ES2155058T5 - Sistema de ensayo homogeneo. - Google Patents

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ES2155058T5 ES91917050T ES91917050T ES2155058T5 ES 2155058 T5 ES2155058 T5 ES 2155058T5 ES 91917050 T ES91917050 T ES 91917050T ES 91917050 T ES91917050 T ES 91917050T ES 2155058 T5 ES2155058 T5 ES 2155058T5
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Abstract

Un proceso para la detección de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, dicho proceso comprende:<br /><br />a) poner en contacto una muestra que contenga ácidos nucleicos de cadena simple con un oligonucleótido que contenga una región complementaria a la región del ácido nucleico diana y con un oligonucleótido marcado que contenga una secuencia complementaria a una segunda región de la misma cadena de la secuencia de ácido nucleico diana, pero que no incluya la secuencia de ácido nucleico definida por el primer oligonucleótido, para crear una mezcla de dobles cadenas durante las condiciones de hibridación, en donde las dobles cadenas comprendan al ácido nucleico diana hibridado con el primer oligonucleótido y con el oligonucleótido marcado de tal forma que el extremo 3'' del primer oligonucleótido sea adyacente al extremo 5'' del oligonucleótido marcado.<br /><br />b) mantener la mezcla del paso (a) con una polimerasa de ácido nucleico dependiente de molde que tiene actividad nucleasa 5'' a 3'' bajo condiciones que permitan la actividad nucleasa 5'' a 3'' de la polimerasa para escindir los oligonucleótidos hibridados marcados y liberar fragmentos marcados; y <br /><br />c) detectar y/o medir la señal generada por la hidrólisis del oligonucleótido marcado.<br /><br />

Description

Sistema de ensayo homogéneo.
Esta invención se refiere en general al campo de la química de los ácidos nucleicos. Más específicamente, se refiere a la utilidad de la actividad nucleasa 5' a 3' de una polimerasa de ácido nucleico para degradar un oligonucleótido marcado en una doble cadena hibridada compuesta por el oligonucleótido marcado y una secuencia de oligonucleótidos diana y que forman fragmentos marcados detectables.
Técnicas microbiológicas de investigación se aplican rutinariamente en los ensayos de diagnóstico. Por ejemplo, la Patente Estadounidense número 4.358.535 revela un método para detectar patógenos por deposición de una muestra (por ejemplo, sangre, células, saliva, etc.) en un filtro (por ejemplo, nitrocelulosa), lisando las células y fijando el DNA por desnaturalización química y calor. Entonces se añadieron sondas de DNA marcadas y permitieron la hibridación con el DNA muestra fijado, la hibridación nos indica la presencia de DNA de patógenos. La muestra de DNA en este caso puede ser amplificada cultivando las células o organismos en lugar del filtro.
Una mejora significante en la amplificación de DNA, la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se revela en las Patentes Estadounidenses números 4.683.202; 4.683.195; 4.800.159; y 4.965.188. En su forma simple la PCR es un método in vitro para la síntesis enzimática de secuencias específicas de DNA, utilizando dos cebadores que se hibridan con las cadenas complementarias y flanquean la región de interés en el DNA diana. Unas series repetitivas de pasos de reacción implican desnaturalización del molde, hibridación de los cebadores, y la extensión de los cebadores hibridados por la DNA Polimerasa consiguen una acumulación exponencial de fragmentos específicos cuyos extremos están definidos por los extremos 5' de los cebadores. PCR es capaz de producir un enriquecimiento selectivo en secuencias de DNA específicas en un factor de 10^{9}. El método PCR está descrito en Saiki et al., 1985, Science 230:1350.
Los métodos de detección usados generalmente en técnicas de PCR estándar usan una sonda marcada con el DNA amplificado en un ensayo de hibridación. Por ejemplo, la publicación de la Patente Europea número 237.362 y la publicación PCT número 89/11548 revelan métodos de ensayo en donde el DNA amplificado mediante PCR se fija primeramente en un filtro y luego se le añade una sonda de oligonucleótidos específica y se produce la hibridación. Preferiblemente, la sonda está marcada, por ejemplo, con ^{32}P, biotina, peroxidasa de rábano picante (HRP), etc., para permitir la etección de la hibridación. También se sugiere, el método contrario, en el que la sonda está unida a la membrana, y se añade seguidamente la muestra de DNA amplificada mediante PCR.
Otros métodos de detección incluyen el uso del método "fragment lenght polymorphism" (PCR-FLP), hibridación de sondas de oligonucleótidos específicos de alelos (ASO)(Saiki et al., 1986, Nature 324:163), o secuenciación directa por el método "dideoxy" usando DNA amplificado en lugar de DNA clonado. La técnica PCR estándar obra esencialmente por replicación de una secuencia de DNA situada entre dos cebadores, proporcionando como producto mayoritario de reacción una secuencia de DNA de longitud definida por el cebador del extremo 5' de cada cadena. De este modo, inserciones y deleciones entre los cebadores producen secuencias de productos de diferentes tamaños, que se pueden detectar por medición del producto en PCR-FLP. En un ejemplo de hibridación ASO, el DNA amplificado se fija en un filtro de nailon (mediante, por ejemplo, radiación UV) en una serie de "dot blots", entonces permite la hibridación con una sonda de oligonucleótidos marcada con HRP bajo condiciones selectivas. Después del lavado, se añadieron tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno: HRP cataliza la oxidación con peróxido de hidrógeno de TMB a un colorante azulado soluble que se puede hacer precipitar, indicando la sonda hibridada.
Mientras que la técnica PCR practicada en este caso es un método extremadamente poderoso para amplificar las secuencias de DNA, la detección del material amplificado requiere manipulación adicional y el correspondiente manejo de los productos de PCR para determinar si el DNA diana está presente. Sería deseable disminuir los consiguientes pasos de manipulación que normalmente se requieren para la detección del material amplificado. Un sistema de ensayo "homogéneo", que es, uno que genera señal mientras la secuencia diana se amplifica, que requiere una manipulación pos-amplificación mínima, sería ideal.
La presente invención proporciona un proceso para la detección de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, dicho proceso comprende;
(a) poner en contacto una muestra que comprende ácidos nucleicos de cadena sencilla con un oligonucleótido que contiene una secuencia complementaria a una región del ácido nucleico diana y un oligonucleótido marcado que contiene una secuencia complementaria a una segunda región de la misma cadena de ácido nucleico diana, pero no incluye la secuencia de ácido nucleico definida por el primer oligonucleótido, para crear una mezcla de dobles cadenas durante las condiciones de hibridación, en donde las dobles cadenas comprenden la secuencia de ácido nucleico diana hibridada con el primer oligonucleótido tal que el extremo 3' del primer oligonucleótido sea adyacente al extremo 5' del oligonucleótido marcado;
(b) mantener la mezcla del paso (a) con una polimerasa de ácido nucleico dependiente del molde que tiene actividad nucleasa 5' a 3' bajo las condiciones suficientes para permitir que la actividad nucleasa 5' a 3' de la polimerasa pueda escindir el oligonucleótido marcado y liberar fragmentos marcados; y
(c) detectar y/o medir la liberación de fragmentos marcados.
Este proceso es especialmente aconsejable para el análisis de ácido nucleico amplificado por PCR. Este proceso es una mejora de los métodos de detección de PCR conocidos ya que éste permite tanto la amplificación de la diana como la liberación de un marcador para que se lleve a cabo la detección en un sistema de reacción sin necesidad de los múltiples pasos de manipulación del producto amplificado. De este modo, en otra realización de la invención, se detalla un método de la reacción en cadena de la polimerasa para la amplificación y detección de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra. Este método comprende
(a) Proporcionar al ensayo de PCR que contiene dicha muestra, al menos un oligonucleótido marcado que contiene una secuencia complementaria a una región del ácido nucleico diana, en donde dicho oligonucleótido marcado se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana unida por los cebadores del paso (b);
(b) proporcionar un equipo de cebadores, en donde el primer cebador contiene una secuencia complementaria a una región de una cadena de la secuencia de ácido nucleico diana y ceba la síntesis de una cadena de DNA complementaria, y un segundo cebador contiene una secuencia complementaria a una región de una segunda cadena de la secuencia de ácido nucleico diana y ceba la síntesis de una cadena de DNA complementaria; y en donde cada cebador es seleccionado para que hibride su molde complementario corriente arriba de cualquier oligonucleótido marcado hibridado con la misma cadena de ácido nucleico.
(c) amplificar la secuencia de ácido nucleico diana empleando una polimerasa de ácido nucleico con actividad nucleasa 5' a 3' como un agente polimerizante dependiente de molde bajo condiciones que son permisivas para los pasos de ciclación de PCR, (i) hibridación de los cebadores y oligonucleótidos marcados con una secuencia molde de ácido nucleico sin la región diana, y (ii) extensión del cebador, en donde dicha polimerasa de ácido nucleico sintetiza un producto de extensión de cebador mientras que la actividad nucleasa 5' a 3' de la polimerasa de ácido nucleico libera simultáneamente fragmentos marcados de las dobles cadenas marcadas que comprenden oligonucleótidos marcados y sus secuencias molde de ácido nucleico, y de este modo crear fragmentos marcados detectables; y
(d) detectar y/o medir la liberación de fragmentos marcados para determinar la presencia o ausencia de secuencias diana en la muestra
La Figura 1 es una autorradiografía de placa de cromatografía en capa fina (TLC) de DEAE celulosa que muestra la liberación de fragmentos marcados de la sonda escindida.
La Figura 2 es una autorradiografía de placa de cromatografía en capa fina (TLC) de DEAE celulosa que muestra la termoestabilidad de la sonda marcada.
Las Figuras 3A y 3B son autorradiografias de placas de cromatografía en capa fina (TLC) de DEAE celulosa que muestran la cantidad de fragmentos de sonda marcados liberados correlativamente con un incremento del número de ciclos de PCR y de la concentración de DNA molde de partida.
La Figura 4 muestra la polimerización independiente de la actividad nucleasa 5'-3' de la Taq DNA Polimerasa mostrada en la autorradiografía usando unas series de cebadores que hibridan de 0 a 20 nucleótidos corriente arriba de la sonda.
La Figura 5 es una autorradiografía que muestra la liberación de fragmentos de sonda marcados en función del incremento de la temperatura de incubación y del tiempo, en donde la composición en el extremo 5' de la sonda es rico en GC.
La Figura 6 es una autorradiografía que muestra la liberación de fragmentos de sonda marcados en función del incremento de temperaturas y del tiempo, en donde la composición en el extremo 5' de la sonda es rico en AT.
La Figura 7 proporciona el análisis por electroforesis en gel de acrilamida al 5% de un producto HIV de unos 142 pares de bases, amplificado en la presencia o ausencia de la sonda marcada.
La Figura 8 está compuesta de dos autorradiografias de análisis por TLC de alícuotas de productos amplificados por PCR que muestran que se libera radioactividad y que ésta aumenta a mayor concentración de molde inicial y cuando se alarga la termociclación.
La Figura 9 es un esquema de la reacción en que se añade un derivado éster NHS-activo de la biotina a la amina-3' de una sonda de oligonucleótidos.
La Figura 10 es un esquema de la reacción en que se usa una hidrazida de biotina para marcar una sonda de oligonucleótidos que tiene un ribonucleótido-3'.
La Figura 11 es un esquema para el marcaje de una sonda de oligonucleótidos con biotina usando fosforamidita de biotina.
La Figura 12 muestra unos reactivos para marcar sondas de oligonucleótidos con biotina.
La Figura 13 muestra una sonda de oligonucleótidos marcada con rodamina-X-590 y cristal violeta.
La Figura 14 muestra un esquema de reacción para generar una acil azida activa de cristal violeta.
La Figura 15 muestra un esquema de reacción para añadir una amina a una timidina para usarla en la conjugación de un marcador a una sonda de oligonucleótidos.
La Figura 16 muestra los típicos resultados y relación de señal para un número determinado inicial según el presente método usando extracto en fase sólida PEI Bakerbond™.
Tal como se usa aquí, una "muestra" se refiere a cualquier sustancia que contenga o que presuntamente contenga ácidos nucleicos e incluye una muestra de tejido o fluido aislada de un individuo o individuos, incluyendo pero no limitando a éstos, por ejemplo, piel, plasma, suero, líquido espinal, líquido linfático, líquido sinovial, orina, lágrimas, células sanguíneas, órganos, tumores, y también aquellas muestras de constituyentes de cultivos celulares in vitro (incluyendo pero no limitando a los resultantes del condicionamiento del medio a partir del crecimiento de células en el medio de cultivo célular, recombinando las células o los componentes celulares).
Tal como se usa aquí, los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a cebadores, sondas, fragmentos oligoméricos para ser detectados, controles oligoméricos y oligomeros bloqueadores sin marcar y deberían ser genéricamente polidesoxiribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), poliribonucleótidos (que contienen D-ribosa), y cualquier tipo de polinucleótido que sea un N-glicósido de una base púrica o pirimidínica o una base púrica o pirimidínica modificada. No hay distinción explícita en longitud entre el término "ácido nucleico", "polinucleótido", y "oligonucleótido", y estos términos se pueden usar indistintamente. Estos términos se refieren únicamente a la estructura primaria de la molécula. De este modo, estos términos incluyen DNA de cadena doble o sencilla, así como RNA de cadena doble o simple. El oligonucleótido está comprendido por una secuencia de aproximadamente al menos 6 nucleótidos preferiblemente 10-12 nucleótidos y más preferiblemente 15-20 nucleótidos correspondientes a una región de la secuencia de nucleótidos diseñada.
"Correspondiente" significa idéntico o complementario a la secuencia diseñada.
El oligonucleótido no es necesariamente un derivado físico de cualquier secuencia existente o natural, ya que se puede generar de cualquier modo, incluyendo síntesis química, replicación de DNA, transcripción reversa o una combinación de los mismos. Los términos "oligonucleótidos" o "ácido nucleico" proponen un polinucleótido de RNA o DNA genómico, cDNA, de origen semisintético o sintético, que en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con una porción o todo el polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza; y/o (2) está relacionado con otro polinucleótido con el que está relacionado en la naturaleza, y (3) no se encuentra en la naturaleza.
Debido a que los mononucleótidos reaccionan para formar oligonucleótidos de tal forma que el fosfato 5' de un anillo pentosa mononucleótido se une al oxígeno 3' del vecino en una dirección vía la unión fosfodiéster, un extremo de un oligonucleótido se refiere a su extremo 5' si su fosfato 5' no está unido al oxígeno 3' de un anillo pentosa mononucleótido y el extremo 3' si su oxígeno 3' no está unido al fosfato 5' del posterior anillo pentosa mononucleótido. Tal como se usa aquí, una secuencia de ácido nucleico, igual que si estuviera internada en un oligonucleótido mayor, se diría que tiene extremos 5' y 3'.
Cuando dos oligonucleótidos no solapados diferentes hibridan diferentes regiones de la misma secuencia complementaria lineal de ácido nucleico, y el extremo 3' de un oligonucleótido señala hacia el extremo 5' del otro, el primero se puede llamar oligonucleótido "corriente arriba" y el último se puede llamar oligonucleótido "corriente abajo".
El término "cebador" se puede referir a más de un cebador y se refiere a un oligonucleótido, si se obtiene naturalmente, de una digestión restrictiva purificada, o se produce sintéticamente, que es capaz de actuar señalando el punto de iniciación de la síntesis a lo largo de la cadena complementaria cuando está situado bajo condiciones en que la síntesis del producto de extensión de cebador que es complementario a la cadena de ácido nucleico es catalizado. Tales condiciones incluyen la presencia de cuatro desoxiribonucleósidos trifosfato diferentes y un agente inductor de la polimerización tal como DNA Polimerasa o transcriptasa reversa, en un tampón apropiado ("tampón" incluye sustituyentes que son cofactores, o que afectan al pH, fuerza iónica, etc.), y a una temperatura apropiada. El cebador es preferiblemente monocatenario para obtener la eficiencia máxima en la amplificación.
El complementario de una secuencia de ácido nucleico tal como se usa aquí se refiere a un oligonucleótido que cuando está alineado con la secuencia de ácido nucleico tal que el extremo 5' de una secuencia esta emparejado con el extremo 3' del otro, está en "asociación antiparalela". Ciertas bases que no se encuentran comúnmente en los ácidos nucleicos naturales se pueden incluir dentro de los ácidos nucleicos de la presente invención, e incluyen por ejemplo inosina y 7-deazaguanina. La complementariedad no hace falta que sea perfecta; dobles cadenas estables pueden contener pares de bases mal emparejadas o bases no emparejadas. Aquellos expertos en el campo de la tecnología de los ácidos nucleicos pueden determinar la estabilidad de las dobles cadenas empíricamente considerando un número de variables que incluyen, por ejemplo, la longitud del oligonucleótido, la composición de las bases y la secuencia del oligonucleótido, la fuerza iónica, y la incidencia de los pares de bases mal emparejados.
La estabilidad de las dobles cadenas de ácidos nucleicos se mide por la temperatura de fusión, o "Tm". La "Tm" de una doble cadena de ácido nucleico en particular, bajo condiciones específicas, es la temperatura a la que la mitad de los pares de bases se han disociado.
