ES2289190T3 - Proceso para la discriminacion entre variantes de secuencias. - Google Patents

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Abstract

Un método para distinguir variantes de secuencia de un ácido nucleico diana en una muestra que consta de los siguientes pasos: (a) poner en contacto una muestra que comprende ácidos nucleicos de cadena sencilla con un primer oligonucleótido que contiene una secuencia complementaria a una región de dicho ácido nucleico diana y un oligonucleótido marcado que contiene una secuencia complementaria a una de dichas variantes de secuencia en una segunda región de la secuencia de la misma hebra del ácido nucleico diana, en la que dichas variantes de secuencia se diferencian en dicha segunda región, bajo unas condiciones en las que dicho primer oligonucleótido y dicho oligonucleótido marcado hibridan con dicho ácido nucleico diana de manera que el extremo 3'' de dicho primer oligonucleótido se encuentra adyacente o en dirección 5'' de dicho oligonucleótido marcado; (b) mantener la mezcla del paso (a) con una polimerasa de ácidos nucleicos dependiente de molde con actividad nucleasa 5''-3'' en las condiciones suficientes para permitir que la actividad nucleasa 5''-3'' de la polimerasa para escindir el oligonucleótido marcado hibridado para generar productos de escisión que consisten en fragmentos marcados liberados, de manera que se generan diferentes productos de escisión dependiendo de la variante de secuencia presente; (c) examinar los productos de escisión generados; (d) identificar las variantes de secuencia presentes a partir de los productos de escisión analizados.

Description

Proceso para la discriminación entre variantes de secuencias.
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Esta invención, en general, hace referencia al ámbito/campo de la química de los ácidos nucleicos. Más específicamente, hace referencia a la actividad de la nucleasa 5'-3' de una polimerasa de ácidos nucleicos para degradar un oligonucleótido marcado en una doble cadena fruto de la hibridación del oligonucleótido marcado y una secuencia oligonucleótido diana y formar fragmentos marcados detectables.
Las técnicas microbiológicas de investigación se aplican rutinariamente a los ensayos diagnósticos. Por ejemplo, la patente estadounidense Núm. 4 358 535 muestra un método para detectar DNA DE organismos patógenos colocando una muestra (p. ej. sangre, células, saliva, etc.)en un filtro (p. ej. la nitrocelulosa), produciendo lisis en las células y fijando el DNA a través de la desnaturalización química y el calentamiento. Después, las sondas de DNA marcadas se añaden y se permite su hibridación con la muestra fijada de DNA, en este caso, la hibridación indica la presencia de DNA de organismos. La muestra de DNA en este caso puede ser amplificada mediante el cultivo de células u organismos sobre el filtro.
Las patentes estadounidenses Núm. 4 683 202; 4 683 195; 4 800 159 y 4 965 188, muestran que la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) representa una mejora en la amplificación del DNA. En su forma más simple, la PCR es un método in vitro para la síntesis enzimática de secuencias de DNA específicas, utilizando dos oligonucleótidos cebadores que hibriden con las hebras opuestas y que flanqueen la zona de interés en el DNA diana. Una serie repetitiva de pasos de la reacción que implican la desnaturalización de un molde, hibridación del cebador y la extensión de los cebadores hibridados por la polimerasa del DNA, da lugar a la acumulación exponencial de un fragmento específico cuyos extremos terminales se definen por los extremos 5' de los cebadores. La PCR puede producir un enriquecimiento selectivo de una secuencia específica de DNA con un factor del 10^{9}. El método de la PCR también se describe en Saiki et al., 1985, Science 230:1350.
Los métodos de detección que se emplean generalmente en las técnicas de PCR estándar utilizan una sonda marcada del DNA amplificado en un ensayo de hibridación. Por ejemplo, la Publicación PE Núm. 237 362 y la Publicación PCT Núm. 89/11548 revelan métodos de ensayo en los que el DNA amplificado por PCR se fija primero a un filtro y después se añade una sonda oligonucleotídica específica y se permite su hibridación. Preferentemente, la sonda se marca, p. ej. con ^{32}P, biotina, peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés), etc., para permitir la detección de la hibridación. También se sugiere el procedimiento contrario, es decir, la sonda está unida a la membrana y es la muestra de DNA amplificada por PCR la que se añade.
Otros métodos de detección incluyen la utilización de polimorfismos en la longitud de los fragmentos (PCR-FLP, por sus siglas en inglés), la hibridación de sondas oligonucleotídicas específicas de alelos (ASO, por sus siglas en inglés) (Saiki et al., 1986, Nature 324:163) o la secuenciación directa a través del método didesoxi, utilizando DNA amplificado en lugar de DNA clonado. La técnica estándar de la PCR funciona esencialmente mediante la replicación de la secuencia de DNA situada entre dos cebadores, proporcionando como producto principal de la reacción una secuencia de DNA de una determinada longitud que termina en el extremo 5' del cebador de cada cadena. Por lo tanto, las inserciones y las deleciones entre los cebadores resultan en secuencias de producto de diferente longitud que pueden ser detectadas al medir el tamaño del producto de una PCR-FLP. En un ejemplo de hibridación de ASO, el DNA amplificado se fija a un filtro de nilón (por ejemplo mediante radiación UV) en una serie de "dot blots", con lo que se permite su hibridación con una sonda oligonucleótidica marcada con HRP bajo condiciones astringentes. Después del lavado, se añaden tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno. La HRP cataliza la oxidación del TMB por el peróxido de hidrógeno, dando como resultado un colorante azul soluble que puede precipitar, indicando la presencia de una sonda hibridada.
Mientras que la técnica de PCR tal y como se utiliza actualmente, es un método extremadamente potente para amplificar secuencias de ácidos nucleicos, la detección de material amplificado requiere de posteriores manipulaciones de los productos de la PCR para determinar si está presente el DNA diana. Sería conveniente reducir el número de pasos posteriores de manipulación que actualmente son necesarios para la detección de material amplificado. Sería ideal un sistema de ensayo "homogéneo" que es un sistema que produce una señal mientras la secuencia diana está siendo amplificada, que precisa una mínima manipulación después de la amplificación.
La presente invención proporciona un proceso para discriminar variantes de secuencia una secuencia de ácidos nucleicos diana en una muestra, dicho proceso comprende los pasos que se definen en la reivindicación 1.
Este proceso está especialmente pensado para el análisis del ácido nucleico amplificado mediante PCR. Este proceso representa una mejora respecto a los métodos de detección de PCR conocidos, ya que permite que la amplificación de una diana y la liberación de un marcador para que se logre la detección en un sistema de reacción sin tener que utilizar múltiples pasos de manipulación del producto amplificado. Por lo tanto, en otra modalidad de la invención, se proporciona un método de amplificación mediante la reacción en cadena de polimerasa para discriminar variantes de la secuencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra. Este método comprende los pasos tal y como se definen en la reivindicación 10.
La figura 1 es una autorradiografía de una lámina de cromatografía en capa fina (TLC por sus siglas en inglés) de DEAE-celulosa que ilustra la liberación de fragmentos marcados de la sonda escindida.
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La figura 2 es una autorradiografía de laminas de TLC de DEAE-celulosa que ilustran la termoestabilidad de la sonda marcada.
Las figuras 3A y 3B son autorradiografías de laminas de TLC de DEAE-celulosa que muestran que la cantidad de fragmentos de sonda marcados liberados se correlacionan con un aumento en el número de ciclos de la PCR y la concentración inicial del molde de DNA.
La figura 4 ilustra la actividad nucleasa 5'-3' independiente de la polimerización de la DNA polimerasa Taq mostrada en la autorradiografía utilizando una serie de cebadores que hibridan desde el nucleótido cero al 20 en dirección 5' respeto a la sonda.
La figura 5 es una autorradiografía que muestra la liberación de fragmentos de sonda marcada bajo un aumento de la temperatura y el tiempo de incubación, en el que el extremo 5' de la sonda tiene una composición rica en GC.
La figura 6 es una autorradiografía que muestra la liberación de fragmentos de sonda marcada en condiciones de temperatura y tiempo de incubación crecientes, en el que el extremo 5' de la sonda tiene una composición rica en AT.
La figura 7 proporciona el análisis por electroforesis en gel de acrilamida al 5% de un producto de 142 pares de bases del VIH, amplificado con la presencia o ausencia de una sonda marcada.
La figura 8 es una composición de dos autorradiografias en TLC de alícuotas de productos de amplificación por PCR, que muestran que la liberación de marcador radioactivo se produce y aumenta en cantidad con el aumento del molde inicial y con un mayor número de ciclos térmicos.
La figura 9 es un esquema de la reacción en la que un éster activo NHS derivado de la biotina se añade al extremo 3' de una sonda oligonucleótidica.
La figura 10 es un esquema de la reacción en la que la hidrazida de biotina se utiliza para marcar una sonda oligonucleótidica que tiene en el extremo 3' un ribonucleótido.
La figura 11 es un esquema de como marcar una sonda oligonucleótidica con biotina, utilizando biotina fosforamidita.
La figura 12 nos muestra reactivos para marcar sondas oligonucleótidicas con biotina.
La figura 13 nos muestra una sonda oligonucleótidica marcada con rodamina-X-590 y cristal violeta.
La figura 14 muestra un esquema de la reacción para generar azida acilo activa de cristal violeta.
La figura 15 es un esquema de la reacción para añadir una amina a una timidina y utilizarla para conjugar un marcador con una sonda oligonucleótidica.
La figura 16 muestra los resultados y la relación de la señal con el número diana de entrada típicos del presente método utilizando extractante en fase sólida PEI Bakerbond^{^{TM}}.
Tal y como se usa en este documento, el término "muestra" se refiere a toda sustancia que contiene o que supuestamente contiene ácidos nucleicos e incluye una muestra de tejido o líquido aislado de un sujeto o sujetos, incluyendo pero no limitándose a, por ejemplo, piel, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, linfa, líquido sinovial, orina, lágrimas, células sanguíneas, órganos, tumores y también a muestras de constituyentes de cultivo celular in vitro (incluyendo, pero no limitándose a un medio condicionado producido por el crecimiento de células en medios de cultivo celular, células recombinantes y componentes de células).
Del modo en que se usa en este documento, los términos ácido "nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a cebadores, sondas, fragmentos de oligómeros por detectar, controles de oligómeros y oligómeros bloqueadores sin marcador y pueden ser genéricos para polidesoxirribonucleótidos (que contengan 2-desoxi-D-ribosa), de polirribonucleótidos (que contengan D-ribosa) y de cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N-glucósido de una base purínica o pirimidínica o bases purínicas o pirimidínicas modificadas. No existe una distinción intencionada en longitud entre los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" y estos términos se usarán indistintamente. Estos términos se refieren solo a la estructura primaria de la molécula. Por lo tanto, estos términos incluyen DNA de doble cadena y de cadena simple, además de RNA de doble cadena y de cadena simple. El oligonucleótido consta de una secuencia de al menos 6 nucleótidos, aproximadamente, y más preferentemente de al menos 15-20 nucleótidos, aproximadamente, correspondientes a una zona de la secuencia de nucleótidos designada. El término "corresponder" significa que es idéntico o complementario a la secuencia designada.
El oligonucleótido no deriva necesariamente de una secuencia existente o natural, pero se puede generar de cualquier modo, incluyendo la síntesis química, la replicación de DNA, la transcripción inversa o una combinación de estos. Los términos "oligonucleótido" o "ácido nucleico" se refieren a polinucleótidos de DNA o RNA genómico, cDNA, de origen semisintético o sintético que en función de su origen o manipulación: (1) no están asociados con todos o una porción de los polinucleótidos con los que se asocia de modo natural; y/o (2) está ligado a un polinucleótido al que se liga de modo natural; y (3) que no es posible encontrarlo de modo natural.
Debido a que los mononucleótidos se hacen reaccionar para obtener oligonucleótidos de tal modo que el extremo 5' fosfato de un anillo de pentosa mononucleótido se une al oxígeno 3' de su vecino en una única dirección a través de un enlace fosfodiéster, un extremo de un oligonucleótido se denomina "extremo 5'" si su fosfato 5' no se une al oxígeno 3' de un anillo de pentosa de un mononucleótido y se denomina "extremo 3'" si su oxígeno 3' no está ligado a un fosfato 5' de un anillo de pentosa de un mononucleótido posterior. Del modo en que se usa en este documento, una secuencia de ácido nucleico, incluso si es interna a un oligonucleótido más largo, también puede expresarse como una secuencia con extremos 5' y 3'.
Cuando dos oligonucleótidos diferentes que no se solapan hibridan con diferentes zonas de la misma secuencia de ácido nucleico complementaria lineal y el extremo 3' de un oligonucleótido apunta hacia el extremo 5' de otro, el primero se puede denominar oligonucleótido "en dirección 5'" y el otro oligonucleótido "en dirección 3'".
El término "cebador" puede referirse a más de un cebador y se refiere a un oligonucleótido obtenido de modo natural, mediante digestiones purificadas con enzimas de restricción o producido sintéticamente, que puede actuar como iniciador de la síntesis a lo largo de una cadena complementaria cuando se somete a condiciones en las que se cataliza la síntesis de un producto de extensión de un cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico. Dichas condiciones incluyen la presencia de cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato diferentes y un agente inductor de la polimerización como la DNA polimerasa o la transcriptasa inversa, en un tampón adecuado (el "tampón" incluye sustituyentes que son cofactores o que afectan al pH, a la fuerza iónica, etc.) y una temperatura adecuada. Para una amplificación de máxima eficiencia, el cebador será, preferentemente, de una sola cadena.
Tal y como se usa en este documento, el complementario de una secuencia de ácido nucleico se refiere a un oligonucleótido que cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico de modo que el extremo 5' de una secuencia se empareja con el extremo 3' de la otra, está en "asociación antiparalela". Determinadas bases que generalmente no se pueden encontrar en ácidos nucleicos naturales pueden ser incluidas en los ácidos nucleicos de la presente invención e incluir, por ejemplo, inosina y 7 desazaguanina. No es necesario que la complementariedad sea perfecta; las cadenas dobles estables contienen pares de bases que no están bien apareadas o que están desapareadas. Los expertos en las técnicas de los ácidos nucleicos pueden determinar empíricamente la estabilidad de las cadenas dobles empíricamente, considerando muchas variables, como por ejemplo, la longitud del oligonucleótido, la composición de bases y la secuencia del oligonucleótido, la fuerza iónica y la incidencia de las parejas de bases mal
apareadas.
La estabilidad de una cadena doble de ácido nucleico se mide a partir de la temperatura de fusión o "T_{f}". La T_{f} de una doble cadena de ácido nucleico sometida a condiciones específicas es la temperatura a la que se han disociado la mitad de los pares de bases.
Del modo en que se usa en este documento, el término "secuencia diana" o "secuencia de ácidos nucleicos diana" se refiere a una zona del oligonucleótido que será amplificada, detectada o ambas. La secuencia diana se halla entre las dos secuencias de cebadores utilizados para la amplificación.
Del modo en que se usa en este documento, el término "sonda" se refiere a un oligonucleótido marcado que forma una estructura de cadena doble con una secuencia del ácido nucleico diana, debido a la complementariedad de al menos una secuencia en la sonda con una secuencia en la zona diana. Preferentemente, la sonda no contiene una secuencia complementaria a las secuencia(s) utilizadas para cebar la reacción en cadena de la polimerasa. Generalmente, el extremo 3' de la sonda se "bloqueará" para evitar la incorporación de la sonda en un producto de extensión del cebador. El "bloqueo" puede realizarse utilizando bases no complementarias o añadiendo un dominio químico como la biotina o un grupo fosfato al extremo 3' hidroxilo del último nucleótido, que en función del dominio seleccionado, podrá tener un propósito actuando doblemente, también como marcador para una detección o captura posterior del ácido nucleico ligado al marcador. El bloqueo también se puede realizar eliminando el extremo 3' -OH o utilizando un nucleótido al que le falte un extremo 3' -OH como un didesoxinucleótido.
