CN113008879B - 一种利用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于碱性磷酸酶检测技术领域，公开了一种利用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法，以夹心层的方法将充分混合的聚甲基丙烯酸羟乙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯及2‑羟基‑2‑甲基苯丙醇渗入光子晶体结构缝隙，紫外聚合反应后除去光子晶体模板，则得到具有有序大孔结构的薄膜；再利用该反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法，将对硝基苯磷酸二钠在40～70℃预热10min，并加入激活剂与碱性磷酸酶溶液，混合反应后，得到含有p‑NP分子的反应液；将反蛋白石水凝胶薄膜置入反应液中，反应后反蛋白石水凝胶薄膜颜色发生变化。解决以前比色法中的颜色对比度不强烈，不稳定等问题，具有简单携带和即时检测的特性，使其在家庭诊断等领域具有很高的应用价值。

Description

一种利用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法
技术领域
本发明属于碱性磷酸酶检测技术领域，特别涉及一种利用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法。
背景技术
碱性磷酸酶(ALP)的检测在诊断学领域非常重要，它是存在于哺乳动物体内的一种生物酶，参与生物体内的磷、钙等吸收消化活动及骨骼的形成，可以催化水解磷酸酯从而产生生物体需要的磷酸盐。所以生物体内ALP的浓度过高或过低与肝脏等疾病相关联。一般人体血清中的正常水平在46-190mU/mL，儿童和孕妇的会更高，大于500mU/mL。所以其含量偏低时，可能是身体劳累等原因和一些慢性疾病；若ALP含量偏高甚至超过两倍以上，应引起注意，可能是骨骼相关疾病。现在临床上检测ALP最常用于阻塞性黄疸的诊断。
对于ALP的检测，最开始用定磷法，但由于其可催化水解大部分磷酸酯，底物特异性低，则都以检测芳香磷酯释放出来的酚来间接检测ALP。如底物选择苯磷酸二钠盐，产物一般为磷酸钠和苯酚。目前为止，已经建立的检测方法有比色法，电化学法，荧光法和表面增强拉曼散射等。这些方法或仪器较为昂贵或底物合成复杂，如表面增强拉曼散射法和电化学法。如今临床诊断上通常有分光光度法和荧光比色法。分光光度法是利用分光光度计检测p-NP吸光度的升高速率，但需要借助仪器。荧光比色是利用生成物苯酚的氨基安替比林反应生成红色琨类衍生物从而间接检测ALP，但其由于不稳定性使颜色对比度不够强烈，因为氨基安替比林试剂容易氧化导致显色能力减退，且氧化色素原产生红色琨亚衍生物的铁氰化钾在水溶液中也会发生水解从而降低氧化能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法，解决了比色法中的颜色对比度不强烈，不稳定的问题。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种利用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤：
(1)制备反蛋白石水凝胶薄膜；
(2)将对硝基苯磷酸二钠在40～70℃预热10min，并加入激活剂与碱性磷酸酶溶液，混合反应后，得到含有p-NP分子的反应液；
(3)将反蛋白石水凝胶薄膜置入反应液中，反应后反蛋白石水凝胶薄膜颜色发生变化。
进一步，激活剂采用镁离子、钙离子或钡离子。
进一步，激活剂的浓度为5～25mM。
进一步，步骤(1)具体包括以下步骤：
(1.1)制备蛋白石结构的光子晶体模板；
(1.2)将聚甲基丙烯酸羟乙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、溶剂及2-羟基-2-甲基苯丙醇进行混合，制备成前驱液；聚甲基丙烯酸羟乙酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为(2～5)：(1～2)；
(1.3)以夹心层的方法将前驱液渗入光子晶体模板的缝隙，经紫外聚合反应后除去光子晶体模板，得到具有有序大孔结构的反蛋白石水凝胶薄膜。
进一步，溶剂采用无水甲醇或无水乙醇。
进一步，用氢氟酸除去光子晶体模板。
进一步，步骤(1.1)具体为：用乙醇将单分散的二氧化硅微球配成浓度为5％(v/v)的溶液，用垂直自组装法得到蛋白石结构的光子晶体模板。
进一步，步骤(1.3)具体为：将配好的前驱液通入氮气去除多余气体后，在毛细管力的作用下渗透在光子晶体模板缝隙，采用“夹层法”给予压力，然后在170w的紫外灯下照射3h发生聚合反应；
