CN106769914A - 一种测定水解酶活性的方法 - Google Patents

一种测定水解酶活性的方法 Download PDF

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孔金明
胡琼
何玟辉
梅亚琦
张学记
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Abstract

本发明公开了一种测定水解酶活性的方法。所述方法通过将含有底物、Fe3+和红菲绕啉二磺酸钠的检测液与待测水解酶溶液孵育，底物与水解酶反应生成还原性产物，还原性产物将Fe3+还原成Fe2+，Fe2+与红菲绕啉二磺酸钠结合形成Fe2+‑红菲绕啉复合物，检测液由无色变为深红色，且在535nm处有很强的吸收峰。样品中水解酶活性越高，检测液颜色越深。本发明方法对水解酶活性的检测灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强，可重现性好，操作简便，检测时间短，可用于临床样品中水解酶活性的快速、高灵敏检测，极大地降低了检测成本。

Description

一种测定水解酶活性的方法
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，涉及一种测定水解酶活性的方法，具体涉及一种基于比色分析测定水解酶活性的方法。
背景技术
水解酶是催化水解反应的一类酶的总称，广泛存在于各种动物、植物及微生物中。简便、快速和灵敏地测定水解酶的活性，对于疾病的早期诊断、疗效观察和预后监测具有极其重要的意义。
目前，对于水解酶的活性测定多采用荧光分析法和比色分析法。其中，比色分析法，又称吸光光度法，是基于溶液颜色的深浅变化，即溶液对光的选择性吸收，来对物质含量进行定量分析的方法，具有检测成本低、设备简单、操作简便、准确度高和适合大批量样品等优良特性。以β-半乳糖苷酶为例，目前可用于其活性测定的比色分析方法有以下两类：(1)以对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(或邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)为显色底物，由于β-半乳糖苷酶可以将其水解生成对硝基苯酚(或邻硝基苯酚)，后者的溶液在碱性条件下为黄色且在405nm(或420nm)处有最大吸收峰，从而实现对β-半乳糖苷酶活性的比色分析，但是存在选择性差，灵敏度低，检测范围窄和抗干扰能力不足等缺陷；而且，由于底物稳定性差，容易造成“假阳性”结果(1.Maruhn D.(1976).Rapid colorimetric assay ofβ-galactosidase and N-acetyl-β-glucosaminidase in human urine[J].ClinicaChimica Acta,73(3):453-461；2.Gary,R.K.,Kindell,S.M.(2005).Quantitative assayof senescence-associatedβ-galactosidase activity in mammalian cellextracts.Analytical Biochemistry,343(2),329-334.)；(2)以纳米金为探针，基于纳米金聚集状态发生改变引起溶液颜色发生改变的性质，实现对β-半乳糖苷酶活性的比色分析，但是存在探针制备过程复杂，检测周期长，成本高和抗干扰能力差等缺陷(Zeng Z.,etal.(2012).Simple and real-time colorimetric assay for glycosidases activityusing functionalized gold nanoparticles and its application for inhibitorscreening.Analytical Chemistry,84(21),9089-9095；Chen J.,et al.(2016).Colorimetric Detection of Escherichia coli Based on the Enzyme-InducedMetallization of Gold Nanorods.Small,12(18),2469-2475.)。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种测定水解酶活性的方法，该方法基于比色分析测定水解酶活性，灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强，可重现性好，操作简单，检测时间短，成本低廉，可用于水解酶活性的临床检测。
本发明的技术方案如下：
一种测定水解酶活性的方法，包括以下步骤：将含有底物、Fe3+和红菲绕啉二磺酸钠的检测液与待测水解酶溶液孵育，生成Fe2+-红菲绕啉复合物，测定反应液在535nm处的光吸收强度，根据光吸收强度与水解酶活性的标准曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性；所述的底物为非还原性底物，与待测水解酶反应生成还原性产物。
所述的水解酶选自β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、碱性磷酸酶、中性磷酸酶或酸性磷酸酶。
所述的水解酶为β-半乳糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷。
所述的水解酶为α-半乳糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷。
所述的水解酶为α-葡萄糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷。
所述的水解酶为β-葡萄糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
所述的水解酶为α-甘露糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷。
所述的水解酶为β-甘露糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷。
所述的水解酶为碱性磷酸酶时，底物可以是抗坏血酸-2-磷酸。
所述的水解酶为中性磷酸酶时，底物可以是抗坏血酸-2-磷酸。
所述的水解酶为酸性磷酸酶时，底物可以是抗坏血酸-2-磷酸。
本发明的测定水解酶活性的方法，底物不具有还原性，不能将Fe3+还原成Fe2+，底物在水解酶的作用下能够生成还原性产物，产生的还原性产物能将Fe3+还原成Fe2+，Fe2+与红菲绕啉二磺酸结合形成Fe2+-红菲绕啉复合物。在含有底物、Fe3+和红菲绕啉二磺酸钠的检测液与待测水解酶溶液孵育过程中，底物与水解酶反应生成还原性产物，还原性产物将Fe3+还原成Fe2+，Fe2+与红菲绕啉二磺酸钠以1:3的配比结合形成稳定的Fe2+-红菲绕啉复合物，Fe2+-红菲绕啉复合物在535nm处有很强的特征吸收峰。本发明通过测定反应液在535nm的吸收强度，最终根据光吸收强度与水解酶活性的标准曲线关系，得到待测水解酶溶液中水解酶的活性。
本发明只需一步操作即可实现对水解酶活性的测定，具有灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强，可重现性好，操作简单，检测时间短和成本低廉等优点，可用于临床样品中水解酶活性的快速、高灵敏检测，极大地降低了检测成本。
