ES2352041T5 - Detección homogénea de analitos - Google Patents

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Description

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DESCRIPCIÓN
Detección homogénea de analitos
La presente invención se refiere a procedimientos para determinar la presencia o concentración de un analito en una muestra.
Antecedente de la invención
Existe un deseo en el campo de la química clínica de determinar las concentraciones de proteínas, fármacos, organismos y otros analitos en los fluidos biológicos con el fin de diagnosticar y monitorizar enfermedades. Por ejemplo, durante el infarto de miocardio el corazón libera proteínas. La detección de la presencia, concentración y evolución temporal de la liberación de dichas proteínas puede ayudar a diagnosticar un ataque cardíaco.
Las proteínas clínicamente más relevantes que actualmente se detectan en los fluidos biológicos están presentes en concentraciones superiores a 1 picogramo/ml. Por ejemplo, el antígeno prostático específico (PSA) es una proteína sérica útil en la detección de la enfermedad prostática que normalmente está presente en varones en concentraciones de aproximadamente 0-4 ng/ml. Los niveles de PSA superiores a 4 ng/ml indican sospecha de enfermedad prostática, especialmente cáncer de próstata. Este intervalo de concentración se detecta con facilidad mediante tecnología de inmunoensayo convencional. No obstante, tras la extirpación de la próstata, la concentración de PSA cae a niveles que son indetectables mediante tecnología convencional. El incremento de los niveles de PSA en pacientes de cáncer sometidos a extirpación de próstata es indicativo de recaída. Se requiere un ensayo con sensibilidad de femtogramos/ml para monitorizar estos pacientes.
Se ha estimado que existen aproximadamente 35.000 genes y hasta 500.000 proteínas en la especie humana. La mayor diversidad de proteínas, en comparación con los genes, puede justificarse por las modificaciones postranscripcionales (p. ej., corte y empalme) y postraduccionales (p. ej., fosforilación, glicosilación). Dichas modificaciones pueden alterar de forma significativa la función de las proteínas. Por tanto, incluso sutiles diferencias pueden ser clínicamente relevantes. Solamente se han identificado 290 proteínas en el plasma humano, aunque en los geles 2D se observan miles de manchas. El proteoma plasmático humano puede incluir cientos de miles de proteínas que están presentes a concentraciones demasiado bajas para que se puedan detectar con la tecnología actual. Actualmente no se dispone de procedimientos para detectar la mayoría de estas proteínas.
La dificultad de detectar concentraciones bajas de ciertos analitos se combina con el tamaño relativamente pequeño de las muestras que se pueden usar en un ensayo clínico. Por tanto, la mayoría de los inmunoensayos para los analitos proteicos dependen de la metodología heterogénea, como ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción), en los que el analito unido al anticuerpo se separa físicamente del analito no unido. Los procedimientos de detección heterogénea son complicados y requieren múltiples etapas (p. ej., unión a una fase sólida y repetidas etapas de lavado) para separar el analito unido del no unido. Estas etapas conducen a unión inespecífica y menor sensibilidad; pueden ser costosas y requerir tiempo. Por tanto, existe la necesidad de un ensayo homogéneo de alta sensibilidad que evite la unión inespecífica.
Se han descrito inmunoensayos homogéneos (aquellos que no requieren una separación física de las especies unidas y las especies libres) para moléculas pequeñas, tales como fármacos. Estos ensayos incluyen ensayo SYVA’s FRAT®, ensayo EMIT®, inmunoensayo de canalización enzimática e inmunoensayo de transferencia de energía de fluorescencia (FETI) (Dade Behring, Deerfield, Illinois); inmunoensayos de inhibidores de enzimas (Hoffman LaRoche y Abbott Laboratories): inmunoensayo de polarización de fluorescencia (Dandlicker), entre otros. Todos estos procedimientos tienen una sensibilidad limitada y sólo algunos, incluido el FETI y la canalización enzimática, son adecuados para analitos multiepitópicos grandes. Por tanto, existe una necesidad de un procedimiento homogéneo sensible para la detección de analitos grandes y/o complejos presentes en muestras biológicas y clínicas.
Sumario de la invención
La presente invención permite usar un par de unión que tiene un primer elemento de unión que comprende una primera molécula de especificidad acoplada al extremo 5’ de un primer ácido nucleico, y un segundo elemento de unión que comprende una segunda molécula de especificidad acoplada al extremo 3’ de un segundo ácido nucleico, en donde los ácidos nucleicos primero y segundo forman un duplete de estabilidad definida y limitada, en donde la primera molécula de especificidad es un primer anticuerpo y la segunda molécula de especificidad es un segundo anticuerpo.
Las moléculas de especificidad pueden ser idénticas o diferentes entre sí. En una realización, las moléculas de especificidad de la presente invención interaccionan con dos receptores de una sola célula. En otra realización, tanto la primera como la segunda moléculas de especificidad son anticuerpos monoclonales que pueden interaccionar con diferentes epítopos del mismo antígeno y, de este modo, comprenden un par de tipo sándwich.
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De forma típica, los ácidos nucleicos primero y segundo de los pares de unión son ácidos nucleicos monocatenarios que pueden ser ADN, ARN o APN, pero pueden ser ácidos nucleicos parcialmente bicatenarios o análogos de los mismos. En ciertas realizaciones de la invención, al menos uno de los ácidos nucleicos es una molécula de ADN/ARN quimérico. El duplete entre los ácidos nucleicos puede formarse entre extremos de los ácidos nucleicos o
5 pueden comprender una secuencia de ácido nucleico interno. En una realización preferente, el ácido nucleico es adecuado para amplificar mediante PCR, LCR, SDA o TMA.
La presente invención también proporciona procedimientos para detectar un analito usando elementos de unión según la reivindicación 1. Según una realización, un par de unión, como se ha descrito anteriormente, se pone en contacto con un analito para formar un complejo. El ácido nucleico del par de unión se disocia y después se
10 reasocia. Tras la extensión de los extremos 3’ del duplete reformado, que se encuentra predominantemente en los pares de unión unidos al analito, el duplete reformado puede detectarse, de forma típica por amplificación de un ácido nucleico que comprende el duplete mediante PCR. Los restos de fondo se pueden reducir de forma significativa si los cebadores de PCR solamente se unen a los sitios generados mediante extensión de los extremos 3’ del duplete reformado, pero no a los ácidos nucleicos de los propios elementos de unión.
15 Los productos de amplificación se pueden detectar mediante uno cualquiera de varios procedimientos, incluidos tinción con bromuro de etidio, tinción de plata, autorradiografía, transferencia por manchas, transferencia por ranuras, transferencia de tipo Southern e incorporación de una molécula fluorescente, una molécula inactivadora de fluorescencia, un compuesto quimioluminiscente, una molécula inactivadora de quimioluminiscencia, un compuesto bioluminiscente o un nucleótido fluorescente.
20 En una realización de la invención, uno de los ácidos nucleicos del par de unión es una molécula de ADN/ARN quimérico y el otro es una molécula de ADN, en donde el duplete formado entre los dos ácidos nucleicos tiene una región híbrida corta de ADN/ADN y una región híbrida más larga de ADN/ARN. El duplete intacto de esta realización es estable, pero se puede desestabilizar mediante digestión con RNasa, que además reduce los restos de fondo debido a los elementos de unión que no se unen al analito.
25 En una realización, la invención proporciona un ensayo homogéneo para detectar proteínas, virus y células clínicamente relevantes que es específico y muy sensible.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 ilustra el contenido, la conformación y el esquema de unión general de pares de unión.
La Fig. 2 proporciona un esquema general de la formación de duplete, extensión en 3’ y amplificación por 30 PCR de un par de ácido nucleico que comprende la SEC ID N°:1 y la SEC ID N°:2.
La Fig. 3 proporciona un esquema general de la formación de duplete, extensión en 3’ y amplificación por PCR de un par de ácido nucleico que comprende la SEC ID N°:1 y la SEC ID N°:3.
La Fig. 4 muestra la amplificación mediante PCR en tiempo real (inicio en caliente) de las hebras de oligonucleótidos solapantes de 9 y de 15 pares de bases.
35 La Fig. 5 muestra una representación esquemática de un NADIA™ homogéneo.
La Fig. 6 muestra la orientación y la formación de duplete de un par de ácido nucleico en el que uno de los oligonucleótidos [SEC ID N°:1] está unido a través de un separador unido a su extremo 3’ y el otro oligonucleótido [SEC ID N°:3] está unido directamente mediante su extremo 5'.
La Fig. 7 ilustra el procedimiento de uso de oligonucleótidos de ARN/ADN quiméricos en la detección de
40 analitos. “R” indica la posición de bases ribonucleotídicas, “D” indica la posición de bases desoxiribonucleotídicas y “S” indica la posición de moléculas separadoras.
La Fig. 8 muestra un gráfico de la detección de PSA mediante NADIA™ homogéneo.
Descripción detallada de la invención
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son ejemplos y
45 explicaciones únicamente y no son restrictivas de la invención reivindicada. En el presente documento, el uso del singular incluye el plural, a menos que específicamente se indique lo contrario. En el presente documento, “o” significa “y/o”, a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término “que incluye”, así como otras formas, tales como “incluye” e “incluido”, no es limitativo. Los titulares de la sección usados en el presente documento son con motivos organizativos y no deben interpretarse como limitativos del objeto descrito.
50 Definiciones
Antes de continuar con una descripción de las realizaciones específicas de la presente invención, se definirán una serie de términos que se describirán con detalle.
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A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura usada en relación con ellas, y los procedimientos, técnicas y métodos de laboratorio descritos en el presente documento son los conocidos en la técnica a la que pertenecen. Los símbolos y abreviaturas químicos estándar se usan de forma indistinta con los nombres completos representados por dichos símbolos. Por consiguiente, por ejemplo, se entiende que los términos “hidrógeno” y “H” tienen un significado idéntico. Se pueden usar técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, liberación y tratamiento de pacientes. Se pueden usar técnicas estándar para metodología de ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos, cultivo de tejidos y similares. Se pueden realizar reacciones y técnicas de purificación usando, p. ej., kits de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como normalmente se efectúan en la técnica o tal como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores pueden realizarse, en general, de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describen en varias referencias generales o más específicas que se citan y tratan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, p. ej., Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, (2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)).
“Elemento de unión”, como se usa en el presente documento, se refiere a un conjugado formado entre una molécula de especificidad y un ácido nucleico. Las composiciones que contienen dos elementos de unión unidos por un duplete de estabilidad definida y limitada formado entre los ácidos nucleicos del elemento de unión se denominan “pares de unión”. Los pares de unión se combinan con un analito para formar un complejo par de unión-analito que, en el presente documento, se denomina simplemente “complejo”.
En el presente documento, el término “analito” se refiere a cualquier sustancia que es deseable detectar en un ensayo y que puede estar presente en una muestra. El analito puede ser, sin limitaciones, cualquier sustancia. En una realización preferente de la invención, un analito comprende una sustancia para la cual existe un anticuerpo natural o para la cual se puede preparar un anticuerpo. El analito puede ser, por ejemplo, una proteína, un polipéptido, un hapteno, un hidrato de carbono, un lípido, un fármaco, una célula o cualquier otra de una amplia variedad de moléculas biológicas o no biológicas, complejos o combinaciones de los mismos. En otra realización, el analito es un ácido nucleico. En otra realización más, el analito es un anticuerpo. En otra realización más, el analito es una célula (animal, vegetal, fúngica, bacteriana, etc.) o un subcomponente u orgánulo (p. ej., mitocondria) de la misma.
Los analitos ligandos polivalentes que se pueden detectar usando procedimientos de la presente invención serán, normalmente, poli(aminoácidos), es decir, polipéptidos, proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos y combinaciones de los mismos. Dichas combinaciones incluyen componentes de células, tejidos, bacterias, virus, paredes celulares, membranas celulares, orgánulos celulares, cromosomas, genes, mitocondrias, núcleos y similares. Según un aspecto de la invención algunos analitos no contienen ácido nucleico.
Usando los procedimientos de la presente invención se puede detectar de forma ventajosa una amplia variedad de analitos proteicos. Dichos analitos proteicos se pueden clasificar según la familia a la que pertenezcan, teniendo cada familia similares características estructurales, funciones biológicas, relación con microorganismos específicos (especialmente microorganismos causantes de enfermedades), y similares. Las familias de proteínas de particular interés para la presente invención incluyen, por ejemplo, inmunoglobulinas, citoquinas, enzimas, hormonas, antígenos de cáncer, marcadores nutricionales, antígenos específicos de tejido y agentes de guerra biológica. Estos analitos proteicos pueden estar presentes en sangre, suero, plasma, líquido espinal, líquido sinovial, saliva, orina, células o tejidos.
Los siguientes son ejemplos de clases de analitos proteicos relacionados por estructura que se pueden detectar usando los procedimientos de la presente invención:
protaminas
histonas
albúminas
globulinas
escleroproteínas
fosfoproteínas
mucoproteínas
Los siguientes ejemplos son proteínas clínicamente importantes que se encuentran en el plasma humano que se pueden detectar usando los procedimientos de la presente invención:
α1-Lipoproteína
α1-Antitripsina
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Transcortina 4,6S-Postalbúmina Pobre en triptófano α1-Glicoproteína
5 α1χ-Glicoproteína Globulina de unión a tiroxina Inhibidor de inter-α-tripsina Gc-globulina
10 (Gc 1-1) (Gc 2-1) (Gc 2-2)
Haptoglobina
15 (Hp 1-1) (Hp 2-1) (Hp 2-2)
20 Ceruloplasmina Colinesterasa α2 -Lipoproteína(s) Mioglobina Proteína C reactiva
25 α2 -Macroglobulina α2 -HS-glicoproteína Zn-α2-glicoproteína α2 -Neuramino-glicoproteína Eritropoyetina
30 β-lipoproteína Transferrina Hemopexina Fibrinógeno Plasminógeno
35 β2-glicoproteína I β2-glicoproteína II Inmunoglobulina G
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(IgG) o γG-globulina
Fórmula mol.: γ2k2 o γ2λ2 Immunoglobulina A (IgA) o γA-globulina Fórmula mol.: (α2 κ2)n o (α2 κ2)n Immunoglobulina M (IgM) o γM-globulina 5 Fórmula mol.: (µ2 κ2)5 o (µ2 λ2)5 Immunoglobulina D (IgD) o γD-Globulina (γD) Fórmula mol.: (.delta.2 κ2) o (.delta. 2 λ2) Immunoglobulina E (IgE) o γE-Globulina (γE)
Fórmula mol.: (ε2 κ2)o (ε2 λ2)
Cadenas ligeras κ y λ libres 10 Factores del complemento:
C’1 C'1q C’1r
15 C'1s C’2 C'3 β1A α2D
20 C’4 C’5 C’6 C’7 C’8
25 C’9 Los factores de coagulación de la sangre importantes que se pueden detectar usando los procedimientos de la presente invención incluyen los ejemplos enumerados en la siguiente tabla.