Tal como se usa aquí, el término "secuencia diana" o "secuencia de ácido nucleico diana" se refiere a una región del oligonucleótido la que se amplifica, se detecta o ambas. La secuencia diana se encuentra entre las dos secuencias de cebador usadas en la amplificación.
Tal como se usa aquí, el término "sonda" se refiere a un oligonucleótido marcado que forma una estructura en doble cadena con una secuencia de ácido nucleico diana, debido a la complementariedad de al menos una secuencia de la sonda con una secuencia de la región diana. La sonda, preferiblemente, no lleva una secuencia complementaria a la secuencia(s) usada(s) para cebar la cadena en reacción de la polimerasa. Generalmente el extremo 3' de la sonda puede ser "bloqueado" para prohibir la incorporación de la sonda en un producto de extensión del cebador. "Bloqueo" se puede lograr usando bases no complementarias, o por adición de un medio químico tal como biotina o un grupo fosfato al hidroxilo 3' del ultimo nucleótido que puede, dependiendo del medio seleccionado, tener un doble propósito actuando como marcador para la detección posterior o por captura del ácido nucleico unido al marcador. El bloqueo también se puede lograr quitando el OH-3' o usando un nucleótido que carece de un OH-3' tal como un didesoxinucleótido.
El término "marcador" usado aquí se refiere a cualquier átomo o molécula que se puede usar para conseguir una señal detectable (preferiblemente cuantificable), y que se puede unir a un ácido nucleico o proteina. Los marcadores nos pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radioactividad, colorimetría, gravimetría, difracción por rayos X o absorción, magnetismo, actividad enzimática, y similares.
Tal como se define aquí, "actividad nucleasa 5' \rightarrow 3'" o "actividad nucleasa 5' a 3'" se refiere a la actividad de una polimerasa de ácido nucleico específica de molde que incluye tanto una actividad exonucleasa 5' \rightarrow 3' tradicionalmente asociada con algunas DNA Polimerasas en las que los nucleótidos se van eliminando a partir del extremo 5' de un oligonucleótido de manera secuencial, (por ejemplo, DNA Polimerasa I de E. coli tiene esta actividad mientras que el fragmento Klenow no la tiene), o también incluye una actividad endonucleasa 5' \rightarrow 3' en donde la escisión sucede en más de un enlace fosfodiéster(nucleótido) del extremo 5', o ambas.
El término "adyacente" tal como se usa aquí se refiere a la posición del cebador respecto a la sonda en su cadena complementaria del acido nucleico molde. El cebador y la sonda están separados mediante de 1 a 20 nucleótidos, preferiblemente de 1 a 10 nucleótidos, o pueden estar contiguos, tal como sea deseable para la detección con un proceso independiente de polimerización. Alternativamente, para usarse en el proceso dependiente de polimerización, como cuando el presente método se usa en amplificación por PCR o detección tal como se muestra aquí, la "adyacencia" puede estar en cualquier lugar de la secuencia a amplificar, en cualquier lugar corriente abajo del cebador, tal que en la extensión del cebador se posicione la polimerasa lo que provocara la escisión de la sonda.
Tal como se usa aquí, el término "polimerasa de ácido nucleico termoestable" se refiere a una enzima que es relativamente estable al calentamiento, cuando la comparamos, por ejemplo, a las polimerasas de nucleótidos de E. coli y que cataliza la polimerización de nucleósidos trifosfato. Generalmente, la enzima iniciará la síntesis en el extremo 5' del cebador hibridando la secuencia diana, y que puede continuar en la dirección 5' a lo largo del molde, y si tuviera actividad nucleasa 5' a 3', intervendría en la hidrólisis, hibridando la sonda para liberar tanto fragmentos de sonda marcados como sin marcar, hasta que la síntesis terminara. Una enzima termoestable representativa aislada a partir de Thermus aquaticus (Taq) se describe en la Patente Estadounidense número 4.889.818 y un método para usar este en una PCR convencional se describe en Saiki et al., 1988, Science 239:487.
La Taq DNA Polimerasa puede reemplazar cadenas mediante actividad exonucleasa 5'-3' dependiente de la síntesis de DNA (Ver Gelfand, "Taq DNA Polymerase" en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Erlich, Ed. Stockton Press, N.Y. (1989), Capitulo 2). En solución hay muy poca degradación de oligonucleótidos marcados, si es que existe.
La practica de la presente invención empleará, a menos que se especifique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y técnicas de recombinación de DNA, que forman parte de las técnicas de este campo. Tales técnicas se explican extensamente en la bibliografía. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda edición (1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds.,1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, 1984) y una serie, Methods in Enzimology (Academic Press,Inc.). Todas las patentes, aplicaciones de patentes y publicaciones mencionadas aquí, tanto las anteriores como las posteriores están incorporadas en esta referencia.
Varios aspectos de la invención se basan en una propiedad especial de las polimerasas de ácido nucleico. Las polimerasas de ácido nucleico pueden tener algunas actividades, entre ellas, una actividad nucleasa 5' a 3' de este modo la polimerasa de ácido nucleico puede escindir mononucleótidos o pequeños oligonucleótidos a partir de un oligonucleótido hibridado con su mayor, polinucleótido complementario. Para que se escinda eficazmente el oligonucleótido corriente arriba debe ser hibridado con el mismo polinucleótido mayor.
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El extremo 3' del oligonucleótido corriente arriba proporciona la señal inicial de unión para la polimerasa de ácido nucleico. Tan pronto como el enlace de la polimerasa se encuentre el extremo 5' corriente abajo del oligonucleótido, la polimerasa puede escindir mononucleótidos o pequeños oligonucleótidos de allí.
Los dos oligonucleótidos se pueden diseñar de tal modo que estos hibriden un sitio cercano al ácido nucleico diana complementario de tal manera que el enlace de la polimerasa de ácido nucleico al extremo 3' del oligonucleótido corriente arriba automáticamente ponga a este en contacto con el extremo 5' del oligonucleótido corriente abajo. Este proceso en el que no se requiere polimerización para llevar a la polimerasa de ácido nucleico a la posición para llevar a cabo la escisión, se llama "escisión independiente de polimerización".
Por otro lado, si los dos oligonucleótidos hibridan con regiones más lejanas en el espacio del molde del acido nucleico diana. Tal como la polimerización va avanzando, la polimerasa va escindiendo progresivamente mononucleótidos o pequeños oligonucleótidos del extremo 5' del oligonucleótido corriente abajo. Esa escisión continua hasta que el residuo del oligonucleótido corriente abajo ha sido desestabilizado para la extensión, que este disocia de la molécula molde. Este proceso se llama "escisión dependiente de polimerización".
En la presente invención, un marcador está unido al oligonucleótido corriente abajo. De este modo, los mononucleótidos escindidos o los pequeños oligonucleótidos que se han escindido por la actividad nucleasa 5'-3' de la polimerasa se pueden detectar.
Por consiguiente, cualquiera de estas estrategias se puede emplear para distinguir el oligonucleótido sin escindir marcado sin escindir a partir de fragmentos escindidos del mismo. De este modo, la presente invención permite la identificación de aquellas muestras de ácido nucleico que contienen secuencias complementarias al nucleótido corriente arriba y corriente abajo.
La presente invención explica esta actividad nucleasa 5' a 3' de la polimerasa cuando se usa en conjunción con PCR. Estas son las diferencias con la amplificación por PCR previamente descrita en donde los oligonucleótidos diana amplificados por PCR se detectan, por ejemplo, por hibridación con una sonda que forma una doble cadena estable con aquella secuencia diana bajo condiciones de lavado e hibridación de selectivas a moderadamente selectivas. En diferencia con aquellos métodos de detección usados en las amplificaciones post-PCR, la presente invención permite la detección de las secuencias diana de ácido nucleico durante la amplificación de este ácido nucleico diana. En la presente invención se añade un oligonucleótido marcado simultáneamente con el cebador al inicio de la PCR, y la señal generada por la hidrólisis de los nucleótidos marcados de la sonda proporcionan métodos para la detección de la secuencia diana durante su amplificación.
La presente invención es compatible, no obstante, con otros sistemas de amplificación, tal como el sistema de amplificación de transcripción, en el que uno de los cebadores de PCR codifica un promotor que se usa en hacer copias de RNA de la secuencia diana. De modo similar, la presente invención se puede usar en un sistema de secuencia de replicación self-sustained (3SR), en el que se usan una variedad de enzimas para hacer transcripciones de RNA que se utilizarán para hacer copias de DNA, todo a la misma temperatura. Por incorporación de una polimerasa con actividad exonucleasa 5'-3' en un sistema de reacción en cadena de ligasa (LCR), junto con los oligonucleótidos apropiados, también se puede emplear la presente invención para detectar productos LCR.
Por supuesto, la presente invención se puede aplicar a aquellos sistemas que no incluyen amplificación. De hecho, la presente invención no necesita que la polimerización tenga lugar. Una ventaja del proceso independiente de polimerización radica en la eliminación de lo necesario para la amplificación de la secuencia diana. En ausencia de extensión del cebador el ácido nucleico diana se encuentra sustancialmente en cadena sencilla. Una vez tenemos el cebador y el oligonucleótido marcado se unen contiguamente al ácido nucleico diana, y pueden llevarse a cabo ciclos secuenciales de hibridación con oligonucleótidos y escisión de fragmentos marcados. De este modo, se puede generar una cantidad suficiente de fragmentos marcados, que permiten la detección sin necesidad de polimerización. Tal como se podría apreciar por aquellos entendidos en el tema, la señal generada durante la amplificación por PCR se podría aumentar por esta actividad independiente de polimerización.
En cada proceso descrito aquí, se proporciona una muestra que presuntamente puede contener una secuencia de oligonucleótidos particular de interés, de un "ácido nucleico diana". El ácido nucleico diana de la muestra puede ser primero transcrito por transcripción reversa en cDNA, si fuera necesario, y entonces desnaturalizado, usando cualquier método apropiado de desnaturalización, incluyendo cualquier método físico, químico o enzimático, que son conocidos por aquellos entendidos en el tema. Se prefieren métodos físicos para la separación de cadenas que incluyen el calentamiento del ácido nucleico hasta su completa desnaturalización (>99%). Formas típicas para desnaturalizar por calor incluyen aquellas que comprenden temperaturas desde 80ºC hasta 150ºC y tiempos que pueden ser de pocos segundos hasta minutos. Una alternativa a la desnaturalización, es que el ácido nucleico diana ya exista en forma de cadena sencilla en la muestra, tal como, por ejemplo aquellos DNA o RNA de cadena sencilla de virus.
Las cadenas de ácido nucleico desnaturalizadas se incuban entonces con cebadores de oligonucleótidos preseleccionados y oligonucleótidos marcados (también llamados aquí "sonda") bajo condiciones de hibridación, condiciones que permitan la unión de los cebadores y las sondas a las cadenas sencillas de ácido nucleico. Tal como es conocido en este campo, los cebadores se seleccionan para que sus posiciones relativas a lo largo de la doble cadena sean aquellas para que el producto de extensión se sintetice a partir de un cebador, cuando el producto de extensión se separa de su molde (complementario), sirve de molde para la extensión de otro cebador produciendo una cadena replicada de longitud definida.
A causa de que las cadenas complementarias son más largas que cada sonda o cebador, las cadenas tienen más puntos de contacto y de este modo existe una mayor posibilidad de que se encuentren ambas en un tiempo determinado. Un gran exceso de concentración de sonda, más el cebador, contribuye positivamente a que aumente la proporción de hibridación de cebador y sonda en lugar de la rehibridación del molde.
El cebador tiene que ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente para polimerización. La longitud exacta y la composición del cebador dependerán de muchos factores, incluidos la temperatura de hibridación, la procedencia y composición del cebador, la proximidad del sitio de hibridación de la sonda con el sitio de hibridación del cebador, y la relación de concentraciones de sonda-cebador. Por ejemplo, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador de oligonucleótidos contiene normalmente 15-30 nucleótidos, aunque un cebador puede contener un número mayor o menor de nucleótidos. Los cebadores deben ser sufi-
cientemente complementarios para hibridarse con sus respectivas cadenas selectivamente y formar dobles cadenas estables.
Los cebadores usados aquí se seleccionan para ser complementarios "sustancialmente" a las diferentes cadenas de cada secuencia específica para ser amplificados. Los cebadores no necesitan reflejar la secuencia exacta del molde, pero deben ser suficientemente complementarios para hibridar selectivamente a sus cadenas respectivas. Las bases no complementarias o secuencias más largas pueden ser insertadas en el cebador o colocarse en los extremos del cebador, proporcionando al cebador la suficiente complementariedad con una cadena molde como para formar una doble cadena estable con él. Las secuencias de nucleótidos no complementarias de los cebadores pueden provocar lugares de restricción enzimática.
En la práctica de la invención, la sonda de oligonucleótidos marcada se puede hibridar en primer lugar con un ácido nucleico complementario antes de que la polimerasa de ácido nucleico encuentre esta región de doble cadena, permitiendo así la actividad nucleasa 5' a 3' para escindir y liberar fragmentos de oligonucleótidos mar-
cados.
Para aumentar la probabilidad de que el oligonucleótido marcado se hibride con un ácido nucleico complementario antes de que la polimerización de extensión del cebador alcance la región de doble cadena, o antes de que la polimerasa se una al oligonucleótido corriente arriba en el proceso independiente de polimerización, se pueden emplear una gran variedad de técnicas. Para el proceso dependiente de polimerización, se puede posicionar la sonda de tal manera que el extremo 5' de la sonda esté relativamente lejos del extremo 3' del cebador, de este modo se da a la sonda más tiempo para hibridarse antes que la extensión del cebador bloquee el lugar de unión de la sonda. Generalmente las moléculas cortas de cebador requieren temperaturas inferiores para formar complejos hibridados suficientemente estables con el ácido nucleico diana. De este modo, el oligonucleótido marcado se puede diseñar para que sea más largo que el cebador ya que el oligonucleótido marcado hibrida preferiblemente al diana a temperaturas relativas más elevadas que en la hibridación del cebador.
También se pueden usar cebadores o olignucleótidos marcados que tengan diferente estabilidad térmica. Por ejemplo, la composición de nucleótidos del oligonucleótido marcado se puede escoger para conseguir un mayor contenido de G/C y en consecuencia, una mayor estabilidad térmica que el cebador. De modo similar, se pueden incorporar nucleótidos modificados en la sonda, estos nucleótidos modificados contienen análogos de bases que forman pares de bases más estables que las bases que están típicamente presentes en los ácidos nucleicos.
Las modificaciones de la sonda que pueden facilitar la unión de la sonda antes de la unión del cebador para maximizar la eficiencia del presente ensayo, incluyen la incorporación de cargas positivas o enlaces fosfodiéster neutros en la sonda para disminuir la repulsión de la zona polianiónica de la sonda y la diana (ver Letsinger et al., 1988, J. Amer. Chem. Soc. 110:4470); la incorporación de bases alquiladas o halógenadas, tales como 5-bromouridina, en la sonda con tal de incrementar el apilamineto de bases; la incorporación de ribonucleótidos en la sonda para forzar la sonda: dobles cadenas diana en una estructura "A", que ha incrementado el apilamiento de bases; y la sustitución por 2,6-diaminopurina (aminoadenosina) de algunas o todas las adenosinas de la sonda. En la preparación de estas sondas modificadas de la invención, uno debería reconocer que el paso límite de la formación de la doble cadena es la "nucleación", la formación de un par de bases simple, y de éste modo alterando las características biofísicas de una porción de la sonda, de momento, sólo la porción terminal 3' o 5', es suficiente para lograr el resultado deseado. Además, debido a que la porción final 3' de la sonda (los 8-12 nucleótidos finales de 3') se disocian siguiendo degradación por exonucleasa del extremo 5' mediante la polimerasa, las modificaciones del extremo 3' se pueden realizar sin preocuparse de la interferencia de las actividades polimerasa y nucleasa.
Los parámetros de termociclación pueden también ser modificados para conseguir ventajas en la diferente estabilidad térmica de los oligonucleótidos marcados y del cebador. Por ejemplo, siguiendo el paso de desnaturalización en la termociclación, se puede alcanzar una temperatura intermedia que permita la unión de oligonucleótidos marcados pero no permita el enlace del cebador, y entonces seguidamente la temperatura se puede reducir para permitir la hibridación del cebador y la extensión. Uno debería darse cuenta, no obstante, que la escisión de la sonda es necesario que se realice en ciclos tardíos del proceso PCR para obtener resultados adecuados. De este modo, uno podría realizar la mezcla de reacción de forma que aunque inicialmente los cebadores se unieran preferiblemente a las sondas, la concentración de cebador se redujera completamente tras la extensión del cebador, para que en ciclos posteriores, las sondas se unieran preferiblemente a los cebadores.
Para favorecer la unión del oligonucleótido marcado antes que la del cebador, se puede usar una gran concentración en exceso de oligonucleótidos marcados respecto la de cebadores. En este proceso, las concentraciones de oligonucleótidos marcados están normalmente en una concentración 2-20 veces superior a la de los respectivos cebadores, que es generalmente de 0,5-5 * 10^{-7} M. Aquellos que son expertos reconocen que la concentración de oligonucleótidos, la longitud y la composición de las bases son cada uno factores importantes que afectan a la T_{m} de cualquier oligonucleótido en particular de la mezcla de reacción. Cada uno de estos factores pueden ser manipulados para crear una predisposición termodinámica para favorecer la hibridación de la sonda antes que la del cebador.
