ES2315769T3 - Mejoramiento de fosfatasa alcalina con sds en sustratos quimioluminiscentes y ensayos de inhibicion enzimatica. - Google Patents
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Abstract
Un método para mejorar la quimioluminiscencia de una molécula que es capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente que comprende: (a) Proveer una molécula que es capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente, un surfactante dicatiónico ó policatiónico, y un mejorador hidrofóbico aniónico que tiene la fórmula R 1 X - A + , donde R 1 es un grupo hidrofóbico que puede ser una fracción de hidrocarburo sustituido ó no sustituido seleccionado del grupo que consiste de alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, y aralquilo, X - es una fracción aniónica covalentemente adjunta a la fracción R 1 , y A + es un contracatión; y (b) Activar la molécula que es capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente.
Description
Mejoramiento de fosfatasa alcalina con SDS en
sustratos quimioluminiscentes y ensayos de inhibición
enzimática.
Esta invención se relaciona generalmente con
ensayos analíticos, en particular ensayos de hibridización, y
química de ácidos nucleicos. La invención se relaciona con métodos
para preparar oligonucleótidos marcados que proveen una señal con
actividad altamente específica de detección y que genera una señal
objetivo-dependiente en ensayos de hibridización de
ácidos nucleicos minimizando el ruido de fondo que deriva
primariamente del uso de una población heterogénea de sondas
marcadas. La invención también se relaciona a métodos para mejorar
la sensibilidad y velocidad de ensayos analíticos que incluyen la
generación de señales químioluminiscentes, y el uso de tales
métodos de mejoramiento para proveer un ensayo de hibridización de
ácido nucleico que tenga una señal con actividad altamente
específica de detección y mínimo ruido de fondo. La invención
también tiene aplicaciones en genotipificación, antisentido y
terapéuticas de aptámeros, análisis mutacional y mapeo discontinuo
de sondas.
Los ensayos de hibridización de ácidos nucleicos
son usados comúnmente en investigación genética, investigación
biomédica y diagnósticos clínicos. En un ensayo básico de
hibridización de ácidos nucleicos, un analito de ácido nucleico de
cadena simple es hibridizado a una sonda marcada de ácido nucleico
de cadena simple y los duplos marcados resultantes son detectados.
Se han desarrollado variaciones de este esquema básico para mejorar
la precisión, facilitar la separación de materiales extraños de los
duplos que van a a ser detectados, y/o amplificar la señal que sea
detectada. Son descritos métodos para detectar un oligonucleótido
objetivo en una muestra, por ejemplo, en WO 92/08808, EP 05 26 912,
EP 06 22 464, EP 0 265 244 y EP 0 421 725.
Uno de esos ensayos es descrito en detalle en la
Patente U.S. No. 4,868,105 comúnmente asignada a Urdea et
al. Ese ensayo involucra el uso de un sistema de captura de dos
partes diseñado para enlazar el analito polinucleótido a un soporte
sólido, y un sistema de marcado de dos partes diseñado para enlazar
una marca detectable al analito polinucleótido que va a ser
detectado ó cuantificado. El sistema de captura de dos partes
involucra el uso de sondas de captura enlazadas a un soporte sólido
y moléculas extensoras de captura que hibridizan a ambos a un
segmento de las sondas de captura y a un segmento del analito
polinucleótido. El sistema de marcado de dos partes involucra el
uso de moléculas extensoras de marcado que se hibridizan a un
segmento del analito polinucleótido, y sondas marcadas que se
hibridizan a las moléculas extensoras de marcado y contienen o se
enlazan a una marca detectable.
Conjugados oligonucleótidos de fosfatasa
alcalina (véase, por ejemplo, EP 0 317 077) son comúnmente usados
como el componente generador de señal de tales ensayos de
hibridización. Agregando un sustrato apropiado, por ejemplo, un
fosfato dioxetano disparado por enzimas (Schaap et al. (1987)
Tet. Lett. 28:1159-1162 y EPA Pub. No. 0254051)
produce una señal quimioluminiscente detectable. Sin embargo, el
nivel de ruido de fondo puede no ser ideal en tal ensayo debido, en
parte, a la población heterogénea de moléculas de fosfatasa alcalina
disponibles para conjugación, lo cual contribuye a enlaces no
específicos de sondas marcadas. Relación baja de
señal-a-ruido puede también resultar
de la preparación de sondas marcadas de fosfatasa alcalina por
conjugación de oligonucleótidos a la enzima bajo condiciones que
permiten la conjugación de sitios reactivos en ó cerca del sitio
activo de la enzima, de ese modo reduciendo la actividad enzimática
específica de fosfatasa alcalina.
La fosfatasa alcalina es obtenida típicamente a
partir de mucosa intestinal de bovino o ternero. Fosfatasa alcalina
altamente purificada puede ser obtenida en un proceso de cuatro
pasos que produce fracciones hidrofílicas e hidrofóbicas de la
enzima (Bublitz et al. (1993) Eur. J. Biochem.
217:199-207).
La fosfatasa alcalina intestinal bovina ó de
ternero puede ser separada en cinco fracciones que corresponden a
(I) un dímero sin ancla, (II) un tetrámero con cuatro moléculas
ancla glicosilfosfatidilinositol, (III) un tetrámero como en (II)
con dos ácidos grasos adicionales enlazados a inositol en una mitad
del tetrámero, (IV) un octámero con dos moléculas de ácidos grasos
por cada subunidad de fosfatasa alcalina y (V) un octámero con tres
moléculas de ácidos grasos por cada subunidad de fosfatasa alcalina
(Bublitz et al., supra). De este modo, el número de
subunidades de fosfatasa alcalina, la ausencia ó presencia de
moléculas ancla glicosilfosfatidilinositol y la ausencia ó
presencia de varios números de moléculas de ácidos grasos por
subunidad, contribuyen a la heterogeneidad de la población de
fosfatasa alcalina típicamente usada para preparar sondas de
oligonucleótido marcadas. El carácter hidrofóbico de las moléculas
ancla glicosilfosfatidilinositol y los residuos de ácidos grasos en
fracciones (II) a (V) se cree que contribuyen al ruido de fondo en
los ensayos de hibridización de ácido nucleico.
Puede resultar ruido de fondo no deseado del uso
de un conjugado oligonucleótido de fosfatasa alcalina preparado
bajo condiciones donde se forman conjugados en varios sitios en la
enzima, incluyendo en el sitio enzimático activo. Esta fuente de
heterogeneidad en la población de conjugado de la sonda enzimática
resulta en una sonda de marcado con menos del ideal de actividad
enzimática específica.
La falta de una población homogénea de sondas de
oligonucleótido detectablemente marcadas teniendo alta actividad
específica de detección puede limitar la sensibilidad y la precisión
de ensayos típicos de hibridización de ácido nucleico.
Adicionalmente, mientras el uso de sustratos
tales como dioxetanos quimioluminiscentes provee una manera
altamente sensible de detectar métodos de ensayo vinculado con
enzimas, la sensibilidad y velocidad de tales ensayos puede ser
incrementada con el uso de surfactantes dicatiónicos como es
revelado en Publicación EPA No. 0630884. Tales surfactantes mejoran
la quimioluminiscencia producida por la descomposición de compuestos
quimioluminiscentes, por ejemplo, 1,2-dioxetanos
disparados por agentes disparadores como enzimas. Otros mejoradores
con efectos similares son surfactantes policatiónicos como es
revelado en Patente U.S. No. 5,145,772. Estos mejoradores
policatiónicos son sales de amonio cuaternarias poliméricas tales
como poli(cloruro vinilbenziltrimetilamonio). Posteriores
métodos para mejorar la quimioluminiscencia son descritos en US 5
094 939 y EP 0 534 380.
Será reconocido por aquellos expertos en la
técnica que futuras mejoras en la intensidad de luz detectable
producida por la quimioluminiscencia de dioxetano químicamente
disparada proveerá ventajas adicionales en ensayos que usen estos
procesos.
La presente invención puede ser aplicada a
métodos para detectar analitos de ácido nucleico en una muestra. En
general, los métodos suponen ensayos de hibridización en fase de
solución en un formato competitivo, de ensayo indirecto que permite
la regulación de condiciones de hibridización así mejorando la
sensibilidad y especificidad del ensayo.
Se proveen composición y métodos para mejorar la
quimioluminiscencia de una molécula que es capaz de ser activada
para generar una señal quimioluminiscente. Métodos de ensayo son
descritos para detectar analitos de ácido nucleico en una muestra
usando estas composiciones y métodos. En general, las composiciones
incluyen mejoradores quimioluminiscentes aniónicos hidrofóbicos y
los métodos suponen proveer tales mejoradores en un ensayo ó
técnica analítica donde una señal quimioluminiscente es generada de
ese modo mejorando la sensibilidad y especificidad del ensayo.
Adicionalmente, los métodos para detectar analitos de ácido nucleico
implementando los métodos ó composiciones de la invención en una
muestra suponen un ensayo de hibridización en fase de solución en
un formato competitivo, de ensayo indirecto que permite la
regulación de condiciones de hibridización de ese modo mejorando la
sensibilidad y especificidad del ensayo.
Es un objetivo de esta invención proveer un
método para mejorar la quimioluminiscencia de una molécula que es
capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente. El
método supone proveer una molécula que es capaz de ser activada
para generar una señal quimioluminiscente, un surfactante
dicatiónico o policatiónico y un mejorador aniónico hidrofóbico y
activando la molécula.
En otro objetivo de la invención el proveer una
composición que incluye una molécula que es capaz de ser activada
para generar una señal quimioluminiscente, un surfactante
dicatiónico ó policatiónico y un mejorador aniónico
hidrofóbico.
La presente invención por lo tanto provee un
método para mejorar la quimioluminiscencia de una molécula que es
capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente que
comprende:
- (a)
- Proveer una molécula que es capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente, un surfactante dicatiónico ó policatiónico, y un mejorador aniónico hidrofóbico que tiene la fórmula R^{1}X^{-}A^{+}, donde R^{1} es un grupo hidrofóbico que puede ser una fracción sustituida ó no sustituida de hidrocarburo seleccionada del grupo que consiste de alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, y aralquilo, X^{-} es una fracción aniónica enlazada covalentemente a la fracción R^{1}, y A^{+} es un contracatión; y
- (b)
- Activar la molécula que es capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención además provee una
composición que comprende:
- (a)
- Una molécula que es capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente;
- (b)
- Un surfactante dicatiónico ó policatiónico; y
- (c)
- un mejorador aniónico hidrofóbico que tiene la fórmula R^{1}X^{-}A^{+}, donde R^{1} es un grupo hidrofóbico que puede ser una fracción sustituida ó no sustituida de hidrocarburo seleccionada del grupo que consiste de alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, y aralquilo, X^{-} es una fracción aniónica enlazada covalentemente a la fracción R^{1}, y A^{+} es un contracatión.