附图说明
图1是实施例1中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加β-半乳糖苷酶，c为不加对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，d为不加Fe3+，e为不加红菲绕啉二磺酸钠。
图2是实施例2中检测信号与β-半乳糖苷酶活性之间的关系曲线图。
图3是实施例3中含有不同蛋白质样品的检测液在535nm处吸收值的比较图，其中，a为β-半乳糖苷酶，b为凝血酶，c为胰蛋白酶，d为血红蛋白，e为人血清白蛋白，f为球蛋白，g为淀粉酶，h为碱性磷酸酶，i为空白对照。
图4是实施例4中检测信号与β-半乳糖苷酶活性之间的关系曲线图。
图5是实施例5中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加α-半乳糖苷酶，c为不加对氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷，d为不加Fe3+，e为不加红菲绕啉二磺酸钠。
图6是实施例6中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加α-葡萄糖苷酶，c为不加对氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，d为不加Fe3+，e为不加红菲绕啉二磺酸钠。
图7是实施例7中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加β-葡萄糖苷酶，c为不加对氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，d为不加Fe3+，e为不加红菲绕啉二磺酸钠。
图8是实施例8中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加α-甘露糖苷酶，c为不加对氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷，d为不加Fe3+，e为不加红菲绕啉二磺酸钠。
图9是实施例9中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加β-甘露糖苷酶，c为不加对氨基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷，d为不加Fe3+，e为不加红菲绕啉二磺酸钠。
图10是实施例10中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加碱性磷酸酶，c为不加抗坏血酸-2-磷酸，d为不加Fe3+，e为不加红菲绕啉二磺酸钠。
图11是实施例11中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加中性磷酸酶，c为不加抗坏血酸-2-磷酸，d为不加Fe3+，e为不加红菲绕啉二磺酸钠。
图12是实施例12中含有不同组分的检测液的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为所有试剂都加，b为不加酸性磷酸酶，c为不加抗坏血酸-2-磷酸，d为不加Fe3+，e为不加红菲绕啉二磺酸钠。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
实施例1
本发明方法用于测定β-半乳糖苷酶活性的可行性分析实验。
将10μL 0.01mg·mL-1β-半乳糖苷酶溶液加入到590μL含有10mM对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，0.25mM Fe3+和0.75mM红菲绕啉二磺酸钠的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的紫外-可见吸收光谱。
在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图1可以看出，在所有组分都存在的情况下(a)，检测液在～535nm处有很强的吸收峰；而当检测液中不加β-半乳糖苷酶(b)、对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(c)、Fe3+(d)、或红菲绕啉二磺酸钠(e)时，其在～535nm处的吸收值很低。由此可见，本发明方法可用于测定β-半乳糖苷酶的活性。
实施例2
本发明方法用于测定β-半乳糖苷酶活性的检测信号与β-半乳糖苷酶活性之间的关系。
将10μL的0，20，40，60，80，100，120，140，160，180，200和220mU·mL-1的β-半乳糖苷酶溶液分别加入到590μL含有10mM对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，0.25mM Fe3+和0.75mM红菲绕啉二磺酸钠的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的紫外-可见吸收光谱。
从图2可以看出，随着β-半乳糖苷酶活性的增加，检测液在～535nm处的吸收值相应增大，且吸收强度与β-半乳糖苷酶活性具有很好的定量关系。由此可见，本发明方法可用于β-半乳糖苷酶活性的定量测定。
实施例3
本发明方法用于测定β-半乳糖苷酶活性的选择性。
将10μL 0.01mg·mL-1的β-半乳糖苷酶或10μL 0.1mg·mL-1的其他蛋白质溶液加入到590μL含有10mM对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，0.25mM Fe3+和0.75mM红菲绕啉二磺酸钠的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液在～535nm处的吸收值。
从图3可以看出，只有当加入β-半乳糖苷酶时，检测液在～535nm处的吸收值才会显著增大。由此可见，本发明方法用于测定β-半乳糖苷酶活性时具有很高的选择性。
实施例4
本发明方法用于测定β-半乳糖苷酶活性时在血清样品中的检测性能。
将10μL的含有0，40，80，120，160和200mU·mL-1的β-半乳糖苷酶的10％的正常人血清样品分别加入到590μL含有10mM对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，0.25mM Fe3+和0.75mM红菲绕啉二磺酸钠的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的紫外-可见吸收光谱。
从图4可以看出，随着血清样品中β-半乳糖苷酶活性的增加，检测液在～535nm处的吸收值相应增大，且吸收强度与β-半乳糖苷酶活性具有很好的定量关系。由此可见，本发明方法可用于血清样品中β-半乳糖苷酶活性的定量测定，具有很好的实用性。
实施例5
本发明方法用于测定α-半乳糖苷酶活性的可行性分析实验。
将10μL 0.01mg·mL-1α-半乳糖苷酶溶液加入到590μL含有10mM对氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷，0.25mM Fe3+和0.75mM红菲绕啉二磺酸钠的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的紫外-可见吸收光谱。
