JP4150166B2 - 修飾ヌクレオチドまたは発色団を有するヌクレオチドとｄｎａポリメラーゼを使用するｄｎａの高密度標識 - Google Patents
修飾ヌクレオチドまたは発色団を有するヌクレオチドとｄｎａポリメラーゼを使用するｄｎａの高密度標識 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
スペーサーアームと検出し得る基を有する修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸の取り込みを介した標識ＤＮＡの合成は、分子生物学において一般的な方法である。しかしながら、現在までのところの修飾ヌクレオチドによる高密度で核酸の標識は示されていない。リンカーアームと、検出しうる基（リポーターグループまたは色素）間の立体障害によって、各塩基またはこれらの塩基の主要部分が検出し得る基に連結されているＤＮＡ断片の合成が妨げられることが想定された。
【０００２】
１ ＤＩＧ-標識ヌクレオチドは、ランダムプライムドラベリング、ニックトランスレーション、PCR、３’-端末標識／テイリング、または、インビトロ転写によるＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＴ４またはＴ７、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼまたはターミナルトランスフェラーゼ）によって限定された密度まで核酸プローブ中に取り込まれることができる。標識混合物はＤｉｇ-ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰとｄＧＴＰを含む。一般的に用いられる反応成分や、 ＤＮＡ標識のために一般に用いるＤＮＡポリメラーゼを使用する時に、反応がＤｉｇ-ｄＵＴＰによって抑制されるように思われるので、標識ヌクレオチドＤｉｇ-ｄＵＴＰは最初の反応混合物において完全にｄＴＴＰに代わることはできない。Ｄｉｇ-ｄＵＴＰとｄＴＴＰの最適割合を使用する時、 Ｄｉｇ-ｄＵＴＰ濃度の上昇はより高い標識密度につながるが、産物の長さや収量は減少する。現在までのところ一般的な標識技術を用いてＤｉｇ-ｄＵＴＰによって完全にｄＴＴＰを置換することは不可能であった（非放射的ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション応用マニュアル第２版、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ １９９６） ［４］。
【０００３】
２ Ｊｅｔｔ Ｊ．Ｈ．ら（米国特許第５、４０５、７４７号、２つの塩基標識を開いたDNA及びRNAの迅速な塩基配列決定法、１９９５）［５、６］は、ＤＮＡは、１つの蛍光ヌクレオチドと３つの修飾されていないヌクレオチドを含む長さが５００ヌクレオチドまでのＤＮＡ鎖を合成したことを記載している。DNA 合成は変異型Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼとローダミン-ｄＣＴＰ 、ローダミン-ｄＡＴＰ 、ローダミン-ｄＵＴＰ 、フルオレセイン-ｄＡＴＰ 、またはフルオレセイン- ｄＵＴＰを用いて実施された。DNA合成はまたローダミン-ｄＣＴＰまたは、ローダミン-ｄＡＴＰとともに修飾Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによっても観察された。著者らは修飾されたヌクレオチドと隣接位置にある修飾されていない塩基の取り込みの効薬については注釈していないが、立体の障害の為、ＤＮＡポリメラーゼによる標識ヌクレオチドの取り込みの困難さについて論じている。誘導体による１つ以上の標準ヌクレオシド三リン酸の置換については述べられていない。
【０００４】
３ Ｍａｋｉｋｏ Ｈｉｙｏｓｈｉと Ｓｈｉｇｅｒｕ Ｈｏｓｏｉ（ＰＣＲによる蛍光標識の組み込み及び蛍光共鳴エネルギー転移分析生化学によるＤＮＡ変性のアッセイ（１９９４）２２１、３０６-３１１）［７］はＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用したPCR増幅中に、例えばフルオレセイン-１１-ｄＵＴＰまたはローダミン-４-ｄＵＴＰの蛍光標識の取り込みについて記載している。これらの発蛍光団標識ヌクレオチドをｄＴＴＰを含む混合物で使用した。デこれらのスオキシヌクレオシド三リン酸誘導体は標準基質、ｄＴＴＰに完全に置き換わることは不可能であったと記載されている。これらの結果から、リンカーアーム及び蛍光基の立体障害が、隣接した位置への特異的な取り込みを抑制すると解釈された。
【０００５】
４ 異なる長さのリンカーアームを有するＣｙ５-修飾デスオキシウリジル三リン酸の取り込みはYu H.らのNAR（１９９４）２２、３４１８-３４２２に記載されている。これらの基質は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて行うニックトランスレーション反応やＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにて解析された。取り込みの程度はリンカーアームの長さが増加するにつれて並行して増加した。最適条件下では、ＰＣＲでは合理的収率で標的ＤＮＡの可能な置換部位の２８％まで、そしてニックトランスレーションでは１８％まで標識することが可能であった。完全に置換できないことはポリメラーゼと（ＰＣＲのための）鋳型上のシアニン標識部位間、及び伸長鎖と修飾ｄＵＴＰ基質間の立体的相互作用によるものと説明された。
【０００６】
５ Ｓｔａｒｋｅ Ｈ．Ｒ．ら(Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９４）２２，３９９７-４００１)［９］は、鋳型としてＭ１３ＤＮＡ、フルオレセイン-１５-ｄＡＴＰ、テトラメチルローダミン-ｄＡＴＰ, ｄＣＴＰ, ｄＧＴＰ, ＴＴＰ, 修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ）及び二価の金属イオンとして Ｍｎ＋＋を用いた酵素的ＤＮＡ標識−合成について記載している。Ｍｇ＋＋の代りにＭｎ＋＋を用いるとミスマッチ塩基の誤った取り込みを促進する。これらの条件下では、ポリメラーゼは必ずしも正しい塩基を取り込まない。正しい塩基の取り込みが例えば立体障害のために困難ならば、、非相補的塩基の取り込みがなされる。著者らは標識ヌクレオチドがある程度までは取り込まれることを示している。しかし、詳細な分析により、４つのｄＡヌクレオチドが連続して組み込まれるべきところのプライマーに類似した配列は、予測通りには合成されないことが示されている。この標識反応の主生成（８０-９０％）は標識ｄＡＴＰ１個のみと３個の非相補的ヌクレオチドを含む。２個、または３個の標識ｄＡＴＰを含む生成物はマイナー画分としてみられる。著者らは４個の標識ｄＡＴＰを含む生成物については記載していない。
【０００７】
６ ２個の標識塩基がＤＮＡポリメラーゼにより成功裏に取り込まれた例はＤａｖｉｓ Ｌ．Ｍ．らの報告である（ＧＡＴＡ（１９９１），８（１）；１−７）［１０］。Ｂｉｏ-１１-ｄＣＴＰまたは Ｂｉｏ-１１-ｄＵＴＰ等のビオチン標識ヌクレオチドと鋳型／プライマーとしての大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ大断片）,ｄ（Ａ，Ｇ）２１００を用いて、完全にビオチン化されたヌクレオチドのストリングが生じた。著者らは立体的影響はビオチン化ヌクレオチドでは問題ではないと明記している。ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰと共にＢｉｏ-１１-ｄＣＴＰ、Ｂｉｏ-１１-ｄＵＴＰの組み合わせを、すべての４塩基を含む鋳型として、Ｍ１３の一本鎖ＤＮＡで試した。この実験で、全長の産物を生じることは不可能であった。
【０００８】
７ Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．とＲｅｈａ−Ｋｒａｎｔｚ、 Ｌ．（国際出願番号 ＰＣＴ／ＵＳ９７／０６４９３， ＷＯ９７／３９１５０、Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ標識ＤＮＡの合成）は、修飾ＤＮＡ、例えば蛍光標識ＤＮＡの合成のために、修飾ヌクレオチドを取り込む能力が増加したと主張される突然変異バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼについて記述している。突然変異体は天然の酵素に対して固有のプロセシビティーが増したと記載されている。一つの天然ヌクレオチドがローダミン標識ヌクレオチドに置換する反応では、突然変異ＤＮＡポリメラーゼは野生型酵素より、ＤＮＡ産物のより長い伸長を生じる。２つの天然ヌクレオシド三リン酸が、ローダミン標識ｄＮＴＰｓに完全に置換される場合、産物の長さは１個のローダミン標識ｄＮＴＰを使用した反応と比較して短くなっているが、著者らは生成物の絶対的な長さについては触れていない。全長産物はＴ４ＤＮＡポリメラーゼのＬ４２２Ｍ突然変異体と、ローダミン-ｄＵＴＰ、ローダミン-ｄＣＴＰ、またはビオチン-ｄＣＴＰの取り込みによって得られるとだけ明記されている。
【０００９】
これらの例は、２種以上の修飾ヌクレオチドと共にＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ合成による修飾ヌクレオチドでのＤＮＡの標識では、全長産物を生成することは、現在まで達成し得なかったことを示している。
【００１０】
しかしながら、高密度標識ＤＮＡは核酸配列のような特異的標的分子の超感度検出、単一分子配列決定または単一分子検出のため、必要とされている。発蛍光団-、ＤＩＧ-，ビオチン-標識ヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドがプライマー伸長またはＰＣＲによってＤＮＡに組み込まれなくてはならない。また、全長産物がより高温で働くＤＮＡポリメラーゼによって生成されなくてはならない。ゆえに、本発明の主題は、少なくとも２種類の天然ヌクレオチドが完全に修飾ヌクレオチドに置換され、全長産物が生じるようなＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ合成によるＤＮＡの標識方法を提供することである。
【００１１】
これらのそして他の目的は、ＤＮＡポリメラーゼと修飾ヌクレオシド三リン酸（塩基に共有的に結合している検出し得る修飾を持つヌクレオチド）を用いたＤＮＡの鋳型指向的合成のための方法を提供する本発明により達成される。ＤＮＡポリメラーゼは鋳型指向的に修飾デオキシヌクレオシド三リン酸を相補鎖に取り込み、主要な部分またはすべてのヌクレオチドが修飾を有し、少なくとも２個の天然ヌクレオチドが完全に修飾ヌクレオチドに置換される。本発明の方法は１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼ及び少なくとも２種の塩基が独占的に修飾ヌクレオチドからなるヌクレオシド三リン酸混合物を用いたＤＮＡの合成を含み、１以上のＤＮＡポリメラーゼは修飾ヌクレオチドを取り込むことによってＤＮＡを合成することができ、また１以上のＤＮＡポリメラーゼは修飾ヌクレオチドを独占的に含むＤＮＡの伸長を合成する。本発明または、一つまたは少なくとも２つの塩基がもっぱら修飾塩基からなるヌクレオシド三リン酸のセットを用いるＰＣＲ反応に用いることが可能なＤＮＡポリメラーゼを含む。Ｂ−タイプポリメラーゼのクラスに属するポリメラーゼは特に本発明の方法に適している。特に適しているのは必須の（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないＢ−タイプポリメラーゼである。更に、親水性の色素または他の親水性の標識に結合している修飾ヌクレオチドが本発明において好ましい。
【００１２】
特に好ましいものは、カルボシアニン、ローダミン、フルオレセイン、クマリン、例えばビオチンのようなビタミン、例えばジゴキシゲニンのようなハプテン、オキサジン、コレステロール及びエストラジオールようなホルモンから成る群から選ばれた色素である。
【００１３】
固相上の高密度標識ＤＮＡ合成の為の方法を実施する場合、標識の親水性はそれほど重要なパラメーターではないので、上記した例よりも親水性の少ない標識を使用することも可能である。しかしながら、本発明の方法を液相中で実施する場合、親水性の標識が好ましい。
【００１４】
適切なリンカーは例えばペプチドもしくは脂質、またはこれらの誘導体であり得る。ヌクレオチドに色素を結合するリンカーの長さは約１５個の炭素原子またはそれ以上であることが好ましい。蛍光（フルオレセイン、ローダミン-グリーン、Ｃｙ５）によって検出され得る修飾ヌクレオチド、抗体反応（ジゴキシゲニン、フルオレセイン）によって検出され得るヌクレオチド、ストレプトアビジン（ビオチン）を用いた特異的相互作用により検出され得るヌクレオチド、そして、化学的に標識に連結し得る反応基を有するヌクレオチド（アミノペンチニル−Ｃ７−デアザ−ｄＡＴＰ）を用いた核酸標識の例を提供する。リンカーの長さはヌクレオチドに結合させる標識に依存する。ほとんどの標識にとって、約１５またはそれ以上の炭素原子のリンカー長が都合が良いことが判明した。しかしながら、ある種より小さい標識、例えばＡＭＣＡ等にとって、６炭素原子を含むリンカーを使用することが好都合である。本発明におけるヌクレオチド誘導体の有用な例を図１５に挙げる。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明の方法は３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないＢ−タイプポリメラーゼと、上記載の色素から成る群から選択される親水性の標識に結合したヌクレオチドを用い色素をヌクレオチドに結合させるリンカーが約１５、またはそれ以上の炭素原子の長さを有するようにして行われる。
【００１６】
１１種の異なるＤＮＡポリメラーゼまたはポリメラーゼの混合物及び種々ファミリーの逆転写酵素［３］の取り込み効率を調べた。
【００１７】
１ 大腸菌由来のＤＮＡ ｐｏｌＩのクレノウ断片（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＲＭＢ）を、既知の蛋白結晶構造を有する性状解析された好中温性（ｍｅｓｏｐｈｉｌｅ）Ａ−タイプポリメラーゼの例として選択した。
【００１８】
２ カルボキシドサーマス・ハイドロジェノフォルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｕｓ）由来ＣｈｙＤＮＡ ｐｏｌＩのクレノウ断片を大腸菌のクレノウ断片に類似する好熱性のＡ−タイプポリメラーゼ相同体の例として選択した。
【００１９】
３ シーケナーゼ （Ａｍｅｒｓｈａｍ）はＤＮＡ配列解析に最も多く使用されるＴ７−ＤＮＡ−ポリメラーゼを遺伝子操作したものである。
【００２０】
４ Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（ＲＭＢ）は単一サブ単位の酵素であり、
５ ＡＭＶ逆転写酵素（ＲＭＢ）はα／βサブ単位の二量体酵素である。
【００２１】
６ Ｔａｑポリメラーゼ（ＲＭＢ）は、好熱性のＡ−タイプポリメラーゼであり、また解析された蛋白構造を持つ。
【００２２】
７ ＶｅｎｔポリメラーゼとＶｅｎｔ ｅｘｏ−ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）は好熱性Ｂ−タイプポリメラーゼである。Ｖｅｎｔポリメラーゼはさらなる３’-５’エキソヌクレアーゼ活性による校正活性を持つ。
【００２３】
８ Ｔｇｏ（及びＴｇｏ ｅｘｏ−ポリメラーゼ、 ＲＭＢ；市販品として入手不可能、３’-５’エキソヌクレアーゼ機能を遺伝的に欠失）はまた好熱性で古細菌（ａｒｃｈａｅａｌ）Ｂ−タイプ酵素である（実施例７、図８）。
【００２４】
９ Ｐｗｏポリメラーゼ（ＲＭＢ）もまた古細菌起源のＢ−タイプ酵素である。さらに３’-５’エキソヌクレアーゼ活性による校正活性を示す。
【００２５】
１０ 組み換えＰｏｌβ（ラット）は Ｓａｍｕｅｌ Ｗｉｌｓｏｎ（Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ／Ｔｅｘａｓ）によりＲＭＢ供与された。
【００２６】
１１ Ｅｘｐａｎｄ（商標） Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＭＢ）はより優れたＰＣＲ性能のためのＴａｑとＰｗｏポリメラーゼの特有な混合物である。
【００２７】
Ｖｅｎｔ，Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−及びＴｇｏ ｅｘｏ−ポリメラーゼは古細菌起源の好熱性Ｂ−タイプ酵素であり、真核生物の複製α様ＤＮＡポリメラーゼとある程度の類似性を示す。これら２種の酵素の野生型酵素は強い３’-５’エキソヌクレアーゼ活性を示し、ゆえに、それらの遺伝子操作されたもの（ｅｘｏ−変異体）よりＤＮＡ標識のためには不都合である。
【００２８】
本特許出願の実施例は、他のポリメラーゼと比較して標識効率が優れていることを示す（データは詳細には示さない）、５種のポリメラーゼまたはここに挙げたポリメラーゼの混合（ｎｏｓ．２．，７．，８．，９．，１１．）（上のｎｏ．１１を参照）を含む。
【００２９】
すべてのＤＮＡポリメラーゼは、供給されたバッファー、さもなければ指示されたものでアッセイした（ Ｔｇｏ ｅｘｏ−は５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣＬ，２０℃でのｐＨ＝８．５，１０ ｍＭ ＫＣｌ，１５ ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，７ ｍＭ ＭｇＳＯ４，０．０５％（または指示した場合０．００５％）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００そして１０ ｍＭ ２-メルカプトエタノールを含むバッファーでアッセイした。）
本発明に係る修飾デオキシリボヌクレオチド三リン酸は、標識に結合したデオキシリボヌクレオチド三リン酸である。これらの修飾デオキシリボヌクレオチド三リン酸の誘導体は、例えば修飾７-デアザ-デオキシリボヌクレオチド三リン酸や、修飾Ｃ-ヌクレオシド三リン酸の様に、この標識を更に修飾したものである。
【００３０】
本発明の方法に適した修飾デオキシリボヌクレオチド三リン酸の例は以下の通りである。
【００３１】
ｄアデノシン誘導体
７-ヘキシニル-7-デスアザ-ｄＡＴＰ（構造は付録１を参照）
７-アミノペンチニル-7-デスアザ-ｄＡＴＰ（構造は付録１を参照）
ｄウリジン誘導体
ＡＭＣＡ-６-ｄＵＴＰ（ＲＭＢ，カタログＮｏ．１５３４３８６）
ビオチン-１６-ｄＵＴＰ（ＲＭＢ，カタログＮｏ．１０９３０７０）
Ｃｙ５-１０-ｄＵＴＰ（１０原子のスペーサー長を持つ、ＲＭＢ，構造は付録１を参照）
Ｃｙ５-ｄＵＴＰ（１７、２４、３８原子のスペーサー長を持つ、ＲＭＢ，構造は付録１を参照）
ＤＩＧ-１１-ｄＵＴＰ（ ＲＭＢ，カタログＮｏ．１５５８７０６）
ＭＲ１２１-ｄＵＴＰ（８、１３、２４原子のスペーサー長を持つ、ＲＭＢ，構造は付録１を参照）
フルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ（ＲＭＢ，カタログＮｏ．１３７３２４２）
ローダミン-グリーン-ｄＵＴＰ（ＲＭＢ，構造は付録１を参照）
ローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰ（ＲＭＢ，構造は付録１を参照）
ＴＭＲ-６-ｄＵＴＰ （ＲＭＢ，カタログＮｏ．１５３４３７８）
ｄシチジン - 誘導体
Ｆｌｕｏｒｏ Ｌｉｎｋ（商標）Ｃｙ５（商標）-ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，カタログＮｏＰＡ５５０２１）
ジゴギシゲニン-２８-ｄＣＴＰ（ＲＭＢ，構造は付録１を参照）
ローザミン-ｄＣＴＰ （ＲＭＢ，構造は付録１を参照）
ｄグアノシン - 誘導体
７-ヘキシニル-デスアザ-ｄＧＴＰ（構造は付録１を参照）
構造式、スペーサー化合物及びモル質量については、図１０-１４、または詳細な情報のためのＲＭＢバイオケミカルカタログを参照。
【００３２】
これらの修飾ｄＮＴＰは、完全な標識反応においてｄＮＴＰを生じさせることによって完全に天然のｄＮＴＰに置きかわる。
【００３３】
ポリメラーゼ反応は、のＰＣＲチューブ（２００μｌ）中で総量１０μｌで行い、ＰＣＲ反応は５０−１００μｌの量で行う。鋳型とプライマーは２０℃〜３５℃で１０分間アニーリングさせる。ＤＮＡポリメラーゼ濃度は示したように、Ｔａｑ，Ｃｈｙクレノウ酵素、Ｖｅｎｔ及びＶｅｎｔ ｅｘｏ−ポリメラーゼでは各反応に対して０.１、０.５単位または１単位であり、Ｔｇｏ ｅｘｏ−ポリメラーゼ０.１または１単位（１単位は、酸で沈澱し得るＤＮＡへののデオキシヌクレオシド三リン酸１０ｎｍｏｌの各ポリメラーゼに使用した温度で３０分以内に取り込みである）であり、ＰＣＲを使用した標識では、最適な酵素濃度は増加し得る。例えば１から４単位の酵素がより良い取り込み率を生じ得る。鋳型／プライマーの作用濃度は、示したように０.５から１ｐｍｏｌであり得る。鋳型濃度は０.１から０.７５μｇ間で変動し、プライマーは５０から６００μＭ間で変動し得る。修飾ヌクレオチドの濃度は５μＭから５０μＭで変動し、未修飾ｄＮＴＰは５０μＭから３００μＭ間で変動する。バッファーとして、トリス、バイシン、トリシンを１０ｍＭから５０ｍＭの濃度で使用でき、ｐＨはＨＣｌまたは酢酸で８.５から９.２の値に調節し得る。反応混合液にはＫＣｌは０から１００ｍＭ、及び/または（ＮＨ）２ＳＯ４を０から２０ｍＭ、及びＭｇＣｌを１から４ｍＭ、ＭｎＣｌ２を０.５から１.５ｍＭ，Ｔｗｅｅｎは０.０５％から２％，そして任意にＤＭＳＯを１から５％，またはＢＳＡを１００μｇ／ｍｌが使用する。反応混合液は使用するポリメラーゼに最適の温度で、１０分から６０分インキュベートし得る。例えば、Ｃｈｙクレノウポリメラーゼは５５℃から７２℃間の温度で使用する。ＰＣＲ標識では、ハイブリダイゼーション温度は使用すプライマーの配列により異なる。伸長温度とサイクル数は熱安定性ポリメラーゼと選択した鋳型により異なる。
【００３４】
好ましいプライマー伸長反応は下記に記す:
鋳型／プライマー鎖は１０分間室温でアニーリングする。ポリメラーゼ反応は全量１０μｌでＰＣＲチューブ（２００μｌ）中で行う。各反応は１×ポリメラーゼバッファーを含む。ＤＮＡポリメラーゼ濃度はＴａｑ、Ｃｈｙクレノウ酵素、及びＶｅｎｔ、及びＶｅｎｔ ｅｘｏ-ポリメラーゼでは示す場合、反応あたり０.１、０.５または１単位、 Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼでは０.１、または１単位 である（１単位は酸で沈澱し得るＤＮＡ中に各ポリメラーゼに使用した温度で３０分以内に総量でデオキシヌクレオチド三リン酸１０ｎｍｏｌを取り込む）。鋳型／プライマーの作用濃度は示したように０.５から１ｐｍｏｌである。修飾ヌクレオチドの濃度は５μＭから５０μＭで変動する。通常のｄＮＴＰはそれぞれ１２.５μＭである。反応は通常以下の条件下でポリメラーゼと一緒にインキュベートする：Ｔａｑ：０.１ｕ，７２℃、３０分。；Ｃｈｙクレノウ酵素：０.１ｕ，７２℃、３０分。；Ｐｗｏ， Ｖｅｎｔ ｅｘｏ- ＤＮＡポリメラーゼ、０.１ｕ，７２℃、３０分。