Los cebadores de oligonucleótidos y los oligonucleótidos marcados se pueden preparar por cualquier método apropiado. Métodos para preparar oligonucleótidos de secuencia específica se conocen en este campo, e incluyen, por ejemplo, la clonación y restricción de secuencias apropiadas y síntesis química directa. Métodos de síntesis química deben incluir, por ejemplo, el método fosfotriéster descrito por Narang et al., 1979, Methods in Enzymology 68:90, el método fosfodiéster revelado por Brown et al., 1979, Methods in Enzymology 68:109, el método dietilfosfoamidato revelado por Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Letters 22:1859, y el método en soporte sólido revelado en la Patente Estadounidense número 4.458.066.
La composición del oligonucleótido marcado se puede diseñar con tal de favorecer la actividad nucleasa frente el desplazamiento de cadenas (fragmentos de mono- y dinucleótidos frente a oligonucleótidos) por métodos de selección de secuencias que son ricas en GC o que eluden A y T de modo secuencial, y por elección de la posición marcada en la sonda. En la presencia de secuencias ricas en A-T en la región 5' complementaria a la sonda, la escisión ocurre aproximadamente después del cuarto, quinto o sexto nucleótido. No obstante, en una región 5' complementaria a la sonda, la escisión generalmente tiene lugar después del primero o segundo nucleótido. De modo alternativo, la incorporación de uniones fosfodiéster modificadas (por ejemplo, fosforotioato o metilfosfonatos) en la sonda marcada durante la síntesis química (Noble et al., 1984, Nuc Acids Res 12: 3387-3403; Iyer et al., 1990, J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254) se puede usar para prevenir la escisión en el lugar seleccionado. Dependiendo de la longitud de la sonda, la composición de la región complementaria 5' de la sonda, y la posición del marcador, uno puede diseñar una sonda para favorecer de modo preferente la generación de fragmentos de sonda marcados cortos o largos para usarlos en la práctica de la invención.
El oligonucleótido se marca, tal como se describe a continuación, por incorporación de marcadores detectables por métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. El método de unión o conjugación del marcador a la sonda de oligonucleótidos depende del tipo de marcador(es) usado(s) y de la posición del marcador en la sonda.
Una variedad de marcadores que podrían ser usados en la invención, así como los métodos para su inclusión en la sonda, se conocen en este campo e incluyen, pero no se limitan a estos, enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante) y sustratos de enzimas, átomos radioactivos, marcadores fluorescentes, cromóforos y marcadores quimioluminiscentes, tales como Origen™ (Igen), ligandos con parejas específicas de unión o cualquier otro marcador que pueda interaccionar con otro para apantallar, alterar o disminuir la señal. Por supuesto, al practicar la PCR usando un termociclador, el marcador tiene que poder soportar la temperatura de ciclación requerida en este proceso automático.
De entre los átomos radioactivos, el ^{32}P es el preferido. Métodos para introducir ^{32}P en los ácidos nucleicos se conocen en este campo, e incluyen, por ejemplo el marcaje 5' con una quinasa, o la inserción aleatoria por "nick translation". Las enzimas se detectan típicamente por su actividad. "Pareja de enlace específico" se refiere a una proteina capaz de unirse a una molécula ligando con alta especificidad, como por ejemplo en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico para el mismo. Otras parejas de unión específica incluyen biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteina A, y las numerosas parejas receptor-ligando conocidas en este campo. La descripción anterior no se ha definido para clasificar los diferentes marcadores en distintas clases, ya que el mismo marcador puede servir en modos diferentes. Por ejemplo, ^{125}I puede servir como marcador radioactivo o como un reactivo de densidad electrónica. HRP puede servir como enzima o como antígeno para un anticuerpo monoclonal. Además, uno puede combinar varios marcadores para obtener el efecto deseado. Por ejemplo, uno puede marcar una sonda con biotina, y detectar la presencia de la sonda con avidina marcada con ^{125}I, o con un anticuerpo monoclonal anti-biotina marcado con HRP. Otras permutaciones y posibilidades que serían aparentes para aquellos entendidos en el tema se consideran equivalentes en la envergadura de esta invención.
Los fluoróforos usados como marcadores en la construcción de sondas marcadas de la invención incluyen rodamina y derivados, tales como rojo Texas, fluoresceína y derivados, tal como 5-bromometil fluoresceína, Amarillo de Lucifer, IAEDANS, 7-Me_{2}N-cumarin-4-acetato, 7-OH-4-CH_{3}-cumarin-3-acetato, 7-NH_{2}-4-CH_{3}-cumarin-3-acetato (AMCA), monobromobimano, trisulfonatos de pireno, tal como "Cascade blue", y monobromotrimetil-amoniobimano. En general se prefieren los fluoróforos que presentan amplias variaciones de Stokes, para permitir usar fluorímetros con filtros en lugar de un monocromómetro y para incrementar la eficiencia de la detección.
En algunas situaciones, se pueden usar dos marcadores interactivos en un oligonucleótido simple con la oportuna consideración dada para mantener un espaciamiento apropiado de los marcadores en el oligonucleótido para permitir la separación de los marcadores durante la hidrólisis de oligonucleótidos. Rodamina y cristal violeta se prefieren como marcadores interactivos.
En otra realización de la invención, la detección de la sonda hidrolizada marcada se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, polarización de fluorescencia, una técnica para diferenciar entre moléculas grandes y pequeñas basada en la escisión molecular. Las grandes moléculas (por ejemplo, sondas marcadas intactas) se escinden en una solución mucho más lentamente que las moléculas pequeñas. La unión de un marcador fluorescente a la molécula de interés (por ejemplo, el extremo 5' de una sonda marcada), este marcador fluorescente se puede medir (y diferenciar) basándose en la escisión molecular, de este modo diferenciando entre sondas intactas y digeridas. La detección se puede medir directamente durante la PCR o se puede llevar a cabo después de la PCR.
En otra realización, se usaron dos oligonucleótidos marcados, cada uno complementario a regiones separadas de las cadenas separadas de una región de doble cadena diana, pero no uno con otro, ya que un oligonucleótido hibrida corriente debajo de cada cebador. Por ejemplo, la presencia de dos sondas puede potencialmente doblar la intensidad de la señal generada a partir de un solo marcador y puede además servir para reducir la rehibridación de la cadena producto, que usualmente ocurre durante la amplificación por PCR. Las sondas se seleccionan para que las sondas se unan a posiciones adyacentes (corriente abajo) a las posiciones en que se han unido los cebadores.
Se puede también usar múltiples sondas en la presente invención para obtener otros beneficios. Por ejemplo, se pueden hacer ensayos de cualquier número de patógenos en una muestra simplemente poniendo tantas sondas como se desee en la mezcla de reacción; las sondas pueden tener cada una un marcador diferente para facilitar la detección.
También se puede obtener discriminación de alelos específicos o especies específicas (esto es, específicas para las diferentes especies de Borrelia, el agente causante de la enfermedad de Lyme) usando múltiples sondas en la presente invención, por ejemplo usando sondas que tienen diferentes T_{m}s y conduciendo la reacción de hibridación/escisión a una temperatura específica para solamente una sonda/cadena doble de alelos. Por ejemplo, uno puede escoger un par de cebadores que amplifican HTLVI y HTLVII y usan dos sondas, cada marcador es único y específico para cada HTLVI o HTLVII. Uno también puede obtener discriminación específica de alelos usando solo una única sonda y examinando los tipos de productos de escisión generados. En esta realización de la invención, la sonda se diseña para que sea exactamente complementaria, al menos en la región del extremo 5', a un alelo pero no al otro alelo(s). Por lo que respecta a otro(s) alelo(s), la sonda se emparejará mal en la región terminal 5' de la sonda la cual cosa generará un producto de escisión diferente comparado con el producto de escisión generado cuando la sonda se hibrida con su alelo exactamente complementario.
Aunque la secuencia de la sonda se puede seleccionar para obtener importantes beneficios, se pueden obtener importantes ventajas por la selección de la sonda(s) marcada(s). Los marcadores se pueden unir al oligonucleótido directamente o indirectamente por diferentes técnicas. Dependiendo del tipo preciso de marcador usado, el marcador se puede localizar en el extremo 5' o 3' de la sonda, localizado internamente en la sonda, o unido a brazos espaciadores de varios tamaños y composiciones para facilitar las interacciones de la señal. Usando reactivos fosforamidita disponibles comercialmente, se pueden producir oligomeros que contienen grupos funcionales (por ejemplo, tioles o aminas primarias) en cada extremo 5' o 3' vía una fosforamidita protegida apropiadamente, y que se pueden marcar usando el protocolo descrito en, por ejemplo, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds. Academic Press, Inc., 1990).
Métodos para introducir reactivos funcionalizadores de oligonucleótidos para introducir una o más porciones sulfhidrilos, amino o hidroxilos en la secuencia de la sonda de oligonucleótidos, normalmente en el extremo 5', se describen en la Patente Esadounidense número 4.914.210. Un grupo fosfato 5' se puede introducir como un radioisótopo usando una quinasa de polinucleótidos y gamma-^{32}P-ATP para proporcionar un grupo detectable. Se puede añadir biotina al extremo 5' por reacción de un residuo aminotimidina, o un residuo 6-amino hexilo, introducido durante la síntesis, con un éster de N-hidroxisuccinimida de biotina. Marcadores en el extremo 3' pueden emplear una transferasa de polinucleótidos terminal para añadir la solución deseada, tal como por ejemplo, cordicepina ^{35}S-dATP, y dUTP biotinilado.
Derivados de oligonucleótidos son también posibles marcadores. Por ejemplo, eteno-dA y eteno-A son conocidos como nucleótidos de adenina fluorescentes que pueden ser incorporados en una sonda de oligonucleótidos. De forma similar, eteno-dC o 2-amino purina desoxiribósido es otro análogo que podría ser usado en la síntesis de sondas. Las sondas que contienen tales derivados de nucleótidos se pueden hidrolizar para liberar mononucleótidos fluorescentes mucho más fuertes por la actividad nucleasa 5' a 3' como la DNA Polimerasa extiende un cebador durante
la PCR.
La extensión dependiente de molde del cebador de oligonucleótidos está catalizada por un agente polimerizante en la presencia de cantidades adecuadas de los cuatro desoxiribonucleósidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) o análogos tal como se explicaba anteriormente, en un reacción media compuesta de las sales apropiadas, cationes metálicos, y un sistema tampón de pH. Agentes polimerizantes apropiados son enzimas conocidas para catalizar la síntesis de DNA dependiente del molde y de cebador y posee una actividad exonucleasa 5'-3'. DNA Polimerasas conocidas incluyen, por ejemplo, E. coli DNA Polimerasa I, Thermus thermophilus (Tth) DNA Polimerasa, Bacillus stearothermophilus DNA Polimerasa, Thermococcus litoralis DNA Polimerasa, y Thermus aquaticus (Taq) DNA Polimerasa. Las condiciones de reacción para catalizar la síntesis de DNA con estas DNA Polimerasas son bien conocidas en este campo. Para ser útiles en la presente invención, el agente polimerizante debe escindir eficientemente el oligonucleótido y liberar fragmentos marcados para que la señal sea directamente o indirectamente generada.
Los productos de la síntesis son moléculas de doble cadena compuestas de cadenas molde y cadenas de extensión del cebador, los cuales incluyen la secuencia diana. Biproductos de esta síntesis son fragmentos de oligonucleótidos marcados que están compuestos de una mezcla de fragmentos de mono-, di- y más largos oligonucleótidos. Ciclos repetitivos de desnaturalización, hibridación de oligonucleótidos marcados y cebadores, y extensión del cebador y escisión del oligonucleótido marcado acaban en una acumulación exponencial de la región diana definida por los cebadores y la generación exponencial de fragmentos marcados. Se llevan a cabo suficientes ciclos para obtener especies detectables marcadas que pueden ser muchas veces de orden de magnitud mayor a la señal conocida previamente, si bien en prácticas comunes estas altas proporciones de señal pueden no ser obtenidas o deseadas.
En un método preferido, el proceso PCR se lleva a cabo como un proceso automatizado que utiliza una enzima termoestable. En este proceso, la mezcla de reacción cíclicamente se somete a un paso de desnaturalización, un paso de hibridación de la sonda y el cebador, y un paso de síntesis, en el que la escisión y el desplazamiento ocurren simultáneamente con la extensión del molde dependiente del cebador. Se puede emplear un termociclador de DNA, tal como la máquina disponible comercialmente de Perkin-Elmer Cetus Instruments, que está especialmente diseñada para usarla con una enzima termoestable.
Polimerasas estables a temperatura se prefieren en este proceso automatizado, porque la vía preferida para desnaturalizar los productos de extensión de doble cadena es por exposición de estos a una alta temperatura (alrededor de 95ºC) durante el ciclo de PCR. Por ejemplo la Patente Estadounidense número 4.889.818 revela una enzima termoestable representativa aislada de Thermus aquaticus. Polimerasas adicionales estables a temperatura representativas incluyen, por ejemplo polimerasas extraídas de la bacteria termoestable Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus (que tiene una temperatura óptima inferior a las otras nombradas), Thermus lacteus, Thermus rubens, Thermotoga maritima, Thermococcus litoralis, y Methanothermus fervidus.
La detección o verificación de los fragmentos de oligonucleótidos marcados se puede hacer mediante una variedad de métodos y puede depender de la fuente del marcador o marcadores empleados. Una realización conveniente de la invención es someter, a los productos de reacción, incluyendo los fragmentos escindidos marcados, al análisis de tamaño. Se conocen métodos para determinar el tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos marcados en este campo, e incluyen, por ejemplo, electroforesis en gel, sedimentación en gradiente, cromatografía de exclusión en gel y homocromatografía.
Durante o después de la amplificación, se puede llevar a cabo la separación de los fragmentos marcados de la mezcla de PCR, por ejemplo, poniendo en contacto la mezcla de PCR con un extracto en fase sólida (SPE). Por ejemplo, se pueden añadir materiales que tienen la habilidad de unir oligonucleótidos en función del tamaño, carga, o interacción con las bases de oligonucleótido a la mezcla de PCR bajo condiciones donde los oligonucleótidos marcados no escindidos están unidos y los fragmentos cortos marcados no. Tales materiales SPE incluyen resinas o bolas de intercambio iónico, tales como las partículas de unión disponibles comercialmente Nensorb (DuPont Chemical Co.), Nucleogen (The Nest Group), PEI, BakerBond™ PEI, Amicon PAE 1.000, Selectacel™ PEI, Borato SPE con una sonda ribosa-3', SPE que contienen secuencias complementarias al extremo 3' de la sonda, y hidroxilapatita. En un procedimiento específico, si se empleara como método de señal, un oligonucleótido marcado dos veces con un marcador biotina 3' separadamente de un marcador 5' por un sitio susceptible a escisión por nucleasa, la mezcla amplificada por PCR se puede poner en contacto con materiales que contienen una pareja específica de enlace como avidina o estreptavidina, o un anticuerpo o un anticuerpo monoclonal para biotina. Tales materiales pueden incluir bolas o partículas cubiertas con parejas de unión específicas y que pueden incluir partículas magnéticas.
Siguiendo el paso en que la mezcla de PCR se ha puesto en contacto con un SPE, el material SPE puede ser eliminado por filtración, sedimentación, o atracción magnética, eliminando los fragmentos libres marcados de los oligonucleótidos marcados no escindidos y permitiendo su detección.
Los reactivos utilizados en los métodos de la invención pueden ser agrupados en equipos de diagnóstico. Los equipos de diagnóstico incluyen los oligonucleótidos marcados y los cebadores en contenedores separados. El oligonucleótido marcado está bloqueado en su extremo 3' y contiene marcadores primeros y segundos estando el primero separado del segundo por un sitio susceptible de escisión por una nucleasa. El equipo puede también contener otros reactivos empaquetados apropiados y materiales necesarios para la amplificación, por ejemplo, tampones, dNTPs, y/o sustancias polimerizantes, y para análisis de detección, por ejemplo, enzimas y extractos de fase sólida, así como las instrucciones para llevar a cabo el ensayo.
Los ejemplos presentados a continuación esperan ser ilustrativos de varios métodos y compuestos de la invención.
Ejemplo 1
Liberación de sonda marcada por PCR
Se realizó una amplificación por PCR que liberó el extremo 5' marcado con ^{32}P de una sonda complementaria cuando el producto específico deseado fue sintetizado.
Marcaje de la sonda con gamma-32P-ATP y polinucleótido quinasa
Se mezclaron 10 pmoles de cada sonda (BW31, BW33, BW35, secuencias detalladas a continuación) individualmente con 15 unidades de T4 polinucleótido quinasa (New England Biolabs) y 15,3 pmoles de gamma-32P-ATP (New England Nuclear, 3000 Ci/mmoles) en un volumen de reacción de 50 \mul que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 5 mM, espermidina 0,1 mM y EDTA 0,1 mM durante 60 minutos a 37ºC. El volumen total se extrajo en fenol/cloroformo, y el etanol precipitó tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning, Segunda edición (1989). Las sondas se resuspendieron en 100 \mul de tampón TE y se sometió a una diálisis por centrifugación en columna en Sephadex G-50 para eliminar el gamma-32P-ATP no incorporado como se explica en Sambrook et al., supra. La precipitación TCA de los productos de reacción indicó las siguientes actividades específicas:
BW31: 1,98 x 10^{6} cpm/pmol
BW33: 2,54 x 10^{6} cpm/pmol
BW35: 1,77 x 10^{6} cpm/pmol
La concentración final de las tres sondas fue 0,10 pmol/\mul.