La invención puede ser aplicada para proveer una
hibridización indirecta, competitiva de ácido nucleico en la cual
se usan moléculas "extensoras de captura", que se enlazan a
moléculas "extensoras de marcado" que sucesivamente se enlazan
a sondas de marcado que tienen una marca detectable enlazada a esto
que es capaz de generar una señal quimioluminiscente activando una
molécula que es capaz de ser activada para generar una señal
quimioluminiscente. En un formato preferido, extensores de captura
son sondas de puenteo que se enlazan a "sondas de captura"
soporte enlazadas como también a extensores de marcado y a secuencia
nucleótido objetivo en un analito, y moléculas extensoras de
marcado son sondas de puenteo que se enlazan a los extensores de
captura como también a "sondas de marcado", es decir,
segmentos oligonucleótidos que tienen una marca detectable enlazada
a esto que es capaz de generar una señal quimioluminiscente
disparando un 1,2-dioxetano estable. En un formato
alterno, extensores de marcado son sondas de puenteo que se enlazan
a sondas de marcado como también a extensores de captura y una
secuencia de nucleótidos objetivo en un analito y moléculas
extensoras de captura son sondas de puenteo que se enlazan a las
moléculas extensoras de marcado como también a sondas de
captura.
La provisión de una población homogénea de
sondas de marcado y métodos para su preparación es también
descrita.
En una modalidad, tales sondas de marcado son
incorporadas en el novedoso formato de ensayo revelado. Tales
sondas de marcado tienen actividad enzimática específica mejorada y
generan mejor detección de señal de ensayo. También descrita esta
la provisión de formatos de ensayo que tienen mejorada sensibilidad
y selectividad de detección de analito que incorporan sondas de
marcado de forma molecular sencilla que tienen actividad enzimática
especifica mejorada y generan mejor detección de señal de ensayo.
Las sondas de marcado son preparadas con un método que supone
purificación de fosfatasa alcalina hidrofílica, sin anclaje,
conjugación de la enzima a una sonda oligonucleotídica bajo
condiciones en las cuales el sitio activo de la enzima es protegido
de conjugación y la conjugación del oligonucleótido a la enzima es
sitio-dirigido, y posterior purificación de la
sonda de marcado así preparada.
En una modalidad, la invención se relaciona a un
método para mejorar la quimioluminiscencia generada de un
1,2-dioxetano estable proveyendo un dioxetano, un
surfactante dicatiónico o policatiónico y un mejorador aniónico
hidrofóbico que tiene la formula R^{1}X^{-}A^{+}, donde
R^{1} es un grupo hidrofóbico que puede ser una fracción
sustituida ó no sustituida de hidrocarburo seleccionada del grupo
que consiste de alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo,
y aralquilo, X^{-} es una fracción aniónica enlazada
covalentemente a la fracción R^{1}, y A^{+} es un
contracatión.
En otra modalidad de la invención, se provee una
composición que contiene 1,2-dioxetano, estable, un
surfactante dicatiónico ó policatiónico y un mejorador aniónico
hidrofóbico que tiene la fórmula R^{1}X^{-}A^{+}, donde
R^{1} es un grupo hidrofóbico que puede ser una fracción
sustituida ó no sustituida de hidrocarburo seleccionada del grupo
que consiste de alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo,
y aralquilo, X^{-} es una fracción aniónica enlazada
covalentemente a la fracción R^{1}, y A^{+} es un
contracatión.
En una modalidad del formato de ensayo
implementando el método de la invención, una muestra que contiene ó
es sospechada de contener un analito que tiene una secuencia de
nucleótido objetivo es primero incubado con un complejo hibrido
extensor de captura soporte-enlazado sonda/captura
bajo primeras condiciones de hibridización. La mezcla de reacción
así producida, conteniendo híbridos no complejos extensores de
captura sonda/captura y complejos de captura sonda/captura
extensor/analito, es entonces incubada con moléculas extensoras de
marcado y moléculas de sonda de marcado bajo segundas condiciones
de hibridización. Complejos formados entre los híbridos extensores
de captura no complejos sonda/captura y los híbridos de sonda de
marcado extensor/marcado son entonces detectados detectando la
quimioluminiscencia usando el método descrito arriba y la
composición para mejorar la quimioluminiscencia. La cantidad de
señal detectada es inversamente proporcional a la cantidad de
analito presente en la muestra.
En otra modalidad del formato de ensayo
implementando el método de la invención, una muestra que contiene o
se sospecha que contiene un analito que contiene una secuencia de
nucleótido objetivo es incubado con complejos híbridos extensores
de marcado sonda/marcado bajo primeras condiciones de hibridización.
La mezcla de reacción así producida que contiene híbridos no
complejos extensores de marcado sonda/marcado y complejos de marcado
sonda/marcado extensor/analito es entonces incubado con moléculas
extensoras de captura y de sonda de captura
soporte-enlace bajo segundas condiciones de
hibridización. Complejos formados entre los híbridos no complejos
extensores de marcado sonda/marcado y los híbridos de sonda de
captura extensor/captura son entonces detectados usando el método
descrito arriba y la composición para mejorar la
quimioluminiscencia. La cantidad de señal detectada es inversamente
proporcional a la cantidad de analito presente en la muestra.
Objetivos adicionales, ventajas y
características novedosas de la invención serán expuestos en parte
en la descripción que sigue, y en parte se harán aparentes a
aquellos diestros en la ciencia en examen de lo siguiente, ó podrán
ser aprendidos con la práctica de la invención.
La Fig. 1 es un diagrama de un formato de ensayo
de hibridización indirecto, fase emparedado de solución competitiva
en el que una muestra es primero incubada con un complejo híbrido
extensor de marcado sonda/marcado.
La Fig. 2 ilustra un ensayo de hibridización
indirecto, fase emparedado de solución competitiva en el que una
muestra es primero incubada con un complejo híbrido
soporte-enlace extensor de captura
sonda/captura.
La Fig. 3 es una gráfica que ilustra el curso de
tiempo del desarrollo de la señal quimioluminiscente generada en la
ausencia (triángulos sólidos) ó presencia (cuadrados sólidos) del
mejorador hifrofóbico aniónico sulfato dodecil de sodio en un
ensayo de fosfatasa alcalina soluble.
La Fig. 4A es una gráfica que representa el
efecto del mejorador hidrofóbico aniónico sulfato dodecil de sodio
en la quimioluminiscencia de fondo generada en la ausencia
(triángulos sólidos) ó presencia (cuadrados sólidos) del mejorador
en un ensayo de fosfatasa alcalina soluble.
La Fig. 4B es una gráfica que muestra el efecto
del dodecil sulfato de sodio en la quimioluminiscencia generada en
la ausencia (triángulos sólidos) y presencia (cuadrados sólidos) de
fosfatasa alcalina soluble. En la Fig. 4B, los datos son trazados
en una escala logarítmica.
La Fig. 5 es una gráfica mostrando el efecto en
de la concentración de dodecil sulfato de sodio (cuadrados sólidos)
y Brij-35 (triángulos sólidos) en la
quimioluminiscencia generada en un ensayo de fosfatasa alcalina
soluble donde la fosfatasa alcalina es conjugada a una sonda de
oligonucleótido.
Antes de revelar la presente invención y
describirla en detalle, debe ser entendido que esta invención no
está limitada a formatos de ensayo específicos, materiales ó
reactivos, como tales podrán, por supuesto, variar. También debe
ser entendido que la terminología usada aquí es para el propósito de
describir solamente modalidades particulares y no pretende ser
limitante.
Debe ser notado que, como es usado en la
especificación y las reivindicaciones agregadas, las formas
singulares "un", "a" y "el" incluyen referentes
plurales a no ser que el contexto claramente dicte lo contrario. De
este modo, por ejemplo, referencia a "un grupo hidrofóbico"
incluye dos ó más de tales grupos hidrofóbicos, referencia a "un
extensor de marcado" incluye mezclas de tales moléculas,
referencia a "una secuencia nucleotídica objetivo" incluye
mezclas de dos ó más de tales secuencias, y similares.
En esta especificación y en las reivindicaciones
que siguen, se hará referencia a un número de términos que serán
definidos para tener los siguientes significados:
Como usado aquí, los términos
"polinucleótido" y "oligonucleótido" serán genéricos a
polideoxirribonucleótidos (que contienen
2-deoxi-D-ribosa), a
polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), a
cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un
N-glicósido de una base de purina o pirimidina, y a
otros polímeros que contienen esqueletos no nucleotídicos (por
ejemplo, ácidos nucleicos de proteínas y polímeros sintéticos de
ácidos nucleicos con secuencia-especifica
comercialmente disponibles del Anti-Gene Development
Group, Corvallis, Oregon, como polímeros NeugeneÔ), asumiendo que
los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita
emparejamiento de bases y apilamiento de bases, como es encontrado
en el ADN y ARN. No hay distinción pretendida de longitud entre el
término "polinucleótido" y "oligonucleótido", y estos
términos serán usados intercambiablemente. Estos términos se
refieren solamente a la estructura primaria de la molécula. Así,
estos términos incluyen ARN de doble y simple cadena e híbridos de
ADN:ARN, y también incluye tipos conocidos de modificaciones, por
ejemplo, marcas que son conocidas en la ciencia, metilación, 0'',
sustitución de uno ó más de los nucleótidos que ocurren
naturalmente con un análogo, modificaciones
inter-nucleótido como, por ejemplo, aquellos con
enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos,
fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces
cargados (por ejemplo, fosforotrioatos, fosforoditioatos, etc.),
aquellos que contienen fracciones colgantes, tales como, por
ejemplo, proteínas (incluyendo nucleasas, toxinas, anticuerpos,
péptidos de señal, poli-L-lisina,
etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen,
etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales,
metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que
contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por
ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), como también
formas no modificadas de los polinucleótidos u oligonucleó-
tidos.
tidos.
Será apreciado que, según se usan aquí, los
términos "nucleósido" y "nucleótido" incluirán aquellas
fracciones que contienen no solamente las bases de purina y
pirimidina conocidas, sino también otras bases heterocíclicas que
hayan sido modificadas. Tales modificaciones incluyen purinas ó
pirimidinas metiladas, purinas ó pirimidinas aciladas, u otros
heterociclos. Nucleósidos ó nucleótidos modificados también
incluirán modificaciones en la fracción azúcar, por ejemplo, donde
uno ó más de los grupos hidroxilo son remplazados con halógeno,
grupos alifáticos, ó son funcionalizados como ésteres, aminas ó
similares.
