sobre DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Lugar: 39
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Otros datos/nota="Y está definido como en la posición 29"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia SEQ ID NO 6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS RESPECTO A LA SEC ID NO 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia
\vskip0.500000\baselineskip
- (y)
- Longitud: 61 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (z)
- Tipo: Nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (aa)
- Forma de rama: Monorama
\vskip0.500000\baselineskip
- (bb)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Tipo de molécula: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (g)
- Descripción = "oligodesoxirribonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (e)
- Lugar: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (f)
- Otros datos/nota="Y significa que DNP está unido sobre DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (e)
- Lugar: 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (f)
- Otros datos/nota="Y significa DNP unido sobre DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (e)
- Lugar: 21
\vskip0.500000\baselineskip
- (f)
- Otros datos/nota="Y significa DNP unido sobre DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (e)
- Lugar: 26
\vskip0.500000\baselineskip
- (f)
- Otros datos/nota="v significa AM III maleinimido o AM III-maleinimido-S-TTTTTTTTTYTTTTTTTTTYT-3' donde Y es DNP montado sobre DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (e)
- Lugar: 31
\vskip0.500000\baselineskip
- (f)
- Otros datos/nota="Y significa DNP unido sobre DNP-TEG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Nombre/clave misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (e)
- Lugar: 36
\vskip0.500000\baselineskip
- (f)
- Otros datos/nota="Y está definido como en la posición 26"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia SEQ ID NO 7
Claims (10)
1. Sonda para detectar un analito, que se
caracteriza porque está reorganizada a base de
- -
- una parte específica del analito, con la que la sonda puede enlazar directa o indirectamente con el analito, y
- -
- una parte, que contienen bases nucleicas en una backbone,
que se ramifica varias veces sobre monómeros de
ramificación y contiene una secuencia primaria con varios puntos de
ramificación y secuencias secundarias periféricas unidas a los
puntos de ramificación
que contiene grupos mediadores del marcaje, no
nucleosídicos, donde la distancia entre los puntos centrales de dos
mononucleósidos consecutivos de la sonda marcados con un grupo
mediador de marcaje es inferior a 18 nucleótidos.
2. Sonda conforme a la reivindicación 1, que se
caracteriza porque la distancia entre los puntos de
ramificación es menor de 11, preferiblemente menor de 7
nucleótidos.
3. Sonda conforme a una de las reivindicaciones 1
hasta 2, que se caracteriza porque el grupo mediador del
marcaje y la backbone de la sonda están unidos por un espaciador
\geq 4 átomos.
4. Sonda conforme a una de las reivindicaciones 1
hasta 3, que se caracteriza porque los grupos mediadores del
marcaje se incorporan en la secuencia primaria y secundaria.
5. Método para la detección de un analito en una
muestra mediante el contacto de la muestra con una sonda que
contiene bases nucleicas conforme a una de las reivindicaciones 1
hasta 4 en las condiciones, en las que el analito se enlaza directa
o indirectamente a la sonda, y detección del producto enlazante.
6. Método conforme a la reivindicación 5, que se
caracteriza porque, el producto enlazante se detecta sobre un
conjugado que tiene una masa molar \leq 100 kDa y que consta de
un grupo afín al grupo mediador del marcaje y un componente emisor
de una señal unido a través de un conector con una longitud de
\geq 4 átomos.
7. Método conforme a la reivindicación 6, que se
caracteriza porque el grupo mediador del marcaje es un
hapteno.
8. Método conforme una de las reivindicaciones 5
hasta 7, que se caracteriza porque el componente emisor de la
señal es una fotoproteína activable por calcio fabricada nativa o
recombinante
9. Estuche de ensayo para la realización de un
método conforme a una de las reivindicaciones 5 hasta 8, que se
caracteriza porque contiene una sonda conforme a una de las
reivindicaciones 1 hasta 4 así como todos los reactivos necesarios
para realizar una señal de medición.
10. Utilización de una sonda conforme a una de
las reivindicaciones 1 hasta 4 para detectar un analito en una
muestra.
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|---|---|---|---|
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