JP3099853B2 - 核酸の測定試薬及び測定方法 - Google Patents
核酸の測定試薬及び測定方法Info
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸の測定に係わり、特
に３’末端及び５’末端に固相物質、例えば粒子を結合
させたヌクレオチドを核酸プローブとして用いる核酸の
測定試薬及び測定方法に関する。
に３’末端及び５’末端に固相物質、例えば粒子を結合
させたヌクレオチドを核酸プローブとして用いる核酸の
測定試薬及び測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】感染症の診断には、病原微生物の検出同
定が必須である。しかし、感染症の原因微生物を培養に
よって検出同定するには時間がかかり、疾病の診断と治
療に間に合わないことが多い。このために、免疫学的検
査法による診断が普及するようになってきている。免疫
学的検査法では、主として微生物の細胞表層の蛋白質と
か、増殖過程で多量に生産された抗原物質を検出してい
るが、これらの蛋白質は必ずしも微生物の病原性と関連
している訳でもない。なぜなら、特定の病原微生物また
はその特異抗原に対する患者血清の抗体価上昇を証明す
ることは、感染症の影を見ているに過ぎず、その本態を
確認するものではないからである。
定が必須である。しかし、感染症の原因微生物を培養に
よって検出同定するには時間がかかり、疾病の診断と治
療に間に合わないことが多い。このために、免疫学的検
査法による診断が普及するようになってきている。免疫
学的検査法では、主として微生物の細胞表層の蛋白質と
か、増殖過程で多量に生産された抗原物質を検出してい
るが、これらの蛋白質は必ずしも微生物の病原性と関連
している訳でもない。なぜなら、特定の病原微生物また
はその特異抗原に対する患者血清の抗体価上昇を証明す
ることは、感染症の影を見ているに過ぎず、その本態を
確認するものではないからである。
【０００３】近年、核酸ハイブリダイゼイションの技術
を使用して、試料中の特定塩基配列の有無を調べること
により、感染症の病因菌の特定ならびに、感染症の発症
前の診断が可能になってきた。すなわち、ＤＮＡプロー
ブを用いる方法である。これは試料に含まれる検出対象
の核酸の塩基配列に相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡ
（これをＤＮＡプローブと呼ぶ）を特異的な反応試薬と
して利用する方法である。試料中にＤＮＡプローブの塩
基配列と相補的な塩基配列の有無を検出することによ
り、目的病原菌の有無を判断できるのである。具体的な
方法としては、各種提案されており、日本臨床：４７
巻，７３７−７５４（１９８９）等に紹介されている。
を使用して、試料中の特定塩基配列の有無を調べること
により、感染症の病因菌の特定ならびに、感染症の発症
前の診断が可能になってきた。すなわち、ＤＮＡプロー
ブを用いる方法である。これは試料に含まれる検出対象
の核酸の塩基配列に相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡ
（これをＤＮＡプローブと呼ぶ）を特異的な反応試薬と
して利用する方法である。試料中にＤＮＡプローブの塩
基配列と相補的な塩基配列の有無を検出することによ
り、目的病原菌の有無を判断できるのである。具体的な
方法としては、各種提案されており、日本臨床：４７
巻，７３７−７５４（１９８９）等に紹介されている。
【０００４】その一例として、ドットハイブリダイゼイ
ションと呼ばれる方法がある。これは、試料を変性処理
して得た一本鎖ＤＮＡ（ＳＳ−ＤＮＡ）を固相に結合さ
せ、この固相にラジオアイソトープを標識したＳＳ−Ｄ
ＮＡを作用させて固相のＳＳ−ＤＮＡとハイブリッドを
形成させてから未反応の標識ＳＳ−ＤＮＡを除去し、固
相の放射線を測定する方法である（以下、第１の従来技
術という）。
ションと呼ばれる方法がある。これは、試料を変性処理
して得た一本鎖ＤＮＡ（ＳＳ−ＤＮＡ）を固相に結合さ
せ、この固相にラジオアイソトープを標識したＳＳ−Ｄ
ＮＡを作用させて固相のＳＳ−ＤＮＡとハイブリッドを
形成させてから未反応の標識ＳＳ−ＤＮＡを除去し、固
相の放射線を測定する方法である（以下、第１の従来技
術という）。
【０００５】また、この方法の変法として、サンドイッ
チハイブリダイゼイションがある。この方法では、吸着
によるバックグラウンドを下げることができ、不純なサ
ンプルを用いる場合に特に有効である。この方法では、
識別しようとする標的核酸に関係するＤＮＡフラグメン
トを少なくとも２つ使用する。一方のＤＮＡフラグメン
トは固相に結合させて、捕獲試薬として使用する。もう
一方のフラグメントは検出用試薬として標識し、ハイブ
リダイゼイション溶液に可溶化した試料サンプルと一緒
に加える。試料サンプル中に、両方の試薬に相同的な塩
基配列が存在している場合には、その配列は、捕獲試薬
にも検出用試薬にもハイブリダイズするはずである。ハ
イブリダイズしたか否かは、固相への標識を介して知る
ことができる（以下、第２の従来技術という）。
チハイブリダイゼイションがある。この方法では、吸着
によるバックグラウンドを下げることができ、不純なサ
ンプルを用いる場合に特に有効である。この方法では、
識別しようとする標的核酸に関係するＤＮＡフラグメン
トを少なくとも２つ使用する。一方のＤＮＡフラグメン
トは固相に結合させて、捕獲試薬として使用する。もう
一方のフラグメントは検出用試薬として標識し、ハイブ
リダイゼイション溶液に可溶化した試料サンプルと一緒
に加える。試料サンプル中に、両方の試薬に相同的な塩
基配列が存在している場合には、その配列は、捕獲試薬
にも検出用試薬にもハイブリダイズするはずである。ハ
イブリダイズしたか否かは、固相への標識を介して知る
ことができる（以下、第２の従来技術という）。
【０００６】さらに、特公平３−７８１２０号公報には
制限酵素を用いる方法が提案されている。この方法で
は、測定対象である一本鎖ポリヌクレオチドを、標識物