El término "marcador" tal y como se usa en este documento se refiere a todo átomo o molécula que se puede usar para obtener una señal (preferentemente cuantificable), que se puede unir a un ácido nucleico o proteína. Los marcadores pueden proporcionar señales detectables mediante radiactividad, fluorescencia, colorimetría, gravimetría, difracción o absorción de rayos X, magnetismo, actividad enzimática y similares.
Tal y como se definen en este documento, "la actividad nucleasa 5' \rightarrow 3'" o la "actividad nucleasa de los extremos 5' al 3'" se refieren a la actividad de una polimerasa de ácidos nucleicos específica de molde, incluyendo actividad exonucleasa de los extremos 5' \rightarrow 3', tradicionalmente asociada con algunas polimerasas de DNA a través de los cuales los nucleótidos se eliminan del extremo 5' de un oligonucleótido, de modo secuencial (es decir, la DNA polimerasa I de E. coli presenta esta actividad, mientras que el fragmento Klenow no), o una actividad endonucleasa de los extremos 5' \rightarrow 3' en la que se produce una escisión, a una distancia superior a un enlace de fosfodiéster (nucleótido) del extremo 5' o ambos.
Del modo en que se usa en este documento, el término "adyacente" se refiere a la posición del cebador con respecto a la sonda en su cadena complementaria del molde de ácido nucleico. El cebador y la sonda pueden estar separados por una distancia de 1 a 20 nucleótidos, más preferentemente de 1 a 10 nucleótidos o directamente por uno u otro, como puede resultar deseable para la detección con un proceso independiente de polimerización. Como alternativa a la utilización de un proceso dependiente de polimerización, así como también cuando se utiliza el presente método en los métodos de amplificación y detección de la PCR, tal y como se explica en este documento, la "adyacencia" puede producirse en cualquier posición dentro de la secuencia que se va a amplificar, en cualquier posición en dirección 3' de un cebador de modo que la extensión de este cebador posicionará a la polimerasa para que tenga lugar la escisión de la sonda.
Del modo en que se usa en este documento, el término "polimerasa del ácido nucleico termoestable" se refiere a una enzima que es relativamente estable al calor, comparada, por ejemplo, con polimerasas de nucleótidos de E. coli y que cataliza la polimerización de nucleósidos trifosfato. Generalmente, la enzima iniciará la síntesis en el extremo 3' del cebador hibridado con la secuencia diana y avanzará en dirección 5' a lo largo del molde y si posee una actividad nucleasa 5' \rightarrow 3', continúa hidrolizando la sonda hibridada para liberar los fragmentos de sonda marcados y no marcados, hasta que la síntesis termine. Una enzima termoestable representativa aislada de Thermus aquaticus (Taq) se describe en la patente estadounidense Núm. 4 889 818 y en Saiki et al., 1988, Science 239:487 se describe un método para usarla en la PCR convencional.
La DNA polimerasa Taq tiene un DNA dependiente de síntesis, actividad exonucleasa 5'-3' de sustitución de la cadena (véase Gelfand, "Taq DNA Polymerase" en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Erlich, Ed., Stockton Press, N.Y. (1989), Capítulo 2. En solución se produce poca degradación, existe, de oligonucleótidos marcados.
La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ingeniería genética, que se encuentran entre las técnicas de vanguardia. Estas técnicas se explican exhaustivamente en la literatura científica. Véase, p. ej., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, segunda edición (1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, 1984); y una serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.). Todas las patentes, las solicitudes de patentes y publicaciones que se mencionan en este documento, ya sean supra e infra, se incorporan por la presente mediante referencias.
Los diferentes aspectos de la invención se basan en una propiedad especial de las polimerasas de ácidos nucleicos. Las polimerasas de ácidos nucleicos pueden poseer varias actividades, entre ellas una actividad nucleasa 5'-3' mediante la que la polimerasa del ácido nucleico puede escindir mononucleótidos o oligonucleótidos de tamaño pequeño de un oligonucleótido hibridado con su polinucleótido complementario de mayor longitud. Para que se produzca la escisión eficientemente, un oligonucleótido en dirección 5' debe también hibridarse al mismo polinucleótido de mayor longitud.
El extremo 3' de este oligonucleótido en dirección 5' proporciona el sitio de unión inicial para la polimerasa de ácidos nucleicos. En el momento en el que la polimerasa unida alcanza el extremo 5' del oligonucleótido en dirección 3', la polimerasa puede escindir mononucleótidos o oligonucleótidos de tamaño pequeño a partir de éste.
Los dos oligonucleótidos se pueden diseñar de tal modo que hibriden en posiciones cercanas con el ácido nucleico diana complementario de manera que esta unión de la polimerasa de ácidos nucleicos al extremo 3' del oligonucleótido en dirección 5' lo pone en contacto automáticamente con el extremo 5' del oligonucleótido en dirección 3'. Debido a que la polimerización no es necesaria para que la polimerasa del ácido nucleico se coloque en una posición para que se produzca una escisión, este proceso se denomina "escisión independiente de la polimerización".
De modo alternativo, si los dos oligonucleótidos se hibridan con regiones más separadas en el molde diana del ácido nucleico, la polimerización debe tener lugar antes de que la polimerasa del ácido nucleico alcance el extremo 5' del oligonucleótido en dirección 3'. A medida que la polimerización avanza, la polimerasa escinde progresivamente mononucleótidos o oligonucleótidos de tamaño pequeño a partir del extremo 5' del oligonucleótido en dirección 3'. Esta escisión continuará hasta que el resto del oligonucleótido en dirección 3' se haya desestabilizado hasta el punto que se disocia de la molécula molde. Este proceso se denomina "escisión dependiente de la polimerización".
En la presente invención se une un marcador al oligonucleótido en dirección 3'. Por lo tanto, se pueden detectar los mononucleótidos o oligonucleótidos de tamaño pequeño escindidos por la actividad nucleasa 5'-3' de la polimerasa.
Posteriormente, se pueden emplear cualquiera de las diversas estrategias para distinguir el oligonucleótido marcado no escindido de los fragmentos escindidos del mismo. De este modo, la presente invención permite identificar aquellas muestras de ácidos nucleicos que contienen secuencias complementarias a los oligonucleótidos en dirección 5' y en dirección 3'.
La presente invención aprovecha esta actividad nucleasa 5' \rightarrow 3' de la polimerasa cuando se utiliza conjuntamente con la PCR. Esto difiere de la amplificación de la PCR que se ha descrito anteriormente, en la que se detectan oligonucleótidos diana amplificados tras la PCR, por ejemplo, mediante la hibridación con una sonda que forma una cadena doble estable con la de la secuencia diana bajo condiciones estrictas o moderadamente estrictas de hibridación y de lavado. En contraste con los métodos de detección conocidos utilizados en amplificaciones tras la PCR, la presente invención permite la detección de secuencias de ácidos nucleicos diana durante la amplificación de este ácido nucleico diana. En la presente invención, se añade un oligonucleótido marcado conjuntamente con el cebador en el inicio de la PCR y la señal generada por la hidrólisis del nucleótido(s) marcado de la sonda proporciona un medio para la detección de la secuencia diana durante su amplificación.
No obstante, la presente invención es compatible con otros sistemas de amplificación como el sistema de amplificación de la transcripción en el que uno de los cebadores de la PCR codifica un promotor que se utiliza para realizar copias de RNA de la secuencia diana. De un modo similar, la presente invención se puede utilizar en un sistema de replicación de secuencias automantenido (3SR), en el que se utilizan diferentes enzimas para producir tránscritos de RNA que después se utilizan para obtener copias de DNA, todo a una única temperatura. También se puede emplear la presente invención para detectar productos LCR, mediante la incorporación de una polimerasa con actividad exonucleasa 5'\rightarrow3' en un sistema de reacción en cadena de la ligasa (LCR), conjuntamente con oligonucleótidos adecuados.
Por supuesto, la presente invención se puede aplicar a sistemas que no implican una amplificación. De hecho, la presente invención ni siquiera requiere que se produzca la polimerización. Una de las ventajas del proceso independiente de polimerización reside en que no es necesaria la amplificación de la secuencia diana. En ausencia de la extensión del cebador, el ácido nucleico diana es básicamente de cadena simple. Debido a que el cebador y el oligonucleótido marcado están unidos adyacentemente al ácido nucleico diana, se pueden producir series secuenciales de hibridación de oligonucleótidos y escisión de los fragmentos marcados. Por lo tanto, se puede generar una cantidad suficiente de fragmentos marcados, que permite la detección en ausencia de polimerización. Los expertos en la materia comprenderán que la señal se genera durante la amplificación mediante PCR podría aumentar mediante esta actividad independiente de polimerización.
En los procesos descritos en este documento, se proporciona una muestra que contiene supuestamente la determinada secuencia de oligonucleótidos de interés, el "ácido nucleico diana". El ácido nucleico diana de la muestra debe primero transcribirse inversamente en cDNA, si es necesario, y desnaturalizarse después utilizando cualquier método de desnaturalización adecuado, incluyendo medios físicos, químicos o enzimáticos, conocidos por los expertos en la materia. Uno de los medios físicos preferidos para la separación de cadenas requiere la aplicación de calor sobre el ácido nucleico hasta que esté completamente (>99%) desnaturalizado. Los procesos típicos de desnaturalización por calor implican el uso de temperaturas que oscilan desde los 80ºC hasta los 105ºC, aproximadamente, para períodos de tiempo que oscilan entre los pocos segundos y los minutos. Como alternativa a la desnaturalización, el ácido nucleico diana puede existir en forma de cadena simple en la muestra, como por ejemplo, en los virus de RNA o DNA de cadena simple.
Después, las cadenas de ácido nucleico desnaturalizadas se incuban con cebadores oligonucleótidos preseleccionados y oligonucleótidos marcados (denominados también aquí como "sonda") en condiciones de hibridación, que permiten la unión de los cebadores y las sondas a las cadenas simples de ácidos nucleicos. Como se conoce en la materia, los cebadores se seleccionan de modo que sus posiciones relativas a lo largo de una secuencia de doble cadena sean aquellas en que un producto de extensión sintetizado a partir de un cebador, cuando el producto de extensión se separa de su molde (complemento), sirve como molde para la extensión del otro cebador para producir una réplica de longitud definida.
Debido a que las cadenas complementarias son más largas que la sonda o el cebador, las cadenas tienen más puntos de contacto y por lo tanto, una mayor probabilidad de encontrarse en cualquier período de tiempo. Una concentración molar en exceso de sonda más el cebador ayuda a establecer un equilibrio hacia la hibridación del cebador y la sonda, en lugar de hacia la rehibridación del molde.
El cebador debe tener una longitud suficientemente para iniciar la síntesis de productos de extensión en presencia de un agente de polimerización. La longitud exacta y la composición de un cebador dependerán de muchos factores, como la temperatura de la reacción de hibridación, el origen y composición del cebador, la proximidad del sitio de hibridación de la sonda y el sitio de hibridación del cebador y la proporción entre el cebador y la sonda. Por ejemplo, en función de la complejidad de la secuencia diana, el oligonucleótido cebador contiene típicamente de 15 a 30 nucleótidos, aunque un cebador puede contener más o menos nucleótidos. Los cebadores deben ser lo suficientemente complementarios para hibridarse selectivamente con las cadenas respectivas y formar cadenas dobles estables.
Los cebadores que aquí se utilizan se seleccionan de modo que sean "sustancialmente" complementarios a las diferentes cadenas de cada secuencia específica que se amplifica. No es necesario que los cebadores reflejen la secuencia exacta del molde, pero deben ser suficientemente complementarios para hibridar selectivamente con las cadenas respectivas. Las bases no complementarias o las secuencias más largas pueden intercalarse en el cebador o localizarse en los extremos del cebador, siempre que el cebador mantenga una complementariedad suficiente con una cadena del molde como para formar cadenas dobles estables con esta. Las secuencias de nucleótidos no complementarios de los cebadores pueden incluir sitios para las enzimas de restricción.
En la práctica de la invención, la sonda oligonucleotídica marcada debe hibridarse primero con un ácido nucleico complementario antes de que la polimerasa de ácidos nucleicos alcance esta región de cadena doble, permitiendo, de ese modo, que la actividad nucleasa 5'-3' se escinda y libere fragmentos de oligonucleótidos marcados.
Para aumentar la probabilidad de que el oligonucleótido marcado se hibride a un ácido nucleico complementario antes de que la polimerización de la extensión del cebador alcance esta región de cadena doble o antes de que la polimerasa se una al extremo 5' del oligonucleótido en el proceso independiente de polimerización, puedan emplearse diferentes técnicas. Para el proceso dependiente de polimerización se puede colocar la sonda de modo que el extremo 5' de ésta se encuentre relativamente alejada del extremo 3'- del cebador, proporcionando así, más tiempo a la sonda para hibridarse antes de que la extensión del cebador bloquee el sitio de unión de la sonda. Generalmente, las moléculas cebadoras de poca longitud necesitan temperaturas inferiores para formar complejos híbridos suficientemente estables con el ácido nucleico diana. Por lo tanto, el oligonucleótido marcado se puede diseñar para tenga una longitud mayor que el cebador, de modo que el oligonucleótido marcado se hibride preferentemente a la diana a una temperatura superior, en comparación con la hibridación del cebador.
También se pueden utilizar cebadores y oligonucleótidos marcados con una estabilidad térmica distinta. Por ejemplo, puede escogerse un oligonucleótido marcado compuesto por nucleótidos que presenten un contenido mayor de G/C y, consecuentemente, una mayor estabilidad térmica que el cebador. De un modo similar, se pueden incorporar nucleótidos modificados en la sonda y éstos contienen análogos de bases que forman pares de bases más estables que las bases que están presentes normalmente en ácidos nucleicos naturales.
Las modificaciones de la sonda que pueden facilitar la unión de la sonda antes que la unión del cebador para maximizar la eficiencia del presente ensayo incluyen la incorporación de enlaces fosfodiéster cargados positivamente o neutros en la sonda, para disminuir la repulsión de los esqueletos polianiónicos de la sonda y la diana (véase Letsinger et al., 1988, J. Amer. Chem. Soc. 110:4470);la incorporación de bases con grupos alquilo o halogenadas, como la 5-bromouridina, en la sonda para incrementar la acumulación de bases, la incorporación de ribonucleótidos en la sonda para forzar la transformación de la cadena doble sonda : diana en una estructura "A" que da lugar a un aumento de la acumulación de bases; y la sustitución por 2,6-diaminopurina (aminoadenosina) de algunas o todas de las adenosinas de la sonda. En la preparación de dichas sondas modificadas de la invención hay que reconocer que la fase limitante de la velocidad de formación de las cadenas dobles es la "nucleación", la formación de un único par de bases y por tanto, la alteración de las características biofísicas de una porción de la sonda, por ejemplo, solo la porción del extremo 3' o 5', puede ser suficiente para alcanzar el resultado deseado. Además, debido a que la porción del extremo 3' de la sonda (los 8 a 12 nucleótidos terminales 3') se disocia y después de la degradación del extremo 5' mediante la actividad nucleasa de la polimerasa, las modificaciones del extremo 3' se pueden realizar sin preocuparse por la interferencia con la actividad polimerasa/nucleasa.
Los parámetros de los ciclos térmicos también se pueden modificar para beneficiarse de la estabilidad térmica diferente del oligonucleótido marcado y del cebador. Por ejemplo, después de la fase de desnaturalización en los ciclos térmicos se puede introducir una temperatura intermedia que permita que la unión de oligonucleótidos marcados, pero no la unión de los cebadores y después la temperatura se reduce aun más para permitir la hibridación y la extensión de los cebadores. No obstante, se debe observar que la escisión de la sonda es necesario que se produzca solamente en los últimos ciclos del proceso de la PCR si se desean obtener los resultados esperados. Por lo tanto, se puede establecer la mezcla de reacción de modo que aunque los cebadores inicialmente se unan de forma preferente a las sondas, la concentración de cebadores se reduce a medida que la extensión de cebadores se produce de modo que en los últimos ciclos las sondas se unen preferentemente a los cebadores.