将固化后的夹层结构在5％的氢氟酸溶液下浸泡，除去光子晶体模板，得到具有有序大孔结构的反蛋白石水凝胶薄膜。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开了一种利用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法，ALP反应催化生成的p-NP分子具有硝基的吸电子作用，在水中会发生解离生成氧负离子与薄膜上的羰基发生相互作用，该光子晶体薄膜属于大孔三维反蛋白石结构，原理是使渗透压改变，从而引起光子晶体薄膜的骨架膨胀，结构色会发生改变。这种骨架膨胀引起的结构色变化更加稳定，在复杂的环境中也可以具有很高的灵敏度和选择性。可以解决以前比色法中的颜色对比度不强烈，不稳定等问题，且该方法的简单携带和即时检测的特性，使其在家庭诊断等领域具有很高的应用价值。相比于传统方法，更简单快捷且灵敏，检测只需15分钟即可肉眼可视。
进一步，利用聚甲基丙烯酸羟乙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯及2-羟基-2-甲基苯丙醇，制备出具有有序大孔结构的反蛋白石水凝胶薄膜，方法简单，成本低，易于推广。
附图说明
图1为本发明验证实施例1制备的可视化检测ALP薄膜检测前后的反射光谱图；
图2为本发明验证实施例2制备的可视化检测ALP薄膜检测前后的反射光谱图；
图3为本发明验证实施例3制备的可视化检测ALP薄膜检测前后的反射光谱图；
图4为本发明验证实施例4制备的可视化检测ALP薄膜检测前后的反射光谱图；
图5为本发明验证实施例5制备的可视化检测ALP薄膜检测前后的反射光谱图；
图6为本发明验证实施例6制备的可视化检测ALP薄膜检测前后的反射光谱图；
图7为本发明验证实施例7制备的可视化检测ALP薄膜检测前后的反射光谱图；
图8为本发明验证实施例8制备的可视化检测ALP薄膜检测前后的反射光谱图；
图9为本发明验证实施例9制备的可视化检测ALP薄膜检测前后的反射光谱图；
图10为本发明验证实施例10制备的可视化检测ALP薄膜检测前后的反射光谱图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明公开了一种反蛋白石水凝胶薄膜的制备方法，具体为：
将240nm的二氧化硅微球制备成蛋白石结构模板，以夹心层的方法将充分混合的功能单体和交联剂及光引发剂渗入光子晶体结构缝隙，紫外聚合反应后用氢氟酸除去微球模板，则得到具有有序大孔结构的薄膜。
功能单体可采用聚甲基丙烯酸羟乙酯。
交联剂可采用乙二醇二甲基丙烯酸酯。
光引发剂可采用2-羟基-2-甲基苯丙醇。
实施例1
本发明公开了一种反蛋白石水凝胶薄膜的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)用乙醇将240nm的单分散的二氧化硅微球配成浓度为5％左右(v/v)的溶液，用垂直自组装法得到蛋白石结构的光子晶体模板；
(2)以无水甲醇作为溶剂，将摩尔比为5：1的聚甲基丙烯酸羟乙酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯以及10μL的2-羟基-2-甲基苯丙醇溶于溶剂中，得到前驱液。将配好的前驱液通入氮气去除多余气体后在毛细管力的作用下渗透在光子晶体缝隙，采用“夹层法”给予一定的压力，然后在170w的紫外灯下照射3h发生聚合反应。将固化后的夹层结构在5％的氢氟酸溶液下浸泡过夜，从而除去步骤一制备的光子晶体模板，得到具有有序大孔结构的反蛋白石水凝胶薄膜。
光引发剂仅需少量即可，其作用是使渗透在模板缝隙的前驱液在紫外灯照射下引发固化。
实施例2
本发明公开了一种反蛋白石水凝胶薄膜的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)用乙醇将240nm的单分散的二氧化硅微球配成浓度为5％左右(v/v)的溶液，用垂直自组装法得到蛋白石结构的光子晶体模板；
(2)以无水乙醇作为溶剂，将摩尔比为2：1的聚甲基丙烯酸羟乙酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯以及10μL的2-羟基-2-甲基苯丙醇溶于溶剂中，得到前驱液。将配好的前驱液通入氮气去除多余气体后在毛细管力的作用下渗透在光子晶体缝隙，采用“夹层法”给予一定的压力，然后在170w的紫外灯下照射3h发生聚合反应。将固化后的夹层结构在5％的氢氟酸溶液下浸泡过夜，从而除去步骤一制备的光子晶体模板，得到具有有序大孔结构的反蛋白石水凝胶薄膜。
实施例3
本发明公开了一种反蛋白石水凝胶薄膜的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)用乙醇将240nm的单分散的二氧化硅微球配成浓度为5％左右(v/v)的溶液，用垂直自组装法得到蛋白石结构的光子晶体模板；