が結合されかつ測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドと反
応して二本鎖ポリヌクレオチドを形成することができる
一本鎖ポリヌクレオチドを結合させた固相と、溶液中で
接触させて二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ、形成さ
れた二本鎖ポリヌクレオチドに制限酵素を作用させて、
この二本鎖ポリヌクレオチドを切断し、溶液又は固相の
標識物を測定する（以下、第３の従来技術という）。
制限酵素を用いる方法が提案されている。この方法で
は、測定対象である一本鎖ポリヌクレオチドを、標識物
が結合されかつ測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドと反
応して二本鎖ポリヌクレオチドを形成することができる
一本鎖ポリヌクレオチドを結合させた固相と、溶液中で
接触させて二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ、形成さ
れた二本鎖ポリヌクレオチドに制限酵素を作用させて、
この二本鎖ポリヌクレオチドを切断し、溶液又は固相の
標識物を測定する（以下、第３の従来技術という）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記従
来技術には次のような問題がある。第１及び第２の従来
技術では、特に検出対象核酸の量が少ない場合に問題が
ある。また、測定の際に数多くの作業工程を必要とし、
特に試料の固定化に長時間を要したり固液反応であるた
めに反応の進行に長時間を要し操作の労力及び、測定の
迅速性にも問題があった。
来技術には次のような問題がある。第１及び第２の従来
技術では、特に検出対象核酸の量が少ない場合に問題が
ある。また、測定の際に数多くの作業工程を必要とし、
特に試料の固定化に長時間を要したり固液反応であるた
めに反応の進行に長時間を要し操作の労力及び、測定の
迅速性にも問題があった。
【０００８】第３の従来技術はこれらの問題を解決して
おり、試料の固定化は不要である。しかし、この従来技
術においては検出感度について不十分であった。例えば
酵素を標識物とする場合には、酵素反応による化学増幅
は、概ね１０４ 倍程度が限界である上、基質の分解等
の影響で低濃度での測定値の信頼性に欠ける。増幅率は
反応条件に依存しやすく共存物の影響を受け、不安定で
ある。これを補う方法として、試料ＤＮＡ断片を増幅す
る方法があるが、時間を要すること及びサンプルのコン
タミネイションがある等実用上問題を有する。
おり、試料の固定化は不要である。しかし、この従来技
術においては検出感度について不十分であった。例えば
酵素を標識物とする場合には、酵素反応による化学増幅
は、概ね１０４ 倍程度が限界である上、基質の分解等
の影響で低濃度での測定値の信頼性に欠ける。増幅率は
反応条件に依存しやすく共存物の影響を受け、不安定で
ある。これを補う方法として、試料ＤＮＡ断片を増幅す
る方法があるが、時間を要すること及びサンプルのコン
タミネイションがある等実用上問題を有する。
【０００９】また、上記第３の従来技術においては、測
定にあたり反応によって形成した二本鎖を切断した後
に、切断により固相から分離した標識物と、切断を受け
ずに固相に結合した状態にある標識物（未反応試薬の標
識物）とを溶液中で分離する必要がある。
定にあたり反応によって形成した二本鎖を切断した後
に、切断により固相から分離した標識物と、切断を受け
ずに固相に結合した状態にある標識物（未反応試薬の標
識物）とを溶液中で分離する必要がある。
【００１０】さらに、上記第１〜第３の従来技術のその
他の欠点としては、核酸プローブとしてアイソトープで
標識したプローブが使用されることである。アイソトー
プを使うと、コストが高い上に、安全性や廃棄の点を考
慮しなくてはならないという欠点がある。
他の欠点としては、核酸プローブとしてアイソトープで
標識したプローブが使用されることである。アイソトー
プを使うと、コストが高い上に、安全性や廃棄の点を考
慮しなくてはならないという欠点がある。
【００１１】また、これらの検出における問題は、従来
の検出方法がいずれも濃度測定を行なうことにある。
の検出方法がいずれも濃度測定を行なうことにある。
【００１２】本発明の第１の目的は、上記の問題を解決
し、迅速な処理が可能でかつ検出感度に優れる核酸の測
定試薬及び測定方法を提供することである。
し、迅速な処理が可能でかつ検出感度に優れる核酸の測
定試薬及び測定方法を提供することである。
【００１３】本発明の第２の目的は、未反応試薬の標識
物を洗浄分離する必要のない核酸の測定試薬及び測定方
法を提供することである。
物を洗浄分離する必要のない核酸の測定試薬及び測定方
法を提供することである。
【００１４】本発明の第３の目的は、放射性同位元素を
用いない取扱いの容易な核酸の測定試薬及び測定方法を
提供することである。
用いない取扱いの容易な核酸の測定試薬及び測定方法を
提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本願発明者等は上記課題
を解決すべく検討を重ねた結果、粒子を標識体として用
い、３′末端及び５′末端の両方に粒子を結合させたヌ
クレオチドを試薬として用いることによって、上記第１
〜第３の目的を達成できることを見出して、本発明を完
成するに至った。
を解決すべく検討を重ねた結果、粒子を標識体として用
い、３′末端及び５′末端の両方に粒子を結合させたヌ
クレオチドを試薬として用いることによって、上記第１
〜第３の目的を達成できることを見出して、本発明を完
成するに至った。
【００１６】すなわち、本発明の測定試薬の最大の特徴
は、３′末端及び５′末端にそれぞれ第１及び第２の粒
子を結合させたヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドは
二本鎖の形成が可能であり、前記第１及び第２の粒子は
前記二本鎖形成後に切断されたときに光学的測定により
