ES2252011T3 - Marcado de alta densidad de dna con nucleotidos modificados o que llevan un cromoforo y dna-polimerasas empleadas. - Google Patents

Abstract

Un método para el marcado enzimático de ácidos nucleicos que utiliza una DNA-polimerasa, un molde ácidonucleico, un cebador y trifosfatos de nucleósidos modificados, que pueden incorporarse por acción de la polimerasa en el DNA recién sintetizado, en el que la DNA-polimerasa es un mutante exo menos de ingeniería genética o polimerasas de tipo B que no presentan actividad de 3¿-exonucleasa y los trifosfatos de por lo menos dos desoxinucleósidos naturales se han reemplazado completamente por los correspondientes trifosfatos de desoxinucleósidos modificados o por derivados de los mismos, de tal manera que en el ácido nucleico general dos de las cuatro bases lleven modificaciones y se logre la longitud completa deseada.

Description

Marcado de alta densidad de DNA con nucleótidos modificados o que llevan un cromóforo y DNA-polimerasas empleadas.

La síntesis de DNA marcado mediante la incorporación de trifosfatos de desoxinucleósidos modificados, que llevan un brazo espaciador y un grupo detectable, es un método habitual en biología molecular. Sin embargo, el marcado de alta densidad de ácidos nucleicos con nucleótidos modificados no es tan frecuente. Se supone que el impedimento estérico entre los brazos del engarce (linker) y el grupo detectable (grupo informante o "reporter" o colorantes) impide la síntesis de fragmentos de DNA, en los que cada base o cada fracción principal de estas bases está unida a un grupo detectable.

1.

Pueden incorporarse nucleótidos marcados con IDG, en una densidad definida, a sondas de ácido nucleico con DNA-polimerasas (por ejemplo la DNA-polimerasa de la E. coli, las DNA-polimerasas T4 o T7, la transcriptasa inversa, la Taq-polimerasa o la transferasa terminal) mediante un marcado con cebador aleatorio, el desplazamiento de mella, la PCR, el marcado/añadido (tailing) del extremo 3' o la transcripción "in vitro". La mezcla de marcado contiene Dig-dUTP y dTTP, dATP, dCTP y dGTP. El nucleótido marcado Dig-dUTP no puede reemplazar por completo el dTTP en la mezcla reaccionante inicial, porque la reacción parece que se inhibe por acción de la Dig-dUTP cuando se emplean los componentes de reacción que se utilizan habitualmente y las DNA-polimerasas empleadas normalmente para el marcado del DNA. Cuando se emplea una proporción optimizada entre Dig-dUTP y dTTP se obtiene un aumento en la concentración de Dig-dUTP en algunos marcados de alta densidad, pero resulta una reducción de la longitud del producto y del rendimiento del producto. No es posible por tanto reemplazar completamente el dTTP por el Dig-dUTP empleando las técnicas habituales de marcado (Hibridación no radiactiva "in situ", Manual de aplicación, 2ª edición, Boehringer Mannheim GmbH, 1996) [4].

2.

Jett, J.H. y col. (patente US-5 405 747, Método de secuenciación rápida de bases en DNA y RNA con dos marcadores de bases, 1995) [5,6] describen que se han sintetizado hebras de DNA de hasta 500 nucleótidos de longitud que contienen un nucleótido fluorescente y tres nucleótidos no modificados. La síntesis de DNA se realiza empleando una DNA-polimerasa T7 mutada y rodamina-dCTP, rodamina-dATP, rodamina-dUTP, fluoresceína-dATP o fluoresceína-dUTP. La síntesis de DNA se ha observado también por acción de la DNA-polimerasa T4 con rodamina-dCTP o rodamina-dATP. Los autores no comentan nada de la eficacia de incorporación de los nucleótidos modificados frente a las bases no modificadas en posiciones inmediatamente adyacentes, pero debaten la dificultad de incorporación de los nucleótidos marcados a las DNA-polimerasas debido al impedimento estérico. Estos autores no describen la sustitución simultánea de más de un trifosfato de nucleósido normal por derivados.

3.

Makiko Hiyoshi & Shigeru Hosoi (Ensayo de desnaturalización de DNA por incorporación de marcador fluorescente realizada por PCR y transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, Analytical Biochemistry 221, 306-311, 1994) [7] describen la incorporación de marcadores fluorescentes, tales como la fluoresceína-11-dUTP o la rodamina-4-dUTP durante la amplificación por PCR empleando la DNA-polimerasa Taq. Estos nucleótidos marcados con fluoróforos se utilizan en mezcla que contienen el dTTP. Los autores describen que estos derivados trifosfato de desoxinucleósido son incapaces de sustituir por completo el sustrato normal, el dTTP. Estos resultados se interpretan de modo que el impedimento estérico del brazo de engarce y el grupo fluorescente impiden la incorporación específica a las posiciones adyacentes.

4.

La incorporación de trifosfatos de desoxiuridilo modificados con Cy5 de diferentes longitudes de brazos de engarce se describe en Yu, H. y col., NAR 22, 3418-3422, 1994. Estos sustratos se analizan en reacciones de desplazamiento de mella (nick) realizadas con la DNA-polimerasa I de E. coli y en PCR empleando la DNA-polimerasa Taq. El nivel de incorporación aumenta en paralelo si se incrementa la longitud del brazo de engarce. En condiciones óptimas es posible marcar por PCR hasta un 28% de los posibles sitios de sustitución del DNA deseado con un rendimiento razonable y un 18% por desplazamiento de mella. La imposibilidad de realizar la sustitución completa se explica diciendo que viene provocada por las interacciones estéricas entre la polimerasa y los sitios del molde (de la PCR) marcados con cianina y las cadenas extendidas y el sustrato dUTP modificado.

5.

Starke, H.R. y col. (Nucl. Acids Res. 22, 3997-4001, 1994) [9] describen la síntesis-marcado enzimáticos de DNA en DNA M13 como molde, fluoresceína-15-dATP o tetrametilrodamina-dATP, dCTP, dGTP, TTP, DNA-polimerasa T7 modificada (secuenasa) y Mn^{++} como ion metálico divalente. El uso del Mn^{++} en lugar del Mg^{++} fomenta la falsa incorporación de bases mal apareadas. En estas condiciones, la polimerasa no necesariamente incorporará la base correcta. Si es difícil la incorporación de la base correcta, p.ej. debido al impedimento estérico, entonces será preferida la incorporación de una base no complementaria. Los autores indican que los nucleótidos marcados se incorporan en alguna medida. Pero el análisis detallado pone de manifiesto que, p.ej. una secuencia próxima al cebador, a la que deberían incorporarse cuatro nucleótidos dA en posición contigua, no se sintetiza del modo esperado. El producto principal (80-90%) de esta reacción de marcado contiene solamente un dATP marcado y tres nucleótidos no complementarios. Los productos que contienen dos o tres dATP marcados se observan como fracción menor. Los autores no describen un producto que contenga cuatro dATP marcados.

6.

Un ejemplo, en el que se incorporan con éxito dos bases marcadas por acción de las DNA-polimerasas se describe en Davis, L.M. y col. (GATA 8(1), 1-7, 1991) [10]. Empleando nucleótidos marcados con biotina, por ejemplo el Bio-11-dCTP o el Bio-11-dUTP, y DNA-polimerasas I de la E. coli (fragmento grande de Klenow), el d(A,G)_{2100} como molde/cebador, se genera una serie de nucleótidos completamente biotinilados. Los autores constatan que los efectos estéricos no son problema en los nucleótidos biotinilados. La combinación de Bio-11-dCTP y Bio-11-dUTP junto con el dATP y el dGTP se ensayan en DNA M13 de hebra simple como molde que contiene las cuatro bases. Con este ensayo no se consigue generar un producto de longitud completa.

7.

Goodman, M.F. y Reha-Krantz, L. (número de solicitud internacional PCT-US 97/06493, WO 97/39150, Síntesis de DNA marcado con un fluoróforo) describen DNA-polimerasas T4 de bacteriófago mutante, de las que se reivindica que tienen una mayor capacidad para incorporar nucleótidos modificados para la síntesis de DNA modificado, p.ej. marcado con fluoróforo. Se describe que los mutantes tienen una procesabilidad intrínseca mayor que las enzimas nativas. En las reacciones en las que se reemplace un nucleótido natural por un nucleótido marcado con rodamina, las DNA-polimerasas mutantes generan un producto DNA de tramos más largos que la enzima de tipo salvaje. Cuando se reemplazan por completo dos trifosfatos de nucleósido naturales por dNTP marcados con rodamina, los autores no comentan la longitud absoluta que tienen los productos. Solamente se ha descrito que se obtienen productos de longitud completa con el mutante L422M de la DNA-polimerasa T4 y la incorporación del rodamina-dUTP o del rodamina-dCTP o del biotina-dCTP.

Estos ejemplos indican que de momento no se puede lograr el marcado del DNA con nucleótidos modificados por síntesis de DNA empleando DNA-polimerasas con más de un nucleótido modificado, que genere un producto de longitud completa.

Sin embargo, el DNA marcado en alta densidad es un requisito necesario para la detección ultrasensible de moléculas deseadas específicas, por ejemplo secuencias de ácido nucleico, para la secuenciación de moléculas individuales o para la detección de moléculas individuales. Los nucleótidos modificados, por ejemplo los nucleótidos marcados con fluoróforos, con DIG o con biotina, tienen que incorporarse al DNA por elongación con cebador o por PCR y los productos de longitud completa tienen que generarse por acción de las DNA-polimerasas que trabajen a temperaturas elevadas. Por lo tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar un método de marcado de DNA mediante la síntesis de DNA empleando una DNA-polimerasa, al tiempo que por lo menos dos nucleótidos de origen natural se reemplazan por nucleótidos modificados y se genera un producto de longitud completa.

Estos y otros objetos se logran con la presente invención que proporciona métodos para la síntesis de DNA dirigida a molde con DNA-polimerasas y trifosfatos de nucleósido modificados (nucleótidos que llevan una modificación detectable unida con enlace covalente a la base). Las DNA-polimerasas incorporan los trifosfatos de desoxinucleósido modificado que contienen una modificación, mientras que por lo menos dos nucleótidos de origen natural se reemplazan completamente por nucleótidos modificados. El método comprende la síntesis del DNA con una o varias DNA-polimerasas y una mezcla de trifosfatos de nucleósidos, en la que por lo menos dos bases constan exclusivamente de nucleótidos modificados, una o varias DNA-polimerasas que son capaces de sintetizar el DNA por incorporación de nucleótidos modificados, mientras que una o varias DNA-polimerasas sintetizan tramos de DNA que contienen exclusivamente nucleótidos modificados. La invención abarca además DNA-polimerasas que pueden utilizarse en reacciones PCR con un conjunto de trifosfato de nucleósidos, en el que uno o por lo menos dos bases constan exclusivamente de bases modificadas. Las polimerasas de la invención pertenecen al grupo de las polimerasas de tipo B, que no despliegan esencialmente actividad de exonucleasa 3'. Según la invención son preferidos además los nucleótidos modificados que se fijan sobre colorantes hidrófilos u otros marcadores hidrófilos.

Son especialmente preferidos los colorantes elegidos entre el grupo formado por las carbocianinas, las rodaminas, las fluoresceínas, las cumarinas, las vitaminas, p.ej. la biotina, los haptenos, p.ej. la digoxigenina, las oxazinas y las hormonas, p.ej. el colesterol y el estradiol.

Cuando se lleva a cabo el método de síntesis de DNA marcado de alta densidad en fase sólida es posible también utilizar marcadores que sean menos hidrófilos que los ejemplos recién mencionados, porque la naturaleza hidrófila del marcador no es un parámetro tan crítico. Sin embargo, en caso de llevar a la práctica el método de la presente invención en fase líquida, son preferidos los marcadores hidrófilos.

