CN105259168B - 一种碱性磷酸酶活性的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定碱性磷酸酶活性的方法。所述方法以L‑抗坏血酸‑2‑磷酸作为碱性磷酸酶的催化底物，该底物在碱性磷酸酶的催化下水解为L‑抗坏血酸，由于L‑抗坏血酸可以将二价铜还原成一价铜，亮黄色的二价铜‑红菲绕啉复合物转化为墨绿色的一价铜‑红菲绕啉复合物，样品中碱性磷酸酶活性越高，检测液颜色变化越明显，从而实现对碱性磷酸酶活性的半定量比色检测或用紫外可见分光光度计进行定量检测。通过本发明的方法，能检测到3.05mU·mL^‑1的碱性磷酸酶，与传统方法相比，该方法灵敏度高，抗干扰能力强，重复性好，操作简单，检测时间短，成本低廉，为临床样品中碱性磷酸酶活性的检测提供了一种简便、低廉、高分辨、灵敏且性能稳定的比色分析方法。

Description

一种碱性磷酸酶活性的测定方法

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种碱性磷酸酶活性的测定方法，尤其涉及一种基于比色分析测定碱性磷酸酶活性的方法。

背景技术

碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)是由phoA基因编码的一种非特异性磷酸单酯酶，能催化磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖等，也能催化磷酸基团的转移反应。ALP广泛存在于微生物和动物体内，可直接参与磷代谢，在钙、磷的消化、吸收、分泌及骨化过程中发挥了重要的作用，已成为诊断和监测阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、精原细胞瘤、卵巢癌、某些消化系统疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、胆汁淤积性肝炎、骨软化症和佝偻病等疾病的重要指标。在免疫学领域，ALP标记抗体可用于酶联免疫吸附分析和Western印迹分析等，与辣根过氧化物酶相比，ALP作为标记酶具有稳定性好、灵敏度高等优良特性。在生物化学和分子生物学领域，用ALP催化除去DNA分子的5’末端磷酸基团以防止载体自连是基因克隆中的常规手段之一。此外，还可将ALP作为检验牛奶的巴氏灭菌的标志以及将其应用于分析化学领域以实现高灵敏检测。因此，简单、快速和灵敏地测定ALP的活性具有重要的意义。

在基础研究领域，常用的测定ALP活性的方法有荧光测定法、化学(生物)发光分析法、电化学分析法及表面增强共振拉曼散射法等。然而，这些方法由于检测过程繁琐以及需要复杂昂贵的科学仪器和专业的操作人员，所以限制了它们的进一步应用。在临床检测中，测定ALP活性的方法主要有以下5种：(1)Gomori钙钴法：ALP在pH9.2～9.8的缓冲溶液中，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀；(2)磷酸苯二钠法：ALP在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，其颜色深浅与ALP活性成正比；(3)BCIP/NBT(四唑硝基蓝)比色法：在ALP的催化下，BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐)被水解，水解产物与NBT(氯化硝基四氮唑蓝)发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan；(4)Kaplow法(偶氮偶联法)：在PH9.2～9.8的缓冲溶液中，人工合成的磷酸萘酚盐经ALP水解后释放出萘酚，后者立即与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素；(5)对硝基苯磷酸二钠法：对硝基苯磷酸二钠在ALP的催化作用下生成黄色的水溶性产物对硝基苯酚，该产物在405nm处有光吸收，通过测定其吸光度值，即可对ALP活性进行定量分析。由此可见，在临床检测中，测定ALP活性的方法主要是基于溶液颜色的深浅变化(即溶液对光的选择性吸收)来对物质含量进行定量测定的比色分析法，这是由于比色分析法具有设备简单、操作简便、分析速度快、准确度高、重现性好和适合大批量样品等优良特性。