B. Amplificación
La región amplificada fue un producto de 350 pares de bases del bacteriófago M13mp10w dirigido por los cebadores BW36 y BW42. La región de cada secuencia de cebador numerada diseñada aquí, sigue a la secuencia de nucleótidos M13 estándar.
SEQ ID NO:1
BW36 = 5' 5241-5268 3'
\quad
5'-CCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGC-3'
SEQ ID NO: 2
BW42 = 5' 5591-5562 3'
\quad
5'-GAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGC-3'.
Se usaron tres sondas diferentes, cada una contenía una secuencia de 30 bases exactamente complementarias a M13mp10w pero que se diferenciaban en las longitudes de los extremos 5' no complementarios. Las sondas se sintetizaron para tener un 3'-PO_{4} en lugar de un 3'-OH para bloquear cualquier extensión por Taq polimerasa.
SEQ ID NO:3
BW31 = 5' 5541-5512 3'
\quad
5'-*CGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCX-3'
SEQ ID NO:4
BW33 = 5' 5541-5512 3'
\quad
5'-*gatCGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCCGCGCX-3'
SEQ ID NO:5
BW35 = 5' 5541-5512 3'
\quad
5'-*cgtcaccgatCGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCX-3'
X = 3'-fosfato
a,t,g,c, = bases no complementarias a la cadena molde
* = marcador gamma ^{32}P-ATP.
Para amplificación del fragmento de 350 pb, se añadieron 10^{-3} pmoles de secuencia M13mp10w diana a un volumen de reacción de 50 \mul que contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 3 mM, 10 pmoles de cada uno de los cebadores BW36 y BW42, 200 \muM de cada uno de los cuatro desoxiribonucleosido trifosfatos, 1,25 unidades de Taq DNA Polimerasa, y además 1, 10 o 20 pmoles de las sondas isotópicamente diluidas BW31, BW33 o BW35. La cantidad de sonda marcada radioactivamente se mantuvo constante a 0,4 pmoles por reacción y se diluyó a 1, 10 o 20 pmoles con sonda no radioactiva. Se añadió Taq DNA Polimerasa en 4 \mu por reacción a 0,3125 U/\mu y se diluyó en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, KCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, NP40 0,5%, Tween 20 0,5% y gelatina 500 \mug/ml.
Una mezcla de reacción madre se hizo con cantidades apropiadas de tampón de reacción, nucleósido trifosfatos, ambos cebadores y enzima. A partir de esta mezcla madre se cogieron alícuotas y se añadieron a estas, molde y varias concentraciones de cada sonda. Las reacciones de control consistieron en la adición de todos los componentes de reacción a excepción del molde y de todos los componentes de reacción excepto la sonda. Cada mezcla de reacción fue cubierta con 50 \mul de aceite mineral para prevenir la evaporación, se microcentrifugó durante 45 segundos, y entonces se puso en un termociclador. Las mezclas de reacción estuvieron sujetas al siguiente esquema de amplifi-
cación:
Quince ciclos:
96ºC desnaturalización, 1 min
\quad
60ºC hibridación/extensión, 1,5 min
Un ciclo:
96ºC desnaturalización, 1 min
\quad
60ºC hibridación/extensión, 5,5 min.
Después de los ciclos, el aceite mineral se extrajo con 50 \mul de cloroformo, las mezclas se conservaron a 4ºC, y se realizaron los tests siguientes.
C. Análisis
Para análisis en gel de acrilamida, 4 \mul de cada reacción de amplificación se mezclaron con 3 \mul de una mezcla de gel 5X (azul de bromofenol 0,125%, Ficoll 400 12,5% en agua) y se pusieron en gel de acrilamida al 4% (10 ml de tampón TBE 10X, 1 ml de persulfato amónico 10%, 10 ml de Bis Acrilamida 40% 19:1, 50 \mul de TEMED, y 79 ml de agua) en tampón TBE 1X (Tris 0,089 M, ácido bórico 0,089 M, y EDTA 2 mM) y se sometió a electroforesis durante 90 minutos a 200 voltios. Después se marcaron con bromuro de etidio, para visualizar el DNA por fluorescencia UV.
Los resultados mostraron que la presencia de cada una de estas tres sondas a concentraciones varias no tenían efecto en las cantidades de producto amplificado generado. Los carriles muestra que no contenían sonda mostraron una discreta intensidad alta en las bandas de 350 pares de bases que corresponden a la secuencia deseada. Todos los carriles que contenían sonda mostraron lo mismo, así como algunas pocas bandas débiles a peso molecular ligeramente alto. Los carriles de control sin molde añadidos no mostraron bandas a 350 bases, solo había bandas de baja intensidad que representan cebadores de 30-40 bases.
Después de fotografiar, el gel se transfirió a papel Whatman, cubierto con Saran Wrap y se autorradiografiaron. Una exposición durante toda la noche demostró que el 90-95% de marcador radioactivo estaba cerca del fondo del gel, donde la sonda o la sonda parcialmente degradada podría actuar.
Para el análisis del gel de desnaturalización, 2 \mul de cada reacción de amplificación se mezclaron con 2 \mul de formamida cargando el tampón (0,2 ml de EDTA 0,5 M, pH 8, 10 mg de azul de bromofenol, 10 mg de cianolo de xileno, y 10 ml de formamida), entonces se calentó a 96ºC durante 3-5 minutos y se puso en hielo. Las muestras se cargaron en un gradiente desnaturalizante de gel de poliacrilamida al 6,2% (urea 7 M con sacarosa y un gradiente de tampones) de acuerdo con el procedimiento de Sambrook et al., supra. El gel se sometió a electroforesis durante 90 minutos a 2000 V, 45 W, entonces se transfirió a un papel Whatman y se autorradiografió.
Los resultados del gel desnaturalizante indican que alrededor del 50% de cada sonda fue degradado en pequeños fragmentos marcados. Aproximadamente el 50-60% de los recuentos están en el rango de 30-40 bases, correspondientes a la sonda de bajo gradiente. Una banda muy débil es visible a 300 bases para todas las reacciones de amplificación, sugiriendo que un pequeño porcentaje de las sondas se ha perdido, o nunca lo ha tenido, un grupo 3'-PO4 y ha sido extendido. El conjunto de los recuentos está en el rango de cero a quince bases. La resolución de cada gel no revela el tamaño exacto de los productos, que se puede determinar mejor por análisis homocromatográfico.
Para un análisis homocromatográfico, 1 \mul de cada muestra se puso a 1,2 cm en una placa en capa fina de celulosa de 20 X 20 cm Polygram CEL 300 DEAE en la cual se cargaron anteriormente 5 \mul de DNA de esperma de salmón (150 \mug/ml) y se secó. Después de que la muestra se secara, la placa se puso en el canal con agua destilada, y el agua permitió migrar justo hasta arriba del área de carga de la muestra. La placa se puso en un recipiente de vidrio que contenía Homo-mix III filtrado (Jay et al, 1979, Nuc. Acid Res. 1(3):331-353), una solución de RNA parcialmente hidrolizado que contenía urea 7 M, en un horno a 70ºC. La Homo-mix se dejó migrar por acción capilar hasta el extremo superior de la placa, en este tiempo la placa se eliminó, se dejó secar, se cubrió con Saran Wrap y se autorradiografió.
Una exposición durante toda la noche de la placa de homocromatografia mostró que alrededor del 40% de las sondas se degradaron en fragmentos pequeños. Estos fragmentos eran de un tamaño muy específico, dependiendo de la longitud de la cola 5' no complementaria de cada sonda. La Figura 1 nos muestra una autorradiografía de la placa TLC. La sonda BW31 (Carriles 1-3), que fue totalmente complementaria al molde M13mp10w, generó fragmentos marcados predominantemente de 1 a 2 bases de longitud. La sonda BW33 (carriles 4-6) que contenía una región no complementaria de 3 bases en 5', liberando productos predominantemente de 4 a 6 bases de longitud. La sonda BW35 (carriles 7-9) que tenía una cola 5' con 10 bases no complementarias y libero productos predominantemente de 12 a 13 bases de longitud. Los carriles 10-12 son reacciones de control que contienen además BW31, BW33 o BW35 y todos los componentes de la PCR excepto el molde después de 15 ciclos. Durante la síntesis de DNA, la enzima desplazó el primer o el segundo par de bases encontrado y lo corto en ese punto, indicativo de cómo es la actividad endonucleasa. Los resultados muestran liberación específica de sonda coordinadamente a la acumulación de producto en la PCR.
\newpage
Ejemplo 2
Especificidad de la liberación de sonda marcada
La especificidad de la liberación de sonda marcada se examinó por realización de una amplificación por PCR usando DNA de bacteriófago lambda y cebadores, y una serie de sondas con actividad quinasa no complementarias.
La región para ser amplificada fue una región de 500 nucleótidos de DNA de bacteriófago lambda que provienen del equipo de reactivos de amplificación de DNA GeneAmp® (Perkin-Elmer Cetus), flanqueado por los cebadores PCR01 y PCR02, que también provienen del equipo de DNA GeneAmp®.
SEQ ID NO:
PCR01 = 5' 7131-7155 3'
\quad
5'-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-3'
SEQ ID NO:
PCR02 = 5' 7630-7606 3';
\quad
5'-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3'.
Se usaron alícuotas de las mismas tres sondas marcadas BW31, BW33 y BW35 identificadas en el Ejemplo 1, todas ellas fueron totalmente no complementarias a la secuencia diana.
Para la amplificación de la región de 500 pares de bases, se añadieron 0,5 ng de secuencia diana de DNA lambda (Molde control, Lote #3269, 1 \mug/ml, diluido 1:10 en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM y NaCl 10 mM para estoc) a un volumen de reacción de 50 \mul que contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 3 mM, 1 \muM de cada uno de los cebadores PCR01 (Lote #3355) y PCR02 (Lote #3268), 200 \muM de cada uno de los cuatro desoxinucleósidos trifosfato, 1,25 unidades de Taq DNA Polimerasa, y además 2, 10 o 20 pmoles de sonda isotópicamente diluida BW31, BW33 o BW35. La cantidad de sonda marcada radioactivamente se mantuvo constante a 0,4 pmoles por reacción y se diluyó a 1, 10 o 20 pmoles con sonda no radioactiva. Se añadió Taq DNA Polimerasa en 4 \mul por reacción en 0,3125 unidades/\mul y se diluyó en Tris HCl 10 mM, pH 8,0, KCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, NP40 0,5%, Tween 20 0,5%, y gelatina 500 \mug/ml.
La mezcla de reacción madre se preparó como se ha enseñado previamente, a lo largo de reacciones de control sin sonda o sin enzima. Las mezclas de reacción se amplificaron siguiendo las condiciones de ciclación y así sucesivamente del Ejemplo 1B y entonces fue analizado tal como se explica a continuación. Por análisis en gel de acrilamida, 4 \mul de cada mezcla de reacción de amplificación con 3 \mul de mezcla de carga 5X se cargaron en un gel de 4% de acrilamida en un tampón TBE 1X y se sometió a electroforesis durante 90 minutos a 200 voltios. Después, revelando con bromuro de etidio, el DNA se visualizó por fluorescencia UV.
Los resultados muestran que la presencia de cualquier sonda en alguna concentración no tiene efecto en la cantidad de producto de amplificación generado. Los carriles control muestra no contenían sonda, y todos los carriles que contenían sonda, mostraron una banda débil de alta intensidad en 500 pares de bases correspondiente a la secuencia deseada. Los carriles control sin adición de enzima no mostraron ninguna banda de producto, mostraron tan sólo bandas de baja intensidad que representaban al cebador y a sondas de 30-40 nucleótidos.
El análisis por homocromatografía mostrado en la Figura 2 muestra una exposición durante toda la noche de la placa en que no se observó degradación de las sondas. Todos los recuentos se situaban en el punto de origen, no mostrando liberación alguna de fragmentos marcados. Los carriles 1-3 eran reacciones que contenían sonda BW31; Los carriles 4-6 incluían la sonda BW33; Los carriles 7-9 incluían la sonda BW35; y los carriles 10-12 eran reacciones de control sin molde. Los resultados muestran que la sonda no es degradada a excepción de enlaces específicos a la diana y que es capaz de resistir las condiciones de ciclación de la PCR.
En análisis de gel desnaturalizado, 2 \mul de cada reacción de amplificación se mezclaron con 2 \mul de formamida cargando el tampón (descrito en el Ejemplo 1) y se situó en la estufa a 96ºC durante 3-5 minutos. Las muestras se pusieron inmediatamente en hielo y se cargaron en gel de acrilamida al 6,2% en gradiente desnaturalizante, y se sometió a electroforesis durante 90 minutos a 2000 voltios. Después de la electroforesis, el gel se transfirió a un papel Whatman, se cubrió con Saran Wrap, y se autorradiografió.
Una exposición durante toda la noche reveló que todos los recuentos en el rango de 30-40 pares de bases, correspondían al tamaño de las sondas. Otra vez, no había degradación de sonda aparente, además se confirmaba que la sonda debía ser enlazada específicamente al molde antes de que cualquier degradación tuviera lugar.
Ejemplo 3
Especificidad de la liberación de sonda marcada en la presencia de DNA genómico
En este ejemplo, la especificidad de la liberación de sonda marcada se estudió por realización de una amplificación por PCR en presencia de DNA genómico degradado o no degradado.
La sonda BW33 con actividad quinasa usada en este experimento tenía una actividad específica de 5,28 x 10^{6} cpm/pmoles determinada por precipitación TCA seguida de reacción quinasa. La reacción amplificada era una región de 350 pares de bases de M13mp10w, flanqueada por los cebadores BW36 y BW42. Secuencias de cebadores y situaciones se citan en el Ejemplo 1. El DNA genómico humano era de la línea celular HL60 y se usó degradado o sin degradar por cortes en una prensa francesa hasta un tamaño promedio de 800 pares de bases.
Cada 50 \mul de reacción de amplificación consistían en 10^{-2} o 10^{-3} pmoles de secuencia diana M13mp10w, 1 \mug de DNA genómico HL60 degradado o no degradado añadido a una mezcla que contenía KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 3 mM, 10 pmoles de cada uno de los cebadores BW36 y BW42, 200 \muM de cada uno de los cuatro desoxiribonucleósidos trifosfato, 1,25 unidades de Taq DNA Polimerasa y 10 pmoles de sonda BW33 diluida isotópicamente.
La mezcla de reacción madre se hizo con cantidades apropiadas de tampón de reacción, nucleósidos trifosfato, cebadores, sonda y enzima. Se cogieron alícuotas y a éstas se añadieron molde M13mp10w y/o DNA genómico. Las reacciones de control incluían todos los componentes de reacción a excepción de DNA diana M13mp10w o todos los componentes de reacción excepto DNA genómico.
Cada mezcla de reacción se cubrió con 50 \mul de aceite mineral, se microcentrifugó, y se introdujo en un termociclador. Las mezclas de reacción se sometieron al siguiente esquema de amplificación:
Para 10, 15 o 20 ciclos:
96ºC desnaturalización, 1 min
\quad
60ºC hibridación/extensión, 1,5 min
Ciclo final:
96ºC desnaturalización, 1 min
\quad
60ºC hibridación/extensión, 5,5 min.
Después de los ciclos, el aceite mineral se eliminó usando 50 \mul de cloroformo y las muestras se guardaron a 4ºC. Las muestras fueron seguidamente analizadas por electroforesis en gel de acrilamida al 4%, y análisis por homocromatografía.
Para el análisis en gel de acrilamida, 4 \mul de cada mezcla de reacción se mezclaron con 3 \mul de mezcla de carga 5X, se cargó en un gel de acrilamida al 4% en Tampón TBE 1X, y se sometió a electroforesis durante 90 minutos a 220 voltios. El DNA se visualizó por fluorescencia UV después de revelarlo con bromuro de etidio.
En los carriles correspondientes a las muestras control que no contenían DNA diana M13mp10w, no había bandas de producto visibles, indicando la ausencia de cualquier contaminación cruzada de M13mp10w. Todos los carriles siguientes mostraron una banda a 350 bases correspondiente a la secuencia esperada. La intensidad de la banda fue más grande cuando había 10^{-2} pmoles de DNA diana M13mp10w que cuando había 10^{-3} pmoles en ausencia o presencia de DNA genómico (degradado o sin degradar). La intensidad de la banda del producto incrementaba con números crecientes de ciclos de amplificación. Veinte ciclos producían una banda de doble intensidad que la de diez ciclos, y quince ciclos generaban una banda de intensidad intermedia. La cantidad de producto de PCR presente variaba según la cantidad de molde diana de partida y del número de ciclos, y la presencia de 1 \mug de DNA genómico humano, degradado o sin degradar, no mostraba efecto en ninguno en su producto de formación.