El término "analito polinucleótido" se
refiere a una molécula de ácido nucleico de cadena simple ó doble
que contiene una secuencia objetivo de nucleótido. Los ácidos
nucleicos de analito pueden ser de una variedad de fuentes, por
ejemplo, fluidos ó sólidos biológicos, materias comestibles,
materiales ambientales, etc., y pueden ser preparados para el
análisis de hibridización por una variedad de formas, por ejemplo,
sulfato de dodecil K/sodio proteinasa ("SDS"), sales
caotrópicas, ó similares. El término "analito polinucleótido"
es usado intercambiablemente aquí con los términos "analito",
"analito de ácido nucleico", "objetivo", y "molécula
objetivo".
Como es usado aquí, el término "región
objetivo", "secuencia objetivo" ó "secuencia nucleótido
objetivo" hace referencia a una región de enlace de sonda
contenida dentro de la molécula objetivo. El término "secuencia
objetivo" hace referencia a una secuencia con la cual una sonda
formará un híbrido estable bajo condiciones deseadas.
Como es usado aquí, el término "sonda" hace
referencia a una estructura compuesta de un polinucleótido, como se
definió arriba, que contiene una secuencia nucleotídica
complementaria de una secuencia nucleotídica presente en la
molécula objetivo. Las regiones polinucleotídicas de sondas pueden
estar compuestas de ADN, y/o ARN, y/o análogos sintéticos de
nucleótido.
Será evidente que las secuencias de enlace no
deben tener perfecta complementariedad para proveer híbridos
estables. En muchas situaciones, se formarán híbridos estables donde
menos de aproximadamente 10% de las bases son mal emparejadas,
ignorando lazadas de cuatro ó más nucleótidos. Por consiguiente,
como es usado aquí, el término "complementariedad" se refiere
a un oligonucleótido que forma una dupla estable con su
"complemento" bajo condiciones de ensayo, generalmente donde
existe aproximadamente 90% ó más de homología. Típicamente, tales
secuencias de unión complementaria contendrán aproximadamente 15 a
50, preferiblemente 15 a 30, nucleótidos.
Los polinucleótidos usados aquí pueden ser
ensamblados usando una combinación de síntesis oligonucleotídica
directa de fase sólida y métodos de ligadura enzimática, como son
descritos en detalle en Publicación PCT No. WO92/02526.
Un "agente de protección de sitio activo de
fosfatasa alcalina" hace referencia a un compuesto que se enlaza
a fosfatasa alcalina en el sitio activo, de ese modo protegiendo de
modificación química a los aminoácidos contenidos en el sitio
activo. Tales agentes de protección de sitio activo de fosfatasa
alcalina pueden ser sustratos de fosfatasa alcalina tales como
fosfato, análogos de sustrato tales como ácidos fosfóricos y
compuestos de ácido arsónico, que son análogos de fosfato, u otros
inhibidores de fosfatasa alcalina. Agentes de protección de sitio
activo de fosfatasa alcalina preferidos son inhibidores competitivos
u otros compuestos que tienen afinidad de unión reversible para el
sitio activo de la enzima.
Como es usado aquí, una "muestra biológica"
hace referencia a una muestra de tejido ó fluido aislado de un
individuo, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo, plasma,
suero, fluido medular, semen, fluido linfático, las secciones
externas de la piel, tractos respiratorios, intestinales, y
genitourinarios, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas,
tumores, órganos y también muestras de constituyentes de cultivo
celular in vitro (incluyendo pero no limitado a medio
acondicionado resultante del cultivo de células en medio de cultivo
celular, células putativamente viralmente infectadas, células
recombinantes y componentes celulares). Usos preferidos del
presente método son en la detección y/o cuantificación de
polinucleótidos que codifican antígenos virales, tales como del
virus hepatitis B ("HBV"), virus de hepatitis C ("HCV"),
virus de hepatitis D ("HDV"), virus de inmunodeficiencia
humana ("HIV"), y la familia herpes de los virus, incluyendo
zoster herpes (varicela), virus herpes simplex I & II,
citomegalovirus, virus Epstein-Barr, y el
recientemente aislado virus Herpes VI, y polinucleótidos que
codifican productos celulares tales como
citoquinas.
citoquinas.
Como es usado aquí, el término "enlace no
especifico" es usado para referirse a aquellos acontecimientos en
los que un polinucleótido se enlaza a un soporte solido, u otro
componente del ensayo, a través de una interacción- la cual puede
ser directa ó indirecta- que no involucra enlaces de hidrógeno para
polinucleótidos soporte-enlace.
Con "purificado" u "homogéneo" se
quiere decir, cuando se refiere a una secuencia polipéptida ó
nucleotídica, que la molécula indicada está presente en la ausencia
sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El
término "purificado" u "homogéneo" como es usado aquí
preferiblemente significa por lo menos 90% por peso, más
preferiblemente por lo menos 95% por peso, y de mejor preferencia
por lo menos 98% por peso, de macromoléculas biológicas presentes
del mismo tipo. Así, una "forma molecular singular" de un
oligonucleótido, un polipéptido ó un conjugado
oligonucleótido-polipéptido es una molécula que está
presente en forma purificada u
homogénea.
homogénea.
Una "población uniforme de sitios" para una
fosfatasa alcalina oligonucleotídica_{n}-conjugada
significa que 50%, preferiblemente 75%, más preferiblemente 80%,
aun más preferible 90%, del oligonucleótido puede ser encontrado en
fragmentos n trípticos. Por ejemplo, una población uniforme de
sitios para un conjugado de fosfatasa alcalina con un
oligonucleótido sencillo es indicada con un fragmento tríptico
sencillo que contiene oligonucleótido del conjugado de fosfatasa
alcalina.
Con fosfatasa alcalina de "actividad
enzimática alta especifica" se hace referencia a actividad
enzimática de por lo menos aproximadamente 2,000 a 3,000 unidades
por mg proteína enzimática. Una unidad de actividad representa la
cantidad de enzima capaz de catalizar la conversión de I mmol de
p-nitrofenil fosfato a p-nitrofenol por
minuto en dietanolamina/HCl, 1 M pH 9.8.
El término "1,2-dioxetano
estable" pretende abarcar compuestos de dioxetano que requieran
la aplicación de calor para su descomposición en dos productos
etónicos. La quimioluminiscencia es "disparada" cuando la
descomposición de un 1,2-dioxetano estable que de
otra forma produciría quimioluminiscencia ante descomposición
térmica es efectuada por un proceso que no requiere del uso de
calor. De este modo, la quimioluminiscencia de
1,2-dioxetano puede ser disparada por la adición de
base en solventes orgánicos, por iones de fluoruro, ó por la acción
de una enzima, tal como fosfatasa alcalina, para convertir
catalíticamente el 1,2-dioxetano en una especie
quimioluminiscente.
El término "alcohol" como es usado aquí se
refiere a alcoholes primarios, secundarios ó terciarios, carbinoles,
y alcoholes polihídricos donde los grupos sustituyentes son
ramificados ó no ramificados, cadenas de hidrocarburo saturadas ó
no saturadas que contienen 1 a 24 átomos de carbono. El término
"alcohol inferior" es destinado a un alcohol con un grupo
sustituyente de uno a seis átomos de carbono. Alcoholes preferidos
son alcoholes inferiores primarios que contienen un grupo
sustituyente de hidrocarburo saturado no ramificado.
El término "alquil" como es usado aquí hace
referencia a un grupo hidrocarburo saturado ramificado ó no
ramificado de 1 a 20 átomos de carbono, tales como metilo, etilo,
n-propilo, isopropilo, n-butilo,
isobutilo, t-butilo, octilo, decilo, tetradecilo,
hexadecilo, eicosil y similares. Grupos alquil preferidos aquí
contienen 1 a 12 átomos de carbono. El término "alquil
inferior" es destinado a un grupo alquil de uno a seis átomos de
carbono, preferiblemente uno a cuatro átomos de carbono. El término
"cicloalquil" es destinado a un grupo alquil cíclico,
típicamente de 3 a 6 átomos de carbono, más preferiblemente 4 a 5
átomos de carbono.
El término "alquileno" como es usado aquí
hace referencia a una cadena de hidrocarburo bifuncional saturada
ramificada ó no ramificada que contiene desde 1 a 20 átomos de
carbono, e incluye, por ejemplo, metileno (-CH_{2}-), etileno
(-CH_{2}-CH_{2}-), propileno
(-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-),
2-metilpropileno
[-CH_{2}-CH(-CH_{3})-CH_{2}-],
hexileno [-(CH_{2})_{6}-] y similares. "Alquileno
inferior" hace referencia a un grupo alquileno de 1 a 6, más
preferiblemente 1 a 4, átomos de carbono.
Los términos "alquenil" y
"alquenileno" respectivamente hacen referencia a una cadena de
hidrocarburo monofuncional y una bifuncional ramificada ó no
ramificada que contiene desde 2 a 24 átomos de carbono y por lo
menos un doble enlace. "Alquenileno inferior" hace referencia
a un grupo alquenileno de 2 a 6, más preferiblemente 2 a 5, átomos
de carbono.
Los términos "alquinil" y
"alquinileno" respectivamente hacen referencia a una cadena de
hidrocarburo monofuncional y una bifuncional ramificada ó no
ramificada que contiene desde 2 a 20 átomos de carbono y por lo
menos un triple enlace. "Alquenileno inferior" hace referencia
a un grupo alquenileno de 2 a 6, más preferiblemente 2 a 5, átomos
de carbono.
El término "aril" como es usado aquí hace
referencia a una especie aromática que contiene 1 a 5 anillos
aromáticos, pueden ser no sustituidos ó sustituidos con 1 ó más
sustituyentes típicamente seleccionados del grupo que consiste de
alquileno, alquenileno y alquinileno. El término "aralquil"
tiene como propósito una fracción que contiene especies de alquil
como también de arilo, que típicamente contienen menos de
aproximadamente 20 átomos de carbono, y más típicamente menos de
aproximadamente 12 átomos de carbono en el segmento alquil de la
fracción, y típicamente conteniendo 1 a 5 anillos aromáticos. El
término "aralquil" será usualmente utilizado para hacer
referencia a grupos alquil sustituidos con aril. El término
"aralquileno" será usado de una forma similar para hacer
referencia a fracciones que contienen especies de alquileno como de
arilo, que típicamente contienen menos de aproximadamente 20 átomos
de carbono en la porción alquileno y 1 a 5 anillos aromáticos en la
porción arilo, y típicamente alquileno sustituido con aril.
"Opcional" u "opcionalmente" significa
que el evento ó circunstancia descrita subsecuentemente puede ó no
puede ocurrir, y que la descripción incluye casos donde dicho evento
ó circunstancia ocurre y casos donde no. Por ejemplo, la frase
"opcionalmente lavado" significa que un paso de lavado puede ó
no puede ocurrir y que la descripción del método incluye proceder
con ó sin el paso de lavado.