個数を識別し得る粒子である。
は、３′末端及び５′末端にそれぞれ第１及び第２の粒
子を結合させたヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドは
二本鎖の形成が可能であり、前記第１及び第２の粒子は
前記二本鎖形成後に切断されたときに光学的測定により
個数を識別し得る粒子である。
【００１７】また、本発明の測定試薬は、３′末端及び
５′末端にそれぞれ標識物を結合させたヌクレオチド
と、前記標識物にそれぞれ結合可能な標識物を結合させ
た第１及び第２の粒子を含む構成であってもよく、３′
末端及び５′末端の一方に標識物を結合させ、他方に第
１の粒子を結合させたヌクレオチドと、前記標識物に結
合可能な標識物を結合させた第２の粒子とを含む構成で
あってもよい。これらの場合、当該ヌクレオチドと第１
及び第２の粒子を溶液中で接触させることにより標識物
が互いに結合し、３′末端及び５′末端にそれぞれ第１
及び第２の粒子を結合させた上記の本発明試薬が得られ
る。
５′末端にそれぞれ標識物を結合させたヌクレオチド
と、前記標識物にそれぞれ結合可能な標識物を結合させ
た第１及び第２の粒子を含む構成であってもよく、３′
末端及び５′末端の一方に標識物を結合させ、他方に第
１の粒子を結合させたヌクレオチドと、前記標識物に結
合可能な標識物を結合させた第２の粒子とを含む構成で
あってもよい。これらの場合、当該ヌクレオチドと第１
及び第２の粒子を溶液中で接触させることにより標識物
が互いに結合し、３′末端及び５′末端にそれぞれ第１
及び第２の粒子を結合させた上記の本発明試薬が得られ
る。
【００１８】また、本発明の測定方法の最大の特徴は、
３′末端及び５′末端にそれぞれ第１及び第２の粒子を
結合させたヌクレオチドを測定試薬として用い、この試
薬と測定試料とを反応させて二本鎖ヌクレオチドを形成
させ、該二本鎖ヌクレオチドの二本鎖を切断し、この切
断により互いに分離した第１及び第２の粒子と切断を受
けていない未反応試薬の第１及び第２の粒子の双方を含
む液をフローセルに導入し、前記液がフローセル内を流
れるときに、前記切断により互いに分離した第１及び第
２の粒子と切断を受けていない未反応試薬の第１及び第
２の粒子とを光 学的に識別して検出し、少なくとも一方
の粒子を計数し、その計数された粒子数に基づいて前記
測定試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在を測定
することである。
３′末端及び５′末端にそれぞれ第１及び第２の粒子を
結合させたヌクレオチドを測定試薬として用い、この試
薬と測定試料とを反応させて二本鎖ヌクレオチドを形成
させ、該二本鎖ヌクレオチドの二本鎖を切断し、この切
断により互いに分離した第１及び第２の粒子と切断を受
けていない未反応試薬の第１及び第２の粒子の双方を含
む液をフローセルに導入し、前記液がフローセル内を流
れるときに、前記切断により互いに分離した第１及び第
２の粒子と切断を受けていない未反応試薬の第１及び第
２の粒子とを光 学的に識別して検出し、少なくとも一方
の粒子を計数し、その計数された粒子数に基づいて前記
測定試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在を測定
することである。
【００１９】さらに本発明の測定方法は、３′末端及び
５′末端にそれぞれ標識物を結合させたヌクレオチド
と、前記標識物にそれぞれ結合可能な標識物を結合させ
た第１及び第２の粒子とを測定試薬として用いてもよい
し、３′末端及び５′末端の一方に標識物を結合させ、
他方に第１の粒子を結合させたヌクレオチドと、前記標
識物に結合可能な標識物を結合させた第２の粒子とを測
定試薬として用いてもよく、これらの場合、この試薬と
測定試料とを反応させてヌクレオチドの３′末端及び
５′末端にそれぞれ前記第１及び第２の粒子を結合させ
かつ測定試料と二本鎖ヌクレオチドを形成させ、該二本
鎖ヌクレオチドの二本鎖を切断し、この切断により互い
に分離した第１及び第２の粒子と切断を受けていない未
反応試薬の第１及び第２の粒子の双方を含む液をフロー
セルに導入し、前記液がフローセル内を流れるときに、
前記切断により互いに分離した第１及び第２の粒子と切
断を受けていない未反応試薬の第１及び第２の粒子とを
光学的に識別して検出し、少なくとも一方の粒子を計数
し、その計数された粒子数に基づいて前記測定試料中の
特定のポリヌクレオチド配列の存在を測定する。ヌクレ
オチド両末端に結合された粒子は、同一粒径であっても
よいし異なる粒径を有していてもよい。該二本鎖の切断
により互いに分離した粒子と切断を受けない未反応試薬
の粒子の一方を計測することにより、試料中の測定対象
であるヌクレオチドを測定できる。粒子の計測には粒子
カウンタを用いればよい。切断により分離した粒子と切
断を受けない未反応試薬の粒子（非分離粒子）とでは粒
子塊としての大きさが異なるので、それぞれの粒子を識
別して検出できる。本方法によれば試料と反応した試薬
の粒子と未反応試薬の粒子との分別工程が不要である
し、二本鎖の切断を受けた試薬の粒子と切断を受けない
未反応試薬の粒子との分別工程も、さらには洗浄工程も
不要である。
５′末端にそれぞれ標識物を結合させたヌクレオチド
と、前記標識物にそれぞれ結合可能な標識物を結合させ
た第１及び第２の粒子とを測定試薬として用いてもよい
し、３′末端及び５′末端の一方に標識物を結合させ、
他方に第１の粒子を結合させたヌクレオチドと、前記標
識物に結合可能な標識物を結合させた第２の粒子とを測
定試薬として用いてもよく、これらの場合、この試薬と
測定試料とを反応させてヌクレオチドの３′末端及び
５′末端にそれぞれ前記第１及び第２の粒子を結合させ
かつ測定試料と二本鎖ヌクレオチドを形成させ、該二本
鎖ヌクレオチドの二本鎖を切断し、この切断により互い
に分離した第１及び第２の粒子と切断を受けていない未
反応試薬の第１及び第２の粒子の双方を含む液をフロー
セルに導入し、前記液がフローセル内を流れるときに、