在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图5可以看出，在所有组分都存在的情况下(a)，检测液在～535nm处有很强的吸收峰；而当检测液中不加α-半乳糖苷酶(b)、对氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(c)、Fe3+(d)、或红菲绕啉二磺酸钠(e)时，其在～535nm处的吸收值很低。由此可见，本发明方法可用于测定α-半乳糖苷酶的活性。
实施例6
本发明方法用于测定α-葡萄糖苷酶活性的可行性分析实验。
将10μL 0.05mg·mL-1α-葡萄糖苷酶溶液加入到590μL含有10mM对氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，0.25mM Fe3+和0.75mM红菲绕啉二磺酸钠的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的紫外-可见吸收光谱。
在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图6可以看出，在所有组分都存在的情况下(a)，检测液在～535nm处有很强的吸收峰；而当检测液中不加α-葡萄糖苷酶(b)、对氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(c)、Fe3+(d)、或红菲绕啉二磺酸钠(e)时，其在～535nm处的吸收值很低。由此可见，本发明方法可用于测定α-葡萄糖苷酶的活性。
实施例7
本发明方法用于测定β-葡萄糖苷酶活性的可行性分析实验。
将10μL 0.05mg·mL-1β-葡萄糖苷酶溶液加入到590μL含有10mM对氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，0.25mM Fe3+和0.75mM红菲绕啉二磺酸钠的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的紫外-可见吸收光谱。
在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图7可以看出，在所有组分都存在的情况下(a)，检测液在～535nm处有很强的吸收峰；而当检测液中不加β-葡萄糖苷酶(b)、对氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(c)、Fe3+(d)、或红菲绕啉二磺酸钠(e)时，其在～535nm处的吸收值很低。由此可见，本发明方法可用于测定β-葡萄糖苷酶的活性。
实施例8
本发明方法用于测定α-甘露糖苷酶活性的可行性分析实验。
将10μL 0.1mg·mL-1α-甘露糖苷酶溶液加入到590μL含有10mM对氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷，0.25mM Fe3+和0.75mM红菲绕啉二磺酸钠的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的紫外-可见吸收光谱。
在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图8可以看出，在所有组分都存在的情况下(a)，检测液在～535nm处有很强的吸收峰；而当检测液中不加α-甘露糖苷酶(b)、对氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷(c)、Fe3+(d)、或红菲绕啉二磺酸钠(e)时，其在～535nm处的吸收值很低。由此可见，本发明方法可用于测定α-甘露糖苷酶的活性。
实施例9
本发明方法用于测定β-甘露糖苷酶活性的可行性分析实验。
将10μL 0.1mg·mL-1β-甘露糖苷酶溶液加入到590μL含有10mM对氨基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷，0.25mM Fe3+和0.75mM红菲绕啉二磺酸钠的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的紫外-可见吸收光谱。
在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图9可以看出，在所有组分都存在的情况下(a)，检测液在～535nm处有很强的吸收峰；而当检测液中不加β-甘露糖苷酶(b)、对氨基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷(c)、Fe3+(d)、或红菲绕啉二磺酸钠(e)时，其在～535nm处的吸收值很低。由此可见，本发明方法可用于测定β-甘露糖苷酶的活性。
实施例10
本发明方法用于测定碱性磷酸酶活性的可行性分析实验。
将10μL 0.5mg·mL-1碱性磷酸酶溶液加入到590μL含有10mM抗坏血酸-2-磷酸，0.25mM Fe3+和0.75mM红菲绕啉二磺酸钠的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的紫外-可见吸收光谱。
在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图10可以看出，在所有组分都存在的情况下(a)，检测液在～535nm处有很强的吸收峰；而当检测液中不加碱性磷酸酶(b)、抗坏血酸-2-磷酸(c)、Fe3+(d)、或红菲绕啉二磺酸钠(e)时，其在～535nm处的吸收值很低。由此可见，本发明方法可用于测定碱性磷酸酶的活性。
实施例11
本发明方法用于测定中性磷酸酶活性的可行性分析实验。
将10μL 0.5mg·mL-1中性磷酸酶溶液加入到590μL含有10mM抗坏血酸-2-磷酸，0.25mM Fe3+和0.75mM红菲绕啉二磺酸钠的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的紫外-可见吸收光谱。
在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图11可以看出，在所有组分都存在的情况下(a)，检测液在～535nm处有很强的吸收峰；而当检测液中不加中性磷酸酶(b)、抗坏血酸-2-磷酸(c)、Fe3+(d)、或红菲绕啉二磺酸钠(e)时，其在～535nm处的吸收值很低。由此可见，本发明方法可用于测定中性磷酸酶的活性。
实施例12
本发明方法用于测定酸性磷酸酶活性的可行性分析实验。
将10μL 0.5mg·mL-1酸性磷酸酶溶液加入到590μL含有10mM抗坏血酸-2-磷酸，0.25mM Fe3+和0.75mM红菲绕啉二磺酸钠的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的紫外-可见吸收光谱。
在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图12可以看出，在所有组分都存在的情况下(a)，检测液在～535nm处有很强的吸收峰；而当检测液中不加酸性磷酸酶(b)、抗坏血酸-2-磷酸(c)、Fe3+(d)、或红菲绕啉二磺酸钠(e)时，其在～535nm处的吸收值很低。由此可见，本发明方法可用于测定酸性磷酸酶的活性。