Los engarces (linker) apropiados pueden ser p.ej. péptidos o lípidos o derivados de los mismos. Es preferido que la longitud del engarce que se fija el colorante sobre el nucleótido tenga unos 15 átomos de carbono o más. Se proporcionan ejemplos de marcado de ácidos nucleicos empleando un nucleótido marcado que puede detectarse por fluorescencia (fluoresceína, verde rodamina o Cy5), un nucleótido que puede detectarse por reacción con un anticuerpo (digoxigenina, fluoresceína), un nucleótido que puede detectarse por interacción específica con estreptavidina (biotina) y un nucleótido que lleva un grupo reactivo que puede estar unido químicamente al marcador (aminopentinil-C7-desaza-dATP). La longitud del engarce dependerá del marcador que esté unido al nucleótido. Para la mayoría de marcadores se ha constatado que es favorable un engarce de una longitud de unos 15 átomos de carbono o más. Sin embargo, para algunos marcadores pequeños, p.ej. AMCA, es favorable el uso de un engarce que contenga 6 átomos de carbono. En la fig. 15 se da una lista de derivados de nucleótidos que son útiles para la presente invención.

En una forma preferida de ejecución, el método de la invención se lleva a cabo empleando una polimerasa de tipo B que no despliega actividad de exonucleasa 3' y nucleótidos que están unidos a marcadores hidrófilos elegidos entre el grupo formado por los colorantes recién mencionados, mientras que el engarce que une el colorante con el nucleótido tiene una longitud de unos 15 átomos de carbono o más.

Se estudia la eficacia de incorporación de 11 DNA-polimerasas diferentes (o mezclas de polimerasas) y transcriptasas inversas de diferentes familias [3].

1. Se elige un fragmento de Klenow de la DNA-pol I de la E. coli (Roche Molecular Biochemicals, RMB) como ejemplo de una polimerasa mesófila de tipo A bien caracterizada, de estructura cristalina de proteína conocida.

2. Se elige un fragmento de Klenow de DNA-pol I Chy del Carboxydothermus hydrogenoformans como ejemplo de polimerasa termófila homóloga de tipo A con similaridad con el fragmento de Klenow de la E. coli.

3. La secuenasa (Amersham) es una versión de ingeniería genética de la DNA-polimerasa T7, que se emplea con gran frecuencia para el análisis de secuencias de DNA.

4. La transcriptasa inversa M-MuLV (RMB) es una enzima de subunidad única y

5. La transcriptasa inversa AMV (RMB) es una enzima dímera de subunidad \alpha/\beta.

6. La polimerasa Taq (RMB) es una polimerasa termófila de tipo A, también con estructura proteica resuelta.

7. La polimerasa Vent y la polimerasa Vent exo^{-} (New England Biolabs) son polimerasas termófilas de tipo B. Además la polimerasa Vent tiene una actividad adicional de prueba de lectura 3'-5'-exonucleolítica.

8. La polimerasa Tgo (y la polimerasa Tgo exo^{-}, RMB; no son productos comerciales; tienen una función 3'-5'-exonucleasa que ha sufrido deleción genética) es también una enzima termófila, arcaeana de la familia B (ejemplo 7, figura 8).

9. La polimerasa Pwo (RMB) es también una enzima de tipo B de fuente arcaeana. Despliega además actividad de prueba de lectura 3'-5'-exonucleolítica.

10. La Pol \beta recombinante (rata), suministrada gentilmente por Samuel Wilson (Galveston/Texas) a RMB.

11. El sistema Expand™ High Fidelity PCR (RMB) es una mezcla única de polimerasa Taq y Pwo para una eficacia superior de la PCR.

Las polimerasas Vent, Vent exo^{-} y Tgo exo^{-} son enzimas termófilas de tipo B de origen arcaeano y presentan una cierta similaridad con las DNA-polimerasas eucariotas replicativas de tipo \alpha. Las enzimas de tipo salvaje de estas dos enzimas presentan una fuerte actividad de 3'-5'-exonucleasa y por ello son menos convenientes para marcar el DNA que las variantes correspondientes de ingeniería genética (variantes exo^{-}) (1).

Los ejemplos de esta solicitud de patente comprenden 5 polimerasas o mezclas (nº 2, 7, 8, 9, 11) véase el anterior apartado 11) de las polimerasas que figuran en las listas de esta solicitud, que presentan una eficacia de marcado superior a la de otras polimerasas (los datos no se presentan detallados).

Todas las DNA-polimerasas se ensayan con los tampones suministrados, o lo que se indique en otro caso (la Tgo exo se ensaya en un tampón que contiene Tris-HCl 50 mM, pH = 8,5, a 20ºC, KCl 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 15 mM, MgSO_{4} 7 mM, Tritón X-100 del 0,05% (o del 0,005%, según se indique) y 2-mercaptoetanol 10 mM).

Los trifosfatos de desoxirribonucleótidos modificados según la presente invención son trifosfatos de desoxirribonucleótidos que están unidos a marcadores. Los derivados de estos trifosfatos de desoxirribonucleótidos modificados se modifican adicionalmente al marcador, p.ej. trifosfatos de 7-desaza-desoxirribonucleótidos modificados o trifosfatos de C-nucleósidos modificados.

Los ejemplos de trifosfatos de desoxirribonucleótidos modificados que son idóneos para el método de la invención son los siguientes:

Derivados de dAdenosina

7-hexinil-7-desaza-dATP (véase la estructura en el apéndice 1).

7-aminopentinil-7-desaza-dATP (véase la estructura en el apéndice 1).

\newpage

Derivados de dUridina

AMCA-6-dUTP (RMB, nº de catálogo: 1534386).

biotina-16-dUTP (RMB, nº de catálogo: 10930670).

Cy5-10-dUTP (con una longitud de espaciador de 10 átomos, RMB, véase la estructura en el apéndice 1).

Cy5-dUTP (con una longitud de espaciador de 17, 24 ó 38 átomos, RMB, véase la estructura en el apéndice 1).

DIG-11-dUTP (RMB, nº de catálogo: 1558706).

MR121-dUTP (con una longitud de espaciador de 8, 13 ó 24 átomos, RMB, véase la estructura en el apéndice 1).

fluoresceína-12-dUTP (RMB, véase la estructura en el apéndice 1).

verde-rodamina-dUTP (RMB, véase la estructura en el apéndice 1).

verde-rodamina-X-dUTP (RMB, véase la estructura en el apéndice 1).

TMR-6-dUTP (RMB, nº de catálogo: 1534378).

Derivados de dCitidina

FluoroLinK™ Cy5™ -dCTP (Amersham Life Science, nº de catálogo: PA55021).

digoxigenina-28-dCTP (RMB, véase la estructura en el apéndice 1).

rosamina-dCTP (RMB, véase la estructura en el apéndice 1).

Derivados de dGuanosina

7-hexinil-7-desaza-dGTP (véase la estructura en el apéndice 1).

Véase la fórmula estructural, los compuestos espaciadores y los pesos moleculares en las figuras 10-14 o el catálogo de productos bioquímicos de RMB para obtener información más detallada.

Estos dNTP modificados sustituyen por completo a los dNTP de origen natural en las reacciones de marcado.

Las reacciones de polimerasa se llevan a cabo en tubos de PCR (200 \mul) en un volumen total de 10 \mul; las reacciones PCR en un volumen de 50 a 100 \mul. El molde y el cebador se fusionan de 20 a 35ºC durante 10 min. Las concentraciones de DNA-polimerasa son de 0,1, 0,5 unidades y 1 unidad según se indica por cada reacción de Taq, enzima Chy de Klenow y polimerasa Vent y Vent exo^{-}, de 0,1 o 1 unidad de polimerasa Tgo exo^{-} (una unidad es la incorporación de 10 nmoles de trifosfatos de desoxinucleósidos totales al DNA precipitable en medio ácido en un tiempo de 30 min a la temperatura empleada para cada polimerasa), para el marcado mediante la PCR la concentración óptima de enzima puede aumentarse p.ej. de 1 a 4 unidades de enzima para producir mejores proporciones de incorporación. La concentración de trabajo de molde/cebador puede situarse entre 0,5 y 1 pmol, según se indica. Las concentraciones de molde pueden variar entre 0,1 y 0,75 \mug y las de cebador entre 50 y 600 nM. Las concentraciones de nucleótido modificado pueden variar entre 5 \muM y 50 \muM, los dNTP no modificados entre 50 \muM y 300 \muM. Como tampones pueden utilizarse el Tris, la bicina y la tricina, en concentraciones de 10 mM a 50 mM; el pH puede ajustarse con HCl o ácido acético a valores comprendidos entre 8,5 y 9,2. En la mezcla reaccionante pueden utilizarse el KCl de 0 a 100 mM; y/o (NH_{4})_{2}SO_{4}, de 0 a 20 mM; y el MgCl_{2}, de 1 a 4 mM; o el MnCl_{2}, de 0,5 a 1,5 mM; el Tween, de 0,05% al 2%; y opcionalmente el DMSO del 1 al 5%; o el BSA, 100 \mug/ml. La mezcla reaccionante puede incubarse durante un tiempo de 10 min a 60 min a una temperatura óptima para la polimerasa empleada, p.ej. la polimerasa Chy de Klenow se emplea en un intervalo de temperaturas comprendido entre 55ºC y 72ºC. Para el marcado por PCR, la temperatura de hibridación puede variar según la secuencia de cebador que se utilice. Esta temperatura de elongación y el número de ciclos puede variar según la polimerasa termoestable y el molde que se elijan.

Las reacciones de extensión con cebador preferidas se describen a continuación.

Se fusionan las hebras de molde/cebador a temperatura ambiente durante 10 min. Se llevan a cabo las reacciones de polimerasa en tubos PCR (200 \mul) en un volumen total de 10 \mul. Cada mezcla reaccionante contiene 1 x tampón de polimerasa. Las concentraciones de DNA-polimerasa son de 0,1, 0,5 unidades o 1 unidad según se indica por cada reacción de la Taq, la enzima Chy de Klenow y las polimerasas Vent y Vent exo^{-}, 0,1 ó 1 unidad de polimerasa Tgo exo (una unidad es la incorporación de 10 nmoles de trifosfatos de desoxinucleótidos totales al DNA precipitable en medio ácido durante 30 min a la temperatura aplicada para cada polimerasa). Las concentraciones de trabajo de molde/cebador se sitúan entre 0,5 y 1 pmol, según se indica. Las concentraciones de nucleótidos modificados varían entre 5 \muM y 50 \muM. Los dNTP regulares son 12,5 \muM en cada caso. Las mezclas reaccionantes se incuban normalmente con las polimerasas en las condiciones siguientes. Taq: 0,1 u, 72ºC, 30 min; enzima Chy de Klenow: 0,1 u, 72ºC, 30 min; DNA-polimerasas Pwo, Vent exo^{-}: 0,1 u, 72ºC, 30 min.

Las reacciones de polimerización se terminan con la adición de una solución de paro de 10 \mul de formamida (formamida desionizada del 98%, EDTA 10 mM, azul de bromofenol al 0,01%) y se desnaturaliza el DNA por calentamiento a 95ºC durante 10 min. Se cargan partes alícuotas de 3 \mul en geles de secuenciación acrilamida/urea de desnaturalización al 12,5% y se someten a electroforesis con una tensión de 2000-2500 voltios hasta que el colorante azul de bromofenol alcanza el ánodo del tanque de tampón.

Condiciones preferidas para la detección de la digoxigenina

Después de la separación electroforética de los productos de la reacción de la polimerasa se transfiere el DNA a membranas de poliamida cargadas positivamente (RMB) por transferencia (blotting) de contacto durante 30-60 min y se reticulan por irradiación (254 nm, 10-15 min). Después se bloquean la membrana durante 30 min con ácido maleico 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 7,5 (tampón 1), que contiene un 1% (p/v) de agente bloqueante (caseína) y se hace reaccionar con una solución 1:10.000 de fragmentos Fab anti-digoxigenina-AP (RMB) durante 60 min. Se eliminan los anticuerpos no fijados por varios lavados con un exceso de tampón 1 que contiene un 0,3% de Tween 20. Después se transfiere la membrana al tampón 2 (Tris/HCl 0,1 M, pH 9,5, NaCl 0,1 M), se lava de nuevo y finalmente se incuba con CDP Star™ (dilución 1:1000 en el tampón 2) durante 10-15 min. Se elimina cuidadosamente el exceso de líquido con un papel Whatman 3MM Chr. Después se sella el material transferido (blot) entre dos hojas de transparencia y se expone a una película Lumi (RMB) o a un Lumi Imager™ (RMB) durante un tiempo de 10 min a 20 min.