前記切断により互いに分離した第１及び第２の粒子と切
断を受けていない未反応試薬の第１及び第２の粒子とを
光学的に識別して検出し、少なくとも一方の粒子を計数
し、その計数された粒子数に基づいて前記測定試料中の
特定のポリヌクレオチド配列の存在を測定する。ヌクレ
オチド両末端に結合された粒子は、同一粒径であっても
よいし異なる粒径を有していてもよい。該二本鎖の切断
により互いに分離した粒子と切断を受けない未反応試薬
の粒子の一方を計測することにより、試料中の測定対象
であるヌクレオチドを測定できる。粒子の計測には粒子
カウンタを用いればよい。切断により分離した粒子と切
断を受けない未反応試薬の粒子（非分離粒子）とでは粒
子塊としての大きさが異なるので、それぞれの粒子を識
別して検出できる。本方法によれば試料と反応した試薬
の粒子と未反応試薬の粒子との分別工程が不要である
し、二本鎖の切断を受けた試薬の粒子と切断を受けない
未反応試薬の粒子との分別工程も、さらには洗浄工程も
不要である。
【００２０】粒子としては、特に蛍光性色素を含有する
直径１０μｍ以下の粒子が好ましいが、蛍光粒子に限定
するものではなく、ルミネセンス粒子であってもよい
し、あるいは別の標識粒子であっても良い。また標識を
持たない粒子や磁性粒子を使用することができる。
直径１０μｍ以下の粒子が好ましいが、蛍光粒子に限定
するものではなく、ルミネセンス粒子であってもよい
し、あるいは別の標識粒子であっても良い。また標識を
持たない粒子や磁性粒子を使用することができる。
【００２１】粒子の検出には、標識粒子を濃度として測
定してもよいが、粒子の数を計数すると感度良く測定す
ることができる。
定してもよいが、粒子の数を計数すると感度良く測定す
ることができる。
【００２２】測定対象は一本鎖ヌクレオチド（ＤＮＡ，
ＲＮＡ）である。試料中に含まれるヌクレオチドが二本
鎖である場合には一本鎖にしておく必要がある。
ＲＮＡ）である。試料中に含まれるヌクレオチドが二本
鎖である場合には一本鎖にしておく必要がある。
【００２３】また、試薬としてのヌクレオチドは測定対
象ヌクレオチドと二本鎖ヌクレオチドを形成しうるもの
である。この試薬としてのヌクレオチドを結合させる固
相物質は特に制限されるものではないが、ポリスチレン
ラテックス、イオン交換樹脂、セファロースなどのゲル
などが好適である。ヌクレオチドを固相物質に結合させ
る方法は化学結合法でもよく、物理吸着法でもよく、固
相物質の状況に応じて広く知られた方法に従えばよい。
このヌクレオチドの大きさは、普通は１５塩基を下回ら
ず、５０塩基以上である場合もある。当該ヌクレオチド
と試料とのハイブリダイゼーションのための領域は、１
６塩基またはそれ以上である場合が多いが、完全な相同
性は必要ではなく、少なくとも約５０％、より好ましく
は少なくとも８０％の相同性があればよい。二本鎖ヌク
レオチドの切断には二本鎖特異的切断酵素を用いるのが
好適であるが、制限酵素でなくてもよい。
象ヌクレオチドと二本鎖ヌクレオチドを形成しうるもの
である。この試薬としてのヌクレオチドを結合させる固
相物質は特に制限されるものではないが、ポリスチレン
ラテックス、イオン交換樹脂、セファロースなどのゲル
などが好適である。ヌクレオチドを固相物質に結合させ
る方法は化学結合法でもよく、物理吸着法でもよく、固
相物質の状況に応じて広く知られた方法に従えばよい。
このヌクレオチドの大きさは、普通は１５塩基を下回ら
ず、５０塩基以上である場合もある。当該ヌクレオチド
と試料とのハイブリダイゼーションのための領域は、１
６塩基またはそれ以上である場合が多いが、完全な相同
性は必要ではなく、少なくとも約５０％、より好ましく
は少なくとも８０％の相同性があればよい。二本鎖ヌク
レオチドの切断には二本鎖特異的切断酵素を用いるのが
好適であるが、制限酵素でなくてもよい。
【００２４】すなわち、第１の方法では、ヌクレオチド
の３’末端及び５’末端それぞれに粒子を結合させた試
薬と試料とを反応させて二本鎖ヌクレオチドを形成させ
た後、該二本鎖を酵素で切断する。ヌクレオチド両末端
に結合された粒子は、同一粒径であってもよいし異なる
粒径を有していてもよい。該二本鎖の切断により互いに
分離した粒子と切断を受けない未反応試薬の粒子の一方
を計測することにより、試料中の測定対象であるヌクレ
オチドを測定できる。粒子の計測には粒子カウンタを用
いればよい。切断により分離した粒子と切断を受けてい
ない未反応試薬の粒子（非分離粒子）とでは粒子塊とし
ての大きさが異なるので、それぞれ粒子を識別できる。
本方法によれば試料と反応した試薬の粒子と未反応試薬
の粒子との分別工程が不要であるし、二本鎖の切断を受
けた試薬の粒子と切断を受けない未反応試薬の粒子との
分別工程も、さらには洗浄工程も不要である。
の３’末端及び５’末端それぞれに粒子を結合させた試
薬と試料とを反応させて二本鎖ヌクレオチドを形成させ
た後、該二本鎖を酵素で切断する。ヌクレオチド両末端
に結合された粒子は、同一粒径であってもよいし異なる
粒径を有していてもよい。該二本鎖の切断により互いに
分離した粒子と切断を受けない未反応試薬の粒子の一方
を計測することにより、試料中の測定対象であるヌクレ
オチドを測定できる。粒子の計測には粒子カウンタを用
いればよい。切断により分離した粒子と切断を受けてい
ない未反応試薬の粒子（非分離粒子）とでは粒子塊とし
ての大きさが異なるので、それぞれ粒子を識別できる。
本方法によれば試料と反応した試薬の粒子と未反応試薬
の粒子との分別工程が不要であるし、二本鎖の切断を受
けた試薬の粒子と切断を受けない未反応試薬の粒子との
分別工程も、さらには洗浄工程も不要である。
【００２５】第２の方法では、ヌクレオチドの３′末端
に蛍光性などの標識粒子、５′末端に磁性粒子を結合さ
せた試薬と試料とを反応させて二本鎖ヌクレオチドを形
成させた後に、該二本鎖を酵素で切断する。該二本鎖の
切断後、磁性粒子を磁石で吸着して、切断により遊離し
た蛍光粒子を計測することにより試料中の測定対象であ
るヌクレオチドを測定することができる。本方法によれ
ば、試料と反応した試薬の粒子と未反応試薬の粒子の分