Tabla 1. FACTORES DE COAGULACIÓN DE LA SANGRE
Designación Internacional
Nombre
I
Fibrinógeno
II
Protrombina
IIa
Trombina
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(continuación)
Tabla 1. FACTORES DE COAGULACIÓN DE LA SANGRE
Designación Internacional Nombre
III
Tromboplastina tisular V y VI Proacelerina, globulina aceleradora VII
Proconvertina VIII Globulina antihemofílica (AHG) Factor Christmas, componente de la tromboplastina
IX
plasmática (PTC) X Factor Stuart-Prower, autoprotrombina III XI Tromboplastina plasmática XIII Factor estabilizante de la fibrina
Las hormonas proteicas importantes que pueden ser detectadas usando los procedimientos de la presente invención incluyen: 5 Hormonas peptídicas y proteicas Hormona paratiroidea (paratohormona) Tirocalcitonina Insulina Glucagón Relaxina 10 Eritropoyetina Melanotropina (hormona estimulante de melanocitos; intermedina) Somatotropina (hormona de crecimiento) Corticotropina (hormona adrenocorticotropa) Tirotropina Hormona foliculoestimulante 15 Hormona luteinizante (hormona estimulante de células intersticiales) Hormona luteomamotrópica (luteotropina, prolactina) Gonadotropina (gonadotropina coriónica) Hormonas tisulares Secretina 20 Gastrina Angiotensina I y II Bradiquinina Lactógeno placentario humano Citoquinas 25 IL1 IL 2
5
10
15
20
25
30
35
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IL 4
IL 6
IL 8
IL 10
EGF
TNF
NGF
Antígenos de cáncer
PSA
CEA
α-fetoproteína
Fosfatasa ácida
CA 19,9
CA125
Antígenos específicos de tejidos
Fosfatasa alcalina
Mioglobina
CPK-MB
Troponina
BNP
Pro-BNP
Calcitonina
Proteína básica de la mielina
Hormonas peptídicas de la neurohipófisis
Oxitocina
Vasopresina
Factores de liberación (RF) CRF, LRF, TRF, Somatotropina-RF, GRF, FSH-RF, PIF, MIF
Ricina
Toxina diftérica
Toxina del botulismo
Enterotoxina B estafilocócica Las bacterias y virus también son analitos que se pueden detectar usando los procedimientos de la presente invención. Entre estos analitos biológicos se incluyen, entre otros:
Corinebacterias
Corynebacterium diphtheria
Neumococos
E05858303
30-09-2014
Diplococcus pneumoniae
Estreptococos
Streptococcus pyrogenes Streptococcus salivarus
5 Estafilococos
Staphylococcus aureus Staphylococcus albus
Neisseria
Neisseria meningitidis 10 Neisseria gonorrhea Enterobacterias Coliformes
Escherichia coli Aerobacter aerogenes 15 Klebsiella pneumoniae Salmonellae
Salmonella typhosa Salmonella choleraesuis Salmonella typhimurium
20 Shigellae Shigella dysenteria Shigella schmitzii Shigella arabinotard Shigella flexneri
25 Shigella boydii Shigella sonnei
Otros bacilos entéricos
Proteus vulgaris Proteus mirabilis
30 Proteus species Proteus morgani Pseudomonas aeruginosa Alcaligenesfaecalis Vibrio cholerae
35 Grupo Hemophilus-Bordetella
Hemophilus influenza
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Hemophilus ducryi Hemophilus hemophilus Hemophilus aegyplicus Hemophilus parainfluenza
5 Bordetalla pertussis Pasteurellae
Pasteurella pestis
Pasteurella tulareusis
Brucellae
10 Brucella melitensis Brucella abortus Brucella suis Bacilos aerobios formadores de esporas Bacillus anthracis
15 Bacillus subtilis Bacillus megaterium Bacillus cereus Bacilos anaerobios formadores de esporas Clostridium botulinum
20 Clostridium tetani Clostridium perfringens Clostridium novyi Clostridium septicum Clostridium histolyticum
25 Clostridium tertium Clostridium bifermentans Clostridium sporogenes Micobacterias Mycobacterium tuberculosis hominis
30 Mycobacterium bovis Mycobacterium avium Mycobacterium leprae Mycobacterium paratuberculosis Actinomicetos (bacterias similares a los hongos)
35 Actinomyces Isaeli Actinomyces bovis Actinomyces naeslundii
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Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis
Las espiroquetas
Treponema pallidum Treponema pertenue Treponema carateum Borrelia recurrentis Leptospira icterohemorrhagiae Leptospira canicola Trypanasomes
Micoplasmas
Mycoplasma pneumoniae
Otros patógenos Rickettsiae (parásitos similares a las bacterias)
Rickettsia prowazekii Rickettsia mooseri Rickettsia rickettsii Rickettsia conori Rickettsia australis Rickettsia sibiricus Rickettsia akari Rickettsia tsutsugamushi
Clamidias (parásitos bacterianos/víricos no clasificables) Agentes de clamidia (denominación incierta) Hongos
Cryptococcus neoformans Blastomyces dermatidis Hisoplasma capsulatum Coccidioides immitis Paracoccidioides brasiliensis Candida albicans Aspergillus fumigatus Mucor corymbifer (Absidia corymbifera) Rhizopus oryzae Rhizopus arrhizua Phycomycetes Rhizopus nigricans Sporotrichum schenkii
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Flonsecaea pedrosoi Fonsecacea compact Fonsecacea dermatidis Cladosporium carrionii
5 Phialophora verrucosa Aspergillus nidulans Madurella mycetomi Madurella grisea Allescheria boydii
10 Phialophora jeanselmei Microsporum gypseum Trichophyton mentagrophytes Keratinomyces ajelloi Microsporum canis
15 Microsporum adouini Trichophyton rubrum Virus Adenovirus Herpesvirus
20 Herpes simplex Varicella (Chicken pox) Herpes Zoster (Shingles) Virus B Cytomegalovirus
25 Poxvirus Variola (viruela) Vaccinia Poxvirus bovis Paravaccinia
30 Molluscum contagiosum Picomavirus Poliovirus Coxsackievirus Echovirus
35 Rhinovirus Mixovirus
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Parainfluenza (1-4) Virus de la parotiditis Virus de la enfermedad de Newcastle Virus del sarampión
5 Virus de la peste bovina Virus del moquillo canino Virus sincitial respiratorio Virus de la rubéola
Arbovirus
10 Virus de la encefalitis equina oriental Virus de la encefalitis equina occidental Virus Sindbis Virus Chikungunya Virus de los bosques de Semliki
15 Virus Mayora Virus de la encefalitis de San Luis Rickettsia prowazekii Virus de la encefalitis californiana Virus de la fiebre por garrapatas de Colorado
20 Virus de la fiebre amarilla Virus del dengue
Reovirus
Reovirus Tipos 1-3
Retrovirus 25 Virus de la inmunodeficiencia humana I y II (VIH) Virus linfotrópico de células T humanas I y II (HTLV)
Hepatitis
Virus de la hepatitis A Virus de la hepatitis B 30 Virus de la hepatitis C
Virus tumorales
Virus de la leucemia de Rauscher Virus Gross Virus de la leucemia de Maloney
35 Virus del papiloma humano
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Además, puede ser deseable detectar el tejido o las células normales o enfermos de un paciente. La presencia o ausencia de determinadas células de cáncer o de otro tipo en circulación, por ejemplo, puede ser un diagnóstico de la enfermedad. Por tanto, las células endógenas de un paciente humano son analitos que se pueden detectar de forma ventajosa usando los procedimientos de la presente invención.
En el presente documento, el término “muestra” se refiere a una alícuota de material, con frecuencia una solución acuosa o una suspensión acuosa derivada de material biológico. Las muestras para analizar la presencia de un analito mediante los procedimientos de la presente invención incluyen, por ejemplo, células, tejidos, homogeneizados, lisados, extractos, proteínas purificadas o parcialmente purificadas y otras moléculas biológicas y mezclas de las mismas. Ejemplos no limitativos de muestras usadas de forma típica en los procedimientos de la invención incluyen fluidos corporales humanos y animales tales como sangre entera, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, esputo, lavados bronquiales, aspirados bronquiales, orina, fluidos linfáticos y varias secreciones externas de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, glóbulos blancos, mielomas y similares; fluidos biológicos tales como sobrenadantes de cultivo celular; muestras de tejido que pueden o no fijarse; y muestras de células que pueden fijarse o no.
Las muestras usadas en los procedimientos de la presente invención variarán según el formato del ensayo y la naturaleza de los tejidos, células, extractos u otros materiales, especialmente materiales biológicos, que se van a analizar. En la técnica se conocen bien los procedimientos para preparar, por ejemplo, homogeneizados y extractos, tales como extractos proteicos, de células u otras muestras, y pueden adaptase con facilidad con el fin de obtener una muestra que sea compatible con los procedimientos de la invención.
En el presente documento, el término “contactar” se refiere en general a proporcionar acceso de un componente, reactivo, analito o muestra a otro. Por ejemplo, contactar puede implicar mezclar una solución que comprende un par de unión con una muestra que comprende un analito. La solución que comprende un componente, reactivo, analito o muestra puede también comprender otro componente o reactivo, tal como dimetilsulfóxido (DMSO) o un detergente, que facilita el mezclado, interacción, captación u otro fenómeno físico o químico ventajoso para el contacto entre componentes, reactivos, analitos y/o muestras. En una realización de la invención, contactar implica añadir una solución que comprende un par de unión a una muestra que comprende un analito usando un aparato de administración, tal como un dispositivo basado en una pipeta o un dispositivo basado en una jeringuilla.
En el presente documento, el término “detectar” se refiere a cualquier procedimiento para verificar la presencia de una molécula dada. Las técnicas usadas para conseguir esto pueden incluir, de forma no limitativa, PCR, secuenciación de nucleótidos, secuenciación por PCR, tecnología de baliza molecular, hibridación, hibridación seguida por PCR, fluorescencia, radiomarcaje, fosforescencia y absorbancia. Ejemplos de reactivos que se pueden usar para detección incluyen, de forma no limitativa, radiomarcadores, marcadores enzimáticos (p. ej., peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina), fluorescencia, fosforescencia, bioluminiscencia, quimioluminiscencia, marcadores de afinidad (p. ej., biotina, avidina o estreptavidina) y otros reactivos bien conocidos por los expertos en la técnica.
En el presente documento, el término “distinguible” se refiere a una capacidad para distinguir experimentalmente entre diferentes marcadores, especies o analitos. En determinadas realizaciones de la invención, se puede usar un par de unión o ensayo de la presente invención para detectar múltiples analitos. En algunas de estas realizaciones, ninguno de los marcadores de ácido nucleico consistirá en secuencias idénticas tanto en longitud como en secuencia. Dos marcadores pueden comprender la misma secuencia central, pero los marcadores serán distinguibles sobre la base del tamaño y/o diferentes secuencias. En realizaciones preferentes, los productos de detección serán de longitud diferente. En otras realizaciones, los marcadores tendrán secuencias que se unen a diferentes sondas específicas de secuencia. Estas realizaciones no son limitativas y se pueden contemplar otras realizaciones usadas en la invención.
Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico (molécula)” se usan de forma indistinta para hacer referencia a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud. Los polinucleótidos pueden incluir desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. Los nucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. El término “polinucleótido” incluye moléculas monocatenarias, bicatenarias y de triple hélice. “Oligonucleótido” se refiere, en general, a polinucleótidos de entre 5 y aproximadamente 100 nucleótidos de ácido nucleico monocatenario o bicatenario, de forma típica ADN. Los oligonucleótidos también se conocen como oligómeros u oligos y pueden aislarse a partir de genes, o sintetizarse (p. ej., química o enzimáticamente) mediante procedimientos conocidos en la técnica. Un “cebador” se refiere a un oligonucleótido, normalmente monocatenario, que proporciona un extremo 3’-hidroxilo para el inicio de la síntesis de ácido nucleico mediada por enzimas. Las siguientes son realizaciones no limitativas de polinucleótidos: un gen, un fragmento génico, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucléotidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas y cebadores de ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico puede también comprender moléculas de ácido nucleico modificadas, tales como moléculas de ácido nucleico metilado y análogos de moléculas de ácido nucleico. En la técnica se conocen análogos de purinas y pirimidinas e incluyen, de forma no limitativa, aziridinicitosina 4-acetilcitosina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, pseudouracilo, 5
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pentilniluracilo y 2,6-diaminopurina. El uso de uracilo como sustituto de timina en un ácido desoxirribonucleico también se considera una forma análoga de pirimidina.
Modificaciones de azúcar (p. ej., 2’-o-metilo, 2-fluoro y similares) y modificaciones en la cadena principal fosfato (p. ej., morfolino, APN’, tioatos, ditioatos y similares) se pueden incorporar de forma única, o en combinación, en las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. En una realización, por ejemplo, un ácido nucleico para usar en la invención puede comprender un azúcar modificado y una cadena principal modificada con fosfato. En otra realización, un ácido nucleico de la invención puede comprender modificaciones en la cadena principal de azúcar, base y fosfato.
El término “marcador de ácido nucleico” se refiere a una molécula de ácido nucleico que producirá un producto de detección de un tamaño previsto u otra característica seleccionada cuando se usa con cebadores oligonucleótidos diseñados de forma adecuada en una reacción de amplificación de ácido nucleico, tal como una reacción de PCR. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con el diseño de cebadores oligonucleótidos adecuados para PCR y hay programas disponibles comercialmente y en Internet para facilitar este aspecto de la invención (véase, por ejemplo, el sitio http://bibiserv.techfak.unibielefeld.de/genefisher). Un marcador de ácido nucleico puede ser lineal o circular. En realizaciones preferentes, el marcador de ácido nucleico comprenderá una secuencia de ácido nucleico lineal predeterminada con sitios de unión para cebadores seleccionados localizados en cada extremo o cerca de cada extremo. En una molécula de ácido nucleico de ADN circular, los cebadores estarán en el interior en lugar de en un extremo, y se puede usar un cebador sencillo, por ejemplo para amplificación en círculo rodante. El ADN amplificado puede detectarse usando cualquier procedimiento disponible, incluyendo, de forma no limitativa, técnicas tales como PCR en tiempo real, tinción SYBR® Green o tinción con bromuro de etidio. En otras realizaciones de la invención, los sitios de unión para los cebadores de amplificación flanquean una secuencia de ADN no definida de longitud definida, o una secuencia de ADN que comprende otra característica identificable, tal como una secuencia detectable, además de secuencias no definidas. En algunas realizaciones, el marcador de ácido nucleico se distingue por el tamaño o la masa de las secuencias amplificadas; por tanto, la secuencia de ADN entre los cebadores no necesita definirse en cuanto a la secuencia exacta, solo en cuanto al número de bases. De forma alternativa, el tamaño y/o secuencia de todo el marcador de ácido nucleico no necesitan definirse siempre que se suministre un sitio de unión para una baliza molecular (véase, más adelante). En otras realizaciones, la secuencia de ADN localizada entre los sitios de unión del cebador comprende una “secuencia de identificación característica” que se puede detectar durante la reacción de PCR. La generación de señal fluorescente puede ser, por ejemplo, específica de la secuencia (Molecular Beacons, TaqMan®, cebadores fluorogénicos, tales como los cebadores LUX™ (Invitrogen (Carlsbad, CA.)) o dependientes de la masa (p. ej., SYBR® Green, bromuro de etidio). Los ejemplos proporcionados no pretenden ser una lista exhaustiva de posibles esquemas de detección de ácido nucleico, ya que los expertos en la técnica conocerán marcadores alternativos adecuados para usar en los procedimientos de la presente invención.
En el presente documento, el término “molécula de especificidad” se refiere a cualquier molécula que puede unirse de forma específica a otra molécula. En una realización, la molécula de especificidad es un anticuerpo. En otras realizaciones de la invención, las moléculas de especificidad pueden incluir, sin limitación: moléculas receptoras biológicas, tales como el receptor de insulina; ligandos para receptores (p. ej., insulina para el receptor de insulina); antígenos (p. ej., para unirse a anticuerpos) y moléculas biológicas, químicas o de otro tipo que tienen afinidad por otra molécula, tal como biotina y avidina. Las moléculas de especificidad de la presente invención no necesitan comprender una molécula completamente natural, sino que pueden consistir en solo una parte, fragmento
o subunidad de una molécula natural como, por ejemplo, el fragmento Fab de un anticuerpo. Las moléculas de especificidad se pueden generar por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden encontrar anticuerpos en un antisuero, preparado a partir de un sobrenadante de cultivo tisular de hibridoma o de fluido ascítico, o pueden derivar de un sistema de expresión recombinante, como se conocerá bien en la técnica. Se pueden generar fragmentos, partes o subunidades de, por ejemplo, un anticuerpo, receptor u otra especie, mediante medios químicos, enzimáticos o de otro tipo que dan, por ejemplo, moléculas bien conocidas (p. ej., Fab, Fab’) o nuevas. La presente invención también contempla que moléculas de especificidad pueden incluir moléculas recombinantes, quiméricas e híbridas, tales como anticuerpos humanizados y primatizados, y otras formas de anticuerpo no naturales. Los expertos en la técnica reconocerán que los ejemplos no limitativos proporcionados anteriormente que describen varias formas de anticuerpos también se pueden ampliar a otras moléculas de especificidad, de modo que formas recombinantes, quiméricas, híbridas y truncadas de moléculas que no son anticuerpos pueden usarse en los procedimientos de la presente invención.
En el presente documento, los términos “que se une específicamente” y “unión específica” se refieren a que un anticuerpo u otra molécula, especialmente una molécula de especificidad de la invención, se une a un blanco tal como un antígeno, ligando u otro analito, con mayor afinidad que cuando se une a otras moléculas en las condiciones especificadas en la presente invención. Anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, como se conocen en la técnica, son moléculas polipeptídicas que incluyen regiones que se pueden unir a otras moléculas, tales como antígenos. En varias realizaciones de la invención, “que se une específicamente” puede significar que un anticuerpo u otra molécula de especificidad se une a una molécula analito diana con una afinidad al menos aproximadamente 106 veces mayor, preferentemente con una afinidad al menos aproximadamente 107 veces mayor, más preferentemente con una afinidad al menos aproximadamente 108 veces mayor y, con máxima preferencia, con una afinidad al menos aproximadamente 109 veces mayor, que la afinidad con la que se une a moléculas no
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relacionadas con la molécula diana. De forma típica, la unión específica se refiere a afinidades en el intervalo de aproximadamente 106 veces a aproximadamente 109 veces mayor que la unión no específica. En algunas realizaciones, la unión específica se puede caracterizar por afinidades mayores de 109 veces por encima de la unión no específica. Siempre que en el presente documento aparece un intervalo, como en 1-10 o de uno a diez, el intervalo se refiere sin limitaciones a cada número entero o unidad de medida en el intervalo dado. Por tanto, por 110 quiere decir cada uno de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y cualquier subunidad comprendida entre ellos.
