CN104007080A - 基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法，属于纳米材料和生物分析技术领域。该方法通过将金纳米棒、含有L-抗坏血酸-2-磷酸的缓冲液、硝酸银溶液和目标物碱性磷酸酶混合孵育后，记录下检测液的颜色变化，用于可视化半定量检测或用紫外可见分光光度计进行定量检测。本方法可以通过肉眼对碱性磷酸酶浓度进行高分辨率的比色半定量检测，也可以通过紫外可见分光光度计进行定量检测。本发明涉及金纳米棒制备工艺简单，成本较低，比色检测方法简便、分辨率高、灵敏度高，为临床生物分子检测提供了一种简单、低廉、高分辨、灵敏且性能稳定的可视化检测新方法。

Description

基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法

技术领域

本发明涉及一种基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法，属于纳米材料和生物分析技术领域。

背景技术

碱性磷酸酶（ALP）是在人血清中存在的一种酶，它可以作为肝胆和骨骼病、以及乳腺癌和前列腺癌的指示剂[Y. Liu et al., Anal. Chem., 2008, 80: 8605]。而且由于碱性磷酸酶的高催化活性、高稳定性、价格低廉、广阔的底物特异性等优点，使它成为一种最常用的酶标签用于免疫分析、基于适配体的分析、基因分析和相关的亲和分析，来检测毒素、蛋白、核酸、药物等[A. Hayat et al., Anal. Chem., 2013, 85: 10028]。所以检测碱性磷酸酶活性显得尤为的重要。到目前为止，各种各样的基于不同信号产生原理的方法和策略已经被报道用于碱性磷酸酶活性的检测，比如，基于荧光的方法、基于化学发光的方法、基于拉曼的方法、基于电化学的方法。不幸的是，大多数这些方法由于需要复杂昂贵的科学仪器和专业的操作人员，所以限制了它们的进一步应用。比色检测方法由于其所具有的简单、方便、实用、低廉、易于标准化和可用肉眼进行可视化检测的优点，有望用于进行免贵重仪器的分析方法的建立，得到迅速的发展和应用，逐步成为应用最广泛的生物分析方法之一，涉及生物学检验的各个领域。目前传统比色检测碱性磷酸酶的方法主要是利用对硝基苯磷酸作为酶底物，通过碱性磷酸酶水解对硝基苯磷酸得到黄色的末端产物，利用紫外可见光谱进行定量检测。近几年，已有文献报道将一些纳米材料应用于比色检测碱性磷酸酶的体系，展现出优秀的性能，比如灵敏度高、检测线低、稳定性高[C. Zhou et al., Anal. Chem., 2014, 86: 2752]。但是，当涉及到利用肉眼进行可视化半定量判断时，这些方法的分辨率都相对比较低。因此，发展高分辨型的可视化检测碱性磷酸酶的方法具有极其重要的意义。

贵金属纳米材料由于其独特迷人的源于表面等离子体共振效应的光学性能受到了广泛的关注，为发展高分辨型的可视化检测碱性磷酸酶的方法开阔了新的视野。基于金属纳米颗粒的比色分析法由于其简单、方便以及金属纳米颗粒独特的光学性质而受到人们的广泛关注。纳米金诱导银沉积相结合，随着金纳米颗粒粒径变大，颜色从纳米金的红色逐渐变成纳米银的黄色再变成灰黑色，这对进行可视化检测碱性磷酸酶的方法的开发具有重大的实际意义，但是由于金纳米颗粒可视化分辨率不高，目前还无法开展高分辨型的可视化检测碱性磷酸酶的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法。由于金纳米棒表面长银纳米壳后，其局域表面等离子体共振吸收峰发生蓝移，导致丰富多彩的颜色变化。利用金棒的这个特点，可以建立一种简单、低廉、高分辨、灵敏且性能稳定的可视化检测碱性磷酸酶的新方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法包括如下步骤：

（1）制备金纳米棒；

（2）将金纳米棒、含有L-抗坏血酸-2-磷酸的缓冲液、硝酸银溶液和目标物碱性磷酸酶混合孵育后，记录下检测液的颜色变化，用于可视化半定量检测或用紫外可见分光光度计进行定量检测。