別のために遠心操作やフィルタ分離をしなくてもよい。
二本鎖の切断反応後、反応容器の底部に磁石を配置して
おき磁性粒子を吸着させた状態で上清中の切断により遊
離した蛍光粒子を、蛍光光度計あるいは粒子カウンタで
計測することにより、特別に切断を受けた反応試薬の粒
子と切断を受けない未反応試薬の粒子の分別操作及び洗
浄操作はしなくてもよい。反応液上清の遊離した蛍光粒
子を計測する代わりに、磁石により吸着した磁性粒子に
結合した蛍光粒子（未反応試薬の螢光粒子）を計測して
もよい。
に蛍光性などの標識粒子、５′末端に磁性粒子を結合さ
せた試薬と試料とを反応させて二本鎖ヌクレオチドを形
成させた後に、該二本鎖を酵素で切断する。該二本鎖の
切断後、磁性粒子を磁石で吸着して、切断により遊離し
た蛍光粒子を計測することにより試料中の測定対象であ
るヌクレオチドを測定することができる。本方法によれ
ば、試料と反応した試薬の粒子と未反応試薬の粒子の分
別のために遠心操作やフィルタ分離をしなくてもよい。
二本鎖の切断反応後、反応容器の底部に磁石を配置して
おき磁性粒子を吸着させた状態で上清中の切断により遊
離した蛍光粒子を、蛍光光度計あるいは粒子カウンタで
計測することにより、特別に切断を受けた反応試薬の粒
子と切断を受けない未反応試薬の粒子の分別操作及び洗
浄操作はしなくてもよい。反応液上清の遊離した蛍光粒
子を計測する代わりに、磁石により吸着した磁性粒子に
結合した蛍光粒子（未反応試薬の螢光粒子）を計測して
もよい。
【００２６】第３の方法では、ヌクレオチドの３′末端
及び５′末端にそれぞれ粒子を結合させ、粒子同志をさ
らに結合させてマトリックス状の粒子塊とした試薬と試
料を反応させて二本鎖ヌクレオチドを形成させた後に、
該二本鎖を酵素で切断する。該二本鎖の切断により、マ
トリックス状の粒子塊は分断されてマトリッククス径が
小さくなると共に、分断された粒子塊が生成してくるか
ら、これを計測することによって試料中の測定対象であ
るヌクレオチドを測定する。使用する粒子は蛍光性など
の標識粒子であってもよいし、標識を持たない粒子であ
ってもよい。本方法は試料と反応した試薬粒子と未反応
試薬の粒子を分別する必要はないし、二本鎖の切断を受
けた粒子と切断を受けない試薬の粒子の分別洗浄をしな
くともよい。
及び５′末端にそれぞれ粒子を結合させ、粒子同志をさ
らに結合させてマトリックス状の粒子塊とした試薬と試
料を反応させて二本鎖ヌクレオチドを形成させた後に、
該二本鎖を酵素で切断する。該二本鎖の切断により、マ
トリックス状の粒子塊は分断されてマトリッククス径が
小さくなると共に、分断された粒子塊が生成してくるか
ら、これを計測することによって試料中の測定対象であ
るヌクレオチドを測定する。使用する粒子は蛍光性など
の標識粒子であってもよいし、標識を持たない粒子であ
ってもよい。本方法は試料と反応した試薬粒子と未反応
試薬の粒子を分別する必要はないし、二本鎖の切断を受
けた粒子と切断を受けない試薬の粒子の分別洗浄をしな
くともよい。
【００２７】
【作用】本発明において、３′末端及び５′末端にそれ
ぞれ第１及び第２の粒子を結合させたヌクレオチドを試
薬として用いることにより、この試薬と試料を反応させ
て二本鎖ヌクレオチドを形成させ、該二本鎖ヌクレオチ
ドの二本鎖を切断したとき、試料と反応した試薬では二
本鎖の切断で第１及び第２の粒子が互いに分離するのに
対して、未反応試料の第１及び第２の粒子は切断を受け
ず互いに結合したままの状態にある。このため、切断を
受けた第１及び第２の粒子と切断を受けない第１及び第
２の粒子とでは粒子塊としての大きさが異なり、両者は
識別可能である。また、磁性粒子を用いた場合及びヌク
レオチドを反応容器壁へ結合した場合は、切断を受けた
粒子のみが溶液中に遊離するので、同様に両者は識別可
能である。したがって、切断により分離した第１及び第
２の粒子と切断を受けない未反応試薬の第１及び第２の
粒子の少なくとも一方を検出することにより、試薬に反
応した試料中の目的とする成分を測定することができ
る。
ぞれ第１及び第２の粒子を結合させたヌクレオチドを試
薬として用いることにより、この試薬と試料を反応させ
て二本鎖ヌクレオチドを形成させ、該二本鎖ヌクレオチ
ドの二本鎖を切断したとき、試料と反応した試薬では二
本鎖の切断で第１及び第２の粒子が互いに分離するのに
対して、未反応試料の第１及び第２の粒子は切断を受け
ず互いに結合したままの状態にある。このため、切断を
受けた第１及び第２の粒子と切断を受けない第１及び第
２の粒子とでは粒子塊としての大きさが異なり、両者は
識別可能である。また、磁性粒子を用いた場合及びヌク
レオチドを反応容器壁へ結合した場合は、切断を受けた
粒子のみが溶液中に遊離するので、同様に両者は識別可
能である。したがって、切断により分離した第１及び第
２の粒子と切断を受けない未反応試薬の第１及び第２の
粒子の少なくとも一方を検出することにより、試薬に反
応した試料中の目的とする成分を測定することができ
る。
【００２８】したがって、本発明によれば、形成した二
本鎖ヌクレオチドの切断前に末反応試薬を反応系から除
く必要がない。また、形成した二本鎖の切断後に、その
切断を受けた試薬の粒子と切断を受ないに反応試薬の粒
子とを分離分別して測定してもよいし、分離分別せず測
定してもよい。さらに、分離する際に洗浄操作を省いて
もよい。
本鎖ヌクレオチドの切断前に末反応試薬を反応系から除
く必要がない。また、形成した二本鎖の切断後に、その
切断を受けた試薬の粒子と切断を受ないに反応試薬の粒
子とを分離分別して測定してもよいし、分離分別せず測
定してもよい。さらに、分離する際に洗浄操作を省いて
もよい。
【００２９】また、本発明において、粒子の数を計数す
ることにより感度良く検出することができる。
ることにより感度良く検出することができる。
【００３０】以上より、本発明では未反応試薬の標識物
を洗浄分離する必要がなく、迅速かつ高感度に核酸を測
定できる。また、放射性同位元素を用いないので取扱い
が容易である。
を洗浄分離する必要がなく、迅速かつ高感度に核酸を測