“Anticuerpos policlonales” o “PAb” son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno o un derivado antigénico funcional de las mismas. Para la producción de anticuerpos policlonales, los animales huéspedes, tales como conejos, ratones y cabras, se pueden inmunizar mediante inyección con un antígeno o conjugado hapteno-vehículo, suplementado opcionalmente con adyuvantes. Los anticuerpos policlonales pueden estar sin purificar, purificados o parcialmente purificados a partir de otra especie en un antisuero. Las técnicas para la preparación y purificación de anticuerpos policlonales son bien conocidas en la técnica y se describen en varias referencias generales y más específicas, incluyendo, de forma no limitativa, Kabat & Mayer, Experimental lmmunochemistry, 2ª ed., (Thomas, Springfield, IL (1961)); Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, (2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)); y Weir, Handbook of Experimental Immunology, 5ª ed. (Blackwell Science, Cambridge, MA (1996)).
“Anticuerpos monoclonales” o “MAb”, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos contra un antígeno concreto, se pueden obtener mediante cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo, tales como mediante cultivo continuo de líneas celulares. Estas técnicas incluyen, de forma no limitativa, la técnica del hibridoma de Köhler y Milstein, Nature, 256:495-7 (1975); y la patente US-4.376.110), la técnica del hibridoma de células B humanas (Kosbor, y col., Immunology Today, 4:72 (1983); Cote, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-30 (1983)), y la técnica del hibridoma con EBV (Cole, y col., en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Nueva York, pp. 77-96 (1985)). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluidas IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el MAb de esta invención puede cultivarse in vitro o in vivo. La producción de títulos elevados de MAb in vivo lo convierte en un procedimiento de producción preferente en la presente invención.
Además, se pueden usar técnicas desarrolladas para la producción de “anticuerpos quiméricos” (Morrison, y col., Proc. Natl. Acad Sci., 81:6851-6855 (1984); Takeda, y col., Nature, 314:452-54 (1985)) empalmando los genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad antigénica adecuada con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Un anticuerpo quimérico puede ser una molécula en la que diferentes partes derivan de diferentes especies animales, tales como los que tienen una región variable derivada de un MAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana.
De forma alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple (patente US4.946.778; Bird, Science 242:423-26 (1988); Huston, y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 85:5879-83 (1988); y Ward, y col., Nature, 334:544-46 (1989)) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena simple de un gen adecuados para usar en la presente invención. De forma típica, los anticuerpos de cadena simple se forman mediante unión de los fragmentos de la cadena ligera y pesada de la región Fv a través de un puente de aminoácido, que tiene como resultado un polipéptido de cadena simple.
Los fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos específicos se pueden generar mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen de forma no limitativa: los fragmentos F(ab’)2 que se pueden producir mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que se pueden generar mediante la reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab’)2. De forma alternativa, se pueden construir bibliotecas de expresión de Fab (Huse, y col., Science, 246:1275-81 (1989)) para permitir la identificación rápida y sencilla de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad adecuada.
En el presente documento, el término “hapteno” se refiere a un pequeño determinante antigénico proteico o no proteico, que puede ser reconocido por un anticuerpo. De forma típica, los haptenos no provocan formación de anticuerpos en un animal a menos que forme parte de una especie más grande. Por ejemplo, los haptenos peptídicos pequeños se acoplan con frecuencia a una proteína portadora tal como la hemocianina de la lapa californiana, con el fin de generar una respuesta de anticuerpos antihapteno. “Antígenos” son macromoléculas capaces de generar una respuesta de anticuerpos en un animal y de ser reconocidas por el anticuerpo resultante. Tanto los antígenos como los haptenos comprenden al menos un determinante antigénico o “epítopo”, que es la región del antígeno o hapteno que se une al anticuerpo. De forma típica, el epítopo de un hapteno es toda la molécula.
En el presente documento, las expresiones “anticuerpos en par en sándwich” o “pares de anticuerpos en sándwich” se refieren, de forma típica, a un par de anticuerpos monoespecíficos, p. ej., anticuerpos monoclonales, que son adecuados para usar en un inmunoensayo de formato de tipo sándwich. Cada anticuerpo del par se une a un epítopo diferente de la misma molécula y ambos anticuerpos del par se pueden unir al antígeno al mismo tiempo. Los procedimientos para identificar pares de anticuerpos adecuados para los ensayos de tipo sándwich serán bien conocidos para los expertos en la técnica. El técnico experto también reconocerá que se pueden usar otras diversas moléculas como pares en sándwich. Por ejemplo, un analito receptor puede formar un sándwich entre un ligando de
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dicho receptor y un anticuerpo que se une a un epítopo del receptor que no está implicado en la unión al ligando. Por tanto, un anticuerpo y un ligando se pueden usar como par en sándwich para un analito receptor.
De forma típica, “receptor” o “receptor biológico” se refieren a una estructura molecular en el interior o en la superficie de una célula, que se caracteriza por la unión selectiva de una sustancia específica (p. ej., un “ligando”)y que tiene como resultado un efecto fisiológico específico que acompaña a la unión. Ejemplos de receptores incluyen receptores de superficie celular para hormonas peptídicas, neurotransmisores, antígenos, fragmentos del complemento, inmunoglobulinas y receptores citoplásmicos para hormonas esteroideas. En el presente documento, no obstante, el receptor se aislará y purificará de forma típica y no es necesario que efectúe o pueda efectuar un efecto fisiológico o biológico de otro tipo. Los procedimientos de la presente invención aprovechan la unión selectiva del receptor a la sustancia específica.
El término “ligando” se refiere en general a una molécula que se une a un receptor. De forma típica, un ligando es una molécula pequeña y soluble, tal como una hormona o un neurotransmisor.
El término “soporte sólido” se refiere a cualquier fase sólida que se pueda usar para inmovilizar, por ejemplo, un analito, un anticuerpo o un complejo. Los soportes sólidos adecuados serán bien conocidos en la técnica e incluyen las paredes de pocillos de una bandeja de reacción, tal como una placa de microtitulación, las paredes de tubos de ensayo, perlas de poliestireno, perlas paramagnéticas o no magnéticas, membranas de nitrocelulosa, membranas de nylon, micropartículas como partículas de látex y glóbulos rojos de oveja (o de otro animal). Los materiales típicos para soportes sólidos incluyen, de forma no limitativa, poli(cloruro de vinilo) (PVC), poliestireno, celulosa, nylon, látex y derivados de los mismos. Además, el soporte sólido puede estar revestido, derivado o modificado de otro modo para estimular la adhesión de las moléculas deseadas (p. ej., analitos) y/o para impedir la unión no específica u otras interacciones no deseadas. La elección de una “fase sólida” específica no suele ser crítica y el experto en la técnica puede seleccionarla en función del ensayo empleado. Por tanto, las partículas de látex, micropartículas, perlas paramagnéticas o no magnéticas, membranas, tubos de plástico, paredes de pocillos de microtitulación, chips de vidrio o de silicio y glóbulos rojos son, todos ellos, soportes sólidos adecuados. De forma conveniente, el soporte sólido se puede seleccionar de modo que se acomode a varios procedimientos de detección. Por ejemplo, se pueden usar placas de 96 o de 384 pocillos para ensayos que serán automáticos, por ejemplo mediante estaciones de trabajo robóticas, y/o aquellas que se detectarán usando, por ejemplo, un lector de placas. En los procedimientos de la presente invención que pueden implicar una etapa de detección autorradiográfica o quimioluminiscente usando una visualización basada en película, el soporte sólido puede ser una membrana fina, tal como una membrana de nitrocelulosa o de nylon. Según una realización de la invención en la que se realizan inmunoensayos de tipo sándwich, de forma típica se emplean las paredes de los pocillos de una bandeja de reacción. En realizaciones alternativas de la presente invención, se pueden usar perlas paramagnéticas como soporte sólido. Procedimientos adecuados para inmovilizar moléculas sobre fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares, y combinaciones de los mismos. No obstante, el procedimiento de inmovilización no suele ser importante y puede implicar mecanismos de adsorción no caracterizados. Por tanto, un soporte sólido en el presente documento se puede referir a cualquier material que es insoluble o que puede hacerse insoluble, mediante una reacción posterior. El soporte sólido se puede seleccionar por su capacidad intrínseca para atraer e inmovilizar un reactivo de captura. De forma alternativa, la fase sólida puede retener un receptor adicional que tenga la capacidad de atraer e inmovilizar un reactivo de captura. El receptor adicional puede incluir una sustancia con carga opuesta con respecto al propio reactivo de captura o una sustancia cargada conjugada al reactivo de captura. En otra realización más de la invención, una molécula receptora adicional puede ser cualquier elemento de unión específico que está inmovilizado sobre (fijado a) la fase sólida y que tiene la capacidad de inmovilizar un reactivo de captura a través de una reacción de unión específica. La molécula receptora adicional permite la inmovilización indirecta del reactivo de captura sobre una fase sólida antes o durante la realización del ensayo. La fase sólida, por tanto, puede ser un plástico, derivado de plástico, metal paramagnético o no magnético, superficie de vidrio o de silicio de un tubo de ensayo, pocillo de microtitulación, lámina, perla, micropartícula, chip u otras configuraciones conocidas para los expertos en la técnica.
En general, “péptido” se refiere a una cadena corta de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. De forma típica, los péptidos comprenden cadenas de aminoácidos de aproximadamente 2-100, de forma más típica aproximadamente 4-50 y más normalmente aproximadamente 6-20 aminoácidos. En general, “polipéptido” se refiere a secuencias individuales de cadena lineal o ramificada de aminoácidos que de forma típica son más largas que los péptidos. Normalmente, los polipéptidos comprenden al menos aproximadamente de 100 a 1000 aminoácidos de longitud, de forma más típica al menos aproximadamente 150 a 600 aminoácidos, y frecuentemente al menos aproximadamente 200 a aproximadamente 500 aminoácidos. “Proteínas” incluyen polipéptidos sencillos, así como complejos de múltiples cadenas polipeptídicas, que pueden ser iguales o diferentes. Las cadenas múltiples de una proteína, que se puede caracterizar por una estructura secundaria, terciaria y cuaternaria, así como por la estructura primaria de la secuencia de aminoácidos; se pueden mantener juntas mediante, por ejemplo, puentes disulfuro; y pueden incluir modificaciones postsintéticas tales como, sin limitaciones, glicosilación, fosforilación, truncamientos u otro procesamiento. Los anticuerpos tales como proteínas IgG, por ejemplo, están compuestos de forma típica por cuatro cadenas polipetídicas (es decir, dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras) que se mantienen juntas por puentes disulfuro. Además, las proteínas pueden incluir componentes adicionales tales como metales asociados (p. ej., hierro, cobre y azufre) u otros restos. Las definiciones de péptidos, polipéptidos y proteínas incluyen, sin limitaciones, formas biológicamente activas e inactivas; formas desnaturalizadas y nativas; así como formas
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variantes, modificadas, truncadas, híbridas y quiméricas de los mismos. Los péptidos, polipéptidos y proteínas de la presente invención pueden obtenerse de cualquier fuente o mediante cualquier procedimiento, incluyendo, de forma no limitativa, extracción de tejidos naturales u otros materiales; producción recombinante en organismos huésped, tales como células de bacterias, hongos, plantas, insectos o animales, y síntesis química usando procedimientos que serán bien conocidos para los expertos en la técnica.
El término “conjugado” en el presente documento se refiere a dos moléculas que están unidas de forma covalente
o unidas de otro modo. En una realización, un conjugado de ácido nucleico se genera mediante unión covalente de un ácido nucleico a una proteína, polipéptido u otra molécula de especificidad. En una realización preferente, la proteína, polipéptido u otra molécula de especificidad se une de forma covalente a un ácido nucleico a través de un grupo de enlace para formar un conjugado.
Un “kit” para detectar la presencia de un analito en una muestra mediante los procedimientos de la invención puede comprender, a modo de ejemplo, al menos un medio contenedor que tiene dispuesto en él un par de unión específico para el analito seleccionado. El kit puede comprender además otro medio contenedor que comprende uno
o más de los siguientes: tampones, soluciones u otros reactivos y materiales necesarios para realizar detección de analitos; reactivos capaces de amplificar los componentes de la sonda de ácido nucleico de los pares de unión; y reactivos capaces de detectar la presencia de componentes de ácido nucleico tras la amplificación. Preferentemente, el kit comprende además instrucciones de uso. El kit, si está destinado para uso diagnóstico, puede también incluir la notificación de un uso aprobado por la FDA y sus instrucciones.
Específicamente, un kit compartimentado incluye cualquier kit en el que los reactivos están contenidos en recipientes separados. Dichos recipientes incluyen recipientes pequeños de vidrio, recipientes de plástico o tiras de plástico o papel. Dichos recipientes permiten la transferencia eficaz de reactivos de un compartimento a otro compartimento de modo que las muestras y los reactivos no sufren contaminación cruzada y los agentes o soluciones de cada recipiente pueden añadirse de un modo cuantitativo de un compartimento a otro. Dichos recipientes pueden incluir un recipiente que acepta una muestra de prueba, un recipiente que contiene la sonda o los cebadores usados en el ensayo, recipientes que contienen tampones y reactivos (tal como solución salina tamponada con fosfato, tampones Tris y similares) y recipientes que contienen los reactivos usados para detectar el ácido nucleico marcador, el producto amplificado o similares. Un experto en la técnica reconocerá con facilidad que pares de unión preconformados y/o materiales, suministros y reactivos necesarios para preparar los pares de unión pueden incorporarse con facilidad a uno de los formatos de kit establecidos que son bien conocidos en la técnica.
Un kit para acoplamiento de ADN a un anticuerpo u otra molécula de especificidad mediante los procedimientos de la presente invención puede comprender al menos un medio contenedor que tiene dispuesto en su interior ADN activado liofilizado. El kit puede comprender además otros recipientes que comprenden uno o más de los siguientes: reactivos, tampones y agentes que pueden detectar la presencia de ácido nucleico después de la reacción. Preferentemente, el kit comprende además instrucciones de uso. Un experto en la técnica reconocerá con facilidad que los ácidos nucleicos activados descritos en la presente invención se pueden incorporar con facilidad a uno de los formatos en kit establecidos que son bien conocidos en la técnica.
Ensayo homogéneo de detección de analitos
En general, la presente invención proporciona procedimientos para usar pares de unión de ácido nucleico marcados de estabilidad definida y limitada en las condiciones definidas para la detección de analitos, en particular detección de analitos homogénea y sensible.
Pares de unión
La invención usa pares de unión que son útiles para detectar analitos. Los pares de unión para usar en la presente invención se forman entre dos elementos de unión, teniendo cada uno una molécula de especificidad acoplada a un ácido nucleico, como se muestra en la Fig. 1. El componente ácido nucleico de los elementos de unión es complementario en al menos una parte de su longitud y puede formar un duplete a través del cual los dos elementos del par de unión están unidos (véase la Fig. 1).
Componentes de la molécula de especificidad de los pares de unión
Las moléculas de especificidad de cada par de unión dirigen la interacción del par con un analito deseado. Una molécula de especificidad para usar en la invención, como se ha descrito anteriormente en el presente documento puede ser cualquier molécula que puede interaccionar con otra molécula, tal como un analito. En una realización preferente, las moléculas de especificidad interaccionan con un analito con elevada especificidad y afinidad.
En un aspecto de la invención, la molécula de especificidad es un receptor. En otro aspecto, la molécula de especificidad es un ligando. En otro aspecto más de la invención, la molécula de especificidad es un anticuerpo.
Las moléculas de especificidad individuales de un par de unión pueden ser ambas el mismo tipo de molécula o pueden ser diferentes tipos de moléculas. En una realización, ambas moléculas de especificidad en un par son receptores. En otra realización, ambas moléculas de especificidad en un par son ligandos. En otra, ambas son
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anticuerpos. En otra más, ambas son antígenos. En otra realización más, una molécula de especificidad es un ligando y la otra molécula de especificidad es un receptor. En otra realización más, una o ambas moléculas de especificidad en un par de unión es un ácido nucleico. En un aspecto de esta realización, el analito diana es un ácido nucleico complementario. En otro aspecto de esta realización, el analito diana es un ADN, un ARN o una proteína, o un componente de un complejo de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, el analito diana es un complejo que comprende un ácido nucleico y una proteína y una de las moléculas de especificidad del par de unión es un ácido nucleico que es complementario del componente ácido nucleico del analito diana y la otra molécula de especificidad del par de unión es una proteína (es decir, un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor etc.) que se une específicamente al componente de proteína del analito diana. En una realización preferente, al menos una molécula de especificidad de un par de unión es un anticuerpo.
Los anticuerpos son especialmente útiles como moléculas de especificidad. Todos los tipos de anticuerpos descritos en lo que antecede son útiles para transmitir especificidad a un par de unión, incluyendo, de forma no limitativa, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos híbridos, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanizados, anticuerpos primatizados, anticuerpos truncados, anticuerpos de cadena simple y similares.
Cuando se usan dos anticuerpos para formar un par de unión, los dos anticuerpos pueden tener las mismas o diferentes especificidades. En una realización de la invención, los dos anticuerpos reconocen el mismo epítopo y ese epítopo está presente múltiples veces en un único analito. Por ejemplo, ambos anticuerpos de un par de unión pueden reconocer un receptor que está presente en múltiples copias sobre la superficie de un analito celular. En otra realización, los anticuerpos reconocen epítopos diferentes en una molécula de analito simple. En determinados aspectos de esta realización, ambos anticuerpos se pueden unir de forma simultánea a una molécula de analito sencillo. Los denominados anticuerpos de “par en sándwich” de este aspecto de la invención serán bien conocidos para los expertos en la técnica.