【００３５】
重合反応は１０μｌのホルムアミド停止液（９８％脱イオン化ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％ブロムフェノールブルー）の添加により終わらせらた。ＤＮＡは９５℃で１０分間加熱し変性させた。３μｌの割数は１２.５％の変性アクリルアミド／尿素シークエンシングゲルにのせ、ブロムフェノールブルー色素が陽極バッファータンクに達するまで２０００-２５００ボルトで電気泳動した。
【００３６】
ジゴキシゲニン検出の好ましい条件：
ポリメラーゼ反応生成物の電気泳動分離後、ＤＮＡを３０-６０分間のコンタクトブロッティングにより陽性を帯びたナイロン膜（ＲＭＢ）にトランスファーし、照射（２５４ｎｍ、１０−１５分）により、架橋した。次いで膜を３０分１％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬（カゼイン）を含む０.１Ｍのマレイン酸、０.１５Ｍ ＮａＣｌ，１％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬（カゼイン）を含む ｐＨ７．５（バッファー１）でブロックングされ、抗ジコギシゲニン−ＡＰＦａｂ断片（ＲＭＢ）の１：１００００希釈と６０分反応させた。結合しなかった抗体は０.３％Ｔｗｅｅｎ２０を含む過剰量のなバッファー１で数回洗浄して取り除いた。そして、膜をバッファー２（０.１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ， ｐＨ９．５，０．１Ｍ ＮａＣｌ）に移し再び洗浄し、最後にＣＤＰ Ｓｔａｒ（商標）（バッファー２で、１：１０００希釈）と共に１０-１５分間インキュベートした。過剰な流体はＷｈａｔｍａｎ ３ＭＭ Ｃｈｒ紙で念入りに取り除いた。次いでブロットを透明な２枚のシート間に密封し、Ｌｕｍｉ Ｆｉｌｍ （ＲＭＢ）またはＬｕｍｉ Ｉｍａｇｅｒ（商標）（ＲＭＢ）に１０分から２０分間露光した。
【００３７】
標的ＤＮＡ配列の情報に従った修飾デオキシヌクレオシド三リン酸の正確な取り込みを決定する為、明確な鋳型／プライマー系を使用した。この系により、修飾された誘導体の存在下で種々のＤＮＡポリメラーゼを用いた５’ジゴキシゲニン標識プライマー（２２ｍｅｒ）の伸長を行うことが可能である。可能であれば、Ｔ-ｔｒａｃｔｓ（ＮｕｃＴ１５）またはＣ-ｔｒａｃｔｓ（ＮｕｃＴ１６）を有する鋳型を使用して幾つかの修飾ヌクレオチドを次々に取り込み、そしてまた天然ｄＮＴＰ（ＮｕｃＴ-鋳型、図１を参照）で更なる伸長を検討した。
【００３８】
鋳型-プライマー系ｃａｓｓ１-１０を全ての４つの天然ｄＮＴＰが修飾類似体によって置換される取り込み実験に使用した。この鋳型-プライマー系は、１０個の鋳型配列からなり、これらはそれぞれが単位あたり１回提示される４塩基の基礎単位をもつ。このようにしてｃａｓｓ１は１からなり、ｃａｓｓ２は２つ、等となっている。この系により、種々の誘導体を（例えばｃａｓｓ１を用いて）段階を踏んで取り込み、そして４０の取り込み段階まで反応産物を調整することが可能となる。鋳型配列は置換えである。
【００３９】
従って、本発明はまた修飾デオキシリボヌクレオチド三リン酸とポリメラーゼをそれらの高濃度標識能について試験する方法をも提供する。
【００４０】
本発明に係る方法は固相上または液相中で行うことが可能である。本発明による方法はＤＮＡ合成と同時にＰＣＲによるＤＮＡ標識に使用することが可能である。
【００４１】
新たに合成される核酸に取り込まれる修飾ヌクレオチドは、蛍光の励起及び検出、免疫学的反応による検出、特異的相互作用（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン）または化学的に導入された標識による検出、等の非放射的方法によって検出される。４つの修飾塩基は異なる標識を有し、互いに識別され得ることが好ましい。例えば、ｄＡＴＰはｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰの修飾とは異なる修飾を持つ。
【００４２】
更に、本発明の方法は、ＤＮＡ配列決定、特に単一分子の配列決定に用いられる。実施形態において、本発明はサブマイクロメーターチャネルにおける単一分子ＤＮＡの配列決定に使用される。この新しい方法は、コーン（ｃｏｎｅ）形の微小キャピラリー中でＤＮＡ鎖から分解された一つの蛍光標識モノヌクレオチド分子の検出と同定に基づく。
【００４３】
高密度標識ＤＮＡの単一分子配列決定の場合、修飾モノヌクレオチドの検出は、分解段階後になされ、このことは修飾モノヌクレオチドが高密度標識ＤＮＡから切断された後を意味する。
【００４４】
本発明に係る方法は、１つまたは幾つかの特異的核酸配列の高感度な検出または定量に使用することができる。
【００４５】
本発明の方法の別の用途は、ＰＲＩＮＳ，またはＦＩＳＨの様な特異的核酸配列のｉｎ ｓｉｔｕの検出である。
【００４６】
ＰＲＩＮＳ（プライムされたＩｎＳｉｔ標識）では、未標識合成オリゴヌクレオチドを中間期分離（ｍｅｔａｐｈａｓｅ ｓｐｒｅａｄｓ）または顕微鏡のスライドの中間期核の変性した染色体の標的配列に対してアニーリングさせる。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドはプライマーとして働き新しく合成されるＤＮＡに高密度で標識ヌクレオチドをｉｎ ｓｉｔｕで取り込む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼで伸長され得る。標識により、新しく合成されるＤＮＡは様々な方法で検出される。例えば、フルオろクロム結合抗ＤＩＧ抗体による間接的検出（ＤＩＧ-ｄＵＴＰが取り込まれた場合）、または蛍光顕微鏡での直接的検出（ローダミン-ｄＵＴＰが取り込まれた場合）がある。
【００４７】
蛍光Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法においては、本発明の方法で創られ得る蛍光標識ＤＮＡプローブが使用される。ＦＩＳＨは例えば全染色体中のある配列を検出する時、ｍＲＮＡ種を検出する時、またはウイルスＲＮＡを検出する時等に使用され得る。本発明の方法で得られ得るより高密度の標識は、感度を失わずより容易に、細胞の密なマトリクスまたは染色体中に拡散できる、より短いプローブの使用を可能にする。本発明の方法による標識ヌクレオチドの全スペクトルの許容はプローブ配列の選択及び複数標識により柔軟性を与える。更に、まれなｍＲＮＡ種の検出における感度と確率が増す。
【００４８】
実施例１
７−デアザプリン - ２’デオキシヌクレオシド５ - 三リン酸誘導体の合成
全般：
薄層クロマトグラフィー（ＴＣＬ）：ＴＣＬアルミニウムシートシリカゲル６０Ｆ２５４（０.２ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ，ドイツ）。逆相ＨＰＬＣは、可変波長モニター（モデル６５５-Ａ）、コントローラー（モデルＬ-５０００）、及びインテグレーター（モデルＤ-２０００）に接続しているＭｅｒｃｋ-Ｈｉｔａｃｈｉ ＨＰＬＣポンプ（モデル６５５Ａ-１２）で４×２５０ｍｍＲＰ-１８（１０μｍ）Li Chrosorbカラム（Ｍｅｒｃｋ）で行った。３１Ｐ ＮＭＲ分光法はＡＣ-２５０ Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ分光計で行った。１２.５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓｅｑｕａｇｅｌ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）はＰＳ２５００ＤＣ パワーサプライ（Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ＵＳＡ）とＬａｕｄａ ＭＧＷサーモスタット（Ｌａｕｄａ，ドイツ）に接続した、またはＨａａｋｅ Ｄ１サーモスタットに接続し、ＥＣＰＳ３０００／１５０パワーサプライ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ）を備えたＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｍａｃｒｏｐｈｏｒシークエンシングゲル単位、ＤＳ９１シークエンサー（Ｂｉｏｎｅｔｒａ，ドイツ）で行った。
【００４９】
プライマー精製の予備的変性ゲル電気泳動は１５％アクリルアミド／尿素垂直スラブゲル（１５ｃｍ×２０ｃｍ×０.２ｃｍ；Ｓｅｑｕａｇｅｌ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で行い、そしてブロムフェノールブルー色素が陽極バッファー貯留所に到達するまで１５０-２００ボルト（コンソートマイクロコンピューター電気泳動パワーサプライ）で電気泳動した。３１Ｐ-ＮＭＲ分光法はＡＣ-２５０ Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ分光計で行った。
【００５０】
５’ - 一リン酸の合成：
修飾ヌクレオシド１．０ｍｍｏｌをアルゴン存在下でトリメチルリン酸（５ｍｌ）に溶解した。氷浴上で冷却した後、新しく蒸留したＰＯＣｌ３（１８０μｌ）を添加し、数時間４℃で反応を保った。（ｉ−プロパノール／Ｈ２Ｏ／ＮＨ３（３／１／１）または（７／１／１）のＴＥＡＢ−バッファーで少量の加水分解した後のＴＬＣコントロール）。反応が完了した時、溶液をＴＥＡＢ−バッファー（２００ｍｌ）に冷却しながら滴下した。エバポレートした後、残渣をＨ２Ｏに溶解させ、ＤＥ５２セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ）カラム（２０×３ｃｍ）にかけた。１ｌのＨ２Ｏで洗浄した後、１ｌのＨ２Ｏと１ｌの１Ｍ ＴＥＡＢバッファーの勾配を用いて精製を行った。５’-一リン酸は０.３-０.４ＭのＴＥＡＢ濃度でカラムから溶出した。
【００５１】
生成物を凍結乾燥し、３１Ｐ−ＮＭＲにより特徴づけた。
【００５２】
５’ - 三リン酸の合成：
５’-一リン酸をＤＭＦｐ．ａ．（１ｍｌ）に溶解または懸濁し、アルゴン下、１,１’-カルボニルジイミダゾール（０.５ｍｍｏｌ、８０ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液で処理した。混合物を３０分間かけて良く密閉された容器で振とうし、一晩室温でアルゴンが漂うエキシケーター(exicator)中に置いた。メタノール（３３μｌ）をアルゴン存在下で添加し、室温にて３０分後、ＤＭＦ ｐ．ａ．（５ｍｌ）中のモノ-（トリ-ｎ-ブチルアンモニウム）ピロリン酸（０.５ｍｍｏｌ、０.１８１６ｇ）が攪拌しながら添加した。反応混合液を一晩アルゴン浮遊エキシケーター中に置き、沈澱を生じさせた。上清を分離し、沈殿物を１ｍｌＤＭＦで４回洗浄し、遠心した。洗浄した液を合わせてエバポレートし、Ｈ２Ｏに溶解して、ＤＥ５２セルロースカラム（２０×３ｃｍ）にかけた。１ｌのＨ２Ｏでカラムを洗った後、１ｌＨ２Ｏと１ｌの１Ｍ ＴＥＡＢバッファーの勾配を用いて精製を行った。目的の産物は０.２-０.４ＭのＴＥＡＢ濃度でカラムから溶出した。５’-三リン酸を凍結乾燥し、３１Ｐ-ＮＭＲにより特徴づけた。
【００５３】
トリフルオロアセチル保護化合物のアミノ基の脱保護：
７-トリフルオロアセチルアミノペンチニル-７-デアザプリン-２’デオキシヌクレオシド５-三リン酸をＨ２Ｏ（１２.５ｍｌ）に溶解し、３.５時間攪拌しながら、濃アンモニア（１２.５ｍｌ）で処理した。２時間アスピレーター真空下で溶液を攪拌してアンモニアを除去し、凍結乾燥した。残渣を０.１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ、ｐＨ７.８）に溶解し、ＤＥ５２セルロースカラム（２０×３ｃｍ）にかけた。カラムを０.１Ｍ（１ｌ）から１.０Ｍ（１ｌ）のＴＥＡＢの直線勾配にて溶出させた。主な領域(zone)の画分をエバポレートし、更にエタノールとコエバポレート(co-evaporate)して、凍結乾燥した。
【００５４】
表１：
７-置換-７-デアザ-２’-デオキシアデノシン及びグアノシンの５’−一及び三リン酸の収率と３１Ｐ ＮＭＲデータ
ａ）トリフルオロアセチル保護；ｂ）アミノ基の脱保護の後
実施例２
鋳型オリゴヌクレオチドの合成と精製：
オリゴヌクレオチドの固相合成は、ホスホロアミダイト化学を用いて自動化したＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems、ＡＢＩ３９２-０８）上で１μｍｏｌのスケールで行った。ｄＧ，ｄＡ，ｄＣ，ＴのホスホロアミダイトとＣＰＧカラムはＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ（ドイツ）から購入した。Aminolink−(Applied Biosystems, ＣＨ３ＣＮ中の１００ｍＭ溶液）はプライマーの更なる５’-標識に使用した。すべてのオリゴヌクレオチドはトリチロン(trityl-on)合成で合成し、次いで支持体からの切断とアンモニアを用いた脱保護を行った（２５％、６０度、１８時間）。
【００５５】
鋳型鎖の精製は、ＯＰＣ（オリゴヌクレオチド精製カートリッジ）カラム（ＡＢＩ Ｍａｓｔｅｒｐｉｅｃｅ，Applied Biosystems，ドイツ）を用い、これに示された精製プロトコールに従って行った。オリゴヌクレオチドは、７Ｍ尿素の存在下で１５％ゲル上でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により更に精製し、ＰＳＣ６０Ｆ２５４＋３６６（Ｍｅｒｃｋ５６３７ 薄層クロマトグラフィー用プレート）でＵＶシャドウイングにより可視化した；目的の長さの産物のバンドを切り出し、０.５ Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ＳＤＳでゲルから溶出させた。得られたオリゴヌクレオチドを濃縮し、ＯＰＣカートリッジを用いて脱塩するかまたはエタノール沈澱させ、そして、適量の水で希釈した。短くした鋳型オリゴヌクレオチド（結合の誤りによる）は合成停止に導くことができ、ここで提示するデータの適当な評価を妨げることから、後半の過程は非常に重要であることが判明した。精製したオリゴヌクレオチドは、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃエバポレーターで凍結乾燥して無色の固体を得、これを１００μｌのＨ２Ｏに溶解し、−１８℃で凍結保存した。
【００５６】
実施例３
プライマーの標識と精製：
オリゴヌクレオチドの脱保護の後、エバポレーションによってアンモニアを取り除き、エタノール沈殿により脱塩した。オリゴヌクレオチドの２０Ａ２６０単位を１００ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）の２００μｌに溶解し、新たに調製した２００μｌエタノール中ＤＩＧ-ＮＨＳ３５０ｍｇの溶液で処理した。反応を室温で一晩シェーカー中で維持し、濃縮し、残った液体を１ｍｌＨ２Ｏに溶解した。０.４５μmフィルターでの濾過後、以下に記載する勾配を用いて逆相ＨＰＬＣにかけた：２０分１００％０.１ＭＥｔ３ＮＨＯＡｃ（ｐＨ７．０）（Ａ），２０-５０分、Ａ中０-４０％ＣＨ３ＣＮ。未標識オリゴヌクレオチドは約２０％のＣＨ３ＣＮ濃度で溶出し、ＤＩＧ-標識オリゴヌクレオチドは約３０％のＣＨ３ＣＮで溶出する。ＤＩＧ-標識プライマーを上記のように脱塩され、ゲル精製する。
【００５７】
実施例４
７ - 置換７ - デアザ - ２’デオキシアデノシン及びグアノシン誘導体の取り込み：
図２で、７-置換７-デアザ-２’デオキシアデノシン及びグアノシン誘導体の取り込みとＴｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼによる他の誘導体ヌクレオチドを用いた伸長を分析した。この目的の為、鋳型オリゴＮｕｃＴ１７，Ｔ１６，Ｔ８とＴ３を使用した。これによって１８個までの隣接位置へのそれぞれの三リン酸の有効な取り込みと、他の修飾デオキシヌクレオシド三リン酸による更なる伸長をモニターすることが可能となった。
【００５８】
塩基対形成則に従うと、２’-デオキシアデノシン誘導体(５０μM）は鋳型ＮｕｃＴ１７を使用して１５個の隣接位置に取り込まれ（レーン７-８）、２’-デオキシグアノシン誘導体は鋳型ＮｕｃＴ１６を用いて２１個までの次の(subsequent)位置まで重合化することができた（図２、レーン９-１０）。レーン１５-３４では、他の誘導されたデオキシヌクレオシド−三リン酸を用いた７-デアザ化合物の更なる伸長を分析した。ＮｕｃＴ８は３つの連続的なＨｅｘ７ｃ７Ａｄから成るトラックにＨｅｘ７ｃ７Ｇｄの成功した添加及び更なるローザミン-ｄＣＴＰによる伸長を証明するために選択した。レーン１５、１８、２１、２４では、Ｈｅｘ７ｃ７Ａｄを有する反応産物が反応混合液中に独占的に存在するデオキシヌクレオチド三リン酸であることが示される。ポリメラーゼ量とヌクレオチド濃度によって、ポリメラーゼは予測通りｄＮＴＰを添加するが、産物は1つ及びややマイナーな２つの重合段階によって鋳型を指示する長さを３個のＨｅｘ７ｃ７Ａｄだけ超え，ポリメラーゼによって鋳型のＣに対して２個までの誤った対のＨｅｘ７ｃ７Ａｄを取り込むことが示される。これは非常に偏ったヌクレオシド三リン酸プールでは一般的に見られる現象である。
【００５９】
レーン１６、１９、２２、２５は、反応に付加的なＨｅｘ７ｃ７Ｇｄが含まれると、前の反応の（上記を参照）予想されたバンド及び予想外のバンドが消失することと、より高分子量の物質が蓄積することを示す。明らかになったレーン１６と２２の中間での停止を考慮すると、鋳型９の指示に従って取り込みが検出可能であった。それぞれの誘導体（レーン１９、２５）の５０μＭを含む反応では、ほどんど停止は見られず、均一バンドが示される。
【００６０】
反応１７、２０、２３、２６においてＨｅｘ７ｃ７ＡｄとＨｅｘ７ｃ７Ｇｄにローザミン-ｄＣＴＰを更に添加すると、すべての反応において再び前の反応の最終産物の更なる伸長がみられた。レーン２３（１ｕポリメラーゼ）の場合、ローザミン-ｄＣＴＰの予測される３個の連続的取り込みが検出できた。これは、ＤＮＡ伸長が連続的に組み立てられ、１２個の誘導体ヌクレオチドからなることを意味している。
【００６１】
レーン２７-３４は鋳型ＮｕｃＴ３を使用した類似する実験を示している。ここではＨｅｘ７ｃ７Ｇｄの５個（鋳型によって指示された）及び６個（１つの追加の重合段階、ヌクレオチドプールの偏りによる）の連続的取り込みがみられる。ビオチン-１６-ｄＵＴＰを反応混合液に添加すると（レーン２８及び３０）、停止が消滅し、高分子量の産物がつくられ、反応２３（９個のＨｅｘ７ｃ７Ａｄ、Ｈｅｘ７ｃ７Ａｄ＋３個のローザミン-ｄＣ’ｓ）の分子量を越える。このことは、末端塩基も挿入されたことを示す（矢印で示す）。レーン３１-３４は、ビオチン-１６-ｄＵＴＰがリンカー長が短い誘導体に置換された反応を示す（例えば、レーン３１、３２のフルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ，レーン３３、３４のＡＭＣＡ-６-ｄＵＴＰ）。ここでは完全な伸長があったと推測され、顕著な停止や終結部位は検出されない。
【００６２】
より高いポリメラーゼ濃度では、３０を越える挿入がみられた（レーン１４）。これは伸長されたプライマー鎖のルーピングバックメカニズムや高い温度での再度のハイブリダイゼーションによるものであろう。Ｔａｑポリメラーゼと天然ｄＮＴＰを用いたコントロール反応ではＮｕｃＴ１６で２２個の挿入が見られた（レーン４、５）。クレノウ断片は同様の条件下、ＮｕｃＴ１５を用い、しかし３７℃にて、１９個までの天然ｄＮＴＰを合成することが可能であった（データは示さない）。
【００６３】
この実験構成では、Ｈｅｘ７ｃ７ＡｄとＨｅｘ７ｃ７ＧｄからなるＤＮＡ鎖は他の誘導ｄＮＴＰで容易に伸長することができ、全長産物を生成することを示すことができた。
【００６４】
実施例５
Ｔｇｏ ｅｘｏ - ポリメラーゼによるローダミン - グリーン - ｄＵＴＰとローダミン - グリーン - Ｘ - ｄＵＴＰの取り込み
本実験では、天然デオキシヌクレオシド三リン酸を用いた２種のローダミン-グリーン誘導体の取り込みと伸長を検討した。反応は別の実験において取り込み効率を促進することが示された（データは示さない）０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００の存在下でＴｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼにより触媒された。２種のヌクレオチドコンジュゲートはそのスペーサー化合物が異なっていた。ローダミン-グリーン-ｄＵＴＰ（ローダミン-グリーン-５（６）-カルボキシアミド-［５-（３-アミノアリル）-２’デスオキシ-ウリジン-５’-トリホスフェート］）は、５原子のスペーサー基を、ローダミン-Ｘ-ｄＵＴＰ（ローダミン-グリーン-５（６）-カルボキシアミド-ε-アミノカプロイル-［５-（３-アミノアリル）-２’デスオキシ-ウリジン-５’-トリホスフェート］）は１２原子のスペーサー基をデスオキシヌクレオシド化合物と発蛍光団分子との間に有する。
【００６５】
図３は両方の化合物が有効に取り込まれたことを示している。これら２者間の質量の違いは、それぞれレーン７、１１とレーン１５、１９間の矢印によって示されている。鋳型ＮｕｃＴ４では、４個の挿入後に重合が停止することが示される（レーン７、１１、１５、１９、２３、２７）の後、重合は停止することを示した。いくつかの重要でない誤った取り込みが、鋳型の配列がチミジン残基である位置５で検出することができた（レーン１１、１９、２７）。この誤った取り込みを超えて、それ以上の伸長は検出できない。反応混合液に更にｄＡＴＰとｄＧＴＰを添加すると、位置４の主な停止は克服できる。双方の誘導体で、より高分子量の産物が生成する（レーン８、１２、１６、２０、２４、２８）。しかし、この鋳型では、全長産物が作られるかどうか（１２個の挿入、そのうち９個は誘導体）はまだあいまいである。このデータは、ポリメラーゼが位置１１で停止し、最後の誘導体は位置１２に非常にわずかしか添加されないという解釈に有利である。０．１または１単位のポリメラーゼを使用したかどうか、反応時間が３０分から６０分に延長されたかどうかで大きな違いは検出されなかった。より長いインキュベーション時間とより多くのポリメラーゼを使用した場合、全長生成物の量のみ増加した。
【００６６】
鋳型ＮｕｃＴ１５（１８個の連続した挿入が可能）の場合、短いリンカーアームの誘導体が１５-１６個の隣接位置まで挿入された（レーン２５と２６の比較）。一方、ローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰは、１８個の位置まで重合され、主要生成物は１３-１７個の挿入（レーン３０）であった。これ以下の停止はフィルムの露出過剰の後にのみ検出され、このヌクレオチドがポリメラーゼに対して非常に良い基質であり、ＤＮＡ合成を失敗させないことをを示している。リンカー長はポリメラーゼにより受け入れられる基質にある影響を及ぼし得ることも推量される。この場合、より長いリンカー化合物は基質としてより受容される結果となることが容認されるだろう。このことは、ローダミン-グリーン -ｄＵＴＰの１６ヌクレオチドの代りに、ローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰを１８ヌクレオチドまで挿入できるポリメラーゼについてだけではなく、レーン７、１５、２２とレーン１１、１９、２７を比較した時にも証明される。ローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰの場合、４番目のヌクレオチドの挿入までいかなる停止も検出されないが、ローダミン-グリーン −ｄＵＴＰでは２及び３個のヌクレオチドの取り込み後に停止が検出される。