定できる。また、放射性同位元素を用いないので取扱い
が容易である。
【００３１】また、本発明において、３′末端及び５′
末端にそれぞれ標識物を結合させたヌクレオチドと、前
記標識物にそれぞれ結合可能な標識物を結合させた第１
及び第２の粒子とを試薬として用いた場合、又は３′末
端及び５′末端の一方に標識物を結合させ、他方に第１
の粒子を結合させたヌクレオチドと、前記標識物に結合
可能な標識物を結合させた第２の粒子とを含む試薬とし
て用いた場合は、使用直前又は使用時にこれらを結合し
て完成試薬とすることにより、使用に至るまでの間に搬
送中の振動等でヌクレオチドと粒子が分離するような危
険性が少なくなり、試薬としての信頼性が向上する。
末端にそれぞれ標識物を結合させたヌクレオチドと、前
記標識物にそれぞれ結合可能な標識物を結合させた第１
及び第２の粒子とを試薬として用いた場合、又は３′末
端及び５′末端の一方に標識物を結合させ、他方に第１
の粒子を結合させたヌクレオチドと、前記標識物に結合
可能な標識物を結合させた第２の粒子とを含む試薬とし
て用いた場合は、使用直前又は使用時にこれらを結合し
て完成試薬とすることにより、使用に至るまでの間に搬
送中の振動等でヌクレオチドと粒子が分離するような危
険性が少なくなり、試薬としての信頼性が向上する。
【００３２】粒子を検出する方法としては種々の方法が
考えられる。特に、フローセル中に粒子を含む液を流
し、そこに光を照射してこの応答を検出することによ
り、粒子塊ごとに標識の有無や大きさを識別する検出方
法が有効である。具体的には、フローサイトメータを利
用すればよい。
考えられる。特に、フローセル中に粒子を含む液を流
し、そこに光を照射してこの応答を検出することによ
り、粒子塊ごとに標識の有無や大きさを識別する検出方
法が有効である。具体的には、フローサイトメータを利
用すればよい。
【００３３】
【実施例】以下、本発明をさらに詳細に説明するために
実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるも
のではない。
実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるも
のではない。
【００３４】実施例１ 本発明の方法によって、ハイブリダイゼーション条件下
において一端に蛍光粒子、他の一端に磁性粒子を結合さ
せたヌクレオチド試薬と一本鎖核酸試料とを反応させ
た。該試料と粒子を結合させた該ヌクレオチド試薬との
ハイブリダイゼーション生成物に酵素を作用させて二本
鎖を切断した。磁性粒子を磁石で吸着した状態で、反応
液に遊離する蛍光粒子を検出した。すなわち、市販のフ
ローサイトメータ装置を用いて、フローセル中に反応液
を流し、そこに光を照射してこの応答を検出した。
において一端に蛍光粒子、他の一端に磁性粒子を結合さ
せたヌクレオチド試薬と一本鎖核酸試料とを反応させ
た。該試料と粒子を結合させた該ヌクレオチド試薬との
ハイブリダイゼーション生成物に酵素を作用させて二本
鎖を切断した。磁性粒子を磁石で吸着した状態で、反応
液に遊離する蛍光粒子を検出した。すなわち、市販のフ
ローサイトメータ装置を用いて、フローセル中に反応液
を流し、そこに光を照射してこの応答を検出した。
【００３５】結果を図１に示す。縦軸の応答回数が切断
により分離された螢光粒子の個数に一致し、螢光粒子の
個数が反応したヌクレオチドの個数に一致する。したが
って、応答回数から興味あるヌクレオチドの個数を測定
できる。
により分離された螢光粒子の個数に一致し、螢光粒子の
個数が反応したヌクレオチドの個数に一致する。したが
って、応答回数から興味あるヌクレオチドの個数を測定
できる。
【００３６】実施例２ 次に、測定対象の一本鎖核酸を含む試料と、一端に蛍光
粒子、他の一端に標識を持たない粒子を結合させたヌク
レオチド試薬とのハイブリダイゼーション生成物に酵素
を作用させて二本鎖を切断し、切断された粒子と切断さ
れない粒子が混在する状態の試料を用いて、粒子を検出
した。市販のフローサイトメータ装置を用いて、フロー
セル中に反応液を流し、そこに光を照射してこの応答を
検出した。すなわち、二本鎖切断用酵素反応の結果とし
て二本鎖が切断されているかどうかを、粒子塊ごとに蛍
光強度と散乱光強度を同時に計測することによって識別
した。
粒子、他の一端に標識を持たない粒子を結合させたヌク
レオチド試薬とのハイブリダイゼーション生成物に酵素
を作用させて二本鎖を切断し、切断された粒子と切断さ
れない粒子が混在する状態の試料を用いて、粒子を検出
した。市販のフローサイトメータ装置を用いて、フロー
セル中に反応液を流し、そこに光を照射してこの応答を
検出した。すなわち、二本鎖切断用酵素反応の結果とし
て二本鎖が切断されているかどうかを、粒子塊ごとに蛍
光強度と散乱光強度を同時に計測することによって識別
した。
【００３７】結果を図２〜図４に示す。図２は散乱光強
度の応答回数であり、切断で分離された粒子は切断を受
けないに反応試薬の粒子（粒子塊）よりも散乱光強度が
減少し、２つのピークが得られる。最初のピークの応答
回数が切断で分離された粒子の個数に一致し、この個数
の既知の割合が反応したヌクレオチドの個数に一致す
る。したがって、図２のデータからだけでも応答回数か
ら興味あるヌクレオチドの個数を測定できる。しかし、
散乱光強度で測定を行なう場合はバックグラウンドの誤
差が入る可能性がある。これを補正するため、図２の２
種類の散乱光強度の応答に同期して螢光強度を計測し、
螢光強度から測定を行なう。
度の応答回数であり、切断で分離された粒子は切断を受
けないに反応試薬の粒子（粒子塊）よりも散乱光強度が
減少し、２つのピークが得られる。最初のピークの応答
回数が切断で分離された粒子の個数に一致し、この個数
の既知の割合が反応したヌクレオチドの個数に一致す
る。したがって、図２のデータからだけでも応答回数か
ら興味あるヌクレオチドの個数を測定できる。しかし、
散乱光強度で測定を行なう場合はバックグラウンドの誤
差が入る可能性がある。これを補正するため、図２の２