Para favorecer la unión del oligonucleótido marcado antes que la del cebador, también se puede usar un exceso en la concentración molar de los oligonucleótidos marcados en relación con la concentración de cebador. En este modo de realización de la invención, la concentración de oligonucleótidos marcados es generalmente unas 2-20 veces más elevada que la concentración del cebador respectivo, que generalmente es de 0,5-5 x 10^{-7} M. Los expertos reconocen que la concentración de oligonucleótidos, la longitud y la composición de bases son factores importantes que afectan a la T_{m} de un oligonucleótido concreto en una mezcla de reacción. Se puede manipular cada uno de estos factores para crear un sesgo termodinámico y favorecer, de este modo, la hibridación de la sonda con respecto a la hibridación del cebador.
Los cebadores oligonucleótidos y los oligonucleótidos marcados pueden prepararse mediante cualquier método adecuado. Los métodos para preparar oligonucleótidos de secuencia específica se conocen en el ámbito e incluyen, por ejemplo, la clonación y la restricción de secuencias adecuadas y la síntesis química directa. Los métodos de síntesis química pueden incluir, por ejemplo el método de fosfotriéster que describen Narang et al., 1979, Methods in Enzymology 68:90, el método fosfodiéster descrito por Brown et al., 1979, Methods in Enzymology 68:109. El método dietilfosforamidato descrito en Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Letters 22:1859 y el método en soporte sólido descrito en la patente estadounidense Núm. 4 458 066.
La composición del oligonucleótido marcado se puede diseñar para favorecer la actividad nucleasa frente al desplazamiento de la cadena (fragmentos mononucleótidos y dinucleótidos frente a los fragmentos oligonucleótidos) mediante la elección de secuencias que son ricas en GC o que evitan secuencias de A y T y mediante la elección de la posición del marcador en la sonda. En presencia de secuencias ricas en AT en la región 5' complementaria de la sonda, la escisión se produce después del cuarto, el quinto o el sexto oligonucleótido, aproximadamente. No obstante, en una región 5' complementaria de la sonda rica en GC rica, generalmente se produce la escisión después del primer o segundo nucleótido. De modo alternativo, se puede utilizar la incorporación de un enlace de fosfodiéster modificado (p. ej. fosforotioato o metilfosfonato) en la sonda marcada durante la sínteis química (Noble et al., 1984, Nuc Acids Res 12:3387-3403; lyer et al., 1990, J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254) para prevenir la escisión en un sitio seleccionado. En función de la longitud de la sonda, la composición de la región 5' complementaria de la sonda y la posición del marcador, se puede diseñar una sonda para favorecer preferentemente la generación de fragmentos de sonda marcados de pequeña o gran longitud, para utilizarlos en la práctica de la invención.
El oligonucleótido se marca tal y como se describe más adelante, con la incorporación de dominios que sean detectables mediante métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. El método para unir o conjugar el marcador a la sonda oligonucleotídica depende, por supuesto, del tipo de marcador(es) utilizados y la posición del marcador en la sonda.
Existen diversos marcadores que son adecuados para utilizar en esta invención, así como también los métodos para unirlos a la sonda que son conocidos en la materia y que incluyen, pero no se limitan a las enzimas (p. ej. la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rábano picante) y sustratos de enzimas, átomos radiactivos, colorantes fluorescentes, cromóforos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores electroquimioluminiscentes como el Origen^{^{TM}} (Igen), ligandos que tienen miembros de enlace específicos o cualquier otro tipo de marcadores que puedan interactuar el uno con el otro para aumentar, alterar o disminuir una señal. Por supuesto, la PCR debe llevarse a cabo con un termociclador y el marcador deberá soportar la temperatura de ciclado necesaria en este proceso automático.
Entre todos los átomos radiactivos, es preferible el ^{32}P. Los métodos para introducir el ^{32}P en los ácidos nucleicos son conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo, el marcado en 5' con quinasa o la inserción aleatoria mediante el traslado de mellas. Las enzimas se detectan generalmente mediante su actividad. "La unión a un miembro específico" se refiere a una proteína que puede unirse con elevada especificidad a una molécula ligando, como por ejemplo en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico de éste. Otros miembros de unión específicos incluyen la biotina y la avidina o estreptavidina, la IgG y la proteína A y numerosas parejas de receptor-ligando conocidas en la materia. La descripción anterior no está destinada a dividir en categorías los diferentes marcadores en distintas clases, ya que el mismo marcador puede utilizarse de modos diferentes. Por ejemplo, el ^{125}I puede utilizarse como un marcador radiactivo o como un reactivo de alta densidad electrónica. El HRP puede utilizarse como una enzima o como un antígeno para un anticuerpo monoclonal. Además, se pueden combinar varios marcadores para obtener el efecto deseado. Por ejemplo, se puede marcar una sonda con biotina y detectar la presencia de una sonda con avidina marcada con ^{125}I o con un anticuerpo monoclonal antibiotina marcado con HRP. Para los expertos en la materia, otras per- mutaciones y posibilidades que se consideren equivalentes dentro del alcance inmediato de la invención son evidentes.
Los fluoróforos utilizados como marcadores en la construcción de sondas marcadas de la invención son la rodamina y derivados como el Texas Red, la fluoresceína, el amarillo Lucifer, IAEDANS, 7-Me_{2}N-cumarina-4-acetato, 7-OH-4-CH_{3}-cumarina-3-acetato, 7-NH_{2}-4-CH_{3}-cumarina-3-acetato (AMCA), monobromobimano, trisulfonato de pireno como el Azul Cascada y el monobromotrimetil-amoniobimano. En general, son preferibles los fluoróforos con desplazamientos de Stokes amplios para permitir el uso de fluorímetros con filtros, en lugar de un monocromómetro y para aumentar la eficiencia de la detección.
En algunas situaciones se pueden utilizar dos marcadores interactivos en un único oligonucleótido, con la debida consideración para mantener una separación adecuada de los marcadores en el oligonucleótido para permitir la separación de los marcadores durante la hidrólisis del oligonucleótido. La rodamina y el cristal violeta son los marcadores interactivos preferidos.
En otra modalidad de la invención, la detección de las sondas marcadas hidrolizadas se puede llevar a cabo utilizando, por ejemplo, la polarización de fluorescencia, una técnica para diferenciar entre las moléculas grandes y pequeñas basada en la rotación molecular Las moléculas grandes (p. ej. la sonda marcada intacta) rota en la solución mucho más despacio que las moléculas pequeñas. Hasta que se produzca un enlace entre una fracción fluorescente con la molécula de interés (p. ej. el extremo 5' de una sonda marcada), esta fracción fluorescente se puede medir (y diferenciar) en función de la rotación molecular, por lo tanto, diferenciando así entre sondas intactas y digeridas. La detección se puede determinar directamente durante la PCR o puede realizarse después de la PCR.
En otra modalidad, se utilizan dos oligonucleótidos marcados, cada uno de ellos complementario a regiones separadas de cadenas separadas de una región diana de cadena doble, pero no complementarios el uno del otro, de modo que un oligonucleótido hibrida en dirección 3' de cada cebador. Por ejemplo, la presencia de dos sondas puede potencialmente doblar la intensidad de la señal generada por un marcador único y además, puede reducir la rehibridación de la cadena de producto, como ocurre frecuentemente durante la amplificación PCR. Las sondas se seleccionan de modo que se unan a las posiciones adyacentes (en dirección 3') a las posiciones a las que se unen los cebadores.
En la presente invención también se pueden utilizar múltiples sondas para alcanzar otros beneficios. Por ejemplo, se puede analizar la cantidad de patógenos en una muestra simplemente añadiendo tantas sondas como se desee en la mezcla de reacción; cada una de las sondas puede contener un marcador diferente para facilitar la detección.
También se puede conseguir la discriminación específica de alelos o de especies (p. ej. específica para diferentes especies de Borrelia, el agente causante de la enfermedad de Lyme), utilizando múltiples sondas en la presente invención, por ejemplo, utilizando sondas que tienen diferentes T_{m} y realizando la reacción de hibridación/escisión a una temperatura específica solamente para una cadena doble sonda/alelo. Por ejemplo, se puede escoger un par de cebadores que amplifiquen el HTLV-I (Human T-cell Lymphotrophic virus type I, por sus siglas en inglés) y el HTLV-II (Human T-cell Lymphotrophic virus type II, por sus siglas en inglés) y utilicen dos sondas, cada una de ellas marcadas especialmente y de manera específica para el HTLV-I o el HTLV-II. También se puede conseguir la discriminación específica de alelos utilizando una única sonda y examinando los tipos de productos escindidos generados. En esta modalidad de la invención, la sonda se diseña para que sea exactamente complementaria a un alelo, pero no al resto de alelo(s), al menos en la región terminal 5'. Con respeto al resto de alelo(s), la sonda se desapareará en la región terminal 5' de la sonda, de modo que se generará un producto de escisión diferente comparado con el producto de escisión generado cuando la sonda se hibride con el alelo exactamente complementario.
Aunque se puede seleccionar la secuencia de la sonda para conseguir beneficios importantes, también se pueden obtener ventajas importantes mediante la selección de los marcadores de la sonda. Los marcadores se pueden unir a los oligonucleótidos directa o indirectamente mediante una gran variedad de técnicas. En función del tipo preciso de marcador utilizado, el marcador se puede colocar en el extremo 5' o 3' de la sonda, en el interior de la sonda o unido a brazos espaciadores de varios tamaños y composiciones, para facilitar las interacciones de la señal. Utilizando los reactivos de fosforamidita disponibles en el mercado se pueden producir oligómeros que contengan grupos funcionales (p. ej., tioles o aminas primarias), ya sea en la terminación 5' o la 3', a través de una fosforamidita protegida adecuada y se pueden marcar utilizando protocolos descritos, por ejemplo, en los PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds. Academic Press, Inc., 1990).
En la Patente Estadounidense Núm. 4 914 210 se describen los métodos para introducir reactivos funcionalizadores de oligonucleótidos para introducir uno o más sulfidrilos, dominios hidroxilo o amino en la secuencia de la sonda oligonucleotídica, típicamente en la terminación 5'. Se puede introducir como radioisótopo un grupo fosfato en el extremo 5' mediante la utilización de polinucleótido quinasa y gamma-ATP -^{32}p para proporcionar un grupo indicador. Se puede añadir biotina al extremo 5' mediante la reacción de un residuo de aminotimidina o un residuo de 6-amino hexil, introducido durante la síntesis, con un éster N-hidroxisuccinimida de biotina. Los marcadores en el extremo 3' pueden utilizar la polinucleótido transferasa terminal para añadir el dominio deseado, como por ejemplo, la cordicepina 35s-dATP y el dUTP biotinado.
Los derivados de los oligonucleótidos también son marcadores disponibles. Por ejemplo, el eteno-dA y el eteno-A son nucleótidos de adenina fluorescentes conocidos que se pueden incorporar en una sonda oligonucleotídica. Del mismo modo, el eteno-dC o la 2-aminopurina desoxirribosa es otro análogo que se puede utilizar en la síntesis de la sonda. Las sondas que contienen tales derivados de los oligonucleótidos pueden hidrolizarse para liberar mononucleótidos mucho más fluorescentes mediante la actividad nucleasa 5'-3' a medida que la DNA polimerasa realiza la extensión de un cebador durante la PCR.
Una extensión dependiente del cebador(es) oligonucleotídico del molde se cataliza mediante un agente de polimerización en presencia de cantidades adecuadas de los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) o de análogos, tal y como se ha mencionado anteriormente, en un medio de reacción que consta de las sales apropiadas, los cationes de metal y un sistema de tampón del pH. Los agentes polimerizantes adecuados son enzimas que se sabe que catalizan la síntesis de DNA dependiente de los cebadores y de los moldes y tienen actividad nucleasa 5'-3'. Las DNA polimerasas conocidas son, por ejemplo, la DNA polimerasa I de E. coli, la DNA polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), la DNA polimerasa de Bacillus stearothermophilus, la DNA polimerasa de Thermococcus litoralis y la DNA polimerasa de Thermus aquaticus (TTa). Las condiciones de reacción para catalizar la síntesis del DNA con estas DNA polimerasas son bien conocidas en la materia. Para ser de utilidad en la presente invención, el agente polimerizador debe escindir eficientemente el oligonucleótido y liberar fragmentos marcados, de modo que la señal se genere directa o indirectamente.
Los productos de la síntesis son moléculas de cadena doble que constan de las cadenas de molde y de las cadenas de extensión del cebador que incluyen la secuencia diana. Los subproductos de esta síntesis son fragmentos de oligonucleótidos marcados que constan de una mezcla de fragmentos de mononucleótidos, dinucleótidos y nucleótidos de mayor longitud. Los ciclos repetidos de desnaturalización, la hibridación del oligonucleótido marcado y los cebadores hibridados, la extensión del cebador y la escisión del oligonucleótido marcado dan lugar a la acumulación exponencial de la región diana definida por los cebadores y la generación exponencial de fragmentos marcados. Se llevan a cabo un número de ciclos suficientes para conseguir una cantidad de marcador detectable, que puede ser de varios ordenes de magnitud superior al de la señal de fondo, aunque en la práctica común estas elevadas proporciones entre la señal y el ruido de fondo puede que no se alcancen ni se deseen.
En un método preferido, el proceso de PCR se lleva a cabo como un proceso automático que utiliza una enzima termoestable. En este proceso, se realizan un ciclado a partir de la mezcla de reacción a través de una etapa de desnaturalización, una etapa de hibridación de la sonda y el cebador y una etapa de síntesis, en las que se produce la escisión y el desplazamiento simultáneamente con la extensión del molde dependiente del cebador. Se puede emplear un termociclador de DNA como la maquina de Perkin-Elmer Cetus Instruments, disponible en el mercado, que está diseñada especialmente para utilizarla con una enzima termoestable.
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En este proceso automático son preferibles las polimerasas estables a la temperatura porque el modo preferido de desnaturalizar los productos de extensión de doble cadena es sometiéndolos a altas temperaturas (95ºC aproximadamente) durante el ciclo de la PCR. Por ejemplo, la patente estadounidense Núm. 4 889 818 describe una enzima termoestable representativa aislada del Thermus aquaticus. Otras polimerasas termoestables representativas son, p. ej., las polimerasas extraídas de las bacterias termoestables Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus (que de algún modo presenta una temperatura óptima más baja que el resto de las bacterias de la lista), Thermus lacteus, Thermus rubens, Thermotoqa maritima, Thermococcus litoralis y Methanothermus fervidus.
La detección o verificación de los fragmentos de oligonucleótidos marcados puede conseguirse mediante una gran variedad de métodos y puede depender del origen del marcador o de los marcadores utilizados. Una modalidad adecuada de la invención consiste en someter a los productos de reacción, incluyendo los fragmentos marcados y escindidos, al análisis de tamaño. Los métodos para determinar el tamaño de los fragmentos de ácido nucleico se conocen en la materia e incluyen, por ejemplo, electroforesis en gel, sedimentación en gradiente, cromatografía de exclusión en gel y homocromatografía.
Durante o después de la amplificación, la separación de los fragmentos marcados de la mezcla de la PCR se pueden conseguir mediante, por ejemplo, el contacto de la mezcla de PCR con un extractante en fase sólida (EFS). Por ejemplo, los materiales que pueden unirse a los oligonucleótidos en base al tamaño, la carga o la interacción con las bases de oligonucleótido, las bases se pueden añadir a la mezcla de la PCR, en condiciones en las que los oligonucleótidos marcados y no escindidos son de pequeña longitud y están unidos y los fragmentos marcados no. Estos materiales EFS son las resinas o microesferas de intercambio iónico, como las partículas de unión Nensorb disponibles en el mercado (DuPont Chemical Co.), el Nucleogen (The Nest Group), el PEI, BakerBond^{^{TM}} PEI, el Amicon PAE 1.000, el Selectacel^{^{TM}} PEI, el Boronato SPE con una sonda en la ribosa 3', secuencias que contienen EFS complementarias al extremo 3' de la sonda e hidroxilapatita. En una modalidad específica si se utiliza un oligonucleótido marcado doblemente que consta de un marcador de biotina en 3' separado del marcador en 5' mediante un sitio susceptible de ser escindido por una nucleasa como medio de señal, la mezcla amplificada de la PCR se puede poner en contacto con materiales que contienen un miembro de unión específico como la avidina o la estreptavidina o un anticuerpo o un anticuerpo monoclonal de la biotina. Tales materiales pueden ser microesferas y partículas recubiertas con miembros de unión específicos y también pueden ser partículas magnéticas.