En referencia ahora a los ensayos preferidos
implementando la invención representada en la Fig. 1 y Fig. 2, los
siguientes términos aplican al ensayo de hibridización representado
aquí.
"Sondas marcadas (LPs)" son diseñadas para
enlazarse a un extensor de marcado y contienen una fracción de
marcado que es capaz de generar una señal detectable. Varias formas
para proporcionar marcadores enlazados a una secuencia de ácido
nucleico han sido reportados en la literatura, Véase, por ejemplo:
Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad Sci. USA 80:4045; Renz
et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:3435; Richardson et
al. (1983) Nucl. Acids Res. 11:6167; Smith et al. (1985)
Nucl. Acids Res. 13:2399; Meinkoth et al. (1984) Anal.
Biochem. 138:267; Klibanov et al. (1989) Applied Biochem.
Biolechnol. 22:45; Grumbach et al. (1991) J. Immunol. Meth.
140:205; Forgac et al. (1992) Chemicke Listy 86:253; Sehgal
et al. (1994) Anal. Biochem. 218:87; y Lewis et al.
(1994) Bioconjugate Chem. 5:565. Los marcadores pueden enlazarse
covalente ó no covalentemente (por ejemplo, ionicamente, ó a través
de un complejo de alta afinidad tal como un vínculo
biotina-avidina) a la secuencia complementaria.
Marcadores que pueden ser utilizados incluyen radionuclidos,
fluorescentes, quimioluminiscentes, tinciones, enzimas, sustratos
de enzimas, cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas,
subunidades de enzimas, iones metálicos, y similares. Marcadores
específicos ilustrativos incluyen fluoresceína, rodamina, rojo
Texas, picoeritrina, umbeliferona, luminol, NADPH,
a-b-galactosidasa, peroxidasa de
rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.
Dependiendo de la naturaleza del marcador,
varias técnicas pueden ser utilizadas para detectar la presencia
del marcador. Para fluorescentes, un gran número de fluorómetros
diferentes están disponibles. Para quimioluminiscentes, están
disponibles luminómetros y películas. Con enzimas, un producto
fluorescente, quimioluminiscente, ó coloreado puede proveerse y
determinarse fluorométricamente, luminométricamente,
espectrofotométricamente o visualmente. Los diversos marcadores que
han sido utilizados en inmunoensayos y las técnicas aplicables a
inmunoensayos pueden ser utilizadas con los ensayos en materia.
\newpage
Una fracción de marcado preferida es la
fosfatasa alcalina. Métodos para usar un sustrato de fosfatasa
alcalina con fosfatasa alcalina como una fracción de marcado son
conocidos en la ciencia (Schaap et al., Tet. Lett.
28:1159-1162 (1987) y EPA Pub. No. 0254051).
LPs comprenden una región que tiene una
secuencia de ácidos nucleicos L-3 complementaria a
una secuencia de ácidos nucleicos L-2 presente
dentro de un extensor de marcado y están enlazados a, ó
estructurados para enlazarse a, un marcador que proporcione,
directa ó indirectamente, una señal detectable. La secuencia
L-3 está diseñada para ser complementaria solo a
L-2, y vice versa, y no para ser secuenciada en
ningún otro componente del sistema de ensayo. El LP puede tener
regiones adicionales no complementarias tales como regiones
separadoras flanqueando la secuencia L-3.
"Moléculas extensoras de sonda de marcado
(LEs)", también referidas aquí como "moléculas extensoras de
marcado" ó "extensores de marcado", contienen regiones de
complementariedad con respecto al analito polinucleótido y/o,
dependiendo del formato del ensayo, el extensor de captura
(L-1) y la sonda de marcado (L-2).
De ese modo, moléculas extensoras de marcado son cadenas
polinucleotídicas de cadena simple que comprenden una primera
región que tiene una secuencia de ácidos nucleicos
L-1 complementaria a una secuencia del analito
polinucleótido y/o una secuencia del extensor de captura, y una
segunda región que tiene una secuencia reconocimiento de sonda de
marcado L-2 complementaria a un segmento
L-3 de la sonda de prueba. El LE puede tener
regiones adicionales no complementarias tales como una región
separadora entre L-1 y L-2.
Dependiendo del formato del ensayo, "moléculas
extensoras de sonda de captura (CEs)", también referidas aquí
como "moléculas extensoras de captura" ó "extensores de
captura", se enlazan al analito polinucleótido y/o a la molécula
extensora de marcado y a sondas de captura (CPs), que en su turno se
enlazan a un soporte sólido. Así, moléculas extensoras de captura
son cadenas polinucleotídicas de cadena sencilla que componen una
primera región que tiene una secuencia de ácidos nucleicos
C-1 que es complementaria a una secuencia del
analito ó a una secuencia del extensor de marcado, y una segunda,
región no complementaria que tiene una secuencia de reconocimiento
de sonda de captura C-2. El CE puede tener regiones
adicionales no complementarias tales como una región separadora
entre C-1 y C-2.
En los formatos de ensayo revelados aquí, se
usará una secuencia de ácidos nucleicos L-1 ó una
C-1 que sea complementaria a una secuencia de
ácidos nucleicos en el analito, pero no se usarán ambas. En
cualquier formato, L-1 y C-1 son
secuencias de ácidos nucleicos complementarias.
"Sondas de captura (CPs)" se enlazan a los
extensores de captura y a un soporte sólido. De este modo, como es
ilustrado en la Fig. 1 y Fig. 2, las sondas de captura comprenden
una primera región que tiene una secuencia de ácidos nucleicos
C-3 complementaria a C-2 y una
segunda región por la cual los CPs son enlazados covalentemente a
(ó capaces de ser enlazados covalentemente a) un soporte sólido. La
secuencia C-3 está diseñada para ser complementaria
solo a C-2, y vice versa, y no para ser secuenciada
en cualquier otro componente del sistema de ensayo. Los CPs pueden
tener regiones adicionales no complementarias tales como regiones
separadoras flanqueando la secuencia C-2. Sondas de
captura pueden ser enlazadas a soportes sólidos como es descrito en
Publicación PCT No. WO93/13224, para crear un soporte sólido para
hibridización.
Generalmente, ensayos de hibridización de fase
de solución realizados usando el sistema ilustrado en la Fig. 1
proceden como sigue. Una muestra que contiene ó es sospechada de
contener un ácido nucleico de cadena simple incluyendo la secuencia
objetivo es incubada bajo las primeras condiciones de hibridización
con sonda de prueba y extensores de marcado. En este formato, el
extensor de marcado está diseñado para ser capaz de formar un
puente entre la sonda de prueba y la secuencia objetivo ó el
extensor de captura. El producto resultante es una mezcla de
complejos de ácidos nucleicos del analito polinucleótido enlazado a
híbridos extensores de marcado sonda/marcado e híbridos extensores
de marcado no enlazados sonda/marcado. Esta mezcla es entonces
añadida bajo segundas condiciones de hibridización a una fase
sólida que tiene extensores de captura hibridizados a sondas de
captura enlazadas a la superficie del mismo. El híbrido extensor de
marcado no enlazado sonda/marcado está disponible para
hibridizarse a los híbridos extensores de captura
soporte-enlazados sonda/captura.
En este formato de ensayo, la presencia de la
secuencia objetivo en la muestra reduce la población de sondas de
marcado que son capaces de hibridizarse al extensor de sonda de
captura soporte-enlazado. De ese modo, la señal
detectable que se enlaza al soporte sólido está relacionada
cuantitativamente al inverso de la cantidad de secuencia objetivo
en la muestra.
La cantidad de secuencia objetivo en la muestra,
como es reflejada por la señal detectable generada como se
describió arriba, puede ser calculada de una curva estándar. Una
curva estándar puede ser construida preparando una formulación
estándar que contiene una cantidad conocida de un oligonucleótido
que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es idéntica a
la secuencia objetivo. Unas series de diluciones son hechas usando
el estándar tal que la cantidad de oligonucleótido en las series de
dilución estándar corresponda al rango anticipado de cantidades de
secuencia objetivo en la muestra. Las series de dilución estándar
pueden ser usadas en el formato de ensayo descrito arriba para
generar series de señales detectables que corresponden a las
cantidades conocidas de oligonucleótido en las series de dilución
estándar. La cantidad de secuencia objetivo en la muestra puede
entonces ser calculada comparando la señal generada por la muestra
con las señales generadas por las series estándar de dilución.
Una alternativa, y preferible, de formato de
ensayo es esquematizada en la Fig. 2. En este formato, el extensor
de captura está diseñado para ser capaz de formar un puente entre la
sonda de captura y la secuencia objetivo del extensor de marcado.
La muestra es inicialmente incubada bajo las primeras condiciones de
hibridización con moléculas extensoras de captura hibridizadas a
las moléculas de sonda de captura soporte-enlazadas,
así produciendo una mezcla de híbridos de captura de
soporte-enlazados sonda/captura extensor/analito e
híbridos extensores libres de captura sonda/captura. Los híbridos
extensores libres de captura sonda/captura están disponibles para
hibridizarse con complejos híbridos extensores de marcado
sonda/marcado subsecuentemente añadidos. Después de la adición de
los complejos híbridos extensores de marcado sonda/marcado la mezcla
resultante es incubada bajo segundas condiciones de hibridización
para producir híbridos de sonda detectables de captura
sonda/captura extensor/marcado extensor/marcado y lavados para
remover complejos híbridos extensores no enlazados de marcado
sonda/marcado. La fase sólida con complejos enlazados detectables es
entonces separada de los materiales no enlazados, y leída.
En este formato de ensayo, la presencia de la
secuencia objetivo en la muestra disminuye la población de moléculas
extensoras de captura enlazadas a soporte que son capaces de
hibridizarse a los híbridos extensores de marcado sonda/marcado. De
este modo, como en el formato esquematizado en la Fig. 1, la señal
detectable que se enlaza al soporte sólido es relacionada
inversamente a la cantidad de secuencia objetivo en la muestra.
La cantidad de secuencia objetivo en la muestra,
como es reflejado por la señal detectable generada como se
describió arriba, puede ser calculada de una curva estándar como
descrito arriba.
Típicamente, la relación del híbrido extensor de
marcado sonda/marcado ó el híbrido extensor de captura sonda/captura
a los moles anticipados de analito será mayor que aproximadamente
1:1, preferiblemente por lo menos aproximadamente 10:1, más
preferiblemente por lo menos aproximadamente 25:1, y posiblemente
tan alto como 100:1 ó mas alto. Concentraciones de cada una de las
sondas variará generalmente desde aproximadamente 10^{-9} M a
10^{-6} M, con concentraciones de ácidos nucleicos en muestra
variando desde aproximadamente 10^{-21} M a aproximadamente
10^{-12} M.