Con el fin de determinar la incorporación precisa de los trifosfatos de desoxinucleósidos modificados con arreglo a la instrucción de la instrucción de la secuencia de DNA deseado se emplean sistemas de molde/cebador bien definidos. Este sistema permite seguir la elongación del cebador marcado (22-mero) con 5'-digoxigenina con diferentes DNA-polimerasas en presencia de los derivados modificados. Se examina si es posible incorporar diversos nucleótidos modificados, uno tras otro, empleando un molde con tractos T (Nuc T15) o con tractos C (Nuc T16) y también prolongar además con dNTP naturales (moldes Nuc T, ver figura 1a).

Para los estudios de incorporación se emplea el cassette (cass) 1-10 del sistema molde-cebador, en el que los cuatro dNTP de origen natural se sustituyen por análogos modificados. Este sistema de molde-cebador consta de 10 secuencias de molde, con bloques de construcción de cuatro bases, cada una está representada una vez por unidad, de tal manera que el cass 1 consta de un bloque, el cass 2 consta de dos y así sucesivamente. Este sistema permite la incorporación paso a paso de diferentes derivados (por ejemplo, con el cass 1) y calibrar los productos de reacción hasta 40 pasos de incorporación. Se permutan las secuencias del molde.

La presente invención proporciona, pues, métodos para ensayar trifosfatos de desoxirribonucleótidos modificados y polimerasas en lo que respecta a su utilidad para el marcado de alta densidad.

El método según la presente invención puede llevarse a la práctica en fase sólida o líquida. El método de la presente invención puede aplicarse a la síntesis del DNA y al marcado simultáneo del DNA por PCR.

Los nucleótidos modificados incorporados a los nuevos ácidos nucleicos sintetizados pueden detectarse por métodos no radiactivos, por ejemplo la excitación y detección de fluorescencia, la detección de una reacción inmunológica, la detección por interacción específica (p.ej. estreptavidina-biotina) o por marcado introducido químicamente. Es preferido que las cuatro bases modificadas lleven marcadores diferentes de modo que puedan distinguirse entre sí, p.ej. el dATP lleva una modificación diferente de la modificación que llevan el dGTP, el dCTP o el dTTP.

El método de la invención puede utilizarse además para la secuenciación del DNA, en especial la secuenciación de moléculas individuales. En una forma de ejecución, la invención puede aplicarse también a la secuenciación de DNA de molécula individual en canales submicrométricos. Este nuevo método se basa en la detección y la identificación de moléculas de nucleótidos marcadas por fluorescencia, degradadas de hebras de DNA en un microcapilar en forma de cono.

En el caso de secuenciación de una molécula individual de un DNA marcado en alta densidad, la detección del mononucleótido modificado se efectúa después del paso de degradación, es decir, después de que el mononucleótido modificado haya sido separado del DNA marcado en alta densidad.

El método de esta invención puede aplicarse también para la detección o cuantificación de alta sensibilidad de una o varias secuencias específicas de ácidos nucleicos.

Otra aplicación del método de la invención es la detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos "in situ", por ejemplo la PRINS o la FISH.

Con el PRINS (marcado "in situ" con cebador, Primed In Situ Labeling) se fusiona un oligonucleótido sintético no marcado con una secuencia deseada de cromosomas desnaturalizados en brotes metafase o en núcleos interfase de cursores microscópicos. El oligonucleótido hibridado sirve como cebador que puede prolongarse con una DNA-polimerasa termoestable que incorpore "in situ" nucleótidos marcados en alta densidad un DNA recién sintetizado. En función del o de los marcadores, el DNA recién sintetizado podrá detectarse por varios métodos, p.ej. por detección directa por anticuerpo anti-DIG conjugado con fluorcromo (si se incorpora el DIG-dUTP) o por detección directa con el microscopio de fluorescencia (para detectar p.ej. el rodamina-dUTP incorporado).

En las técnicas de hibridación "in situ" de fluorescencia (FISH) se emplean sondas de DNA marcadas con fluorescencia, que pueden crearse con los métodos de la invención. La FISH puede utilizarse p.ej. para detectar ciertas secuencias dentro de cromosomas enteros, para detectar especies de mRNA o para detectar RNA víricos. Puede lograrse un marcado de alta densidad con el método de esta invención que permita el uso de sondas más cortas, que puedan difundirse hacia el interior de una matriz densa de células o de cromosomas, con mayor facilidad y sin perder sensibilidad. La admisión de un amplio espectro de nucleótidos marcados en el método de la invención ofrece una mayor flexibilidad en el momento de elegir la secuencia de la sonda y de efectuar un marcado múltiple. Además, aumenta la sensibilidad y la probabilidad de detectar especies de mRNA raras.

Leyendas de las figuras

Figura 1a: sistemas de molde/cebador Nuc.

Figura 1b: cassettes 1-10 de sistemas molde/cebador.

Figura 1c: incorporación del hexinil-7-desaza-dATP y del hexinil-7-desaza-dGTP.

Pistas 1-6: reacciones de control con 0,1 unidades de Taq-polimerasa por reacción. Pista 1: solamente cebador y tampón; pista 2: molde 17, mezcla reaccionante completa, los 4 dNTP; pista 3: igual que la pista 2, pero solamente dTAP; pista 4: molde 16, mezcla reaccionante completa, solamente dGTP; pista 5: como la pista 4, pero con los 4 dNTP; pista 6: mezcla reaccionante completa, sin molde; pistas 7-8: molde 17, 0,1 unidad de polimerasa, con hexil-7-desaza-dATP 5 y 50 \muM, respectivamente; pistas 9-10: molde 16, 0,1 unidad de polimerasa, con hexil-7-desaza-dGTP 5 y 50 \muM, respectivamente; pistas 11-14: igual que las pistas 7-10, pero con 1 unidad de polimerasa; pistas 15-17: molde 8, 0,1 unidad de polimerasa, hexinil-7-desaza-dATP de nucleótido derivatizado 5 \muM (pista 15), hexinil-7-desaza-dATP y hexinil-7-desaza-dGTP (pista (16), hexinil-7-desaza-dATP, hexinil-7-desaza-dGTP y rosamina-dCTP (pista 17); pistas 18-20: igual que las pistas 15-17, pero con dNTP 50 \muM; pistas 21-26: igual que las pistas 15-20, pero con 1 unidad de polimerasa; pistas 27-34: molde 3; pista 27: hexinil-7-desaza-dGTP (10 \muM), 0,1 unidad de polimerasa; pista 28: hexinil-7-desaza-dGTP y biotina-dUGTP (50 \muM en cada caso), 0,1 unidad de polimerasa; pistas 29-30: igual que la pistas 27-28, pero con 1 unidad de polimerasa; pistas 31-32: hexinil-7-desaza-dGTP y fluoresceína-12-dUTP (50 \muM en cada caso), 0,1 y 1 unidad de polimerasa, respectivamente; pistas 33-34: hexinil-7-desaza-dGTP y AMCA-6-dUTP (50 \muM, en cada caso), 0,1 y 1 unidad de polimerasa, respectivamente.

Compuesto A: hexinil-7-desaza-dATP; B: hexinil-7-desaza-dGTP; C: rosamina-dCTP; D: biotina-16-dUTP; E: fluoresceína-12-dUTP; F: AMCA-6-dUTP.

Figura 3: incorporación del verde rodamina-dUTP mediante la polimerasa Tgo exo^{-}.

Incorporaciones múltiples de verde-ro y verde-ro-X-dUTP en posiciones adyacentes y comparación de las longitudes del engarce (linker) en la actividad del sustrato.

Pistas 1-6: reacciones de control. Pista 1: solamente cebador marcado con Dig (22-mero) y tampón; pista 2: solamente cebador marcado con Dig (20-mero) y tampón; pista 3: molde/cebador (28 incorporaciones posibles), Taq-polimerasa y 4 dNTP regulares; pista 4: molde/cebador (12 inserciones posibles), Taq-polimerasa y 4 dNTP regulares; pista 5: molde/ cebador (es posible la inserción 18 veces de dTTP o dUTP), Taq-polimerasa y 4 dNTP regulares; pista 6: como la pista 1; pistas 7-14: reacciones con 0,1 unidades de polimerasa Tgo exo^{-}; pistas 7-10: verde rodamina-dUTP; pistas 11-14: verde rodamina-X-dUTP; pista 7: molde Nuc T4, verde rodamina-dUTP 5 \muM; pista 8: molde Nuc T4, verde rodamina-dUTP,dATP,dGTP 50 \muM; pista 9: molde Nuc T15, verde rodamina-dUTP 5 \muM; pista 10: molde Nuc T15, verde rodamina-dUTP 50 \muM; pista 11: molde Nuc T4, verde rodamina-X-dUTP 5 \muM; pista 12: molde Nuc T4, verde rodamina-X-dUTP,dATP,dGTP 50 \muM; pista 13: molde Nuc T15, verde rodamina-X-dUTP 5 \muM; pista 14: molde Nuc T15, verde rodamina-X-dUTP 50 \muM; pistas 15-22: como las pistas 7-14, pero 1 u. de polimerasa; pistas 23-30: como las pistas 15-22, pero con un tiempo de reacción de 60 min.

Figura 4: incorporación de diferentes derivados de U con intervención de diferentes polimerasas.

Se incorporan eficazmente diferentes derivados de U por acción de diferentes polimerasas en posiciones adyacentes del molde NucT15.

Pista 1-6: reacciones de control. Pista 1: solamente cebador y tampón. Las pistas 2-6 contienen 0,1 unidades de Taq-polimerasa por reacción. Pista 2: dATP 13,5 \muM; pista 3: dGTP 12,5 \muM; las pistas 4 y 5 son idénticas, con dNTP natural 12,5 \muM en cada una; pista 6: como las pistas 4 ó 5, sin molde; todas las demás reacciones de marcado se realizan únicamente con el trifosfato de nucleósido marcado que se indica. Pistas 7-10: incorporación de tetrametilrodamina con polimerasa Vent exo^{-}. Pista 7: TMR-dUTP 5 \muM y 0,1 unidades de polimerasa; pista 8: TMR-dUTP 50 \muM y 0,1 unidades de polimerasa; pistas 9 y 10: como las 7 y 8, pero con 1 unidad de polimerasa. Pistas 11-14: como las pistas 7-10, pero con Cy5-dUTP; pistas 15-18: incorporación de fluoresceína-dUTP con el fragmento de polimerasa Chy de Klenow. Las pistas 15 y 16: 0,1 unidades de polimerasa con fluoresceína-dUTP 5 \muM y 50 \muM, respectivamente; pistas 17-18: como las pistas 15 y 16, pero con 1 unidad de polimerasa; pistas 19-22: como las pistas 15-19 con AMCA-dUTP como sustrato; pistas 23-24: incorporación con polimerasa Tgo exo^{-}; pistas 23-26: como las pistas 15-19 con fluoresceína-dUTP como sustrato; pistas 27-30: como las pistas 15-17 con biotina-dUTP como sustrato; pistas 31-34: como las pistas 15-17 con digoxigenina-dUTP como sustrato.

Figura 5: incorporación de Cy5-dUTP con diferentes longitudes de espaciador por acción de polimerasas de tipo A

Comparación de la eficacia de incorporación de Cy5-dUTP con diferentes longitudes de engarce con polimerasas de tipo A.