【００６７】
実施例６
種々のポリメラーゼによる種々のＵ−誘導体の取り込み
本実施例では、種々の型のポリメラーゼの、種々のリポーター基をタグ付けしたヌクレオチドの取り込み能を分析した。使用したポリメラーゼは異なるサーモコッカス種由来の２種の非常に近接したＢ−タイプポリメラーゼ（３’-５’exoマイナス変異体）、及びカルボキシドサーマス ハイドロジェノフォルマンスのＡ−タイプポリメラーゼの遺伝的に短くしたもの（クレノウ断片、５’-３’-ヌクレアーゼ活性を欠く）であった。ここでの実験は、１８個のアデニン残基からなる鋳型を使用し、３’-プライマー末端から始まり、ポリメラーゼが隣接した位置で１８個の変異体ヌクレオチドを取り込むことができるようにした。反応はそれぞれ修飾ヌクレオチド５μＭ及び５０μＭ（最終濃度）、及び０．１及び１単位のポリメラーゼで実施した。反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣＬ，２０℃におけるｐＨ＝８．５、１０ｍＭ ＫＣＬ，１５ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、７ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ２-メルカプトエタノール、各ポリメラーゼに使用）に0.01％（vol/vol）のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ-１００を取り込みを促進するために添加した。
【００６８】
図４は、誘導体ＴＭ-ローダミン-ｄＵＴＰ、Ｃｙ５-１０-ｄＵＴＰ，フルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ及びＡＭＣＡ-６-ｄＵＴＰを用いた場合、より高濃度のポリメラーゼ（１単位／反応）では、０．１単位／反応（それぞれレーン７、８；１１，１２；１４、１６；１９、２０とレーン９、１０；１３、１４；１７、１８；２１、２２との比較）より長い産物が合成された。フルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ、ビオチン-１６-ｄＵＴＰまたはＤｉｇ-１１-ｄＵＴＰ及びより低濃度（０．１単位／反応）のＴｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼを用いた反応においては、全長産物が検出された（レーン２８と３１）。
【００６９】
ＡＭＣＡ-６-ｄＵＴＰ（レーン１９-２２）とＤｉｇ-１１-ｄＵＴＰ（レーン３１-３４）の場合、実際に取り込まれたヌクレオチドの量は正確には決定できなかった。これは、他の点で最適でない反応状態下（５μＭ修飾ｄＮＴＰ；０．１単位ポリメラーゼ）での合成中に停止がなかったことによる。このことは、他の誘導体（例えばＣｙ５-１０-ｄＵＴＰ）と比較して、これらの化合物の高い基質活性と、優れた取り込み性能を示している。
【００７０】
伸長されていないプライマーと生成した種々の産物間の移動距離は、各誘導体と天然ｄＮＴＰを用いたコントロール（例えばレーン４、５）間で実質的に変化する。このことは誘導体が種々の分子量であることを表している（注、Ｄｉｇ-１１-ｄＵＴＰ（ｍｗ：１０９０．７Ｄａ）と比べると、ＡＭＣＡ-ｄＵＴＰは比較的小さい分子（ｍｗ：７４８．１Ｄａ）であり、変性ゲル電気泳動での全長産物のより高い移動性を説明する）。ＴＭ-ローダミン-ｄＵＴＰとＣｙ５-１０-ｄＵＴＰはＶｅｎｔ ｅｘｏ-ポリメラーゼにより１４箇所及び１３箇所にそれぞれ挿入され、産物の多くはＴＭ-ローダミンについて１０から１３個の取り込み（レーン９、１０）と、Ｃｙ５-１０-ｄＵＴＰについて１１及び１２個の取り込み（レーン１４）であった。全長合成が生じたか否かを記録するための反応中間体のバンドパターンの解釈（較正）を容易にするために、最適でない反応パラメーター（５μＭｄＮＴＰ、０．１単位ポリメラーゼ）を選択した（レーン２７を参照）。ビオチン-１６-ｄＵＴＰはＴｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼによりすべての可能な位置に取り込まれた。レーン２７は、低濃度ポリメラーゼ及びヌクレオチドにおける位置１-１０（１１、元のフィルムではほとんど見えない）からの合成停止を示し、レーン３０の１８個の取り込まれたヌクレオチドの適切な測定を可能とする。観察された各取り込み段階のバンドの分離はおそらくビオチン-１６-ｄＵＴＰ調製で見られる立体異性体の存在のためであろう（Ｍｕｅｈｌｅｇｇｅｒ，私信）。
【００７１】
本実施例において、Ａ-、Ｂ-タイプポリメラーゼの双方は、高マグネシウム濃度（７ｍＭ）と洗浄剤（０．０１％ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）-Ｘ-１００を用いて、隣接位置において、誘導ヌクレオチドの長い伸長を合成できることが実証された。取り込まれた化合物のより高い分子量によって、全ての産物は、通常のヌクレオチド-三リン酸を用いたコントロール反応で形成する生成物と比較すると（レーン１−６）より高分子量へ移行する。この系において、ＡＭＣＡ-、ビオチン-、及びＤｉｇ-ｄＵＴＰが最高の取り込み率を示し、フルオレセイン- ｄＵＴＰがこれに続く。Ａ-タイプ（Ｃｈｙ-クレノウ）とＢ-タイプポリメラーゼ（Ｔｇｏ ｅｘｏ-）間の後者の基質の取り込みを比較すると、操作されたＢ-タイプポリメラーゼ（より多くの挿入、停止がより少ない；レーン１５-１８と２３-２６を参照）がより良い取り込み性能を有するとみなし得る。Ｂ−タイプポリメラーゼ（特に、３’-５’エキソヌクレアーゼ機能が欠如したもの）は、誘導ｄＮＴＰを独占的に用いた標識反応を実施する上で選択すべき酵素と考えられる。３’-５’エキソヌクレアーゼ活性は、プライマー及び／または鋳型ＤＮＡの分解のために、標識効率に対して有害なものとみなすべきである。これらのポリメラーゼの野生型は３’-５’エキソヌクレアーゼ活性を、ＤＮＡポリメラーゼ活性１単位あたり５倍まで示すため、３’-５’エキソヌクレアーゼ活性の欠如は都合が良いとみなされるべきである。
【００７２】
実施例７
Ａ - タイプポリメラーゼによる種々のリンカーアーム長を持つＣｙ - ５ - ｄＵＴＰの取り込み
本研究では、種々のポリメラーゼによる取り込みに対するリンカーアーム長の影響（実施例５も参照）を検討した。実施例２で既に指摘したように、こうした化合物の酵素的重合に対して、ヌクレオシド−化合物と発蛍光団／検出し得る基との距離が影響し得る。本研究で、我々は１７、２４、及び３８原子のＣｙ-５-ｄＵＴＰ-誘導体のリンカーアームの長を用いた。
【００７３】
酵素的反応はそれぞれ鋳型ＮｕｃＴ４とＴ１５で行なった（図５）。使用したポリメラーゼは反応あたり０．１単位濃度のＴａｑ及びＣｈｙ-クレノウポリメラーゼであった。天然ｄＮＴＰ（レーン８、１１、１４、２３、２６及び２９）を用いた更なる伸長をモニターするため、誘導体濃度は５及び５０μＭであり、５０μＭの反応では、その上に１２．５μＭのｄＡＴＰとｄＧＴＰを別の反応チューブに添加した。
【００７４】
本実施例で、取り込み効率はリンカー長によることが明らかになった。Ｔａｑポリメラーゼは１７-原子-スペーサーの化合物を２回のみ取り込み、双方の鋳型で１回の取り込み後にのみ合成停止が見られた（レーン７-９、１５、１６）。それ以上の反応産物は検出されなかった。Ｃｈｙ-クレノウポリメラーゼは最大挿入数３個（４個の挿入がトレース量、レーン３１）のであるこをが示されたが、２個の取り込み後に重大な停止を持つ一方、一個のみの挿入後の停止が大きく減少する（レーン６、７、１５、１６とレーン２１、２２、３０、３１の比較）。
【００７５】
中間のスペーサー長を有する化合物（２４原子）はＴａｑポリメラーゼにより３つの位置に重合され、Ｃｈｙ-クレノウポリメラーゼで４つの位置に重合された（鋳型ＮｕｃＴ４、レーン９-１１とレーン２４-２６の比較）。レーン１１における追加のバンドの発生は反応混合液中に存在する天然ｄＮＴＰの過った取り込みから起こっているであろう。しかし、Ｃｈｙ-ポリメラーゼを使用すると、これらの中間バンドはレーン２６で欠けている。ここで（レーン２６）、鋳型が指示する４個の誘導ヌクレオチドの重合の後に、更なる伸長が観察される（４個の取り込みの後の停止バンドの減少）が、全長産物の検出は不可能だった。ほとんどの場合は合成は位置１０（主な産物）後に停止し、位置１１で１個が（更に）過って取り込まれたマイナーな産物が検出可能である。鋳型ＮｕｃＴ１５では、Ｔａｑポリメラーゼ（５）とＣｈｙ-クレノウ−ポリメラーゼ（９）で追加の重合事象ポリメラーゼが検出できる（それぞれレーン１７、１８と３２、３３を参照）。レーン１８において生じる中間バンドの性質は、レーン３２と３３においては見られないため、未結合ｄＵＴＰ（デオキシヌクレオシド分子に結合し、色素に結合していないスペーサーのみを有する）の混入は考えにくく、理解されていない。中間のスペーサー長を有する化合物は、短い１７-原子-化合物よりもより近くの位置に取り込まれるが、やはり２以上の挿入後、合成を停止させる傾向がまだある。
【００７６】
しかしながら、３８原子スペーサーの化合物は他の２つ（１７と２４原子距離）の物質とは取り込まれる能力において異なる。第１に、鋳型ＮｕｃＴ４では、使用される双方のポリメラーゼで１-４個の取り込みの間、検出し得る合成停止はずっと少ない（レーン１２-１４と２７、２９を参照；レーン２８では、伸長が全く検出されないことから明らかにポリメラーゼの添加が省略されている）。しかしながら、位置４における天然の停止は、ｄＡＴＰとｄＧＴＰの添加により克服できた。レーン１４（Ｔａｑポリメラーゼ）では、位置４での停止の消失が見られ、次いで天然ｄＡＴＰとｄＧＴＰの取り込み、更に２個の修飾ヌクレオチドの取り込みが生じ、鋳型の位置７で終わる主要産物と位置８で終わるマイナー産物が得られる。レーン２９では、Ｃｈｙ-ポリメラーゼが４個の取り込まれたＣｙ-５-ｄＵＭＰを伸長できたことを示すが、Ｔａｑ-ポリメラーゼによって触媒されるよりかなり効果が少ない。一方、産物の長さはＣｈｙ-ポリメラーゼでより高い（１２個の取り込み中全部で１０個が証明される）。
【００７７】
鋳型ＮｕｃＴ１５では、Ｔａｑポリメラーゼが７個（レーン１９）と６個（レーン２０）のＣｙ-５-ウラシル-誘導体の伸長を合成することができ、５個及び６個の取り込みが主要な産物であった。Ｔａｑポリメラーゼは、多くの合成停止を生じ、これはＣｈｙ-ポリメラーゼを用いた各反応では存在しなかった（レーン３４と３５）。その上、この酵素は、８個の取り込みを重合でき、５から７個のＣｙ-５-ｄＵの並んだ主要産物を生じ、４個の挿入以下では停止が検出されなかった。従って、効率的な取り込みにはスペーサーアーム長が重要な値であると結論できる。この場合、より長いスペーサーを有する化合物となるにつれて（２４-と３８-原子）挿入がより効果的になり、重合中の合成停止が少なくなる。しかし、使用するポリメラーゼ間での多少の違いもある。本実施例では、Ａ-タイプポリメラーゼの末端切断型（Ｃｈｙ-クレノウ断片）がＴａｑ野生型ポリメラーゼより良い取り込み性能を示した。
【００７８】
実施例８
Ｂ - タイプポリメラーゼによる種々のリンカーアーム長を有するＣｙ - ｄＵＴＰとＭＲ１２１ - ｄＵＴＰの組み込み
本実施例では、Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼ（Ｂ - タイプ、反応あたり０．１単位）によって、８、１３及び２４原子のスペーサーアームを有する実施例４の３種のＣｙ５-ｄＵＴＰと、さらに３種のＭＲ１２１-ｄＵＴＰ誘導体の組み込みを調べた。重合を調べるために使用した鋳型は、再度ＮｕｃＴ４とＴ１５（図６）とした。
【００７９】
ｄＡＴＰとｄＧＴＰは添加しないで鋳型ＮｕｃＴ４を使用すると、鋳型により指示された４つの組み込み（レーン６、７、９、１０、１２、１３）後、３種の全てのＣｙ-５-変異体の重合が停止した。これらのレーンを比較すると、例えば最小（１７原子のスペーサー）の化合物の４つの組み込みは、約１３個の正規のヌクレオチド組み込みのゲル位置に移動したことも示される（コントロールのレーン３）。より長いスペーサーを持つＣｙ-５-化合物は、それらのモル質量が高いため、このバンドと比べてシフトした。他の注目すべき特徴は、本明細書中では、短いスペーサーアームが１、２及び３個の組み込みの後に合成中停止するように導くというものであり、実施例４の場合と同様であった。２４原子のスペーサーは、有意に異なるパターンを示した。この場合（レーン９）、三リン酸濃度（５マイクロモル）が低い場合のみ、位置３での単一の停止が検出可能である。一方では、３８スペーサー誘導体は、有意な停止はなく組み込まれた（レーン１２-１４）。すべてのプライマーは、必要な天然ｄＡＴＰとｄＧＴＰの添加により、この４番目の位置からさらに伸長し、１７原子および２４原子の化合物の場合には全長産物が得られた。しかしながら３８原子のスペーサー化合物は、１０番目の重合が停止するまで他の２つのヌクレオチドと共に組み込まれただけであった。
【００８０】
鋳型ＮｕｃＴ１５の使用によって、ＮｕｃＴ４にみられるように、組み込みを考慮にいれた類似の傾向が明らかになった。短いリンカー化合物は、２、３、４つの組み込み後にみられる主要な停止で、初期のＤＮＡに１０回まで導入され、そして１０個までの組み込みで連続合成が中断される（レーン２４、２５）。中間リンカー化合物（レーン２６、２７）は、低（ほぼ最適な）誘導体濃度（５μＭ、レーン２６）で、３つの組み込みの後に明らかに停止したが、三リン酸高濃度（レーン２７）ではそれを克服できたものであることが示された。この化合物を用いると、１０個の隣接した重合工程も検出可能であり、これはＢ-ＤＮＡの１つのヘリックスターンのおおよその量である。
【００８１】
有意で良好な組み込みは、３８原子のスペーサーヌクレオチドを用いた場合に達成された。この誘導体は、１８箇所の可能な位置のうち１１箇所（レーン２８、２９）に導入されたが、合成中の停止はかなり少ない程度で起こった。高濃度（５０μＭ）では、組み込みは７個より少なく（レーン２９）、停止はほとんど検出されなかった。この反応の主要な産物は８〜１０個の組み込みを有する。
【００８２】
３種のＭＲ１２１-ｄＵＴＰデオキシヌクレオシド三リン酸の組み込みに関して類似の傾向は、レーン１５-２３と３０-３５にみられる。ここで短いリンカーアーム（８原子）によって、鋳型ＮｕｃＴ４を用い、低濃度（５μＭ）で（レーン１５-２０）、また鋳型ＮｕｃＴ１５を用いて（レーン３０）、２、３及び４つの組み込みの後に合成停止が導かれた。より長いスペーサー分子（１３及び２４原子）を持つ２つのヌクレオチドは停止バンドがないが、均質な産物ではなく、ゲル中において高分子のシミ（レーン２０-２３）のみを示した。不連続の停止合成バンドはみられなかった。一方では、プライマーはほぼ完全に消費され（コントロールレーン１、２、４及び５と比較した場合）、このことは、プライマーが、それぞれの誘導体化ヌクレオチドと組み合わせて使用したＤＮＡポリメラーゼにより伸長されたことを示している。この事実はおそらく新たに組み込まれた色素結合ヌクレオチドが、上記のようにしてＤＮＡの物理化学的性質を変えたことで、結果的に得られる分子には慣例的なＤＮＡ分析法では解析できなかったことを説明する。
【００８３】
図６ａ、すなわち図６（レーン６-２３）のブロット部分は、ストームイメージャー（Molecular Dynamics）で解析された。原則として、図６と比較して同じバンドのパターンが検出されたことを示す。しかし、ここでは、少なくとも１つの組み込まれた色素分子によって開始する産物のみが検出される（レーン１-９）。予測通り、非伸長Ｄｉｇ-標識プライマー産物は、シグナルを産出しない。ＭＲ１２１-標識デオキシヌクレオチドは弱い蛍光シグナルを生じ、それはこの検出系におけるＭＲ１２１の最適ではない励起及び発光パラメータと共に適合する。しかし、化学光検出系と同様に、ここでは分離してない産物バンドは８以上の原子のスペーサー長が解析された（レーン１２、１３と１５-１８との比較）。
【００８４】
本実施例では、試験した実施例４のＡ−タイプポリメラーゼよりも変異型３’−５’エキソヌクレアーゼ機構を持つＢ−タイプポリメラーゼの方が良好にＣｙ-５-ｄＵＴＰ化合物に組み込まれたことを示している。各Ａ-、Ｂ-タイプポリメラーゼに対して、スペーサー分子が長くなると、より良好な組み込みの傾向があることが実証されている。非常に疎水性の蛍光色素ＭＲ１２１は、組み込み後ＤＮＡの性質を変えるが、これらの分子は実験上の機構では解析ができなかったものである。
【００８５】
実施例９
誘導体化化合物により置き換えられた全４種の天然のｄＮＴＰを用いたＤＮＡの合成
この実験は、鋳型ｃａｓｓ１、ｃａｓｓ５、ｃａｓｓ１０（図７）を用いて行なわれた。使用したポリメラーゼはＴｇｏ ｅｘｏ−およびＶｅｎｔ ｅｘｏ−（各０．１、０．５及び１単位）であった。天然のｄＮＴＰは、コントロール反応（レーン１-６）を除いて、それらの誘導体化類似体により完全に置き換えられた。すべての反応混合物と鋳型ｃａｓｓ１，ｄａｓｓ５およびｃａｓｓ１０による産物は、４＋１、２０＋１および４０＋１ヌクレオチド組み込みに相当するレーン３、４及び５に示す。ひとつの“余分な”ヌクレオチドの末端付加はＴａｑポリメラーゼの特徴として一般に知られている。
【００８６】
レーン７-１０には、ｃａｓｓ１とＶｅｎｔ ｅｘｏ-ポリメラーゼを用いた反応産物を示す。反応７（レーン７）には、アッセイに存在する唯一のヌクレオチド三リン酸であるＨｅｘ７ｃ７Ｇｄが含まれた。ここではプライマーが、塩基対合規則に対応してひとつのヌクレオチドにより正確に伸長され、誤った組み込みは検出されなかった（図１ｂを参照：材料と方法におけるＣａｓｓ１-１０の配列）。反応８（レーン８）には、さらにローザミン-ｄＣＴＰ（他のヌクレオチドはない）が含まれた。組み込み後の停止は克服され、そして５〜６個の組み込まれた天然ｄＮＴＰの範囲で他のバンド（シフトしたもの）がみられた。これは、反応７からの末端Ｈｅｘ７ｃ７Ｇｄ残基がローザミン-ｄＣＴＰによって更に伸長したということである。レーン９では反応混合液には反応８に加えてＨｅｘ７ｃ７Ａｄが含まれた。ここでも、反応８での停止は消え、新たに添加された化合物によって伸長した（７-デアザ-ｄＡＴＰの比較的マイナーな修飾と一致する、反応８の産物までのわずかな移動距離に注意）。しかし、ここでは明確に定義される単一バンドの代りに、計３本のバンドが可視化されるが、これは誤った組み込みを意味し、ほとんどはおそらくアデニン残基（鋳型配列の最後の塩基）と向かい合わせの塩基である。反応１０では、反応９の他の３つのヌクレオチドに加え、ビオチン-１６-ｄＵＴＰを添加した。ここでは適当なヌクレオチドが鋳型配列中のＡの向かい側に挿入された。上述したように、立体異性体の発生の結果として、バンド分離はここでも検出された（Ｍｕｈｌｅｇｇｅｒ，私信）。誤った組み込みはわずかな程度でのみ検出された。
【００８７】
レーン１１-１４において、レーン７-１０で証明されたように、同じ反応は、Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼにより目下のところ触媒されている。この酵素の注目すべき特徴は正確さであり、その理由はＶｅｎｔ ｅｘｏ-の誤った組み込み（レーン９）がこのポリメラーゼでは起こらなかった（レーン１３を参照）からである。ここでは、Ｈｅｘ７ｃ７Ａｄを反応混合液に添加した後、一つの分離したバンドだけが可視化される。この位置から最終産物を得るためにビオチン-１６ｄＵＴＰを結合させた。
【００８８】
レーン１５-２２においては、レーン７-１４と同じであるが、鋳型ｃａｓｓ５を用いた実験を示している。ここで、２つのポリメラーゼを比較すると、類似の反応産物パターンが得られている（レーン１５-１８：Ｖｅｎｔ ｅｘｏ-ポリメラーゼ；レーン１９-２２：Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼ）。しかし、完了した反応混合液の産物（レーン１８-２２）は、それらの長さを考慮すると正確に分析されない。これは、より高濃度（５０μＭ）のヌクレオチドと０、１単位の代りに０、５単位のポリメラーゼを使用した場合（レーン２-２６）でも不可能である。ここで、誤った組み込みの傾向は、ヌクレオチド濃度とポリメラーゼ濃度が低い反応と比較すると増大した（レーン１６、１７とレーン２４、２５の比較）。特に、レーン２５とｃａｓｓ１０を用いた場合（レーン２９）では、不完全なヌクレオチド混合物が使用された場合に、大量の異なる中間産物が測定されうる（レーン１３と比較）。しかし、完全なｄＮＴＰ混合物が使用された場合（レーン２２、２６、３０を参照）には、失敗した合成産物が本実施例ではないので、これらの誤った組み込みはすべて明らかに形成されていない。
【００８９】
ｃａｓｓ１０が鋳型として機能する場合、ｃａｓｓ５よりも、より長い反応産物が合成されたが、所定の産物は産出されない（レーン３０、３２）。この場合にはいくつかの中間産物が検出される。標的配列に達していたか否かの、情報は得られない。Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼ産物はより少ない停止とより長い産物（レーン３０とレーン３２とを比較）を生じる傾向がみられる。ローザミン-ｄＣＴＰを正規のｄＣＴＰに置き代えると（レーン３４-３６）、推定の最終産物が重合される（レーン３６）。ここで、反応３０と３２よりずっと少ない程度に停止がおこる。誘導体化ローザミン-ｄＧＴＰが正規のｄＧＴＰ（より低分子量である）と置き換わったが、反応３６の最終産物は、反応３０と３２の最長の産物よりも、より高分子量の位置に移動するため、反応３０と３２での全長合成は失敗したにもかかわらず、反応３６は明らかに標的配列に到達している。
【００９０】
本実施例では、ｃａｓｓ１のみを用いて、誘導体による全４種のヌクレオチドの全置換が証明された（レーン７-１４）。
【００９１】
ｃａｓｓ１０を使用する場合（レーン２７-３０及び３２-３６）、バンドは１８個組み込まれた天然ヌクレオチド（レーン１５-２６、ｃａｓｓ５を使用した場合）の範囲に、また３８−３９個の天然ヌクレオチドの範囲に移動し、これは、ヘテロ２本鎖の鋳型プライマーが不完全に変性されたことに対応するものであり、他のいくつかのコントロール実験でも検出されうる（データは示さない）。
【００９２】
実施例１０
誘導されたヌクレオチド三リン酸による天然ｄＮＴＰの完全置換及び４０塩基対の標的配列の重合