Claims (9)

1.一种测定水解酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有底物、Fe3+和红菲绕啉二磺酸钠的检测液与待测水解酶溶液孵育，生成Fe2+-红菲绕啉复合物，测定反应液在535nm处的光吸收强度，根据光吸收强度与水解酶活性的标准曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性；所述的底物为非还原性底物，与待测水解酶反应生成还原性产物。
2.根据权利要求1所述的测定水解酶活性的方法，其特征在于，所述的水解酶选自β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、碱性磷酸酶、中性磷酸酶或酸性磷酸酶。
3.根据权利要求1所述的测定水解酶活性的方法，其特征在于，所述的水解酶为β-半乳糖苷酶，底物为对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷。
4.根据权利要求1所述的测定水解酶活性的方法，其特征在于，所述的水解酶为α-半乳糖苷酶，底物为对氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷。
5.根据权利要求1所述的测定水解酶活性的方法，其特征在于，所述的水解酶为α-葡萄糖苷酶，底物为对氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷。
6.根据权利要求1所述的测定水解酶活性的方法，其特征在于，所述的水解酶为β-葡萄糖苷酶，底物为对氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
7.根据权利要求1所述的测定水解酶活性的方法，其特征在于，所述的水解酶为α-甘露糖苷酶，底物为对氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷。
8.根据权利要求1所述的测定水解酶活性的方法，其特征在于，所述的水解酶为β-甘露糖苷酶，底物为对氨基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷。
9.根据权利要求1所述的测定水解酶活性的方法，其特征在于，所述的水解酶为碱性磷酸酶、中性磷酸酶或酸性磷酸酶，底物为抗坏血酸-2-磷酸。
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Citations (4)

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