步骤（1）和（2）所述的金纳米棒是通过晶种生长法得到的，所述的金纳米棒长度为55 ± 5 nm、直径为12 ± 1nm，其紫外可见光谱在896 nm和507 nm分别有一个峰。

步骤（2）所述金纳米棒的浓度为1 a.u.，以其在896 nm处的吸收峰强度为基准，用量为200 mL。

步骤（2）所述含有L-抗坏血酸-2-磷酸的缓冲液，用量为200 mL，其中L-抗坏血酸-2-磷酸浓度为10 mM，缓冲液为含有2 mM硝酸镁的0.4 M pH 9.8的二乙醇胺溶液。

步骤（2）所述硝酸银溶液的浓度为10 mM，用量为20 mL。

步骤（2）所述混合孵育的时间为1小时、温度为37 °C。

本发明的基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法的测定原理是：最初，碱性磷酸酶催化水解L-抗坏血酸-2-磷酸生成L-抗坏血酸，然后L-抗坏血酸还原银离子在金纳米棒表面形成银纳米壳，使得金纳米棒在896 nm的吸收峰发生蓝移，从而导致检测液的颜色发生变化。随着碱性磷酸酶浓度的增加，银纳米壳的厚度就增加，检测液的颜色将从红色变为橙色、变为黄色、变为绿色、变为青色、变为蓝色、最后变为紫色，肉眼对碱性磷酸酶浓度的分辨率可以低至20 mU mL^-1，从而达到高分辨的可视化半定量检测的目的，利用紫外可见光谱还可以达到定量检测的目的。对于碱性磷酸酶的检出限为3.2 mU mL^-1，线性范围是0 mU mL^-1到100 mU mL^-1。本发明涉及金纳米棒制备工艺简单，成本较低，比色检测方法简便、分辨率高、灵敏度高，为临床生物分子检测提供了一种简单、低廉、高分辨、灵敏且性能稳定的可视化检测新方法。

本发明的优点如下：

（1）本发明提供了一种将金纳米棒长银纳米壳体系应用于可视化检测碱性磷酸酶的方法。本方法具有可视化分辨率高、操作简单、价格低廉、使用方便、检测线低、灵敏度和稳定性高等优点。

（2）与传统的比色检测碱性磷酸酶相比，由于金纳米棒长银纳米壳体系可以发生一系列丰富多彩的颜色变化，使得其对碱性磷酸酶的肉眼可视化半定量检测的分辨率大大的提高。

（3）通过利用碱性磷酸酶作为酶标签应用于免疫、适配体和基因检测，本方法可以扩展到分析毒素、蛋白、核酸和药物等目标物。

附图说明

图1是基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法的示意图；

图2是金纳米棒的(a)紫外可见光谱图和(b)透射电镜图；

图3是基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法显色检测碱性磷酸酶的可视化照片；

图4是基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法显色检测碱性磷酸酶的(a)紫外可见图谱和(b)标准工作曲线图；

图5是基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法显色检测碱性磷酸酶的特异性。

具体实施方式

下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是不能以此限制本发明的范围。

实施例1

1. 金纳米棒的制备

首先合成晶种溶液，在室温下，将冰浴过且新鲜配制的硼氢化钠溶液(0.01 M，0.6 mL)快速地加入到HAuCl₄ (0.01 M, 0.25 mL)和十六烷基三甲基溴化铵(0.1 M, 9.75 mL)的混合溶液中，之后在室温下静止2h后使用。然后配制生长溶液，将十六烷基三甲基溴化铵溶液(0.1 M, 40 mL)、HAuCl₄溶液(0.01 M, 2 mL)、AgNO₃溶液(0.01 M, 0.400 mL)、HCl溶液(0.800 mL)、和 L-抗坏血酸溶液(0.1 M, 0.32 mL)混合均匀。最后，取200 mL晶种溶液加入到上述的生长溶液中，静止放置于室温过夜。第二天，将合成的金纳米棒在7000 rmp下离心20 分钟，再分散于10 mL水中。如图2(a)所示，所合成的金纳米棒的紫外可见光谱有两个吸收峰（507 nm和896 nm）。通过透射电镜图表征所制备的金纳米棒，如图2(b)所示。从图2(b)可以看出，所制备的金纳米棒大小分布均匀，长度为55 ± 5 nm，直径为12 ± 1nm。