Componentes de ácido nucleico de los pares de unión
Cada molécula de especificidad en un par de unión está acoplada a o “marcada” con una molécula de ácido nucleico (es decir, un marcador de ácido nucleico). Según un aspecto de la invención, los ácidos nucleicos son monocatenarios. En otro aspecto, los ácidos nucleicos son parcialmente monocatenarios. En otra realización más, el ácido nucleico es todo ADN, todo ARN o una mezcla de ADN y ARN. En otras realizaciones, se pueden usar análogos o derivados nucleotídicos. En otra realización se usa APN como parte o todo el ácido nucleico. La molécula de especificidad puede acoplarse al extremo 3’ o 5’ del ácido nucleico. En una realización de la invención, los extremos libres de los dos ácidos nucleicos en un par de unión son complementarios, de modo que se pueden hibridar para formar una región de ácido nucleico duplete de estabilidad limitada y definida. En otra realización, el extremo libre de uno de los ácidos nucleicos en un par de unión es complementario de una secuencia del otro ácido nucleico de dicho par de unión en un punto distinto al extremo de uno de los ácidos nucleicos. En un aspecto de la invención, el extremo 3’ del primer ácido nucleico forma un duplete con una secuencia interna del segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico está acoplado a una molécula de especificidad a través de uno o más enlazadores o separadores.
La secuencia nucleotídica de los ácidos nucleicos usados en la presente invención es de menor importancia que los papeles funcionales que tienen que realizar. Por tanto, la secuencia de los ácidos nucleicos, así como la longitud del componente ácido nucleico del par de unión, puede variar considerablemente, siempre que el componente ácido nucleico del par de unión pueda seguir realizando los papeles funcionales que tiene que realizar. De manera importante, la secuencia y la longitud de los ácidos nucleicos del par de unión no se limitan a las secuencias y longitudes exactas de los pares de unión de ejemplo descritos en el presente documento descriptivo. Por tanto, los ácidos nucleicos del par de unión pueden ser de diferentes longitudes y/o secuencias. Una función importante del componente ácido nucleico de los pares de unión usados en la presente invención es proporcionar un marcador altamente sensible para la detección de analitos. En una realización, el ácido nucleico se amplifica y detecta como medida de concentración de analitos. El ácido nucleico se puede amplificar usando procedimientos bien establecidos. Los procedimientos de amplificación ilustrativos incluyen los descritos en varias patentes, PCR (véase,
p. ej., US-4.683.202), TMA (véase, p. ej., patente de los EE.UU. nº 5.399.491); SDA (véase, p. ej., patente de los EE.UU. nº 5.270.184) y LCR (véase, p. ej., patente de los EE.UU. nº 5.427.930).
Una amplia variedad de secuencias de nucleótidos se pueden usar para amplificación. De forma similar, la longitud del ácido nucleico puede variar considerablemente. En una realización, los ácidos nucleicos están diseñados para evitar la formación de horquillas intramoleculares con el fin de incrementar la eficiencia con la que se pueden amplificar. En ciertos aspectos de la invención, el ácido nucleico se detecta usando un colorante fluorescente de intercalación no específico, tal como SYBR® Green. Según esta realización, la intensidad de la señal de detección será una función de la longitud del ácido nucleico detectado.
Se sabe bien que la estabilidad de un duplete de ácido nucleico depende, en parte, de la longitud de la región de complementariedad entre las hebras de ácido nucleico en el duplete. Una región de complementariedad más larga o “solapante” entre ácidos nucleicos aumenta la estabilidad del duplete que se forma. Por el contrario, una solapante más corta conduce a un duplete menos estable. Los ácidos nucleicos para usar en la presente invención están
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diseñados para tener una estabilidad definida que se puede manipular mediante alteración de la longitud, la temperatura, el disolvente y otras condiciones. Los factores que influyen sobre la estabilidad de un híbrido incluyen, de forma no limitativa, la concentración de los pares de unión marcados con ácido nucleico, la concentración de sales, la temperatura, los disolventes orgánicos tales como etanol, DMSO, iones de tetrametilamonio (TMA+), faltas de correspondencia de pares de bases y similares.
En un aspecto de la invención, los ácidos nucleicos están diseñados para formar dupletes de pares internos de unión. En otro aspecto de la invención, los dupletes de ácido nucleico de un par de unión pueden disociarse en condiciones definidas y, de este modo, tener una estabilidad limitada en ciertas condiciones.
En una realización de la invención, las condiciones de reacción están diseñadas para maximizar la formación de dupletes entre los elementos de los pares de unión unidos a sus analitos diana respectivos, mientras que se minimiza la formación de dupletes entre elementos de pares de unión que no están unidos a los analitos diana. En otra realización, los dupletes permanecen estables durante la unión a un analito, pero pueden disociarse de forma selectiva o fundirse mediante un operador de ensayo.
En estas condiciones, las condiciones termodinámicas favorecen la deshibridación de los pares no unidos. En determinadas realizaciones de la invención, menos de aproximadamente 1 % de los pares de unión no está unido al analito. En otras realizaciones, menos de aproximadamente 0,1 %, 0,01 % o 0,001 % de los pares de unión no están unidos al analito. En otras realizaciones, se puede usar un ácido nucleico competidor (p. ej., complementario de una región de formación de duplete entre los ácidos nucleicos del par de unión) para evitar que los elementos de unión libres se reasocien. Se puede obtener un efecto similar diseñando uno de los ácidos nucleicos de un par de unión de modo que forme una pequeña horquilla cuando no se hibride con el ácido nucleico de su pareja de unión.
Una vez formado, se puede potenciar la estabilidad del complejo entre el par de unión y el analito diana usando una enzima polimerasa para extender los extremos 3’ del duplete de ácido nucleico, tal como se describe en la patente de los EE.UU nº 5.635.602.
Los marcadores de ácido nucleico usados en la presente invención se pueden detectar incorporando uno cualquiera de un número de marcadores en uno o ambos ácidos nucleicos del par de unión. Los ejemplos de marcadores adecuados para usar en la presente invención incluyen moléculas fluorescentes de intercalación tales como SYBR® Green y bromuro de etidio; pares de transferencia de energía de resonancia fluorescente FRET, tales como fluoresceína y rodamina; compuestos radioactivos, compuestos bioluminiscentes, compuestos quimioluminiscentes tales como éster de acridinio; pares inactivadores quimioluminiscentes; y reactivos que hibridan con ácido nucleico de un modo específico de secuencia, tales como Molecular Beacons (Kramer), TaqMan®, y cebadores fluorogénicos
(p. ej., cebadores LUX™; Invitrogen, Carlsbad, CA). Además, se pueden incorporar trifosfatos de ácido nucleico fluorescentes (NTP y dNTP) durante una extensión de los extremos 3' de los pares de ácido nucleico en duplete. Además, es posible incorporar los marcadores mediante traducción de tipo nick y otros medios.
Ensayo de analito con par de unión de ácido nucleico
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención proporciona procedimientos para detectar analitos usando pares de unión, según la reivindicación 1. En una realización, un par de unión específico de analito, como se ha descrito anteriormente, se pone en contacto con su analito para formar un complejo. Los elementos del par de unión están unidos mediante el complejo intermolecular de estabilidad definida y limitada formado entre los dos ácidos nucleicos. Además, los elementos de unión están bloqueados en su lugar en proximidad cercana y, por tanto, con concentración local elevada, en virtud de su asociación con el analito. Los dupletes de ácido nucleico pueden después disociarse y dejarse reasociar.
Para disociar los dupletes se usa calor. La disociación se consigue calentando los complejos por encima de la temperatura de fusión del duplete de ácido nucleico.
En otro aspecto de la invención, la reasociación de los ácidos nucleicos de los elementos del par de unión que no están en complejo con el analito se puede evitar o eliminar mediante dilución. En otro aspecto, la dilución u otra condición de la reacción no permite una reasociación sustancial del exceso de los elementos de unión libres. En general, las condiciones que no permiten una reasociación sustancial implican menos de 5 %, de forma típica menos de 1 %, con frecuencia menos de 0,1 % y, con mayor frecuencia, menos de 0,01 %, de reasociación del exceso de los elementos de unión libres. Según esta realización, los pares de unión se ponen en contacto con un analito de modo que se forma un complejo entre el par de unión y el analito. Después, los complejos se diluyen de tal modo que se favorece la hibridación de los marcadores de ácido nucleico unidos cercanos, pero se desfavorece la hibridación de la solución en total. En estas condiciones, la extensión de los extremos 3’ del ácido nucleico marcador se produce, de forma predominante o exclusiva, en los ácidos nucleicos marcadores en complejo e hibridados, mientras que los ácidos nucleicos que no están en complejos no hibridan y, por tanto, la extensión de los extremos 3’ no se produce.
Según este procedimiento de la invención, los dupletes extendidos se detectan después como medio para la detección del analito. En una realización de la invención se amplifica un ácido nucleico que comprende el duplete
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para facilitar la detección. La amplificación se puede conseguir mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Procedimientos adecuados incluyen, de forma no limitativa, PCR, LCR, SDA y TMA.
De forma típica, los procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos dependen de la síntesis enzimática cebada del ADN. Según dichos procedimientos, un cebador con un extremo 3’ OH libre se hibrida con un molde de ADN o de ARN monocatenario. El 3’ OH puede formar el punto de inicio de la extensión usando una polimerasa, ejemplos de la cual se conocen en la técnica e incluyen, sin limitaciones, ADN polimerasa Taq, ADN polimerasa I, fragmento Klenow de ADN polimerasa, ADN polimerasa T4, ADN polimerasa T7, transcriptasa inversa, ADN polimerasa phi29, ADN polimerasa Bst, AccuPrime™ (Invitrogen), ADN polimerasa Pfx (Invitrogen), ADN polimerasa FideliTaq™ (Amersham Biosciences), Sequenase™, ADN Thermo Sequenase ™, ADN polimerasa Hot Tub™ (Amersham Biosciences), Vent® Polymerase (New England Biolabs) y ADN polimerasa 9°Nm.
En un aspecto de la invención, el molde para PCR es una molécula de ácido nucleico que comprende la región duplete de las dos hebras de ácido nucleico en complejo con el analito a través de sus respectivas moléculas de especificidad. Como entenderán los expertos en la técnica, un molde para PCR puede ser más largo que el producto deseado de la PCR. Los dos cebadores individuales de PCR pueden hibridar internamente e iniciar la síntesis de ADN, cada una en un punto particular en una hebra del molde de ácido nucleico. El producto resultante de la PCR tiene de forma típica un extremo 5’ definido por un cebador y un extremo 3’ definido por el otro cebador.
Después, se pueden detectar los productos de amplificación mediante, por ejemplo, tinción con bromuro de etidio, tinción de plata, autorradiografía, transferencia por manchas, transferencia por ranuras o transferencia de tipo Southern. Como alternativa, la detección se puede conseguir incorporando una molécula de detección en uno o ambos ácidos nucleicos, el producto de amplificación o la región duplete del complejo. Las moléculas de detección adecuadas para usar en los procedimientos de la presente invención incluyen, de forma no limitativa, moléculas fluorescentes, moléculas inactivadoras de fluorescencia, un compuesto quimioluminiscente, moléculas inactivadoras de quimioluminiscencia, nucleótidos fluorescentes, marcadores enzimáticos y radiomarcadores.
En determinadas realizaciones de la invención, la detección del duplete puede facilitarse mediante incorporación de éster de acridinio en la región duplete del complejo e hidrólisis selectiva del marcador en los elementos del par de unión primero y segundo que no han formado un duplete de ácido nucleico.
Extensión en 3’ del duplete y generación de sitios de unión del cebador
La presente invención proporciona procedimientos para detectar analitos a través de la amplificación del duplete de ácido nucleico del par de unión en el que uno o ambos sitios de unión del cebador están ausentes de las secuencias marcadoras de ácido nucleico. Según esta realización, se generan uno o más sitios de unión al cebador una vez que el par de unión se ha unido a un analito. Por ejemplo, una o ambas secuencias marcadoras de ácido nucleico pueden incorporar una secuencia idéntica a la secuencia del cebador deseada, fuera de la región duplete. En otras palabras, los sitios de unión al cebador para amplificación no están presentes en los ácidos nucleicos del par de unión, sino que sólo se forman después de la extensión de los extremos 3’ de los dupletes de ácido nucleico.
En esta realización, no está presente una región de complementariedad con el cebador (es decir, sin sitio en el cebador) en el ácido nucleico marcador. Tras la hibridación, el extremo 3’ de uno o ambos marcadores puede extenderse usando una polimerasa adecuada. La extensión abarca la secuencia idéntica a la secuencia del cebador deseada, de modo que se genera un sitio de unión al cebador complementario que puede usarse en posteriores etapas de amplificación para la unión al cebador (Figs. 2 y 3). En un aspecto de esta realización, el cebador de amplificación no se hibridará ni iniciará la síntesis/amplificación del ácido nucleico a menos que se forme una región duplete entre el primer y el segundo marcador de ácido nucleico y su posterior extensión. En otro aspecto de la invención, se reduce la detección de fondo no específica porque sólo se detectan las moléculas hibridadas.
Se ha descubierto que los oligonucleótidos de 60 bases de longitud que tienen un brazo separador en el 5’ amino de C12 (separador C12 CE fosforamidita; 12-(4,4’-dimetoxitritiloxi)dodecil-1-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita) con las siguientes secuencias nucleotídicas son adecuados para usar en este aspecto de la presente invención:
(1)
5′NH3-C12-GCTACGGCTAGATCGTGTCCATGCGCTTACGACT
(2)
5′ NH3-C12-TCTCCAACTCTTCAACGCCATGTTCTTATGATAC GAGAGATTCAGCGGAGGCATCTAGCT 3′ [SEC ID N°:2]
(3)
5′ NH3-C12-TCTCCAACTCTTCAACGCCATGTTCTTATGATAC GAGAG ATTCATCATCTAGCTAGCGAG-3′ [SEC ID N°:3]
TCGATGCTCGGCTCGCTAGCTAGATG 3′ [SEC ID N°:1]
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El oligonucleótido (I) [SEC ID N°:1] es complementario del oligonucleótido (2) [SEC ID N°:2] y del oligonucleótido (3) [SEC ID N°:3] para las 9 a 15 últimas bases, respectivamente, en los extremos 3’. La longitud del duplete formado entre los oligos tiene una energía de Gibbs libre específica (�G), que se controla mediante la secuencia de la base vecina más cercana. Véase Breslauer, y col., Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 83: 3746-3750 (1986). El par de bases 9 y 15 solapante tiene temperaturas de fusión (Tm) de 26 °C y 42 °C, respectivamente, en NaCl 50 mM, de acuerdo con la fórmula:
Tm= 64,9+ 41 * (yG + zC -16,4) / (wA+ xT+ yG + zC)
en la que w, x, y, z son el número de las bases A, T, G, C en la secuencia, respectivamente. Véase p. ej., http://www.ba-sic.nwu.edu/biotools/oligoalc.html. Las hebras solapantes se hibridan (> 50 % duplex) cuando están presentes en solución a concentraciones superiores a 50 nM a 25 °C, NaCl 50 mM. Las hebras existen, principalmente, como monómeros (< 50 % hibridadas) a concentraciones de menos de 100 pM en equilibrio. De acuerdo con los principios de la termodinámica, las hebras de ADN complementario como estas pueden tener una transición entre formas monocatenarias y bicatenarias en función de la temperatura, la concentración de ADN y los efectos salinos. Cuando se hibridan, el extremo 3’ de cada hebra puede servir como punto de inicio para la síntesis del ácido nucleico complementario de la otra hebra. Cada hebra se puede extender en presencia de una ADN polimerasa adecuada y trifosfatos nucleotídicos, que tiene como resultado un duplete de ADN de los pares de bases 111 (Fig. 2) o 105 (Fig. 3). El duplete recién formado incluye secuencias que no estaban presentes inicialmente en la estructura parcialmente solapada. Estas nuevas secuencias se pueden replicar de forma exponencial mediante PCR en presencia de los siguientes cebadores después del extremo 3’:
5’ GCTACGGCTAGATCGTGTCCA 3' [SEC ID N°:4]
y
5’ TGTCCAACTCTTCAACGCCATGTTC 3’ [SEC ID N°:5]
Las hebras individuales no se pueden replicar en presencia de estos cebadores sin formar el primer producto de extensión de la cadena.
La Fig. 4 muestra la amplificación mediante PCR en tiempo real (inicio en caliente) de las hebras de oligonucleótidos solapantes de 9 y de 15 pares de bases. En esta figura se puede ver que la amplificación no se produce hasta que hay presente una concentración suficiente de hebras para garantizar la probabilidad de que una hebra esté lo bastante cerca de una hebra complementaria para que se produzca hibridación y una primera extensión de la cadena. El incremento de la concentración de las hebras solapantes tiene como resultado un incremento exponencial de la generación del molde, medido mediante ciclo umbral en PCR en tiempo real. Por el contrario, diluyendo esta concentración, por ejemplo lavando el soporte, disminuye exponencialmente la señal. La amplificación de un molde normal de 60 mer se muestra para comparar.