実施例６で使用された鋳型を用いた場合、電気泳動中の合成停止と不規則な移動により、ｃａｓｓ５と１０での反応の産物の長さを正確に決定することは不可能であった。本実施例（図８）では、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される正確な重合の回数を決めるため、本発明者は鋳型ｃａｓｓ１-１０の完全なセットを使用した。カセット１-１０は１０種類のオリゴヌクレオチドであり、基礎単位から構成され、互いに長さが４ヌクレオチドずつ異なる。これらの基礎単位において、各塩基が一度ずつ提示される。ここで使用されたヌクレオチドは、Ｈｅｘ７ｃ７Ｇｄ、ジゴキシゲニン-ｄＣＴＰ、アミノペンチニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ、ビオチン-１６-ｄＵＴＰである。ローザミン-ｄＣＴＰをこのアッセイではＤｉｇ-ｄＣＴＰにより置き換えた。その理由は、後者は得られる重合産物の電気泳動の移動度を妨害しないからである（データは示してない）。使用されたポリメラーゼはＴｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼ（反応当たり０．１単位）であった。
【００９３】
ｃａｓｓ１での反応産物は、露光過度の後でのみ可視化され、図８では星印で印をつけてある。鋳型としてｃａｓｓ１０及び天然ｄＮＴＰを用いたコントロール反応（４０個の取り込みが可能）をレーン１-４に示してある。
【００９４】
使用する鋳型の長さが増すにつれ（ｃａｓｓ１-１０）、重合産物の長さも増加したことが示される。実施例６の結果と比較すると、合成停止の数は、組み込まれたヌクレオチドの最大数（４、８、１２．．．）の１ｎを、カセットごとに異なる電気泳動移動度の増加（プライマーと産物との距離）に対してプロットすると、線状の相関性がみられる（図８ａ）。このことから、全長産物がすべてのカセット-鋳型で合成されたことを強く示している。ここで、ＤＮＡ配列は酵素的（組み込まれたヌクレオチドの最大数：４０、各塩基につき１０回）に形成され、プリン類がそれらの７-デアザ-類似体により置き代えられ、ピリミジン類がレポーター基に結合した通常の核酸塩基である、４種の誘導されたヌクレオチドから構成される。
【００９５】
実施例１１
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による修飾ヌクレオチドの取り込み
修飾ｄＮＴＰの有効な取り込みの測定のための第２の実験法として、ＰＣＲを選択した。ＰＣＲでは、プライマー伸長反応とは違い、数ラウンドの増幅の後にも標識されたヌクレオチドが鋳型鎖に存在し、最終的に双方の鎖が２本鎖ＤＮＡの各５’末端の未標識プライマーを除き、誘導された化合物から成る。反応混合液では各天然ヌクレオチドはそれらの標識された対応物により完全に置き代えられた。増幅パラメーターは以下の通りである：
１×９５℃２分
３５×９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒
鋳型濃度は反応あたりｔＰＡ-遺伝子を含む線状化プラスミド０．５-０．７ｆｍｏｌとした。５１７ｂｐＤＮＡ断片を生じさせるプライマー（ｔＰＡエクソン９ ５’-ＴＧＧ．ＴＧＣ．ＣＡＣ．ＧＴＧ．ＣＴＧ．ＡＡＧ．ＡＡ-３’（配列番号１）とｔＰＡエクソン１２ ５’-ＡＧＣ．ＣＧＧ．ＡＧＡ．ＧＣＴ．ＣＡＣ．ＡＣＴ．Ｃ-３’（配列番号２）、そして２６４ｂｐＤＮＡ産物を生じさせるｔＰＡエクソン１０ ５’-ＡＧＡ．ＣＡＧ．ＴＡＣ．ＡＧＣ．ＣＡＧ．ＣＣＴ．ＣＡ-３’（配列番号３）とｔＰＡエクソン１１ ５’-ＧＡＣ．ＴＴＣ．ＡＡＡ．ＴＴＴ．ＣＴＧ．ＣＴＣ．ＣＴＣ-３’（配列番号４））は各２０ｐｍｏｌとした。
【００９６】
反応あたりのポリメラーゼ量は２．６単位、各ｄＮＴＰのヌクレオチド濃度は２００μＭであった。サイクル処置の後、プローブを２％アガロースゲルで解析した。与えられた誘導体を良好なものとして受け入れるための指標は産物のバンドが作られることであった。
【００９７】
一般に、これらの産物はモノマー基礎単位がより高分子量であるために、分子量がシフトした。より高分子量への移行は使用する化合物に厳密に依存していた。図９に示す例では、ビオチン化した２６４ｂｐ産物が、約５２０ｂｐの見かけの分子量に移動した。この断片をゲル（レーンD）から単離し、ＤＮＡを回収して、天然ｄＮＴＰを用いた新たな増幅のラウンドで鋳型として使用し、元の２６４ｂｐ産物を生じさせる（復帰）。レーンDのＤＮＡ鋳型を各希釈段階（レーンＥ-Ｊ）で１０倍ずつ順次希釈すると、産物収量の減少がみられた（鋳型滴定）。ゲルの約５００ｂｐ位置から鋳型を回収したため、プラスミドを含む線状化されたプラスミノーゲン活性化因子遺伝子の残りのプラスミドＤＮＡがここで鋳型として機能するという可能性は非常に低い。そして、復帰により得られた産物を精製して配列決定した。配列決定より、元のプラスミドと比較して、配列には変化がないことが明らかにされた。
【００９８】
表２ではいくつかのポリメラーゼが異なる誘導体デオキシヌクレオチドで産物を合成できたことを示している。
【００９９】
表２ 各天然ｄＮＴＰがそれらの誘導化された対応物により完全に置き代えられたＰＣＲ。
【０１００】
１）Ｈｅｘ７ｃ７Ｇｄはエチジウムブロマイド-蛍光を消光する。産物は銀染色の後でのみ可視化された。
【０１０１】
アミノペンチニル-７-デアザ-ｄＡＴＰの場合で、他の誘導体との組み合わせにおいてのみ、いくつかのポリメラーゼによって産物が作られることに留意すべきである。ｄＴＴＰを（Ａ-Ｔ-塩基対が完全に置き代えられた）Ｄｉｇ-またはビオチン-１６-ｄＵＴＰによって置き代えた時、産物が作られた。この産物はアミノ機能化された塩基を組み込んでおり、それによって蛍光色素または検出しうる基による”ポストラベリング”にとって理想的な基質になる。
【０１０２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ａ：Ｎｕｃ鋳型／プライマーシステムを示す。
ｂ：カセット１-１０の鋳型／プライマーシステムを示す。
【図２】ヘキシニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ及びヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰの取り込みを示す。
レーン１-６：反応当たり０．１単位のＴａｑ-ポリメラーゼを用いたコントロール反応。レーン１：プライマーとバッファーのみ；レーン２：鋳型１７、完全な反応混合物、すべての４ｄＮＴＰ；レーン３：レーン２と同様であるがｄＡＴＰのみ；レーン４：鋳型１６、完全な反応混合物、ｄＧＴＰのみ；レーン５：レーン４と同様であるがすべての４ｄＮＴＰ；レーン６：鋳型を除いた完全な反応混合物；レーン７-８：鋳型１７、０．１単位のポリメラーゼ、それぞれ５及び５０μＭのヘキシニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ；レーン９-１０：鋳型１６、０．１単位のポリメラーゼ、それぞれ５及び５０μＭのヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰ；レーン１１-１４：レーン７-１０と同様であるが１単位のポリメラーゼ；レーン１５-１７：鋳型８、０．１単位のポリメラーゼ、５μＭの誘導されたヌクレオチドであるヘキシニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ（レーン１５）、ヘキシニル-７-デアザ-ｄＡＴＰとヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰ（レーン１６）、ヘキシニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ、ヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰとローザミン-ｄＣＴＰ（レーン１７）；レーン１８-２０：レーン１５-１７と同様であるが５０μＭのｄＮＴＰ；レーン２１-２６：レーン１５-２０と同様であるが１単位のポリメラーゼ；レーン２７-３４：鋳型３；レーン２７：ヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰ（５０μＭ）、０．１単位のポリメラーゼ；レーン２８：ヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰとビオチンｄＵＴＰ（各５０μＭ）、０．１単位のポリメラーゼ；レーン２９-３０：レーン２７-２８と同様であるが１単位のポリメラーゼ；レーン３１-３２：ヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰとフルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ（各５０μＭ）、それぞれ０．１単位及び１単位のポリメラーゼ；レーン３３-３４：ヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰとＡＭＣＡ-６-ｄＵＴＰ（各５０μＭ）、それぞれ０．１単位及び１単位のポリメラーゼ。
化合物：Ａ：ヘキシニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ；Ｂ：ヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰ；Ｃ：ローザミン-ｄＣＴＰ；Ｄ：ビオチン-１６-ｄＵＴＰ；Ｅ：フルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ；Ｆ：ＡＭＣＡ-６-ｄＵＴＰ。
【図３】Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼによるローダミン-グリーン-ｄＵＴＰの取り込みを示す。
隣接位置でのＲｈｏ-グリーンとＲｈｏ-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰの複数の取り込みと基質活性に対するリンカーの長さの比較
レーン１-６：コントロール反応。レーン１：Ｄｉｇ-標識プライマー（２２ｍｅｒ）とバッファーのみ；レーン２：Ｄｉｇ-標識プライマー（２０ｍｅｒ）とバッファーのみ；レーン３：鋳型／プライマー（２８個の取り込みが可能）、Ｔａｑ-ポリメラーゼと４種の通常のｄＮＴＰ；レーン４：鋳型／プライマー（１２個の挿入が可能）、Ｔａｑ-ポリメラーゼと４極の通常のｄＮＴＰ；レーン５：鋳型／プライマー（ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰの１８回の挿入が可能）、Ｔａｑ-ポリメラーゼと４種の通常のｄＮＴＰ；レーン６：レーン１と同様；
レーン７-１４：０．１単位のＴｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼを用いた反応；レーン７-１０：ローダミン-グリーン-ｄＵＴＰ；レーン１１-１４：ローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰ；レーン７：鋳型Ｎｕｃ Ｔ４、５μＭローダミン-グリーン-ｄＵＴＰ；レーン８：鋳型Ｎｕｃ Ｔ４、５０μＭローダミン-グリーン-ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ；レーン９：鋳型Ｎｕｃ Ｔ１５、５μＭローダミン-グリーン-ｄＵＴＰ；レーン１０：鋳型Ｎｕｃ Ｔ１５、５０μＭローダミン-グリーン-ｄＵＴＰ；レーン１１：鋳型Ｎｕｃ Ｔ４、５μＭローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰ；レーン１２：鋳型Ｎｕｃ Ｔ４、５０μＭローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ；レーン１３：鋳型Ｎｕｃ Ｔ１５、５μＭローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰ；レーン１４：鋳型Ｎｕｃ Ｔ１５、５０μＭローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰ；
レーン１５-２２：レーン７-１４と同様であるが、１Ｕのポリメラーゼ；
レーン２３-３０：レーン１５-２２と同様であるが６０分の反応時間。
【図４】種々のポリメラーゼによる種々のＵ-誘導体の取り込みを示す。
種々のＵ-誘導体が鋳型Ｎｕｃ Ｔ１５上の隣接した位置に種々のポリメラーゼによって効率的に取り込まれる。
レーン１-６：コントロール反応。レーン１：プライマーとバッファーのみ。レーン２-６：反応あたり０．１単位のＴａｑポリメラーゼ；レーン２：１２．５μＭｄＡＴＰ；レーン３：１２．５μＭｄＧＴＰ；レーン４、５：同一で各天然ｄＮＴＰ１２．５μＭ；レーン６：レーン４、５と同様で鋳型を含まない；他の全ての標識反応は示された誘導ヌクレオシド三リン酸のみを含む。レーン７-１０：Ｖｅｎｔ ｅｘｏ-ポリメラーゼによるテトラメチルローダミンの取り込み。レーン７：５μＭのＴＭＲ-ｄＵＴＰと０．１単位のポリメラーゼ；レーン８：５０μＭのＴＭＲ-ｄＵＴＰと０．１単位のポリメラーゼ；レーン９、１０：レーン７、８と同様であるが１単位のポリメラーゼ。レーン１１-１４：レーン７-１０と同様であるがＣｙ５-ｄＵＴＰを使用；レーン１５-１８：Ｃｈｙ-ボリメラーゼクレノウ断片によるフルオレセイン-ｄＵＴＰの取り込み。レーン１５、１６：それぞれ５μＭまたは５０μＭのフルオレセイン-ｄＵＴＰ及び０．１単位ポリメラーゼ；レーン１７、１８：レーン１５、１６と同様であるが１単位のポリメラーゼ；レーン１９-２２：レーン１５-１９と同様であるが基質としてＡＭＣＡ-ｄＵＴＰを使用；レーン２３-３４：Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼによる取り込み；レーン２３-２６：レーン１５-１９と同様であるが基質としてフルオレセイン-ｄＵＴＰを使用；レーン２７-３０：レーン１５-１７と同様であるが基質としてビオチン-ｄＵＴＰを使用；レーン３１-３４：レーン１５-１７と同様であるがジゴキシゲニン-ｄＵＴＰを使用。
【図５】Ａ−タイプポリメラーゼによる種々のスペーサー長を有するＣｙ５-ｄＵＴＰの取り込みを示す。
Ａ−タイプポリメラーゼによる種々のリンカー長を有するＣｙ５-ｄＵＴＰの取り込み効率の比較。
レーン１-５：コントロール反応。レーン１と２：ポリメラーゼなし；レーン１：更に鋳型なし；レーン３と４：４ｄＮＴＰと鋳型ＮｕｃＴ４を有する完全反応混合物；レーン５：鋳型なしの完全反応混合物；レーン６-２０：Ｔａｑポリメラーゼ；レーン６-１４：鋳型ＮｕｃＴ４；レーン１５-２０：鋳型Ｔ１５；レーン６-８：１７原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン６：５μＭのＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン７：５０μＭのＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン８：５０μＭのＣｙ５-ｄＵＴＰ及び１２．５μＭのｄＡＴＰとｄＧＴＰ；レーン９-１１：レーン６-８と同様であるが２４原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰを有する；レーン１２-１４：レーン６-８と同様であるが３８原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰを有する；レーン１５、１６：鋳型ＮｕｃＴ１５、それぞれ５及び５０μＭの１７原子のスペーサーをもつ、Ｃｙ５-ｄＵＴＰ；レーン１７、１８：レーン１５、１６と同様で、それぞれ５及び５０μＭの２４原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン１９、２０：レーン１５、１６と同様で、それぞれ５及び５０μＭの３８原子のメペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン２１-３４：レーン６-２０と同様であるが、Ｔａｑポリメラーゼの代わりに、Ｃｈｙ-クレノウポリメラーゼを使用。
【図６】ｅｘｏ- Ｂ−タイプポリメラーゼによる種々のスペーサーを有するＣｙ５-ｄＵＴＰとＭＲ１２１-ｄＵＴＰの取り込みを示す。
Ｂ-タイプポリメラーゼによる種々のリンカー長を有するＣｙ５-ｄＵＴＰとＭＲ１２１-ｄＵＴＰの取り込み効率の比較
レーン１-５：０．１単位のＴａｑポリメラーゼを用いたコントロール反応。レーン１：プライマーのみ；レーン２：鋳型／プライマー、ヌクレオチドなし；レーン３：完全反応混合物；レーン４：レーン３と同様で、ｐｏｌ無し；レーン５：レーン３と同様で、ｐｏｌ無し；レーン６-８：１７原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン６：５μＭのＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン７：５０μＭのＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン８：５０μＭのＣｙ５-ｄＵＴＰ及びｄＡＴＰとｄＧＴＰ；レーン９-１１：レーン６-８と同様であるが２４原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン１２-１４：レーン６-８と同様であるが３８原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン１５-２３：レーン６-１４と同様であるがＣｙ５-ｄＵＴＰの代わりに８、１３、２４原子のリンカー長を持つＭＲ１２１-ｄＵＴＰ；レーン２４-３５：鋳型ＮｕｃＴ１５；レーン２４：５μＭの１７原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン２５：５０μＭの１７原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン２６-２７：レーン２４-２５と同様であるが２４原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン２８-２９：レーン２４-２５と同様であるが３８原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン３０-３５：レーン２４-２９と同様であるがＣｙ５-ｄＵＴＰの代わりに８、１３、２４原子のリンカー長を持つＭＲ１２１-ｄＵＴＰ。
６ａ：化学発光検出前の図６のブロットに対する蛍光スキャン
スキャンは図６のレーン６-２３を含み、ブロッキング過程が蛍光分析を妨害することが示されたので、ジゴキシゲニン標識プライマーの免疫学的検出の前に分析した。レーン１-９：Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼによる鋳型ＮｕｃＴ４へのＣｙ５-ｄＵＴＰの取り込み。レーン１-３：１７原子のスペーサー；レーン４-６：２４原子のスペーサー；レーン７-９：３８原子のスペーサー。Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼによる鋳型Ｔ４へのＭＲ１２１-ｄＵＴＰの取り込み。レーン１０-１２：ＭＲ１２１-８-ｄＵＴＰ；レーン１３-１５：ＭＲ１２１-１３-ｄＵＴＰ；レーン１６-１８：ＭＲ１２１-２４-ｄＵＴＰ。
【図７】誘導化されたｄＮＴＰによるすべての４種のデスオキシヌクレオシド三リン酸の完全置換を示す。
使用したポリメラーゼは標識反応（レーン７-３６）に対してＶｅｎｔ ｅｘｏ-とＴｇｏ ｅｘｏ-であり、コントロール反応（レーン１-６）ではＴａｑ ｐｏｌであった。使用した誘導体は：Ａ：ｄＧＴＰの代わりヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰ（示したように５μＭと５０μＭ）。Ｂ：ｄＣＴＰの代わりにローザミン-ｄＣＴＰ（示したように５μＭと５０μＭ）。Ｃ：ｄＡＴＰの代わりにヘキシニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ（示したように５μＭと５０μＭ）。Ｄ：ｄＴＴＰの代わりにビオチン-１６-ｄＵＴＰ（示したように５μＭと５０μＭ）。Ｅ：コントロールとして反応３４-３６においてｄＣＴＰ、未標識。
【図８】様々に誘導された４つのデスオキシヌクレオシド三リン酸から成るＤＮＡ鎖の合成を示す。
誘導ヌクレオチドによって置換されたすべてのｄＮＴＰを有する４０個のヌクレオチド標的配列の合成の実証。
レーン１-４：コントロール反応；レーン１：プライマーのみ；レーン２、３：０．１単位のＴａｑポリメラーゼと各１２．５μＭの天然ｄＮＴＰを含む完全反応混合物；レーン５：レーン１と同様；レーン５-１４：Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼ（反応当たり０．１単位）を有する標識反応、鋳型としてレーン５はｃａｓｓ１、レーン６はｃａｓｓ２、レーン７はｃａｓｓ３、レーン８はｃａｓｓ４、レーン９はｃａｓｓ５、レーン１０はｃａｓｓ６、レーン１１はｃａｓｓ７、レーン１２はｃａｓｓ８、レーン１３はｃａｓｓ９、レーン１４はｃａｓｓ１０；誘導体（各５０μＭ）は：ｄＡＴＰの代わりにアミノ-ペンチニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰの代わりにヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの代わりにジゴキシゲニン-ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰの代わりにビオチン-１６-ｄＵＴＰ；反応時間３０分；レーン１５-２４：レーン５-１４と同様であるが６０分の反応時間。
ａ：図８の分離した生成物の移動距離のln
【図９】ビオチン-１６-ｄＵＴＰによるｄＴＴＰの完全置換を伴うＰＣＲによる２６４ｂｐ断片の生成を示す。
ＰＣＲでの修飾ヌクレオチドの取り込み（完全置換）
Ｍで印をつけたレーンはマーカーレーンである。レーンＡ：天然ｄＮＴＰを用いたコントロール反応；レーンＢ：ビオチン-１６-ｄＵＴＰで完全に置換されたｄＴＴＰを有する２６４ｂｐの断片；レーンＣ：鋳型としてレーンＢを切除、精製した生成物を使用し、天然ｄＮＴＰを用いた２６４ｂｐの断片。レーンＤ：レーンＣと同様であるがビオチン-１６-ｄＵＴＰで完全に置換されたｄＴＴＰを使用；レーンＫ：レーンＡと同様（コントロール）；レーンＥ-Ｊ：レーンＣと同様であるが添加した鋳型の連続希釈（１０倍）（鋳型滴定）。
【図１０】使用した誘導体の化学式を示す。
【図１１】使用した誘導体の化学式を示す。
【図１２】使用した誘導体の化学式を示す。
【図１３】使用した誘導体の化学式を示す。
【図１４】使用した誘導体の化学式を示す。
【図１５】使用したヌクレオシド誘導体のリストを示す。
スペーサーアームと検出し得る基を有する修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸の取り込みを介した標識ＤＮＡの合成は、分子生物学において一般的な方法である。しかしながら、現在までのところの修飾ヌクレオチドによる高密度で核酸の標識は示されていない。リンカーアームと、検出しうる基（リポーターグループまたは色素）間の立体障害によって、各塩基またはこれらの塩基の主要部分が検出し得る基に連結されているＤＮＡ断片の合成が妨げられることが想定された。
【０００２】