Pistas 1-5: reacciones de control. Pistas 1 y 2: sin polimerasa; pista 1: además sin molde; pistas 3 y 4: mezcla reaccionante completa con 4 dNTP y molde Nuc T4; pista 5: mezcla reaccionante completa, sin molde; pistas 6-20: Taq-polimerasa; pistas 6-14: molde Nuc T4; pistas 15-20: molde T15; pistas 6-8: Cy5-dUTP con espaciador de 17 átomos; pista 6: Cy5-dUTP 5 \muM; pista 7: Cy5-dUTP 50 \muM; pista 8: Cy5-dUTP 50 \muM más dATP y dGTP 12,5 \muM; pistas 9-11: como las pistas 6-8, pero con Cy5-dUTP con espaciador de 24 átomos; pistas 12-14: como las pistas 6-8, pero con Cy5-dUTP con espaciador de 38 átomos; pistas 15 y 16: molde Nuc T15, con espaciador Cy5-dUTP 5 y 50 \muM, respectivamente; pistas 17 y 18: como las pistas 15 y 16, con un espaciador de 24 átomos Cy5-dUTP 5 y 50 \muM, respectivamente; pistas 19 y 20: como las pistas 15 y 16, con un espaciador Cy5-dUTP de 38 átomos 5 y 50 \muM, respectivamente; pistas 21-34: como las pistas 6-20, pero con polimerasa Chy de Klenow en lugar de la Taq-polimerasa.

Figura 6: incorporación de Cy5-dUTP y MR121-dUTP con diferentes longitudes de espaciador por acción de polimerasa exo^{-} de tipo B.

Comparación de la eficacia de incorporación de Cy5-dUTP y MR121-dUTP con diferentes longitudes de engarce por acción de polimerasas de tipo B.

Pistas 1-5: reacciones de control con 0,1 unidades de Taq-pol. Pista 1: cebador solo; pista 2: molde/cebador, sin nucleótidos; pista 3: mezcla reaccionante completa; pista 4: como la pista 3, sin pol; pista 5: como la pista 3, sin pol; pistas 6-8: Cy5-dUTP con espaciador de 17 átomos; pista 6: Cy5-dUTP 5 \muM; pista 7: Cy5-dUTP 50 \muM; pista 8: Cy5-dUTP 50 \muM más dATP y dGTP; pistas 9-11: como las pistas 6-8, pero Cy5-dUTP con espaciador de 24 átomos; pistas 12-14: como las pistas 6-8, pero Cy5-dUTP con espaciador de 38 átomos; pistas 15-23: como las pistas 6-14, pero MR121-dUTP con una longitud de espaciador de 8, 13 y 14 átomos en lugar del Cy5-dUTP; pistas 24-35: molde Nuc T15; pista 24: Cy5-dUTP 5 \muM con espaciador de 17 átomos; pista 25: Cy5-dUTP 50 \muM con espaciador de 17 átomos; pistas 26-27: como las pistas 24-25, pero con Cy5-dUTP con espaciador de 24 átomos; pistas 28-29: como las pistas 24-25, pero Cy5-dUTP con espaciador de 38 átomos; pistas 30-35: como las pistas 24-29, pero MR121-dUTP con longitud de engarce de 8, 13 y 24 átomos en lugar del Cy5-dUTP.

Figura 6a: escaneo de fluorescencia del cromatograma (blot) de la figura 6 antes de la detección por quimiolumiscencia.

El escaneo abarca las pistas 6-23 de la figura 6 y se analiza antes de la detección inmunológica del cebador marcado con digoxigenina, porque se observa que el procedimiento de bloqueo interfiere en el análisis de fluorescencia. Pista 1-9: incorporación de Cy5-dUTP en molde Nuc T4 por acción de la polimerasa Tgo exo^{-}. Pistas 1-3: espaciador de 17 átomos; pistas 4-6: espaciador de 24 átomos; pistas 7-9: espaciador de 38 átomos. Incorporación de MR121-dUTP al molde T4 por la polimerasa Tgo exo^{-}. Pistas 10-12: MR121-8-dUTP; pistas 13-15: MR121-13-dUTP; pistas 16-18: MR121-24-dUTP.

Figura 7: reemplazo total de los cuatro trifosfatos de desoxinucleósidos por dNTP derivatizados.

Las polimerasas empleadas son la Vent exo^{-} y la Tgo exo^{-} para las reacciones de marcado (pistas 7-36) y Taq-pol para las reacciones de control (pistas 1-6). Los derivados empleados son: A: hexinil-7-desaza-dGTP (5 \muM y 50 \muM, según se indica) en lugar del dGTP. B: rosamina-dCTP (5 \muM y 50 \muM, según se indica) en lugar del dCTP. C: hexinil-7-desaza-dATP (5 \muM y 50 \muM, según se indica) en lugar del dATP. D: biotina-16-dUTP (5 \muM y 50 \muM, según se indica) en lugar del dTTP. E: dCTP, sin marcador, en las reacciones 34-36 como control.

Figura 8: síntesis de una hebra de DNA que contiene los cuatro trifosfatos de desoxinucleótido derivatizados de diferente manera.

Documentación de la síntesis de un DNA de una secuencia deseada de 40 nucleótidos en la que todos los dNTP se han reemplazado por nucleótidos derivatizados.

Pistas 1-4: reacciones de control; pista 1: cebador solo; pistas 2-3: mezcla reaccionante completa con 0,1 unidades de Taq-polimerasa y dNTP naturales 12,5 \mul en cada caso; pista 4: como la pista 1; pistas 5-14: reacciones de marcado con polimerasa Tgo exo^{-} (0,1 unidades por reacción) cass I en pista 5, cass 2 en pista 6, cass 3 en pista 7, cass 4 en pista 8, cass 5 en pista 9, cass 6 en pista 10, cass 7 en pista 11, cass 8 en pista 12, cass 9 en pista 13 y cass 10 en pista 14 como moldes; los derivados (50 \muM en cada caso) son: amino-pentinil-7-desaza-dATP en lugar del dATP; hexinil-7-desaza-dGTP en lugar del dGTP; dogoxigenina-dCTP en lugar del dCTP y biotina-16-dUTP en lugar del dTTP; tiempo de reacción: 30 min; pistas 15-24: igual que las pistas 5-14, pero con un tiempo de reacción de 60 min.

Figura 8a: ln de la distancia de migración de los productos separados de la figura 8.

Figura 9: generación de un fragmento de 264 pares de bases (bp) por PCR con sustitución completa del dTTP por biotina-16-dUTP.

Incorporación de nucleótidos modificados en PCR (sustitución completa).

Las pistas marcadas con M son pistas de marcador. Pista A: reacción de control con dNTP naturales; pista B: fragmento de 264 bp con dTTP completamente reemplazado por biotina-16-dUTP; pista C: productos de 264 bp con dNTP natural empleando el producto de la pista B escindido y purificado como molde (reversión); pista d: como la pista C, pero el dTTP sustituido por completo por biotina-16-dUTP; pista K: como la pista A (control); pistas E-J: como la pista C, pero con una dilución en serie (10 veces) del molde añadido (valoración del molde).

Figura 10-14: Fórmulas de los derivados empleados.

Figura 15: Lista de derivados nucleósidos empleados.

Ejemplo 1 Síntesis de derivados 7-desazapurina-2'-desoxinucleósido-5-trifosfato Generalidades

Cromatografía de capa fina (CCF): láminas de aluminio para CCF recubiertas con gel de sílice 60 F_{254} (0,2 mm, Merck, Alemania). La HPLC en fase inversa se lleva a cabo en una columna LiChrosorb 4x250 mm RP-18 (10 \mum) (Merck) con una bomba HPLC de tipo Merck-Hitachi (modelo 655 A-12) conectada a un monitor de longitud de onda variable (modelo 655-A), un controlador (modelo L-5000) y un integrador (modelo D-2000). La espectroscopía RMN-P^{31} se lleva a cabo en un espectrómetro RMN del tipo Bruker AC-250. La electroforesis a través de gel de poliacrilamida desnaturalizada del 12,5% (Sequagel/National Diagnostics) se lleva a cabo en un secuenciador DS91 (Biometra, Alemania) conectado a una fuente de alimentación eléctrica PS 2500 DC (Hoefer Scientific Instruments, EE.UU.) y un termostato Lauda MGW (Lauda, Alemania) o un gel de secuenciación LKB Macrophor de Pharmacia con una fuente de alimentación ECPS 3000/150 (Pharmacia/LKB) conectada a un termostato Haake D1.

La electroforesis a través de gel de desnaturalización preparativa para la purificación del cebador se lleva a cabo con geles de placa vertical de acrilamida/urea del 15% (15 cm x 20 cm x 0,2 cm; Sequagel/National Diagnostics) y la electroforesis se realiza a 150-200 voltios (fuente de alimentación eléctrica para electroforesis microcomputerizada de Consort) hasta que el colorante de azul de bromofenol alcance el ánodo del tanque de tampón. La espectroscopía RMN-P^{31} se lleva a cabo en un espectrómero RMN del tipo AC-250 de Bruker.

Síntesis de los 5'-monofosfatos

Se disuelve 1,0 mmol de nucleósidos modificados en fosfato de trimetilo (5 ml) en atmósfera de argón. Se enfría con un baño de hielo, se le añade POCl_{3} recién destilado (180 \mul) y se mantiene la mezcla reaccionante a 4ºC durante varias horas. (Se controla por CCF después de hidrolizar una pequeña porción con tampón TEAB en i-propanol/H_{2}O/NH_{3} (3/1/1) o (7/1/1)). Una vez ha finalizado la reacción se añade la solución por goteo al tampón TEAB (200 ml), al tiempo que se enfría. Se concentra por evaporación, se disuelve el residuo en H_{2}O y se aplica a una columna DE 52 Cellulose (Whatman) (20 x 3 cm). Se lava con H_{2}O y se realiza la purificación con un gradiente de H_{2}O y tampón TEAB 1 M. El 5'-monofosfato se eluye de la columna en una concentración de TEAB de 0,3 a 0,4 M.

Se liofiliza el producto y se caracteriza por RMN-P^{31}.

Síntesis de 5'-trifosfatos

Se disuelve o suspende el 5'-monofosfato en DMF p.a. (11 ml) y se trata con una solución de 1,1'-carbonildiimidazol (0,5 mmoles, 80 mg) en DMF (1 ml). Se agita la mezcla en un recipiente bien sellado durante 30 min y se mantiene en un desecador con flujo argón a t.a. durante una noche. Se añade metanol (33 \mul) en atmósfera de argón y después de 30 min a t.a. se añade con agitación el pirofosfato de mono(tri-n-butilamonio) (0,5 mmoles, 0,1816 g) en DMF p.a. (5 ml). Se mantiene la mezcla reaccionante en un desecador con flujo de argón durante una noche, formándose un precipitado. Se separa el líquido sobrenadante, se lava el precipitado 4 veces con 1 ml de DMF cada vez y se centrifuga. Se reúnen los lavados, se concentran por evaporación, se disuelven en H_{2}O y se aplican a una columna de DE 52 Cellulose (20 x 3 cm). Se lava con H_{2}O y se realiza la purificación con un gradiente de H_{2}O y tampón TEAB 1 M. El producto deseado se eluye de la columna en una concentración de TEAB entre 0,2 y 0,4 M. Se seca el 5'-trifosfato por liofilización y se caracteriza por RMN-P^{31}.

Desprotección del grupo amino de los compuestos protegidos con trifluoracetilo

Se disuelve el 5-trifosfato de 7-trifluoracetilaminopentinil-7-desazapurina-2'-desoxinucleósido en H_{2}O (12,5 ml) y se trata con amoníaco conc. (12,5 ml) con agitación durante 3,5 h. Se agita la solución con el vacío de un aspirador durante 2 h para eliminar el amoníaco y se liofiliza. Se disuelve el residuo en TEAB 0,1 M (10 ml, pH 7,8) y se aplica a una columna de DE 52 Cellulose (20 x 3 cm). Se eluye la columna con un gradiente de TEAB 0,1 M (11) a 1,0 M (11). Se concentra por evaporación la fracción de la zona principal, se co-evapora con metanol y se liofiliza.