Efectos de la proximidad en los complejos par de unión-analito
Los inmunoensayos de tipo sándwich que emplean marcadores oligonucleotídicos solapantes se han denominado NADIA™ (Inmunoensayo de detección de ácido nucleico). Se han demostrado los formatos tanto homogéneo como heterogéneo del NADIA. En la Fig. 5 se proporciona una representación esquemática de un NADIA homogéneo.
Los elementos de unión a anticuerpo marcados con oligonucleótidos solapantes también presentan el efecto de la amplificación por PCR mostrada en la Fig. 4. La unión de tales conjugados de ADN-Ab al mismo antígeno, o a una superficie recubierta con antígeno, fija las hebras oligonucleotídicas solapantes cercanas unas a otras. Esto incrementa de forma eficaz las concentraciones relativas de ambas hebras y la probabilidad de formar moldes. El molde, una vez formado, presenta una relación lineal entre concentración y señal umbral en la PCR en tiempo real.
Este efecto de proximidad tiene implicaciones para reducir considerablemente la señal de fondo que se produce por la unión no específica del conjugado ADN-Ab molde cuando se usa un soporte de captura (es decir, en un ensayo heterogéneo). Las secuencias oligonucleotídicas solapantes individuales no son moléculas molde para la amplificación y, al contrario que los conjugados ADN-Ac descritos anteriormente, no se pueden amplificar por sí mismas con el grupo de cebadores seleccionado. Aunque los conjugados solapantes se siguen uniendo de forma no específica, la unión es aleatoria. La unión no específica aleatoria de un número relativamente pequeño de copias del conjugado disminuye considerablemente la oportunidad de interacción proximal y la extensión de la primera cadena.
El efecto de proximidad puede también ser la base del ensayo de tipo sándwich de formato homogéneo de la presente invención, en el que no es necesario un soporte sólido de captura. Según un procedimiento de la presente invención, se deben usar condiciones que favorezcan la hibridación y la extensión de la primera cadena de conjugados solapantes unidos proximalmente y que desfavorezcan la hibridación en la solución total. Toda hibridación no específica del par de conjugado en solución provocará una señal, como se muestra en la Fig. 4. Una realización de la presente invención abarca, por tanto, emplear la menor concentración de conjugado posible para
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mantener una tasa de formación de complejo inmune aceptable. El ajuste de los efectos de la longitud de solapamiento, las condiciones de sales y la temperatura también está disponible para minimizar la hibridación aleatoria de las secuencias de solapamiento en la solución total.
Inmunodetección de analitos celulares
Se han conjugado anticuerpos policlonales purificados por afinidad a E. coli 0157 con las hebras oligonucleotídicas solapantes con el fin de demostrar un formato de NADIA heterogéneo para la detección de microorganismos intactos. Se ha usado anticuerpo unido a partículas magnéticas (Dynal, Lake Success, NY) para aislar y enriquecer las células de E. coli 0157 en muestras de agua y homogeneizado de carne. Se ha estimado que la superficie celular presenta varios miles de copias del antígeno específico que se detectó. Los cálculos muestran que la distancia entre los sitios distribuidos al azar entra dentro de la distancia de separación de los oligonucleótidos solapantes conjugados con anti-E. coli 0157. En este caso, la unión de proximidad se debe a la separación antigénica individual, en oposición a los epítopos separados en un antígeno proteico sencillo.
Según los procedimientos de la presente invención (que se describen más adelante en Ejemplos), el anticuerpo policlonal dirigido contra E. coli 0157 (KPL, Gaithersburg, MD) se marcó en tres reacciones separadas con secuencias (1) (2) y (3) y se mantuvo como conjugados individuales. A partir de la ATCC (700728) se obtuvo E. coli 0157:H7 y se cultivó a 37 °C. Las células del cultivo líquido se diluyeron en medio reciente y se incubaron con conjugados Ac-oliginucleótidos solapantes 10 nM durante 1 hora a temperatura ambiente. El complejo célulaanticuerpo resultante se lavó para eliminar el exceso de conjugado no unido mediante centrifugación y resuspensión en solución salina tamponada con Tris en frío, diluyendo de forma eficaz el reactivo de anticuerpo solapante a menos de 1,0 pM. Las células lavadas se sembraron de forma simultánea en placas y se analizaron mediante incubación en mezcla de reactivos de PCR durante 10 min a 33 °C, seguido por 40 ciclos de PCR en tiempo real en presencia de cebadores después del extremo 3’. La presencia de 10-50 células, determinada mediante la formación de colonias en cultivo durante la noche a 37 °C, fue suficiente para provocar señal por encima de la de fondo en ensayo de 2-3 horas, sin cultivar.
Ensayos homogéneos para analitos celulares
La presente invención proporciona un procedimiento para detectar células o virus intactos formando un complejo sobre la superficie de la célula con un reactivo de par de unión. El reactivo de par de unión usado para detectar células intactas, como células bacterianas, es similar al usado para detectar un analito proteico que tiene dos sitios de unión para dos o más MAb. En este caso, los sitios de unión pueden comprender la misma proteína embebida en la superficie celular. El reactivo de par de unión abarca la distancia entre unidades proteicas individuales.
Las células que pueden detectarse de acuerdo con este procedimiento incluyen células bacterianas, animales, vegetales, de insectos y fúngicas. En una realización, la célula animal es una célula humana que puede estar enferma o sana. Por ejemplo, se puede usar el procedimiento para detectar células de cáncer en circulación empleando el par de unión que comprende anticuerpos frente a antígenos tumorales de superficie celular.
Detección de analitos usando pares de unión que tienen conjugación 3’-5’ de marcadores de ADN solapantes
Se puede conseguir una sensibilidad del ensayo considerablemente mayor mediante el uso de reactivos de pares de unión que comprenden un elemento del par de unión (conjugado 5’) que comprende un primer ácido nucleico de un par solapante conjugado con la primera molécula de especificidad (p. ej., primer MAb de un par sándwich) en el extremo 5’ y el otro elemento del par de unión (conjugado 3’) que comprende la segunda hebra del ácido nucleico de un par solapante conjugado con una segunda molécula de especificidad (p. ej., segundo MAb) a través del extremo 3’, como se ilustra en la Fig. 6. Según este procedimiento, el extremo 3’ del conjugado 5’ se hibrida con una secuencia interna del conjugado 3’, produciendo un par de unión en el que la extensión del extremo 3’ está dirigida hacia el exterior a partir del centro de masas del complejo formado y hacia un extremo terminal de rotación libre (el extremo 5’ del complejo 3’). Esta orientación mejora la eficacia de la extensión de la cadena cuando se compara con los pares de unión solapantes 3’-3’, de modo que se permite mayor acceso estérico a la polimerasa y la disipación de la tensión torsional durante la polimerización inicial.
Ensayo homogéneo empleando digestión enzimática
La mejora de la sensibilidad para la detección homogénea de analitos se puede conseguir mediante el uso de elementos de unión que comprenden moléculas de especificidad, tales como anticuerpos, conjugados con ácidos nucleicos monocatenarios que tienen bases desoxirribosa en el extremo 5' y bases ribosa en el extremo 3'. Según este procedimiento, los marcadores de ADN/ARN son complementarios en los extremos 3’ para toda la extensión de la secuencia de ARN y para la extensión corta de la secuencia de ADN. En algunas realizaciones, la secuencia de ARN tiene una longitud de al menos aproximadamente 20 bases. En otras realizaciones, la secuencia de ARN tiene una longitud de al menos aproximadamente 30, 40, 50 o 60 bases. Según un aspecto de la invención, la secuencia de ARN tiene una longitud de 26 bases. La región duplete de ADN-ADN es corta, comprendiendo de forma típica menos de 15 pares de bases, con frecuencia menos de aproximadamente 12 pares de bases y, preferentemente,
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menos de aproximadamente 10 pares de bases. En varios aspectos de la invención, el duplete ADN-ADN tiene una longitud de 12, 11, 10, 9, 8 o 7 pares de bases.
Según este procedimiento, una región duplete de ácido nucleico del complejo analito-par de unión, especialmente las regiones heteroduplete ADN/ARN, es estable a temperaturas elevadas, de modo que se garantiza la formación de un complejo que contiene elementos de unión encerrados en una orientación y distancia específicas entre sí en el complejo del par de unión. Tras la formación del complejo, el componente ARN del par de unión acomplejado y del par en exceso se puede digerir mediante la adición de RNasa, dejando un par de unión corto relativamente inestable unido al duplete ADN/ADN residual. En una realización, la RNasa es RNasa H. Tras el tratamiento con RNasa, el par de unión inestable se disocia en sus respectivos elementos de unión al elevar la temperatura. Sólo los elementos de unión fijados en posición en el complejo se reasocian rápidamente al reducir la temperatura. Los elementos de unión disociados que no se mantienen cercanos al analito no pueden volver a formar un par de unión debido a la baja concentración y a la limitada estabilidad de un duplete de ADN/ADN corto. En un aspecto de este procedimiento, la unión de elementos con componentes ácido nucleico del ADN 3’ acortado solapante reduce el requisito de dilución de la reacción de formación del complejo y, por tanto, mejora más la sensibilidad.
Las hebras de ácido nucleico que comprenden monómeros de nucleótidos de desoxirribosa y de ribosa y que tienen una función 5’ amino pueden sintetizarse mediante química de fosforamidita estándar. De forma alternativa, un solapante de ADN/ADN 3’ corto puede cargarse enzimáticamente con ARN polimerasa.
Ensayo homogéneo sensible para analitos
Combinando las características descritas en lo que antecede se ha desarrollado un ensayo homogéneo para analitos, tales como antígenos proteicos y microorganismos, que se acerca a la sensibilidad alcanzada para la detección de ácidos nucleicos. Según este procedimiento de la invención, una primera molécula de especificidad (p. ej., un primer MAb de un par de sándwich o una primera parte de anticuerpo policlonal) se conjuga con el extremo 5' de un oligonucleótido ADN/ARN quimérico. En un aspecto de este procedimiento, la parte ARN del oligo ADN/ARN comprende 30 bases en el extremo 3’. De forma típica, un único sitio del cebador se localiza en el extremo 5’ del ADN del oligo ADN/ARN. La segunda molécula de especificidad (p. ej., el segundo MAb o una segunda parte de anticuerpo policlonal) se conjuga con el extremo 3' de un oligonucleótido de ADN opcionalmente sintetizado con uno
o más separadores de fosforamidita en 3’ para incrementar la longitud global. En un aspecto de este procedimiento, el oligo ADN tiene una longitud de al menos 60 bases. De forma típica, un único sitio del cebador se localiza en el extremo 5’ del oligo ADN. Según este procedimiento, los oligonucleótidos forman un duplete híbrido de ARN-ADN relativamente largo, de forma típica de 20-40 pares de bases de longitud, seguido por una extensión corta del híbrido ADN-ADN de aproximadamente 7-15 pares de bases. (Fig. 7).
Tras la formación del complejo de analito, digestión del ARN, fusión y rehibridación, los pares de unión de esta realización se pueden extender mediante polimerasa solamente en una dirección desde el extremo 3’ del ADN expuesto (Fig. 7). Se eliminan las restricciones estéricas y torsionales impuestas por las superposiciones en 3’, como se ha descrito anteriormente. La digestión enzimática del par de unión tiene como resultado un duplete de ADN-ADN corto, que es relativamente inestable y, de este modo, minimiza la reformación del par de unión a partir de los elementos de unión libres en la solución total.
Debe entenderse que la aplicación de las enseñanzas de la presente invención a un problema o situación específicos estará dentro de las capacidades de un experto en la técnica a la luz de las enseñanzas contenidas en el presente documento descriptivo. La invención se ilustrará adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos. Los ejemplos siguientes, incluidos los experimentos y resultados alcanzados, se proporcionan con fines ilustrativos únicamente y no deben interpretarse como limitativos de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Activación del molde de ADN 5’ amino
Se sintetizaron dos secuencias de ADN monocatenario de 60 bases [SEC ID NOS. 1 y 3] de modo que contenían un único grupo amino primario unido al extremo 5' mediante un brazo separador de 12 carbonos (Glen Research, Sterling, VA). Las secuencias eran complementarias entre sí para las últimas 15 bases del extremo 3’. Ambas se trataron de forma idéntica. El ADN 5’ amino (350 µg) se disolvió en 25 µl de tampón fosfato sódico 0,05 M a pH 7,0. Se disolvió suberato de disuccinimidilo en DMSO seco a una concentración de 10 mg/ml e inmediatamente se añadieron 50 µl de alícuota a la solución de ADN y se mezclaron mediante repipeteo suave. Después de un minuto a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se inyectó en una columna G-25 (fina) de 0,5 x 20 cm conectada a un sistema FPLC de Pharmacia. La columna se equilibró en ácido cítrico 5 mM, se ajustó a pH 5,4 con hidróxido sódico 0,1 M y se desarrolló a un caudal de 0,5 ml/min a temperatura ambiente. El primer pico eluido se recogió directamente en una unidad de filtración ultracentrífuga Microcon® YM-10 (Millipore, Billerica, Mass.) insertada en hielo. El molde de ADN activado con suberato se concentró a 4 °C y 5000 x g durante 30 minutos, hasta 200-300 µl. La concentración de ADN se evaluó rápidamente mediante absorbancia a 260 nm. Se dispensaron alícuotas que contenían 1,0 unidad A260 (aproximadamente 30 µl) en tubos de microcentrífuga que contenían 5 µl de 10 % de
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manitol y se congelaron inmediatamente en baño de hielo seco/acetona. Las alícuotas congeladas se liofilizaron hasta sequedad, se sellaron en argón seco y se almacenaron a -20 °C.
La actividad del ADN liofilizado activado se evaluó mediante conjugación con una molécula pequeña que contenía amino. Se hizo reaccionar glutatión a 50 mg/ml en fosfato sódico 0,1 M, pH 8,0, con una cantidad estequiométrica de N-etilmaleimida (NEM). El pH se reajustó hasta 8,0 con hidróxido sódico. Se disolvió una unidad A260 de ADN activado con suberato en 10 µl de glutatión tratado con NEM, después se diluyó 25 veces con agua hasta 4,0 unidades A260/ml. La conjugación con glutatión alquilado tuvo como resultado una banda de migración más lenta en comparación con el ADN 5’ amino cuando se sometió a electroforesis en un gel de 15 % de poliacrilamida TBE-urea. El ADN activado con suberato purificado y liofilizado en las condiciones descritas anteriormente presentó de forma típica una conjugación de casi 100 % con el glutatión tratado con NEM, lo que indica completa activación del suberato y mantenimiento de la reactividad de la amina.
Ejemplo 2: Conjugación de MAb dirigido contra PSA emparejado en sándwich con ADN activado con suberato
El marcaje de los anticuerpos monoclonales anti-PSA pareados de tipo sándwich (cMAb y rMAb) se ha descrito con anterioridad. Véase la solicitud de patente de los EE.UU. nº 10/701,347 (publicación US nº 2005-0026161). En determinados experimentos, el cMAb se marcó con oligonucleótidos de ADN monocatenario que comprenden la SEC ID N°:1 y el rMAb se conjugó con la SEC ID N°:2 o la SEC ID N°:3 usando los procedimientos descritos en la solicitud de patente de los EE.UU. nº 10/701.347 (publicación US nº 2005-0026161).
Para los experimentos de la presente invención, los MAb emparejados en sándwich dirigidos contra diferentes epítopos de PSA se obtuvieron de BiosPacific, Inc. (Emeryville, CA) y cada uno se conjugó con una de las secuencias de ADN solapantes activadas. Se intercambiaron cien microlitos de MAb (1 mg/ml) con tampón y se concentraron en fosfato sódico 0,1 M, cloruro sódico 0,15 M, pH 8,25, mediante dos pases a través de una unidad de ultrafiltración centrífuga Microcon® 50 (Millipore, Billerica, Mass.) a 10.000 x g en una microcentrífuga a temperatura ambiente. El volumen final de 25-50 µl se recogió mediante centrifugación en tubo de microcentrífuga y se añadió a un sedimento liofilizado de ADN activado (preparado como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1). La reacción de conjugación se dejó proceder durante varias horas a temperatura ambiente.
El grado de marcaje del anticuerpo con ADN se evaluó mediante SDS y/o electroforesis en gel de la proteína nativa. La incorporación de una o más hebras de ADN a una estructura de anticuerpo aumentó el peso molecular y la electronegatividad. El anticuerpo marcado con ADN apareció como bandas de migración claras más lentas cuando se sometió a electroforesis en geles de 4 % de poliacrilamida-SDS con la tasa de migración electroforética correspondiente al grado de incorporación de ADN. Las mismas moléculas conjugadas migraron más rápido que el correspondiente anticuerpo sin derivar en la electroforesis en gel de 4-12 % de proteína nativa. La separación fue más importante, pero menos definida, para los conjugados de mayor orden en geles nativos.