１ ＤＩＧ-標識ヌクレオチドは、ランダムプライムドラベリング、ニックトランスレーション、PCR、３’-端末標識／テイリング、または、インビトロ転写によるＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＴ４またはＴ７、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼまたはターミナルトランスフェラーゼ）によって限定された密度まで核酸プローブ中に取り込まれることができる。標識混合物はＤｉｇ-ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰとｄＧＴＰを含む。一般的に用いられる反応成分や、 ＤＮＡ標識のために一般に用いるＤＮＡポリメラーゼを使用する時に、反応がＤｉｇ-ｄＵＴＰによって抑制されるように思われるので、標識ヌクレオチドＤｉｇ-ｄＵＴＰは最初の反応混合物において完全にｄＴＴＰに代わることはできない。Ｄｉｇ-ｄＵＴＰとｄＴＴＰの最適割合を使用する時、 Ｄｉｇ-ｄＵＴＰ濃度の上昇はより高い標識密度につながるが、産物の長さや収量は減少する。現在までのところ一般的な標識技術を用いてＤｉｇ-ｄＵＴＰによって完全にｄＴＴＰを置換することは不可能であった（非放射的ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション応用マニュアル第２版、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ １９９６） ［４］。
【０００３】
２ Ｊｅｔｔ Ｊ．Ｈ．ら（米国特許第５、４０５、７４７号、２つの塩基標識を開いたDNA及びRNAの迅速な塩基配列決定法、１９９５）［５、６］は、ＤＮＡは、１つの蛍光ヌクレオチドと３つの修飾されていないヌクレオチドを含む長さが５００ヌクレオチドまでのＤＮＡ鎖を合成したことを記載している。DNA 合成は変異型Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼとローダミン-ｄＣＴＰ 、ローダミン-ｄＡＴＰ 、ローダミン-ｄＵＴＰ 、フルオレセイン-ｄＡＴＰ 、またはフルオレセイン- ｄＵＴＰを用いて実施された。DNA合成はまたローダミン-ｄＣＴＰまたは、ローダミン-ｄＡＴＰとともに修飾Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによっても観察された。著者らは修飾されたヌクレオチドと隣接位置にある修飾されていない塩基の取り込みの効薬については注釈していないが、立体の障害の為、ＤＮＡポリメラーゼによる標識ヌクレオチドの取り込みの困難さについて論じている。誘導体による１つ以上の標準ヌクレオシド三リン酸の置換については述べられていない。
【０００４】
３ Ｍａｋｉｋｏ Ｈｉｙｏｓｈｉと Ｓｈｉｇｅｒｕ Ｈｏｓｏｉ（ＰＣＲによる蛍光標識の組み込み及び蛍光共鳴エネルギー転移分析生化学によるＤＮＡ変性のアッセイ（１９９４）２２１、３０６-３１１）［７］はＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用したPCR増幅中に、例えばフルオレセイン-１１-ｄＵＴＰまたはローダミン-４-ｄＵＴＰの蛍光標識の取り込みについて記載している。これらの発蛍光団標識ヌクレオチドをｄＴＴＰを含む混合物で使用した。デこれらのスオキシヌクレオシド三リン酸誘導体は標準基質、ｄＴＴＰに完全に置き換わることは不可能であったと記載されている。これらの結果から、リンカーアーム及び蛍光基の立体障害が、隣接した位置への特異的な取り込みを抑制すると解釈された。
【０００５】
４ 異なる長さのリンカーアームを有するＣｙ５-修飾デスオキシウリジル三リン酸の取り込みはYu H.らのNAR（１９９４）２２、３４１８-３４２２に記載されている。これらの基質は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて行うニックトランスレーション反応やＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにて解析された。取り込みの程度はリンカーアームの長さが増加するにつれて並行して増加した。最適条件下では、ＰＣＲでは合理的収率で標的ＤＮＡの可能な置換部位の２８％まで、そしてニックトランスレーションでは１８％まで標識することが可能であった。完全に置換できないことはポリメラーゼと（ＰＣＲのための）鋳型上のシアニン標識部位間、及び伸長鎖と修飾ｄＵＴＰ基質間の立体的相互作用によるものと説明された。
【０００６】
５ Ｓｔａｒｋｅ Ｈ．Ｒ．ら(Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９４）２２，３９９７-４００１)［９］は、鋳型としてＭ１３ＤＮＡ、フルオレセイン-１５-ｄＡＴＰ、テトラメチルローダミン-ｄＡＴＰ, ｄＣＴＰ, ｄＧＴＰ, ＴＴＰ, 修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ）及び二価の金属イオンとして Ｍｎ＋＋を用いた酵素的ＤＮＡ標識−合成について記載している。Ｍｇ＋＋の代りにＭｎ＋＋を用いるとミスマッチ塩基の誤った取り込みを促進する。これらの条件下では、ポリメラーゼは必ずしも正しい塩基を取り込まない。正しい塩基の取り込みが例えば立体障害のために困難ならば、、非相補的塩基の取り込みがなされる。著者らは標識ヌクレオチドがある程度までは取り込まれることを示している。しかし、詳細な分析により、４つのｄＡヌクレオチドが連続して組み込まれるべきところのプライマーに類似した配列は、予測通りには合成されないことが示されている。この標識反応の主生成（８０-９０％）は標識ｄＡＴＰ１個のみと３個の非相補的ヌクレオチドを含む。２個、または３個の標識ｄＡＴＰを含む生成物はマイナー画分としてみられる。著者らは４個の標識ｄＡＴＰを含む生成物については記載していない。
【０００７】
６ ２個の標識塩基がＤＮＡポリメラーゼにより成功裏に取り込まれた例はＤａｖｉｓ Ｌ．Ｍ．らの報告である（ＧＡＴＡ（１９９１），８（１）；１−７）［１０］。Ｂｉｏ-１１-ｄＣＴＰまたは Ｂｉｏ-１１-ｄＵＴＰ等のビオチン標識ヌクレオチドと鋳型／プライマーとしての大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ大断片）,ｄ（Ａ，Ｇ）２１００を用いて、完全にビオチン化されたヌクレオチドのストリングが生じた。著者らは立体的影響はビオチン化ヌクレオチドでは問題ではないと明記している。ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰと共にＢｉｏ-１１-ｄＣＴＰ、Ｂｉｏ-１１-ｄＵＴＰの組み合わせを、すべての４塩基を含む鋳型として、Ｍ１３の一本鎖ＤＮＡで試した。この実験で、全長の産物を生じることは不可能であった。
【０００８】
７ Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．とＲｅｈａ−Ｋｒａｎｔｚ、 Ｌ．（国際出願番号 ＰＣＴ／ＵＳ９７／０６４９３， ＷＯ９７／３９１５０、Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ標識ＤＮＡの合成）は、修飾ＤＮＡ、例えば蛍光標識ＤＮＡの合成のために、修飾ヌクレオチドを取り込む能力が増加したと主張される突然変異バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼについて記述している。突然変異体は天然の酵素に対して固有のプロセシビティーが増したと記載されている。一つの天然ヌクレオチドがローダミン標識ヌクレオチドに置換する反応では、突然変異ＤＮＡポリメラーゼは野生型酵素より、ＤＮＡ産物のより長い伸長を生じる。２つの天然ヌクレオシド三リン酸が、ローダミン標識ｄＮＴＰｓに完全に置換される場合、産物の長さは１個のローダミン標識ｄＮＴＰを使用した反応と比較して短くなっているが、著者らは生成物の絶対的な長さについては触れていない。全長産物はＴ４ＤＮＡポリメラーゼのＬ４２２Ｍ突然変異体と、ローダミン-ｄＵＴＰ、ローダミン-ｄＣＴＰ、またはビオチン-ｄＣＴＰの取り込みによって得られるとだけ明記されている。
【０００９】
これらの例は、２種以上の修飾ヌクレオチドと共にＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ合成による修飾ヌクレオチドでのＤＮＡの標識では、全長産物を生成することは、現在まで達成し得なかったことを示している。
【００１０】
しかしながら、高密度標識ＤＮＡは核酸配列のような特異的標的分子の超感度検出、単一分子配列決定または単一分子検出のため、必要とされている。発蛍光団-、ＤＩＧ-，ビオチン-標識ヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドがプライマー伸長またはＰＣＲによってＤＮＡに組み込まれなくてはならない。また、全長産物がより高温で働くＤＮＡポリメラーゼによって生成されなくてはならない。ゆえに、本発明の主題は、少なくとも２種類の天然ヌクレオチドが完全に修飾ヌクレオチドに置換され、全長産物が生じるようなＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ合成によるＤＮＡの標識方法を提供することである。
【００１１】
これらのそして他の目的は、ＤＮＡポリメラーゼと修飾ヌクレオシド三リン酸（塩基に共有的に結合している検出し得る修飾を持つヌクレオチド）を用いたＤＮＡの鋳型指向的合成のための方法を提供する本発明により達成される。ＤＮＡポリメラーゼは鋳型指向的に修飾デオキシヌクレオシド三リン酸を相補鎖に取り込み、主要な部分またはすべてのヌクレオチドが修飾を有し、少なくとも２個の天然ヌクレオチドが完全に修飾ヌクレオチドに置換される。本発明の方法は１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼ及び少なくとも２種の塩基が独占的に修飾ヌクレオチドからなるヌクレオシド三リン酸混合物を用いたＤＮＡの合成を含み、１以上のＤＮＡポリメラーゼは修飾ヌクレオチドを取り込むことによってＤＮＡを合成することができ、また１以上のＤＮＡポリメラーゼは修飾ヌクレオチドを独占的に含むＤＮＡの伸長を合成する。本発明または、一つまたは少なくとも２つの塩基がもっぱら修飾塩基からなるヌクレオシド三リン酸のセットを用いるＰＣＲ反応に用いることが可能なＤＮＡポリメラーゼを含む。Ｂ−タイプポリメラーゼのクラスに属するポリメラーゼは特に本発明の方法に適している。特に適しているのは必須の（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないＢ−タイプポリメラーゼである。更に、親水性の色素または他の親水性の標識に結合している修飾ヌクレオチドが本発明において好ましい。
【００１２】
特に好ましいものは、カルボシアニン、ローダミン、フルオレセイン、クマリン、例えばビオチンのようなビタミン、例えばジゴキシゲニンのようなハプテン、オキサジン、コレステロール及びエストラジオールようなホルモンから成る群から選ばれた色素である。
【００１３】
固相上の高密度標識ＤＮＡ合成の為の方法を実施する場合、標識の親水性はそれほど重要なパラメーターではないので、上記した例よりも親水性の少ない標識を使用することも可能である。しかしながら、本発明の方法を液相中で実施する場合、親水性の標識が好ましい。
【００１４】
適切なリンカーは例えばペプチドもしくは脂質、またはこれらの誘導体であり得る。ヌクレオチドに色素を結合するリンカーの長さは約１５個の炭素原子またはそれ以上であることが好ましい。蛍光（フルオレセイン、ローダミン-グリーン、Ｃｙ５）によって検出され得る修飾ヌクレオチド、抗体反応（ジゴキシゲニン、フルオレセイン）によって検出され得るヌクレオチド、ストレプトアビジン（ビオチン）を用いた特異的相互作用により検出され得るヌクレオチド、そして、化学的に標識に連結し得る反応基を有するヌクレオチド（アミノペンチニル−Ｃ７−デアザ−ｄＡＴＰ）を用いた核酸標識の例を提供する。リンカーの長さはヌクレオチドに結合させる標識に依存する。ほとんどの標識にとって、約１５またはそれ以上の炭素原子のリンカー長が都合が良いことが判明した。しかしながら、ある種より小さい標識、例えばＡＭＣＡ等にとって、６炭素原子を含むリンカーを使用することが好都合である。本発明におけるヌクレオチド誘導体の有用な例を図１５に挙げる。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明の方法は３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないＢ−タイプポリメラーゼと、上記載の色素から成る群から選択される親水性の標識に結合したヌクレオチドを用い色素をヌクレオチドに結合させるリンカーが約１５、またはそれ以上の炭素原子の長さを有するようにして行われる。
【００１６】
１１種の異なるＤＮＡポリメラーゼまたはポリメラーゼの混合物及び種々ファミリーの逆転写酵素［３］の取り込み効率を調べた。
【００１７】
１ 大腸菌由来のＤＮＡ ｐｏｌＩのクレノウ断片（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＲＭＢ）を、既知の蛋白結晶構造を有する性状解析された好中温性（ｍｅｓｏｐｈｉｌｅ）Ａ−タイプポリメラーゼの例として選択した。
【００１８】
２ カルボキシドサーマス・ハイドロジェノフォルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｕｓ）由来ＣｈｙＤＮＡ ｐｏｌＩのクレノウ断片を大腸菌のクレノウ断片に類似する好熱性のＡ−タイプポリメラーゼ相同体の例として選択した。
【００１９】
３ シーケナーゼ （Ａｍｅｒｓｈａｍ）はＤＮＡ配列解析に最も多く使用されるＴ７−ＤＮＡ−ポリメラーゼを遺伝子操作したものである。
【００２０】
４ Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（ＲＭＢ）は単一サブ単位の酵素であり、
５ ＡＭＶ逆転写酵素（ＲＭＢ）はα／βサブ単位の二量体酵素である。
【００２１】
６ Ｔａｑポリメラーゼ（ＲＭＢ）は、好熱性のＡ−タイプポリメラーゼであり、また解析された蛋白構造を持つ。
【００２２】
７ ＶｅｎｔポリメラーゼとＶｅｎｔ ｅｘｏ−ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）は好熱性Ｂ−タイプポリメラーゼである。Ｖｅｎｔポリメラーゼはさらなる３’-５’エキソヌクレアーゼ活性による校正活性を持つ。
【００２３】
８ Ｔｇｏ（及びＴｇｏ ｅｘｏ−ポリメラーゼ、 ＲＭＢ；市販品として入手不可能、３’-５’エキソヌクレアーゼ機能を遺伝的に欠失）はまた好熱性で古細菌（ａｒｃｈａｅａｌ）Ｂ−タイプ酵素である（実施例７、図８）。
【００２４】
９ Ｐｗｏポリメラーゼ（ＲＭＢ）もまた古細菌起源のＢ−タイプ酵素である。さらに３’-５’エキソヌクレアーゼ活性による校正活性を示す。
【００２５】
１０ 組み換えＰｏｌβ（ラット）は Ｓａｍｕｅｌ Ｗｉｌｓｏｎ（Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ／Ｔｅｘａｓ）によりＲＭＢ供与された。
【００２６】
１１ Ｅｘｐａｎｄ（商標） Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＭＢ）はより優れたＰＣＲ性能のためのＴａｑとＰｗｏポリメラーゼの特有な混合物である。
【００２７】
Ｖｅｎｔ，Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−及びＴｇｏ ｅｘｏ−ポリメラーゼは古細菌起源の好熱性Ｂ−タイプ酵素であり、真核生物の複製α様ＤＮＡポリメラーゼとある程度の類似性を示す。これら２種の酵素の野生型酵素は強い３’-５’エキソヌクレアーゼ活性を示し、ゆえに、それらの遺伝子操作されたもの（ｅｘｏ−変異体）よりＤＮＡ標識のためには不都合である。
【００２８】
本特許出願の実施例は、他のポリメラーゼと比較して標識効率が優れていることを示す（データは詳細には示さない）、５種のポリメラーゼまたはここに挙げたポリメラーゼの混合（ｎｏｓ．２．，７．，８．，９．，１１．）（上のｎｏ．１１を参照）を含む。
【００２９】
すべてのＤＮＡポリメラーゼは、供給されたバッファー、さもなければ指示されたものでアッセイした（ Ｔｇｏ ｅｘｏ−は５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣＬ，２０℃でのｐＨ＝８．５，１０ ｍＭ ＫＣｌ，１５ ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，７ ｍＭ ＭｇＳＯ４，０．０５％（または指示した場合０．００５％）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００そして１０ ｍＭ ２-メルカプトエタノールを含むバッファーでアッセイした。）
本発明に係る修飾デオキシリボヌクレオチド三リン酸は、標識に結合したデオキシリボヌクレオチド三リン酸である。これらの修飾デオキシリボヌクレオチド三リン酸の誘導体は、例えば修飾７-デアザ-デオキシリボヌクレオチド三リン酸や、修飾Ｃ-ヌクレオシド三リン酸の様に、この標識を更に修飾したものである。
【００３０】
本発明の方法に適した修飾デオキシリボヌクレオチド三リン酸の例は以下の通りである。
【００３１】
ｄアデノシン誘導体
７-ヘキシニル-7-デスアザ-ｄＡＴＰ（構造は付録１を参照）
７-アミノペンチニル-7-デスアザ-ｄＡＴＰ（構造は付録１を参照）
ｄウリジン誘導体
ＡＭＣＡ-６-ｄＵＴＰ（ＲＭＢ，カタログＮｏ．１５３４３８６）
ビオチン-１６-ｄＵＴＰ（ＲＭＢ，カタログＮｏ．１０９３０７０）
Ｃｙ５-１０-ｄＵＴＰ（１０原子のスペーサー長を持つ、ＲＭＢ，構造は付録１を参照）
Ｃｙ５-ｄＵＴＰ（１７、２４、３８原子のスペーサー長を持つ、ＲＭＢ，構造は付録１を参照）
ＤＩＧ-１１-ｄＵＴＰ（ ＲＭＢ，カタログＮｏ．１５５８７０６）
ＭＲ１２１-ｄＵＴＰ（８、１３、２４原子のスペーサー長を持つ、ＲＭＢ，構造は付録１を参照）
フルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ（ＲＭＢ，カタログＮｏ．１３７３２４２）
ローダミン-グリーン-ｄＵＴＰ（ＲＭＢ，構造は付録１を参照）
ローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰ（ＲＭＢ，構造は付録１を参照）
ＴＭＲ-６-ｄＵＴＰ （ＲＭＢ，カタログＮｏ．１５３４３７８）
ｄシチジン - 誘導体
Ｆｌｕｏｒｏ Ｌｉｎｋ（商標）Ｃｙ５（商標）-ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，カタログＮｏＰＡ５５０２１）
ジゴギシゲニン-２８-ｄＣＴＰ（ＲＭＢ，構造は付録１を参照）
ローザミン-ｄＣＴＰ （ＲＭＢ，構造は付録１を参照）
ｄグアノシン - 誘導体
７-ヘキシニル-デスアザ-ｄＧＴＰ（構造は付録１を参照）
構造式、スペーサー化合物及びモル質量については、図１０-１４、または詳細な情報のためのＲＭＢバイオケミカルカタログを参照。
【００３２】
これらの修飾ｄＮＴＰは、完全な標識反応においてｄＮＴＰを生じさせることによって完全に天然のｄＮＴＰに置きかわる。
【００３３】
ポリメラーゼ反応は、のＰＣＲチューブ（２００μｌ）中で総量１０μｌで行い、ＰＣＲ反応は５０−１００μｌの量で行う。鋳型とプライマーは２０℃〜３５℃で１０分間アニーリングさせる。ＤＮＡポリメラーゼ濃度は示したように、Ｔａｑ，Ｃｈｙクレノウ酵素、Ｖｅｎｔ及びＶｅｎｔ ｅｘｏ−ポリメラーゼでは各反応に対して０.１、０.５単位または１単位であり、Ｔｇｏ ｅｘｏ−ポリメラーゼ０.１または１単位（１単位は、酸で沈澱し得るＤＮＡへののデオキシヌクレオシド三リン酸１０ｎｍｏｌの各ポリメラーゼに使用した温度で３０分以内に取り込みである）であり、ＰＣＲを使用した標識では、最適な酵素濃度は増加し得る。例えば１から４単位の酵素がより良い取り込み率を生じ得る。鋳型／プライマーの作用濃度は、示したように０.５から１ｐｍｏｌであり得る。鋳型濃度は０.１から０.７５μｇ間で変動し、プライマーは５０から６００μＭ間で変動し得る。修飾ヌクレオチドの濃度は５μＭから５０μＭで変動し、未修飾ｄＮＴＰは５０μＭから３００μＭ間で変動する。バッファーとして、トリス、バイシン、トリシンを１０ｍＭから５０ｍＭの濃度で使用でき、ｐＨはＨＣｌまたは酢酸で８.５から９.２の値に調節し得る。反応混合液にはＫＣｌは０から１００ｍＭ、及び/または（ＮＨ）２ＳＯ４を０から２０ｍＭ、及びＭｇＣｌを１から４ｍＭ、ＭｎＣｌ２を０.５から１.５ｍＭ，Ｔｗｅｅｎは０.０５％から２％，そして任意にＤＭＳＯを１から５％，またはＢＳＡを１００μｇ／ｍｌが使用する。反応混合液は使用するポリメラーゼに最適の温度で、１０分から６０分インキュベートし得る。例えば、Ｃｈｙクレノウポリメラーゼは５５℃から７２℃間の温度で使用する。ＰＣＲ標識では、ハイブリダイゼーション温度は使用すプライマーの配列により異なる。伸長温度とサイクル数は熱安定性ポリメラーゼと選択した鋳型により異なる。
【００３４】
好ましいプライマー伸長反応は下記に記す:
鋳型／プライマー鎖は１０分間室温でアニーリングする。ポリメラーゼ反応は全量１０μｌでＰＣＲチューブ（２００μｌ）中で行う。各反応は１×ポリメラーゼバッファーを含む。ＤＮＡポリメラーゼ濃度はＴａｑ、Ｃｈｙクレノウ酵素、及びＶｅｎｔ、及びＶｅｎｔ ｅｘｏ-ポリメラーゼでは示す場合、反応あたり０.１、０.５または１単位、 Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼでは０.１、または１単位 である（１単位は酸で沈澱し得るＤＮＡ中に各ポリメラーゼに使用した温度で３０分以内に総量でデオキシヌクレオチド三リン酸１０ｎｍｏｌを取り込む）。鋳型／プライマーの作用濃度は示したように０.５から１ｐｍｏｌである。修飾ヌクレオチドの濃度は５μＭから５０μＭで変動する。通常のｄＮＴＰはそれぞれ１２.５μＭである。反応は通常以下の条件下でポリメラーゼと一緒にインキュベートする：Ｔａｑ：０.１ｕ，７２℃、３０分。；Ｃｈｙクレノウ酵素：０.１ｕ，７２℃、３０分。；Ｐｗｏ， Ｖｅｎｔ ｅｘｏ- ＤＮＡポリメラーゼ、０.１ｕ，７２℃、３０分。
【００３５】
重合反応は１０μｌのホルムアミド停止液（９８％脱イオン化ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％ブロムフェノールブルー）の添加により終わらせらた。ＤＮＡは９５℃で１０分間加熱し変性させた。３μｌの割数は１２.５％の変性アクリルアミド／尿素シークエンシングゲルにのせ、ブロムフェノールブルー色素が陽極バッファータンクに達するまで２０００-２５００ボルトで電気泳動した。
【００３６】
ジゴキシゲニン検出の好ましい条件：