TABLA 1 Rendimiento y datos RMN-P de los 5'-mono- y -trifosfato de 7-desaza-2'-desoxiadenosina y -guanosina sustituidas en posición 7

compuesto	rendimiento [%]	RMN-P^{31} ppm (J [Hz])
Hex^{7}c^{7}A_{d} 5'-MP	61	3,99
Hex^{7}c^{7}A_{d} 5'-TP	10	-21,30 (t, 19,97), -10,26 (d, 19,31), -6,28 (d, 20,66)
NH_{2}Pen^{7}c^{7}A_{d} 5'-MP^{a)}	20	4,09
NH_{2}Pen^{7}c^{7}A_{d} 5'-TP	35^{b)}	-21,25 (t, 20,08), -10,30 (d, 19,88), -6,16 (d, 19,33)
Hex^{7}c^{7}G_{d} 5'-MP	20	3,65
Hex^{7}c^{7}G_{d} 5'-TP	87	-21,34 (t, 19,23), -10,25 (d, 19,41), -6,40 (d, 20,51)
NH_{2}Pen^{7}c^{7}G_{d} 5'-MP^{a}	10	4,11
NH_{2}Pen^{7}c^{7}G_{d} 5'-TP	20^{b}	-21,00 (t, 19,24), -10,20 (d, 19,21), -5,65 (d, 19,28)
a) protegido con un grupo trifluoracetilo;
b) después de la desprotección del grupo amino.

Ejemplo 2 Síntesis y purificación de moldes oligonucleótidos

La síntesis en fase sólida de oligonucleótidos se lleva a cabo a escala 1 \mumolar en un sintetizador automático de DNA (Applied Biosystems, ABI 392-08) utilizando la química de las fosforamiditas. Las fosforamiditas de dG, dA, dC y T y las columnas de CPG se adquieren a PerSeptive Biosystems GmbH (Alemania). Se utiliza el Aminolink II (Applied Biosystems, solución 100 mM en CH_{3}CN) para el posterior marcado en 5' del cebador. Todos los oligonucleótidos se sintetizan mediante una síntesis de tritilón y posterior separación del soporte y desprotección con amoníaco (del 25%, 60ºC, 18 h).

La purificación de las hebras del molde se realiza empleando una columna OPC (cartucho de purificación de oligonucleótidos) (ABI Masterpiece, Applied Biosystems, Alemania) con arreglo a las instrucciones de purificación que se indican. Los oligonucleótidos se purifican a continuación por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida (PAGE) a través de un gel del 15% en presencia de urea 7 M y se visualizan por sombreado UV con PSC 60 F_{254+366} (placas para la cromatografía de capa fina 5637 de Merck), se cortan las bandas de producto de longitud deseada y se eluyen del gel con acetato amónico 0,5 M, EDTA 1 mM, SDS del 0,1%. Se concentran los oligonucleótidos resultantes y se desalinizan empleando un cartucho OPC o se precipitan con etanol y se diluyen en un volumen apropiado de agua. El último paso resulta ser de una importancia crucial, porque los moldes oligonucleótidos más cortos (debido a errores de adición) podrían simular paros de la síntesis y de este modo impedirían la evaluación apropiada de los datos aquí presentados. Se liofilizan los oligonucleótidos purificados en un evaporador Speed-Vac, obteniéndose sólidos incoloros que se disuelven en 100 \mul de H_{2}O y se almacenan congelados a -18ºC.

Ejemplo 3 Marcado y purificación del cebador

Después de la desprotección de los oligonucleótidos se elimina el amoníaco por evaporación y se desaliniza por precipitación con etanol. Se disuelven 20 unidades A_{260} de oligonucleótido en 200 \mul de una solución 100 mM de borato sódico (pH 8,5) y se tratan con una solución recién preparada de 350 mg de DIG-NHS en 200 \mul de etanol. Se mantiene la reacción en un agitador a temperatura ambiente durante una noche, se concentra y se disuelve el líquido residual en 1 ml de H_{2}O. Se filtra la solución en un filtro de 0,45 \mum, se somete a HPLC en fase inversa utilizando el gradiente siguiente: 20 min 100% de Et_{3}NHOAc 0,1 M (pH 7,0) (A), 20-50 min 0-40% de CH_{3}CN en A. El oligonucleótido sin marcar se eluye en una concentración de CH_{3}CN de aprox. el 20%, el oligonucleótido marcado con DIG aprox. en una concentración del 30% de CH_{3}CN. El cebador marcado con DIG se desaliniza y se purifica a través de gel del modo descrito anteriormente.

Ejemplo 4 Incorporación de derivados 7-desaza-2'-desoxiadenosina y -guanosina sustituidos en posición 7

En la figura 2 se analiza la incorporación de derivados 7-desaza-2'-desoxiadenosina y -guanosina sustituidos en posición 7 con otros nucleótidos derivatizados por acción de la polimerasa Tgo exo^{-}. Para tal fin se emplean moldes oligos NucT17, T16, T8 y T3. Esto permite hacer el seguimiento de la incorporación más eficaz de los respectivos trifosfatos hasta un total de 18 posiciones adyacentes y posterior elongación con otros trifosfatos de desoxinucleósidos modificados.

Según las reglas de apareamiento de bases el derivado 2'-desoxiadenosina (50 \muM) se incorpora a 15 posiciones adyacentes empleando el molde NucT17 (pistas 7-8) y el derivado 2'-desoxiguanosina podría polimerizarse hasta en un total de 21 posiciones subsiguientes empleando el molde NucT16 (fig. 2, pistas 9-10). En las pistas 15-34 se analiza la posterior elongación de los compuestos 7-desaza con otros trifosfatos de desoxinucleósido derivatizados. Se elige el Nuc T8 para demostrar el éxito de la adición del Hex^{7}c^{7}G_{d} en una pista que consta de tres Hex^{7}c^{7}A_{d} consecutivos y de la posterior elongación con rosamina-dCTP. Las pistas 15, 18, 21 y 24 demuestran que los productos de reacción con el Hex^{7}c^{7}A_{d} son los únicos trifosfatos de desoxinucleótidos presentes en la mezcla reaccionante. En función de la cantidad de polimerasa y de la concentración del nucleótido, la polimerasa adiciona los dNTP, como era de esperar, pero los productos superan la longitud instruida del molde en tres Hex^{7}c^{7}A_{d} (en caso de un paso de polimerización y, en menor medida, dos pasos), lo cual indica que la polimerasa incorpora hasta dos Hex^{7}c^{7}A_{d} opuestos mal apareados al C del molde, que es un fenómeno que se observa a menudo en un banco de trifosfatos de nucleósidos extremadamente biesado.

Las pistas 16, 19, 22 y 25 indican la desaparición de las bandas esperadas y no esperadas de las reacciones previas (véase antes) y la acumulación de material de peso molecular mayor, cuando las mezclas reaccionantes contienen Hex^{7}c^{7}G_{d} adicional. Una estimación, contando los paros intermedios de las pistas 16 y 22, indica que con arreglo a la instrucción del molde 9 hay incorporaciones detectables. En las mezclas reaccionantes que contienen 50 \muM del respectivo derivado (pistas 19 y 25), casi no se observan paros y se presenta una banda homogénea.

La posterior adición de rosamina-dCTP a Hex^{7}c^{7}A_{d} y Hex^{7}c^{7}G_{d} en las reacciones 17, 20, 23 y 26 da lugar de nuevo en todas las reacciones a una elongación adicional del producto final de las reacciones previas. En el caso de la pista 23 (1 u de polimerasa) se pueden detectar las tres incorporación consecutivas esperadas del rosamina-dCTP. Esto significa que se ha formado de forma consecutiva un tramo de DNA que contiene 12 nucleótidos derivatizados.

Las pistas 27-34 muestran los resultados de ensayos similares empleando el molde NucT3. En este caso se observan cinco (instruidas por el molde) y seis incorporaciones (un paso adicional de polimerización, debido al banco biesado de nucleótidos) consecutivas de Hex^{7}c^{7}G_{d}. Cuando se añade biotina-16-dUTP a la mezcla reaccionante (pistas 28 y 30), desaparecen los paros y se forma un producto de peso molecular más elevado, que supera el peso molecular del obtenido en la reacción 23 (nueve Hex^{7}c^{7}A_{d}, Hex^{7}c^{7}G_{d} más tres rosamina-dC), lo cual indica que también se ha insertado la base terminal (indicada con flechas). Las pistas 31-34 muestran las reacciones en las que la biotina-16-dUTP se ha reemplazado por derivados con longitudes de engarce decrecientes (es decir, fluoresceína-12-dUTP, pistas 31, 32 y AMCA-6-dUTP, pistas 33, 34). En este caso puede deducirse una elongación completa, ya que no se detectan pausas ni paros significativos.

En concentraciones más elevadas de polimerasa se observan más de 30 inserciones (pista 14). Esto puede ser debido a un mecanismo de nueva formación de bucle de la hebra del cebador alargado y la rehibridación a temperaturas elevadas. Una reacción de control con Taq-polimerasa y dNTP naturales revela 22 inserciones con el NucT16 (pistas 4 y 5). El fragmento de Klenow es capaz de sintetizar hasta 19 dNTP naturales en condiciones similares con el NucT15, pero a 37ºC (no se presentan los datos).

Con esta configuración experimental se puede demostrar que las hebras de DNA que contienen Hex^{7}c^{7}A_{d} y Hex^{7}c^{7}G_{d} pueden alargarse fácilmente con otros dNTP derivatizados, proporcionando productos de longitud completa.

Ejemplo 5 Incorporación de verde rodamina-dUTP y verde rodamina-X-dUTP por acción de polimerasa Tgo exo^{-}

En este ensayo se examina la incorporación y elongación de dos derivados de verde rodamina con trifosfatos de desoxinucleósidos naturales. La reacción se cataliza con polimerasa Tgo exo^{-} en presencia de un 0,05% de Tritón X-100, que en un ensayo aparte (datos no representados) se observó que mejoraba la eficacia de la incorporación. Los dos conjugados de nucleótido difieren en su compuesto espaciador. El verde rodamina-dUTP (verde-rodamina-5(6)-carboxiamido-[5'-trifosfato de 5-(3-aminoalil)-2'-desoxi-uridina]) tiene un grupo espaciador de 5 átomos y la rodamina-X-dUTP (verde-rodamina-5-(6)carboxiamido-\varepsilon-aminocaproil-[5'-trifosfato de 5-(3-aminoalil)-2'-desoxi-uridina]) tiene un espaciador de 12 átomos entre el compuesto desoxinucleósido y la molécula de fluoróforo.

En la figura 3 se representa que los dos compuestos se incorporan con eficacia. Las diferencias de peso entre estos dos compuestos se indican con flechas entre las pistas 7 y 11 y las pistas 15 y 19, respectivamente. Se observa que con el molde NucT14, la polimerización se detiene después de 4 inserciones (pistas 7, 11, 15, 19, 23, 27). En la posición 5 se pueden detectar algunas falsas incorporaciones de menor importancia, en las que la secuencia de molde es un resto timidina (pistas 11, 19, 27). Aparte de esta falsa incorporación no se detecta ninguna elongación más. El paro principal en posición 4 puede superarse cuando se añade a la mezcla reaccionante dATP y dGTP. Se forma un producto de peso molecular más alto con ambos derivados (pistas 8, 12, 16, 20, 24 y 28). Pero con este molde sigue habiendo ambigüedad sobre si se forma un producto de longitud completa (12 inserciones, 9 de las cuales son del derivado). Los datos obtenidos favorecerían la interpretación de que la polimerasa se detiene en la posición 11 y que el último derivado se añade únicamente de forma pobra en la posición 12. No se detectan diferencias importantes entre el uso de 0,1 unidades de polimerasa y de 1 unidad, o entre un tiempo de reacción de 30 min y otro de 60 min. Únicamente aumenta la cantidad de producto de longitud completa cuando se emplean tiempo de incubación largos y más polimerasa.

En el caso del molde NucT14 (son posibles 18 inserciones subsiguientes), se inserta el derivado con el brazo de engarce corto en las posiciones adyacentes 15-16 (véase las pistas 25 y 26). Por otro lado, el verde rodamina-X-dUTP se polimeriza hasta en 18 posiciones, con productos principales de 13-17 inserciones (pista 30). Los paros por debajo de ello solamente se detectan después de una sobreexposición de la película, lo cual indica que este nucleótido es un sustrato muy bueno para la polimerasa y que no conduce a síntesis abortivas de DNA. Se supone además que la longitud del engarce puede tener alguna influencia en la aceptación del sustrato por parte de la polimerasa. En este caso cabe suponer que los compuestos de engarce más largo dan lugar a una mejor aceptación del sustrato. Esto se documenta no solo con la posibilidad de la polimerasa de insertar hasta 18 nucleótidos del verde rodamina-X-dUTP en lugar de 16 de verde rodamina-dUTP, sino también con la comparación de las pistas 7, 15 y 22 con las pistas 11, 19 y 27. En el caso del verde rodamina-X-dUTP no se detectan paros hasta la inserción del cuarto nucleótido, mientras que pueden detectarse ya paros después de la incorporación de 2 ó 3 nucleótidos con el verde rodamina-dUTP.