La extensión de la conjugación de ADN varió de 50 a 100 % en función de la reactividad relativa y la exposición de los grupos de aminolisina en cada estructura de anticuerpo. Se descubrió que los conjugados tienen una densidad de marcado promedio de 2,5. En algunos experimentos, la mezcla de reacción que contiene los conjugados anticuerpo-ADN se añadió a un segundo sedimento liofilizado de ADN activado para incrementar la extensión del marcaje del anticuerpo con ADN.
El ADN no reaccionado se eliminó del conjugado mediante cromatografía de filtración en gel FLPC usando una columna Sephacryl™ S-200 (Amersham Biosciences) equilibrada con TBS a un caudal de 0,4 ml/min. Los primeros picos eluidos incluyen MAb conjugado y sin conjugar. El conjugado puro se obtuvo mediante cromatografía de intercambio aniónico FPLC usando una columna Q™ (Amersham Biosciences) equilibrada en tampón Tris 20 mM, pH 7,4, y eluyó con gradiente de sales de NaCl (0,0-1,0 M) a un caudal de 0,5 ml/min. El conjugado MAb-ADN eluyó a 60-70 % de sales.
Los conjugados MAb-ADN se concentraron de forma individual mediante ultrafiltración centrífuga y se analizó la presencia de proteínas usando un ensayo BCA Protein Assay (Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL). Se combinaron cantidades iguales de ambos conjugados para formar el par de unión, que se hibrida formando una única molécula. Se añadió azida sódica hasta una concentración final de 0,1 % y el reactivo de par de unión se almacenó a 4 °C.
Ejemplo 3: Ensayo homogéneo para el antígeno prostático específico
Se diluyó el par de unión del Ejemplo 2 hasta 20 pM y se combinó con un volumen igual de una serie de dilución de antígeno que contenía de 0 a 1 ng/ml de PSA. La mezcla antígeno-par de unión se incubó durante dos horas a 37 °C. La incubación permitió la formación de complejos de unión que comprenden una molécula de antígeno y una molécula de par de unión, con las regiones de anticuerpo de cada elemento del par de unión unidas a un epítopo distinto sobre el antígeno PSA. Todas las sales se omitieron intencionadamente para disminuir la hibridación de los marcadores oligonucleotídicos solapantes en la solución de reacción. Tras la incubación, se extrajo una alícuota de la mezcla de incubación, se diluyó a 1:100 en Tris 10 mM, 0,1 % de BSA, pH 8,0, para reducir la concentración del conjugado a menos de 1 pM y se calentó durante 3 min a 45 °C. La etapa de calentamiento separó de forma eficaz
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los elementos del par de unión entre sí mediante disociación de las regiones duplete solapantes tanto de los elementos de unión sin formar complejos y libres en solución como de los pares de unión en complejo con antígeno. Se añadió un volumen igual de mezcla 2X PCR (20 mM de tris-HCl, pH 8,3; 100 mM de KCl; 7 mM de MgCl2; 400 µM de cada dNTP; 50 U/ml de AmpliTaq® (Applied Biosystems, Foster City, CA) que contenía 400 µm de cada cebador (SEC ID N°:4 y 5). La temperatura se disminuyó a 23 °C para rehibridar preferentemente las hebras de ADN asociadas con los complejos analito-par de unión e iniciar la extensión de la primera cadena y la mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 3 minutos. En estas condiciones, las regiones de ADN complementarias de los elementos del par de unión en complejo se rehibridan rápidamente para volver a formar el híbrido solapante del reactivo del par de unión debido a su cercana proximidad y orientación. Por tanto, las regiones de ADN de los pares de unión en complejo se pueden extender mediante Taq polimerasa, de modo que se forma un molde para PCR. No obstante, los elementos del par de unión libres sin formar complejos no rehibridan en una extensión significativa antes o durante la reacción de amplificación porque están demasiado diluidos. La solución de reacción (50 µl) se transfirió al pocillo de una placa de microtitulación, se selló y se sometió a termociclado de PCR en tiempo real. La temperatura se aumentó de 50 °C a 85 °C en 3 minutos y, después, se mantuvo a 95 °C durante 2 minutos. Se realizaron 45 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 62 °C durante 1 minuto. Los resultados de un experimento típico se muestran en la Fig. 8. Como se muestra en esta figura, una muestra que contenía 100 fg/ml de PSA se pudo detectar sobre el fondo (es decir, cuando se comparó con las muestras de control que no contenían PSA).
Ejemplo 4: Ensayo homogéneo para E. coli 0157
Se obtuvieron células de E. coli de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron en cultivo líquido. La concentración celular se determinó mediante la aparición de colonias en medio agar cultivado durante la noche a 37 °C.
Se obtuvieron anticuerpos policlonales contra E. coli 0157 de KPL, Inc. (Gaithersburg, Maryland) y se conjugaron con oligos marcadores de ácido nucleico que tienen secuencias solapantes complementarias según los procedimientos descritos en los ejemplos 1 y 2. Se marcaron alícuotas de la misma preparación de anticuerpos policlonales de forma individual, cada una con uno de los dos oligonucleótidos solapantes, y se purificaron y combinaron estequiométricamente para producir un reactivo de par de unión.
Se suspendieron células bacterianas en tampón neutro (Tris 10 mM, pH 7,5) para detener el crecimiento activo y se trataron con un volumen igual de 20 a 200 pM de reactivo de par de unión durante dos horas a temperatura ambiente. La unión de un elemento anticuerpo del par de unión a una proteína de superficie celular potencia la unión del segundo elemento, formando un puente molecular que une dos sitios de unión adyacentes en una célula. Después, la suspensión celular se diluyó a 1:100 en 10 mM de Tris, pH 7,5, y se calentó hasta 45-50 °C para disociar el exceso de reactivo del par de unión en elementos de par de unión independientes. Se añadió un volumen igual de la mezcla 2X PCR que contiene cebadores 400 µM y la mezcla se incubó durante 3 minutos a temperatura ambiente. La reacción (50 µl) se transfirió al pocillo de una placa de microtitulación, se selló y se sometió a PCR en tiempo real en las condiciones descritas anteriormente en el Ejemplo 3. Antes de la PCR, también se retiró una muestra para determinar el número de células bacterianas mediante siembra en medio sólido. Tras 45 ciclos de amplificación, se detectó un límite inferior de 10-50 células intactas usando este procedimiento.
Ejemplo 5: Ensayo homogéneo para PSA Troponina T usando solapamiento 3’-3’ y 3’-5’ de marcadores de ADN conjugados
Se puede obtener una sensibilidad mayor del ensayo mediante el uso de reactivos de pares de unión que comprenden un elemento de par de unión compuesto por una hebra de ADN de un par solapante conjugado con un MAb de un par de tipo sándwich en el extremo 5’ como se ha descrito en el Ejemplo 1 y la segunda hebra de ADN conjugada con el otro MAb a través del extremo 3’. El extremo 3’ del conjugado 5’ se hibrida con una secuencia interna del conjugado 3’ produciendo un par de unión en el que la extensión del extremo 3’ libre se produce lejos del centro de masas de un complejo formado y hacia un extremo de rotación libre. Esta orientación puede mejorar la eficiencia de la extensión de la cadena cuando se compara con la descrita anteriormente de los pares de unión solapantes 3’-3’, de modo que se permite mayor acceso estérico a la polimerasa y la disipación de la tensión torsional durante la polimerización inicial.
Los elementos de unión de este ejemplo se forman y purifican como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 2, usando pares de tipo sándwich de anticuerpos monoclonales obtenidos de Roche Diagnostics, Indianapolis, IN. Los marcadores de ADN 5’ [SEC ID NOS. 6 y 7] estaban compuestos por 60 bases que tienen el extremo 3’ complementario para 9 bases. Además, la SEC ID N°:6 era complementaria de una secuencia interna de 9 bases de un marcador de ADN 3’ de 75 bases [SEC ID N°:8]. El marcador de ADN 3’ también puede sintetizarse de modo que contenga una o varias fosforamiditas separadoras (Glenn Research) en el extremo 3’ para compensar la pérdida de longitud del par de unión creado mediante la hibridación interna. La SEC ID N°6 se conjugó de forma arbitraria con el anticuerpo monoclonal denominado MAK<TNT>M-7. Las SEC ID Nos. 7 y 8 se conjugaron con el anticuerpo monoclonal denominado MAK<TN-T>M-11-7. La química de conjugación y la purificación siguieron siendo iguales.
El par de unión que comprende un segmento híbrido solapante interno estable se diluye, reacciona con troponina T y amplifica en presencia de cebadores después del extremo 3’ (SEC ID Nros.9 y 10) tal como se ha descrito para el Ejemplo 3. El par de unión libre y acomplejado tiene propiedades de fusión y reasociación similares al del par de
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unión solapante 3’-3’ de la misma secuencia. La orientación hacia fuera de la polimerización inicial de un solapante 3’-5’ mejora la eficiencia de la generación de la secuencia molde en los casos en los que el complejo total sándwich puede impedir la progresión de la Taq polimerasa. La amplificación de un mayor número de moléculas de molde inicial permite un umbral de señal más rápido en la PCR en tiempo real y mayor sensibilidad del ensayo. El ensayo homogéneo para la troponina T usando un reactivo de par de unión solapante 3’-3’ mostró una sensibilidad de detección similar a la del PSA (Ejemplo 3). El correspondiente ensayo homogéneo para la troponina T usando la orientación del solapante 3’-5’ dio una mejora de 2-4 veces.
Ejemplo 6: Ensayo homogéneo para estreptavidina usando ADN solapante marcado con biotina 3’-3’ y 3’-5’
Un ejemplo de la sensibilidad extrema que se puede conseguir en un formato homogéneo de inmuno-PCR quedó demostrado mediante la detección de estreptavidina. La estreptavidina sirve como “antígeno” en este sistema de modelo, con un diámetro molecular de aproximadamente 60 angstroms. Las funciones amino terminales de las SEC ID Nos.:6, 7 y 8 se marcaron con etil-1,3’ditiopropionato de sulfosuccinimidilo 2-(biotinamido) (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) y se purificaron mediante cromatografía de filtración en gel FPLC. Cada marcador de ADN tiene una longitud mayor de 200 angstroms en extensión completa y garantiza una capacidad de extenderse la distancia requerida para conseguir hibridación solapante.
Se disolvió estreptavidina (Prozyme, San Leandro, CA) en Tris 10 mM que contiene 0,05 % de Tween-20 y 0,05 % de azida sódica, pH 8,0, y se dejó formar un complejo con el ADN solapante en 3'-3' y 3'-5' marcado con biotina, presente a una concentración final de 10-100 pM. El complejo se detectó mediante tratamiento con la adición de la mezcla 2X PCR durante 15 minutos, se calentó hasta 37 °C y se sometió a ciclado de PCR en tiempo real en presencia de cebadores después del extremo 3’ (SEC ID Nos. . 9 y 10). La estreptavidina se pudo detectar a aproximadamente 500 moléculas (50 attogramos) cuando se analizó en la configuración solapante de 3'-5' y 2.000 moléculas en la orientación 3'-3'.
SEC ID N°6
5’(C6) NH2 ATATACCCCC GCTGCCATGA TATCACTCTG TATAAATTTG
TATGCTATTC ACGATTGGGA 3’
SEC ID N°7
5’(C6) NH2 ACTCTTCGCA ACAGATCCAC ACGTACACAT
CCAAACTAGC TTCCACCACC ATCCCAATCG 3’
SEC ID N°8
5’ ACTCTTCGCA ACAGATCCAC ACGTACGTCC CAATCGAAAG
TAAACAGTTT AAACATATGT AGCGCGTCTC CTCAT NH2 (C6) 3’
SEC ID N°9 5’ ATATACCCCC GCTGCCATGA TATC 3’
SEC ID N°10 5’ ACTCTTCGCA ACAGATCCAC ACGT 3’
Ejemplo 7: Ensayo homogéneo para PSA usando conjugación 3’-5’ de los marcadores de ADN solapantes
Los elementos de unión de este procedimiento se pueden formar y purificar como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 2, a excepción de que uno de los ácidos nucleicos está acoplado a través de su extremo 3’. El marcador de ADN 5’ es un oligonucleótido de 60 bases con un extremo 3’ complementario de 15 bases de una secuencia interna del marcador de ADN 3’. El marcador de ADN 3’ se sintetiza de modo que contenga fosforamiditas separadoras (Glenn Research, Sterling, VA) en el extremo 3’ para compensar la pérdida de longitud del par de unión creado mediante la hibridación interna. La química de conjugación y la purificación se realizan como se ha descrito anteriormente.
El par de unión que comprende un segmento híbrido solapante interno estable se diluye, reacciona con PSA y se amplifica como se describe en el Ejemplo 3. Los pares de unión libres y acomplejados tienen propiedades de fusión y reasociación similares a las de los pares de unión solapante 3’-3’, dictadas por las propiedades termodinámicas de los pares de bases ADN. La orientación hacia fuera de la polimerización inicial mejora la eficiencia de la generación
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de la secuencia molde. La amplificación de un mayor número de moléculas del molde inicial permite un umbral de señal más rápido en la PCR en tiempo real y mayor sensibilidad del ensayo.
Ejemplo 8: Ensayo homogéneo de PSA empleando digestión enzimática
Mediante el uso de elementos de unión que comprenden anticuerpos conjugados con ácidos nucleicos monocatenarios con bases desoxirribosa en el extremo 5’ y bases ribosa en el extremo 3’ se puede conseguir una mejora de la sensibilidad para la detección homogénea de antígenos proteicos y microorganismos. Las hebras de ácido nucleico compuestas por monómeros de nucleótidos de desoxirribosa y de ribosa que contienen una función 5’ amino se sintetizan mediante química de fosforamidita estándar. De forma alternativa, un solapante de ADN/ADN 3’ corto puede cargarse enzimáticamente con ARN polimerasa. Los marcadores de ácido nucleico solapantes compuestos por ADN y ARN se sintetizan a partir de ARN fosforamidita para las primeras 26 bases. Las 59 bases restantes se sintetizan con ADN fosforamidita, terminando en una función amino (C12). Las primeras 25 bases de los extremos 5’ representan secuencias cebadoras únicas. Las siguientes 26 bases de ADN son complementarias de las 26 bases de ARN de la hebra solapante.
Las siguientes 9 bases de ADN son complementarias de las siguientes 9 bases de ADN de la hebra solapante, de modo que los marcadores ADN/ARN son complementarios en los extremos 3’ para toda la extensión de la secuencia de ARN y para aproximadamente 9 bases de la secuencia de ADN. El par de unión consiste en dos elementos de unión unidos a través de una extensión relativamente larga de duplete de ADN/ARN y una extensión relativamente corta de duplete de ADN/ADN. Cuando está conjugado con anticuerpos monoclonales contra PSA en sándwich, como se describe en los Ejemplos 2 y 3, y combinado estequiométricamente, el par de unión resultante contiene un puente nucleotídico de 110 bases de las cuales 60 bases internas estaban apareadas.
Este reactivo se usa como en el Ejemplo 3 para detectar PSA. El par de unión forma un complejo con el analito mediante reconocimiento de dos epítopos de PSA mediante los dos elementos anticuerpo del par. La región duplete de ácido nucleico del complejo antígeno-par de unión, especialmente la región heteroduplete de ADN/ARN, es estable a temperaturas elevadas, y garantiza la formación de un complejo que contiene elementos de unión encerrados en una orientación y distancia específicas entre sí en el complejo del par de unión. Tras la formación del complejo antígeno-par de unión, la reacción se diluye únicamente 10 veces y se trata con RNasa H (Promega Corp., Madison, WI) durante 30 minutos a temperatura ambiente para digerir las hebras de ARN de los pares de unión tanto en complejo como en exceso, dejando un par de unión corto y relativamente inestable unido al duplete de ADN/ADN residual. El par de unión resultante se disocia térmicamente calentando hasta 45 °C durante 3 minutos, después se enfría hasta temperatura ambiente. El ADN/ADN solapante corto restante se reasocia rápidamente, aunque sólo transitoriamente, en el complejo inmune. Sólo los elementos de unión fijados en posición en el complejo se reasocian rápidamente al reducir la temperatura. Los elementos de unión disociados no pueden volver a formar pares de unión debido a su baja concentración y a la estabilidad limitada del solapante ADN/ADN corto. El hecho de tener elementos de unión con marcadores de ADN de solapantes 3’ cortos reduce el requisito de dilución de la reacción de formación del complejo y, por tanto, mejora la sensibilidad del ensayo en comparación con el ensayo del Ejemplo 3 mencionado anteriormente. Se añaden la mezcla de PCR y los cebadores, y la amplificación por PCR en tiempo real se realiza como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 9: Ensayo homogéneo para PSA usando digestión enzimática y conjugación 3’-5’
Combinando las características descritas anteriormente, se puede desarrollar un ensayo homogéneo para antígenos proteicos y microorganismos, que se acerca a la sensibilidad alcanzada para la detección de ácidos nucleicos. El primer MAb de un par de sándwich se conjuga con el extremo 5’ de un oligonucleótido ADN/ARN quimérico. Se apreciará que se puede usar una primera parte de anticuerpo policlonal en lugar del MAb. La parte ARN del oligo ADN/ARN comprende 30 bases en el extremo 3’. Un único sitio en el cebador se localiza en el extremo 5’ del ADN del oligo ADN/ARN. El segundo MAb (que podría estar sustituido por una segunda parte de anticuerpo policlonal) se conjuga con el extremo 3’ de un oligonucleótido ADN de 64 mer que se sintetiza con varias fosforamiditas separadoras en 3’ para incrementar la longitud global. Las 25 bases del extremo 5’ desde el extremo 5’ del 64 mer representan un único sitio del cebador. Las siguientes 30 bases son complementarias de las 30 bases de ARN del oligo ADN/ARN. Las últimas 9 bases son complementarias del segmento de ADN adyacente al segmento de ARN (Fig. 7).