種類の散乱光強度の応答に同期して螢光強度を計測し、
螢光強度から測定を行なう。
【００３８】図３及び図４は螢光強度のデータを示すも
のであり、図３が図２の最初のピークの応答に同期して
得られた、切断で分離された螢光粒子の応答回数であ
り、図４が図２のに番目のピークの応答に同期して得ら
れた、切断を受けない未反応試薬の螢光粒子の応答回数
である。図３より切断で分離された螢光粒子の個数が分
かり、実施例１と同様に螢光粒子の個数から興味あるヌ
クレオチドの個数を正確に測定できる。
のであり、図３が図２の最初のピークの応答に同期して
得られた、切断で分離された螢光粒子の応答回数であ
り、図４が図２のに番目のピークの応答に同期して得ら
れた、切断を受けない未反応試薬の螢光粒子の応答回数
である。図３より切断で分離された螢光粒子の個数が分
かり、実施例１と同様に螢光粒子の個数から興味あるヌ
クレオチドの個数を正確に測定できる。
【００３９】
【発明の効果】本発明によれば、未反応試薬の標識物を
洗浄分離する必要がなく、迅速かつ高感度に核酸を測定
できる。また、放射性同位元素を用いないので極めて取
扱いが容易である。
洗浄分離する必要がなく、迅速かつ高感度に核酸を測定
できる。また、放射性同位元素を用いないので極めて取
扱いが容易である。
【図１】実施例１の測定方法において、切断で分離され
た螢光粒子の螢光強度の計測データを示す図である。
た螢光粒子の螢光強度の計測データを示す図である。
【図２】実施例２の測定方法において、粒子の散乱光強
度の計測データを示す図である。
度の計測データを示す図である。
【図３】実施例２の測定方法において、切断で分離され
た螢光粒子の螢光強度の計測データを示す図である。
た螢光粒子の螢光強度の計測データを示す図である。
【図４】実施例２の測定方法において、切断を受けない
未反応試薬の螢光粒子の螢光強度の計測データを示す図
である。
未反応試薬の螢光粒子の螢光強度の計測データを示す図
である。
フロントページの続き (72)発明者 野村 靖 茨城県勝田市市毛882番地 株式会社 日立製作所 計測器事業部内 (56)参考文献 特開 平２−92300（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−256059（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−91999（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−132375（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−124768（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−32169（ＪＰ，Ａ)
Claims (12)
- 【請求項１】 ３′末端及び５′末端にそれぞれ第１及
び第２の粒子を結合させたヌクレオチドを含み、該ヌク
レオチドは二本鎖の形成が可能であり、前記第１及び第
２の粒子は前記二本鎖形成後に切断されたときに光学的
測定により個数を識別し得る粒子であることを特徴とす
る核酸の測定試薬。 - 【請求項２】 ３′末端及び５′末端にそれぞれ標識物
を結合させたヌクレオチドと、前記標識物にそれぞれ結
合可能な標識物を結合させた第１及び第２の粒子を含む
ことを特徴とする核酸の測定試薬。 - 【請求項３】 ３′末端及び５′末端の一方に標識物を
結合させ、他方に第１の粒子を結合させたヌクレオチド
と、前記標識物に結合可能な標識物を結合させた第２の
粒子とを含むことを特徴とする核酸の測定試薬。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸
の測定試薬において、前記粒子は蛍光性粒子であること
を特徴とする核酸の測定試薬。 - 【請求項５】 ３′末端及び５′末端にそれぞれ粒子径
が異なり、標識を持たない粒子を結合させたヌクレオチ
ドを含むことを特徴とする核酸の測定試薬。 - 【請求項６】 ３′末端及び５′末端にそれぞれ粒子を
結合させ、かつその粒子にそれぞれ他の粒子を結合させ
てマトリックス状の粒子塊を形成したヌクレオチドを含
むことを特徴とする核酸の測定試薬。 - 【請求項７】 ３′末端及び５′末端にそれぞれ第１及
び第２の粒子を結合させたヌクレオチドを測定試薬とし
て用い、この試薬と測定試料とを反応させて二本鎖ヌク
レオチドを形成させ、該二本鎖ヌクレオチドの二本鎖を
切断し、この切断により互いに分離した第１及び第２の
粒子と切断を受けていない未反応試薬の第１及び第２の
粒子の双方を含む液をフローセルに導入し、前記液がフ
ローセル内を流れるときに、前記切断により互いに分離
した第１及び第２の粒子と切断を受けていない未反応試
薬の第１及び第２の粒子とを光学的に識別して検出し、
少なくとも一方の粒子を計数し、その計数された粒子数
に基づいて前記測定試料中の特定のポリヌクレオチド配
列の存在を測定することを特徴とする核酸の測定方法。 - 【請求項８】 ３′末端及び５′末端にそれぞれ標識物
を結合させたヌクレオチドと、前記標識物にそれぞれ結
合可能な標識物を結合させた第１及び第２の粒子とを測
定試薬として用い、この試薬と測定試料とを反応させて
ヌクレオチドの３′末端及び５′末端にそれぞれ前記第
１及び第２の粒子を結合させかつ測定試料と二本鎖ヌク
レオチドを形成させ、該二本鎖ヌクレオチドの二本鎖を
切断し、この切断により互いに分離した第１及び第２の
粒子と切断を受けていない未反応試薬の第１及び第２の
粒子の双方を含む液をフローセルに導入し、前記液がフ
ローセル内を流れるときに、前記切断により互いに分離
した第１及び第２の粒子と切断を受けていない未反応試
薬の第１及び第２の粒子とを光学的に識別して検出し、
少なくとも一方の粒子を計数し、その計数された粒子数
に基づいて前記測定試料中の特定のポリヌクレオチド配
列の存在を測定することを特徴とする核酸の測定方法。 - 【請求項９】 ３′末端及び５′末端の一方に標識物を
結合させ、他方に第１の粒子を結合させたヌクレオチド