菲绕啉衍生物由于具有独特的光学性能，已被广泛应用于钴、铍、镓、砷、铌、钽、钨、钒、铬、铀、铁和铜等金属离子的定量检测。然而，迄今为止，尚未有报道将其应用于基于比色分析的生物分子的定量测定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种碱性磷酸酶活性的测定方法，特别是一种基于比色分析测定碱性磷酸酶活性的方法。本发明的方法灵敏度高，抗干扰能力强，重复性好，操作简单，检测时间短，成本低廉，为临床样品中碱性磷酸酶活性检测提供了一种简便、低廉、高分辨、灵敏且性能稳定的新方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术解决方案：

一种碱性磷酸酶活性的测定方法，包括以下步骤：将含有L-抗坏血酸-2-磷酸、硫酸铜、红菲绕啉二磺酸钠的缓冲液与待测碱性磷酸酶溶液孵育后，根据检测液的颜色变化对样品中碱性磷酸酶活性进行半定量比色检测或用紫外可见分光光度计进行定量检测。

所述缓冲液为含有1mM镁离子的1M pH9.8的2-(乙氨基)乙醇溶液。

所述缓冲液中，L-抗坏血酸-2-磷酸的浓度为50nM～100mM，优选为10mM。

所述缓冲液中，硫酸铜的浓度为5nM～10mM，优选为0.2mM。

所述缓冲液中，红菲绕啉二磺酸钠的浓度为10nM～20mM，优选为0.4mM。

所述孵育温度为20～37℃，优选为25℃。

所述孵育时间为5～150min，优选为60min。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

①本发明的方法对碱性磷酸酶活性的检出限为3.05mU·mL^-1，具有灵敏度高，抗干扰能力强，重复性好，操作简单，检测时间短和成本低廉等优点；

②本发明所需仪器设备普及化程度高，所需试剂均为商业化产品，对操作人员无特殊技术要求，并可实现半定量比色分析；

③本发明的方法可用于临床样品中碱性磷酸酶活性的快速、灵敏地检测，而且可以大大降低检测费用和检测成本。

附图说明

图1是本发明碱性磷酸酶活性的测定方法的原理图。

图2是以本发明方法比色分析碱性磷酸酶活性的照片。

图3是本发明中检测液在不同情况下在426nm处的吸收值随时间变化的动力学曲线图(其中，a为所有试剂都加，b为不加L-抗坏血酸-2-磷酸，c为不加红菲绕啉二磺酸钠，d为不加硫酸铜)。

图4是本发明中紫外可见吸收光谱随碱性磷酸酶活性的变化曲线(A)及标准工作曲线(B)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。

图1示出了本发明一种碱性磷酸酶活性的测定方法的原理，该检测原理具体如下：

碱性磷酸酶催化水解L-抗坏血酸-2-磷酸生成L-抗坏血酸，L-抗坏血酸将二价铜离子还原成一价铜离子，使得二价铜-红菲绕啉复合物转化为一价铜-红菲绕啉复合物，从而导致溶液颜色和吸光度的变化。由于二价铜-红菲绕啉复合物溶液为亮黄色，一价铜-红菲绕啉复合物溶液为墨绿色，通过观察溶液颜色变化，即可对样品中碱性磷酸酶活性进行半定量比色分析。此外，由于一价铜-红菲绕啉复合物在426nm处产生一个新的吸收峰，其强度与一价铜-红菲绕啉复合物的浓度成正比，因此可通过紫外可见分光光度计对样品中碱性磷酸酶活性进行定量检测。本发明的方法对碱性磷酸酶活性的检出限为3.05mU·mL^-1，线性范围是0～140mU·mL^-1。本发明的方法灵敏度高，抗干扰能力强，重复性好，操作简单，检测时间短，成本低廉，为临床样品中碱性磷酸酶活性检测提供了一种简便、低廉、高分辨、灵敏且性能稳定的比色分析方法。