Los pasos de hibridización en los formatos de
ensayo son realizados bajo condiciones rigurosas apropiadas. La
rigurosidad puede ser controlada alterando un parámetro que es una
variable termodinámica. Tales variables son bien conocidas en el
arte e incluyen concentración de formamida, concentración de sal,
concentración de sal caotrópica, pH, contenido de solvente
orgánico, y temperatura. Controles de rigurosidad preferidos son pH
y concentración de sal. La rigurosidad será variada dependiendo de
la longitud y naturaleza de la secuencia objetivo.
Las primeras condiciones de hibridación en las
que un híbrido sonda-objetivo es formado son
ajustadas para proveer la deseada rigurosidad para el ensayo.
Típicamente, las primeras condiciones de hibridación son altas
condiciones de rigurosidad para aumentar la especificidad de la
reacción de hibridación sonda-objetivo.
Las segundas condiciones de hibridación son
usadas cuando se forman híbridos entre secuencias que han sido
diseñadas para hibridizarse unas con otras, por ejemplo, para formar
híbridos extensores de marcado sonda/marcado ó extensores de
captura sonda/captura. Como corresponde, las segundas condiciones de
hibridación no necesitan ser tan rigurosas como las primeras
condiciones de hibridación. Condiciones preferidas de la segunda
hibridación, aproximándose a condiciones fisiológicas, son 37ºC,
0.15 M catión monovalente, 16 mM Mg^{++}, y 1 mM de
espermidina.
El procedimiento usado en los pasos de
separación del ensayo variará dependiendo de la naturaleza de la
fase sólida. Para partículas, la centrifugación ó filtración
proveerá para la separación de las partículas, descartando el
sobrenadante ó aislando el sobrenadante. Donde las partículas son
ensayadas, las partículas serán lavadas minuciosamente, usualmente
una a cinco veces, con un medio amortiguado apropiado, por ejemplo,
salina amortiguada de fosfato (PBS) que contiene un detergente como
SDS. Cuando los medios de separación son una pared ó soporte, el
sobrenadante puede ser aislado ó descartado y la pared lavada de la
misma manera como fue indicado para las partículas.
Un enfoque adicional de los métodos de ensayo
implementando la invención es mejorar tanto la especificidad del
ensayo disminuyendo enlaces no específicos, como la sensibilidad del
ensayo, es decir, la habilidad para distinguir entre diferentes
secuencias de ácido nucleico. Estos objetivos son logrados, en
parte, proveyendo una población homogénea de sondas de marcado que
tienen alta actividad específica de detección de marcado.
La preparación de tales sondas de marcado
involucra, en el principio, proveer moléculas de fosfatasa alcalina,
purificadas, hidrofílicas que tienen alta actividad enzimática
especifica. La fosfatasa alcalina purificada es entonces conjugada
a una sonda oligonucleotídica que contiene la secuencia de ácido
nucleico L-3 bajo condiciones que controlan los
sitios en la enzima que están disponibles para conjugación.
Opcionalmente, el conjugado de fosfatasa
alcalina-oligonucleótido así formado puede ser
posteriormente purificado.
Una preparación de fosfatasa alcalina purificada
hidrofílica puede ser hecha usando los procedimientos de Bublitz
et al., supra, la revelación de la cual es incorporada
por referencia. Bublitz et al. reportó que aunque una
preparación típica de fosfatasa alcalina puede ser enzimáticamente
99% pura, esta puede consistir de más de una fracción de enzima. De
este modo, una fracción dímero hidrofílica, sin anclaje de fosfatasa
alcalina puede ser preparada de mucosa intestinal bovina ó de
ternero ó quimioextrayendo con un alcohol inferior como butanol,
purificando la enzima por cromatografía de inmunoafinidad y
separando la fracción dímero sin anclaje hidrofílica de la fracción
fosfatasa glicosilfosfatidilinositol-alcalina por
cromatografía de interacción hidrofóbica, por ejemplo, usando una
columna fenil Sepharose®. Un dímero sin anclaje, hidrofílico de
fosfatasa alcalina puede también ser preparado a partir de la
fracción de fosfatasa
glicosilfosfatidilinositol-alcalina por tratamiento
con fosfolipasa C fosfatidilinositol-específica ó
fosfolipasa
D-glicosilfosfatidil-inositol
seguida por preparación de fracciones hidrofílicas e hidrofóbicas
por cromatografía de fase reversa (por ejemplo, octil
Sepharose®).
La fosfatasa alcalina puede también ser obtenida
y purificada de otras fuentes y especies incluyendo hígado bovino;
placenta, y riñón, mucosa intestinal porcina, placenta, y riñón,
mucosa intestinal ovina, como también de bacteria tal como
Escherichia coli.
La preparación de sondas de marcado con alta
actividad específica de detección involucra conjugación de éster
oligonucleótido altamente purificado a aminas reactivas en fosfatasa
alcalina en la presencia de una molécula que proteja el sitio de
enzima activa de conjugación. De este modo, durante la reacción de
conjugación, el sitio activo enzimático puede ser protegido por
co-incubación con sustratos enzimáticos, por
ejemplo, fosfatos, sustratos análogos, ó inhibidores, tales como
ácidos fosfónicos. Técnicas para la preparación y purificación de
ésteres oligonucleótidos son bien conocidas en la ciencia. Véase,
por ejemplo, Moller et al. (1995) Bioconjugate Chem. 6:174 e
Ivanovskaya et al. (1994) Molecular Biol. 28:754.
Preferiblemente, el conjugado de fosfatasa
alcalina-oligonucleótido es hecho usando
modificaciones de los métodos descritos en la Patente U.S. No.
4,868,105 a Urdea et al., supra, y Urdea et al.
(1988) Nucl. Acids Res. 16:4937-4955, la revelación
de la cual es incorporada aquí por referencia.
El método generalmente involucra un primer paso
de hacer reaccionar el entrecruzador con el oligonucleótido para
producir un oligonucleótido "disparado". En particular, agentes
solubles en agua entrecruzadores son preferidos, por ejemplo,
bis(sulfosuccinimidil) suberato. La relación de entrecruzador
a oligonucleótido puede ser variado independientemente para
optimizar el producto de reacción. En general, el entrecruzador
puede estar presente en exceso suficiente para evitar la formación
de dímeros oligonucleótido entrecruzados. Como corresponde, la
relación entrecruzador:oligonucleótido estará en el rango de
aproximadamente 5 a 100, preferiblemente aproximadamente 5 a 25, y
más preferiblemente 5 a 10.
La preparación de una población homogénea de
sondas de marcado involucra el siguiente paso de conjugar la
fosfatasa alcalina al oligonucleótido disparado bajo condiciones
donde la reactividad de las aminas en la enzima pueden ser
moduladas para dirigir la conjugación a una población uniforme de
sitios reactivos en la enzima. Debido a los microambientes de
grupos amina en la fosfatasa alcalina, la reactividad de las aminas
puede ser controlada variando el pH de las condiciones de reacción
de conjugación, de ese modo dirigiendo la conjugación a una
población uniforme de sitios reactivos. Adicionalmente, la relación
del oligonucleótido disparado a fosfatasa alcalina puede ser
variada entre 5 y 100 ó más alto. Esto produce una sonda de marcado
en la cual un oligonucleótido es conjugado a una población uniforme
de aminas.
El pH de la reacción de conjugación puede ser
variado para producir un conjugado
enzima-oligonucleótido que tiene actividad
enzimática deseada (por ejemplo, máximo) alterando la composición
amortiguador de la solución de reacción. Por ejemplo, para poder
amortiguar la reacción de conjugación en el rango apropiado de pH
fisiológico, es decir, en el rango de aproximadamente pH 6.6 a pH
8.0, más típicamente en el rango de aproximadamente pH 7.2 a pH
7.8, un amortiguador de fosfato puede ser usado. El fosfato, como un
sustrato de fosfatasa alcalina, provee protección del sitio activo
de la enzima. Composiciones alternativas amortiguadoras capaces de
proveer una mezcla de reacción a un pH deseado son bien conocidas
en la ciencia y pueden ser encontradas en, por ejemplo, el CRC
Handbook of Chemistry and Physics, D.R. Lide, ed., 1994. Reactividad
diferencial de grupos amina de proteína como función de pH en
reacciones usando agentes entrecruzantes ha sido reportada por
Grumbach et al., supra. La dependencia de pH
diferencial de reacciones de hidrólisis y aminólisis de agentes
entrecruzantes con proteínas ha sido descrita por Anjaneyulu et
al. (1987) Int. J. Peptide Protein Res.
30:117-124.
La proporción de oligonucleótido a fosfatasa
alcalina en la sonda de marcado (es decir, el número de sitios
conjugados en la enzima) puede ser determinado por electroforesis
analítica en gel usando técnicas bien conocidas en la ciencia.
Adicionalmente, la población de sitios de fosfatasa alcalina
conjugadas a oligonucleótidos puede ser determinada digiriendo la
enzima conjugada con oligonucleótido y realizando análisis de amino
ácidos en la digestora usando técnicas bien conocidas en la
ciencia. Actividad enzimática de la sonda de marcado puede ser
determinada y comparada a la actividad enzimática de la fosfatasa
alcalina purificada. Sondas de marcado de alta actividad
específica, preferiblemente que tienen 75% a 100%, más
preferiblemente 80% a 100%, y más preferiblemente 90% a 100% de la
actividad enzimática de los materiales de iniciación son entonces
usados en ensayos de hibridación de ácido
nucleico.
nucleico.
Opcionalmente, la sonda de marcado puede ser
posteriormente purificada usando cromatografía de intercambio de
iones, cromatografía de interacción hidrofóbica (por ejemplo, fenil
Sepharose®), cromatografía de fase reversa (por ejemplo, octil
Sepharose®), cromatoenfoque, ó similares. Alternativamente, y en
general preferiblemente, la sonda de marcado es posteriormente
purificada usando cromatografía de afinidad como es descrito, por
ejemplo, en Landt et al. (1978) Biochem.
17:915-919. La cromatografía de afinidad usando
sustratos de fosfatasa alcalina ó análogos de sustrato tiene el
beneficio añadido de proveer sondas de marcado que tienen sitios de
enlace intactos de fosfatasa alcalina.
Este procedimiento puede ser usado para proveer
sondas de marcado de alta actividad específica para uso en
virtualmente cualquier tipo de ensayo de hibridización donde se usan
moléculas de marcado de sonda, incluyendo un amplio rango de
ensayos de hibridización de fase de solución, ensayos de
amplificación, métodos de hibridización de filtrado, ensayos que
involucran reacciones de polimerización en cadena ("PCR"), y
similares. Un ejemplo de un ensayo de hibridización con el cual la
presente técnica es útil es ese descrito en la Patente U.S. No.