ポリメラーゼ反応生成物の電気泳動分離後、ＤＮＡを３０-６０分間のコンタクトブロッティングにより陽性を帯びたナイロン膜（ＲＭＢ）にトランスファーし、照射（２５４ｎｍ、１０−１５分）により、架橋した。次いで膜を３０分１％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬（カゼイン）を含む０.１Ｍのマレイン酸、０.１５Ｍ ＮａＣｌ，１％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬（カゼイン）を含む ｐＨ７．５（バッファー１）でブロックングされ、抗ジコギシゲニン−ＡＰＦａｂ断片（ＲＭＢ）の１：１００００希釈と６０分反応させた。結合しなかった抗体は０.３％Ｔｗｅｅｎ２０を含む過剰量のなバッファー１で数回洗浄して取り除いた。そして、膜をバッファー２（０.１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ， ｐＨ９．５，０．１Ｍ ＮａＣｌ）に移し再び洗浄し、最後にＣＤＰ Ｓｔａｒ（商標）（バッファー２で、１：１０００希釈）と共に１０-１５分間インキュベートした。過剰な流体はＷｈａｔｍａｎ ３ＭＭ Ｃｈｒ紙で念入りに取り除いた。次いでブロットを透明な２枚のシート間に密封し、Ｌｕｍｉ Ｆｉｌｍ （ＲＭＢ）またはＬｕｍｉ Ｉｍａｇｅｒ（商標）（ＲＭＢ）に１０分から２０分間露光した。
【００３７】
標的ＤＮＡ配列の情報に従った修飾デオキシヌクレオシド三リン酸の正確な取り込みを決定する為、明確な鋳型／プライマー系を使用した。この系により、修飾された誘導体の存在下で種々のＤＮＡポリメラーゼを用いた５’ジゴキシゲニン標識プライマー（２２ｍｅｒ）の伸長を行うことが可能である。可能であれば、Ｔ-ｔｒａｃｔｓ（ＮｕｃＴ１５）またはＣ-ｔｒａｃｔｓ（ＮｕｃＴ１６）を有する鋳型を使用して幾つかの修飾ヌクレオチドを次々に取り込み、そしてまた天然ｄＮＴＰ（ＮｕｃＴ-鋳型、図１を参照）で更なる伸長を検討した。
【００３８】
鋳型-プライマー系ｃａｓｓ１-１０を全ての４つの天然ｄＮＴＰが修飾類似体によって置換される取り込み実験に使用した。この鋳型-プライマー系は、１０個の鋳型配列からなり、これらはそれぞれが単位あたり１回提示される４塩基の基礎単位をもつ。このようにしてｃａｓｓ１は１からなり、ｃａｓｓ２は２つ、等となっている。この系により、種々の誘導体を（例えばｃａｓｓ１を用いて）段階を踏んで取り込み、そして４０の取り込み段階まで反応産物を調整することが可能となる。鋳型配列は置換えである。
【００３９】
従って、本発明はまた修飾デオキシリボヌクレオチド三リン酸とポリメラーゼをそれらの高濃度標識能について試験する方法をも提供する。
【００４０】
本発明に係る方法は固相上または液相中で行うことが可能である。本発明による方法はＤＮＡ合成と同時にＰＣＲによるＤＮＡ標識に使用することが可能である。
【００４１】
新たに合成される核酸に取り込まれる修飾ヌクレオチドは、蛍光の励起及び検出、免疫学的反応による検出、特異的相互作用（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン）または化学的に導入された標識による検出、等の非放射的方法によって検出される。４つの修飾塩基は異なる標識を有し、互いに識別され得ることが好ましい。例えば、ｄＡＴＰはｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰの修飾とは異なる修飾を持つ。
【００４２】
更に、本発明の方法は、ＤＮＡ配列決定、特に単一分子の配列決定に用いられる。実施形態において、本発明はサブマイクロメーターチャネルにおける単一分子ＤＮＡの配列決定に使用される。この新しい方法は、コーン（ｃｏｎｅ）形の微小キャピラリー中でＤＮＡ鎖から分解された一つの蛍光標識モノヌクレオチド分子の検出と同定に基づく。
【００４３】
高密度標識ＤＮＡの単一分子配列決定の場合、修飾モノヌクレオチドの検出は、分解段階後になされ、このことは修飾モノヌクレオチドが高密度標識ＤＮＡから切断された後を意味する。
【００４４】
本発明に係る方法は、１つまたは幾つかの特異的核酸配列の高感度な検出または定量に使用することができる。
【００４５】
本発明の方法の別の用途は、ＰＲＩＮＳ，またはＦＩＳＨの様な特異的核酸配列のｉｎ ｓｉｔｕの検出である。
【００４６】
ＰＲＩＮＳ（プライムされたＩｎＳｉｔ標識）では、未標識合成オリゴヌクレオチドを中間期分離（ｍｅｔａｐｈａｓｅ ｓｐｒｅａｄｓ）または顕微鏡のスライドの中間期核の変性した染色体の標的配列に対してアニーリングさせる。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドはプライマーとして働き新しく合成されるＤＮＡに高密度で標識ヌクレオチドをｉｎ ｓｉｔｕで取り込む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼで伸長され得る。標識により、新しく合成されるＤＮＡは様々な方法で検出される。例えば、フルオろクロム結合抗ＤＩＧ抗体による間接的検出（ＤＩＧ-ｄＵＴＰが取り込まれた場合）、または蛍光顕微鏡での直接的検出（ローダミン-ｄＵＴＰが取り込まれた場合）がある。
【００４７】
蛍光Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法においては、本発明の方法で創られ得る蛍光標識ＤＮＡプローブが使用される。ＦＩＳＨは例えば全染色体中のある配列を検出する時、ｍＲＮＡ種を検出する時、またはウイルスＲＮＡを検出する時等に使用され得る。本発明の方法で得られ得るより高密度の標識は、感度を失わずより容易に、細胞の密なマトリクスまたは染色体中に拡散できる、より短いプローブの使用を可能にする。本発明の方法による標識ヌクレオチドの全スペクトルの許容はプローブ配列の選択及び複数標識により柔軟性を与える。更に、まれなｍＲＮＡ種の検出における感度と確率が増す。
【００４８】
実施例１
７−デアザプリン - ２’デオキシヌクレオシド５ - 三リン酸誘導体の合成
全般：
薄層クロマトグラフィー（ＴＣＬ）：ＴＣＬアルミニウムシートシリカゲル６０Ｆ２５４（０.２ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ，ドイツ）。逆相ＨＰＬＣは、可変波長モニター（モデル６５５-Ａ）、コントローラー（モデルＬ-５０００）、及びインテグレーター（モデルＤ-２０００）に接続しているＭｅｒｃｋ-Ｈｉｔａｃｈｉ ＨＰＬＣポンプ（モデル６５５Ａ-１２）で４×２５０ｍｍＲＰ-１８（１０μｍ）Li Chrosorbカラム（Ｍｅｒｃｋ）で行った。３１Ｐ ＮＭＲ分光法はＡＣ-２５０ Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ分光計で行った。１２.５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓｅｑｕａｇｅｌ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）はＰＳ２５００ＤＣ パワーサプライ（Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ＵＳＡ）とＬａｕｄａ ＭＧＷサーモスタット（Ｌａｕｄａ，ドイツ）に接続した、またはＨａａｋｅ Ｄ１サーモスタットに接続し、ＥＣＰＳ３０００／１５０パワーサプライ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ）を備えたＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｍａｃｒｏｐｈｏｒシークエンシングゲル単位、ＤＳ９１シークエンサー（Ｂｉｏｎｅｔｒａ，ドイツ）で行った。
【００４９】
プライマー精製の予備的変性ゲル電気泳動は１５％アクリルアミド／尿素垂直スラブゲル（１５ｃｍ×２０ｃｍ×０.２ｃｍ；Ｓｅｑｕａｇｅｌ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で行い、そしてブロムフェノールブルー色素が陽極バッファー貯留所に到達するまで１５０-２００ボルト（コンソートマイクロコンピューター電気泳動パワーサプライ）で電気泳動した。３１Ｐ-ＮＭＲ分光法はＡＣ-２５０ Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ分光計で行った。
【００５０】
５’ - 一リン酸の合成：
修飾ヌクレオシド１．０ｍｍｏｌをアルゴン存在下でトリメチルリン酸（５ｍｌ）に溶解した。氷浴上で冷却した後、新しく蒸留したＰＯＣｌ３（１８０μｌ）を添加し、数時間４℃で反応を保った。（ｉ−プロパノール／Ｈ２Ｏ／ＮＨ３（３／１／１）または（７／１／１）のＴＥＡＢ−バッファーで少量の加水分解した後のＴＬＣコントロール）。反応が完了した時、溶液をＴＥＡＢ−バッファー（２００ｍｌ）に冷却しながら滴下した。エバポレートした後、残渣をＨ２Ｏに溶解させ、ＤＥ５２セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ）カラム（２０×３ｃｍ）にかけた。１ｌのＨ２Ｏで洗浄した後、１ｌのＨ２Ｏと１ｌの１Ｍ ＴＥＡＢバッファーの勾配を用いて精製を行った。５’-一リン酸は０.３-０.４ＭのＴＥＡＢ濃度でカラムから溶出した。
【００５１】
生成物を凍結乾燥し、３１Ｐ−ＮＭＲにより特徴づけた。
【００５２】
５’ - 三リン酸の合成：
５’-一リン酸をＤＭＦｐ．ａ．（１ｍｌ）に溶解または懸濁し、アルゴン下、１,１’-カルボニルジイミダゾール（０.５ｍｍｏｌ、８０ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液で処理した。混合物を３０分間かけて良く密閉された容器で振とうし、一晩室温でアルゴンが漂うエキシケーター(exicator)中に置いた。メタノール（３３μｌ）をアルゴン存在下で添加し、室温にて３０分後、ＤＭＦ ｐ．ａ．（５ｍｌ）中のモノ-（トリ-ｎ-ブチルアンモニウム）ピロリン酸（０.５ｍｍｏｌ、０.１８１６ｇ）が攪拌しながら添加した。反応混合液を一晩アルゴン浮遊エキシケーター中に置き、沈澱を生じさせた。上清を分離し、沈殿物を１ｍｌＤＭＦで４回洗浄し、遠心した。洗浄した液を合わせてエバポレートし、Ｈ２Ｏに溶解して、ＤＥ５２セルロースカラム（２０×３ｃｍ）にかけた。１ｌのＨ２Ｏでカラムを洗った後、１ｌＨ２Ｏと１ｌの１Ｍ ＴＥＡＢバッファーの勾配を用いて精製を行った。目的の産物は０.２-０.４ＭのＴＥＡＢ濃度でカラムから溶出した。５’-三リン酸を凍結乾燥し、３１Ｐ-ＮＭＲにより特徴づけた。
【００５３】
トリフルオロアセチル保護化合物のアミノ基の脱保護：
７-トリフルオロアセチルアミノペンチニル-７-デアザプリン-２’デオキシヌクレオシド５-三リン酸をＨ２Ｏ（１２.５ｍｌ）に溶解し、３.５時間攪拌しながら、濃アンモニア（１２.５ｍｌ）で処理した。２時間アスピレーター真空下で溶液を攪拌してアンモニアを除去し、凍結乾燥した。残渣を０.１ＭのＴＥＡＢ（１０ｍｌ、ｐＨ７.８）に溶解し、ＤＥ５２セルロースカラム（２０×３ｃｍ）にかけた。カラムを０.１Ｍ（１ｌ）から１.０Ｍ（１ｌ）のＴＥＡＢの直線勾配にて溶出させた。主な領域(zone)の画分をエバポレートし、更にエタノールとコエバポレート(co-evaporate)して、凍結乾燥した。
【００５４】
表１：
７-置換-７-デアザ-２’-デオキシアデノシン及びグアノシンの５’−一及び三リン酸の収率と３１Ｐ ＮＭＲデータ
実施例２
鋳型オリゴヌクレオチドの合成と精製：
オリゴヌクレオチドの固相合成は、ホスホロアミダイト化学を用いて自動化したＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems、ＡＢＩ３９２-０８）上で１μｍｏｌのスケールで行った。ｄＧ，ｄＡ，ｄＣ，ＴのホスホロアミダイトとＣＰＧカラムはＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ（ドイツ）から購入した。Aminolink−(Applied Biosystems, ＣＨ３ＣＮ中の１００ｍＭ溶液）はプライマーの更なる５’-標識に使用した。すべてのオリゴヌクレオチドはトリチロン(trityl-on)合成で合成し、次いで支持体からの切断とアンモニアを用いた脱保護を行った（２５％、６０度、１８時間）。
【００５５】
鋳型鎖の精製は、ＯＰＣ（オリゴヌクレオチド精製カートリッジ）カラム（ＡＢＩ Ｍａｓｔｅｒｐｉｅｃｅ，Applied Biosystems，ドイツ）を用い、これに示された精製プロトコールに従って行った。オリゴヌクレオチドは、７Ｍ尿素の存在下で１５％ゲル上でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により更に精製し、ＰＳＣ６０Ｆ２５４＋３６６（Ｍｅｒｃｋ５６３７ 薄層クロマトグラフィー用プレート）でＵＶシャドウイングにより可視化した；目的の長さの産物のバンドを切り出し、０.５ Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ＳＤＳでゲルから溶出させた。得られたオリゴヌクレオチドを濃縮し、ＯＰＣカートリッジを用いて脱塩するかまたはエタノール沈澱させ、そして、適量の水で希釈した。短くした鋳型オリゴヌクレオチド（結合の誤りによる）は合成停止に導くことができ、ここで提示するデータの適当な評価を妨げることから、後半の過程は非常に重要であることが判明した。精製したオリゴヌクレオチドは、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃエバポレーターで凍結乾燥して無色の固体を得、これを１００μｌのＨ２Ｏに溶解し、−１８℃で凍結保存した。
【００５６】
実施例３
プライマーの標識と精製：
オリゴヌクレオチドの脱保護の後、エバポレーションによってアンモニアを取り除き、エタノール沈殿により脱塩した。オリゴヌクレオチドの２０Ａ２６０単位を１００ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）の２００μｌに溶解し、新たに調製した２００μｌエタノール中ＤＩＧ-ＮＨＳ３５０ｍｇの溶液で処理した。反応を室温で一晩シェーカー中で維持し、濃縮し、残った液体を１ｍｌＨ２Ｏに溶解した。０.４５μmフィルターでの濾過後、以下に記載する勾配を用いて逆相ＨＰＬＣにかけた：２０分１００％０.１ＭＥｔ３ＮＨＯＡｃ（ｐＨ７．０）（Ａ），２０-５０分、Ａ中０-４０％ＣＨ３ＣＮ。未標識オリゴヌクレオチドは約２０％のＣＨ３ＣＮ濃度で溶出し、ＤＩＧ-標識オリゴヌクレオチドは約３０％のＣＨ３ＣＮで溶出する。ＤＩＧ-標識プライマーを上記のように脱塩され、ゲル精製する。
【００５７】
実施例４
７ - 置換７ - デアザ - ２’デオキシアデノシン及びグアノシン誘導体の取り込み：
図２で、７-置換７-デアザ-２’デオキシアデノシン及びグアノシン誘導体の取り込みとＴｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼによる他の誘導体ヌクレオチドを用いた伸長を分析した。この目的の為、鋳型オリゴＮｕｃＴ１７，Ｔ１６，Ｔ８とＴ３を使用した。これによって１８個までの隣接位置へのそれぞれの三リン酸の有効な取り込みと、他の修飾デオキシヌクレオシド三リン酸による更なる伸長をモニターすることが可能となった。
【００５８】
塩基対形成則に従うと、２’-デオキシアデノシン誘導体(５０μM）は鋳型ＮｕｃＴ１７を使用して１５個の隣接位置に取り込まれ（レーン７-８）、２’-デオキシグアノシン誘導体は鋳型ＮｕｃＴ１６を用いて２１個までの次の(subsequent)位置まで重合化することができた（図２、レーン９-１０）。レーン１５-３４では、他の誘導されたデオキシヌクレオシド−三リン酸を用いた７-デアザ化合物の更なる伸長を分析した。ＮｕｃＴ８は３つの連続的なＨｅｘ７ｃ７Ａｄから成るトラックにＨｅｘ７ｃ７Ｇｄの成功した添加及び更なるローザミン-ｄＣＴＰによる伸長を証明するために選択した。レーン１５、１８、２１、２４では、Ｈｅｘ７ｃ７Ａｄを有する反応産物が反応混合液中に独占的に存在するデオキシヌクレオチド三リン酸であることが示される。ポリメラーゼ量とヌクレオチド濃度によって、ポリメラーゼは予測通りｄＮＴＰを添加するが、産物は1つ及びややマイナーな２つの重合段階によって鋳型を指示する長さを３個のＨｅｘ７ｃ７Ａｄだけ超え，ポリメラーゼによって鋳型のＣに対して２個までの誤った対のＨｅｘ７ｃ７Ａｄを取り込むことが示される。これは非常に偏ったヌクレオシド三リン酸プールでは一般的に見られる現象である。
【００５９】
レーン１６、１９、２２、２５は、反応に付加的なＨｅｘ７ｃ７Ｇｄが含まれると、前の反応の（上記を参照）予想されたバンド及び予想外のバンドが消失することと、より高分子量の物質が蓄積することを示す。明らかになったレーン１６と２２の中間での停止を考慮すると、鋳型９の指示に従って取り込みが検出可能であった。それぞれの誘導体（レーン１９、２５）の５０μＭを含む反応では、ほどんど停止は見られず、均一バンドが示される。
【００６０】
反応１７、２０、２３、２６においてＨｅｘ７ｃ７ＡｄとＨｅｘ７ｃ７Ｇｄにローザミン-ｄＣＴＰを更に添加すると、すべての反応において再び前の反応の最終産物の更なる伸長がみられた。レーン２３（１ｕポリメラーゼ）の場合、ローザミン-ｄＣＴＰの予測される３個の連続的取り込みが検出できた。これは、ＤＮＡ伸長が連続的に組み立てられ、１２個の誘導体ヌクレオチドからなることを意味している。
【００６１】
レーン２７-３４は鋳型ＮｕｃＴ３を使用した類似する実験を示している。ここではＨｅｘ７ｃ７Ｇｄの５個（鋳型によって指示された）及び６個（１つの追加の重合段階、ヌクレオチドプールの偏りによる）の連続的取り込みがみられる。ビオチン-１６-ｄＵＴＰを反応混合液に添加すると（レーン２８及び３０）、停止が消滅し、高分子量の産物がつくられ、反応２３（９個のＨｅｘ７ｃ７Ａｄ、Ｈｅｘ７ｃ７Ａｄ＋３個のローザミン-ｄＣ’ｓ）の分子量を越える。このことは、末端塩基も挿入されたことを示す（矢印で示す）。レーン３１-３４は、ビオチン-１６-ｄＵＴＰがリンカー長が短い誘導体に置換された反応を示す（例えば、レーン３１、３２のフルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ，レーン３３、３４のＡＭＣＡ-６-ｄＵＴＰ）。ここでは完全な伸長があったと推測され、顕著な停止や終結部位は検出されない。
【００６２】
より高いポリメラーゼ濃度では、３０を越える挿入がみられた（レーン１４）。これは伸長されたプライマー鎖のルーピングバックメカニズムや高い温度での再度のハイブリダイゼーションによるものであろう。Ｔａｑポリメラーゼと天然ｄＮＴＰを用いたコントロール反応ではＮｕｃＴ１６で２２個の挿入が見られた（レーン４、５）。クレノウ断片は同様の条件下、ＮｕｃＴ１５を用い、しかし３７℃にて、１９個までの天然ｄＮＴＰを合成することが可能であった（データは示さない）。
【００６３】
この実験構成では、Ｈｅｘ７ｃ７ＡｄとＨｅｘ７ｃ７ＧｄからなるＤＮＡ鎖は他の誘導ｄＮＴＰで容易に伸長することができ、全長産物を生成することを示すことができた。
【００６４】
実施例５
Ｔｇｏ ｅｘｏ - ポリメラーゼによるローダミン - グリーン - ｄＵＴＰとローダミン - グリーン - Ｘ - ｄＵＴＰの取り込み
本実験では、天然デオキシヌクレオシド三リン酸を用いた２種のローダミン-グリーン誘導体の取り込みと伸長を検討した。反応は別の実験において取り込み効率を促進することが示された（データは示さない）０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００の存在下でＴｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼにより触媒された。２種のヌクレオチドコンジュゲートはそのスペーサー化合物が異なっていた。ローダミン-グリーン-ｄＵＴＰ（ローダミン-グリーン-５（６）-カルボキシアミド-［５-（３-アミノアリル）-２’デスオキシ-ウリジン-５’-トリホスフェート］）は、５原子のスペーサー基を、ローダミン-Ｘ-ｄＵＴＰ（ローダミン-グリーン-５（６）-カルボキシアミド-ε-アミノカプロイル-［５-（３-アミノアリル）-２’デスオキシ-ウリジン-５’-トリホスフェート］）は１２原子のスペーサー基をデスオキシヌクレオシド化合物と発蛍光団分子との間に有する。
【００６５】
図３は両方の化合物が有効に取り込まれたことを示している。これら２者間の質量の違いは、それぞれレーン７、１１とレーン１５、１９間の矢印によって示されている。鋳型ＮｕｃＴ４では、４個の挿入後に重合が停止することが示される（レーン７、１１、１５、１９、２３、２７）の後、重合は停止することを示した。いくつかの重要でない誤った取り込みが、鋳型の配列がチミジン残基である位置５で検出することができた（レーン１１、１９、２７）。この誤った取り込みを超えて、それ以上の伸長は検出できない。反応混合液に更にｄＡＴＰとｄＧＴＰを添加すると、位置４の主な停止は克服できる。双方の誘導体で、より高分子量の産物が生成する（レーン８、１２、１６、２０、２４、２８）。しかし、この鋳型では、全長産物が作られるかどうか（１２個の挿入、そのうち９個は誘導体）はまだあいまいである。このデータは、ポリメラーゼが位置１１で停止し、最後の誘導体は位置１２に非常にわずかしか添加されないという解釈に有利である。０．１または１単位のポリメラーゼを使用したかどうか、反応時間が３０分から６０分に延長されたかどうかで大きな違いは検出されなかった。より長いインキュベーション時間とより多くのポリメラーゼを使用した場合、全長生成物の量のみ増加した。
【００６６】
鋳型ＮｕｃＴ１５（１８個の連続した挿入が可能）の場合、短いリンカーアームの誘導体が１５-１６個の隣接位置まで挿入された（レーン２５と２６の比較）。一方、ローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰは、１８個の位置まで重合され、主要生成物は１３-１７個の挿入（レーン３０）であった。これ以下の停止はフィルムの露出過剰の後にのみ検出され、このヌクレオチドがポリメラーゼに対して非常に良い基質であり、ＤＮＡ合成を失敗させないことをを示している。リンカー長はポリメラーゼにより受け入れられる基質にある影響を及ぼし得ることも推量される。この場合、より長いリンカー化合物は基質としてより受容される結果となることが容認されるだろう。このことは、ローダミン-グリーン -ｄＵＴＰの１６ヌクレオチドの代りに、ローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰを１８ヌクレオチドまで挿入できるポリメラーゼについてだけではなく、レーン７、１５、２２とレーン１１、１９、２７を比較した時にも証明される。ローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰの場合、４番目のヌクレオチドの挿入までいかなる停止も検出されないが、ローダミン-グリーン −ｄＵＴＰでは２及び３個のヌクレオチドの取り込み後に停止が検出される。
【００６７】
実施例６
種々のポリメラーゼによる種々のＵ−誘導体の取り込み