Después de la etapa en la que la mezcla de la PCR ha entrado en contacto con un EFS, el material EFS se puede eliminar mediante la filtración, la sedimentación o la atracción magnética, permitiendo que los fragmentos marcados se liberen de los oligonucleótidos marcados no escindidos y estén preparados para la detección.
Los reactivos utilizados en los métodos de la invención se pueden envasar en kits de diagnóstico. Los kits de diagnóstico constan de oligonucleótidos marcados y los cebadores, en recipientes separados. Si el oligonucleótido no está marcado, también deben incluirse en el kit los reactivos marcadores específicos. El kit debe también constar de otros reactivos envasados adecuadamente y materiales necesarios para la amplificación, como por ejemplo tampones, dNTP y/o medios de polimerización y para el análisis de detección, por ejemplo, debe incluir enzimas y extractantes en fase sólida, así como también instrucciones para llevar a cabo el ensayo.
Los ejemplos que se describen a continuación pretenden ser ilustrativos de los diversos métodos y compuestos de la invención.
Ejemplo 1 Liberación del Marcador de la Sonda en la PCR
Se realizó una amplificación en una PCR que liberó el extremo 5' marcado con ^{-32}P de una sonda complementaria cuando se intentó sintetizar un producto específico.
A. Marcado de la sonda con gamma^{-32}P-ATP y polinucleótido-quinasa
Se mezclaron individualmente diez pmoles de cada una de las sondas (BW31, BW33, BW35, las secuencias se proporcionan más abajo) con 15 unidades de polinucleótido quinasa T4 (New England Biolabs) y 15,3 pmoles de gamma-^{32}P-ATP (New England Nuclear, 3000 Ci/mmol) en un volumen de reacción de 50 \mul que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 5 mM, espermidina 0,1 mM y EDTA 0,1 mM durante 60 minutos a 37ºC. Después, el volumen total se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol tal y como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning, segunda edición (1989). Las sondas se resuspendieron en un tampón de TE 100 \mul y se realizó una "spin diálisis" en columna de Sephadex G-50 para eliminar el gamma-^{32}P-ATP, tal y como se muestra en Sambrook et al., supra. La precipitación de TCA de los productos de reacción indicaban las siguientes actividades específicas:
BW31: 1,98 x 10^{6} cpm/pmol
BW33: 2,54 x 10^{6} cpm/pmol
BW35: 1,77 x 10^{6} cpm/pmol
La concentración final de las tres sondas era de 0,10 pmol/\mul.
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B. Amplificación
La región amplificada era un producto de 350 pares de bases del bacteriófago M13mp10w dirigido por los cebadores BW36 y BW42. La región de cada secuencia de los cebadores numerados que se designan en este documento sigue la utilización de la secuencia de nucleótidos del M13 estándar.
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Se utilizaron tres sondas diferentes, cada una de ellas contenía la secuencia exactamente complementaria a
M13mp10w de 30 bases, pero diferían en longitud de las regiones del extremo 5' no complementarias. Las sondas se sintetizaron para obtener 3'-PO4, en lugar de 3'-OH para bloquear toda extensión realizada mediante la Taq polimerasa.
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Para la amplificación del fragmento de 350 pares de bases se añadieron 10^{-3} pmoles de la secuencia diana de M13mp10w a 50 \mul de volumen de reacción que contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 3 mM, de cada uno de los cebadores BW36 y BW42 10 pmol, de cada uno de los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato 200 \muM, de DNA polimerasa Taq 1,25 unidades y de las sondas BW31, BW33 o BW35 isotópicamente diluidas 1, 10 o 20 pmol. La cantidad de sonda marcada radiactivamente se mantuvo constante a 0,4 pmol por reacción y se diluyó en 1, 10 o 20 pmol con sonda no radiactiva. La polimerasa Taq se añadió a 4 \mul por reacción a 0,3125 U/\mul y se diluyó en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, KCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, NP40 0,5%, Tween 20 0,5% y gelatina 500 \mug/ml.
Se elaboró un master mix de reacción con cantidades adecuadas de tampón de reacción, nucleósidos trifosfato y ambos cebadores y enzimas. De este master mix se formaron las alícuotas y se añadió el molde y varias concentraciones de cada sonda. Las reacciones de control consistieron en añadir todos los componentes de la reacción excepto el molde y todos los componentes de la reacción excepto la sonda. Cada mezcla de reacción se cubrió con 50 \mul de aceite mineral para evitar la evaporación, se centrifugó durante 45 segundos y después se introdujo en un termociclador. Las mezclas de reacción estaban sujetas al siguiente esquema de amplificación:
Quince ciclos:
96ºC desnaturalización, 1 min
\quad
60ºC hibridación/extensión, 1,5 min
Un ciclo:
96ºC desnaturalización, 1 min
\quad
60ºC hibridación/extensión, 5,5 min
Después de los ciclos, el aceite mineral se extrajo con 50 \mul de cloroformo, las mezclas se almacenaron a 4ºC y se llevaron a cabo las siguientes pruebas.
C. Análisis
Para el análisis en gel de acrilamida se mezclaron 4 \mul de cada reacción de amplificación con 3 \mul de 5X de gel de mezcla de carga (azul de bromofenol 0,125%, Ficoll 400 12,5% en H_{2}O) y se cargaron en gel de acrilamida al 4% (tampón 10X TBE 10 ml, persulfato amónico al 10% 1 ml, 10 ml de Bis acrilamida al 40% 19:1, TEMED 50 \mul y 79 ml de H_{2}O) en un tampón 1X TBE (Tris 0,089 M, ácido bórico 0,089 M, y EDTA 2 mM) y se sometieron a electroforesis durante 90 minutos a 200 voltios. El DNA se visualizó mediante fluorescencias UV, después de teñirlo con bromuro de etidio.
Los resultados mostraron que la presencia de cada una de las tres sondas a varias concentraciones no tenían efecto sobre la cantidad de producto amplificado que se generaba. Los carriles de muestras que no contenían sonda mostraron bandas de 350 pares de bases de una intensidad elevada separadas que correspondían a la secuencia deseada. Todos los carriles que contenían sonda mostraron lo mismo, además de unas cuantas bandas tenues a un peso molecular ligeramente más elevado. Los carriles de control sin molde añadido no mostraron ninguna banda a 350 bases, sólo mostraron bandas de intensidad más baja que representan al cebador en 30-40 bases.
Después de la fotografía el gel se trasladó a un papel Whatman, cubierto con Saran Wrap y se autorradiografiaron. Una exposición durante toda la noche reveló que el 90-95% del marcador radiactivo se encontraba cerca del fondo del gel, donde migraba la sonda o la sonda parcialmente degradada.
Para el análisis en gel desnaturalizante, se mezclaron 2 \mul de cada reacción de amplificación con 2 \mul de tampón de carga de formamida (EDTA 0,5 M 0,2 ml pH 8, azul de bromofenol 10 mg, xileno cianol 10 mg y formamida 10 ml), después se calentó a 96ºC durante 3-5 minutos y se colocaron en hielo. Las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante en gradiente al 6,2% (urea 7 M con gradiente de sacarosa y tampón) según el procedimiento de Sambrook et al., supra. El gel se sometió a electroforesis durante 90 minutos a 2000 V, 45 W y después se trasladó a un papel Whatman y se autorradiografió.
Los resultados del gel desnaturalizante indicaban que aproximadamente el 50% de cada sonda se degradaba en fragmentos marcados más pequeños. Aproximadamente el 50%-60% de los recuentos están en el rango de 30-40 bases, correspondientes a los fragmentos de sonda. Una banda muy tenue es visible a 300 bases para todas las reacciones de amplificación, lo que indica que un porcentaje muy reducido de las sondas han perdido o nunca han tenido un grupo 3'-PO_{4} y han sido sometidas a una extensión. El resto de los recuentos oscilan entre cero y quince bases. La resolución en dicho gel no muestra el tamaño exacto de los productos, que se puede determinar mejor mediante el análisis por homocromatografía.
Para un análisis de homocromatografía se coloca 1 \mul de cada muestra a 1,2 cm de distancia en una lámina de celulosa de capa fina Polygram CEL 300 DEAE de 20 x 20, que se había colocado anteriormente con 5 \mul de DNA de esperma de arenque (150 \mug/ml)y se había dejado secar. Después de que la muestra se secara la lámina se colocó en un recipiente con agua destilada y se permitió que el agua migrara justo por encima de la zona de carga de la muestra. Después la lámina se situó en una cubeta de revelado de vidrio con Homo-mix III (Jay et al., 1979, Nuc. Acid Res. 1(3):331-353) filtrado, una solución de RNA parcialmente hidrolizado que contiene 7 M de urea en un horno de 70ºC. Se permitió que el Homo-Mix migrara a través por capilaridad hasta la parte superior de la lámina, momento en el que se retiró la lámina, se secó, se cubrió con Saran Wrap y se autorradiografió.
La exposición durante toda la noche de la lámina de homocromatografía indicó también que el 40% de las sondas se degradaba en fragmentos más pequeños. Estos fragmentos tenían un tamaño muy específico, dependiendo de la longitud de la cola 5' no complementaria de cada sonda. En la Figura 1 se muestra una autorradiografía de las láminas de CCF (TLC, por sus siglas en inglés). La sonda BW31 (carriles 1-3) que era totalmente complementaria al molde M13mp10w generó fragmentos marcados, predominantemente de una a dos bases de longitud. La sonda BW33 (carriles 4-6) que contiene una región no complementaria de 3 bases en el extremo 5' liberó productos predominantemente de cuatro a seis bases de longitud. La BW35 (carriles 7-9) tenía una cola 5' de 10 bases no complementarias y liberó productos predominantemente de 12 a 13 bases de longitud. Los carriles 10-12 son reacciones de control que pueden contener BW31, BW33 o BW35 y todos los componentes de la PCR excepto el molde, después de 15 ciclos. Durante la síntesis de DNA, la enzima desplazó los primeros y segundos pares de bases que encontró y después lo escindió por este sitio, indicando una actividad parecida a la de la endonucleasa. Los resultados mostraron una liberación específica de la sonda coordinadamente con una acumulación de producto en la PCR.
Ejemplo 2 Especificidad de la liberación de la sonda marcada
La especificidad de la liberación de sonda marcada se comprobó mediante la realización de una amplificación por PCR usando el DNA del bacteriófago lambda y cebadores y una serie de sondas tratadas con quinasas y no complementarias.
La región que se amplificó era una región de 500 nucleótidos de DNA del bacteriófago lambda procedente del equipo de reactivos de amplificación de DNA GeneAmp® (Perkin-Elmer Cetus), flanqueado por los cebadores PCRO1 y PCRO2, procedentes también del equipo de DNA GeneAmp®.
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Las alícuotas de las tres mismas sondas marcadas BW31, BW33 y BW35 identificadas en el Ejemplo 1, se utilizaron siendo todas ellas totalmente no complementarias a la secuencia diana.
Para la amplificación de la región de 500 pares de bases, se añadieron 0,5 ng de secuencia de DNA diana lambda (molde control, Lo #3269, 1 \mug/ml, diluir 1:10 en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, y NaCl 10 mM para la solución madre) con un volumen de reacción de 50 \mul que contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM a pH 8,3, MgCl2 3 mM, cada uno de los cebadores PCRO1 (Lote #3355) yPCRO2 (Lote #3268) a 1 \muM, cada uno de los cuatro desoxinucleósidos trifosfato a 200 \muM, 1,25 unidades de DNA polimerasa Taq, y 2, 10 o 20 pmol de la sonda BW31, BW33 o BW35 diluidas isotópicamente. La cantidad de sonda marcada radiactivamente se mantuvo constante a 0,4 pmol en cada reacción y se diluyó hasta 1,10 o 20 pmol con sonda no radiactiva. Se añadió 4 \mul por reacción de DNA polimerasa Taq a una concentración de 0.3125 unidades/\mul y se diluyó en Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, KCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, NP40 0,5%, Tween 20 0,5%, y gelatina 500 \mug/ml.
La master mix de la reacción se preparó tal y como se ha descrito anteriormente junto con las reacciones de control sin la sonda o sin la enzima. Las mezclas de reacción se amplificaron siguiendo las condiciones de ciclado que se establecen más adelante en el Ejemplo 1B y se analizaron entonces del siguiente modo: para el análisis en gel de poliacrilamida se partió de 4 \mul de cada reacción de amplificación mezclados con 3 \mul del mix de carga 5X, se cargaron en un gel de acrilamida al 4% en un tampón 1X TBE y se realizó la electroforesis durante 90 minutos a 200 voltios. Tras la tinción con bromuro de etidio, se visualizó el DNA mediante fluorescencia UV.
Los resultados muestran que la presencia de cualquier sonda a cualquier concentración no ejerce ningún efecto sobre la cantidad de producto amplificado que se genera. Los carriles de muestra de control que no contienen ninguna sonda, y todos los carriles que contienen sonda, muestran una banda discreta de 500 pares de bases de elevada intensidad que corresponde a la secuencia deseada. Los carriles de controles a los que no se añadió enzima no mostraban ninguna banda de producto, sólo bandas de poca intensidad que representan al cebador y a la sonda de 30-40 nucleótidos aproximadamente.
El análisis homocromatográfico que se muestra en la Figura 2 muestra una exposición durante toda la noche de la lámina en la que no se observó degradación de las sondas. Todos los recuentos se establecieron en el punto de origen, mostrando que no se produce una liberación de los fragmentos marcados. Los carriles 1-3 pertenecen a reacciones que contienen la sonda BW31; los carriles 4-6 contienen la sonda BW33; los carriles 7-9 contienen la sonda BW35; y los carriles 10-12 pertenecen a reacciones de control sin molde. Los resultados muestran que la sonda no se degrada a menos que se encuentre unida específicamente a la diana y sea capaz de soportar las condiciones de ciclado de la PCR.
En el análisis en gel desnaturalizante, se mezclaron 2 \mul de cada reacción de amplificación con 2 \mul de tampón de carga de formamida (descrito en el Ejemplo 1) y se colocó en un bloque calefactor a una temperatura de 96ºC durante 3-5 min. Las muestras se colocaron inmediatamente en hielo y se cargaron en un gel de acrilamida desnaturalizante en gradiente al 6,2%, y se realizó una electroforesis durante 90 minutos a 2000 voltios. Después de la electroforesis, el gel se transfirió sobre papel Whatman, se cubrió con Saran Wrap, y se autorradiografió.
Una exposición durante toda la noche mostró que todos los recuentos se situaban dentro del intervalo de 30-40 pares de bases, lo que correspondía con los tamaños de las sondas. Una vez más, no se produjo una degradación de sonda evidente, confirmando así que la sonda debe estar unida específicamente al molde antes de que se produzca cualquier degradación.
Ejemplo 3 Especificidad de la liberación de la sonda marcada en presencia de DNA genómico
En este ejemplo, la especificidad de la liberación de la sonda marcada se determinó mediante una amplificación por PCR en presencia de ADN genómico humano degradado o no degradado.
La sonda BW33 tratada con quinasas utilizada en este experimento presentaba una actividad específica de 5,28 x 10^{6} cpm/pmol determinada mediante precipitación con TCA seguida de reacción con quinasas. La región amplificada era de 350 pares de bases del M13mp10w, flanqueada por los cebadores BW36 y BW42. Los listados de secuencias de los cebadores y sus localizaciones se encuentran el Ejemplo 1. El DNA genómico humano proviene de la línea celular HL60 y se utiliza sin degradar o degradado mediante lisis celular en una prensa francesa hasta un tamaño medio de 800 pares de bases.
Cada 50 \mul de reacción de amplificación consta de 10-2 o 10-3 pmol de la secuencia diana del M13mp10w, 1 \mug de DNA genómico HL60, degradado o no degradado, se añade a una mezcla que contiene KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 3 mM, 10 pmol de cada uno de los cebadores BW36 y BW42, cada uno de los cuatro desoxi-
rribonucleósidos trifosfato a 200 \muM, 1,25 unidades de DNA polimerasa Taq y de sonda BW33 isotópicamente diluida.