La combinación de ambos elementos de unión produce un par de unión con un híbrido ADN/ADN de 9 pares de bases adyacente a un híbrido ADN/ADN de 30 pares de bases, como se ilustra en la Figura 7. Tras la formación del complejo inmune, digestión del ARN, fusión y rehibridación, el par de unión se podría extender mediante polimerasa solamente en una dirección desde el extremo 3’ del ADN expuesto (véase la Fig. 7). Se eliminan las restricciones estéricas y torsionales impuestas por las superposiciones en 3’, como en el Ejemplo 5. La digestión enzimática del par de unión tiene como resultado un solapamiento corto de 9 pares de bases, que es relativamente inestable y minimiza la reformación del par de unión en la solución total. La amplificación por PCR se lleva a cabo como se ha descrito anteriormente.

Claims (22)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de detección de un analito, que comprende:
    a) poner en contacto un par de unión que comprende:
    un primer elemento de unión que comprende una primera molécula de especificidad acoplada a un
    5 primer ácido nucleico; y un segundo elemento de unión que comprende una segunda molécula de especificidad acoplada a un segundo ácido nucleico, en donde los ácidos nucleicos primero y segundo forman un duplete de estabilidad definida y limitada, con un analito para formar un complejo;
    b) disociar el duplete mediante calentamiento a una temperatura superior a la temperatura de fusión del duplete, mientras que dichos elementos de unión presentes en dicho complejo se mantienen encerrados en
    10 su lugar en proximidad cercana en virtud de su asociación con el analito;
    c) incubar el complejo par de unión-analito en condiciones que permitan la reasociación de los pares de unión unidos al analito, pero que no permitan la reasociación sustancial del exceso de elementos de unión libres en solución, de modo que se genera un duplete reformado;
    d) extender los extremos 3’ del duplete reformado; y
    15 e) detectar el duplete reformado extendido y detectando, por tanto, el analito.
  2. 2.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa (b) además comprende diluir el complejo.
  3. 3.
    El procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que el complejo se forma en una solución acuosa que comprende una sal y la etapa (b) comprende disminuir la concentración en sal de la solución acuosa.
  4. 4.
    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa (e) comprende amplificar una
    20 molécula de ácido nucleico que comprende los dupletes reformados y detectar un producto de la amplificación, en el que de forma opcional la amplificación se consigue mediante PCR, LCR, SDA o TMA.
  5. 5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la amplificación se consigue mediante PCR usando cebadores que se unen únicamente a sitios generados mediante extensión de los extremos 3’ del duplete reformado en la etapa (d).
    25 6. El procedimiento de la reivindicación 4 o de la reivindicación 5, en el que el producto de la amplificación se detecta mediante un procedimiento seleccionado de tinción con bromuro de etidio, tinción de plata, autorradiografía, transferencia por manchas, transferencia por ranuras y transferencia de Southern.
  6. 7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la detección del duplete reformado se consigue mediante la incorporación de una molécula de detección en al menos uno de: el primer ácido nucleico
    30 monocatenario, el segundo ácido nucleico monocatenario, la región duplete del par de unión y el producto de amplificación.
  7. 8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la molécula de detección se selecciona de: una molécula fluorescente, una molécula inactivadora de fluorescencia, un compuesto quimioluminiscente, una molécula inactivadora de quimioluminiscencia, una molécula bioluminiscente, una molécula radioactiva y un nucleótido
    35 fluorescente.
  8. 9.
    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que al menos uno de los ácidos nucleicos primero y segundo es una molécula de ADN/ARN quimérico y el complejo de la etapa (a) se digiere con ARNasa antes de disociar el duplete en la etapa (b).
  9. 10.
    Un procedimiento de detección de PSA, comprendiendo dicho procedimiento:
    40 a) proporcionar un primer elemento de unión que comprende un anticuerpo monoclonal dirigido a un primer epítopo sobre el antígeno prostático específico acoplado a un primer ácido nucleico monocatenario y un segundo elemento de unión que comprende un anticuerpo monoclonal dirigido a un segundo epítopo sobre el antígeno prostático específico acoplado a un segundo ácido nucleico monocatenario, en el que el primer ácido nucleico monocatenario hibrida con el segundo ácido nucleico monocatenario, de modo que se forma
    45 un par de unión unido a través de un duplete de ácido nucleico;
    b) poner en contacto el par de unión con una muestra, en donde la muestra comprende PSA en una solución de modo que se forma un complejo par de unión-PSA;
    c) calentar el complejo par de unión-PSA para disociar los dupletes de ácido nucleico;
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    d) incubar el complejo par de unión-PSA en condiciones que permiten la reasociación de los elementos de unión unidos a PSA, pero que no permiten la reasociación sustancial del exceso de elementos de unión libres en la solución; y
    e) detectar los dupletes de par de unión y detectando por tanto el PSA.
    5 11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que los anticuerpos monoclonales primero y segundo juntos forman un par de tipo sándwich de anticuerpos monoclonales con PSA.
  10. 12.
    El procedimiento de la reivindicación 10 o de la reivindicación 11, en el que la muestra se selecciona de una muestra de sangre, una muestra de suero, una muestra de plasma o una muestra de tejido.
  11. 13.
    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el primer ácido nucleico
    10 monocatenario comprende la SEC ID N°:1 y el segundo ácido nucleico monocatenario comprende las SEC ID N°:2 o 3.
  12. 14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la etapa (c) se realiza a 45 °C y la etapa (d) se realiza a temperatura ambiente.
  13. 15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que la etapa de detección comprende 15 amplificar la región duplete, en donde opcionalmente la amplificación comprende las etapas de:
    a) extender los extremos 3’ del duplete con una ADN polimerasa, en donde la extensión genera al menos un sitio de unión al cebador; y
    b) realizar la reacción en cadena de la polimerasa del duplete extendido usando al menos un cebador complementario a el al menos un sitio de unión al cebador de la etapa (a).
    20 16. Un procedimiento de detección de una célula, que comprende:
    a) proporcionar una muestra que comprende al menos una célula;
    b) proporcionar un primer elemento de unión que comprende un anticuerpo dirigido a un epítopo de la célula acoplado a un primer ácido nucleico monocatenario y un segundo elemento de unión que comprende un anticuerpo dirigido a un epítopo sobre la célula acoplado a un segundo ácido nucleico monocatenario, en
    25 donde el primer ácido nucleico monocatenario hibrida con el segundo ácido nucleico monocatenario, de modo que se forma un par de unión unido a través de un duplete de ácido nucleico;
    c) poner en contacto el par de unión con una muestra, de modo que se forma un complejo par de unióncélula;
    d) disociar el duplete de ácido nucleico mediante calentamiento a una temperatura por encima de la
    30 temperatura de fusión del duplete, mientras que dichos elementos de unión presentes en dicho complejo se mantienen encerrados en su lugar en proximidad cercana en virtud de su asociación con la célula;
    e) incubar el duplete en condiciones que permiten la reasociación de los elementos de unión unidos a la célula, pero que no permiten la reasociación sustancial del exceso de elementos de unión libres, de modo que se genera un duplete reformado;
    35 f) detectar un ácido nucleico que contiene el duplete reformado y detectar así la célula.
  14. 17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la célula se selecciona de una célula bacteriana, una célula animal, una célula vegetal y una célula fúngica, en donde de forma opcional la célula es una célula humana y en donde además, de forma opcional, la célula humana está enferma.
  15. 18.
    El procedimiento de la reivindicación 16 o de la reivindicación 17, en el que el primer ácido nucleico comprende 40 la SEC ID N°:1 y el segundo ácido nucleico comprende las SEC ID N°:2 o 3.
  16. 19. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que los anticuerpos primero y segundo son anticuerpos policlonales, en el que, de forma opcional, los anticuerpos primero y segundo son alícuotas del mismo anticuerpo policlonal.
  17. 20.
    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que en la etapa (d) el calentamiento se 45 realiza a aproximadamente 45 °C.
  18. 21. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que la etapa (e) comprende diluir el complejo; e incubar el complejo diluido a temperatura ambiente, en donde de forma opcional el complejo está diluido al menos 10 veces y además, de forma opcional, el complejo está diluido al menos 100 veces.
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  19. 22. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en el que la etapa (f) comprende amplificar un ácido nucleico que comprende el duplete reformado, en el que, de forma opcional, la amplificación comprende las etapas de:
    a) extender los extremos 3’ del duplete con una polimerasa, en donde la extensión genera un sitio de unión 5 para al menos un cebador; y
    b) realizar la reacción en cadena de la polimerasa del duplete extendido usando al menos un cebador complementario al sitio de unión generado en la etapa (a).
  20. 23.
    El procedimiento de la reivindicación 22, en el que el al menos un cebador comprende las SEC ID N°:4 o 5.
  21. 24.
    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que el primer ácido nucleico está
    10 acoplado al primer anticuerpo a través de su extremo 3’ y el segundo ácido nucleico está acoplado al segundo anticuerpo a través de su extremo 5’ y en donde, de forma opcional, al menos uno de los ácidos nucleicos primero y segundo está unido a su correspondiente anticuerpo a través de un separador.
  22. 25. Un procedimiento de detección de un analito, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    a) proporcionar una muestra que comprende un analito;
    15 b) proporcionar un primer elemento de unión que comprende un anticuerpo que interacciona con el analito acoplado con un primer ácido nucleico monocatenario, en donde el primer ácido nucleico monocatenario comprende una secuencia ADN 5' y una secuencia ARN 3', en donde el primer ácido nucleico monocatenario está acoplado con el elemento de unión a través de su extremo 5’;
    c) proporcionar un segundo elemento de unión que comprende un anticuerpo que interacciona con el analito
    20 acoplado a un segundo ácido nucleico monocatenario, en el donde segundo ácido nucleico monocatenario comprende ADN acoplado al elemento de unión a través de su extremo 3’, en donde el segundo ácido nucleico monocatenario hibrida con el primer ácido nucleico monocatenario, de modo que se forma un par de unión unido a través de un duplete de ácido nucleico que consiste en regiones de híbrido ADN-ADN e híbrido ADN-ARN;
    25 d) poner en contacto el par de unión con la muestra, de modo que se forma un complejo par de uniónanalito;
    e) digerir el complejo con RNasa;
    f) disociar el duplete de ácido nucleico;
    g) incubar la solución en condiciones que permiten la reasociación de los elementos de unión unidos al 30 analito, pero que no permiten la reasociación sustancial del exceso de elementos de unión libres, de modo que se genera un duplete reformado;
    h) extender los extremos 3’ del duplete reformado, en donde la extensión genera al menos un sitio de unión al cebador para PCR;
    i) amplificar un ácido nucleico que comprende el duplete reformado mediante PCR usando al menos un 35 cebador que se une a el al menos un sitio de unión al cebador para PCR generado en la etapa (h); y
    j) detectar el ácido nucleico amplificado de la etapa (i) y detectar así la célula.
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Families Citing this family (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2463420T3 (es) * 2002-11-01 2014-05-27 Iris International, Inc. Inmuno-PCR sándwich por desplazamiento
WO2006137933A2 (en) * 2004-11-03 2006-12-28 Leucadia Technologies, Inc. Microbubbles for affinity separation
PT1842226E (pt) 2004-11-03 2010-11-29 Iris Molecular Diagnostics Inc Detecção homogénea de analitos
WO2009086197A1 (en) 2007-12-20 2009-07-09 Monogram Biosciences, Inc. Her-2 diagnostic methods
WO2009105264A1 (en) * 2008-02-21 2009-08-27 Iris International Inc. Method for early determination of recurrence after therapy for prostate cancer
WO2010011901A1 (en) * 2008-07-24 2010-01-28 Innovative Biosensors, Inc. Detection of rna-dna duplex molecules
WO2010065568A2 (en) * 2008-12-01 2010-06-10 Laboratory Corporation Of America Holdings METHODS AND ASSAYS FOR MEASURING p95 AND/OR p95 IN A SAMPLE AND ANTIBODIES SPECIFIC FOR p95
ES2535723T3 (es) 2009-01-15 2015-05-14 Laboratory Corporation Of America Holdings Métodos de determinación de la respuesta del paciente mediante la medición de Her-3
CN102439452B (zh) * 2009-01-15 2015-04-15 美国控股实验室公司 通过测量her-2表达确定患者应答的方法
KR101029343B1 (ko) * 2009-07-30 2011-04-13 한국과학기술연구원 면역분석 기반의 항원 검출용 키트 및 항원 검출 방법
NZ598962A (en) 2009-09-16 2014-12-24 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
JP2012003925A (ja) 2010-06-16 2012-01-05 Sony Corp 表示装置
WO2012085064A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Roche Diagnostics Gmbh Detection of a posttranslationally modified polypeptide by a bi-valent binding agent
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
CN103384831B (zh) * 2010-12-23 2016-02-10 霍夫曼-拉罗奇有限公司 通过二价结合剂来检测多肽二聚体
JP6162044B2 (ja) 2010-12-23 2017-07-12 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 結合剤
GB201101621D0 (en) * 2011-01-31 2011-03-16 Olink Ab Method and product
DE102011082353B4 (de) 2011-09-08 2021-04-01 Siemens Aktiengesellschaft Stator für einen Elektromotor
GB201201547D0 (en) 2012-01-30 2012-03-14 Olink Ab Method and product
WO2013119966A2 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Genentech, Inc. Single-chain antibodies and other heteromultimers
US10670740B2 (en) 2012-02-14 2020-06-02 American Science And Engineering, Inc. Spectral discrimination using wavelength-shifting fiber-coupled scintillation detectors
CA2865575C (en) 2012-02-27 2024-01-16 Cellular Research, Inc. Compositions and kits for molecular counting
EP2867253B1 (en) 2012-06-27 2016-09-14 F. Hoffmann-La Roche AG Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
WO2014001326A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the selection and production of tailor-made, selective and multi-specific therapeutic molecules comprising at least two different targeting entities and uses thereof
BR112014028368A2 (pt) 2012-06-27 2017-11-14 Hoffmann La Roche método de produção de conjugado de região fc de anticorpo, conjugado de região fc de anticorpo e formulação farmacêutica
US10081842B2 (en) 2012-08-07 2018-09-25 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Prostate cancer gene expression profiles
RU2646159C2 (ru) 2012-09-14 2018-03-01 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения и отбора молекул, включающих по меньшей мере две различные группировки, и их применение
CN105121659A (zh) 2013-03-15 2015-12-02 富鲁达公司 单细胞中的靶蛋白和靶核酸的同时检测
US9593364B2 (en) * 2013-05-21 2017-03-14 Src, Inc. Detecting a target molecule in a sample using a dual-antibody quantitative fluorescence-based detection method
SG10201806890VA (en) 2013-08-28 2018-09-27 Cellular Res Inc Massively parallel single cell analysis
CA2922926A1 (en) * 2013-09-04 2015-03-12 Fluidigm Corporation Proximity assays for detecting nucleic acids and proteins in a single cell
US10711311B2 (en) 2013-12-30 2020-07-14 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Genomic rearrangements associated with prostate cancer and methods of using the same
CN103728452B (zh) * 2014-01-23 2015-06-24 湖南大学 一种检测黄曲霉素b1的胶体金免疫试剂盒及其制备方法
CN103728451B (zh) * 2014-01-23 2015-06-24 湖南大学 一种检测赭曲霉素a的胶体金免疫试剂盒及其制备方法
US9909167B2 (en) 2014-06-23 2018-03-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University On-slide staining by primer extension
NL2013857B1 (en) * 2014-11-21 2016-10-11 Piculet Biosciences Tech B V Self-assembled bivalent ligand complex (SABLC) libraries and methods for screening such libraries.