(2)以无水乙醇作为溶剂，将摩尔比为5：2的聚甲基丙烯酸羟乙酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯以及10μL的2-羟基-2-甲基苯丙醇溶于溶剂中，得到前驱液。将配好的前驱液通入氮气去除多余气体后在毛细管力的作用下渗透在光子晶体缝隙，采用“夹层法”给予一定的压力，然后在170w的紫外灯下照射3h发生聚合反应。将固化后的夹层结构在5％的氢氟酸溶液下浸泡过夜，从而除去步骤一制备的光子晶体模板，得到具有有序大孔结构的反蛋白石水凝胶薄膜。
取本发明实施例制备的反蛋白石水凝胶薄膜来检测碱性磷酸酶，具体过程为：
步骤一：将对硝基苯磷酸二钠在40～70℃的温度范围之间预热10min，并加入激活剂与碱性磷酸酶溶液，使其充分混合后反应，得到含有p-NP分子的反应液；
步骤二：将反蛋白石水凝胶薄膜置入反应液中，可以明显观测到颜色的变化，薄膜由绿色转变为其他颜色。
激活剂可采用镁离子、钙离子或钡离子，但镁离子效果最佳。在ALP反应中，酶作为催化剂，镁离子作为酶的激活剂。
验证实施例1
用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的具体过程为：
步骤一：将100mM对硝基苯磷酸二钠在40℃的温度范围之间预热10min，并加入5mM的镁离子与1mg/mL的碱性磷酸酶溶液，使其充分混合后反应，得到反应液；
步骤三：将交联比为5:1的反蛋白石水凝胶薄膜置入反应液中，反应1.5h后可以明显观测薄膜由绿色转变为鲜艳的红色。
验证实施例2
用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的具体过程为：
步骤一：将100mM对硝基苯磷酸二钠在40℃的温度范围之间预热10min，并加12mM的镁离子与1mg/mL的碱性磷酸酶溶液，使其充分混合后反应，得到反应液；
步骤三：将交联比为5:1的反蛋白石水凝胶薄膜置入反应液中，反应1h后可以明显观测薄膜由绿色转变为鲜艳的红色。
验证实施例3
用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的具体过程为：
步骤一：将100mM对硝基苯磷酸二钠在40℃的温度范围之间预热10min，并加25mM的镁离子与1mg/mL的碱性磷酸酶溶液，使其充分混合后反应，得到反应液；
步骤三：将交联比为5:1的反蛋白石水凝胶薄膜置入反应液中，反应40min后可以明显观测薄膜由绿色转变为鲜艳的红色。
验证实施例4
用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的具体过程为：
步骤一：将100mM对硝基苯磷酸二钠在40℃的温度范围之间预热10min，并加25mM的镁离子与1mg/mL的碱性磷酸酶溶液，使其充分混合后反应，得到反应液；
步骤三：将交联比为2:1的反蛋白石水凝胶薄膜置入反应液中，反应40min后可以明显观测薄膜由绿色转变为鲜艳的红色。
验证实施例5
用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的具体过程为：
步骤一：将100mM对硝基苯磷酸二钠在40℃的温度范围之间预热10min，并加25mM的镁离子与1mg/mL的碱性磷酸酶溶液，使其充分混合后反应，得到反应液；
步骤三：将交联比为5:2的反蛋白石水凝胶薄膜置入反应液中，反应40min后可以明显观测薄膜由绿色转变为鲜艳的红色。
验证实施例6
用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的具体过程为：
步骤一：将100mM对硝基苯磷酸二钠在65℃的温度范围之间预热10min，并加25mM的镁离子与1mg/mL的碱性磷酸酶溶液，使其充分混合后反应，得到反应液；
步骤三：将交联比为5:1的反蛋白石水凝胶薄膜置入反应液中，反应15min后可以明显观测薄膜由绿色转变为鲜艳的红色。
验证实施例7
用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的具体过程为：
步骤一：将100mM对硝基苯磷酸二钠在70℃的温度范围之间预热10min，并加25mM的镁离子与1mg/mL的碱性磷酸酶溶液，使其充分混合后反应，得到反应液；
步骤三：将交联比为5:1的反蛋白石水凝胶薄膜置入反应液中，反应15min后可以明显观测薄膜由绿色转变为鲜艳的红色。
验证实施例8
用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的具体过程为：