En el análisis por homocromatografía, 1 \mul de cada mezcla de reacción fue introducido en una placa en capa fina DEAE, y se puso en una cámara de revelado que contenía Homo-Mix III a 70ºC. Después de 90 minutos, la placa se extrajo, se secó y se cubrió con Saran Wrap, y se autorradiografió. Una exposición durante toda la noche se muestra en la Figura 3; en la Figura 3A, los carriles de 1 a 6 muestran ciclos de reacción de PCR en ausencia de DNA molde M13mp10w que contenían, alternativamente, DNA HL60 degradado o sin degradar a 10, 15 y 20 ciclos; y carriles 7-12 son reacciones control cargadas duplicadamente que contenían DNA molde M13mp10w sin ningún tipo de DNA genómico humano en 10, 15 o 20 ciclos. En la figura 3B, las reacciones son amplificadas tras aumentar los 5 ciclos de incremento de partida a 10 ciclos. La concentración del DNA molde M13mp10w en las reacciones mostradas en los carriles 1, 2, 5, 6, 9 y 10 es de 10^{-2} pmoles, mientras que en los carriles 3, 4, 7, 8, 11 y 12 es de 10^{-3} pmoles. Las reacciones mostradas en los carriles numerados desde 1 hasta 11 contienen DNA genómico humano degradado, y los otros carriles numerados contienen DNA genómico humano no degradado. Los fragmentos de sonda marcados se vieron como dos manchas bien definidas migrando a aproximadamente 4 y 5 bases en longitud en la placa de capa fina. Tal como la concentración de molde de partida aumenta y/o tal como el número de ciclos aumentan, la cantidad de fragmentos de sonda marcados liberados también aumenta. La presencia o ausencia de DNA genómico humano degradado o sin degradar no interfirió o aumentó la hibridación de la sonda y la degradación.
Los resultados muestran que el aumento de cantidades de fragmentos de sonda pequeños liberados ocurre de forma coordinada y simultáneamente a la acumulación de producto específico durante el curso de un ensayo por PCR. La presencia o ausencia además de una gran cantidad de DNA genómico humano de alta complejidad o un número elevado de extremos de DNA seleccionados al azar no tiene efecto en la acumulación de producto específico o el grado de liberación de sonda. Finalmente, la presencia de una gran cantidad de DNA genómico humano de alta complejidad no nos lleva a ninguna liberación de sonda detectable en ausencia de acumulación de producto específico.
Ejemplo 4
PCR con sonda marcada 3'
La amplificación por PCR se realizó de tal modo que liberó sonda hibridada 3' marcada radioactivamente en pequeños fragmentos cuando la sonda se hibridó con el molde. Las secuencias de las sondas fueron;
SEQ ID NO: 8
DG46 = 5' 5541-5512-3'
\quad
5'-CGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGC-3'
SEQ ID NO: 9
BW32 = 5' 5541-5512-3'
\quad
5'-gatCGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGC-3'
SEQ ID NO: 10
BW34 = 5' 5541-5512-3'
\quad
5'-cgtcaccgatCGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGC-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Marcaje de sondas con ^{32}P-cordicepina y transferasa terminal
Cinco pmoles de cada sonda (DG46, BW32, y BW34) fueron mezcladas individualmente con 17,4 unidades de transferasa terminal (Stratagene) y 10 pmoles de [\alpha-^{32}P]-cordicepina (cordicepina: 3'-desoxiadenosina-5' trifosfato, New England nuclear, 5000 Ci/mmoles, diluido 3X con ddATP [Pharmacia] en 17,5 \mul de volumen de reacción que contienen cacodilato de potasio 100 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 7,6, COCl_{2} 1 mM, y ditiotreitol 0,2 mM durante 60 minutos a 37ºC. El volumen total fue extraído con fenol/cloroformo y el etanol precipitó. Las sondas se resuspendieron en 50 \mul de tampón TE y corrieron a través de una columna de diálisis de giro Sephadex G-50 de acuerdo con el procedimiento descrito en Sambrook, et al., Molecular Cloning, supra. La concentración final de sondas fue de 0,1 \mul. La precipitación TCA de productos de reacción indicó las siguientes actividades específicas:
DG46: 2,13 x 10^{6} cpm/pmol
BW32: 1,78 x 10^{6} cpm/pmol
BW34: 5,02 x 10^{6} cpm/pmol.
La comparación del análisis de gel de gradiente desnaturalizante de las sondas marcadas radioactivamente 3' y las sondas con actividad quinasa 5' BW31, BW33 y BW35, muestran que las sondas marcadas radioactivamente 3' corrían de un modo similar que las sondas marcadas radioactivamente 5'.
De nuevo, la región amplificada fue la región de 350 bases en M13mp10w definida por los cebadores BW36 y BW42. Las secuencias de cebadores y las situaciones se indican en el Ejemplo 1. Cada mezcla de amplificación se preparó adicionando 10^{-3} pmoles del DNA M13mp10w diana a un volumen de reacción de 50 \mul que contiene KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 3 mM, 10 pmoles de cada uno de los cebadores BW36 y BW42, 200 \muM de cada uno de los cuatro desoxinucleósidos trifosfato, 1,25 unidades de Taq DNA Polimerasa, y además 2, 10 ó 20 pmoles de sonda isotópicamente diluida DG46, BW32 o BW34.
La mezcla de reacción madre se hizo con cantidades apropiadas de tampón de reacción, nucleósido trifosfato, molde y enzima. Las alícuotas se cogieron y se añadió a éstas una cantidad apropiada de cebadores y sondas. Las reacciones control incluyeron todos los componentes de reacción excepto los cebadores, y todos los componentes de reacción excepto la sonda.
Las mezclas de reacción se cubrieron con 50 \mul de aceite mineral, se sometió a microcentrifugación, y se introdujo en el termociclador. El esquema de amplificación fue el siguiente:
Quince ciclos:
96ºC desnaturalización, 1 min
\quad
60ºC hibridación/extensión, 1,5 min
Ciclo final:
96ºC desnaturalización, 1 min
\quad
60ºC hibridación/extensión, 5,5 min.
Después de los ciclos, el aceite mineral se extrajo usando 50 \mul de cloroformo, y las muestras se guardaron a 4ºC.
Las muestras se analizaron por gel de acrilamida 4%; un gel de acrilamida 8% en gradiente desnaturalizante, y por homocromatografía. Para los tres análisis, el manejo de las mezclas de reacción fue tal como fue descrito previamente.
En el análisis de gel de acrilamida 4%, fue visible una banda muy bien marcada correspondiente al producto deseado de 350 bases en todas las mezclas de reacción a excepción de las reacciones de control sin cebadores. En todas las mezclas de reacción que contenían cebador y sonda, también se veía una segunda banda aproximadamente a 300 bases. Ésta segunda banda se volvía más intensa con el aumento de la concentración de sonda, y probablemente corresponde a la sonda que no fue eficazmente marcada radioactivamente 3' o que perdió el marcaje 3', y generando la extensión de la sonda y la generación de producto no marcado.
Una exposición durante toda la noche de un gel de acrilamida al 8% en gradiente desnaturalizante mostró una distribución de productos en un rango desde la sonda completa bajando hasta al menos 15 bases con las tres sondas usadas. Tal como esperábamos, la actividad nucleasa 5'-3' de la Taq DNA Polimerasa degradó la sonda hasta un punto donde la sonda degradada se disociaba del molde.
La distribución por tamaños de los productos fue ilustrativa de los continuos cambios de las concentraciones de reactivos y los cambios de temperatura durante los ciclos de PCR. Tales variaciones nos llevarían a cambios en la cinética de hibridación de la sonda y enzima, permitiendo a la sonda disociarse en una variedad de tamaños a diferentes tiempos en la rutina de ciclación.
La placa de homocromatografía reveló que el producto más pequeño está alrededor de 10 a 12 bases de longitud para todas las sondas examinadas. Las tres sondas tenían secuencia idéntica excepto en la cola del extremo 5', este resultado muestra que para ésta secuencia de sonda en particular a una temperatura de hibridación/extensión de 60ºC, la sonda se degradó hasta alrededor de 10 bases y entonces se disoció del molde.
Ejemplo 5
Actividad nucleasa 5'-3' independiente de polimerización de la Taq DNA Polimerasa
La Taq DNA Polimerasa era capaz de liberar el extremo 5'marcado con ^{32}P de una sonda hibridada cuando se encuentra próxima a aquella sonda por un cebador corriente arriba. Diferentes series de cebadores se diseñaron para unir de cero a veinte bases corriente arriba de la sonda hibridada fosfatada BW33. Estos cebadores se muestran a continuación:
BW37 SEQ ID NO: 11
\hskip0.5cm Delta-0 \hskip0.5cm 5' 5571-5542 3'
\quad
5'-GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCA-3'
BW38 SEQ ID NO: 12
\hskip0.5cm Delta-l \hskip0.5cm 5' 5572-5543 3'
\quad
5'-GGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTC-3'
BW39 SEQ ID NO: 13
\hskip0.5cm Delta-2 \hskip0.5cm 5' 5573-5544 3'
\quad
5'-GGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGT-3'
BW40 SEQ ID NO: 14
\hskip0.5cm Delta-5 \hskip0.5cm 5' 5576-5547 3'
\quad
5'-AGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGC-3'
SEQ ID NO: 15
\hskip0.5cm Delta-10 \hskip0.5cm 5' 5581-5552 3'
\quad
5'-AAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGT-3'
SEQ ID NO: 16
\hskip0.5cm Delta-20 \hskip0.5cm 5' 5591-5562 3'
\quad
5'-GAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGC-3'.
Alrededor de 0,5 pmoles de sonda BW33 y 0,5 pmoles de cada uno de los cebadores se hibridaron con 0,5 pmoles de M13mp10w en 10,5 \mul de volumen de reacción que contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, y MgCl_{2} 3 mM. Las mezclas de reacción control contenían además 20 \muM o 200 \muM de cada uno de los cuatro desoxinucleósidos trifosfato. Además se usó un cebador adicional, DG47, posicionado 530 bases corriente arriba de la sonda.
DG47 SEQ ID NO: 17
\hskip0.5cm Delta-530 \hskip0.5cm 5' 6041-6012 3'
\quad
5'-CGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCG-3'.
Las mezclas de reacción se calentaron a 98ºC durante 1 minuto y se hibridaron a 60ºC durante 30 minutos. Los tubos fueron microcentrifugados y puestos en baño de agua a 70ºC. Después de bastante tiempo a las mezclas de reacción para equilibrar a la temperatura, se añadieron 10, 5, 2'5, 1'25 o 0'3125 unidades de Taq DNA Polimerasa, y se extrajeron alícuotas de 4 \mul a 2,5 y 10 minutos. La enzima se inactivó por adición de 4 \mul de EDTA 10 mM a cada alícuota y guardándolo a 4ºC. Las mezclas de reacción se examinaron por análisis por homocromatografía.
En el análisis por homocromatografía, 1 \mul de cada muestra se depositó en placas de capa fina de DEAE celulosa y se pusieron en la cámara de desarrollo que contenía Homo-Mix III a 70ºC. Homo-mix es capaz de migrar hasta el extremo superior de la placa, en ese instante las placas son extraídas, secadas, cubiertas con Saran Wrap, y autorradiografiadas. La Figura 4 muestra los resultados de este experimento.
En la figura 4, los carriles 1, 2 y 3 contienen marcadores del tamaño molecular de los oligonucleótidos marcados radioactivamente de 6, 8, 9, 10, 11, 12 y 13 nucleótidos. Los carriles 4-10 muestran reacciones para los cebadores BW37, BW38, BW39, BW40, BW41, BW42, y DG47, respectivamente, en ausencia de dNTP's. Los carriles 11-24 muestran reacciones de control para todos los cebadores en presencia de 20 mM o 200 mM dNTP.
En ausencia de los dNTPs, la Taq DNA Polimerasa generó fragmentos de sonda marcados usando todos los cebadores, con considerablemente menos marcador, siendo así liberados mientras el espacio sonda-cebador va aumentando. El efecto se observó en todas las concentraciones de enzima examinadas (0,3125 a 10 U/reacción) y en todos los tiempos. Los tamaños de los fragmentos liberados fueron los mismos, de más o menos dos o tres bases de longitud; no obstante las especies primarias variaron dependiendo de cual fue el primer cebador añadido. Las especies mayoritarias liberadas por los cebadores delta cero y delta dos fueron una base más pequeños que los liberados por los cebadores delta uno, cinco, diez y veinte. Esta actividad nucleasa fue independiente de polimerización y dependiente de proximidad.
En la presencia de nucleósidos trifosfato, los tamaños de los fragmentos de sonda marcados, y las proporciones relativas de cada uno, fueron idénticas para todos los cebadores examinados. También, los tamaños de los productos fueron más grandes por una o dos bases cuando los dNTPs estaban presentes. Es posible que mientras la enzima iba produciendo polimerización, hubo un inicio de reacción y cómo se iba encontrando sonda hibridada, se desplazaba simultáneamente una o dos bases e iba cortando, esto generaba un fragmento mayor.
No había diferencia detectable en la cantidad del producto liberado cuando los dNTPs eran 20 ó 200 \muM cada uno y no se observaron diferencias significativas debido a las veces que se produjo extensión o a las concentraciones de enzima en la presencia de dNTPs.
Ejemplo 6
Ejemplo para ilustrar la naturaleza del producto liberado basado en la secuencia de sonda en el extremo 5'
Se calculó el efecto del emparejamiento fuerte o débil de bases en la región complementaria 5' de una sonda del tamaño del producto liberado. Dos sondas BW50 y BW51, se diseñaron para contener cada una, una región complementaria a 5' rica en GC o AT. BW50 y BW51 se compararon con la sonda BW33 usada en el ejemplo V.
SEQ ID NO: 18
BW50 = 5' 5521-5496 3'
\quad
5'-tatCCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACA-3'
SEQ ID NO: 19
BW51 = 5' 5511-5481 3'
\quad
5'-gcaTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTACTATGG-3'
a,t,g.c = bases que no son complementarias a la cadena molde.
BW50, BW51, y BW33 fueron marcadas con ^{32}P-ATP usando una polinucleótido quinasa y teniendo las siguientes actividades específicas.
BW50: 1,70 x 10^{6} cpm/pmol
BW51: 2,22 x 10^{6} cpm/pmol
BW33: 1,44 x 10^{6} cpm/pmol
La concentración final de las tres sondas fue de 0,10 pmol/\mul.
Individualmente, 0,5 pmoles de cada sonda BW50, BW51 o BW33 y 0,5 pmoles del cebador BW42 se hibridaron con 0,5 pmoles de M13mp10w en un volumen de reacción de 10,5 \mul que contenía KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 3 mM y 200 \muM de cada uno de los cuatro desoxinucleósido trifosfato. Las muestras control contenían todos los componentes de reacción a excepción del molde. Para el paso de hibridación, las mezclas de reacción se calentaron a 98ºC durante 1 minuto y se hibridaron a 60ºC durante 30 minutos. Los tubos a continuación se microcentrifugaron y se pusieron en baño de agua a 50ºC, 60ºC o 70ºC. Después de pasar amplio tiempo de reacción para equilibrar la temperatura, se añadieron 0,3125 unidades de Taq DNA Polimerasa. Alícuotas de 4 \mul se extrajeron a 1, 2 y 5 minutos. Las reacciones se inactivaron por adición de 4 \mul de EDTA 10 mM a cada alícuota y poniéndolas a 4ºC. Las muestras se examinaron por análisis por homocromatografía y los resultados se muestran en las Figuras 5 y 6.
La Figura 5 muestra las reacciones que contienen una sonda BW50 rica en GC. Los carriles 1-3 contienen marcadores del tamaño molecular de oligonucleótidos de 6, 8, 9, 10, 11, 12 y 13 nucleótidos. Los carriles 4-6 muestran reacciones de extensión llevadas a cabo a 50ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Los carriles 7-9 muestran reacciones de extensión a 60ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Los carriles 10-12 muestran reacciones a 70ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Los carriles 13-15 son reacciones control que contienen todos los componentes excepto el molde, incubados a 70ºC durante 1, 2 y 5 minutos.
La Figura 6 muestra las reacciones que contienen la sonda BW51 rica en AT. Tal como en la figura 5, los carriles 1-3 son marcadores del tamaño molecular de oligonucleótidos de 6, 8, 9, 10, 11, 12 y 13 nucleótidos. Los carriles 4-6 muestran reacciones de extensión llevadas a cabo a 50ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Los carriles 7-9 muestran reacciones de extensión a 60ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Los carriles 10-12 muestran reacciones a 70ºC durante 1, 2 y 5 minutos. Los carriles 13-15 son reacciones control que contienen todos los componentes excepto el molde, incubados a 70ºC durante 1, 2 y 5 minutos.
Los resultados demostraron que la naturaleza de la liberación marcada de la sonda dependía de la temperatura y la composición de bases en el extremo 5'. La sonda BW50 más estable rica en GC mostró una pequeña liberación marcada a 50ºC (Figura 5, carriles 4-6) y fue incrementando más a 60ºC (Figura 5, carriles 7-9) y a 70ºC (Figura 5, carriles 10-12). Los productos mayoritarios liberados fueron de alrededor de 3-5 bases de longitud. BW51, que era rica en AT en el extremo 5', mostró mucha más liberación marcada a 50ºC (Figura 6, carriles 4-6) que la observada a temperaturas más altas. Además la sonda rica en AT generó productos de mayor tamaño que la sonda rica en GC. La composición de bases de la sonda rica en AT puede dar la oportunidad para una mayor capacidad "movimiento", y de este modo permitir un mayor desplazamiento de la sonda antes de cortar, y a temperaturas más bajas que la sonda rica en GC.