Se preparó una master mix de la reacción con cantidades apropiadas de tampón de reacción, nucleósidos trifosfato, cebadores, sondas y enzimas. Se tomaron alícuotas y se les añadió el molde o el DNA genómico del M13mp10w. Las reacciones de control se realizan con todos los componentes de reacción excepto el DNA diana del M13mp10w o con todos los componentes de reacción excepto el DNA genómico.
Cada mezcla de reacción se cubrió con 50 \mul de parafina, se microcentrifugó y se colocó en un termociclador. Las mezclas de reacción se sometieron al siguiente esquema de amplificación:
Durante 10, 15 o 20 ciclos:
desnaturalización a 96ºC, 1 min
\quad
60ºC hibridación/extensión, 1,5 min
Ciclo final:
desnaturalización a 96ºC, 1 min
\quad
60ºC hibridación/extensión, 5,5 min
Después de los ciclos, la parafina se extrajo utilizando 50 \mul de cloroformo y las muestras se almacenaron a 4ºC. Las muestras se analizaron posteriormente mediante una electroforesis en gel de acrilamida al 4% y un análisis homocromatográfico.
Para el análisis en gel de acrilamida, se mezclaron 4 \mul de cada mezcla de reacción con 3 \mul de mix de carga 5X en gel, cargado en un gel de acrilamida al 4% con un tampón 1X BE, y se realizó la electroforesis durante 90 minutos a 220 voltios. El DNA se visualizó mediante fluorescencia UV después de la tinción con bromuro de etidio.
En los carriles que corresponden a las muestras de control que no contienen DNA diana del M13mp10w, no se obtuvieron bandas visibles de productos, que indica la ausencia de cualquier contaminación cruzada del M13mp10w. Todos los carriles posteriores mostraron una banda a la altura de 350 bases que correspondía a la secuencia esperada. La intensidad de la banda era superior cuando se encontraban presentes 10^{-2} pmol del DNA diana del M13mp10w en comparación con 10^{-3} pmol en ausencia o presencia de DNA genómico (degradado o sin degradar). La intensidad de la banda del producto aumentó con el aumento del número de ciclos de amplificación. Veinte ciclos produjeron una banda del doble de intensidad que la que se observó a los diez ciclos y quince ciclos generaron una banda de intensidad intermedia.
La cantidad de producto de la PCR presente varía con la cantidad de molde diana inicial y con el número de ciclos, y la presencia de 1 \mug de DNA genómico humano, ya sea degradado o sin degradar, mostró no tener ningún efecto en la formación de este producto.
En el análisis homocromatográfico, se cargó un 1 \mul de cada mezcla de reacción sobre una capa fina de DEAE, y se colocaron en una cámara de revelado que contenía Homo-Mix III a 70ºC. Después de 90 minutos, se extrajo la lámina, se dejó secar, se cubrió con Saran Wrap y se autorradiografió. En la Figura 3 se muestra una exposición durante toda la noche; en la Figura 3A los carriles del 1 al 6 muestran ciclos de reacción de la PCR en ausencia del DNA molde del M13mp10w que contiene, alternativamente, DNA HL60 degradado y no degradado tras 10, 15, y 20 ciclos; y los carriles 7-12 corresponden a reacciones de control cargadas por duplicado que contienen DNA molde del M13mp10w sin DNA genómico humano tras 10, 15 o 20 ciclos. En la Figura 3B, las reacciones se amplificaron con incrementos de 5 ciclos empezando por 10 ciclos. La concentración del DNA molde del M13mp10w en las reacciones que se muestran en los carriles 1, 2, 5, 6, 9, y 10 es de 10^{-2} pmol, mientras que en los carriles 3, 4, 7, 8, 11, y 12 es de 10^{-3} pmol. Las reacciones que se muestran en los carriles impares del 1 hasta el 11 contienen DNA genómico humano degradado y los carriles pares contienen DNA genómico humano no degradado. Se observaron fragmentos de sonda marcados en forma de dos manchas bien definidas que migran a 4 y 5 bases de longitud aproximadamente en la capa fina. Al aumentar la concentración de molde inicial o al aumentar el número de ciclos, la cantidad de fragmentos de sonda marcada que se libera aumenta también. La presencia o ausencia de DNA genómico humano, degradado o no degradado, no interfirió o mejoró la hibridación de las sondas ni la degradación.
Los resultados muestran que la liberación aumentada de cantidades de pequeños fragmentos de sonda sucede de manera coordinada y simultánea a la acumulación de producto específico durante el transcurso de un proceso de PCR. La presencia o ausencia una cantidad elevada de DNA genómico humano de gran complejidad o bien una gran cantidad de "extremos" aleatorios no ejerce un efecto sobre la acumulación específica de producto o grado de liberación de la sonda. Finalmente, la presencia de una gran cantidad de DNA genómico humano de gran complejidad no da lugar a una liberación de sonda perceptible en ausencia de la acumulación de producto específica.
Ejemplo 4 PCR con sonda marcada en el extremo 3'
Se realizó una amplificación mediante PCR que liberó una sonda hibridada en 3' marcada radiactivamente dando lugar a fragmentos más pequeños al hibridar la sonda con el molde. Las secuencias de las sondas fueron las siguientes:
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A. Marcado de las sondas con ^{32}P-cordicepina y transferasa terminal
Se mezclaron 5 pmol de cada sonda (DG46, BW32, y BW34) de forma individual con 17,4 unidades de transferasa terminal (Stratagene) y 10 pmol de [a-^{32}P]-cordicepina (cordicepina: 3'-desoxiadenosina-5' trifosfato, New England Nuclear, 5000 Ci/mmol, 3X diluidos con ddATP [Pharmacia]) en un volumen de reacción de 17,5 \mul que contiene cacodilato potásico 100 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 7,6, CoCl_{2} 1 mM, y ditiotreitol 0,2 mM durante 60 minutos a 37ºC. Se realizaron extracciones con fenol/cloroformo del volumen total y se precipitó con etanol. Las sondas se resuspendieron en 50 \mul de tampón TE y se introdujeron en una columna de diálisis Sephadex G-50 spin según el procedimiento de Sambrook, et al., Molecular Cloning, supra. La concentración final de las sondas fue de 0,1 pmol/\mul. La precipitación con TCA de los productos de reacción indicaba las actividades específicas siguientes:
DG46: 2,13 x 10^{6} cpm/pmol
BW32: 1,78 x 10^{6} cpm/pmol
BW34: 5,02 x 10^{6} cpm/pmol
La comparación entre los análisis en gel desnaturalizante en gradiente de las sondas marcadas radiactivamente en 3' y las sondas tratadas con quinasas en 5' BW31, BW33 y BW35, mostraban que las sonda marcadas radiactivamente en 3' se desplazan de una forma similar a las sondas marcadas radiactivamente en 5'.
Una vez más, la región amplificada era la región de 350 bases en el M13mp10w definida por los cebadores BW36 y BW42. Las secuencias de los cebadores y su localización se encuentran listados en el Ejemplo 1. Cada mezcla de amplificación se preparó añadiendo 10^{-3} pmol del DNA diana del M13mp10w a un volumen de reacción de 50 \mul que contenía KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 3 mM, 10 pmol de cada cebador BW36 y BW42, cada uno de los cuatro desoxinucleósidos trifosfato a 200 \muM, 1,25 unidades de DNA polimerasa Taq y 2, 10, o 20 pmol de las sondas DG46, BW32, o BW34 isotópicamente diluidas.
Se preparó una master mix de reacción que contenía cantidades apropiadas de tampón de reacción, nucleósidos trifosfato, molde y una enzima. Se tomaron alícuotas y se les añadió la cantidad apropiada de cebadores y sondas. Las reacciones de control comprendían, o bien todos los componentes de reacción excepto los cebadores, o bien todos los componentes de reacción excepto la sonda.
Las mezclas de reacción se cubrieron con 50 \mul de parafina, se microcentrifugaron y se colocaron en un termociclador. El esquema de la amplificación se describe a continuación:
Quince ciclos:
96ºC desnaturalización, 1 min
\quad
60ºC hibridación/extensión, 1,5 min
Ciclo final:
96ºC desnaturalización, 1 min
\quad
60ºC hibridación/extensión, 5,5 min
Tras los ciclos, la parafina se extrajo utilizando 50 \mul de cloroformo y se almacenaron muestras a 4ºC.
Las muestras se analizaron en un gel de acrilamida al 4%, un gel de acrilamida desnaturalizante en gradiente al 8% y mediante homocromatografía. La manipulación de las mezclas de reacción en los tres análisis se realizó como se ha descrito anteriormente.
En el análisis en gel de acrilamida al 4%, se visualizó una banda marcada que correspondía al producto deseado a la altura de 350 bases en todas las mezclas de reacción excepto en las reacciones de control sin los cebadores. En todas las mezclas de reacción que contenían ambos cebadores y la sonda, se detectó una banda a la altura de las 300 bases aproximadamente. Esta segunda banda ganó intensidad al aumentar la concentración de sonda, y correspondía probablemente a una sonda que no se marcó radiactivamente de manera eficiente en el extremo 3'o bien había perdido el marcador en 3', permitiendo de este modo la extensión de la sonda y la generación de producto.
Una exposición durante toda la noche del gel de acrilamida desnaturalizante en gradiente al 8% mostraba una distribución en un rango de tamaños desde el tamaño de la sonda completa hasta menos de 15 bases con las tres sondas. Como era de esperar, la actividad nucleasa 5'-3' de la DNA polimerasa Taq degradó la sonda hasta tal punto que se disoció del molde.
La amplia distribución de tamaños de los productos es ilustrativa de las continuas variaciones en las concentraciones de reactantes y los cambios de temperatura que se producen durante el proceso de ciclado de la PCR. Tales variaciones llevarían a cambios en la cinética de hibridación de la sonda y la enzima, que permite que la sonda se disocie en una variedad de tamaños en diferentes tiempos durante el proceso de ciclado.
La lámina de homocromatografía reveló que el producto de menor tamaño de todas las sondas examinadas tenía una longitud de 10 a 12 bases. El resultado mostraba que para esta secuencia de la sonda en particular a una temperatura de hibridación/extensión de 60ºC la sonda se degradaba hasta un tamaño de 10 bases y entonces se disociaba del molde, ya que las tres sondas tenían una secuencia idéntica excepto en la región de la cola 5'.
Ejemplo 5 Polimerización independiente a la actividad nucleasa 5'-3' de la DNA polimerasa Taq
La DNA polimerasa Taq podía liberar el extremo 5' marcado con ^{32}P de una sonda hibridada cuando se coloca cerca de dicha sonda por un cebador en dirección 5'. Se diseñaron una serie de cebadores para que se colocaran entre la base 0 y la 20 en dirección 5' de una sonda hibridada BW33 tratada con quinasa. Dichos cebadores se muestran a continuación.
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Se hicieron hibridar alrededor de 0,5 pmol de la sonda BW33 y 0,5 pmol de uno de los cebadores con 0,5 pmol de M13mp10w en un volumen de reacción de 10,5 \mul que contenían KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, y MgCl_{2} 3 mM. Las mezclas de reacción usadas como control contenían 20 \muM o 200 \muM de cada uno de los cuatro desoxinucleósidos trifosfato. Se utilizó un cebador adicional, DG47, situado a 530 bases en dirección 5'.
1000
Las mezclas de reacción se calentaron a 98ºC durante un 1 min y se hibridaron a 60ºC durante 30 min. A continuación los tubos se microcentrifugaron y se colocaron en un baño húmedo a 70ºC. Tras un periodo de tiempo suficiente para que las mezclas de reacción alcanzaran la misma temperatura, se añadieron 10, 5, 2,5, 1,25 o 0,3125 unidades de DNA polimerasa Taq y se tomaron alícuotas de 4 \mul a los 2, 5 y 10 minutos. La enzima fue inactivada mediante la adición de 4 \mul de EDTA 10 mM a cada alícuota y colocándolas a 4ºC. Las mezclas de reacción se analizaron mediante homocromatografía.
En el análisis homocromatográfico, 1 \mul de cada una de las muestras se colocó en láminas finas de DEAE-celulosa y se colocaron en cámaras de revelado con Homo-Mix III a 70ºC. Se permitió que el Homo-Mix migrara hacia la parte superior de cada lámina, momento en el cual las láminas se retiraron, se secaron, se cubrieron con Saran Wrap y se autorradiografiaron. La Figura 4 muestra los resultados de este experimento.
En la Figura 4, los carriles del 1 al 3 contienen oligonucleótidos marcados radiactivamente como marcadores de tamaño molecular de 6, 8, 9, 10, 11, 12 y 13 nucleótidos. Los carriles del 4 al 10 muestran reacciones con cebadores BW37, BW38, BW39, BW40, BW41, BW42 y DG47, respectivamente, en ausencia de dNTP. Los carriles del 11 al 24 muestran reacciones de control para todos los cebadores en presencia de 20 o 200 mM de dNTP.
En ausencia de dNTP, la DNA polimerasa Taq generó fragmentos de sonda marcados utilizando todos los cebadores con una disminución considerable de liberación de marcador a medida que la distancia entre cebador y sonda se incrementaba. Este efecto se observó en todas las concentraciones enzimáticas analizadas (0,3125 U a 10 U/reacción) y a todos los tiempos. El tamaño de los fragmentos liberados era el mismo, de una longitud aproximada de dos o tres bases; sin embargo, las especies primarias variaron en función del cebador añadido. La mayor parte de las especies liberadas por los cebadores delta cero y delta dos eran una base más pequeña que las liberadas por los cebadores delta uno, cinco, diez y veinte. Esta actividad nucleasa era independiente de polimerización y dependiente de la distancia. En presencia de nucleótidos trifosfato, el tamaño de los fragmentos de sonda liberados y las proporciones relativas de cada uno eran idénticas para todos los cebadores analizados. Asimismo, el tamaño de los productos era una o dos bases mayor en presencia de dNTP. Puede ser que mientras la enzima se encuentra polimerizando, tenga un "inicio en funcionamiento" y cuando encuentra una sonda hibridada, se desplace simultáneamente una o dos bases y después corte, generando un fragmento más largo.
No se detectaron diferencias en la cantidad de producto liberado cuando la concentración de dNTP era de 20 o 200 \muM cada uno ni tampoco se observaron diferencias significativas debidas a los tiempos de extensión o a las concentraciones enzimáticas en presencia de dNTP.
Ejemplo 6 Ejemplo para ilustrar la naturaleza del producto liberado basado en la secuencia de la sonda en el extremo 5'
Se analizó el efecto del apareamiento entre bases débiles y fuertes en la región complementaria 5' de una sonda sobre el tamaño del producto liberado. Se diseñaron dos sondas, BW50 y BW51, que contenían una región comple-
mentaria en 5' rica en GC- o AT-. Se compararon BW50 y BW51 con la sonda BW33 utilizada en el ejemplo V.
106
Se marcaron BW50, BW51 y BW33 con ^{32}P-ATP utilizando un polinucleótido quinasa y presentaban las actividades específicas siguientes:
BW50: 1,70 x 10^{6} cpm/pmol
BW51: 2,22 x 10^{6} cpm/pmol
BW33: 1,44 x 10^{6} cpm/pmol
La concentración final de las tres sondas fue de 0,10 pmol/\mul.