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
US11291931B2 (en) 2014-12-15 2022-04-05 Akadeum Life Sciences, Inc. Method and system for buoyant separation
EP3262192B1 (en) 2015-02-27 2020-09-16 Becton, Dickinson and Company Spatially addressable molecular barcoding
US10168445B2 (en) 2015-03-20 2019-01-01 Rapiscan Systems, Inc. Hand-held portable backscatter inspection system
ES2934982T3 (es) 2015-03-30 2023-02-28 Becton Dickinson Co Métodos para la codificación con códigos de barras combinatorios
WO2016168711A1 (en) * 2015-04-17 2016-10-20 The Regents Of The University Of California Methods for detecting agglutination and compositions for use in practicing the same
WO2016172373A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
CN113376364A (zh) 2015-08-10 2021-09-10 Essenlix 公司 步骤简化、小样品、快速、易使用的生物/化学分析装置和方法
US10619186B2 (en) 2015-09-11 2020-04-14 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for library normalization
CA2998587C (en) 2015-09-14 2023-01-10 Essenlix Corp. Device and system for analyzing a sample, particularly blood, as well as methods of using the same
CN108633304B (zh) 2015-09-14 2020-08-14 艾森利克斯公司 采集分析蒸汽凝析，特别是呼出气凝析的装置与系统，以及使用方法
GB201518655D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Olink Ab Method for generating proximity probes
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
CN106124781B (zh) * 2016-07-07 2018-01-02 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种基于适配体夹心荧光淬灭技术检测去甲基睾酮的方法
CA3031586A1 (en) 2016-07-27 2018-02-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Highly-multiplexed fluorescent imaging
EP3516400B1 (en) 2016-09-26 2023-08-16 Becton, Dickinson and Company Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
DE102016221875B4 (de) * 2016-11-08 2018-06-28 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Stationäre Phase zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch, Verwendungen hiervon und Verfahren zur Detektion eines bestimmten Analyten in einem Gemisch
WO2018109665A1 (en) 2016-12-15 2018-06-21 Nestec Sa Compositions and methods that modulate bacteria in a companion animal
CN110312473B (zh) 2016-12-21 2023-04-07 艾森利克斯公司 用于认证样本的装置和方法及其使用
WO2018144240A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 Cellular Research, Inc. Selective amplification using blocking oligonucleotides
WO2018148342A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Essenlix Corporation Compressed open flow assay and use
CA3053002A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Essenlix Corp. Bio/chemical material extraction and assay
WO2018148470A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Essenlix Corporation Sample collection and handling for delayed analysis
CN111433606B (zh) 2017-02-09 2024-05-24 上海宜晟生物科技有限公司 采用不同间距高度的测定
KR102513181B1 (ko) * 2017-02-09 2023-03-23 아틀라스 안티바디스 에이비 생체 분자 사이의 상호 작용 수준을 결정하는 방법
CN110770572B (zh) 2017-02-09 2023-08-18 Essenlix公司 比色测定
US11940382B2 (en) 2017-02-09 2024-03-26 Essenlix Corporation Assay with amplification
CN111448449A (zh) 2017-02-16 2020-07-24 Essenlix公司 采用纹理化表面的测定
JP2020522262A (ja) * 2017-06-05 2020-07-30 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 単一細胞用のサンプルインデックス付加
US11280706B2 (en) 2017-08-01 2022-03-22 Essenlix Corporation Dilution calibration
CN112689758A (zh) 2017-08-01 2021-04-20 Essenlix公司 检查药物对微生物影响的装置和方法
US11243201B2 (en) 2017-08-01 2022-02-08 Essenlix Corporation Sample collection, holding and assaying
US11393561B2 (en) 2017-10-13 2022-07-19 Essenlix Corporation Devices and methods for authenticating a medical test and use of the same
US11609224B2 (en) 2017-10-26 2023-03-21 Essenlix Corporation Devices and methods for white blood cell analyses
US11237113B2 (en) 2017-10-26 2022-02-01 Essenlix Corporation Rapid pH measurement
US10807095B2 (en) 2017-10-26 2020-10-20 Essenlix Corporation Making and tracking assay card
US11648551B2 (en) 2017-12-12 2023-05-16 Essenlix Corporation Sample manipulation and assay with rapid temperature change
CN112534259A (zh) 2017-12-14 2021-03-19 Essenlix公司 监测毛发的装置，系统和方法
US11156606B2 (en) 2018-01-11 2021-10-26 Essenlix Corporation Homogeneous assay (II)
WO2019165129A1 (en) * 2018-02-22 2019-08-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for diagnosing and for determining severity of an autism spectrum disorder
US11773441B2 (en) 2018-05-03 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
EP3788170A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 Becton, Dickinson and Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
CN112424644A (zh) 2018-06-20 2021-02-26 美国科学及工程股份有限公司 波长偏移片耦合的闪烁检测器
CN112437692B (zh) 2018-07-09 2022-06-24 爱卡德姆生命科学公司 用于有浮力颗粒处理的系统和方法
US11885952B2 (en) 2018-07-30 2024-01-30 Essenlix Corporation Optics, device, and system for assaying and imaging
US11639517B2 (en) 2018-10-01 2023-05-02 Becton, Dickinson And Company Determining 5′ transcript sequences
JP2022506546A (ja) 2018-11-08 2022-01-17 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ランダムプライミングを使用した単一細胞の全トランスクリプトーム解析
CN113195717A (zh) 2018-12-13 2021-07-30 贝克顿迪金森公司 单细胞全转录组分析中的选择性延伸
EP4242322A3 (en) 2019-01-23 2023-09-20 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
WO2020154620A2 (en) * 2019-01-25 2020-07-30 Psomagen Inc. Antibody-dna conjugates and hpv detection and treatment
WO2020214642A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
US11939622B2 (en) 2019-07-22 2024-03-26 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
JP2023500679A (ja) 2019-11-08 2023-01-10 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 免疫レパートリーシーケンシングのための完全長ｖ（ｄ）ｊ情報を得るためのランダムプライミングの使用
EP4090763A1 (en) 2020-01-13 2022-11-23 Becton Dickinson and Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
WO2021191449A1 (en) 2020-03-27 2021-09-30 Olink Proteomics Ab Method for detecting analytes
GB202004472D0 (en) 2020-03-27 2020-05-13 Olink Proteomics Ab Method for detecting analytes of varying abundance
GB202004469D0 (en) 2020-03-27 2020-05-13 Olink Proteomics Ab Controls for proximity detection assays
EP4150118A1 (en) 2020-05-14 2023-03-22 Becton Dickinson and Company Primers for immune repertoire profiling
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US20220119552A1 (en) * 2020-10-15 2022-04-21 City Of Hope Complementary rna linked bispecific t-cell engaging antibodies
GB202017873D0 (en) 2020-11-12 2020-12-30 Olso Unversitetssykehus Hf Method of determining DLBCL prognosis
CN116635533A (zh) 2020-11-20 2023-08-22 贝克顿迪金森公司 高表达的蛋白和低表达的蛋白的谱分析
US11340361B1 (en) 2020-11-23 2022-05-24 American Science And Engineering, Inc. Wireless transmission detector panel for an X-ray scanner
GB202018503D0 (en) 2020-11-25 2021-01-06 Olink Proteomics Ab Analyte detection method employing concatamers
CN112730840B (zh) * 2021-01-29 2023-10-17 章毅 鉴别cd44和cd24分子表型的方法
WO2023028329A1 (en) 2021-08-26 2023-03-02 Akadeum Life Sciences, Inc. Method and system for buoyant separation
WO2024100258A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 Olink Proteomics Ab Library of proximity probes and method of use
EP4382534A1 (en) 2022-12-06 2024-06-12 Biomérieux Synthetic peptide for use in an immunomolecular assay

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1582956A (en) * 1976-07-30 1981-01-21 Ici Ltd Composite magnetic particles
US4376110A (en) * 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
DE3100535A1 (de) 1981-01-10 1982-08-12 Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach "neue carbonsaeure-derivate, ihre herstellung und ihre verwendung als arzneimittel"
FR2571498B1 (fr) * 1984-10-04 1988-04-08 Immunotech Sa Procede de separation de cellules utilisant des anticorps et des billes de faible densite
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4618525A (en) * 1985-06-03 1986-10-21 Minnesota Mining And Manufacturing Company Coated glass microbubbles and article incorporating them
US4824776A (en) * 1985-07-25 1989-04-25 Molecular Biosystems, Inc. Method for increasing the sensitivity of nucleic acid hybridization assays
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4933447A (en) * 1987-09-24 1990-06-12 Ss Pharmaceutical Co., Ltd. Quinoline derivatives
US4957656A (en) 1988-09-14 1990-09-18 Molecular Biosystems, Inc. Continuous sonication method for preparing protein encapsulated microbubbles
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5766849A (en) * 1989-07-11 1998-06-16 Gen-Probe Incorporated Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence
US5427930A (en) 1990-01-26 1995-06-27 Abbott Laboratories Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction
SE9002480D0 (sv) * 1990-07-23 1990-07-23 Hans Lilja Assay of free and complexed prostate-specific antigen
EP0488152A3 (en) 1990-11-30 1992-11-25 Hitachi, Ltd. Method for immunoassay and apparatus therefor
WO1992015708A1 (en) * 1991-02-27 1992-09-17 Amoco Corporation Methods for improving the sensitivity of hybridization assays
IE920778A1 (en) 1991-03-12 1992-09-23 Du Pont Method for specific binding assays using a releasable ligand
US5665539A (en) * 1991-07-12 1997-09-09 The Regents Of The University Of California Immuno-polymerase chain reaction system for antigen detection
US6723303B1 (en) * 1991-09-17 2004-04-20 Amersham Health, As Ultrasound contrast agents including protein stabilized microspheres of perfluoropropane, perfluorobutane or perfluoropentane
JP2823959B2 (ja) 1991-10-24 1998-11-11 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 改良された取り込みおよびその他の性質を持つ誘導化オリゴヌクレオチド
US5270184A (en) * 1991-11-19 1993-12-14 Becton, Dickinson And Company Nucleic acid target generation
US6172208B1 (en) * 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
DE4232755A1 (de) 1992-09-26 1994-03-31 Schering Ag Mikropartikelpräparationen aus biologisch abbaubaren Mischpolymeren
JP3778925B2 (ja) * 1993-01-15 2006-05-24 ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク 高感度核酸サンドイッチハイブリダイゼーション検定法及びキット
US5985548A (en) * 1993-02-04 1999-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Amplification of assay reporters by nucleic acid replication
EP0698792B1 (en) * 1993-05-10 2003-07-02 Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. Method for assaying more than one immunological ligand, and assay reagent and kit therefor
US5635602A (en) * 1993-08-13 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates
US5681697A (en) * 1993-12-08 1997-10-28 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor
US5599677A (en) * 1993-12-29 1997-02-04 Abbott Laboratories Immunoassays for prostate specific antigen
US5648213A (en) * 1994-08-30 1997-07-15 Beckman Instruments, Inc. Compositions and methods for use in detection of analytes
JPH08178926A (ja) * 1994-10-25 1996-07-12 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd イムノアッセイプレートおよびその用途
NZ295528A (en) 1994-11-15 1999-03-29 Upjohn Co Bicyclic oxazine and thiazine oxazolidinone antibacterials
SE504798C2 (sv) * 1995-06-16 1997-04-28 Ulf Landegren Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten
DE19524133A1 (de) * 1995-07-03 1997-01-09 Bayer Ag Die Verwendung von neuen und bekannten kationischen 4,5-Dihydro-1H-1,2,3-triazoliumverbindungen als Farbstoffe, neue kationische 4,5-Dihydro-1H-1,2,3-triazoliumverbindungen und deren Herstellung
NO301198B1 (no) 1995-07-14 1997-09-22 Alcatel Kabel Norge As Kabel, fremgangsmåte og impregneringsmasse
US5655539A (en) * 1996-02-26 1997-08-12 Abbott Laboratories Method for conducting an ultrasound procedure using an ultrasound transmissive pad
AT403803B (de) 1996-04-19 1998-05-25 Sanochemia Ltd Neue benzazepinderivate, diese enthaltende arzneimittel und verwendung derselben zum herstellen von arzneimitteln
US6165942A (en) * 1996-10-03 2000-12-26 Nissan Chemical Industries, Ltd. Heterocycle-fused pyrimidinone derivative and herbicidal composition
US6083484A (en) * 1996-10-17 2000-07-04 Molecular Biosystems, Inc. Microparticles stabilized by polynuclear chromium complexes and their use as ultrasound contrast agents
US6245318B1 (en) 1997-05-27 2001-06-12 Mallinckrodt Inc. Selectively binding ultrasound contrast agents
US6086540A (en) * 1997-10-07 2000-07-11 Molecular Biosystems, Inc. Methods of ultrasound imaging using echogenically persistent contrast agents
US6531278B1 (en) * 1998-01-14 2003-03-11 Utah State University Ligand-DNA composition for capture and detection of contaminants on a solid surface
CA2326386A1 (en) * 1998-04-28 1999-11-04 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to separation processes
US8063190B2 (en) * 1998-06-02 2011-11-22 Tom Robin Caine Boyde Nucleic acid-linked conjugates and methods for making and using them
US6214566B1 (en) * 1998-11-16 2001-04-10 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Method for detecting anti-squalene antibodies
JP2003526328A (ja) 1999-01-11 2003-09-09 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ Ｄｎａの等温増幅
WO2001027630A2 (en) * 1999-10-13 2001-04-19 The University Of British Columbia Methods to identify compounds that modulate neuronal activity
CA2391534A1 (en) * 1999-11-15 2001-05-25 Drug Innovation & Design, Inc. Selective cellular targeting: multifunctional delivery vehicles
SE516272C2 (sv) † 2000-02-18 2001-12-10 Ulf Landegren Metoder och kit för analytdetektion mha proximitets-probning
US7306904B2 (en) * 2000-02-18 2007-12-11 Olink Ab Methods and kits for proximity probing
US6511809B2 (en) * 2000-06-13 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter
CA2412664A1 (en) 2000-06-15 2001-12-20 Board Of Regents The University Of Texas System Regulatable, catalytically active nucleic acids
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US20020132260A1 (en) 2001-02-22 2002-09-19 Erlander Mark G. Quantitative immunohistochemistry (QIHC)
WO2002083951A1 (en) 2001-04-10 2002-10-24 Northeastern University Multiplexed ligand/protein binding assays with pna labels
EP1249500A1 (de) 2001-04-12 2002-10-16 chimera biotec GmbH Verfahren zum Nachweis einer Substanz
US6670386B2 (en) 2001-07-31 2003-12-30 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic modulators of androgen receptor function
CN1871517A (zh) 2002-02-19 2006-11-29 免疫公司 快速有效分离循环癌细胞的方法和试剂
EP1483585B1 (en) * 2002-03-08 2009-03-04 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Encoded self-assembling chemical libraries (esachel)
CA2872136C (en) * 2002-07-18 2017-06-20 Merus B.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
BR0313405A (pt) * 2002-08-12 2005-07-12 Takeda Pharmaceutical Compostos, métodos para preparar um composto e para prevenir e/ou tratar câncer, prodroga, medicamento, modulador do receptor de androgênio, agente para prevenir e/ou tratar hipogonadismo ou pertubação climatérica masculina, osteoporose e câncer, e, uso de um composto
ES2463420T3 (es) * 2002-11-01 2014-05-27 Iris International, Inc. Inmuno-PCR sándwich por desplazamiento
US7932060B2 (en) * 2003-04-18 2011-04-26 Becton, Dickinson And Company Immuno-amplification
WO2006012356A2 (en) * 2004-06-23 2006-02-02 Washington University Methods for determining risk of developing regular smoking behavior
CA2580856A1 (en) 2004-09-20 2006-03-30 Xenon Pharmaceuticals Inc. Heterocyclic derivatives and their use as stearoyl-coa desaturase inhibitors
PT1842226E (pt) 2004-11-03 2010-11-29 Iris Molecular Diagnostics Inc Detecção homogénea de analitos
WO2006137933A2 (en) 2004-11-03 2006-12-28 Leucadia Technologies, Inc. Microbubbles for affinity separation
JP4692200B2 (ja) 2005-10-06 2011-06-01 横河電機株式会社 化学処理用カートリッジおよびその使用方法
WO2009105264A1 (en) * 2008-02-21 2009-08-27 Iris International Inc. Method for early determination of recurrence after therapy for prostate cancer

Also Published As

Publication number Publication date
US9234890B2 (en) 2016-01-12
US20120082988A1 (en) 2012-04-05
KR20070105967A (ko) 2007-10-31
ES2352041T3 (es) 2011-02-15
WO2006137932A2 (en) 2006-12-28
CN101137758B (zh) 2012-10-10
CA2585781A1 (en) 2006-12-28
ATE480643T1 (de) 2010-09-15
EP1842226B2 (en) 2014-07-02
EP1842226B1 (en) 2010-09-08
WO2006137932A3 (en) 2007-09-20
JP2012120534A (ja) 2012-06-28
US20080131883A1 (en) 2008-06-05
AU2005333156B2 (en) 2011-05-26
WO2006137932A9 (en) 2007-02-15
DK1842226T3 (da) 2010-10-18
PT1842226E (pt) 2010-11-29
AU2005333156A1 (en) 2006-12-28
EP1842226A2 (en) 2007-10-10
JP5188808B2 (ja) 2013-04-24
JP2008518605A (ja) 2008-06-05
EP1842226A4 (en) 2009-08-05
CN103146808A (zh) 2013-06-12
US8338579B2 (en) 2012-12-25
DE602005023529D1 (de) 2010-10-21
CN101137758A (zh) 2008-03-05

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