Ejemplo 7
Ensayo de captura HIV
A continuación se muestra un ejemplo del uso de una sonda debidamente marcada que contiene biotina en una PCR para detectar la presencia de una secuencia diana. Dos oligonucleótidos, BW37 y BW74, cada uno complementario a una porción del genoma HIV, se sintetizaron con una molécula de biotina unida al extremo 3' del oligonucleótido. El extremo 5' de cada oligonucleótido fue marcado adicionalmente con ^{32}P usando una polinucleótido quinasa y gamma-^{32}P-ATP. Los dos oligonucleótidos PH7 y PH8 son también complementarios al genoma HIV, flanquean la región que tiene homología con las dos sondas de oligonucleótidos, y pueden servir como cebadores en una PCR definiendo un producto de 142 bases. Las secuencias de éstos oligonucleótidos se muestran a continuación.
SEQ ID NO: 20 BW73 = ^{32}P-GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT-Y
SEQ ID NO:21 BW74 = ^{32}P-gtgGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT-Y
SEQ ID NO: 22 PH7 = AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT
SEQ ID NO: 23 PH8 = TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT
En las secuencias, "Y" es una biotina, y las demás letras indican bases que no son complementarias a la cadena molde.
Una serie de 50 \mul de reacciones en cadena de la polimerasa se realizaron conteniendo cada una de ellas además BW73 o BW74, cada una marcada doblemente, como sonda de oligonucleótidos a 2 nM.
Adicionalmente, se añadió molde HIV en forma de plásmido clónico en 10^{2} o 10^{3} copias por reacción, y se añadieron cebadores de oligonucleótidos PH7 y PH8 en 0,4 \muM cada uno. Se añadió Taq polimerasa en 1,25 U por reacción y dNTPs en 200 \muM cada uno. Cada reacción fue cubierta con 50 \mul de aceite, se puso brevemente en la microcentrifuga para juntar todos los líquidos en el fondo del tubo, y se puso en el termociclador entre 95ºC y 60ºC, haciendo una parada durante 60 segundos a cada temperatura, durante 30, 35 o 40 ciclos. A la conclusión de la termociclación, cada reacción se extrajo con 50 \mul de CHCl_{3} y se recogió la fase acuosa.
Cada reacción fue analizada por amplificación cargando 3 \mul en un gel de electroforesis de acrilamida al 5% y se examinó para el producto de 142 pares de bases esperado. Adicionalmente, 1 \mul de cada reacción fue examinado por homocromatografía TLC en placas de DEAE celulosa. Finalmente, cada reacción se analizó además por contacto del volumen remanente con 25 \mul de una suspensión 10 mg/ml de bolitas de estreptavidina DYNABEADS M-280 marcada, superparamagnéticas, de poliestireno. Después de la reacción con las bolitas, la mezcla se separó por filtración a través de un filtro centrifugo Costar Spin X, se determinó el filtrado recogido y la liberación marcada radioactivamente.
La Figura 7 contiene imágenes de los dos geles usados y muestran que el producto de 142 pares de bases aparece en todas las reacciones, con o sin sonda, y aumentan ambos a medida que el molde de partida se aumente desde 10^{2} a 10^{3} copias y a medida que la termociclación continuaba desde 30, 35 y 40 ciclos.
La Figura 8 es una composición de dos autorradiografías de análisis TLC de alícuotas de los PCRs y muestran que la liberación marcada radioactivamente se lleva a cabo y aumenta cuantitativamente con el aumento del molde de partida y alargando la termociclación. En el primer TLC de PCRs usando BW73, los carriles 1 y 3 contenían oligonucleótidos marcados radioactivamente de 2 y 3 bases de longitud como tamaños estándar. Los carriles 4, 5 y 6 contienen muestras a partir PCRs con 10^{2} copias de molde de partida y los carriles 7, 8 y 9 con 10^{3} copias de partida. Las muestras de los carriles 4 y 7 se termociclaron durante 30 ciclos; en los carriles 5 y 8 durante 35 ciclos; y en los carriles 6 y 9 durante 40 ciclos. En el segundo TLC de PCRs usando BW74, los carriles 1 y 2 eran los 2 mer y 3 mer marcados radioactivamente; los carriles 4, 5 y 6 contienen muestras a partir PCRs con 10^{2} copias de molde termociclado durante 30, 35 y 40 ciclos, respectivamente y los carriles 7, 8 y 9 con 10^{3} copias de molde de partida termociclados durante 30, 35 y 40 ciclos, respectivamente. El tamaño de la sonda liberada es más pequeño con BW73, que no tiene bases complementarias en 5', y más grande con BW74, que tiene una extensión de tres bases no complementarias en 5'.
Cada cromatograma se analizó adicionalmente por radioisótopos bidimensionales usando un contador Ambis. Los resultados del recuento Ambis y el recuento de captura de bolitas se muestran en la Tabla 1. La coincidencia de valores en los dos métodos de mide de la liberación marcada demuestra los aspectos prácticos del uso de sondas marcadas biotiniladas y bolas avidiniladas en PCRs para determinar la formación de producto.
TABLA 1
1
Ejemplo 8
Marcaje de sonda y Metodología de Extracto en Fase Sólida
En una realización de la presente invención, se emplea un paso de separación después de la escisión de la sonda pero antes a la determinación de la cantidad de sonda escindida, con la finalidad de separar los productos de la sonda escindida de los productos de la sonda sin escindir. Se prefieren dos métodos alternativos de separación: (1) el uso de partículas magnéticas avidiniladas o estreptavidiniladas para unir sondas marcadas en el extremo 3' con biotina y en el extremo 5' con un fluoróforo; las partículas magnéticas unidas a sonda no escindida y el fragmento 3' que es el producto de la escisión de la sonda; y (2) el uso de partículas de intercambio ionico magnéticas que unen oligonucleótidos pero no unen los mono- o dinucleótidos que están típicamente marcados en el extremo 5' con un fluoróforo o ^{32}P. Varias aspectos de estas estrategias alternativas se tratan a continuación.
A. Partículas magnéticas avidiniladas
El sistema de separación que incluye sondas 3'-biotiniladas y bolas magnéticas avidiniladas (o estreptavidiniladas) se lleva a cabo preferiblemente con bolas tales como Dynabeads™ de Dynal; estas bolas tienen capacidad de unión de biotina de aproximadamente 100 pmoles por 50 \mul de bolas. La adsorción no específica es minimizada por un primer tratamiento de las bolas con solución Denhardt's y DNA transporte.
La sonda para los métodos de separación de estreptavidina-biotina requiere una proporción de biotina en el extremo final 3' y fluoróforo en el extremo final 5'. Las funciones 3'-biotina tanto como ligando de separación por bolas estreptavidiniladas (o avidiniladas) y como bloqueante para prevenir la extensión de la sonda durante la amplificación. Las modificaciones post-síntesis se pueden simplificar por extensión de cada extremo de la sonda con un nucleófilo diferente; por ejemplo, se puede añadir una amina al extremo 3' por la adición de biotina y un tiol bloqueante en el extremo 5' por adición posterior del fluoróforo. Las sondas 3'-biotiniladas se pueden preparar por una variedad de caminos; algunos de los cuáles son mostrados a continuación.
Un éster NHS-activo derivado de biotina se puede añadir a la amina-3' de la sonda por el mecanismo de reacción mostrado en la Figura 9. La unión resultante crea un hidroxilo gamma secundario en el carbonilo amida, que puede acabar en inestabilidad durante los termociclos repetitivos de una PCR típica. Por ejemplo, termociclaciones durante 40 ciclos pueden dar como mucho un 6% de la sonda inicial añadida incapaz de unirse a partículas magnéticas avidiniladas. Cuando el enlace entre la sonda y la biotina unida es el resultado de la termociclación, la sonda separada de los productos escindidos no puede ser más larga y contribuye al conocimiento previo. Pero se puede ayudar a solucionar este problema por unión de más de una biotina a la sonda, muchos métodos alternativos para la unión de biotina a un oligonucleótido pueden producir productos más estables.
La hidrazida biotina puede reaccionar con aldehidos generados a partir de una ribosa 3' de la sonda para producir un oligonucleótido biotinilado. Para esta estrategia, el nucleótido 3' de la sonda contiene un azúcar ribosa en lugar de un azúcar desoxiribosa. Durante la síntesis, la ribosa 3' se une a un soporte sólido por su OH 2' ó 3'. Siguiendo la síntesis, el oligonucleótido completo es liberado del soporte sólido, y los dioles vecinales de la ribosa son oxidados por peryodato de sodio (NaIO_{4}) a aldehidos que entonces reaccionan con la hidrazida biotina; tal como muestra la figura 10, y el producto es reducido por borhidruro sódico (NaBH_{4}). No obstante, la sonda biotinilada resultante no se une eficazmente a las partículas magnéticas adiviniladas. El uso de hidrazida de cadena larga de biotina, un compuesto también mostrado en la Figura 10, puede solucionar este problema.
Se puede unir la biotina a la sonda durante la síntesis de sonda usando una fosforamidita de biotina soluble, tal como muestra en la Figura 11. La síntesis empieza con una base unida a un vidrio poroso controlado (CPG), que al final se deshecha. Se añade una fosforamidita, que permite la generación de un fosfato 3' por desprotección con hidróxido amónico del oligonucleótido sintético. La fosforamidita biotina es entonces añadida, y el oligonucleótido se sintetiza como se muestra en la Figura 11, que también muestra el producto final. Este método de unión permite el uso de oligonucleótidos acabados en amina 5' para la unión de un fluoróforo. El uso de una amina 3' para la unión de biotina limita la química de unión del fluoróforo a tioles 5'. La utilización de fosforamidita biotina en que uno de los nitrógenos de biotina está bloqueado puede mejorar la síntesis de sonda de biotina marcada.
También se puede usar un reactivo comercial que consiste en una biotina unida directamente a vidrio poroso; el reactivo es el sustrato de partida para la síntesis de sonda y es mostrado en la Figura 12. Éste método de unión permite el uso de oligonucleótidos acabados en amina 5' para la unión de un fluoróforo. El uso de una amina 3' para la unión de biotina limita la química de unión de fluoróforo a tioles 5'. También son posibles métodos enzimáticos de unión de nucleótidos modificados a los extremos 5' de oligonucleótidos, pero están limitados en su generalidad y práctica.
Matrices de intercambio iónico magnéticas
Se pueden usar partículas (celulosa-, silica-, y polioles basados en polímeros) de matrices (PEI) de polietilenoimina disponibles comercialmente para separar la sonda escindida de la que no. Por ejemplo, Hidrofase PEI, Selectacel™ PEI, Bakerbond™ PEI, y Amicon PAE 300, 1000, y 1000L son todas matrices PEI disponibles comercialmente para dar la separación de los productos de sonda escindida de los que no.
Partículas magnéticas de celulosa activadas disponibles comercialmente, tales como partículas Cortex MagaCell™ pueden ser derivadas con PEIs de diferentes tamaños, tales como PEI 600, PEI 1800, y PEI 10.000 y en diferentes proporciones molares de PEI por gramo de matriz. No obstante, todos los tamaños de nucleótidos y los oligonucleótidos marcados con cumarina se unen a bolas de celulosa magnética o agarosa si o no dependiendo si han sido derivadas con PEI (la especificidad vista con oligonucleóidos de matrices PEI disponibles comercialmente se pierde cuando se marca los oligonucleótidos con cumarina). La adición de concentraciones altas de sal (NaCl 2,0 M) o N-metil pirrolidina (10 a 20%) incrementa parcialmente la especificidad, y otros cosolventes tales como SDS, Brij 35, guanidina y urea también pueden ser usados para incrementar la especificidad del enlace. No obstante, la urea 8 M proporciona un bloqueo eficiente de enlaces no específicos de di- y tri-nucleótidos marcados por cumarina con Bakerbond™ o partículas PEI derivadas magnéticas Cortex™, aunque se prefiera el uso de ureas N-sustituidas.
\newpage
Tal como se apunta anteriormente, Cortex Biochem vende una variedad de partículas magnéticas recubiertas de celulosa activada que pueden unirse a PEI. La más conveniente de estas es la matriz activada de peryodato. El protocolo recomendado por el fabricante para unir aminas a la matriz activada de peryodato, no obstante, presenta varios problemas; la reacción de una amina con un aldehido proporciona iminas que son lábiles y pueden ser hidrolizadas o reaccionar con otras aminas; durante el paso para bloquear los aldehidos remanentes por adición de un exceso de etanolamina, el PEI puede ser desplazado por la etanolamina, y de este modo eliminando el PEI de la matriz; durante la reacción de conjugación en condiciones básicas, la condensación aldolica puede llevar a la reacción de grupos aldehidos, y eso desemboca en la agregación de partículas; y la reacción de aldehidos en condiciones básicas puede proporcionar radicales libres que pueden atacar a la celulosa, y participar en una variedad de reacciones.
Para estabilizar la imina, se puede incluir un paso de reducción (con NaBH_{4} y NaBH_{3}CN); sin embargo, este paso puede desembocar en la producción de gas y una disminución en la masa de las partículas, y una aglutinación de partículas. Estos efectos no deseados pueden conllevar a la producción de radicales libres. Las complicaciones resultantes a partir de la conjugación para activar aldehidos se pueden evitar a través del uso de reacciones de epóxidos. Las beta-hidroxiaminas resultantes son estables y no necesitan reducción. Además, debido a que el oxígeno puede participar en la generación de radicales libres, la eliminación del oxígeno del sistema minimizaría la formación de radicales libres, especialmente durante el paso de reducción. En una síntesis de partículas magnéticas cubiertas de celulosa derivadas de PEI, el paso de bloqueo de la etanolamina se eliminó y la preparación se depuró toda la noche con helio previamente y durante la reducción con cianoborhidruro de sodio. Hubo una pequeña agregación en la preparación final.
Las partículas magnéticas de poliacroleina pueden ser obtenidas con PEI600 y etileno diamina, y el enlace no específico de di- y tri-nucleótidos marcados con cumarina puede ser inhibido por altas concentraciones de NMP. El uso de polímeros PEI de cadena larga puede enmascarar la unión no específica deseada con pequeños olignucleótidos marcados con cumarina.
Un factor importante en la selección de la matriz magnética para su uso en el presente método es la cantidad de fluorescencia final aportada por la matriz. Una estrategia para minimizar esta fluorescencia final es seleccionar fluoróforos con excitación y emisión máxima que minimiza el solapamiento de la fluorescencia final del tampón, matriz y muestras clínicas. Además, la fluorescencia final puede resultar de la presencia de contaminantes en la matriz que pueden ser eliminados por pretratamiento extensivo previo al enlace.
C. Química de Unión del Fluoróforo a la Sonda
Tal como se apunta anteriormente, el marcador preferido para la sonda, independientemente a la estrategia de separación, es un fluoróforo. Éste aparece cuando hay interacción entre la sonda de oligonucleótidos y el fluoróforo unido. Esta interacción puede ser responsable del apantallamiento acontecido observado cuando los fluoróforos se han unido a los oligonucleótidos. Se debería seleccionar fluoróforos que minimicen la interacción con DNA cuando se unen al extremo 5' al ácido nucleico.
Los tres fluoróforos preferidos son 7-dietilamino-3-(4'-maleimidilfenil)-4-metil cumarina (CPM), 6-(bromometil)-fluoresceína (BMF), yodoacetamida amarillo Lucifer (LYIA), y 5-(y 6-)carboxi-X-rodamina succinimidil éster, con CPM preferiblemente debido a sus muchas propiedades: coeficiente de extinción grande, campo quántico grande, blanqueo bajo, y Stokes shif bajo. El fluoróforo puede ser unido a través de un tiol unido al grupo fosfato 5' de la sonda, pero en el caso de CPM, este proceso produce una maleimida de arilo, que puede ser inestable bajo condiciones de termociclación.
Existe una variedad de instrumentos comerciales que son útiles para el análisis de materiales marcados por fluorescencia. Por ejemplo, el analizador de genes ABI puede ser usado para analizar cantidades mínimas de DNA marcado con fluoróforos, tales como ROX (6-carboxi-X-rodamina), rodamina-NHS, TAMRA (5/6-carboxitetrametil rodamina NHS), y FAM (5'carboxifluoresceína NHS). Estos compuestos están unidos a la sonda por un enlace amida a través de una 5'-alquilamina de la sonda. Otros fluoróforos usados son CNHS (ácido 7-amino-4-metil-cumarin-3-acetico, succinimidil éster), que también puede estar unido por un enlace éster.