实施例1：基于检测液颜色变化的碱性磷酸酶活性半定量比色分析。

将20μL 140mU·mL^-1碱性磷酸酶溶液(对照组中用等量的超纯水替代)加入到600μL含有10mM L-抗坏血酸-2-磷酸，0.2mM硫酸铜，0.4mM红菲绕啉二磺酸钠和1mM氯化镁的1M的2-(乙氨基)乙醇检测液(pH9.8)中，所得到的混合液在25℃下孵育60min，然后通过数码相机记录溶液的颜色变化，如图2所示。从图2可以看出，60min后，对照组中溶液仍然为亮黄色，而加入了碱性磷酸酶的溶液则变成了墨绿色。由此可见，可通过观察检测液颜色变化来对样品中的碱性磷酸酶活性进行半定量比色分析。

实施例2：本发明一种碱性磷酸酶活性的测定方法的可行性分析。

将20μL 140mU·mL^-1碱性磷酸酶溶液加入到600μL含有10mM L-抗坏血酸-2-磷酸，0.2mM硫酸铜，0.4mM红菲绕啉二磺酸钠和1mM氯化镁的1M的2-(乙氨基)乙醇检测液(pH9.8)中，用紫外可见分光光度计记录下所得混合液在25℃下在426nm处吸收值随时间变化的动力学曲线，如图3所示。从图3可以看出，在检测液中所有组分都存在的情况下(a)，检测液在426nm处的吸收值随时间逐渐增大；而当检测液中不加L-抗坏血酸-2-磷酸(b)、红菲绕啉二磺酸钠(c)或硫酸铜(d)时，其在426nm处的吸收值不随时间发生变化。由此可见，本发明的一种碱性磷酸酶活性的测定方法具有相当好的可行性。

实施例3：检测液的紫外可见吸收光谱与碱性磷酸酶活性之间的关系。

将20μL的0，20，40，60，80，100，120和140mU·mL^-1的碱性磷酸酶溶液分别加入到600μL含有10mM L-抗坏血酸-2-磷酸，0.2mM硫酸铜，0.4mM红菲绕啉二磺酸钠和1mM氯化镁的1M的2-(乙氨基)乙醇检测液(pH9.8)中，所得混合液在25℃下孵育60min后用紫外可见分光光度计记录其在300～800nm范围内的紫外可见吸收光谱，如图4所示。从图4(A)可以看出，随着样品中碱性磷酸酶活性的增加，检测液在426nm处的吸收值相应增大。从图4(B)可以看出，以检测液在426nm处的吸收值对样品中碱性磷酸酶活性作图，可以得到很好的定量关系，其线性范围为0～140mU·mL^-1(R²＝0.999)，检测下限为3.05mU·mL^-1。

Claims (6)

1.一种碱性磷酸酶活性的测定方法，其特征在于，将含有L-抗坏血酸-2-磷酸、硫酸铜、红菲绕啉二磺酸钠的缓冲液与待测碱性磷酸酶溶液孵育后，根据检测液的颜色变化对样品中碱性磷酸酶活性进行半定量比色检测或用紫外可见分光光度计进行定量检测，其中，缓冲液为含有1mM镁离子的1M pH9.8的2-(乙氨基)乙醇溶液；所述缓冲液中，L-抗坏血酸-2-磷酸的浓度为50nM～100mM，硫酸铜的浓度为5nM～10mM，红菲绕啉二磺酸钠的浓度为10nM～20mM。

2.如权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的测定方法，其特征在于，所述缓冲液中，L-抗坏血酸-2-磷酸的浓度为10mM。

3.如权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的测定方法，其特征在于，所述缓冲液中，硫酸铜的浓度为0.2mM。

4.如权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的测定方法，其特征在于，所述缓冲液中，红菲绕啉二磺酸钠的浓度为0.4mM。

5.如权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的测定方法，其特征在于，所述孵育温度为20～37℃。

6.如权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的测定方法，其特征在于，所述孵育时间为5～150min。