4,868,105 para Urdea et al., ó, preferiblemente, ese descrito
arriba en conjunción con la configuración ilustrada en la Fig. 1 y
Fig. 2 y descrita arriba.
Una composición de sustrato para fosfatasa
alcalina incluye un 1,2-dioxetano quimioluminiscente
estable; tales compuestos quimioluminiscentes son bien conocidos en
la ciencia (véase, por ejemplo, Patente U.S. No. 5,145,772 para
Voyta et al. y Publicación Europea de Patente No. 0630884).
Una composición de sustrato preferida incluye un fosfato dioxetano
disparado con enzima. Una composición de sustrato más preferida
incluye fosfato dioxetano en la presencia de un surfactante
dicatiónico ó policatiónico para mejorar la quimioluminiscencia de
dioxetanos, más preferido es un dioxetano en la presencia de un
surfactante dicatiónico y un mejorador quimioluminiscente aniónico
hidrofóbico.
Como es revelado en la Publicación EPA No.
0630884, un surfactante dicatiónico preferido tiene la fórmula
estructural
Z-(R^{2})_{3}B^{+}CH_{2}-Y-CH_{2}B^{+}(R^{3})_{3}Z-
donde B puede ser fósforo, nitrógeno ó una combinación del mismo, Z
es un contraion aniónico y R^{2} y R^{3}, que pueden ser el
mismo ó diferente, y puede ser un alquil ó aralquil no sustituido ó
sustituido que contiene 1 a 20 átomos de carbono y Y puede ser un
dialquilenearilo, arilo, alquileno, alquenileno y alquinileno que
contiene 4 a 20 átomos de carbono.
Surfactantes dicatiónicos preferidos que pueden
ser usados para amplificar la quimioluminiscencia de reacciones
disparadas 1,2-dioxetano incluyen aquellas que
tienen la siguiente estructura:
donde el sustituyente
X-(R^{3})_{3}A^{+}CH_{2}- en el anillo de benzeno
puede estar en la posición ortho, meta ó para, A
puede ser fósforo ó nitrógeno, R^{2} y R^{3} puede ser alquil o
aralquil conteniendo aproximadamente 1 a aproximadamente 30 átomos
de carbono y X^{-} es un fluoruro, cloruro, bromuro ó yoduro. Más
preferiblemente, el surfactante dicatiónico es
1-(tri-n-octilfosfoniometil)-4-(tri-n-butilfosfoniometil)
benzeno
dicloruro:
que puede ser preparado
reaccionando 4-(clorometil)benzil tri-n-butilfosfonio
cloruro con tri-n-octilfosfino como descrito en la
Publicación EPA No.
0630884.
Como es revelado en la Patente U.S. No.
5,145,772, surfactantes policatiónicos preferidos son
poli(sales de amonio cuaternario vinilaril), tales como las
poli(sales de amonio cuaternario vinilbenzil). Preferidas
particularmente sales policatiónicas son
poli(vinilbenziltrimetil cloruro de amonio) (TMQ) y
poli[vinilbenzil(benzilmetil cloruro de amonio]
(BDMQ).
Estos surfactantes son típicamente usados en
combinación con 1,2-dioxetanos estables que pueden
ser disparados por reactivos químicos, por ejemplo, ácidos, bases,
sales, enzimas, catalizadores inorgánicos y orgánicos y donantes de
electrones, para generar quimioluminiscencia. Tales dioxetanos
estables son bien conocidos en la ciencia y dioxetanos preferidos
son revelados en la Publicación EPA No. 0630884. Amplificación de
quimioluminiscencia por los surfactantes puede ser observada con
concentraciones de surfactante entre aproximadamente 0.001% y
aproximadamente 10%, preferiblemente entre aproximadamente 0.01% y
aproximadamente 0.5%.
Un mejorador hidrofóbico aniónico
quimioluminiscente puede ser de fórmula R^{1}X^{-}A^{+},
donde R^{1} es un grupo hidrofóbico que puede ser una fracción de
hidrocarburo sustituido o no sustituido que tiene entre
aproximadamente 1 a 20 átomos de carbono, preferiblemente
aproximadamente 4 a 18 átomos de carbono, más preferiblemente
aproximadamente 6 a 18 átomos de carbono, incluyendo alquilo,
cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquil y tales grupos
funcionales similares. X^{-} es una fracción aniónica
covalentemente unida a la fracción R^{1}. X^{-} puede ser un
sulfato, sulfito, sulfonato, acetato, butirato, fosfato, fosfito,
fosfonato, carbonato, carboxilato, arsenato, y similares. A^{+}
es un contracatión que puede ser sodio, potasio, plata, amonio. El
grupo IA incluye cationes metálicos alcalinos, otro catión metálico
monovalente, y similares. Mejoradores hidrofóbicos aniónicos
quimioluminiscentes preferidos incluyen un grupo alquil ó aralquil
que provee un componente hidrofóbico y un grupo aniónico.
Adicionalmente, el mejorador puede incluir una fracción catiónica,
tal como amonio, amino y similares, así proveyendo un mejorador
hidrofóbico zwitteriónico. Ejemplos de tales mejoradores
hidrofóbicos aniónicos, y fuentes comerciales de los cuales pueden
ser obtenidos, incluyen
3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-2-hidroxipropanosulfonato
("CHAPSO"; Sigma),
2-[N-ciclohexilamino)etano-sulfonato
("CHES"; Sigma), 4-fenilbutirato
("4-PBA"; Aldrich), quenodeoxicolato
("CDC"; Sigma), taurodehidrocolato ("TDHC"; Calbiochem),
taurolitocolato ("TLCA"; Sigma), deoxicolato ("DC";
Sigma), 4-sulfobenzoato
("4-SBA"; Aldrich), colato ("CA"; Sigma),
hexano sulfonato ("HSA"; Sigma), taurocolato ("TCA";
Sigma), glicocolato ("GCA"; Sigma), glicodeoxicolato
("GDCA"; Sigma), benzeno sulfonato ("BSA"; Sigma),
tauroursodeoxicolato ("TSDC"; Sigma), taurodeoxicolato
("TDC"; Sigma), p-tolueno sulfonato
("PTSA"; Sigma), tauroquenodeoxicolato ("TCDC"; Sigma) y
sodio dodecil sulfato ("SDS"; Sigma).
Al incluir un mejorador hidrofóbico aniónico en
una reacción donde quimioluminiscencia dioxetano es generada en la
presencia de un surfactante dicatiónico, la quimioluminiscencia es
aumentada sobre la quimioluminiscencia producida por el dioxetano
en la presencia de un surfactante en la ausencia de un agente
mejorador, como es mostrado en la Tabla 1.
Los mejoradores hidrofóbicos aniónicos aumentan
la intensidad quimioluminiscente relativa de luz de
1,2-dioxetano sin aumentar el nivel de fondo de
generación de luz (véase, Fig. 4A y Fig. 4B). La concentración de
mejorador añadido a una reacción quimioluminiscente depende de la
concentración de dioxetano y surfactante. Por ejemplo, en una
reacción catalizada por enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina), la
concentración de fosfato de dioxetano es ajustada para que la
enzima sea completamente saturada. Por lo tanto, la concentración de
dioxetano puede estar en el rango de aproximadamente 2- a
10-veces mayor que el K_{as} de la enzima, ó más
alto dependiendo de la solubilidad del dioxetano. La relación de
peso de surfactante a dioxetano puede estar entre aproximadamente
0.1:1 y aproximadamente 100:1, preferiblemente entre aproximadamente
1:1 y 20:1. Finalmente, la relación molar de mejorador hidrofóbico
aniónico a surfactante puede ser entre aproximadamente 0.1:1 a 10:1,
preferiblemente entre aproximadamente 0.5:1 a aproximadamente 3:1 y
más preferiblemente entre aproximadamente 0.5:1 y 1.5:1.
De acuerdo con ello, la presente invención se
relaciona a un método mejorado para detectar quimioluminiscencia en
ensayos de hibridización de ácido nucleico en fase de solución donde
sondas de marcado que llevan fosfatasa alcalina son usadas, como es
descrito abajo en detalle y ejemplificado aquí en Ejemplos 1 y 5.
Adicionalmente, será claro para aquellos de ordinaria destreza en
la ciencia que las composiciones de mejorador hidrofóbico aniónico
y métodos de la presente invención pueden encontrar uso como en
otros procedimientos que utilizan ensayos quimioluminiscentes
mejorados con surfactante. Ejemplos de tales ensayos incluyen
ensayos inmunoabsorbentes vinculado con enzimas (ELISAs), Western
blotting, Southern blotting, otros ensayos que usan sistemas de
detección basados en fosfatasa alcalina, y similares.
La invención puede por lo tanto ser aplicada a
ensayos novedosos que son específicos (por ejemplo, capaz de
reconocer diferencias únicas de nucleótido entre secuencias de ácido
nucleico de analito), sensible (por ejemplo, capaz de cuantificar
cantidades de atomol de ácidos nucleicos de analito) y fácilmente
automatizada. Por lo tanto, la invención es particularmente útil en
ensayos de pruebas de sangre y ensayos de genotipo ó subtipo. La
invención es particularmente apropiada para análisis mutacional de
ADN ó ARN genómico y otros análisis estructurales de ácidos
nucleicos. Adicionalmente, la invención puede ser usada para
monitorear terapia genética ó drogas antisentido y para mapear
sondas discontinuas que se enlazan ajustadamente a objetivos de
ácido nucleico para uso en diagnósticos ó como terapéutica
antisentido como descrito en WO 96/17955 comúnmente asignado a
Collins, archivado en Diciembre 5, 1995, titulado "Discontinuous
Probe Design Using Hybritope Mapping".
La práctica de la presente invención empleará, a
no ser que sea indicado de otra forma, técnicas convencionales de
química orgánica sintética, bioquímica, biología molecular, y
similares, que están dentro del alcance de la técnica. Tales
técnicas son explicadas completamente en la literatura. Véase, por
ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Second Edition (1989); Oligonucleotide Synthesis
(M.J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames
& S.J. Higgins, eds., 1984); y una serie, Methods in Enzymology
(Academic Press, Inc.). Todas las patentes, solicitudes de patentes,
y publicaciones mencionadas aquí, tanto supra e
infra, son por la presente incorporadas por referencia.
Se han hecho esfuerzos para garantizar precisión
respecto a los números (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.)
pero algunos errores y desviaciones deben ser tenidos en cuenta. A
no ser que se indique de otra forma, partes son partes por peso,
temperatura es en ºC y presión es a ó cerca de la atmosférica.