Pueden ser necesarias modificaciones en el proceso de marcaje para conseguir uniones eficientes de un fluoróforo dado a una sonda de oligonucleótidos en particular. Por ejemplo, la reacción inicial entre una sonda acabada en 5'-amina y 7-dietilaminocumarin-3-carboxilato NHS éster fue muy poco eficiente. La sonda, que había sido fosforilada en el extremo 3' para prevenir la extensión de la sonda durante la amplificación, tenía una estructura secundaria significante, una conformación en la cual la 5'-amina y 3'-fosfato estaban situados lo bastante cerca para formar un puente salino. Esta estructura podía haber protegido la 5'-amina de estar disponible para reaccionar con el NHS éster, causando de este modo la baja producción de producto. La adición de N-metilpirrolidinona 25% (NMP) mejora marcadamente la eficiencia de la reacción.
También se puede usar un fluoróforo y un agente apantallador para marcar la sonda. Cuando la sonda está intacta, la fluorescencia del fluoróforo es apantallada por el apantallador. Durante el presente método, la sonda es escindida entre el fluoróforo y el apantallador, permitiendo la expresión completa de la fluorescencia del fluorórofo. El apantallamiento comprende la transferencia de energía entre el fluoróforo y el apantallador, el espectro de emisión del fluoróforo y el espectro de absorción del apantallador se pueden solapar. Una combinación preferida por este aspecto de la invención, es el fluoróforo rodamina 590 y el agente apantallador cristal violeta.
Un ejemplo de sonda se muestra en el Ejemplo 13. La síntesis de esta construcción requiere unión de un derivado de rodamina a través del tiol 5' y la unión del cristal violeta a través de una amina extendiéndose desde una timidina dos bases más allá. La separación de las dos porciones por dos enlaces fosfodiéster incrementa las posibilidades de la escisión mediante la DNA Polimerasa entre ellos.
Los intentos iniciales para unir el cristal violeta por reacción entre una lactona y una amina no tuvieron éxito. El cristal violeta se modificó para generar una acilo azida activa, mostrada en la Figura 14. Esta forma del cristal violeta reaccionó con una amina de DNA modificado, y el producto deseado se purificó por HPLC de fase reversa.
Los intentos para hacer reaccionar el grupo rodamina-X-maleimida con el tiol 5' no tuvieron éxito. Sucedió lo mismo cuando la rodamina-X-maleimida se hizo reaccionar de forma previa a la adición de cristal violeta. Esto puede ser a causa de que el tiol-5' desbloqueado reacciona con el doble enlace de acrilamida en el elemento espaciador de timidina (ver Figura 13). Un método alternativo para la adición de una amina a una timidina se muestra en la Figura 15.
Este ejemplo nos sirve como guía general para unir una biotina al extremo 3' de una sonda de oligonucleótidos y un fluoróforo al extremo 5' de una sonda de oligonucleótidos. Aquellos expertos en el tema reconocerán que se conocen un gran número de métodos para tales uniones en este campo y que la presente invención no está limitada al método elegido en particular para marcar la sonda.
Ejemplo 9
Protocolo para una PCR mediada por AmpliWax™ con UNG y dUTP
El proceso de PCR puede ser mejorado con respecto a la especificidad de la amplificación por procesos y reactivos descritos más detalladamente en el número de serie de aplicación de patente PCT 91/01039 de 15 de Febrero, 1991; número de serie de aplicación de patente Estadounidense número PCT/US 91/05210, de 23 de Julio, 1991; número de serie de aplicación de patente Estadounidense número 557.517, de 24 de Julio, 1990. Las revelaciones de estas aplicaciones de patentes se incorporan aquí como referencia, y el siguiente protocolo demuestra como estos métodos de PCR mejorados se pueden usar en conjunción con el presente método para tener mejores resultados. Todos los reactivos se pueden comprar de Perkin-Elmer Cetus Instruments (PECI, Norwalk, CT).
Este protocolo incluye esencialmente tres componentes: tubos MicroAmp™ que contienen dNTPs, cebadores, magnesio y Tris que han sido cubiertos con cera; Premix B al cual se añade DNA AmpliTaq® Polimerasa y UNG (y se llama Mezcla de enzimas); y Premix C a los cuales se añade la muestra test y la sonda. Se hizo la mezcla de enzimas y las muestras test con sonda y se añadió bajo la capa de cera. Los tubos entonces se pusieron en un termociclador TC9600 y se procedió a la termociclación. El protocolo siguiente muestra una reacción de 50 \mul, con muestras test de no más de 27 \mul y la diana es VIH.
Los reactivos son suministrados preferiblemente tal como se especifica a continuación. Los tubos MicroAmp™ se prepararon conteniendo 1,25 \mul de Premix A y un pellet de PCR de AmpliWax™ 12 mg por tubo. Premix A contiene cebador SK145 1 \muM y cebador SK431 \muM (ningún cebador está biotinilado), dATP 800 \muM, dGTP 800 \muM, dCTP 800 \muM, dUTP 800 \muM, MgCl_{2} 15 mM y Tris-HCl 10 mM, pH 8,3. El pellet AmpliWax™ consiste en una parafina con punto de fusión de 55ºC (Aldrich Chemical Co.) que contiene Tween 65 0,15%, el pellet céreo y la capa del fondo de Premix A se añaden juntos en una cámara libre de DNA. El pellet céreo se calienta entonces para formar una barrera de vapor en la parte superior. Esta barrera retendrá su integridad cuando los tubos pasen de 4 a 25ºC, y los reactivos de PCR bajo la barrera se mantienen estables durante meses a 4ºC. No hay mezcla del material añadido por encima de la barrera hasta que la cera se funde durante los estados iniciales de la termociclación. Los tubos de control son idénticos pero no tienen cebador.
El tampón Premix B contiene tris-HCl 10 mM, pH 8,3, y KCl 50 mM y se usa para dilución de las enzimas polimerasa DNA AmpliTaq® y UNG. Se usaron más o menos 2,6 \mul del tampón Premix B por reacción.
El tampón Premix C se prepara en una concentración 10X, el cual contiene Tris-HCl 105 mM, pH 8,3, y KCl 715 mM y es añadido a la muestra de DNA test hasta que las concentraciones finales de Tris y KCl en la reacción final fueron 10 mM y 50 mM respectivamente. La sonda se añadió también en esta capa, así como el DNA transportador, si había. Si se llevan a cabo controles de plásmido, se añade alrededor de 1 \mug de DNA de placenta humana (1 \mug/\mul en Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, y NaCl 10 mM, que ha sido esquilado, extraído con fenol/cloroformo, extraído con cloroformo, y precipitado con etanol) por reacción como DNA vehículo. Se añaden unos 3,3 \mul de estoc 10X de Premix C por reacción.
La sonda es preparada como estoc 5 \muM y diseñada como LG101C. La sonda LG101C tiene un fosfato-3' para prevenir la extensión de la sonda y un 7-dietilaminocumarin-3-carboxilato unido al grupo 5' amino alifático en el nucleótido por un enlace amida. La secuencia de nucleótidos de la sonda es mostrada a continuación:
SEQ ID NO: 24 LG10lC: 5'-GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
Esta sonda se podría guardar a -20ºC en oscuridad.
La DNA AmpliTaq® polimerasa se proporciona a una concentración estoc de 5 U/\mul de PECI, y UNG se proporciona a una concentración estoc de 1 U/\mul, tal como viene del mismo vendedor. También se pueden hacer muestras de calibración de plásmidos, y con ésta finalidad, es de ayuda la preparación de diluciones estoc (copias/ml) de 300, 1.000, 3.000, 10.000, 30.000, 100.000 y 1.000.000 con DNA control positivo GeneAmplimer™. Este DNA consiste del genoma HIVZ6 reordenado para interrumpir la región pol, y bloquea la infestación, insertado en el plásmido pBR322.
Cada reacción final consistirá en 12,5 \mul de Premix A; 2,6 \mul de Premix B; 3,3 \mul de Premix C; 2 \mul de sonda LG101C; 27 \mul de muestra test; 0,4 \mul de polimerasa DNA AmpliTaq®; y 2 \mul de UNG llegando a un volumen final de 49,8 \mul. Esta mezcla comprende 250 nM de cada cebador; 200 \muM de cada dNTP; 3,74 MgCl_{2} mM; KCl 50 mm, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3; 200 nM de sonda; 2 unidades de UNG; y 2 unidades de polimerasa.
Para poner en marcha esta reacción, inicialmente se prepara la Mezcla de Enzimas en una cámara o vial libre de DNA mezclando, por reacción, 2,6 \mul de tampón Premix B, 0,4 \mul de DNA Polimerasa AmpliTaq®, y 2 \mul de UNG. Para 16 reacciones que se lleven a cabo, se debería preparar la mezcla de enzimos suficientes para 18 reacciones para asegurarse de tener suficiente material. A un tubo MicroAmp™ que contiene Premix A cubierto por cera, se añade la Mezcla de Enzimos sobre la cera, en un vial o una cámara libre de DNA. Un extremo de muestra simple es suficiente para todos los transfers, y 5 \mul de mezcla de enzimos se añadió a cada tubo.
En el área de preparación de la muestra, la mezcla muestra se preparó por mezcla, por reacción, de 3,3 \mul de tampón Premix C 10X, 27 \mul de muestra (para controles de cuantificación, se añade 10 \mul de delución estoc y 17 \mul de agua), y 2 \mul de sonda (DNA vehículo, si hay, mezclado con la muestra). Entonces, usando una punta de muestra separada de cada transfer, se añadió 32,3 \mul de mezcla de muestra a cada tubo; el desajuste de volumen entre la mezcla de enzimos y la mezcla de muestra asegura una mezcla completa. Se deberían preparar dos tubos de control sin cebadores para servir como medida de la escisión de sonda resultante de la termociclación. Este control normalmente contiene 1.000 copias de molde control. Además, se deberían realizar una serie de diluciones del plásmido para calibrar el ensayo. Esta calibración está normalmente en el rango de 3 a 10.000 copias de HIV diana por muestra. Después de completar los pasos anteriores, los tubos son cogidos y juntados en la cubeta TC9600.
El proceso de temociclación es el siguiente: 1 ciclo de 50ºC durante 2 minutos; 5 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 10 segundos, y 72ºC durante 10 segundos; y 35 ciclos de 90ºC durante 10 segundos, 60ºC durante 10 segundos, y 72ºC durante 10 segundos. Cuando la termociclación está completa, los tubos son eliminados de la TC9600 y se pusieron a -20ºC, si fuera necesario. El someter prolongadamente a los tubos a 70ºC no se recomienda, y la desnaturalización alcalina no debería ser empleada.
Son útiles una serie de controles, incluyendo un control sin molde para determinar la contaminación de las mezclas de reacción así como la amplificación de productos no específicos que pueden aparecer en la escisión de la sonda y pueden dar señales no específicos; un control sin cebador para demostrar la medida de que no hay amplificación relacionada con la sonda que pueda contribuir a la invención (se pueden incluir algunas muestras clínicas en los tests para detectar la presencia de componentes que pueden aparecer por la escisión de la sonda); y controles de quantificación.
Para extraer por debajo de la capa de cera, el producto de PCR formado por la amplificación utilizando el protocolo anterior, se puede extraer la muestra situando la pipeta en el centro de la capa de cera, haciendo avanzar la punta lentamente con presión suave para minimizar que la mezcla de reacción pase a la pipeta y contamine el laboratorio. Manteniendo la pipeta con un dedo de la misma mano que mantiene el tubo de reacción se incrementa el control. Las puntas de pipeta para cargar geles penetran en la cera especialmente bien. Un movimiento suave en lugar de uno brusco facilita la penetración y ayuda a asegurar que la punta no se obstruya con cera. Si la punta recoge un fragmento de cera, la cera se puede volver a depositar sobre la cera remanente.
También se pueden congelar los tubos de reacción (por ejemplo, en etanol helado seco o durante toda la noche en un congelador), se descongelan y se les centrifuga brevemente en una microcentrífuga (rotor de ángulo). La capa cérea se fragmentará fuertemente, permitiendo la inserción de muestra sin ningún tipo de obstrucción. Los fragmentos de cera se pueden enjugar desde el extremo desechado contra la cara interna del tubo. Este método es especialmente conveniente por el desplazamiento positivo de samplers, que frecuentemente tienen extremos tan delgados que la penetración de la capa de cera es dura. Además de los métodos anteriores debemos excluir la cera de la muestra limpia completamente para que la extracción con cloroformo no sea necesaria.
Además la invención precedente ha sido descrita en detalle con el propósito de ilustración, pero es obvio que se podrán hacer cambios y modificaciones siguiendo el alcance de las reivindicaciones por aquellos expertos en el tema.
\newpage
Ejemplo 10
Extracción en fase sólida con PEI Bakerbond™
Este ejemplo facilita el protocolo para el método para realizar una mezcla de PCR en que la amplificación se llevó a cabo en la presencia de una sonda marcada fluorescentemente (un derivado de cumarina) de acuerdo con el método de la presente invención.
La preparación de ciertos reactivos en estoc facilita la práctica de este protocolo. Tal reactivo está en tubos Eppendorf que contienen 50 mg de matriz PEI Bakerbond pre-lavada. El PEI Bakerbond™ se puede obtener de J. T. Baker (producto número 7264-00) y es una base de sílice, tamaño de partícula de 40 \muM, el tamaño de poro de 275 angstroms. La matriz se prepara lavando primero con agua; entonces etanol; entonces agua; y entonces una mezcla de Tris 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, EDTA 1 mM, NaCl 2 M, y urea 8 M; y entonces se equilibró en Tris 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM, y urea 8 M. Siguiendo la distribución, se añadieron 15 \mul de agua a cada tubo para mantener la matriz hidratada. Los tubos se deben conservar a 4ºC.
El tampón de unión se puede también preparar como una solución estoc, y la composición es Tris 10 mM, pH 8, NaCl 500 mM, KCl 50 mM, EDTA 1 mM y urea 8 M. El tampón de unión se debería conservar a 4ºC, pero la urea puede precipitar a esta temperatura. El tampón de unión puede ser calentado brevemente antes de su uso para resuspender la urea.
Determinado equipo es de utilidad para cumplir este protocolo. Durante el paso de unión, los tubos deberían ser mezclados para mantener la matriz en suspensión, y un mezclador Vortex Genie 2 (disponible en Fischer Scientific, Cat. No. 12-812, con soporte para los 60 microtubos, Cat. No. 12-812-B) es útil para este propósito. Además, también son útiles para este protocolo, un microfuge Eppendorf, un espectrofluorómetro Hitachi modelo 2000, y cubetas de quarzo de microfluorómetro con anchura interna de 2 mm y una longitud de base de 2,5 mm (disponibles en Starna Cells, Inc., No. 18F Q 10 mm 5).
También deberían realizarse controles apropiados, y el paso de unión requiere tres controles. El control para la fluorescencia final incluye la preparación de una muestra que contiene todos los componentes de la amplificación por PCR excepto la sonda. La muestra control debería ser procesada de modo idéntico a las muestras test actual en que 20 \mul se añadirán a la matriz y se medirá la fluorescencia presente en el sobrenadante. Este control proporciona un método para medir la fluorescencia final presente en la matriz, en el tampón de unión, y cualquiera de los componentes de amplificación por PCR y también proporciona una medida de las cantidades de fluorescencia presentes en muestras clínicas.
El segundo control proporciona una medida para la sonda escindida que pasa inadvertida y para la reacción de unión y consiste en una mezcla de amplificación por PCR de prueba que contiene todos los componentes incluyendo la sonda pero no está sometida a la termociclación. La muestra control debería ser procesada idénticamente a las muestras test actuales en que se añadirán 20 \mul a la matriz y la fluorescencia presente en el sobrenadante se medirá. Este control proporciona un método para medir la presencia de sonda rota en el almacenamiento así como la eficiencia de la reacción de unión. Si no hay rotura y la reacción de unión se ha completado, la fluorescencia del sobrenadante siguiendo la unión al PEI Bakerbond™ debería ser similar al medido anteriormente en el primer control.
El tercer control proporciona un método para medir la cantidad aportada de sonda. La muestra preparada para el segundo control se puede usar para esta medida. No obstante, en este caso, se añaden 20 \mul a un tubo que contiene 290 \mul de tampón de unión sin matriz. Este control se puede usar para determinar la cantidad aportada de sonda.
Para empezar el protocolo, primero hay que determinar el número de tubos de enlace requeridos; este número es la suma de muestras test y controles. Los controles no son un control de molde, no son un control de cebador, son un control de calibración, y el primer y segundo controles indicados anteriormente. Los controles pueden ser hechos por triplicado. A cada tubo, se añaden 235 \mul de tampón de unión.
También se puede preparar un tubo para medir el aporte por adición a un tubo Eppendorf vacío de; 290 \mul de tampón de unión, que es equivalente al volumen en los tubos con matriz (235 \mul de tampón de unión, 15 \mul de agua, y 40 \mul aportados por el volumen de matriz). La determinación de la cantidad aportada se puede hacer por
triplicado.
A los tubos que contienen matriz (las muestras test y el primer y segundo control), se añadió 20 \mul de mezcla de amplificación por PCR de prueba. Los tubos fueron agitados con un mixer Vortex Genie 2 en un total de 4 veces a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los tubos entonces se centrifugaron en una microfuga Eppendorf (16.000X g) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los 200 \mul superiores del sobrenadante de cada tubo se extrajeron sin tocar el pellet o matriz presente en la pared del tubo y se pusieron en un tubo Eppendorf limpio.