2. 基于金纳米棒长银壳的分析方法可视化检测碱性磷酸酶

图1是本发明的金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法过程示意图。10 μL一系列浓度的碱性磷酸酶标准样品加入到200 μL含有10 mM L-抗坏血酸-2-磷酸的0.4 M的二乙醇胺溶液(pH 9.8，2 mM 硝酸镁)、 20 μL的10 mM硝酸银溶液和200 μL金纳米棒(在896 nm处吸收峰强度为1.0 a.u.)的底物液中，所得到的混合液在37 °C下孵育1小时。然后，通过数码相机记录这些溶液的颜色变化，如图3所示。从图3可以看出，随着碱性磷酸酶浓度的增加，检测液的颜色从红色变为橙色，变为黄绿色，变为绿色、变为青色、变为蓝色、最后变为紫色，肉眼对碱性磷酸酶浓度的分辨率可以低至20 mU mL^-1，从而实现了高分辨的可视化半定量检测碱性磷酸酶的目的。通过紫外可见分光光度计记录这些溶液的紫外可见光谱，根据金纳米棒纵向的局域表面等离子共振峰的蓝移值和碱性磷酸酶浓度变化的关系绘制标准工作曲线，如图4所示。从图4(a)可以看出，随着碱性磷酸酶浓度的增加，金纳米棒纵向的局域表面等离子共振峰从865 nm逐步地蓝移至560 nm左右。从图4(b)可以看出，以金纳米棒纵向的局域表面等离子共振峰的蓝移值的变化对碱性磷酸酶浓度作图，可以得到很好的定量关系，其线性范围为0 mU mL^-1 ~ 100 mU mL^-1 (R ² = 0.985)，检测线为3.2 mU mL^-1。

为了证明本方法对碱性磷酸酶的特异性，我们考察了其他的一些酶或物质（包括：1.0 mg mL^-1的葡萄糖氧化酶、1.0 mg mL^-1的辣根过氧化物酶、1.0 mg mL^-1的溶菌酶、1.0 mM的凝血酶、1.0 mM的细胞色素c、和1.0 mg mL^-1的人免疫球蛋白G）作为对照所得到的金纳米棒纵向的局域表面等离子共振峰的蓝移值的柱状图，如图5所示。从图中可以看出对照组的信号均在阴性阈值的范围内，只有在碱性磷酸酶的存在下才会使金纳米棒纵向的局域表面等离子共振峰产生大的蓝移，从而证明了该方法对碱性磷酸酶的检测具有比较好的特异性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。 

Claims (6)

1.一种基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

（1）制备金纳米棒；

（2）将金纳米棒、含有L-抗坏血酸-2-磷酸的缓冲液、硝酸银溶液和目标物碱性磷酸酶混合孵育后，记录下检测液的颜色变化，用于可视化半定量检测或用紫外可见分光光度计进行定量检测。

2.根据权利要求1所述的基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法，其特征在于：步骤（1）和（2）所述的金纳米棒是通过晶种生长法得到的，所述的金纳米棒长度为55 ± 5 nm、直径为12 ± 1nm，其紫外可见光谱在896 nm和507 nm分别有一个峰。

3.根据权利要求1所述的基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法，其特征在于：步骤（2）所述金纳米棒的浓度为1 a.u.，以其在896 nm处的吸收峰强度为基准，用量为200 mL。

4.根据权利要求1所述的基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法，其特征在于：步骤（2）所述含有L-抗坏血酸-2-磷酸的缓冲液，用量为200 mL，其中L-抗坏血酸-2-磷酸浓度为10 mM，缓冲液为含有2 mM硝酸镁的0.4 M pH 9.8的二乙醇胺溶液。

5.根据权利要求1所述的基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法，其特征在于：步骤（2）所述硝酸银溶液的浓度为10 mM，用量为20 mL。

6.根据权利要求1所述的基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法，其特征在于：步骤（2）所述混合孵育的时间为1小时、温度为37 °C。