En los Ejemplos 1 y 5, un oligonucleótido
marcado con un superíndice "c" denota un oligonucleótido que es
complementario al oligonucleótido no así marcado. Por lo tanto,
"objetivo^{c}" es un oligonucleótido que contiene una
secuencia objetivo que es complementaria a "objetivo". Un
oligonucleótido marcado con un superíndice "c" denota un
oligonucleótido que es complementario a un oligonucleótido marcado
con un superíndice "c". Por lo tanto, "objetivo^{c}"
denota un oligonucleótido que contiene una secuencia de ácido
nucleico que es complementaria a "objetivo^{c}".
Ejemplo
1
Sondas oligonucleotídicas fueron preparadas
usando preparación sin anclado, hidrofóbica de fosfatasa alcalina.
El proceso de conjugar la sonda oligonucleotídica fue realizado bajo
condiciones que dirigen selectivamente la conjugación a una
población uniforme de sitios en la enzima y en la presencia de
fosfatasa para asegurar que el sitio activo en la enzima no estará
disponible para conjugación. Una población homogénea de conjugados
de fosfatasa-oligonucleótido alcalina fue producida
después de posterior purificación del conjugado usando pasos de
cromatografía adicionales.
- A.
- Purificación de Fosfatasa Alcalina. La fosfatasa alcalina fue purificada de una fuente comercialmente disponible para producir una preparación sin anclado, hidrofílica como sigue.
- \quad
- Una columna de afinidad de fosfatasa alcalina fue preparada de acuerdo al método de Landt et al., supra. La columna fue vertida usando aproximadamente 1 ml suspensión de resina de ácido L-histidildiazobenzilfosfonico (Sigma) por mg de fosfatasa alcalina. La columna vertida fue empacada corriendo 10 mM Tris HCl, pH 8.0, a través de a una velocidad de aproximadamente 10-20 ml/hr. La densidad óptica de la columna vertida fue monitorizada a 280 nm hasta que el OD_{280} era aproximadamente 0.00.
- \quad
- Se preparó como sigue fosfatasa alcalina soluble lavada y concentrada. La fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim) fue concentrada, y el amortiguador en el cual la enzima fue originalmente suplida fue intercambiada por 10 mM Tris HCl, pH 8.0, en un concentrador Centricon-30 (Amicon) que había sido enjuagado con 10 mM Tris HCl, pH 8.0. La enzima y 10 mM Tris HCl, pH 8.0, fueron añadidos y el concentrador fue centrifugado a 3000-4000 x g. Este proceso fue repetido dos veces.
- \quad
- La fosfatasa alcalina lavada, concentrada fue aplicada a la columna empacada a una velocidad de 10-20 ml/hr. La columna fue lavada usando 10 mM Tris HCl para remover impurezas que no se enlazan específicamente a la resina. La fosfatasa alcalina retenida fue eluida por 10 mM Na_{2}HPO_{4} en 10 mM Tris HCl, pH 8.0.
- \quad
- Fracciones recolectadas que contenían fosfatasa alcalina fueron concentradas usando una Centriprep-30 (Amicon) o Centricon-30, ó ambos, como se describió arriba. La fosfatasa alcalina concentrada fue lavada en 100 mM de amortiguador de fosfato, pH 7.2, a 4ºC ó amortiguador de almacenamiento de fosfatasa alcalina que contiene 3 M cloruro de sodio, 1 mM cloruro de magnesio, 0.1 mM cloruro de zinc, 30 mM trietilamina, pH 7.4.
- B.
- Conjugación de fosfatasa alcalina a una sonda oligonucleotídica para formar una sonda de marcado. La cadena de 3'-largo de la porción (X) de amina ("LCA") del oligonucleótido bla3 (5' AAGTACGACAACCACATCX-3'), donde X es N^{4}-(6-aminoc-aproil-2-aminoetil)-citosina, es activada usando bis(sulfosuccinimidil) suberato ("BS^{3}") (Pierce) en una relación 1:10 de bla3:BS^{3}. Por lo tanto, BS^{3} (21.5 mg) y bla3 (274 nmoles/ml) son agregadas a 100 mM de amortiguador de fosfato, pH 7.8, e incubadas por 30 min a temperatura ambiente.
- \quad
- La mezcla de reacción es aplicada a una columna NAP-5 (Pharmacia) previamente equilibrada con 100 mM de amortiguador de fosfato, pH 6.5, a 4ºC. El producto deseado es eluido usando 100 mM de amortiguador de fosfato, pH 6.5, a 4ºC. Si se desea, el oligonucleótido disparado puede ser posteriormente purificado usando un paso de precipitación de etanol.
Para proveer una sonda de marcado de acuerdo al
método de la invención, la reacción de conjugación puede ser
realizada a varios pHs y relaciones ADN:enzima para determinar las
condiciones de conjugación deseadas. El bla3 es disparado,
purificado, y agregado a aproximadamente 100 nmoles/ml de la
fosfatasa alcalina afinidad-purificada en 100 mM de
amortiguador de fosfato, pH 7.2, ó pH 7.8, a 4ºC, a una relación
ADN:enzima de 5:1, 25:1 ó 100:1, e incubado por 30 min a 4ºC. El
producto de la reacción es concentrado y lavado en amortiguador de
reserva de fosfatasa alcalina usando un
Centricon-30. El paso de lavado es repetido tres
veces para asegurar que el ADN que no ha reaccionado fluya a través
de la membrana de filtro y que sea minimizado en el producto.
Si es necesario, el conjugado de oligonucleótido
fosfatasa alcalina puede ser posteriormente purificado usando, por
ejemplo, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía
hidrofóbica, cromatografía de fase reversa, cromatoenfoque ó
cromatografía de afinidad. La relación de marcado a ADN es
determinada usando electroforesis analítica en gel. La actividad
enzimática es determinada usando técnicas convencionales de ensayo
(véase Landt et al., supra). Las aminas reactivas
marcadas son determinadas digiriendo la fosfatasa alcalina conjugada
y realizando un análisis de amino ácidos usando técnicas
convencionales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La fosfatasa alcalina lavada, concentrada fue
preparada como fue descrito en el Ejemplo 1.
La fosfatasa alcalina concentrada fue diluida a
1 atomol/microlitro en solución sustrato
((3-(2'-espiro-adamantane)-4-metoxi-4-(3''-fosforiloxi)-fenil-1,2-dioxetano
(sal disodio) (0.33 mM) (Lumigen® PPD, Lumigen, Inc., Southfield,
MI) en 0.2 M
2-metil-2-amino-1-propanol
amortiguador, pH 9.6, con 0.88 mM MgCl_{2} y 1.0 mg/ml
1-(tri-n-octilfosfoniometil)-4-(tri-n-butilfosfoniometil)benzeno
dicloruro (véase, Publicación EPA No. 0630884)) ó solución sustrato
con 0.03% SDS a 4ºC. Un alícuota de cincuenta microlitros de
cualquiera de ambas soluciones fue transferida a un luminómetro e
incubada a 37ºC. La quimioluminiscencia generada en las soluciones
fue monitoreada por los tiempos indicados en la Fig. 3. Un
mejoramiento de 0.03% de la señal quimioluminiscente
fosfatasa-catalizada alcalina SDS fue observado en
todos los puntos de tiempo probados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Estos experimentos fueron realizados para
determinar el curso de tiempo y dependencia de concentración de
quimioluminiscencia SDS-mejorada y el efecto de SDS
en la quimioluminiscencia de fondo generada en la ausencia de
fosfatasa alcalina.
- A.
- Cincuenta microlitros de solución sustrato ó solución sustrato con 0.03% SDS preparado como descrito en Ejemplos 1 y 2 fueron incubados a 37ºC en un luminómetro y la quimioluminiscencia fue monitoreada a los tiempos indicados en la Fig. 4A. Los resultados representados en la Fig. 4A indican que el efecto de SDS para mejorar la generación de señal quimioluminiscente es específica para la señal enzima-catalizada.
- B.
- Soluciones sustrato que contienen varias concentraciones de SDS ó soluciones sustrato que contienen varias concentraciones de SDS y 1 atomole/microlitro de fosfatasa alcalina a 4ºC fueron preparadas como es descrito en los Ejemplos 1 y 2; la concentración final de SDS en cada solución es indicada en la Fig. 4B. Alícuotas de cincuenta microlitros de cada solución fueron incubados a 37ºC en un luminómetro. La quimioluminiscencia fue medida después de 60 min. de incubación. Los resultados representados en la Fig. 4B muestran el pico de mejoramiento de generación quimioluminiscente enzima-catalizada a una concentración SDS dada. Adicionalmente, estos resultados muestran que, hasta a concentraciones SDS más altas, no hay efecto del mejorador en la ausencia de la enzima.
\newpage
Ejemplo
4
El propósito de este experimento era el comparar
el efecto de SDS, un mejorador aniónico, con ese de
Brij-35, un detergente no-iónico,
en quimioluminiscencia fosfatasa
alcalina-generada.
La fosfatasa alcalina fue preparada y conjugada
a una sonda oligonucleotídica como descrito en el Ejemplo 1.
Fosfatasa alcalina sonda
oligonucleotídica-conjugada fue diluida a 1
atomol/microlitro de fosfatasa alcalina en solución sustrato
preparada como descrito en el Ejemplo 2 y conteniendo varias
concentraciones de SDS ó Brij-35 a 4ºC; la
concentración final de SDS ó Brij-35 es indicada en
la Fig. 5. Alícuotas de cincuenta microlitros de cada una de las
soluciones fueron incubados a 37ºC en un luminómetro y
quimioluminiscencia fue medida después de 60 min. de
incubación.
Los resultados de este experimento son
representados en la Fig. 5 desde la cual el mejoramiento de
quimioluminiscencia por SDS y la ausencia de mejoramiento por
Brij-35 puede ser observada. Estos resultados
indican que mejoramiento de quimioluminiscencia fosfatasa
alcalina-generada puede ser observada para fosfatasa
alcalina soluble sea ó no sea conjugada a una sonda
oligonucleotídica.
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Ejemplo
5
Este ensayo fue realizado usando el formato de
ensayo esquematizado en la Fig. 2 para detectar la presencia de
una sonda elemento respuesta Rev virus de inmunodeficiencia humana
("la sonda RRE") que tiene la secuencia
5'-TCCTGCTGCTCCCAAGAA-3'. Extractos
de células MOLT-3 (ATCC CRL 1552), citoplasmática ó
nuclear, fueron separadas por centrifugación y sometido a ruptura
con diversas cantidades de la sonda RRE para simular cuantificación
de moléculas terapéuticas antisentido en células.