Ejemplo 6 Incorporación de diferentes derivados U por acción de diferentes polimerasas

En este ejemplo se analiza la capacidad de diferentes tipos de polimerasas para incorporar diferentes nucleótidos marcados con grupos informantes (reporter). Las polimerasas empleadas son dos polimerasas muy afines de tipo B de diferentes especies de Thermococcus (variantes 3'-5' menos) y una forma genéticamente acortada (fragmento de Klenow, al que le falta la actividad de 5'-3'-nucleasa) de un tipo de polimerasa A del Carboxydothermus hydrogenoformans. Los ensayos efectuados para ello emplean un molde que contiene 18 restos adenina, empezando por el extremo del cebador 3', que permite a la polimerasa incorporar 18 de los nucleótidos variantes en posiciones contiguas. Las reacciones se llevan a cabo con nucleótidos modificados 5 \muM y 50 \muM (concentración final) y 0,1 y 1 unidad de polimerasa, respectivamente. Al tampón de reacción (Tris-HCl 50 mM, pH 8,5 a 20ºC, KCl 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 15 mM, MgSO_{4} 7 mM y 2-mercaptoetanol 10 mM, empleado para cada polimerasa) se le añade un 0,01% (vol/vol) de Tritón® X-100 para mejorar la incorporación.

En la figura 4 se representa que los derivados TM-rodamina-dUTP, Cy5-10-dUTP, fluoresceína-12-dUTP y AMCA-6-dUTP en concentraciones elevadas de polimerasa (1 unidad/reacción) se sintetizan productos más largos que con 0,1 unidades/reacción (pistas 7, 8; 11, 12; 14, 16; 19, 20; comparadas con las pistas 9, 10; 13, 14; 17, 18 y 21, 22, respectivamente). En las reacciones con fluoresceína-12-dUTP, biotina-16-dUTP o Dig-11-dUTP y polimerasa Tgo exo^{-}, incluso con concentraciones bajas de polimerasa (0,1 unidades/reacción) se detectan productos de longitud completa (pistas 28 y 31).

En el caso del AMCA-6-dUTP (pistas 19-22) y Dig-11-dUTP (pistas 31-34) no se pudo determinar exactamente la cantidad de nucleótidos virtualmente incorporados. Esto es debido a la falta de paros durante la síntesis en condiciones de reacción por lo demás subóptimas (dNTP modificado 5 \muM; 0,1 unidades de polimerasa). Esto indica una gran actividad de sustrato de estos compuestos y una superior capacidad de incorporación si se compara con otros derivados (p.ej. el Cy5-10-dUTP).

Las distancias de migración entre el cebador no alargado y los diferentes productos formados varían sustancialmente entre los derivados correspondientes y los controles con dNTP naturales (p.ej. pistas 4 y 5). Esto representa en mayor medida los pesos moleculares diferentes de los derivados (nótese que el AMCA-dUTP tiene una molécula relativamente pequeña (PM: 748,1 Da) si se compara con el Dig-11-dUTP (PM: 1090,7 Da), lo cual explicaría la mayor movilidad de los productos de longitud completa en la electroforesis de desnaturalización a través de gel). El TM-rodamina-dUTP y el Cy5-10-dUTP se insertan en 14 y 13 posiciones, respectivamente, por acción de la polimerasa Vent exo^{-}, con cantidades mayores de productos que tienen entre 10 y 13 incorporaciones para la TM-rodamina (pistas 9, 10) y 11 y 12 incorporaciones para el Cy5-10-dUTP (pista 14). Los parámetros de reacción subóptimos (dNTP 5 \muM, 0,1 unidades de polimerasa) se eligen para facilitar la interpretación del modelo de bandas de los productos intermedios de la reacción (calibrado), con el fin de documentar si tiene lugar la síntesis de longitud completa (ver pista 27). El biotina-16-dUTP se incorpora a todas las posiciones posibles por acción de la polimerasa Tgo exo^{-}. En la pista 27 se representan los paros de síntesis en concentraciones bajas de polimerasa y de nucleótido desde la posición 1 a 10 (11, difícilmente visible en la película original), permitiendo una determinación correcta de los 18 nucleótidos incorporados en la pista 30. La división de banda observada en cada paso de incorporación es debida probablemente a la existencia de estereoisómeros que surgen de la obtención de la biotina-16-dUTP (Muehlegger, comunicación personal).

En este ejemplo se verifica que las polimerasas tanto de tipo A como B son capaces de sintetizar tramos largos de nucleótidos derivatizados en posiciones adyacentes, empleando concentraciones altas de magnesio (7 mM) y de detergente Tritón® X-100 (un 0,01% vol/vol). Todos los productos se desplazan hacia pesos moleculares más altos, si se comparan con los productos obtenidos en las reacciones de control (pistas 1-6) con trifosfatos de nucleótido regulares, debido a los pesos moleculares más altos de los compuestos incorporados. En este sistema, el AMCA-, biotina- y Dig-dUTP presentan los mejores porcentajes de incorporación, seguidos por el fluoresceína-dUTP. Si se compara la incorporación de esta última sustancia entre la polimerasa de tipo A (Chy de Klenow) y la de tipo B (Tgo exo^{-}), se podrá atribuir una mejor capacidad de incorporación a la polimerasa de tipo B obtenida por ingeniería genética (más inserciones, menos paros; véase las pistas 15-18 y 23-26). Las polimerasas de tipo B (en especial cuando se ha suprimido la función 3',5'-oxinucleasa) deberían considerarse la mejor opción como enzimas para efectuar reacciones de marcado únicamente con dNTP derivatizados. La actividad de 3',5'-oxinucleasa debe considerarse como perjudicial para la eficacia de marcado, debido a la degradación del DNA cebador y/o molde. La deleción de la actividad de la 3',5'-exonucleasa debe considerarse conveniente, ya que las formas de tipo salvaje de estas polimerasas presentan
una actividad de 3',5'-exonucleasa hasta cinco veces mayor por unidad de actividad de DNA-polimerasa [1].

Ejemplo 7 Incorporación de Cy5-dUTP con diferentes longitudes de brazo de engarce por acción de polimerasas de tipo A

En este estudio se investiga la influencia de la longitud del brazo de engarce en la incorporación por acción de diferentes polimerasas (véase además el ejemplo 5). Tal como se ha mencionado anteriormente, en el ejemplo 2, puede haber alguna influencia de la distancia entre el compuesto nucleósido y el grupo fluoróforo/detectable en la polimerización enzimática de tal compuesto. Para este estudio hemos utilizado longitudes de brazo de engarce del derivado de tipo Cy-5-dUTP de 17, 24 y 38 átomos.

Las reacciones enzimáticas se llevan a cabo con moldes NucT4 y T15, respectivamente (figura 5). Las polimerasas empleadas son las polimerasas Taq y Chy de Klenow en concentraciones de 0,1 unidades por reacción. Las concentraciones de derivado son 5 y 50 \muM para las reacciones con 50 \muM y además se añaden dATP y dGTP 12,5 \muM a un tubo de reacción extra para hacer el seguimiento de la elongación ulterior de la conseguida con los dNTP naturales (pistas 8, 11, 14, 23, 26 y 29).

En este ejemplo se comprueba que la eficacia de incorporación depende de la longitud del engarce. La Taq-polimerasa incorpora el espaciador de 17 átomos solamente dos veces, con un paro de síntesis únicamente después de una incorporación en ambos moldes (pistas 7-9 y 15, 16). No se detectan otros productos de reacción. La polimerasa Chy de Klenow presenta un máximo de inserción de tres derivados (cantidades traza de cuatro inserciones, pista 31), pero también un paro grave después de dos incorporaciones, mientras que el paro después de una inserción se reduce drásticamente (compárense las pistas 6, 7, 15 y 16 con las pistas 21, 22, 30 y 31).

El compuesto espaciador de longitud intermedia (24 átomos) se polimeriza en tres posiciones por acción de la Taq-polimerasa y en cuatro posiciones por acción de la polimerasa Chy de Klenow (molde NucT4, compárense las pistas 9-11 con las pistas 24-26). La aparición de bandas adicionales en la pista 11 puede ser debida a falsas incorporaciones de los dNTP naturales presentes en la mezcla reaccionante. Pero estas bandas intermedias no aparecen en la pista 26 cuando se emplea la polimerasa Chy. En este caso (pista (26) se observa una elongación posterior después de la polimerización instruida del molde de cuatro nucleótidos derivatizados (disminución de la banda después de cuatro incorporaciones, pero no se detecta ningún producto de longitud completa). Lo más probable es que la síntesis se detenga después de la posición 10 (producto principal) y se detecta un producto menos importante de una incorporación (adicional) falsa en la posición 11. Con el molde NucT15 pueden detectarse también acontecimientos de polimerización adicional por acción de la Taq-polimerasa (cinco) y la polimerasa Chy de Klenow (nueve) (véanse las pistas 17, 18 y 32, 33, respectivamente). No se entiende la naturaleza de las bandas intermedias que aparecen en la pista 18, puesto que faltan en las pistas 32 y 33, de modo que parece improbable la contaminación con dUTP sin fijar (que llevan solamente el espaciador unido al resto desoxinucleósido, pero no el colorante). Por lo tanto, el compuesto espaciador de longitud intermedia se incorpora a más posiciones contiguas que el compuesto corto de 17 átomos, pero todavía tiende a efectuar paros de síntesis después de 2 ó más inserciones.

Sin embargo, el espaciador de 38 átomos difiere de las dos sustancias restantes (distancia: 17 y 24 átomos) por su capacidad de incorporarse. En primer lugar, con el molde NucT4 se detectan muchos menos paros de síntesis durante las incorporaciones 1-4 con las dos polimerasas utilizadas (véanse las pistas 12-14 y 27, 29; en la pista 28 se omite obviamente la adición de la polimerasa, puesto que no se detecta elongación de ningún tipo). Sin embargo, los paros naturales de la posición 4 pueden superarse con la adición de dATP y de dGTP. En la pista 14 (Taq-polimerasa) se ve la desaparición del paro de la posición 4, seguida por la incorporación del dATP y dGTP naturales, seguida por la incorporación posterior de dos nucleótidos modificados, con un producto principal que termina en la posición 7 del molde y un producto secundario, que termina en la posición 8. En la pista 29 se pone de manifiesto que también la polimerasa Chy es capaz de alargar los cuatro Cy-5-dUMP incorporados, pero es mucho menos eficaz que si se cataliza con la Taq-polimerasa. Por otro lado, la longitud del producto es mayor con la polimerasa Chy (se documenta un total de 10 entre 12 incorporaciones).

Con el molde NucT15, la Taq-polimerasa es capaz de sintetizar tramos de 7 derivados de Cy-5-uracilo (pista 19) y 6 derivados (pista 20), con productos principales que tienen 5 y 6 incorporaciones. La Taq-polimerasa produce una ranura (slot) de paros de síntesis que no están presentes en las correspondientes reacciones con la polimerasa Chy (pistas 34 y 35). Además, esta enzima es capaz de polimerizar 8 incorporaciones, con productos principales entre 5 y 7 Cy-5-uD en línea, sin paros detectables por debajo de las 4 inserciones. Por ello puede concluirse que las longitudes del brazo espaciador son un parámetro crítico para una incorporación eficaz. En este caso la tendencia a compuestos de espaciador más largo (24 y 38 átomos) se traduce en inserciones más eficaces y menos paros de síntesis durante la polimerización. Pero existen también algunas diferencias entre las polimerasas empleadas. En este ejemplo, una forma truncada de una polimerasa de tipo A (fragmento Chy de Klenow) presenta una mejor eficacia de incorporación que la que tiene la polimerasa Taq de tipo salvaje.