と、前記標識物に結合可能な標識物を結合させた第２の
粒子とを測定試薬として用い、この試薬と測定試料とを
反応させてヌクレオチドの３′末端及び５′末端にそれ
ぞれ前記第１及び第２の粒子を結合させかつ測定試料と
二本鎖ヌクレオチドを形成させ、該二本鎖ヌクレオチド
の二本鎖を切断し、この切断により互いに分離した第１
及び第２の粒子と切断を受けていない未反応試薬の第１
及び第２の粒子の双方を含む液をフローセルに導入し、
前記液がフローセル内を流れるときに、前記切断により
互いに分離した第１及び第２の粒子と切断を受けていな
い未反応試薬の第１及び第２の粒子とを光学的に識別し
て検出し、少なくとも一方の粒子を計数し、その計数さ
れた粒子数に基づいて前記測定試料中の特定のポリヌク
レオチド配列の存在を測定することを特徴とする核酸の
測定方法。 - 【請求項１０】 ３′末端及び５′末端の一方に標識を
持つ粒子を結合させ、他方に磁性粒子を結合させたヌク
レオチドを測定試薬として用い、この試薬と測定試料と
を反応させて二本鎖ヌクレオチドを形成させ、該二本鎖
ヌクレオチドの二本鎖を切断し、その後前記磁性粒子を
磁石で吸着し、切断により遊離した標識粒子と切断を受
けていない未反応試薬の標識粒子の双方を含む液をフロ
ーセルに導入し、前記液がフローセル内を流れるとき
に、前記切断により互いに分離した第１及び第２の粒子
と切断を受けていない未反応試薬の第１及び第２の粒子
とを光学的に識別して検出し、少なくとも一方の粒子を
計数し、その計数された粒子数に基づいて前記測定試料
中の特定のポリヌクレオチド配列の存在を測定すること
を特徴とする核酸の測定方法。 - 【請求項１１】 ３′末端及び５′末端の一方に標識を
持つ粒子を結合させ、他方を反応容器壁に結合可能なヌ
クレオチドを測定試薬として用い、この試薬と測定試料
とを前記反応容器内で反応させて前記ヌクレオチドの他
方の末端を反応容器壁に結合させかつ測定試料と二本鎖
ヌクレオチドを形成させ、該二本鎖ヌクレオチドの二本
鎖を切断し、この切断により遊離した標識粒子と切断を
受けていない未反応試薬の標識粒子の双方を含む液をフ
ローセルに導入し、前記液がフローセル内を流れるとき
に、前記切断により互いに分離した第１及び第２の粒子
と切断を受けていない未反応試薬の第１及び第２の粒子
とを光学的に識別して検出し、少なくとも一方の粒子を
計数し、その計数された粒子数に基づいて前記測定試料
中の特定のポリヌクレオチド配列の存在を測定すること
を特徴とする核酸の測定方法。 - 【請求項１２】 ３′末端及び５′末端にそれぞれ粒子
を結合させ、かつその粒子にそれぞれ他の粒子を結合さ
せてマトリックス状の粒子塊を形成したヌクレオチドを
測定試薬として用い、この試薬と測定試料とを反応させ
て二本鎖ヌクレオチドを形成させ、該二本鎖ヌクレオチ
ドの二本鎖を切断し、この切断により遊離した標識粒子
と切断を受けていない未反応試薬の標識粒子の双方を含
む液をフローセルに導入し、前記液がフローセル内を流
れるときに、前記切断により互いに分離した第１及び第
２の粒子と切断を受けていない未反応試薬の第１及び第
２の粒子とを光学的に識別して検出し、少なくとも一方
の粒子を計数し、その計数された粒子数に基づいて前記
測定試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在を測定
することを特徴とする核酸の測定方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05030589A JP3099853B2 (ja) | 1993-02-19 | 1993-02-19 | 核酸の測定試薬及び測定方法 |
| US08/658,398 US5882863A (en) | 1993-02-19 | 1996-06-05 | Method of measuring nucleic acids and reagent used therefor |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05030589A JP3099853B2 (ja) | 1993-02-19 | 1993-02-19 | 核酸の測定試薬及び測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06242117A JPH06242117A (ja) | 1994-09-02 |
| JP3099853B2 true JP3099853B2 (ja) | 2000-10-16 |
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ID=12308057
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|---|---|---|---|
| JP05030589A Expired - Fee Related JP3099853B2 (ja) | 1993-02-19 | 1993-02-19 | 核酸の測定試薬及び測定方法 |
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|---|---|
| US (1) | US5882863A (ja) |
| JP (1) | JP3099853B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102017208515A1 (de) | 2017-05-19 | 2018-11-22 | Koenig & Bauer Ag | Verfahren zum Betreiben einer bogenverarbeitenden Maschine und bogenverarbeitende Maschine |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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