本実施例では、種々の型のポリメラーゼの、種々のリポーター基をタグ付けしたヌクレオチドの取り込み能を分析した。使用したポリメラーゼは異なるサーモコッカス種由来の２種の非常に近接したＢ−タイプポリメラーゼ（３’-５’exoマイナス変異体）、及びカルボキシドサーマス ハイドロジェノフォルマンスのＡ−タイプポリメラーゼの遺伝的に短くしたもの（クレノウ断片、５’-３’-ヌクレアーゼ活性を欠く）であった。ここでの実験は、１８個のアデニン残基からなる鋳型を使用し、３’-プライマー末端から始まり、ポリメラーゼが隣接した位置で１８個の変異体ヌクレオチドを取り込むことができるようにした。反応はそれぞれ修飾ヌクレオチド５μＭ及び５０μＭ（最終濃度）、及び０．１及び１単位のポリメラーゼで実施した。反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣＬ，２０℃におけるｐＨ＝８．５、１０ｍＭ ＫＣＬ，１５ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、７ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ２-メルカプトエタノール、各ポリメラーゼに使用）に0.01％（vol/vol）のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ-１００を取り込みを促進するために添加した。
【００６８】
図４は、誘導体ＴＭ-ローダミン-ｄＵＴＰ、Ｃｙ５-１０-ｄＵＴＰ，フルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ及びＡＭＣＡ-６-ｄＵＴＰを用いた場合、より高濃度のポリメラーゼ（１単位／反応）では、０．１単位／反応（それぞれレーン７、８；１１，１２；１４、１６；１９、２０とレーン９、１０；１３、１４；１７、１８；２１、２２との比較）より長い産物が合成された。フルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ、ビオチン-１６-ｄＵＴＰまたはＤｉｇ-１１-ｄＵＴＰ及びより低濃度（０．１単位／反応）のＴｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼを用いた反応においては、全長産物が検出された（レーン２８と３１）。
【００６９】
ＡＭＣＡ-６-ｄＵＴＰ（レーン１９-２２）とＤｉｇ-１１-ｄＵＴＰ（レーン３１-３４）の場合、実際に取り込まれたヌクレオチドの量は正確には決定できなかった。これは、他の点で最適でない反応状態下（５μＭ修飾ｄＮＴＰ；０．１単位ポリメラーゼ）での合成中に停止がなかったことによる。このことは、他の誘導体（例えばＣｙ５-１０-ｄＵＴＰ）と比較して、これらの化合物の高い基質活性と、優れた取り込み性能を示している。
【００７０】
伸長されていないプライマーと生成した種々の産物間の移動距離は、各誘導体と天然ｄＮＴＰを用いたコントロール（例えばレーン４、５）間で実質的に変化する。このことは誘導体が種々の分子量であることを表している（注、Ｄｉｇ-１１-ｄＵＴＰ（ｍｗ：１０９０．７Ｄａ）と比べると、ＡＭＣＡ-ｄＵＴＰは比較的小さい分子（ｍｗ：７４８．１Ｄａ）であり、変性ゲル電気泳動での全長産物のより高い移動性を説明する）。ＴＭ-ローダミン-ｄＵＴＰとＣｙ５-１０-ｄＵＴＰはＶｅｎｔ ｅｘｏ-ポリメラーゼにより１４箇所及び１３箇所にそれぞれ挿入され、産物の多くはＴＭ-ローダミンについて１０から１３個の取り込み（レーン９、１０）と、Ｃｙ５-１０-ｄＵＴＰについて１１及び１２個の取り込み（レーン１４）であった。全長合成が生じたか否かを記録するための反応中間体のバンドパターンの解釈（較正）を容易にするために、最適でない反応パラメーター（５μＭｄＮＴＰ、０．１単位ポリメラーゼ）を選択した（レーン２７を参照）。ビオチン-１６-ｄＵＴＰはＴｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼによりすべての可能な位置に取り込まれた。レーン２７は、低濃度ポリメラーゼ及びヌクレオチドにおける位置１-１０（１１、元のフィルムではほとんど見えない）からの合成停止を示し、レーン３０の１８個の取り込まれたヌクレオチドの適切な測定を可能とする。観察された各取り込み段階のバンドの分離はおそらくビオチン-１６-ｄＵＴＰ調製で見られる立体異性体の存在のためであろう（Ｍｕｅｈｌｅｇｇｅｒ，私信）。
【００７１】
本実施例において、Ａ-、Ｂ-タイプポリメラーゼの双方は、高マグネシウム濃度（７ｍＭ）と洗浄剤（０．０１％ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）-Ｘ-１００を用いて、隣接位置において、誘導ヌクレオチドの長い伸長を合成できることが実証された。取り込まれた化合物のより高い分子量によって、全ての産物は、通常のヌクレオチド-三リン酸を用いたコントロール反応で形成する生成物と比較すると（レーン１−６）より高分子量へ移行する。この系において、ＡＭＣＡ-、ビオチン-、及びＤｉｇ-ｄＵＴＰが最高の取り込み率を示し、フルオレセイン- ｄＵＴＰがこれに続く。Ａ-タイプ（Ｃｈｙ-クレノウ）とＢ-タイプポリメラーゼ（Ｔｇｏ ｅｘｏ-）間の後者の基質の取り込みを比較すると、操作されたＢ-タイプポリメラーゼ（より多くの挿入、停止がより少ない；レーン１５-１８と２３-２６を参照）がより良い取り込み性能を有するとみなし得る。Ｂ−タイプポリメラーゼ（特に、３’-５’エキソヌクレアーゼ機能が欠如したもの）は、誘導ｄＮＴＰを独占的に用いた標識反応を実施する上で選択すべき酵素と考えられる。３’-５’エキソヌクレアーゼ活性は、プライマー及び／または鋳型ＤＮＡの分解のために、標識効率に対して有害なものとみなすべきである。これらのポリメラーゼの野生型は３’-５’エキソヌクレアーゼ活性を、ＤＮＡポリメラーゼ活性１単位あたり５倍まで示すため、３’-５’エキソヌクレアーゼ活性の欠如は都合が良いとみなされるべきである。
【００７２】
実施例７
Ａ - タイプポリメラーゼによる種々のリンカーアーム長を持つＣｙ - ５ - ｄＵＴＰの取り込み
本研究では、種々のポリメラーゼによる取り込みに対するリンカーアーム長の影響（実施例５も参照）を検討した。実施例２で既に指摘したように、こうした化合物の酵素的重合に対して、ヌクレオシド−化合物と発蛍光団／検出し得る基との距離が影響し得る。本研究で、我々は１７、２４、及び３８原子のＣｙ-５-ｄＵＴＰ-誘導体のリンカーアームの長を用いた。
【００７３】
酵素的反応はそれぞれ鋳型ＮｕｃＴ４とＴ１５で行なった（図５）。使用したポリメラーゼは反応あたり０．１単位濃度のＴａｑ及びＣｈｙ-クレノウポリメラーゼであった。天然ｄＮＴＰ（レーン８、１１、１４、２３、２６及び２９）を用いた更なる伸長をモニターするため、誘導体濃度は５及び５０μＭであり、５０μＭの反応では、その上に１２．５μＭのｄＡＴＰとｄＧＴＰを別の反応チューブに添加した。
【００７４】
本実施例で、取り込み効率はリンカー長によることが明らかになった。Ｔａｑポリメラーゼは１７-原子-スペーサーの化合物を２回のみ取り込み、双方の鋳型で１回の取り込み後にのみ合成停止が見られた（レーン７-９、１５、１６）。それ以上の反応産物は検出されなかった。Ｃｈｙ-クレノウポリメラーゼは最大挿入数３個（４個の挿入がトレース量、レーン３１）のであるこをが示されたが、２個の取り込み後に重大な停止を持つ一方、一個のみの挿入後の停止が大きく減少する（レーン６、７、１５、１６とレーン２１、２２、３０、３１の比較）。
【００７５】
中間のスペーサー長を有する化合物（２４原子）はＴａｑポリメラーゼにより３つの位置に重合され、Ｃｈｙ-クレノウポリメラーゼで４つの位置に重合された（鋳型ＮｕｃＴ４、レーン９-１１とレーン２４-２６の比較）。レーン１１における追加のバンドの発生は反応混合液中に存在する天然ｄＮＴＰの過った取り込みから起こっているであろう。しかし、Ｃｈｙ-ポリメラーゼを使用すると、これらの中間バンドはレーン２６で欠けている。ここで（レーン２６）、鋳型が指示する４個の誘導ヌクレオチドの重合の後に、更なる伸長が観察される（４個の取り込みの後の停止バンドの減少）が、全長産物の検出は不可能だった。ほとんどの場合は合成は位置１０（主な産物）後に停止し、位置１１で１個が（更に）過って取り込まれたマイナーな産物が検出可能である。鋳型ＮｕｃＴ１５では、Ｔａｑポリメラーゼ（５）とＣｈｙ-クレノウ−ポリメラーゼ（９）で追加の重合事象ポリメラーゼが検出できる（それぞれレーン１７、１８と３２、３３を参照）。レーン１８において生じる中間バンドの性質は、レーン３２と３３においては見られないため、未結合ｄＵＴＰ（デオキシヌクレオシド分子に結合し、色素に結合していないスペーサーのみを有する）の混入は考えにくく、理解されていない。中間のスペーサー長を有する化合物は、短い１７-原子-化合物よりもより近くの位置に取り込まれるが、やはり２以上の挿入後、合成を停止させる傾向がまだある。
【００７６】
しかしながら、３８原子スペーサーの化合物は他の２つ（１７と２４原子距離）の物質とは取り込まれる能力において異なる。第１に、鋳型ＮｕｃＴ４では、使用される双方のポリメラーゼで１-４個の取り込みの間、検出し得る合成停止はずっと少ない（レーン１２-１４と２７、２９を参照；レーン２８では、伸長が全く検出されないことから明らかにポリメラーゼの添加が省略されている）。しかしながら、位置４における天然の停止は、ｄＡＴＰとｄＧＴＰの添加により克服できた。レーン１４（Ｔａｑポリメラーゼ）では、位置４での停止の消失が見られ、次いで天然ｄＡＴＰとｄＧＴＰの取り込み、更に２個の修飾ヌクレオチドの取り込みが生じ、鋳型の位置７で終わる主要産物と位置８で終わるマイナー産物が得られる。レーン２９では、Ｃｈｙ-ポリメラーゼが４個の取り込まれたＣｙ-５-ｄＵＭＰを伸長できたことを示すが、Ｔａｑ-ポリメラーゼによって触媒されるよりかなり効果が少ない。一方、産物の長さはＣｈｙ-ポリメラーゼでより高い（１２個の取り込み中全部で１０個が証明される）。
【００７７】
鋳型ＮｕｃＴ１５では、Ｔａｑポリメラーゼが７個（レーン１９）と６個（レーン２０）のＣｙ-５-ウラシル-誘導体の伸長を合成することができ、５個及び６個の取り込みが主要な産物であった。Ｔａｑポリメラーゼは、多くの合成停止を生じ、これはＣｈｙ-ポリメラーゼを用いた各反応では存在しなかった（レーン３４と３５）。その上、この酵素は、８個の取り込みを重合でき、５から７個のＣｙ-５-ｄＵの並んだ主要産物を生じ、４個の挿入以下では停止が検出されなかった。従って、効率的な取り込みにはスペーサーアーム長が重要な値であると結論できる。この場合、より長いスペーサーを有する化合物となるにつれて（２４-と３８-原子）挿入がより効果的になり、重合中の合成停止が少なくなる。しかし、使用するポリメラーゼ間での多少の違いもある。本実施例では、Ａ-タイプポリメラーゼの末端切断型（Ｃｈｙ-クレノウ断片）がＴａｑ野生型ポリメラーゼより良い取り込み性能を示した。
【００７８】
実施例８
Ｂ - タイプポリメラーゼによる種々のリンカーアーム長を有するＣｙ - ｄＵＴＰとＭＲ１２１ - ｄＵＴＰの組み込み
本実施例では、Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼ（Ｂ - タイプ、反応あたり０．１単位）によって、８、１３及び２４原子のスペーサーアームを有する実施例４の３種のＣｙ５-ｄＵＴＰと、さらに３種のＭＲ１２１-ｄＵＴＰ誘導体の組み込みを調べた。重合を調べるために使用した鋳型は、再度ＮｕｃＴ４とＴ１５（図６）とした。
【００７９】
ｄＡＴＰとｄＧＴＰは添加しないで鋳型ＮｕｃＴ４を使用すると、鋳型により指示された４つの組み込み（レーン６、７、９、１０、１２、１３）後、３種の全てのＣｙ-５-変異体の重合が停止した。これらのレーンを比較すると、例えば最小（１７原子のスペーサー）の化合物の４つの組み込みは、約１３個の正規のヌクレオチド組み込みのゲル位置に移動したことも示される（コントロールのレーン３）。より長いスペーサーを持つＣｙ-５-化合物は、それらのモル質量が高いため、このバンドと比べてシフトした。他の注目すべき特徴は、本明細書中では、短いスペーサーアームが１、２及び３個の組み込みの後に合成中停止するように導くというものであり、実施例４の場合と同様であった。２４原子のスペーサーは、有意に異なるパターンを示した。この場合（レーン９）、三リン酸濃度（５マイクロモル）が低い場合のみ、位置３での単一の停止が検出可能である。一方では、３８スペーサー誘導体は、有意な停止はなく組み込まれた（レーン１２-１４）。すべてのプライマーは、必要な天然ｄＡＴＰとｄＧＴＰの添加により、この４番目の位置からさらに伸長し、１７原子および２４原子の化合物の場合には全長産物が得られた。しかしながら３８原子のスペーサー化合物は、１０番目の重合が停止するまで他の２つのヌクレオチドと共に組み込まれただけであった。
【００８０】
鋳型ＮｕｃＴ１５の使用によって、ＮｕｃＴ４にみられるように、組み込みを考慮にいれた類似の傾向が明らかになった。短いリンカー化合物は、２、３、４つの組み込み後にみられる主要な停止で、初期のＤＮＡに１０回まで導入され、そして１０個までの組み込みで連続合成が中断される（レーン２４、２５）。中間リンカー化合物（レーン２６、２７）は、低（ほぼ最適な）誘導体濃度（５μＭ、レーン２６）で、３つの組み込みの後に明らかに停止したが、三リン酸高濃度（レーン２７）ではそれを克服できたものであることが示された。この化合物を用いると、１０個の隣接した重合工程も検出可能であり、これはＢ-ＤＮＡの１つのヘリックスターンのおおよその量である。
【００８１】
有意で良好な組み込みは、３８原子のスペーサーヌクレオチドを用いた場合に達成された。この誘導体は、１８箇所の可能な位置のうち１１箇所（レーン２８、２９）に導入されたが、合成中の停止はかなり少ない程度で起こった。高濃度（５０μＭ）では、組み込みは７個より少なく（レーン２９）、停止はほとんど検出されなかった。この反応の主要な産物は８〜１０個の組み込みを有する。
【００８２】
３種のＭＲ１２１-ｄＵＴＰデオキシヌクレオシド三リン酸の組み込みに関して類似の傾向は、レーン１５-２３と３０-３５にみられる。ここで短いリンカーアーム（８原子）によって、鋳型ＮｕｃＴ４を用い、低濃度（５μＭ）で（レーン１５-２０）、また鋳型ＮｕｃＴ１５を用いて（レーン３０）、２、３及び４つの組み込みの後に合成停止が導かれた。より長いスペーサー分子（１３及び２４原子）を持つ２つのヌクレオチドは停止バンドがないが、均質な産物ではなく、ゲル中において高分子のシミ（レーン２０-２３）のみを示した。不連続の停止合成バンドはみられなかった。一方では、プライマーはほぼ完全に消費され（コントロールレーン１、２、４及び５と比較した場合）、このことは、プライマーが、それぞれの誘導体化ヌクレオチドと組み合わせて使用したＤＮＡポリメラーゼにより伸長されたことを示している。この事実はおそらく新たに組み込まれた色素結合ヌクレオチドが、上記のようにしてＤＮＡの物理化学的性質を変えたことで、結果的に得られる分子には慣例的なＤＮＡ分析法では解析できなかったことを説明する。
【００８３】
図６ａ、すなわち図６（レーン６-２３）のブロット部分は、ストームイメージャー（Molecular Dynamics）で解析された。原則として、図６と比較して同じバンドのパターンが検出されたことを示す。しかし、ここでは、少なくとも１つの組み込まれた色素分子によって開始する産物のみが検出される（レーン１-９）。予測通り、非伸長Ｄｉｇ-標識プライマー産物は、シグナルを産出しない。ＭＲ１２１-標識デオキシヌクレオチドは弱い蛍光シグナルを生じ、それはこの検出系におけるＭＲ１２１の最適ではない励起及び発光パラメータと共に適合する。しかし、化学光検出系と同様に、ここでは分離してない産物バンドは８以上の原子のスペーサー長が解析された（レーン１２、１３と１５-１８との比較）。
【００８４】
本実施例では、試験した実施例４のＡ−タイプポリメラーゼよりも変異型３’−５’エキソヌクレアーゼ機構を持つＢ−タイプポリメラーゼの方が良好にＣｙ-５-ｄＵＴＰ化合物に組み込まれたことを示している。各Ａ-、Ｂ-タイプポリメラーゼに対して、スペーサー分子が長くなると、より良好な組み込みの傾向があることが実証されている。非常に疎水性の蛍光色素ＭＲ１２１は、組み込み後ＤＮＡの性質を変えるが、これらの分子は実験上の機構では解析ができなかったものである。
【００８５】
実施例９
誘導体化化合物により置き換えられた全４種の天然のｄＮＴＰを用いたＤＮＡの合成
この実験は、鋳型ｃａｓｓ１、ｃａｓｓ５、ｃａｓｓ１０（図７）を用いて行なわれた。使用したポリメラーゼはＴｇｏ ｅｘｏ−およびＶｅｎｔ ｅｘｏ−（各０．１、０．５及び１単位）であった。天然のｄＮＴＰは、コントロール反応（レーン１-６）を除いて、それらの誘導体化類似体により完全に置き換えられた。すべての反応混合物と鋳型ｃａｓｓ１，ｄａｓｓ５およびｃａｓｓ１０による産物は、４＋１、２０＋１および４０＋１ヌクレオチド組み込みに相当するレーン３、４及び５に示す。ひとつの“余分な”ヌクレオチドの末端付加はＴａｑポリメラーゼの特徴として一般に知られている。
【００８６】
レーン７-１０には、ｃａｓｓ１とＶｅｎｔ ｅｘｏ-ポリメラーゼを用いた反応産物を示す。反応７（レーン７）には、アッセイに存在する唯一のヌクレオチド三リン酸であるＨｅｘ７ｃ７Ｇｄが含まれた。ここではプライマーが、塩基対合規則に対応してひとつのヌクレオチドにより正確に伸長され、誤った組み込みは検出されなかった（図１ｂを参照：材料と方法におけるＣａｓｓ１-１０の配列）。反応８（レーン８）には、さらにローザミン-ｄＣＴＰ（他のヌクレオチドはない）が含まれた。組み込み後の停止は克服され、そして５〜６個の組み込まれた天然ｄＮＴＰの範囲で他のバンド（シフトしたもの）がみられた。これは、反応７からの末端Ｈｅｘ７ｃ７Ｇｄ残基がローザミン-ｄＣＴＰによって更に伸長したということである。レーン９では反応混合液には反応８に加えてＨｅｘ７ｃ７Ａｄが含まれた。ここでも、反応８での停止は消え、新たに添加された化合物によって伸長した（７-デアザ-ｄＡＴＰの比較的マイナーな修飾と一致する、反応８の産物までのわずかな移動距離に注意）。しかし、ここでは明確に定義される単一バンドの代りに、計３本のバンドが可視化されるが、これは誤った組み込みを意味し、ほとんどはおそらくアデニン残基（鋳型配列の最後の塩基）と向かい合わせの塩基である。反応１０では、反応９の他の３つのヌクレオチドに加え、ビオチン-１６-ｄＵＴＰを添加した。ここでは適当なヌクレオチドが鋳型配列中のＡの向かい側に挿入された。上述したように、立体異性体の発生の結果として、バンド分離はここでも検出された（Ｍｕｈｌｅｇｇｅｒ，私信）。誤った組み込みはわずかな程度でのみ検出された。
【００８７】
レーン１１-１４において、レーン７-１０で証明されたように、同じ反応は、Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼにより目下のところ触媒されている。この酵素の注目すべき特徴は正確さであり、その理由はＶｅｎｔ ｅｘｏ-の誤った組み込み（レーン９）がこのポリメラーゼでは起こらなかった（レーン１３を参照）からである。ここでは、Ｈｅｘ７ｃ７Ａｄを反応混合液に添加した後、一つの分離したバンドだけが可視化される。この位置から最終産物を得るためにビオチン-１６ｄＵＴＰを結合させた。
【００８８】
レーン１５-２２においては、レーン７-１４と同じであるが、鋳型ｃａｓｓ５を用いた実験を示している。ここで、２つのポリメラーゼを比較すると、類似の反応産物パターンが得られている（レーン１５-１８：Ｖｅｎｔ ｅｘｏ-ポリメラーゼ；レーン１９-２２：Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼ）。しかし、完了した反応混合液の産物（レーン１８-２２）は、それらの長さを考慮すると正確に分析されない。これは、より高濃度（５０μＭ）のヌクレオチドと０、１単位の代りに０、５単位のポリメラーゼを使用した場合（レーン２-２６）でも不可能である。ここで、誤った組み込みの傾向は、ヌクレオチド濃度とポリメラーゼ濃度が低い反応と比較すると増大した（レーン１６、１７とレーン２４、２５の比較）。特に、レーン２５とｃａｓｓ１０を用いた場合（レーン２９）では、不完全なヌクレオチド混合物が使用された場合に、大量の異なる中間産物が測定されうる（レーン１３と比較）。しかし、完全なｄＮＴＰ混合物が使用された場合（レーン２２、２６、３０を参照）には、失敗した合成産物が本実施例ではないので、これらの誤った組み込みはすべて明らかに形成されていない。
【００８９】
ｃａｓｓ１０が鋳型として機能する場合、ｃａｓｓ５よりも、より長い反応産物が合成されたが、所定の産物は産出されない（レーン３０、３２）。この場合にはいくつかの中間産物が検出される。標的配列に達していたか否かの、情報は得られない。Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼ産物はより少ない停止とより長い産物（レーン３０とレーン３２とを比較）を生じる傾向がみられる。ローザミン-ｄＣＴＰを正規のｄＣＴＰに置き代えると（レーン３４-３６）、推定の最終産物が重合される（レーン３６）。ここで、反応３０と３２よりずっと少ない程度に停止がおこる。誘導体化ローザミン-ｄＧＴＰが正規のｄＧＴＰ（より低分子量である）と置き換わったが、反応３６の最終産物は、反応３０と３２の最長の産物よりも、より高分子量の位置に移動するため、反応３０と３２での全長合成は失敗したにもかかわらず、反応３６は明らかに標的配列に到達している。
【００９０】
本実施例では、ｃａｓｓ１のみを用いて、誘導体による全４種のヌクレオチドの全置換が証明された（レーン７-１４）。
【００９１】
ｃａｓｓ１０を使用する場合（レーン２７-３０及び３２-３６）、バンドは１８個組み込まれた天然ヌクレオチド（レーン１５-２６、ｃａｓｓ５を使用した場合）の範囲に、また３８−３９個の天然ヌクレオチドの範囲に移動し、これは、ヘテロ２本鎖の鋳型プライマーが不完全に変性されたことに対応するものであり、他のいくつかのコントロール実験でも検出されうる（データは示さない）。
【００９２】
実施例１０
誘導されたヌクレオチド三リン酸による天然ｄＮＴＰの完全置換及び４０塩基対の標的配列の重合
実施例６で使用された鋳型を用いた場合、電気泳動中の合成停止と不規則な移動により、ｃａｓｓ５と１０での反応の産物の長さを正確に決定することは不可能であった。本実施例（図８）では、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される正確な重合の回数を決めるため、本発明者は鋳型ｃａｓｓ１-１０の完全なセットを使用した。カセット１-１０は１０種類のオリゴヌクレオチドであり、基礎単位から構成され、互いに長さが４ヌクレオチドずつ異なる。これらの基礎単位において、各塩基が一度ずつ提示される。ここで使用されたヌクレオチドは、Ｈｅｘ７ｃ７Ｇｄ、ジゴキシゲニン-ｄＣＴＰ、アミノペンチニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ、ビオチン-１６-ｄＵＴＰである。ローザミン-ｄＣＴＰをこのアッセイではＤｉｇ-ｄＣＴＰにより置き換えた。その理由は、後者は得られる重合産物の電気泳動の移動度を妨害しないからである（データは示してない）。使用されたポリメラーゼはＴｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼ（反応当たり０．１単位）であった。
【００９３】
ｃａｓｓ１での反応産物は、露光過度の後でのみ可視化され、図８では星印で印をつけてある。鋳型としてｃａｓｓ１０及び天然ｄＮＴＰを用いたコントロール反応（４０個の取り込みが可能）をレーン１-４に示してある。
【００９４】