Ejemplo 8 Incorporación de Cy-dUTP y MR121-dUTP con diferentes longitudes de brazo de engarce por acción de una polimerasa de tipo B

En este ejemplo se examina la incorporación de los tres derivados Cy5-dUTP del ejemplo 4 y adicionalmente tres MR121-dUTP con brazos de espaciador de 8, 13 y 24 átomos por acción de la polimerasa Tgo exo^{-} (tipo B, 0,1 uni-
dades por reacción). Los moldes empleados para examinar la polimerización son de nuevo el NucT4 y T15 (figura 6).

Utilizando el molde NucT4, sin la adición de dATP ni dGTP, la polimerización se detiene para las tres variantes de Cy-5 después de cuatro incorporaciones instruidas por el molde (pistas 6, 7, 9, 10, 12, 13). Una comparación de estas tres pistas indica también que las cuatro incorporaciones de p.ej. el compuesto más pequeño (espaciador de 17 átomos), migran a una posición del gel de unas 13 incorporaciones de nucleótidos regulares (pista 3 del control). Los compuestos Cy-5 con espaciadores más largos se desplazan relativamente hacia esta banda, debido a que sus pesos moleculares son altos. Otra característica digna de atención es que, por ejemplo en el ejemplo 4, los brazos de espaciador más cortos conducen a paros durante la síntesis después de 1, 2 y 3 incorporaciones. El espaciador de 24 átomos produce un modelo significativamente diferente. En este caso (pista 9) solamente es detectable un solo paro en la posición 3 en concentraciones bajas de trifosfato (5 \muM). Por otro lado, el derivado con espaciador de 38 átomos se incorpora sin ningún paro significativo (pistas (12-24). Todos los cebadores pueden prolongarse más después de esta cuarta posición por adición de los dATP y dGTP naturales requeridos, dando lugar a compuestos de longitud completa en el caso de los compuestos de 17 y 24 átomos. Sin embargo, el compuesto espaciador de 38 átomos solo puede incorporarse junto con los dos nucleótidos restantes hasta el décimo paso de polimerización.

El uso del molde NucT15 pone de manifiesto una tendencia similar. en cuanto a la incorporación, a la observada con el NucT4. El compuesto engarce corto se introduce hasta 10 veces en el DNA naciente, con paros importantes observados después de 2, 3 y 4 incorporaciones y un continuo de interrupciones de síntesis hasta las 10 incorporaciones (pistas 24, 25). El compuesto engarce intermedio (pistas 26, 27) presenta un paro claro después de tres incorporaciones en concentraciones bajas (subóptimas) del derivado (5 \muM, pista 26), que puede superarse con concentraciones más elevadas de trifosfato (pista 27). Con este compuesto pueden detectarse también 10 pasos de polimerización contigua, que es aproximadamente la cantidad de una vuelta de hélice de DNA-B.

Se logra una incorporación significativamente mejor con un nucleótido espaciador de 38 átomos. Este derivado se introduce en 11 posiciones de 18 posibles (pistas 28, 29), pero los paros durante la síntesis surgen en una medida mucho menor. Casi no se detectan paros en concentraciones altas (50 \muM) por debajo de las 7 incorporaciones (pista 29). Los productos principales de esta reacción se sitúan entre 8 y 10 incorporaciones.

Se observa una tendencia similar, en lo tocante a la incorporación de los tres trifosfatos de desoxinucleósidos MR121-dUTP en las pistas 15-23 y 30-35. En este caso, los brazos cortos del espaciador (8 átomos) conducen a paros de síntesis después de 2, 3 y 4 incorporaciones (pistas 15-20) con el molde NucT4 y en concentraciones bajas (5 \muM) también con el molde NucT15 (pista 30). Los dos nucleótidos que tienen las moléculas espaciadoras más largas (13 y 24 átomos) no presentan bandas de paro, pero tampoco productos homogéneos, únicamente una mancha difusa de peso molecular elevado en los geles (pistas 20-23). No son visibles bandas discretas de paro de síntesis. Por otro lado, el cebador está casi completamente consumido (compárense las pistas de control 1, 2, 4 y 5), lo cual indica que se ha prolongado por acción de la DNA-polimerasa combinada con los correspondientes nucleótidos derivatizados. Una explicación de este hecho es que probablemente los nucleótidos marcados con colorantes, recién incorporados, cambian las propiedades físico-químicas del DNA de tal manera que las moléculas resultantes ya no pueden analizarse con los métodos convencionales de análisis del DNA.

En la figura 6a se analiza una parte del cromatograma (blot) de la figura 6 (pistas 6-23) con el Storm imager (Molecular Dynamics). Se pone de manifiesto que en lo fundamental se detecta el mismo modelo de bandas, si se compara con la fig. 6. Pero aquí solo son detectables los productos que empiezan por lo menos con una molécula de colorante incorporada (pistas 1-9). Como era de esperar, el cebador marcado con Dig no alargado no produce señal. Los desoxinucleótidos marcados con MR121 dan solamente una pobre señal de fluorescencia, que encaja con los parámetros no óptimos de excitación y de emisión del MR121 en este sistema de detección. Pero, al igual que en el sistema de detección de quimioluminiscencia, tampoco en este caso se pueden analizar bandas de productos discretos para longitudes de espaciador superiores a 8 átomos (compárense las pistas 12 y 13 con las pistas 15-18).

En este ejemplo se demuestra que una polimerasa de tipo B con función 3',5'-exonucleasa mutada incorpora mejor los compuestos Cy-5-dUTP que las polimerasas de tipo A ensayadas en el ejemplo 4. La tendencia a una mejor incorporación, cuanto más largas sean las moléculas de espaciador, se verifica para las enzimas de tipo A y también las de tipo B, respectivamente. El MR121 es un colorante fluorescente muy hidrófobo que altera las propiedades del DNA después de la incorporación, de modo que estas moléculas no pueden analizarse con esta configuración experimental.

Ejemplo 9 Síntesis de un DNA con los cuatro dNTP de origen natural reemplazados por compuestos derivatizados

Este ensayo se lleva a cabo con moldes cass 1, cass 5 y cass 10 (figura 7). Las polimerasas utilizadas son la Tgo exo^{-} y Vent exo^{-} (0,1, 0,5 y 1 unidades, respectivamente). Los dNTP naturales se han reemplazado completamente por sus análogos derivatizados, excepto en las reacciones de control (pistas 1-6). Los productos de mezclas reaccionantes completas y moldes cass 1, cass 5 y cass 10 se representan en las pistas 3, 4 y 5 que corresponden a 4+1, 20+1 y 40+1 incorporaciones de nucleótidos. La adición terminal de un nucleótido "extra" es una característica habitualmente conocida de la Taq-polimerasa [2].

En las pistas 7-10 se representan los productos de reacción con el cass 1 y la polimerasa Vent exo^{-}. La mezcla reaccionante 7 (pista 7) contiene el Hex^{7}c^{7}G_{d} que es el único trifosfato de nucleósido que está presente en el ensayo. Aquí el cebador está alargado exactamente en un nucleótido, de conformidad con las reglas de apareamiento de bases (véase la figura 1b: secuencias de los cass 1-10 en materiales y métodos), no detectándose ninguna incorporación falsa. La mezcla reaccionante 8 (pista 8) contiene además el rosamina-dCTP (y ningún otro nucleótido). Se observa que se supera el paro después de la incorporación y aparece otra banda (desplazada) en el intervalo de 5-6 dNTP naturales incorporados. Esto significa que el resto Hex^{7}c^{7}G_{d} de la reacción 7 se ha alargado con un rosamina-dCTP. En la pista 9, la mezcla reaccionante contiene además de la mezcla reaccionante 8 el Hex^{7}c^{7}A_{d}. Desaparece de nuevo el paro de la reacción 8 y se alarga nuevamente con el nuevo compuesto (nótese la pequeña distancia de migración con respecto al producto de la reacción 8, que está en buena concordancia con la modificación relativamente menor del 7-desaza-dATP). Pero aquí, en lugar de una banda única claramente definida es visible un total de tres bandas, lo cual indica incorporaciones falsas, muy probablemente opuestas al resto de adenina, la última base de la secuencia del molde. En la mezcla reaccionante 10, además de los otros tres nucleótidos de la reacción 9, se añade el biotina-16-dUTP. Aquí se inserta el nucleótido correcto en sentido opuesto a A de la secuencia del molde. Se detecta también aquí la división de bandas, como consecuencia de la aparición de estereoisómeros, tal como se ha mencionado anteriormente (Mühlegger, comunicación personal). Las incorporaciones falsas se detectan solamente en pequeña medida.

En las pistas 11-14 se documentan las mismas reacciones que en las pistas 7-10, ahora catalizadas por la polimerasa Tgo exo^{-}. Una característica notable de esta enzima es la fidelidad, porque las incorporaciones falsas de la Vent exo^{-} (pista 9) no surgen con esta polimerasa (véase la pista 13). Aquí solamente es visible una banda discreta después de la adición del Hex^{7}c^{7}A_{d} a la mezcla reaccionante. Desde esta posición se fija el biotina-16-dUTP para dar lugar al producto final.

En las pistas 15-22 se representan los mismos ensayos que en las pistas 7-14, pero con el molde cass 5. Aquí se obtienen modelos de producto de reacción similares, cuando se comparan las dos polimerasas (pistas 15-18: polimerasa Vent exo^{-}; pistas 19-22: polimerasa Tgo exo^{-}). Pero los productos de las mezclas reaccionantes completas (pistas 18 y 22) no se han podido analizar correctamente en lo tocante a su longitud. Esto tampoco resulta posible cuando se emplean concentraciones más altas de nucleótidos (50 \muM) y 0,5 unidades en lugar de 0,1 unidades de polimerasa (pistas 23-26). Aquí se amplía la tendencia a falsas incorporaciones, se si compara con las reacciones con bajas concentraciones de nucleótidos y polimerasas (compárense las pistas 16, 17 con las pistas 24, 25). Especialmente en la pista y también con el cass 10 (pista 29) puede determinarse una gran cantidad de diferentes productos intermedios (compárese con la pista 13) cuando se emplea una mezcla incompleta de nucleótidos. Pero todas estas incorporaciones falsas obviamente no se forman cuando se emplea la mezcla dNTP completa (véanse las pistas 22, 26, 30), porque en este caso no están presentes los productos abortivos de la síntesis.

Cuando se toma el cass 10 como molde se sintetizan productos de reacción más largos que con el cass 5, pero no se produce un producto definido (pistas 30, 32). Se detectan diversos productos intermedios. No se obtiene información sobre si se ha alcanzado la secuencia deseada. Se observa la tendencia de la polimerasa Tgo exo^{-} a producir menos paros y productos más largos (compárese la pista 30 con la pista 32). Si se reemplaza la rosamina-dCTP con la dCTP regular (pistas 34-36), se polimeriza un producto putativo final (pista 36). Aquí los paros surgen en mucho menor grado que en las reacciones 30 y 32. Dado que el producto final de la reacción 36 migra hacia una posición de peso molecular más alto que la de los productos más largos de las reacciones 30 y 32, a pesar de que el rosamina-dGTP derivatizado se había reemplazado por el dGTP regular, que tiene un peso molecular más bajo, es muy probable que en las reacciones 30 y 32 fracase la síntesis de longitud completa, mientras que resulta obvio que en la reacción 36 se alcanza la secuencia deseada.

En este ejemplo se documenta únicamente con el cass 1 la sustitución total de los cuatro nucleótidos por sus derivados (pistas 7-14).

Las bandas que migran al intervalo de 18 nucleótidos naturales incorporados (pistas 15-26, cuando se emplea el cass 5) y al rango de 38-39 nucleótidos naturales cuando se emplea el cass 10 (pistas 27-30 y 32-36) corresponden a heterodúplex molde-cebador no completamente desnaturalizados, hecho que puede detectarse también en otros ensayos de control (datos no representados).