50 ml de diluyente amp (50% suero de
caballo, 0.05% azida de sodio, 1.3% SDS, 5X SSC (20X SSC contiene
175 gm/l cloruro de sodio y 88 g/l citrato de sodio), 0.5 mg/ml
proteinasa K, 6 mM Tris-HCl, 0.05% Proclin 300®
(Rolm-Haas) y 0.006 mM fenilmetilsulfonil fluoruro)
que contiene 1 fmol/pozo del extensor de captura
"PSCP^{c}-objetivo^{c}"
(5'-TTCTTGGGAGCAGCAGGACTCTTGGAAAGAAAGTGAAGTG-3')
fue agregado a pozos de microtitulación a los cuales la sonda de
captura "PSCP"
(5'-XCACTTCACTTTCTTTCCAAGAG-3'),
donde X es como definido arriba, fue enlazada. Después de 30 min a
37ºC, los pozos fueron lavados 2 veces con amortiguador de lavado A
(0.1% SDS, 0.1X SSC, 0.05% azida de sodio y 0.05% Proclin 300®).
Para los datos mostrados en las Tablas 2 y 3, 50 ml de extractos
celulares correspondientes a 0, 24,000, 48,000 ó 72,000 células
MOLT-3 que contienen 0, 2, 4, 6 ó 8 fmol de la
sonda RRE fue agregada a los pozos. Para los datos mostrados en la
Tabla 3, 50 ml de extractos celulares correspondientes a 0, 60,000,
120,000 ó 180,000 células MOLT-3 conteniendo 0, 2,
4, 6 ó 8 fmol de la sonda RRE fue agregado a los pozos. La mezcla
reacción fue incubada por 30 min a 37ºC. Los pozos fueron lavados
dos veces con amortiguador de lavado A.
La sonda de marcado de fosfatasa
alcalina-bla3 preparada de acuerdo al método descrito en el
Ejemplo 4 fue agregada a amp diluyente que contenía el
extensor de marcado
bla3^{c}-objetivo^{c'}
(5'-GATGTGGTTGTCGTACTTTCCTGC
TGCTCCCAAGAA-3') en un volumen final de 100 ml. La mezcla de reacción fue incubada por 30 min a 37ºC. La mezcla reacción fue diluida con diluyente de marcado y agregada a los pozos a una concentración final de 5 fmol por 50 ml.
TGCTCCCAAGAA-3') en un volumen final de 100 ml. La mezcla de reacción fue incubada por 30 min a 37ºC. La mezcla reacción fue diluida con diluyente de marcado y agregada a los pozos a una concentración final de 5 fmol por 50 ml.
Después de incubar la mezcla reacción por 1 hr a
37ºC, los pozos de micirtitulación fueron lavados dos veces con
amortiguador de lavado A y después dos veces con amortiguador de
lavado D (0.1% Brij-35, 5 mM cloruro de magnesio,
0.1 M Tris-HCl, 0.01% azida de sodio y 0.01% Proclin
300®). 50 ml
(3-(2'-espiroadamantano)-4-metoxi-4-(3''-fosforiloxi)-fenil-1,2-dioxetano
(sal disódica) (0.33 Mm) (Lumigen® PPD, Lumigen, Inc., Southfield,
MI) en 0.2 M
2-metil-2-amino-1-propanol
amortiguador, pH 9.6, con 0.88 mM MgCl_{2} y 1.0 mg/ml
1-(tri-n-octilfosfoniometil)-4-(tri-n-butilfosfoniometil)benzeno
dicloruro (véase Publicación EPA No. 0630884) y 0.03% SDS fue
agregado a los pozos microtitulación lavados. Las placas de
microtitulación fueron incubadas por 30 min a 37ºC y la señal
generada fue detectada.
Los datos tabulados en las Tablas 2 y 3 indican
que el ensayo es linear sobre el rango de la concentración de sonda
probada, que la precisión (como reflejada por el %C.V.) es muy alta,
y que la presencia del extracto nuclear de células
MOLT-3 no interfiere con la detección de la
sonda.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
El propósito de este experimento fue el
identificar el efecto de SDS, un mejorador aniónico, en otros
sistemas de señal quimioluminiscente. Las moléculas en este ejemplo
que pueden ser activadas para producir una señal quimioluminiscente
son CSPD®
(3-(4-metoxispiro{1,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo[3.3.1.1^{3,7}]decan}-4-il)fenil
sal monofosfato éster disodio, Tropix, Bedford, MA) y
CDP-Star® (Tropix, Bedford, MA). Las moléculas
mejoradoras primarias son Emerald-II ^{TM}y
Sapphire-II^{TM} (ambas Tropix, Bedford, MA), que
son sales poliméricas de amonio cuaternarias con ó sin un mejorador
fluorescente.
Fosfatasa alcalina fue agregada a micropozos a
varias concentraciones en cinco microlitros de amortiguador de
lavado (0.1 M Tris, pH 8.0, 10 mM MgCl_{2}, 0.1 mM ZnCl_{2},
0.1% Brij-35) con 50 microlitros de varias
combinaciones de los agentes quimioluminiscentes arriba listados y
mejoradores primarios, con ó sin 0.03% SDS. Los pozos fueron
incubados por 30 minutos a 37ºC en un luminómetro con temperatura
controlada, y después unidades relativas de luz (RLUs) fueron
determinadas.
La relación señal a fondo (S/B) fue determinada
dividiendo los RLUs producidos por la fosfatasa alcalina por RLUs
producidos por el diluyente. Los datos en la Tabla 4 muestran que la
adición de SDS al sistema CSPD-Sapphire II aumenta
la relación S/B.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: BAYER CORPORATION
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Mejoramiento de Fosfatasa Alcalina con SDS en Sustratos Quimiolumi- {}\hskip4.6cm niscentes y Ensayos de Inhibición Enzimática
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Chiron Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 4560 Horton Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Emeryville
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: United States
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 94608
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete Floppy
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE APLICACIÓN ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE APLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE ARCHIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Goldman Esq., Kenneth M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 34.174
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 1014.100
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (510) 601-2719
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (510) 655-3542
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /standard_name= "N4-(6-aminocaproyl-2-aminoethyl)cytosine"
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGTACGACA ACCACATCN
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCTGCTGCT CCCAAGAA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCTTGGGAG CAGCAGGACT CTTGGAAAGA AAGTGAAGTG
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /standard_name= "N4-(6-aminocaproyl-2-aminoethyl)cytosine"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipNCACTTCACT TTCTTTCCAA GAG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGTGGTTG TCGTACTTTC CTGCTGCTCC CAAGAA
\hfill36
Claims (6)
1. Un método para mejorar la quimioluminiscencia
de una molécula que es capaz de ser activada para generar una señal
quimioluminiscente que comprende:
- (a)
- Proveer una molécula que es capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente, un surfactante dicatiónico ó policatiónico, y un mejorador hidrofóbico aniónico que tiene la fórmula R^{1}X^{-}A^{+}, donde R^{1} es un grupo hidrofóbico que puede ser una fracción de hidrocarburo sustituido ó no sustituido seleccionado del grupo que consiste de alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, y aralquilo, X^{-} es una fracción aniónica covalentemente adjunta a la fracción R^{1}, y A^{+} es un contracatión; y
- (b)
- Activar la molécula que es capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente.
2. El método de la reivindicación 1, donde la
molécula que es capaz de ser activada para generar una señal
quimioluminiscente es un 1,2-dioxetano estable que
puede ser disparado para producir quimioluminiscencia, y el
mejorador aniónico hidrofóbico es seleccionado del grupo que
consiste de
3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-2-hidroxipropanosulfonato,
2-[N-ciclohexilamino)etano-sulfonato,
4-fenilbutirato, quenodeoxicolato,
taurodehidrocolato, taurolitocolato, deoxicolato,
4-sulfobenzoato, colato, hexano sulfonato,
taurocolato, glicocolato, glicodeoxicolato, benzeno sulfonato,
tauroursodeoxicolato, p-tolueno sulfonato,
tauroquenodeoxicolato y dodecil sulfato de sodio.
3. El método de la reivindicación 1, donde la
molécula que es capaz de ser activada para generar una señal
quimioluminiscente es un 1,2-dioxetano estable que
puede ser disparado para producir quimioluminiscencia, y el
surfactante es un surfactante dicatiónico que tiene fórmula
estructural
Z^{-}(R^{2})_{3}B^{+}CH_{2}B^{+}(R^{3})_{3}Z^{-}
donde B puede ser fósforo, nitrógeno ó una combinación del mismo, Z
es un contracatión aniónico y R^{2} y R^{3}, que puede ser el
mismo ó diferente, y puede ser alquil ó aril no sustituido ó
sustituido que contiene aproximadamente 1 a 20 átomos de carbono y
Y puede ser un dialquilenoarilo, arilo, alquileno, alquenileno, y
alquinileno que contiene aproximadamente 4 a aproximadamente 20
átomos de carbono.
4. Una composición que comprende:
- (a)
- Una molécula que es capaz de ser activada para generar una señal quimioluminiscente;
- (b)
- Un surfactante diactiónico ó policatiónico; y
- (c)
- Un mejorador hidrofóbico aniónico que tiene la formula R^{1}X^{-}A^{+}, donde R^{1} es un grupo hidrofóbico que puede ser una fracción de hidrocarburo sustituido ó no sustituido seleccionado del grupo que consiste de alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, y aralquilo, X^{-} es una fracción aniónica covalentemente adjunta a la fracción R^{1}, y A^{+} es un contracatión.
5. La composición de la reivindicación 4, donde
la molécula que es capaz de ser activada para generar una señal
quimioluminiscente es un 1,2-dioxetano estable que
puede ser disparado para producir quimioluminiscencia, y el
mejorador hidrofóbico aniónico es seleccionado del grupo que
consiste de
3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-2-hidroxipropanosulfonato,
2-[N-ciclohexilamino)etano-sulfonato,
4-fenilbutirato, quenodeoxicolato,
taurodehidrocolato, taurolitocolato, deoxicolato,
4-sulfobenzoato, colato, hexano sulfonato,
taurocolato, glicocolato, glicodeoxicolato, benzeno sulfonato,
tauroursodeoxicolato, taurodeoxicolato, p-tolueno sulfonato,
tauroqueno deoxicolato y dodecil sulfato de sodio.
6. La composición de la reivindicación 4, donde
la molécula que es capaz de ser activada para generar una señal
quimioluminiscente es un 1,2-dioxetano estable que
puede ser disparado para producir quimioluminiscencia, y el
surfactante es un surfactante dicatiónico que tiene la fórmula
estructural
Z-(R^{2})_{3}B^{+}CH_{2}-Y-CH_{2}B^{+}(R^{3})_{3}Z^{-}
donde B puede ser fósforo, nitrógeno ó una combinación del mismo, Z
es un contracatión aniónico y R^{2} y R^{3}, que puede ser el
mismo ó diferente, y que puede ser alquil ó aralquil no sustituida ó
sustituida que contiene aproximadamente 1 a aproximadamente 20
átomos de carbono y Y puede ser un dialquilenoarilo, arilo,
alquileno, alquenileno y alquinileno que contiene aproximadamente 4
a aproximadamente 20 átomos de carbono.
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