步骤一：将100mM对硝基苯磷酸二钠在75℃的温度范围之间预热10min，并加25mM的镁离子与1mg/mL的碱性磷酸酶溶液，使其充分混合后反应，得到反应液；
步骤三：将交联比为5:1的反蛋白石水凝胶薄膜置入反应液中，反应15min后可以明显观测薄膜由绿色转变为橙黄色，反射峰波长为563nm，继续反应需要3h才可使薄膜变红，这是由于高温使酶的活性大幅度降低。
验证实施例9
用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的具体过程为：
步骤一：将100mM对硝基苯磷酸二钠在65℃的温度范围之间预热10min，并加入25mM的镁离子与0.1mg/mL的碱性磷酸酶溶液，使其充分混合后反应，得到反应液；
步骤三：将交联比为5:1的反蛋白石水凝胶薄膜置入反应液中，反应15min后薄膜颜色不变化，继续反应需要24h后才可使薄膜变红。
验证实施例10
用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的具体过程为：
步骤一：将100mM对硝基苯磷酸二钠在65℃的温度范围之间预热10min，并加25mM的镁离子与0.5mg/mL的碱性磷酸酶溶液，使其充分混合后反应，得到反应液；
步骤三：将交联比为5:1的反蛋白石水凝胶薄膜置入反应液中，反应15min后薄膜颜色由绿色变为橙黄色，继续反应需要1.5h后才可使薄膜变红。
实施例1～3说明催化剂的含量在一定的范围内，含量越高，反应变色时间越短，检测灵敏度越高；实施例3-5说明本发明制备的反蛋白石水凝胶薄膜都可以用于检测碱性磷酸酶；实施例3、6、7和8说明对硝基苯磷酸二钠在40-65℃范围内，温度越高，反应变色时间越短，检测灵敏度越高，温度升高至70℃灵敏度保持不变，而再升温至75℃，碱性磷酸酶的活性大幅度降低，反应时间反而会变长；实施例6、9和10说明本发明制备的反蛋白石水凝胶薄膜可以检测不同浓度的碱性磷酸酶，浓度不同，在相同时间内变色不同，可以根据变色来确定碱性磷酸酶的浓度。

Claims (7)

1.一种利用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备反蛋白石水凝胶薄膜；
步骤(1)具体包括以下步骤：
(1.1)制备蛋白石结构的光子晶体模板；
(1.2)将聚甲基丙烯酸羟乙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、溶剂及2-羟基-2-甲基苯丙醇进行混合，制备成前驱液；聚甲基丙烯酸羟乙酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为(2～5)：(1～2)；
(1.3)以夹心层的方法将前驱液渗入光子晶体模板的缝隙，经紫外聚合反应后除去光子晶体模板，得到具有有序大孔结构的反蛋白石水凝胶薄膜；
(2)将对硝基苯磷酸二钠在40～70℃预热10min，并加入激活剂与碱性磷酸酶溶液，混合反应后，得到含有p-NP分子的反应液；
(3)将反蛋白石水凝胶薄膜置入反应液中，反应后反蛋白石水凝胶薄膜颜色发生变化。
2.根据权利要求1所述的利用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，激活剂采用镁离子、钙离子或钡离子。
3.根据权利要求1所述的利用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，激活剂的浓度为5～25mM。
4.根据权利要求1所述的利用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，溶剂采用无水甲醇或无水乙醇。
5.根据权利要求1所述的利用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，用氢氟酸除去光子晶体模板。
6.根据权利要求1所述的利用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤(1.1)具体为：用乙醇将单分散的二氧化硅微球配成浓度为5％(v/v)的溶液，用垂直自组装法得到蛋白石结构的光子晶体模板。
7.根据权利要求1所述的利用反蛋白石水凝胶薄膜检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤(1.3)具体为：将配好的前驱液通入氮气去除多余气体后，在毛细管力的作用下渗透在光子晶体模板缝隙，采用“夹层法”给予压力，然后在170w的紫外灯下照射3h发生聚合反应；
将固化后的夹层结构在5％的氢氟酸溶液下浸泡，除去光子晶体模板，得到具有有序大孔结构的反蛋白石水凝胶薄膜。
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