Ejemplo 10 Reemplazo completo de dNTP naturales por trifosfatos de nucleótidos derivatizados y polimerización de una secuencia deseada de 40 pares de bases

Con los moldes empleados en el ejemplo 6 no fue posible determinar la longitud de los productos de las reacciones con el cass 5 y 10 de forma precisa, debido a los paros de síntesis y a la migración irregular durante la electroforesis. En este ejemplo (figura 8) hemos utilizado grupos complejos de moldes cass 1-10 con el fin de determinar el número actual de acontecimientos de polimerización catalizados por la DNA-polimerasa. Los cassettes 1-10 constan de 10 oligonucleótidos, formados con bloques de construcción, que difieren en sus longitudes entre sí en 4 nucleótidos. En estos bloques de construcción, cada base está representada una vez. Los nucleótidos empleados aquí son: Hex^{7}c^{7}G_{d}, digoxigenina-dCTP, aminopentinil-7-desaza-dATP y biotina-16-dUTP. En este ensayo se reemplaza el rosamina-dCTP por el Dig-dCTP porque este último no interfiere en la movilidad electroforética de los productos resultantes de la polimerización (datos no representados). La polimerasa utilizada es la polimerasa Tgo exo^{-} (0,1 unidades por reacción).

Los productos de reacción con el cass 1 como molde se visualizan únicamente después de una sobreexposición y se marcan con asteriscos en la figura 8. Las reacciones de control con el cass 10 como molde y los dNTP naturales (40 incorporaciones posibles) se representan en las pistas 1-4.

Se pone de manifiesto que aumentando la longitud de molde empleada (cass 1-10), también aumenta la longitud de los productos de polimerización. El número de paros de síntesis es relativamente bajo, si se compara con los resultados del ejemplo 6. Se traza una gráfica con el ln del número máximo de nucleótidos incorporados (4, 8, 12, ...) frente al incremento de la movilidad electroforética alterada (distancia entre el cebador y el producto) de un cassette a otro cassette, se podrá ver una correlación lineal (figura 8a). Esta es una fuerte indicación de que se han sintetizado productos de longitud completa con todos los moldes cassette. Aquí se ha construido la secuencia de DNA enzimáticamente (máximo de nucleótidos incorporados: 40, cada base 10 veces), constituida por cuatro nucleótidos derivatizados, en los que las purinas se han reemplazado por sus análogos 7-desaza y las pirimidinas son las nucleobases regulares fijadas sobre un grupo informante (reporter).

Ejemplo 11 Incorporación de nucleótidos modificados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Como segundo método experimental para medir la incorporación eficaz de dNTP modificados se elige la PCR. En la PCR a diferencia de las reacciones de extensión con cebador, los nucleótidos marcados después de unas pocas rondas de amplificación están también presentes en la hebra del molde, de modo que al final ambas hebras constan de compuestos derivatizados, excepto los restos de cebador no marcado en cada extremo 5' del DNA dúplex. En las mezclas de reacción, los nucleótidos naturales correspondientes se han reemplazado por completo por sus análogos marcados. Los parámetros de la amplificación son los siguientes:

1x 95ºC 2 min

35x 95ºC 30 s; 60ºC 30 s; 72ºC 60 s.

La concentración de molde es de 0,5-0,7 fmoles de plásmido linealizado que contiene el gen tPA en cada reacción; cebador (tPa-exón 9: 5'-TGG.TGC.CAC.GTG.CTG.AAG.AA-3' y tPA exón 12: 5'-AGC.CGG.AGA.GCT.CAC.ACT-3' dando lugar a un fragmento de DNA de 517 bp y el tPA-exón 10: 5'-AGA.CAG.TAC.AGC.CAG.CCT.CA-3' y tPA-exón 11: 5'-GAC.TTC.AAA. TTT.CTG.CTC.CTC-3', que dan lugar a un producto DNA de 264 bp) son de 20 pmoles en cada caso.

La cantidad de polimerasa es de 2,6 unidades por reacción y la concentración de nucleótido es 200 \muM para cada dNTP. Después del procedimiento de ciclos se analizan las sondas a través de geles de agarosa del 2%. Un parámetro de buena aceptación de un derivado dado es la formación de una banda de producto.

En general, estos productos se desplazan en el peso molecular, debido al peso molecular mayor de los bloques monoméricos de construcción. El desplazamiento hacia pesos moleculares mayores depende estrictamente del compuesto utilizado. En el ejemplo representado en la figura 9, el producto biotinilado de 264 bp migra con un peso molecular aparente de unos 520 bp. Se aísla este fragmento del gel (pista D), se recupera el DNA y se utiliza como molde para una nueva ronda de amplificación con dNTP naturales, dando lugar al producto original de 264 bp (reversión). Cuando se diluye secuencialmente el DNA molde de la pista D por un factor 10 para cada paso de dilución (pistas E-J), se observa una disminución del rendimiento en producto (valoración del molde). Dado que se recupera el molde de una posición del gel en torno a 500 bp, es muy improbable que el DNA plásmido residual del plásmido que contiene el gen activador de plasminógeno linealizado haya actuado aquí como molde. A continuación se purifica y se secuencia el producto
invertido. La determinación de la secuencia no revela alteración de secuencia, si se compara con el plásmido original.

En la tabla 2 se demuestra que varias polimerasas son capaces de sintetizar productos con diferentes desoxinucleótidos derivatizados.

TABLA 2 PCR en la que los dNTP naturales correspondientes se han reemplazado por completo por sus análogos derivatizados

Polimerasa	Expand™ Hifi	Tgo exo^{-}	Vent exo^{-}
longitud de producto (bp)	264	517	264	517	264	517
Derivado:
\hskip0,2cm biotina-dUTP	+	+	+	+	+	+
\hskip0,2cm Hex^{7}c^{7}A_{d}	+	+	+	-	+	+
\hskip0,2cm Hex^{7}c^{7}G_{d} ^{1)}	?	?	+	?	?	?
\hskip0,2cm AMCA-dUTP	+	-	+	-	+	+
\hskip0,2cm Cy5-dUTP	n.d.	n.d.	-	-	-	-
\hskip0,2cm fluoresceína-dUTP	n.d.	n.d.	-	-	-	-
\hskip0,2cm verde rodamina-dUTP	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	-	-
\hskip0,2cm TAMRA-dUTP	n.d.	n.d.	-	-	-	-
\hskip0,2cm 7-aminopentinil-7-desaza-dATP + biotina-dUTP	+	+	-	-	-	-
\hskip0,2cm 7-aminopentinil-7-desaza-dATP + DIG-dUTP	+	-	-	-	-	-
\hskip0,2cm Hex^{7}c^{7}A_{d} + biotina-dUTP	+	+	-	-	-	-
\hskip0,2cm Hex^{7}c^{7}A_{d} + Hex^{7}c^{7}G_{d} ^{1)}	+	-	-	-	-	-
1) \begin{minipage}[t]{145mm} el Hex^{7}c^{7}G_{d} interfiere en la fluorescencia del bromuro de etidio. Los productos solamente pueden visualizarse después de una tinción con plata. \end{minipage}
n.d. = no determinado.

Cabe señalar que en el caso del aminopentinil-7-desaza-dATP solamente se forma producto por acción de varias polimerasas combinadas con otros derivados. Cuando el dTTP se reemplaza también por Dig- o biotina-16-dUTP (se reemplaza por completo el par de bases A-T), entonces se forma producto. Este producto introduce a continuación una base con grupo funcional amino, que lo convierte en un sustrato ideal para el "post-marcado" ya sea con colorantes fluorescentes, ya sea con otros grupos detectables.

Apéndice Referencias

[1] Perler, F.B.; Kumar, S., Kong, H,. (1996) Thermostable DNA polymerases; Advances in protein chemistry, Vol. 48, 377-435.

[2] Hu G. (1993) DNA polymerase-catalyzed addition of nontemplated extra nucleotides to the 3' end of a DNA fragment; DNA & Cell Biol. 12(8):763-70.

[3] Braithwaite DK, Ito (1993) Compilation, alignment, and phylogenetic relationships of DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 21(4):787-802.

[4] Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual 2nd edition, Boehringer Mannheim GmbH (1996).

[5] Jett J.H. et al. (1995) US Patent 5,405,747: Method for rapid base sequencing in DNA and RNA with two base labeling.

[6] Jett JH, Keller RA, Martin JC, Marrone BL, Moyzis RK, Rallift RL, Seitzinger NK, Shera EB, Stewart CC (1989); High-speed DNA sequencing: an approach based upon fluorescence detection of singlemolecules. J Biomol Struct Dyn 7(2):301-309.

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[9] Starke HR, Yan JY, Zhang JZ, Muhlegger K, Effgen K, Dovichi NJ (1994); Internal fluorescence labeling with fluorescent deoxynucleotides in two-label peak-height encoded DNA sequencing by capillary electrophoresis. Nucleic Acids Res. 22(19):3997-4001.

[10] Davis LM, Fairfield FR, Harger CA, Jett JH, Keller RA, Hann JH, Krakowski LA, Marrone BL, Martin JM, Nutter HL, et al (1991); Rapid DNA sequencing based upon single molecule detection. Genet Anal Tech Appl 8(1):1-7.

[11] Goodman, M.F. and Reha-Krantz L. Patent (International Application Number PCT/US97/06493, WO 97/39150, Synthesis of Fluorophore-labeled DNA.

Claims (11)

1. Un método para el marcado enzimático de ácidos nucleicos que utiliza una DNA-polimerasa, un molde ácido nucleico, un cebador y trifosfatos de nucleósidos modificados, que pueden incorporarse por acción de la polimerasa en el DNA recién sintetizado, en el que la DNA-polimerasa es un mutante exo menos de ingeniería genética o polimerasas de tipo B que no presentan actividad de 3'-exonucleasa y los trifosfatos de por lo menos dos desoxinucleósidos naturales se han reemplazado completamente por los correspondientes trifosfatos de desoxinucleósidos modificados o por derivados de los mismos, de tal manera que en el ácido nucleico general dos de las cuatro bases lleven modificaciones y se logre la longitud completa deseada.

2. El método de la reivindicación 1, en el que los nucléotidos incorporados al ácido nucleico recién sintetizado son detectables por métodos no radiactivos.

3. El método de las reivindicaciones 1-2, en el que el marcado enzimático del ácido nucleico se realiza en una reacción en la que se reemplazan los trifosfatos de tres desoxinucleósidos naturales totalmente por los correspondientes trifosfatos de desoxinucleósidos modificados o por derivados de los mismos, de tal manera que en el ácido nucleico sintetizado tres de las cuatro bases lleven modificaciones y se alcance la longitud completa deseada.

4. El método de la reivindicación 1-2, en el que el marcado enzimático del ácido nucleico se realiza en una reacción en la que los trifosfatos de cuatro desoxinucleósidos naturales se sustituyen por completo por los correspondientes trifosfatos o derivados de los mismos, de tal manera que el ácido nucleico sintetizado esté formado en su totalidad por bases modificadas y se logre la longitud completa deseada.

5. El método de la reivindicación 4, en el que las cuatro bases llevan diferentes marcadores.

6. El método de la reivindicación 1-5, en el que el marcado de una hebra de ácido nucleico se realiza empleando un cebador.

7. El método de la reivindicación 1-6, en el que el marcado de un ácido nucleico de doble hebra se realiza en una reacción de amplificación, en la que se emplean dos o más cebadores o cebadores degenerados o cebadores que contienen inosina.

8. El método de la reivindicación 1-7, en el que las enzimas empleadas son la transcriptasa inversa y una DNA-polimerasa de tipo B.

9. El método de la reivindicación 1-8, en el que los nucleótidos modificados se fijan sobre colorantes hidrófilos o marcadores hidrófilos.

10. El método de la reivindicación 1-9, en el que la polimerasa de tipo B no despliega actividad de 3'-exonucleasa y en el que el marcador hidrófilo se elige entre el grupo formado por las carbocianinas, las rodaminas, las fluoresceínas, las cumarinas, las vitaminas, p.ej. la biotina, los haptenos, p.ej. la digoxigenina, las oxazinas y las hormonas, p.ej. el colesterol y el estradiol y en el que el engarce (linker) que fija el colorante al nucleótido tiene una longitud de unos 15 átomos de carbono o más.

11. El método de la reivindicación 1-10, que se emplea para la síntesis de DNA y marcado simultáneo del DNA por PCR.