De forma independiente, 0,5 pmol de cada una de las sondas BW50, BW51 o BW33 y del cebador BW42 se hibridaron con 0,5 pmol de M13mp10w en un volumen de reacción de 10,5 \mul que contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 3 mM y 200 \muM de cada uno de los cuatro desoxinucleósidos trifosfato. Las muestras de control contenían todos los componentes de la reacción excepto el molde. En la fase de hibridación, las mezclas de reacción se calentaron a 98ºC durante un 1 min y se hibridaron a 60ºC durante 30 min. A continuación los tubos se microcentrifugaron y se colocaron en un baño húmedo a 50, 60 o 70ºC. Tras un periodo de tiempo suficiente para que las mezclas de reacción alcanzaran la misma temperatura, se añadieron 0,3125 unidades de DNA polimerasa Taq. Se tomaron cuatro alícuotas de \mul a 1, 2 y 5 minutos. Las reacciones se pararon mediante la adición de 4 \mul de EDTA 10 mM a cada alícuota y colocándolas a 4ºC. Las muestras se analizaron mediante análisis por homocromatografía y los resultados se muestran en las Figuras 5 y 6. La Figura 5 muestra las reacciones que contienen la sonda BW50 rica en GC. Los carriles del 1 al 3 contienen oligonucleótidos marcadores del tamaño molecular de 6, 8, 9, 10, 11, 12 y 13 nucleótidos. Los carriles 4-6 muestran reacciones de extensión llevadas a cabo a 50ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Los carriles 7-9 son reacciones de extensión llevadas a cabo a 60ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Los carriles 10-12 muestran reacciones de extensión llevadas a cabo a 70ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Los carriles 13-15 muestran reacciones de control con todos los componentes excepto el molde, incubadas a 70ºC durante 1, 2 y 5 minutos.
La Figura 6 muestra las reacciones que contienen la sonda BW51 rica en AT. Como en la Figura 5, los carriles del 1 al 3 son oligonucleótidos marcadores del tamaño molecular de 6, 8, 9, 10, 11, 12 y 13 nucleótidos. Los carriles 4-6 muestran reacciones de extensión llevadas a cabo a 50ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Los carriles 7-9 muestran reacciones llevadas a cabo a 60ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Los carriles 10-12 son reacciones llevadas a cabo a 70ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Los carriles 13-15 son reacciones de control con todos los componentes excepto el molde, incubadas a 70ºC durante 1, 2 y 5 minutos.
Los resultados demuestran que la naturaleza de la liberación del marcador de la sonda era dependiente de la temperatura y de la composición de bases en el extremo 5'. La sonda BW50 rica en GC que resulta más estable mostró poca liberación de marcador a 50ºC (Figura 5, carriles 4-6) y cada vez más a 60ºC (Figura 5, carriles 7-9) y 70ºC (Figura 5, carriles 10-12). La mayoría de los productos liberados tenían una longitud aproximada de 3-5 bases. La BW51, que era rica en AT en el extremo 5', mostró la misma liberación de marcador a 50ºC (Figura 6, carriles 4-6) que se observó a las temperaturas más altas. Además, la sonda rica en AT generó productos de mayor longitud que la sonda rica en GC. La composición de bases de la sonda rica en AT puede ofrecer una mayor "laxitud" que permita un mayor desplazamiento de la sonda antes del corte y a temperaturas más bajas que la sonda rica en GC.
Ejemplo 7 Ensayo de captura del VIH
A continuación se describe un ejemplo de utilización de una sonda doblemente marcada que contiene biotina en una PCR para detectar la presencia de la secuencia diana. Se sintetizaron dos oligonucleótidos, BW73 y BW74, cada uno complementario a una región del genoma del VIH, con una molécula de biotina unida al extremo 3' del oligonucleótido. Además, el extremo 5' de cada oligonucleótido se marcó con ^{32}P utilizando polinucleótido quinasa y gamma-^{32}P-ATP. Los dos oligonucleótidos PH7 y PH8 son también complementarios al genoma del VIH, flanquean la región homóloga a las dos sondas oligonucleotídicas y pueden utilizarse como cebadores de una PCR que forma un producto de 142 bases. Las secuencias de esos oligonucleótidos se muestran a continuación.
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En las secuencias, "Y" es una molécula de biotina, y las letras minúsculas indican bases que no son complementarias a la hebra molde.
Se realizaron una serie de reacciones en cadena de la polimerasa de 50 \mul que contenían BW73 o BW74, cada uno doblemente marcado, como sonda oligonucleotídica a 2 nM. Además, se añadió un molde de VIH en forma de clon plasmídico a razón de 10^{2} o 10^{3} copias por reacción y las sondas oligonucleotídicas PH7 y PH8 se añadieron cada uno a una concentración de 0,4 \muM. Se añadió Taq polimerasa a 1,25 U por reacción y dNTP a una concentración de 200 \muM cada uno. Cada una de las reacciones se cubrió con 50 \mul de aceite, se centrifugaron brevemente en una microcentrífuga para recoger todo el líquido del fondo del tubo. A continuación, se sometieron a ciclos térmicos entre 95ºC y 60ºC, con una pausa de 60 segundos a cada temperatura, durante 30, 35 o 40 ciclos. Al finalizar los ciclos térmicos, se realizaron extracciones de cada reacción con 50 \mul de CHCl_{3} y se recogieron las fases acuosas.
Se analizó la amplificación de cada reacción cargando 3 \mul en un gel de electroforesis al 5% de acrilamida y se analizó la presencia del producto de 142 pares de bases esperado. Además, se analizó 1 \mul de cada reacción mediante homocromatografía TLC en láminas de DEAE-celulosa. Finalmente, cada reacción fue posteriormente analizada poniendo en contacto el volumen restante con 25 \mul de una suspensión a 10 mg/ml de microesferas de poliestireno superparamagnéticas DYNABEADS M-280 marcadas con estreptavidina. Tras reaccionar con las microesferas, la mezcla se separó mediante filtración con un filtro para centrífuga Costar Spin X, se recogió el filtrado y se analizó la presencia de marcador radiactivo.
En la Figura 7 se muestran imágenes de los dos geles utilizados y se observa que el producto de 142 pares de bases aparece en todas las reacciones, con sonda o sin ella, e incrementa su cantidad cuando el molde inicial pasa de 10^{2} a 10^{3} copias y cuando los ciclos térmicos pasan de 30 a 35 o 40.
La figura 8 es una composición de dos autorradiografías del análisis por TLC de alícuotas de las reacciones de PCR y muestran que se produce la liberación de sonda radiactiva y aumenta en cantidad con el aumento del molde inicial y con un mayor número de ciclos térmicos. En las primeras TLC de PCR utilizando BW73, los carriles 1 y 3 contienen oligonucleótidos marcados radiactivamente de 2 o 3 bases de longitud como referencia de tamaño. Los carriles 4, 5 y 6 contienen muestras de PCR con 10^{2} copias iniciales de molde y los carriles 7, 8 y 9 con 10^{3} copias iniciales. Las muestras de los carriles 4 y 7 fueron sometidas a 30 ciclos térmicos, los carriles 5 y 8 a 35 ciclos y los carriles 6 y 9 a 40 ciclos. En la segunda TLC de PCR utilizando BW74, los carriles 1 y 2 corresponden a los dímeros y trímeros marcados radiactivamente; los carriles 4, 5 y 6 contienen muestras de PCR con 10^{2} copias iniciales de molde sometidas a 30, 35 y 40 ciclos térmicos, respectivamente; y los carriles 7, 8 y 9 con 10^{3} copias de molde inicial sometidas a 30, 35 y 40 ciclos térmicos, respectivamente. El tamaño del marcador liberado es más pequeño con BW73 que no posee bases no complementarias en 5' y más grande con BW74 que presenta una extensión no complementaria de tres bases en 5'. Además, cada cromatograma se analizó mediante visualización bidimensional de radioisótopos utilizando un contador Ambis. Los resultados del recuento con Ambis y de la captación de microesferas se muestran en la Tabla 1. La buena concordancia entre ambos métodos para medir la liberación de marcador demuestra la utilidad de utilizar sondas marcadas y biotinadas y microesferas con avidina en PCR para determinar la formación de producto.
TABLA 1
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Ejemplo 8 Metodología del extractante en fase sólida y marcado de sondas
En un modo de realización de la presente invención, se utiliza una fase de separación después de la escisión de la sonda, pero antes de la determinación de la cantidad de sonda escindida, para separar los productos de la sonda escindida de la que no está escindida. Se prefieren dos métodos alternativos: (1) la utilización de partículas magnéticas unidas a avidina o estrepatividina que unan sondas marcadas con biotina en el extremo 3' y con un fluoróforo en el extremo 5'; las partículas magnéticas se unen tanto a la sonda no escindida como al fragmento 3' que el producto de escisión de la sonda; y (2) la utilización de partículas de intercambio iónico que unan oligonucleótidos pero no mono- o dinucleótidos que generalmente están marcados en el extremo 5' con un fluoróforo o ^{32}P. A continuación se discuten diversos aspectos de esas estrategias alternativas.
A. Partículas magnéticas unidas a avidina
El sistema de separación que implica sondas biotinadas en 3' y microesferas magnéticas unidas a avidina (o estreptavidina) se lleva a cabo preferiblemente con microesferas como DYNABEADS^{TM} de Dynal. Esas microesferas presentan una capacidad de unión a biotina de aproximadamente 100 pmoles por cada 50 \mul de microesferas. En primer
lugar, se minimiza la adsorción inespecífica tratando las microesferas con solución Denhardt's y transportador de DNA.
La sonda para métodos de separación de estreptavidina-biotina necesita un dominio biotina en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5'. La biotina del extreme 3' actúa como ligando de separación para microesferas unidas a estreptavidina (o avidina) y como bloqueo para prevenir la extensión de la sonda durante la amplificación. Las modificaciones postsíntesis se pueden simplificar extendiendo cada extremo de la sonda con un nucleófilo diferente; por ejemplo, se puede añadir una amina en el extremo 3' para la adición de biotina y un tiol bloqueado en el extremo 5' para la adición posterior de un fluoróforo. Las sondas biotinadas en 3' se pueden preparar de distintas maneras, algunos de esos posibles métodos se comentan a continuación.
Se puede añadir un derivado éster NHS-activo de biotina al extremo amino-3' de la sonda mediante el mecanismo de reacción mostrado en la Figura 9. El enlace resultante crea un gamma hidroxilo secundario en el carbonilo de la amida que puede resultar inestable durante los ciclos térmicos que se suceden en una PCR típica. Por ejemplo, 40 ciclos térmicos pueden provocar la pérdida de capacidad de unión a las partículas magnéticas unidas a avidina a un 6% de la sonda inicial añadida. Cuando el enlace entre la sonda y la biotina unida se rompe como resultado de los ciclos térmicos, la sonda ya no puede ser separada de los productos escindidos y contribuye a generar ruido de fondo. Aunque es posible evitar este problema uniendo más de una biotina a la sonda, existen diversos métodos de unión de biotina a oligonucleótidos que pueden dar lugar a productos más estables.
Una posibilidad es hacer reaccionar la biotina hidrazida con aldehídos generados de una ribosa-3' de la sonda para generar oligonucleótidos biotinados. En esta estrategia, los nucleótidos-3' de la sonda contienen una ribosa en lugar de una desoxirribosa. Durante la síntesis, la ribosa-3' se une a un soporte sólido, ya sea mediante 2'-OH o 3'-OH. Tras la síntesis, el oligonucleótido completo se libera del soporte sólido y los dioles cercanos a la ribosa se oxidan con peryodato de sodio (NaIO_{4}) a aldehídos que a continuación se hacen reaccionar con la biotina hidrazida, tal como se muestra en la Figura 10 y el producto es reducido con borohidruro sódico (NaBH_{4}). No obstante, la sonda biotinada resultante no se une de forma eficiente a las partículas magnéticas unidas a avidina. La utilización de hidrazida biotina de cadena larga, un compuesto que también se muestra en la Figura 10, puede resolver este problema.
Se puede unir la biotina a la sonda durante la síntesis de la sonda utilizando biotina fosforamidita, como se muestra en la Figura 11. La síntesis empieza con una base unida a vidrio de poro controlado (VPC) que finalmente se descarta. Se añade una fosforamidita que permite provocar la desprotección de un fosfato-3' de un hidróxido amónico del oligonucleótido sintético. A continuación, se añade la biotina fosforamidita y el oligonucleótido sintetizado aparece como se muestra en la Figura 11, que muestra también el producto final. Este método de unión permite la utilización de oligonucleótidos con extremos amina-5' para unir un fluoróforo. La utilización de amina-3' para unir biotina limita la química de unión del fluoróforo a tioles-5'. La utilización de una biotina fosforamidita en la que un nitrógeno de la biotina está bloqueado puede mejorar la síntesis de sondas marcadas con biotina.
Asimismo, se puede utilizar un reactivo comercial que consta de una biotina unida directamente a un vidrio poroso. El reactivo es el sustrato de inicio para la síntesis de sonda y se muestra en la Figura 12. Este método de unión permite la utilización de oligonucleótidos con extremos amina-5' para unir un fluoróforo. La utilización de amina-3' para unir biotina limita la química de unión del fluoróforo a tioles-5'. También están disponibles los métodos enzimáticos de unión de nucleótidos modificados a los extremos 5' de oligonucleótidos, aunque limitados en su aplicación y viabilidad.
B. Matrices magnéticas de intercambio iónico
Se pueden utilizar partículas de matrices comerciales de polietilenimina (PEI) (polímeros basados en celulosa, sílice o poliol) para separar la sonda escindida de la no escindida. Por ejemplo, Hydrophase PEI, Selectacel^{TM} PEI, PEI Bakerbond^{TM} y Amicon PAE 300, 1000 y 1000L son todas matrices de PEI disponibles comercialmente que permiten separar la sonda escindida de la no escindida.
Las partículas magnéticas de celulosa activada disponibles en el mercado como las partículas Cortex MagaCell^{TM}, se pueden derivatizar con PEI de diversa longitud, como PEI 600, PEI 1800 y PEI 10 000 y con diferentes relaciones molares de PEI por gramo de matriz. No obstante, los oligonucleótidos y los oligonucleótidos marcados con cumarina de cualquier tamaño se unen a celulosa magnética y a microesferas de agarosa tanto si han sido derivatizadas con PEI o no (la especificidad observada con oligonucleótidos en matrices comerciales de PEI se pierde cuando los oligonucleótidos se marcan con cumarina). La adición de elevadas concentraciones de sal (NaCl 2,0 M) o N-metil pirrolidona (10 a 20%) incrementa parcialmente la especificidad y también pueden utilizarse otros cosolventes como el SDS, el Brij 35, la guanidina y la urea para incrementar la especificidad de unión. No obstante, una concentración de urea de 8 M proporciona un bloqueo eficaz de la unión inespecífica entre los dinucleótidos y trinucleótidos marcados con cumarina a las partículas derivatizadas con PEI Bakerbond^{TM} o Cortex^{TM} PEI magnético, aunque se prefiere la utilización de ureas N-sustituidas.
Como se ha comentado anteriormente, Cortex Biochem vende una serie de partículas magnéticas cubiertas de celulosa activa que pueden unirse a PEI. La más práctica de todas es la matriz activada con peryodato. Sin embargo, el protocolo recomendado por el fabricante para unir aminas a la matriz activada con peryodato presenta los siguientes problemas: la reacción de una amina con un aldehído produce iminas que son lábiles y pueden hidrolizarse o reaccionar posteriormente con aminas; durante la fase para bloquear los aldehídos restantes mediante la adición de un exceso de etanolamina, el PEI puede ser desplazado por etanolamina eliminando, de esa forma, el PEI de la matriz; durante la reacción de conjugación en condiciones básicas, la condensación de aldol puede provocar la reacción entre los grupos aldehído resultando, de ese modo, en la agregación de partículas; y la reacción de aldehídos en condiciones básicas puede producir radicales libres que pueden atacar a la celulosa y participen en distintas reacciones. Para estabilizar la imina, se puede incluir una etapa de reducción (con NaBH_{4} y NBH_{3}CN); sin embargo, esta fase puede provocar la aparición de gas, un descenso de la masa de partículas y la aglutinación de partículas. Estos efectos no deseados pueden provocar la producción de radicales libres. Las complicaciones provocadas por la conjugación de aldehídos activos pueden evitarse basándose en la química de los epóxidos. Las beta-hidroxiaminas resultantes son estables y no es necesaria su reducción. Además, dado que el oxígeno puede participar en la generación de radicales libres, la eliminación del oxígeno del sistema debe minimizar la formación de radicales libres, especialmente durante la fase de reducción. En la síntesis de partículas magnéticas cubiertas de celulosa derivatizada con PEI, se eliminó la fase de bloqueo de la etanolamina y la preparación purgada durante toda la noche con helio antes de la reducción con cianoborohidruro sódico o durante la misma. Se produjo muy poca agregación durante la preparación final.