使用する鋳型の長さが増すにつれ（ｃａｓｓ１-１０）、重合産物の長さも増加したことが示される。実施例６の結果と比較すると、合成停止の数は、組み込まれたヌクレオチドの最大数（４、８、１２．．．）の１ｎを、カセットごとに異なる電気泳動移動度の増加（プライマーと産物との距離）に対してプロットすると、線状の相関性がみられる（図８ａ）。このことから、全長産物がすべてのカセット-鋳型で合成されたことを強く示している。ここで、ＤＮＡ配列は酵素的（組み込まれたヌクレオチドの最大数：４０、各塩基につき１０回）に形成され、プリン類がそれらの７-デアザ-類似体により置き代えられ、ピリミジン類がレポーター基に結合した通常の核酸塩基である、４種の誘導されたヌクレオチドから構成される。
【００９５】
実施例１１
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による修飾ヌクレオチドの取り込み
修飾ｄＮＴＰの有効な取り込みの測定のための第２の実験法として、ＰＣＲを選択した。ＰＣＲでは、プライマー伸長反応とは違い、数ラウンドの増幅の後にも標識されたヌクレオチドが鋳型鎖に存在し、最終的に双方の鎖が２本鎖ＤＮＡの各５’末端の未標識プライマーを除き、誘導された化合物から成る。反応混合液では各天然ヌクレオチドはそれらの標識された対応物により完全に置き代えられた。増幅パラメーターは以下の通りである：
１×９５℃２分
３５×９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒
鋳型濃度は反応あたりｔＰＡ-遺伝子を含む線状化プラスミド０．５-０．７ｆｍｏｌとした。５１７ｂｐＤＮＡ断片を生じさせるプライマー（ｔＰＡエクソン９ ５’-ＴＧＧ．ＴＧＣ．ＣＡＣ．ＧＴＧ．ＣＴＧ．ＡＡＧ．ＡＡ-３’（配列番号１）とｔＰＡエクソン１２ ５’-ＡＧＣ．ＣＧＧ．ＡＧＡ．ＧＣＴ．ＣＡＣ．ＡＣＴ．Ｃ-３’（配列番号２）、そして２６４ｂｐＤＮＡ産物を生じさせるｔＰＡエクソン１０ ５’-ＡＧＡ．ＣＡＧ．ＴＡＣ．ＡＧＣ．ＣＡＧ．ＣＣＴ．ＣＡ-３’（配列番号３）とｔＰＡエクソン１１ ５’-ＧＡＣ．ＴＴＣ．ＡＡＡ．ＴＴＴ．ＣＴＧ．ＣＴＣ．ＣＴＣ-３’（配列番号４））は各２０ｐｍｏｌとした。
【００９６】
反応あたりのポリメラーゼ量は２．６単位、各ｄＮＴＰのヌクレオチド濃度は２００μＭであった。サイクル処置の後、プローブを２％アガロースゲルで解析した。与えられた誘導体を良好なものとして受け入れるための指標は産物のバンドが作られることであった。
【００９７】
一般に、これらの産物はモノマー基礎単位がより高分子量であるために、分子量がシフトした。より高分子量への移行は使用する化合物に厳密に依存していた。図９に示す例では、ビオチン化した２６４ｂｐ産物が、約５２０ｂｐの見かけの分子量に移動した。この断片をゲル（レーンD）から単離し、ＤＮＡを回収して、天然ｄＮＴＰを用いた新たな増幅のラウンドで鋳型として使用し、元の２６４ｂｐ産物を生じさせる（復帰）。レーンDのＤＮＡ鋳型を各希釈段階（レーンＥ-Ｊ）で１０倍ずつ順次希釈すると、産物収量の減少がみられた（鋳型滴定）。ゲルの約５００ｂｐ位置から鋳型を回収したため、プラスミドを含む線状化されたプラスミノーゲン活性化因子遺伝子の残りのプラスミドＤＮＡがここで鋳型として機能するという可能性は非常に低い。そして、復帰により得られた産物を精製して配列決定した。配列決定より、元のプラスミドと比較して、配列には変化がないことが明らかにされた。
【００９８】
表２ではいくつかのポリメラーゼが異なる誘導体デオキシヌクレオチドで産物を合成できたことを示している。
【００９９】
表２ 各天然ｄＮＴＰがそれらの誘導化された対応物により完全に置き代えられたＰＣＲ。
【０１００】
【０１０１】
アミノペンチニル-７-デアザ-ｄＡＴＰの場合で、他の誘導体との組み合わせにおいてのみ、いくつかのポリメラーゼによって産物が作られることに留意すべきである。ｄＴＴＰを（Ａ-Ｔ-塩基対が完全に置き代えられた）Ｄｉｇ-またはビオチン-１６-ｄＵＴＰによって置き代えた時、産物が作られた。この産物はアミノ機能化された塩基を組み込んでおり、それによって蛍光色素または検出しうる基による”ポストラベリング”にとって理想的な基質になる。
【０１０２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ａ：Ｎｕｃ鋳型／プライマーシステムを示す。
ｂ：カセット１-１０の鋳型／プライマーシステムを示す。
【図２】ヘキシニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ及びヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰの取り込みを示す。
レーン１-６：反応当たり０．１単位のＴａｑ-ポリメラーゼを用いたコントロール反応。レーン１：プライマーとバッファーのみ；レーン２：鋳型１７、完全な反応混合物、すべての４ｄＮＴＰ；レーン３：レーン２と同様であるがｄＡＴＰのみ；レーン４：鋳型１６、完全な反応混合物、ｄＧＴＰのみ；レーン５：レーン４と同様であるがすべての４ｄＮＴＰ；レーン６：鋳型を除いた完全な反応混合物；レーン７-８：鋳型１７、０．１単位のポリメラーゼ、それぞれ５及び５０μＭのヘキシニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ；レーン９-１０：鋳型１６、０．１単位のポリメラーゼ、それぞれ５及び５０μＭのヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰ；レーン１１-１４：レーン７-１０と同様であるが１単位のポリメラーゼ；レーン１５-１７：鋳型８、０．１単位のポリメラーゼ、５μＭの誘導されたヌクレオチドであるヘキシニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ（レーン１５）、ヘキシニル-７-デアザ-ｄＡＴＰとヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰ（レーン１６）、ヘキシニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ、ヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰとローザミン-ｄＣＴＰ（レーン１７）；レーン１８-２０：レーン１５-１７と同様であるが５０μＭのｄＮＴＰ；レーン２１-２６：レーン１５-２０と同様であるが１単位のポリメラーゼ；レーン２７-３４：鋳型３；レーン２７：ヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰ（５０μＭ）、０．１単位のポリメラーゼ；レーン２８：ヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰとビオチンｄＵＴＰ（各５０μＭ）、０．１単位のポリメラーゼ；レーン２９-３０：レーン２７-２８と同様であるが１単位のポリメラーゼ；レーン３１-３２：ヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰとフルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ（各５０μＭ）、それぞれ０．１単位及び１単位のポリメラーゼ；レーン３３-３４：ヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰとＡＭＣＡ-６-ｄＵＴＰ（各５０μＭ）、それぞれ０．１単位及び１単位のポリメラーゼ。
化合物：Ａ：ヘキシニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ；Ｂ：ヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰ；Ｃ：ローザミン-ｄＣＴＰ；Ｄ：ビオチン-１６-ｄＵＴＰ；Ｅ：フルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ；Ｆ：ＡＭＣＡ-６-ｄＵＴＰ。
【図３】Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼによるローダミン-グリーン-ｄＵＴＰの取り込みを示す。
隣接位置でのＲｈｏ-グリーンとＲｈｏ-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰの複数の取り込みと基質活性に対するリンカーの長さの比較
レーン１-６：コントロール反応。レーン１：Ｄｉｇ-標識プライマー（２２ｍｅｒ）とバッファーのみ；レーン２：Ｄｉｇ-標識プライマー（２０ｍｅｒ）とバッファーのみ；レーン３：鋳型／プライマー（２８個の取り込みが可能）、Ｔａｑ-ポリメラーゼと４種の通常のｄＮＴＰ；レーン４：鋳型／プライマー（１２個の挿入が可能）、Ｔａｑ-ポリメラーゼと４極の通常のｄＮＴＰ；レーン５：鋳型／プライマー（ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰの１８回の挿入が可能）、Ｔａｑ-ポリメラーゼと４種の通常のｄＮＴＰ；レーン６：レーン１と同様；
レーン７-１４：０．１単位のＴｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼを用いた反応；レーン７-１０：ローダミン-グリーン-ｄＵＴＰ；レーン１１-１４：ローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰ；レーン７：鋳型Ｎｕｃ Ｔ４、５μＭローダミン-グリーン-ｄＵＴＰ；レーン８：鋳型Ｎｕｃ Ｔ４、５０μＭローダミン-グリーン-ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ；レーン９：鋳型Ｎｕｃ Ｔ１５、５μＭローダミン-グリーン-ｄＵＴＰ；レーン１０：鋳型Ｎｕｃ Ｔ１５、５０μＭローダミン-グリーン-ｄＵＴＰ；レーン１１：鋳型Ｎｕｃ Ｔ４、５μＭローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰ；レーン１２：鋳型Ｎｕｃ Ｔ４、５０μＭローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ；レーン１３：鋳型Ｎｕｃ Ｔ１５、５μＭローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰ；レーン１４：鋳型Ｎｕｃ Ｔ１５、５０μＭローダミン-グリーン-Ｘ-ｄＵＴＰ；
レーン１５-２２：レーン７-１４と同様であるが、１Ｕのポリメラーゼ；
レーン２３-３０：レーン１５-２２と同様であるが６０分の反応時間。
【図４】種々のポリメラーゼによる種々のＵ-誘導体の取り込みを示す。
種々のＵ-誘導体が鋳型Ｎｕｃ Ｔ１５上の隣接した位置に種々のポリメラーゼによって効率的に取り込まれる。
レーン１-６：コントロール反応。レーン１：プライマーとバッファーのみ。レーン２-６：反応あたり０．１単位のＴａｑポリメラーゼ；レーン２：１２．５μＭｄＡＴＰ；レーン３：１２．５μＭｄＧＴＰ；レーン４、５：同一で各天然ｄＮＴＰ１２．５μＭ；レーン６：レーン４、５と同様で鋳型を含まない；他の全ての標識反応は示された誘導ヌクレオシド三リン酸のみを含む。レーン７-１０：Ｖｅｎｔ ｅｘｏ-ポリメラーゼによるテトラメチルローダミンの取り込み。レーン７：５μＭのＴＭＲ-ｄＵＴＰと０．１単位のポリメラーゼ；レーン８：５０μＭのＴＭＲ-ｄＵＴＰと０．１単位のポリメラーゼ；レーン９、１０：レーン７、８と同様であるが１単位のポリメラーゼ。レーン１１-１４：レーン７-１０と同様であるがＣｙ５-ｄＵＴＰを使用；レーン１５-１８：Ｃｈｙ-ボリメラーゼクレノウ断片によるフルオレセイン-ｄＵＴＰの取り込み。レーン１５、１６：それぞれ５μＭまたは５０μＭのフルオレセイン-ｄＵＴＰ及び０．１単位ポリメラーゼ；レーン１７、１８：レーン１５、１６と同様であるが１単位のポリメラーゼ；レーン１９-２２：レーン１５-１９と同様であるが基質としてＡＭＣＡ-ｄＵＴＰを使用；レーン２３-３４：Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼによる取り込み；レーン２３-２６：レーン１５-１９と同様であるが基質としてフルオレセイン-ｄＵＴＰを使用；レーン２７-３０：レーン１５-１７と同様であるが基質としてビオチン-ｄＵＴＰを使用；レーン３１-３４：レーン１５-１７と同様であるがジゴキシゲニン-ｄＵＴＰを使用。
【図５】Ａ−タイプポリメラーゼによる種々のスペーサー長を有するＣｙ５-ｄＵＴＰの取り込みを示す。
Ａ−タイプポリメラーゼによる種々のリンカー長を有するＣｙ５-ｄＵＴＰの取り込み効率の比較。
レーン１-５：コントロール反応。レーン１と２：ポリメラーゼなし；レーン１：更に鋳型なし；レーン３と４：４ｄＮＴＰと鋳型ＮｕｃＴ４を有する完全反応混合物；レーン５：鋳型なしの完全反応混合物；レーン６-２０：Ｔａｑポリメラーゼ；レーン６-１４：鋳型ＮｕｃＴ４；レーン１５-２０：鋳型Ｔ１５；レーン６-８：１７原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン６：５μＭのＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン７：５０μＭのＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン８：５０μＭのＣｙ５-ｄＵＴＰ及び１２．５μＭのｄＡＴＰとｄＧＴＰ；レーン９-１１：レーン６-８と同様であるが２４原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰを有する；レーン１２-１４：レーン６-８と同様であるが３８原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰを有する；レーン１５、１６：鋳型ＮｕｃＴ１５、それぞれ５及び５０μＭの１７原子のスペーサーをもつ、Ｃｙ５-ｄＵＴＰ；レーン１７、１８：レーン１５、１６と同様で、それぞれ５及び５０μＭの２４原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン１９、２０：レーン１５、１６と同様で、それぞれ５及び５０μＭの３８原子のメペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン２１-３４：レーン６-２０と同様であるが、Ｔａｑポリメラーゼの代わりに、Ｃｈｙ-クレノウポリメラーゼを使用。
【図６】ｅｘｏ- Ｂ−タイプポリメラーゼによる種々のスペーサーを有するＣｙ５-ｄＵＴＰとＭＲ１２１-ｄＵＴＰの取り込みを示す。
Ｂ-タイプポリメラーゼによる種々のリンカー長を有するＣｙ５-ｄＵＴＰとＭＲ１２１-ｄＵＴＰの取り込み効率の比較
レーン１-５：０．１単位のＴａｑポリメラーゼを用いたコントロール反応。レーン１：プライマーのみ；レーン２：鋳型／プライマー、ヌクレオチドなし；レーン３：完全反応混合物；レーン４：レーン３と同様で、ｐｏｌ無し；レーン５：レーン３と同様で、ｐｏｌ無し；レーン６-８：１７原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン６：５μＭのＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン７：５０μＭのＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン８：５０μＭのＣｙ５-ｄＵＴＰ及びｄＡＴＰとｄＧＴＰ；レーン９-１１：レーン６-８と同様であるが２４原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン１２-１４：レーン６-８と同様であるが３８原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン１５-２３：レーン６-１４と同様であるがＣｙ５-ｄＵＴＰの代わりに８、１３、２４原子のリンカー長を持つＭＲ１２１-ｄＵＴＰ；レーン２４-３５：鋳型ＮｕｃＴ１５；レーン２４：５μＭの１７原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン２５：５０μＭの１７原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン２６-２７：レーン２４-２５と同様であるが２４原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン２８-２９：レーン２４-２５と同様であるが３８原子のスペーサーをもつＣｙ５-ｄＵＴＰ；レーン３０-３５：レーン２４-２９と同様であるがＣｙ５-ｄＵＴＰの代わりに８、１３、２４原子のリンカー長を持つＭＲ１２１-ｄＵＴＰ。
６ａ：化学発光検出前の図６のブロットに対する蛍光スキャン
スキャンは図６のレーン６-２３を含み、ブロッキング過程が蛍光分析を妨害することが示されたので、ジゴキシゲニン標識プライマーの免疫学的検出の前に分析した。レーン１-９：Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼによる鋳型ＮｕｃＴ４へのＣｙ５-ｄＵＴＰの取り込み。レーン１-３：１７原子のスペーサー；レーン４-６：２４原子のスペーサー；レーン７-９：３８原子のスペーサー。Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼによる鋳型Ｔ４へのＭＲ１２１-ｄＵＴＰの取り込み。レーン１０-１２：ＭＲ１２１-８-ｄＵＴＰ；レーン１３-１５：ＭＲ１２１-１３-ｄＵＴＰ；レーン１６-１８：ＭＲ１２１-２４-ｄＵＴＰ。
【図７】誘導化されたｄＮＴＰによるすべての４種のデスオキシヌクレオシド三リン酸の完全置換を示す。
使用したポリメラーゼは標識反応（レーン７-３６）に対してＶｅｎｔ ｅｘｏ-とＴｇｏ ｅｘｏ-であり、コントロール反応（レーン１-６）ではＴａｑ ｐｏｌであった。使用した誘導体は：Ａ：ｄＧＴＰの代わりヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰ（示したように５μＭと５０μＭ）。Ｂ：ｄＣＴＰの代わりにローザミン-ｄＣＴＰ（示したように５μＭと５０μＭ）。Ｃ：ｄＡＴＰの代わりにヘキシニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ（示したように５μＭと５０μＭ）。Ｄ：ｄＴＴＰの代わりにビオチン-１６-ｄＵＴＰ（示したように５μＭと５０μＭ）。Ｅ：コントロールとして反応３４-３６においてｄＣＴＰ、未標識。
【図８】様々に誘導された４つのデスオキシヌクレオシド三リン酸から成るＤＮＡ鎖の合成を示す。
誘導ヌクレオチドによって置換されたすべてのｄＮＴＰを有する４０個のヌクレオチド標的配列の合成の実証。
レーン１-４：コントロール反応；レーン１：プライマーのみ；レーン２、３：０．１単位のＴａｑポリメラーゼと各１２．５μＭの天然ｄＮＴＰを含む完全反応混合物；レーン５：レーン１と同様；レーン５-１４：Ｔｇｏ ｅｘｏ-ポリメラーゼ（反応当たり０．１単位）を有する標識反応、鋳型としてレーン５はｃａｓｓ１、レーン６はｃａｓｓ２、レーン７はｃａｓｓ３、レーン８はｃａｓｓ４、レーン９はｃａｓｓ５、レーン１０はｃａｓｓ６、レーン１１はｃａｓｓ７、レーン１２はｃａｓｓ８、レーン１３はｃａｓｓ９、レーン１４はｃａｓｓ１０；誘導体（各５０μＭ）は：ｄＡＴＰの代わりにアミノ-ペンチニル-７-デアザ-ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰの代わりにヘキシニル-７-デアザ-ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの代わりにジゴキシゲニン-ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰの代わりにビオチン-１６-ｄＵＴＰ；反応時間３０分；レーン１５-２４：レーン５-１４と同様であるが６０分の反応時間。
ａ：図８の分離した生成物の移動距離のln
【図９】ビオチン-１６-ｄＵＴＰによるｄＴＴＰの完全置換を伴うＰＣＲによる２６４ｂｐ断片の生成を示す。
ＰＣＲでの修飾ヌクレオチドの取り込み（完全置換）
Ｍで印をつけたレーンはマーカーレーンである。レーンＡ：天然ｄＮＴＰを用いたコントロール反応；レーンＢ：ビオチン-１６-ｄＵＴＰで完全に置換されたｄＴＴＰを有する２６４ｂｐの断片；レーンＣ：鋳型としてレーンＢを切除、精製した生成物を使用し、天然ｄＮＴＰを用いた２６４ｂｐの断片。レーンＤ：レーンＣと同様であるがビオチン-１６-ｄＵＴＰで完全に置換されたｄＴＴＰを使用；レーンＫ：レーンＡと同様（コントロール）；レーンＥ-Ｊ：レーンＣと同様であるが添加した鋳型の連続希釈（１０倍）（鋳型滴定）。
【図１０】使用した誘導体の化学式を示す。
【図１１】使用した誘導体の化学式を示す。
【図１２】使用した誘導体の化学式を示す。
【図１３】使用した誘導体の化学式を示す。
【図１４】使用した誘導体の化学式を示す。
【図１５】使用したヌクレオシド誘導体のリストを示す。
Claims (6)
- 好熱性ＤＮＡポリメラーゼ、核酸鋳型、プライマー及びポリメラーゼによって新たに合成されるＤＮＡ中に取り込まれ得る修飾ヌクレオシド三リン酸を使用する酵素的核酸標識の方法であって、ＤＮＡポリメラーゼがＢ−タイプポリメラーゼの遺伝子操作されたｅｘｏ−変異体であって３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないものであり、少なくとも２種の天然デオキシヌクレオシド三リン酸が対応する修飾デオキシヌクレオシド三リン酸またはその誘導体に完全に置換され、生成する核酸において４種の塩基のうち少なくとも２種が修飾を有し、完全な標的の長さが達成される、前記方法。
- 酵素的核酸標識が、３種の天然デオキシヌクレオシド三リン酸が対応する修飾デオキシヌクレオシド三リン酸またはその誘導体で完全に置換される反応において行われ、合成された核酸において４種の塩基中３種が修飾を有し、完全な標的の長さが得られる、請求項１に記載の方法。
- 酵素的核酸標識が、４種の天然デオキシヌクレオシド三リン酸が対応する修飾デオキシヌクレオシド三リン酸またはその誘導体で完全に置換される反応において行われ、合成された核酸が完全に修飾塩基から構成され、完全な標的の長さが得られる、請求項１に記載の方法。
- 二本鎖核酸の標識を増幅反応で行い、２若しくはそれ以上の縮重またはイノシン含有プライマーを使用する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 修飾ヌクレオチドが、カルボシアニン、ローダミン、フルオレセイン、クマリン、ビオチン等のビタミン、ジゴキシゲニン等のハプテン、オキサジン、及びコレステロール及びエストラジオール等のホルモンからなる群から選択される親水性標識に結合しており、そして色素をヌクレオチドに結合させるリンカーが約１５個またはそれ以上の炭素原子の長さを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- ＰＣＲによるＤＮＡ合成と同時のＤＮＡ標識のために使用する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
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