Las partículas magnéticas de poliacroleína se pueden derivatizar tanto con PEI600 como con etilendiamina, y se puede inhibir la unión inespecífica de dinucleótidos y trinucleótidos marcados con cumarina con elevadas concentraciones de NMP. La utilización de polímeros de PEI con cadenas de mayor longitud puede enmascarar una interacción inespecífica del esqueleto con pequeños oligonucleótidos marcados con cumarina. Un factor importante a la hora de seleccionar una matriz magnética para su utilización en el presente método es la cantidad de fluorescencia de fondo aportada por la matriz. Una estrategia para minimizar la fluorescencia de fondo es seleccionar fluoróforos con máximos de excitación y emisión que solapen mínimamente los espectros de la fluorescencia de fondo del tampón, la matriz y las muestras clínicas. Asimismo, la fluorescencia de fondo puede aparecer como resultado de la presencia de contaminantes en la matriz que pueden ser eliminados mediante un pretratamiento exhaustivo antes de la unión.
C. Química de la unión del fluoróforo a la sonda
Como se ha comentado anteriormente, la sonda de elección, independientemente de la estrategia de separación, es un fluoróforo. Parece existir una interacción entre las sondas oligonucleotídicas y el fluoróforo unido. Esta interacción puede ser la responsable de la extinción observada en los fluoróforos unidos a oligonucleótidos. Se deben seleccionar fluoróforos que interaccionen mínimamente con el DNA cuando se unen al extremo 5' de un ácido nucleico.
Son fluoróforos de elección los tres siguientes: cumarina 7-dietilamino-3-(4'-maleimidilfenil)-4-metilo (CPM), fluoresceína 6-(bromometilo) (BMF), amarillo de Lucifer yodoacetamida (LYIA) y éster de 5-(y 6-)carboxi-X-rodamina succinimidilo, con CPM preferiblemente debido a distintas propiedades: un coeficiente de extinción grande, un rendimiento cuántico grande, poco blanqueo y un desplazamiento de Stokes grande. El fluoróforo puede unirse a través de un tiol unido al grupo 5'-fosfato de la sonda, pero en el caso de CPM, este proceso produce una maleimida arilo que puede resultar inestable durante los ciclos térmicos.
Se encuentran disponibles en el mercado una serie de instrumentos para el análisis de materiales marcados con fluorescencia. Por ejemplo, el ABI Gene Analyzer se puede utilizar para analizar cantidades del orden de attomoles de DNA marcado con fluoróforos como el ROX (6-carboxi-X-rodamina), rodamina-NHS, TAMRA (5/6-carboxitetrametil rodamina NHS) y FAM (5'-carboxifluoresceína NHS). Estos compuestos se encuentran unidos a la sonda por un enlace amida con un grupo 5'-alquilamina de la sonda. Entre otros fluoróforos útiles se incluyen el CNHS (ácido 7-amino-4-metil-cumarina-3 acético, éster de succinimidilo) que también se puede unir a través de un enlace amida.
Durante el proceso de marcado pueden ser necesarias modificaciones para alcanzar la unión eficiente de un fluoróforo concreto a una sonda oligonucleotídica particular. Por ejemplo, la reacción inicial entre una sonda acabada en amina-5' y el éster NHS 7-dietilaminocumarina-3-carboxilato resultó muy poco eficiente. La sonda, que había sido fosforilada en el extremo 3' para evitar la extensión de la sonda durante la amplificación, presentaba una estructura secundaria significativa, una de dichas conformaciones sitúa el grupo 5'-amina y el 3'-fosfato lo suficientemente cerca como para formar un puente salino Esta estructura puede haber evitado que el grupo 5'-amina estuviese disponible para reaccionar con el éster NHS provocando de esa manera el bajo rendimiento del producto. La adición de un 25% de N-metilpirrolidinona (NMP) mejoró considerablemente la eficiencia de la reacción.
También se puede utilizar tanto un fluoróforo como un agente de extinción para marcar la sonda. Cuando la sonda está intacta, la fluorescencia del fluoróforo se extingue por el agente de extinción. Durante el presente método, la sonda se escinde entre el fluoróforo y el agente de extinción, permitiendo la emisión completa de la fluorescencia del fluoróforo. La extinción implica la transferencia de energía entre el fluoróforo y el agente de extinción, el espectro de emisión del fluoróforo y el espectro de absorción del agente de extinción debe solaparse. Una combinación de elección para este aspecto de la invención es el fluoróforo rodamina 590 y el agente de extinción cristal violeta.
Una de dichas sondas se muestra en la Figura 13. La síntesis de este constructo requiere la unión de un derivado de la rodamina a través de un tiol-5' y la unión de cristal violeta a través de una amina que se encuentra en una timidina a dos bases de distancia. La separación de los dos dominios por dos enlaces fosfodiéster incrementa las posibilidades de que la DNA polimerasa corte entre ellos.
Los intentos iniciales de unir el cristal violeta haciendo reaccionar una lactona con una amina fueron infructuosos. Se modificó el cristal violeta para generar una acil azida active que se muestra en la Figura 14. Esta forma de cristal violeta se hizo reaccionar con un DNA modificado con amina y el producto deseado fue purificado por HPLC de fase inversa.
Los intentos de hacer reaccionar el grupo rodamina-X-maleimida con el 5'-tiol fueron infructuosos. Ocurrió lo mismo cuando se hizo reaccionar la rodamina-X-maleimida antes de añadir el cristal violeta. Esto puede deberse a que el 5-tiol desbloqueado reacciona con el doble enlace de acrilamida en el brazo espaciador de timidina (véase la Figura 13). En la Figura 15 se muestra un método alternativo para añadir una amina a la timidina.
Este ejemplo supone una guía general para unir biotina al extremo 3' de una sonda oligonucleotídica y un fluoróforo al extremo 5' de una sonda oligonucleotídica. Los expertos en la materia conocen una serie de métodos para realizar ese tipo de unión y saben que la presente invención no está limitada al método elegido para marcar la sonda.
Ejemplo 9 Protocolo para PCR mediadas con AmpliWax^{TM} con UNG y dUTP
Se puede mejorar la especificidad de la amplificación durante el proceso de PCR mediante los procesos y reactivos descritos en detalle en la solicitud de patente internacional PCT con número de serie 91/01039, presentada el 15 de febrero de 1991; la solicitud de patente estadounidense con número de serie 481 501, presentada el 16 de febrero de 1991; la solicitud de patente PCT con número de serie PCT/US 91/05210, presentada el 23 de julio de 1991; la solicitud de patente estadounidense con número de serie 609 157, presentada el 2 de noviembre de 1990; y la solicitud de patente estadounidense con número de serie 557 517, presentada el 24 de julio de 1990. Los descubrimientos descritos en estas solicitudes de patente se incorporan como referencia y el protocolo a seguir demuestra como estos métodos para PCR mejorados pueden utilizarse junto con el presente método para obtener mejores resultados. Todos los reactivos pueden obtenerse de Perkin-Elmer Cetus Instruments (PECI, Norwarlk, CT). Este protocolo implica fundamentalmente tres componentes: Tubos MicroAmp^{TM} que contienen dNTP, cebadores, magnesio y Tris que han sido cubiertos con cera; Premix B a la que se le añade DNA polimerasa AmpliTaq® y UNG (y que por tanto se denomina Mezcla Enzimática); Premix C a la que se le añade la muestra y la sonda. Se preparan la Mezcla Enzimática y la muestra con sonda y se añaden por encima de la capa de cera. A continuación se colocan en un termociclador TC9600 y se someten a los ciclos térmicos. El protocolo que se muestra más abajo asume que la mezcla de reacción tiene un volumen de 50 \mul con muestras que no superen los 27 \mul. La diana es el VIH.
Los reactivos se facilitan tal como se describe a continuación. Se preparan tubos MicroAmp^{TM} que contienen 12,5 de Premix A y un pellet de 12 mg de AmpliWax^{TM} para PCR por tubo. La Premix A contiene el cebador SK145 1 \muM y el cebador SK431 1 \muM (ninguno de los cebadores se encuentra biotinado), dATP 800 \muM, dGTP 800 \muM, dCTP 800 \muM, dUTP 800 \muM, MgCl_{2} y Tris-HCl 10 mM, pH 8,3. El pellet de AmpliWax^{TM} consta de parafina con un punto de fusión a 55ºC (Aldrich Chemical Co.) que contiene Tween 65 0,15%, y el pellet de cera y la capa inferior de Premix A se añaden a la vez en una habitación libre de DNA. A continuación el pellet se funde para formar una barrera de vapor en la superficie. Esta barrera mantendrá su integridad cuando los tubos sean almacenados entre 4 y 25ºC y los reactivos de PCR colocados por debajo de la barrera sean estables durante meses a 4ºC para su almacenamiento. No se produce la mezcla de los materiales añadidos por encima de la barrera hasta que la cera se funda durante las fases iniciales de los ciclos térmicos. Los tubos utilizados como control son idénticos, pero no contienen cebador.
El tampón Premix B contiene Tris-HCl 10 mM a pH 8,3 y KCl 50 mM y se utiliza para diluir los enzimas DNA polimerasa AmpliTaq® y UNG. Se utilizan alrededor de 2,6 \mul de tampón Premix B por reacción. El tampón Premix C se prepara a una concentración 10x, que contiene Tris-HCl 105 mM, pH 8,3, y KCl 715 mM y se añade a la muestra de DNA a ensayar de modo que las concentraciones finales de Tris y KCl en la reacción final son de 10 mM y 50 mM, respectivamente. También se añade la sonda a esta capa, así como DNA transportador, si fuese necesario. Si se trabaja con controles plasmídicos, generalmente se añade por reacción 1 \mug de DNA humano de placenta (1 \mug/\mul en Tris 10 mM, EDTA 1 mM y NaCl 10 mM, que ha sido digerido, extraído en fenol/cloroformo y precipitado con etanol), como DNA transportador. Se añaden alrededor de 3,3 \mul de solución madre 10x del tampón Premix C por reacción.
Se prepara una solución madre de 5 \muM de la sonda y se le designa LG101C. La sonda LG101C tiene un grupo fosfato-3' para impedir la extensión de la sonda y un 7-dietilaminocumarina-3-carboxilato unido a un grupo alifático amino-5' o al oligonucleótido a través de un enlace amida. La secuencia de nucleótidos de la sonda se muestra a continuación:
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Esta sonda debe almacenarse a -20ºC y en oscuridad.
La DNA polimerasa AmpliTaq® se suministra a una concentración de solución madre de 5 U/\mul de PECI y UNG se suministra a una concentración de solución madre de 1 U/\mul del mismo distribuidor. También se pueden correr muestras de calibración plasmídicas y con ese objetivo es de utilidad la preparación de diluciones madre de 300, 1000, 3000, 10 000, 30 000, 100 000 y 1 000 000 (copias/ml) con el DNA Control Positivo de GeneAmplimer^{TM}. Ese DNA consiste en el genoma HIVZ6 reorganizado de manera que la región Pol está interrumpida y, por tanto, con la capacidad infectiva bloqueada, insertado en el plásmido pBR322.
Cada reacción final consta de 12,5 \mul de Premix A, 2,6 \mul de Premix B, 3,3 \mul de Premix C, 2 \mul de sonda LG101C, 27 \mul de la muestra, 0,4 \mul de DNA polimerasa AmpliTaq® y 2 \mul de UNG para alcanzar un volumen final de 49,8 \mul. Esta mezcla consta de 250 nM de cada cebador, 200 \muM de cada dNTP, MgCl_{2} 3,75 mM, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM a pH 8,3, 200 nM de la sonda, 2 unidades de UNG y 2 unidades de polimerasa.
Para correr la reacción, primero se prepara la Mezcla Enzimática en una habitación o cabina libre de DNA mezclando 2,6 \mul de tampón Premix B, 0,4 \mul de DNA polimerasa AmpliTaq® y 2 \mul de UNG por reacción. Cada 16 reacciones que deban realizarse, se debe preparar suficiente Mezcla Enzimática para 18 reacciones para garantizar que habrá suficiente material. A continuación la Mezcla Enzimática se añade a cada tubo MicroAmp^{TM} que contiene Premix A cubierto con cera por encima de la capa de cera en una habitación o cabina libre de DNA. Es suficiente con una única punta muestreadora para todas las transferencias y se añaden a cada tubo 5 \mul de la Mezcla Enzimática.
En la zona de preparación de muestras, la Mezcla Enzimática se prepara mezclando, por cada reacción, 3,3 \mul de tampón Premix C 10x, 27 \mul de muestra (en el caso de los controles de cuantificación, se añaden 10 \mul de la dilución madre y 17 \mul de agua) y 2 \mul de sonda (el DNA transportador, si se utiliza, se mezcla con la muestra). Entonces, utilizando una punta distinta para cada transferencia, se añaden 32,3 \mul de Mezcla de Muestra en cada tubo, el desequilibrio entre la Mezcla Enzimática y la Mezcla de Muestra garantiza un mezclado completo. Además, se deben preparar dos tubos de control a los que no se añaden cebadores para medir la escisión de sonda que se produce durante los ciclos térmicos. Este control contiene normalmente 1000 copias del molde de control. Asimismo, se debe preparar una serie de diluciones de plásmido para calibrar el ensayo. Dicha calibración se encuentra normalmente dentro del intervalo de las 3 a las 10 000 copias de la diana VIH por muestra. Tras completar los pasos anteriores, los tubos se tapan y se colocan en una bandeja del TC9600.
El perfil de ciclos térmicos es el siguiente: 1 ciclo de 50ºC durante 2 minutos, 5 ciclos a 95ºC durante 10 segundos, 10 segundos a 55ºC y 10 segundos a 72ºC; y 35 ciclos de 90ºC durante 10 segundos, 10 segundos a 60ºC y 10 segundos a 72ºC. Al finalizar los ciclos térmicos, los tubos se retiran del TC9600 y se almacenan a -20ºC si fuese necesario. No se recomienda mantener las muestras durante un tiempo prolongado por encima de los 70ºC y no se debe utilizar la desnaturalización alcalina.
Son útiles una serie de controles incluyendo un control sin molde para determinar la contaminación de las mezclas de reacción, así como la amplificación de productos inespecíficos que pueden dar lugar a la escisión de la sonda y generar señales inespecíficas; un control sin cebadores para comprobar la cantidad de no amplificación relacionada con la escisión de la sonda que puede contribuir al ruido de fondo (también se pueden incluir algunas muestras clínicas en las pruebas para detectar la presencia de componentes que puedan provocar la escisión de la sonda); y controles de cuantificación.
Para recoger los productos de PCR que se encuentran por debajo de la capa de cera formados tras la amplificación realizada según el protocolo descrito anteriormente, se puede tomar la muestra tras introducir una punta por el centro de la capa de cera, introduciendo la punta lentamente aplicando una presión ligera para minimizar la posibilidad que la punta pierda parte de la mezcla de reacción y contamine el laboratorio. Se consigue un mayor control estabilizando la punta con un dedo de la mano que sujeta el tubo de reacción. Las puntas delgadas ("Slim") que se utilizan para cargar los geles penetran especialmente bien en la capa de cera. Es mejor introducir la punta con cierta inclinación que introducirla de forma perpendicular para garantizar que la punta no quede atascada con cera. Si la punta toma un trozo de cera, normalmente esa cera se puede extraer friccionando suavemente contra la cera restante.
Los tubos de reacción también se pueden congelar (p. ej., en hielo seco-etanol o durante toda la noche en un congelador), descongelarlos y centrifugarlos brevemente en una microcentrífuga (rotor fijo). La capa de cera se romperá burdamente permitiendo la inserción de la punta sin posibilidad de que se tapone. Los fragmentos de cera de la punta pueden limpiarse contra la pared interna del tubo. Este método es especialmente adecuado para las pipetas de descarga positiva que normalmente utilizan puntas tan gruesas que hace difícil la penetración directa de la capa de cera intacta. Cualquiera de los métodos mencionados anteriormente deben impedir que quede cera en la muestra tomada de manera que la realización de extracciones con cloroformo resulta innecesaria.
Aunque la invención precedente ha sido descrita con cierto detalle a efectos ilustrativos, es obvio que los expertos en la materia pueden realizar cambios y modificaciones dentro del ámbito de las reivindicaciones anexas.
Ejemplo 10 Extracción en fase sólida con matriz de PEI Bakerbond^{TM}
Este ejemplo proporciona un ejemplo para muestrear una mezcla de PCR en la que la amplificación se realizó en presencia de una sonda marcada con fluorescencia (o un derivado de la cumarina) según el método de la presente invención.
La preparación de determinadas soluciones madre facilita la realización de este protocolo. Uno de esos reactivos consiste en tubos Eppendorf que contienen 50 mg de matriz de PEI Bakerbond^{TM} prelavada. La matriz de PEI Bakerbond^{TM} se puede obtener de J.T. Baker (producto n.º 7264-00) y está formada por sílice con un tamaño de partícula de 40 \mum y un tamaño de poro de 275 angstrom. La matriz se prepara lavándola en primer lugar con agua, después con etanol, a continuación con una mezcla de Tris 10 mM a pH 8,3, KCl 50 mM, EDTA 1 mM, NaCl 2 M y urea 8 M, y entonces se equilibra con Tris 10 mM a pH 8,3, KCl 50 mM, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM y urea 8 M. Tras la distribución, se añaden 15 \mul de agua a cada tubo para mantener la matriz hidratada. Los tubos deben guardarse a 4ºC.
El tampón de unión también se puede preparar en forma de solución madre y la composición es: Tris 10 mM a pH 8, NaCl 500 mM, KCl 50 mM, EDTA 1 mM y urea 8 M. El tampón de unión debe guardarse a 4ºC, aunque la urea puede precipitar a esa temperatura. El tampón de unión se puede calentar brevemente antes de su utilización para resuspender la urea.
Ciertos equipamientos pueden ser útiles para llevar a cabo este protocolo. Durante la fase de unión, los tubos se deben mezclar para mantener la matriz en suspensión y con esa finalidad puede resultar útil la utilización de una agitadora Vortex Genie 2 (disponible en Fischer Scientific, Cat. N.º 12-812, con una plataforma de 60 microtubos, Cat. N.º 12-812-B). Además, también son útiles para llevar a cabo este protocolo: una centrífuga de tubos Eppendorf, un espectrofluorímetro Hitachi modelo 2000 y cubetas de cuarzo de microfluorímetro con ancho interno de 2 mm y una longitud de la trayectoria de base de 2,5 mm (disponibles en Starna Cells, Inc., N.º 18F Q 10 mm 5)
También se deben realizar controles apropiados y la fase de unión necesita tres controles. El control de la fluorescencia de fondo implica la preparación de una muestra que contenga todos los componentes de la amplificación por PCR excepto la sonda. La muestra de control se debe procesar de forma idéntica a las muestras a ensayar, añadiendo 20 \mul de cada muestra a la matriz y midiendo la fluorescencia presente en el sobrenadante. Este control proporciona una manera de medir la fluorescencia de fondo presente en la matriz, el tampón de unión y en cualquiera de los componentes de la mezcla de amplificación por PCR. También proporciona una medición de la cantidad de fluorescencia presente en muestras clínicas.
El segundo control proporciona una medición de la degradación no deseada de sonda y de la reacción de unión y consiste en una mezcla de amplificación por PCR simulada que contiene todos los componentes incluyendo la sonda pero no se somete a los ciclos térmicos. La muestra de control se debe procesar de forma idéntica a las muestras a ensayar y se deben añadir 20 \mul a la matriz y medir la fluorescencia presente en el sobrenadante. Este control proporciona una manera de medir la aparición de degradación de la sonda durante el almacenaje, así como también la eficiencia de la reacción de unión. Si no se produce ningún tipo de degradación y si la reacción de unión es completa, la fluorescencia del sobrenadante después de la unión a la matriz de PEI Bakerbond^{^{TM}} debería ser similar a la fluorescencia de fondo medida en el primer control.
El tercer control proporciona una forma de medir la cantidad de sonda que entra. La muestra preparada para el segundo control se puede utilizar para esta medición. No obstante, en este caso, se añaden 20 \mul a un tubo que contiene 290 \mul de tampón de unión sin matriz. Este control se puede utilizar para determinar la cantidad de sonda que entra.
Para iniciar el protocolo, primero hay que determinar el número de tubos de unión que se necesitan: este número corresponde a la suma de las muestras y de los controles de la prueba. Los controles son un control sin molde, un control sin cebador, controles de calibración y el primer y el segundo control mencionados anteriormente. Los controles se pueden llevar a cabo por triplicado. A cada tubo se le añaden 235 \mul de tampón de unión.
También se prepara un tubo para medir la entrada añadiendo a un tubo Eppendorf vacío: 290 \mul de tampón de unión, que es equivalente al volumen de los tubos con matriz (235 \mul de tampón de unión, 15 \mul de agua y 40 \mul aportada por el volumen de la matriz). La determinación de la cantidad de entrada se puede llevar a cabo por triplicado.
A los tubos que contienen matriz (las muestras de la prueba y el primer y el segundo control) se les añade 20 \mul de muestra. A los tubos que contienen tampón (el tercer control) se les añade 20 \mul de una mezcla de amplificación PCR simulada. Después, los tubos se agitan en una mezcladora Vortex Genie 2 a una velocidad de 4 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después se centrifugan los tubos en una microcentrífuga Eppendorf (16 000 x g) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se recogen los 200 \mul superiores de sobrenadante de cada tubo sin alterar el pellet o la matriz presente en la pared del tubo y se introducen en un tubo Eppendorf limpio.
La fluorescencia del sobrenadante se mide en un aparato Hitachi Modelo 2000 en las cubetas indicadas anteriormente. Para las sondas marcadas con 7-dietilamino-3 (4'-maleimidofenil)-4.-metilo-cumarina, se ajusta el espectrofluorímetro del siguiente modo: voltaje PM de 700 V; longitud de onda de excitación de 432 nm; longitud de onda de emisión de 480 nm; anchura de la rendija de excitación de 10 nm y anchura de la hendidura de emisión de 20 nm. Se debe minimizar la exposición de la muestra a la luz de excitación, si la muestra ha de permanecer en el espectrofluorímetro durante un período de tiempo prolongado, el obturador debería estar cerrado.
El número de pmoles de la sonda escindida es la manera más conveniente de calcular la cantidad de señal. Para calcular la cantidad de señal, primero se determina la señal de entrada del tercer control, mediante el siguiente cálculo:
[(Señal de fluorescencia del tercer control - Señal de fluorescencia del primer control) x (310/20)] / 10 pmoles
En esta fórmula, la resta corrige cualquier fondo de fluorescencia de la muestra; 310/20 es el factor de dilución y 10 pmoles es la cantidad de sonda añadida a las amplificaciones por PCR.
[(Señal de fluorescencia de la muestra - Señal de fluorescencia del primer control) x (310/20)] / Señal de entrada
El protocolo anterior se puede modificar según el fluoróforo concreto que se utilice para marcar la sonda y es meramente ilustrativo de la invención.
La figura 16 muestra los resultados y la relación entre la señal y el número de dianas de entrada típicos del presente método utilizando extractante en fase sólida de matriz de PEI Bakerbond^{^{TM}}.
\global\parskip0.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: F.HOFFMANN-LA ROCHE AG
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Grenzacherstrasse 124
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: BS
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: CH-4070
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO 061-688 25 11
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 061-688 13 95
\vskip0.500000\baselineskip
(I)
TELEX: 962292/965542 hlr ch
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Oligonucleótidos marcados
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 24
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMATO DE LECTURA ELECTRÓNICO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
APLICACIÓN INFORMÁTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DATOS PREVIOS A LA SOLICITUD:
\vskip0.800000\baselineskip
NÚMERO DE SOLICITUD: 563,758
\vskip0.800000\baselineskip
FECHA DE PRESENTACIÓN: 6 de agosto de 1990
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGATAGTTT GAGTTCTTCT ACTCAGGC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAGAAAGCG AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC X 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCGCTGCG CGTAACCACC ACACCCGCCG CCGCGCX 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGTCACCGAT CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC X 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATGAGTTCG TGTCCGTACA ACTGG 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTTATCGAA ATCAGCCACA GCGCC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
MOLÉCULA: TIPO: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCGCTGCG CGTAACCACC ACACCCGCCG CGC 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGTCACCGAT CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGCTAGGGC GCTGGCAAGT GTAGCGGTCA 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCGCTAGGG CGCTGGCAAG TGTAGCGGTC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCGCTAGG GCGCTGGCAA GTGTAGCGGT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCGGGCGCT AGGGCGCTGG CAAGTGTAGC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC GCTGGCAAGT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAGAAAGCG AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGCCAACGC GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATCCCGCCG CGCTTAATGC GCCGCTACA 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCATTAATGC GCCGCTACAG GGCGCGTACT ATGG 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAATGG GAT 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGGAGACCA TCAATGAGGA AGCTGCAGAA TGGGAT 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCTATGTCA GTTCCCCTTG GTTCTCT 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAATGG GAT 
\hfill
33

Claims (29)

1. Un método para distinguir variantes de secuencia de un ácido nucleico diana en una muestra que consta de los siguientes pasos:
(a) poner en contacto una muestra que comprende ácidos nucleicos de cadena sencilla con un primer oligonucleótido que contiene una secuencia complementaria a una región de dicho ácido nucleico diana y un oligonucleótido marcado que contiene una secuencia complementaria a una de dichas variantes de secuencia en una segunda región de la secuencia de la misma hebra del ácido nucleico diana, en la que dichas variantes de secuencia se diferencian en dicha segunda región, bajo unas condiciones en las que dicho primer oligonucleótido y dicho oligonucleótido marcado hibridan con dicho ácido nucleico diana de manera que el extremo 3' de dicho primer oligonucleótido se encuentra adyacente o en dirección 5' de dicho oligonucleótido marcado;
(b) mantener la mezcla del paso (a) con una polimerasa de ácidos nucleicos dependiente de molde con actividad nucleasa 5'-3' en las condiciones suficientes para permitir que la actividad nucleasa 5'-3' de la polimerasa para escindir el oligonucleótido marcado hibridado para generar productos de escisión que consisten en fragmentos marcados liberados, de manera que se generan diferentes productos de escisión dependiendo de la variante de secuencia
presente;
(c) examinar los productos de escisión generados;
(d) identificar las variantes de secuencia presentes a partir de los productos de escisión analizados.
2. El proceso de la reivindicación 1 en el que la polimerasa de ácidos nucleicos es una DNA polimerasa que posee actividad nucleasa de 5' a 3'.
3. El proceso de la reivindicación 1 en el que dicho oligonucleótido marcado es exactamente complementario a una de dichas variantes de secuencia.
4. El proceso de la reivindicación 1 en el que dicho oligonucleótido marcado presenta un marcador fluorescente.
5. El proceso de la reivindicación 1 en el que dicho oligonucleótido marcado presenta un marcador en su extremo 5'.
6. El proceso de la reivindicación 1 en el que dicho oligonucleótido marcado se encuentra marcado internamente.
7. El proceso de la reivindicación 1 en el que dicho oligo-nucleótido marcado presenta un marcador en su extremo 3'.
8. El proceso de la reivindicación 1 en el que dicho, en el que el análisis de los productos de escisión se lleva a cabo utilizando un gel de electroforesis.
9. El proceso de la reivindicación 1, en el que el paso (b) se lleva a cabo en las condiciones apropiadas para promover la polimerización de ácidos nucleicos, en el que dichos productos de escisión se generan durante la extensión de dicho primer oligonucleótido.
10. Un proceso de amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, siglas en inglés) para distinguir variantes de secuencia de un ácido nucleico diana en una muestra que consta de los siguientes pasos:
(a) proporcionar una mezcla de reacción para PCR que contenga dicha muestra, una polimerasa de ácidos nucleicos dependiente de molde con actividad nucleasa 5'-3'; un oligonucleótido marcado que contenga una secuencia complementaria a una región de dicho ácido nucleico diana en el que dichas variantes de secuencia difieran, y un par de cebadores oligonucleótidos que comprenden un primer cebador y un segundo cebador, en el dicho primer cebador y dicho oligonucleótido marcado hibridan con la misma hebra de dicho ácido nucleico diana y dicho primer cebador hibrida en dirección 5' de dicho oligonucleótido marcado;
(b) el tratamiento de dicha mezcla de reacción para PCR bajo condiciones de amplificación que consta de un paso en el que dicho primer cebador y dicho oligonucleótido marcado hibridan con dicho ácido nucleico diana, dicho primer cebador se extiende gracias a una polimerasa de ácidos nucleicos mientras que dicha actividad nucleasa 5'-3' de dicha polimerasa de ácidos nucleicos escinda el oligonucleótido marcado hibridado para generar productos de escisión que consisten en fragmentos marcados liberados, de manera que se generan diferentes productos de escisión dependiendo de la variante de secuencia presente;
(c) examinar los productos de escisión generados;
(d) identificar las variantes de secuencia presentes a partir de los productos de escisión analizados.
11. El proceso de la reivindicación 10 en el que dicha polimerasa de ácidos nucleicos es una enzima termoestable.
12. El proceso de PCR de la reivindicación 10 en el que el oligonucleótido marcado presenta un extremo 3' bloqueado para impedir la extensión de la polimerasa de ácidos nucleicos.
13. El proceso de la reivindicación 10 en el que dicho oligonucleótido marcado es exactamente complementario a una de dichas variantes de secuencia.
14. El proceso de la reivindicación 10 en el que dicho oligonucleótido marcado presenta un marcador fluorescente.
15. El proceso de la reivindicación 10 en el que dicho oligonucleótido marcado presenta un marcador en su extremo 5'.
16. El proceso de PCR de la reivindicación 10 en el que dicho oligonucleótido marcado se encuentra marcado internamente.
17. El proceso de la reivindicación 10 en el que dicho oligonucleótido marcado presenta un marcador en su extremo 3'.
18. El proceso de PCR de la reivindicación 10 en el que el análisis de los productos de escisión se lleva a cabo utilizando un gel de electroforesis.
19. Un equipo para detectar secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra que consta de los siguientes pasos:
(a) al menos un oligonucleótido marcado que contiene una secuencia complementaria a una región del ácido nucleico diana, en el que dicho oligonucleótido diana hibrida con la secuencia del ácido nucleico diana unido a los oligonucleótidos cebadores de la parte (b) y comprende un par de marcadores interactivos generadores de señal colocados en el oligonucleótido de tal manera que evita la generación de señales detectables; y
(b) un conjunto de oligonucleótidos cebadores, los cuales
un primer cebador contiene una secuencia complementaria a una región de una hebra de la secuencia del ácido nucleico diana y que ceba la síntesis de un producto de extensión, y un segundo cebador que contiene una secuencia complementaria a una región en una segunda hebra de la secuencia del ácido nucleico diana o de la hebra de DNA complementaria; en el que cada cebador oligonucleótido se selecciona de manera que hibride con su molde complementario en posición 5' a cualquier oligonucleótido marcado que hibride con la misma hebra de ácidos nucleicos.
20. El equipo de la reivindicación 19 que además comprende una polimerasa de ácidos nucleicos que posee actividad nucleasa de 5' a 3'.
21. El equipo de la reivindicación 20 en el que dicha polimerasa de ácidos nucleicos es una enzima termoestable.
22. El equipo de la reivindicación 21 en el que dicha enzima termoestable es una DNA polimerasa procedente de Thermus aquaticus.
23. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 22, en el que los oligonucleótidos constan de desoxirribonucleótidos.
24. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 23, en el que dicho oligonucleótido marcado presenta un marcador en su extremo 5'.
25. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 24, en el que el oligonucleótido marcado además comprende una secuencia de nucleótidos que no es complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos diana.
26. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 25, en el que dicho oligonucleótido marcado se encuentra marcado por un fluoróforo.
27. El equipo de la reivindicación 26 en el que en el oligonucleótido marcado el primer marcador es un fluoróforo y el segundo marcador es un agente de extinción que interacciona con el primer marcador.
28. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 27, que contiene un par de oligonucleótidos sonda marcados en la parte (a).
29. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 28, en el que dichas sondas oligonucleotídicas marcadas son sondas específicas de especies o múltiples alelos.
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