La fluorescencia del sobrenadante se mide en un Hitachi Modelo 2000 en las cubetas indicadas anteriormente. Para sondas marcadas con 7-dietilamino-3(4'-malei-midofenil)-4-metil-cumarina, el espectofotómetro se preparó como se indica a continuación; Voltaje PM de 700 V; la longitud de onda de excitación es de 432 nm; la longitud de unión de emisión es 480 nm; la amplitud de la banda de excitación es de 10 nm; y la amplitud de la banda de emisión es de 20 nm. Se debería minimizar la exposición de muestras a luz de excitación; si la muestra va a permanecer en el espectrofluorómetro durante un período prolongado, el obturador debe ser cerrado.
El número de pmoles de sonda escindida es la vía más conveniente para medir la cantidad de señal. Para medir la cantidad de señal, primero se debe determinar la señal aportada por el tercer control mediante el siguiente cálculo:
\frac{(Señal \ de \ fluorescencia \ del \ tercer \ control - señal \ de \ fluorescencia \ del \ primer \ control) * (310/20)}{10 \ pmoles}
En esta fórmula, la resta corrige cualquier fluorescencia que existiera en la muestra test; 310/20 es el factor de dilución, y 10 pmoles es la cantidad de sonda añadida a las amplificaciones por PCR.
La cantidad de señal de la muestra test se calcula mediante la siguiente fórmula:
\frac{(Señal \ de \ fluorescencia \ de \ la \ muestra \ test - Señal \ de \ fluorescencia \ del \ 1^{o} \ control) * 310/20}{Señal \ de \ entrada}
El protocolo anterior puede ser modificado de acuerdo con el fluoróforo usado para marcar la sonda y es meramente ilustrativo de la invención.
La Figura 16 muestra los resultados típicos y la relación de la señal de entrada del número de dianas para el presente método usando extracto de fase solida PEI Bakerbond™.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Cetus et al.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Sistema de ensayo homogéneo
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 24
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Cetus Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Calle 53, 1400
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Emeryville
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 94608
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR COMPUTADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Disquete, 3,50 pulgadas, capacidad de 800 Kb
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: Apple Macintosh
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: Macintosh 6.0.5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: WordPerfect
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FECHA DE SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE INSCRIPCIÓN: 6 de Agosto de 1991
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FECHA DE SOLICITUD PREVIA
\vskip0.800000\baselineskip
NÚMERO DE SOLICITUD: 563.758
\vskip0.800000\baselineskip
FECHA DE INSCRIPCIÓN: 6 de Agosto de 1990
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL AGENTE JURÍDICO
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Kevin R. Kaster
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE REGISTRO: 32.704
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: 2528,1
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE CONTACTO
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (415) 420-3444
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: (415) 658-5470
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGATAGTTT GAGTTCTTCT ACTCAGGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.800000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
CADENA: única
\vskip0.800000\baselineskip
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAGAAAGCG AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC X 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCGCTGCG CGTAACCACC ACACCCGCCG CCGCGCX 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 41 bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGTCACCGAT CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC X 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 25 bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATGAGTTCG TGTCCGTACA ACTGG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTTATCGAA ATCAGCCACA GCGCC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCGCTGCG CGTAACCACC ACACCCGCCG CGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGTCACCGAT CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGCTAGGGC GCTGGCAAGT GTAGCGGTCA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCGCTAGGG CGCTGGCAAG TGTAGCGGTC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCGCTAGG GCGCTGGCAA GTGTAGCGGT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCGGGCGCT AGGGCGCTGG CAAGTGTAGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC GCTGGCAAGT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAGAAAGCG AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGCCAACGC GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATCCCGCCG CGCTTAATGC GCCGCTACA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCATTAATGC GCCGCTACAG GGCGCGTACT ATGG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAATGG GAT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGGAGACCA TCAATGAGGA AGCTGCAGAA TGGGAT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCTATGTCA GTTCCCCTTG GTTCTCT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAATGG GAT 
\hfill

Claims (55)

1. Un proceso para la detección de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, dicho proceso comprende:
a) poner en contacto una muestra que contenga ácidos nucleicos de cadena simple con un oligonucleótido que contenga una región complementaria a la región del ácido nucleico diana y con un oligonucleótido marcado que contenga una secuencia complementaria a una segunda región de la misma cadena de la secuencia de ácido nucleico diana, pero que no incluya la secuencia de ácido nucleico definida por el primer oligonucleótido, para crear una mezcla de dobles cadenas durante las condiciones de hibridación, en donde las dobles cadenas comprendan al ácido nucleico diana hibridado con el primer oligonucleótido y con el oligonucleótido marcado de tal forma que el extremo 3' del primer oligonucleótido sea adyacente al extremo 5' del oligonucleótido marcado.
b) mantener la mezcla del paso (a) con una polimerasa de ácido nucleico dependiente de molde que tiene actividad nucleasa 5' a 3' bajo condiciones que permitan la actividad nucleasa 5' a 3' de la polimerasa para escindir los oligonucleótidos hibridados marcados y liberar fragmentos marcados; y
c) detectar y/o medir la señal generada por la hidrólisis del oligonucleótido marcado.
2. El proceso de la reivindicación 1 en donde el extremo 3' del primer oligonucleótido en la doble cadena hibridada del paso (a) es adyacente al extremo 5' de un oligonucleótido hibridado marcado, teniendo un espaciamiento efectivo para permitir la liberación de fragmentos marcados en ausencia de polimerización de ácidos nucleicos.
3. El proceso de la reivindicación 1 en donde los oligonucleótidos comprenden desoxiribonucleótidos.
4. El proceso de la reivindicación 1 en donde la polimerasa de ácido nucleico es una DNA Polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' a 3'.
5. El proceso de la reivindicación 1 en donde un nucleótido con el oligonucleótido marcado se modifica para controlar la especificidad de la escisión de la nucleasa.
6. El proceso de la reivindicación 1 en donde dicho oligonucleótido marcado comprende al menos un marcador.
7. El proceso de la reivindicación 1 en donde el oligonucleótido marcado comprende un primer y un segundo marcador en donde el primer marcador está separado del segundo marcador por un sitio susceptible de escisión por nucleasa.
8. El proceso de la reivindicación 6 en donde el oligonucleótido marcado está marcado en el extremo 5'.
9. El proceso de la reivindicación 6 en donde el oligonucleótido marcado además comprende una cola de ácidos no nucleicos o una secuencia de nucleótidos que no es complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana.
10. El proceso de la reivindicación 9 en donde el marcador se une a un nucleótido en la cola o secuencia no complementaria.
11. El proceso de la reivindicación 10 en donde el marcador está en el extremo 5' y está separado de la secuencia complementaria a la secuencia diana de ácido nucleico por la cola o secuencia no complementaria.
12. El proceso de la reivindicación 1 llevado a cabo bajo las condiciones suficientes para promover la polimerización de ácidos nucleicos, en donde la liberación de fragmentos marcados ocurre durante la extensión del primer oligonucleótido.
13. Una proceso de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en la muestra, dicho proceso comprende:
(a) proporcionar al ensayo de PCR que contiene dicha muestra, al menos un oligonucleótido marcado que contenga una secuencia complementaria a una región del ácido nucleico diana, en donde dicho oligonucleótido marcado se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana uniéndose por los cebadores del paso (b);
(b) proporcionar un grupo de cebadores, en donde el primer cebador contenga una secuencia complementaria a una región de una cadena de la secuencia de ácido nucleico diana e inicie la síntesis de un producto de extensión y un segundo cebador que contenga una secuencia complementaria a la otra cadena de la secuencia de ácido nucleico diana o complementaria a una región en el producto de extensión del primer cebador e inicie la síntesis de una cadena complementaria de DNA; y en donde cada cebador se selecciona para que se hibride con su molde complementario corriente arriba de cualquier oligonucleótido marcado hibridado con la misma cadena de ácido nucleico;
\newpage
c) amplificar la secuencia de ácido nucleico diana empleando una polimerasa de ácido nucleico con actividad nucleasa 5' a 3' como agente polimerizante dependiente de molde bajo condiciones permisivas para los pasos de ciclación de la PCR de (i) hibridación de los cebadores y el oligonucleótido marcado con una secuencia de ácido nucleico molde contenida dentro de la secuencia diana, y (ii) extensión del cebador en donde dicha polimerasa de ácido nucleico sintetiza un producto de extensión de cebador mientras la actividad nucleasa 5' a 3' de la polimerasa de ácido nucleico libera simultáneamente fragmentos marcados de las dobles cadenas hibridadas que comprenden oligonucleótidos marcados y sus complementarias secuencias molde de ácido nucleico, creando de este modo fragmentos marcados detectables; y
d) detectar y/o medir la señal generada por la hidrólisis del oligonucleótido marcado para determinar la presencia o ausencia de la secuencia diana en la muestra.
14. El proceso de PCR de la reivindicación 13 en donde dicha polimerasa de ácido nucleico es una enzima termoestable.
15. El proceso de PCR de la reivindicación 14 en donde dicha enzima termoestable es la DNA Polimerasa de especies de Thermus.
16. El proceso de PCR de la reivindicación 13 en donde el extremo 3' de un cebador hibridado es adyacente al extremo 5' del oligonucleótido marcado hibridado con la misma cadena de ácido nucleico.
17. El proceso de PCR de la reivindicación 16 en donde dicho oligonucleótido marcado tiene un extremo 3' bloqueado para prevenir la extensión por la polimerasa de ácido nucleico.
18. El proceso de PCR de la reivindicación 16 en donde el oligonucleótido marcado además comprende una secuencia de uno a alrededor de diez nucleótidos, la cual es sustancialmente no complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana.
19. El proceso de PCR de la reivindicación 13 en donde el oligonucleótido marcado comprende un primer y un segundo marcador en donde el primer marcador está separado del segundo marcador por un sitio susceptible de escisión por nucleasa.
20. El proceso de PCR de la reivindicación 13 en donde un par de sondas de oligonucleótidos marcadas se proporcionan en el paso (a).
21. El proceso de PCR de la reivindicación 20 en donde dicho par de sondas marcadas se hibridan con diferentes regiones no solapantes de la misma cadena complementaria de ácido nucleico, en donde el extremo 5' de la segunda sonda marcada es adyacente al extremo 3' de la primera sonda marcada.
22. El proceso de PCR de la reivindicación 18 en donde el marcador está unido a un nucleótido en la secuencia no complementaria.
23. El proceso de PCR de la reivindicación 22 en donde el marcador está en el extremo 5' y está separado de la secuencia de sonda complementaria por la secuencia no complementaria.
24. El proceso de PCR de la reivindicación 13 en donde el oligonucleótido está marcado en el extremo 5'.
25. El proceso de PCR de la reivindicación 17 en donde el oligonucleótido está marcado en el extremo 3' bloqueado.
26. El proceso de PCR de la reivindicación 13 en donde el marcador está unido a una secuencia interna del oligonucleótido.
27. El proceso de PCR de la reivindicación 13 en donde el marcador proporciona una señal proporcional al número de secuencias diana de ácido nucleico amplificadas.
28. El proceso de PCR de la reivindicación 13 en donde el marcador es un análogo de desoxiribonucleósido que tiene propiedades para generar una señal.
29. El proceso de PCR de la reivindicación 13 en donde el oligonucleótido marcado comprende un par de marcadores generadores de señal interactivos posicionados adecuadamente en el oligonucleótido para apantallar la generación de señal detectable, dichos marcadores están separados por un lugar dentro del oligonucleótido susceptible a escisión por nucleasa, de este modo permite, durante la extensión de cebadores, la actividad nucleasa 5' a 3' de la polimerasa de ácido nucleico para separar el primer marcador generador de señal interactivo del segundo marcador generador de señal interactivo por escisión en el lugar susceptible, produciendo así una señal detectable.
30. El proceso de PCR de la reivindicación 29 en donde dicho primer marcador es un sustrato quimioluminiscente y dicho segundo sustrato es un fluoróforo que interacciona con el mismo.
31. El proceso de PCR de la reivindicación 13 en donde el marcador de dicho oligonucleótido está unido a través de un brazo espaciador de suficiente longitud para permitir la actividad nucleasa 5' a 3' de la polimerasa de ácido nucleico para liberar fragmentos marcados.
32. El proceso de PCR de la reivindicación 13 en donde el diferencial de temperatura de fusión (T_{m}) entre el oligonucleótido marcado y su cebador asociado corriente arriba es efectiva para proporcionar uniones preferenciales del oligonucleótido marcado durante el paso de hibridación de los ciclos de PCR.
33. El proceso de PCR de la reivindicación 32 en donde la Tm del oligonucleótido marcado es más de 40ºC superior a la Tm del cebador corriente arriba.
34. El proceso de PCR de la reivindicación 13 en donde los fragmentos de oligonucleótidos marcados comprenden una mezcla de fragmentos de mononucleótidos, dinucleótidos, y nucleótidos más grandes.
35. El proceso de PCR de la reivindicación 13 que además comprende la separación de fragmentos de oligonucleótidos marcados de otros componentes de la mezcla de PCR antes de la detección de los fragmentos marcados.
36. El proceso de PCR de la reivindicación 35 en donde el paso de separación usa cromatografía de exclusión por tamaño.
37. El proceso de PCR de la reivindicación 35 en donde los fragmentos marcados se separan de la mezcla de PCR por extracción en fase sólida.
38. El proceso de PCR de la reivindicación 37 en donde la avidina o la estreptavidina está unida a la fase sólida y el oligonucleótido marcado comprende además una molécula de biotina unida, separada del marcador por un sitio susceptible a la escisión por nucleasa.
39. El proceso de la reivindicación 29 en donde dicho primer marcador es un fluoróforo y el segundo marcador es un apantallador que interacciona con él.
40. Un equipo para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra que comprende:
(a) al menos un oligonucleótido marcado que contenga una secuencia complementaria a una región del ácido nucleico diana, en donde dicho oligonucleótido marcado se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana unida por el cebador de la parte (b) y en donde el extremo 3' del oligonucleótido marcado esté bloqueado para prevenir la extensión por una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad 5' a 3', a través de cuya actividad nucleasa 5' a 3', los fragmentos marcados de las dobles cadenas hibridadas comprenden oligonucleótidos marcados y su secuencia de ácido nucleico complementaria al molde son liberados durante un proceso de amplificación por PCR; donde el oligonucleótido marcado contiene marcadores primeros y segundos estando el primer marcador separado del segundo por un sitio susceptible de escisión por una nucleasa y en el que los marcadores del oligonucleótido marcado constituyen un par de marcadores generadores de señales interactivas situados sobre el oligonucleótido para apantallar la generación de señal detectable;
(b) un equipo de cebadores en donde
un primer cebador contenga una secuencia complementaria a una región en una cadena de la secuencia de ácido nucleico diana y cebe la síntesis de un producto de extensión, y
un segundo cebador contenga una secuencia complementaria a una región en una segunda cadena de la secuencia de ácido nucleico diana o complementaria a una región en el producto de extensión del primer cebador y cebe la síntesis de una cadena de DNA complementaria;
y en donde cada cebador se selecciona para que se hibride con su molde complementario corriente arriba de cualquier oligonucleótido marcado hibridado con la misma cadena del ácido nucleico.
41. El equipo de la reivindicación 40 que además comprenda una polimerasa de ácido nucleico con actividad nucleasa 5' a 3'.
42. El equipo de la reivindicación 41 en donde dicha polimerasa de ácido nucleico es una enzima termoestable, preferiblemente una DNA Polimerasa de especies de Thermus.
43. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de 40 a 42 en donde los oligonucleótidos comprenden desoxiribonucleótidos.
44. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de 40 a 43 en donde el oligonucleótido marcado está marcado en el extremo 5'.
\newpage
45. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de 40 a 43 en donde el oligonucleótido marcado además comprende una cola de ácidos no nucleicos o una secuencia de nucleótidos que no es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana.
46. El equipo de la reivindicación 45 en donde el marcador en el oligonucleótido marcado está unido a un nucleótido en la cola o secuencia no complementaria.
47. El equipo de la reivindicación 46 en donde el marcador en el oligonucleótido marcado está en el extremo 5' y está separado de la secuencia complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana por la cola o secuencia no complementaria.
48. El equipo de la reivindicación 40 en donde, en el oligonucleótido marcado, el primer marcador es un fluoróforo y el segundo marcador es un apantallador que interacciona con éste.
49. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de 40 a 48 que contiene un par de sondas de oligonucleótidos marcadas en la parte (a).
50. Una mezcla de reacción para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra cuya mezcla de reacción comprende antes de la amplificación una muestra, una polimerasa de ácido nucleico con actividad nucleasa 5' a 3', un par de cebadores y al menos un oligonucleótido marcado, en que el par de cebadores y el oligonucleótido marcado se caracterizan por:
a) el oligonucleótido marcado contiene una secuencia complementaria a una región del ácido nucleico diana y se hibrida con el ácido nucleico diana unido por los cebadores de la parte b)
y de cuyo oligonucleótido a través de la actividad nucleasa 5' a 3' de una polimerasa, se liberan fragmentos marcados de las dobles cadenas hibridadas, que comprenden oligonucleótidos marcados y su secuencia complementaria al ácido nucleico molde, durante el proceso de amplificación por PCR.
b) el par de cebadores comprenden
un primer cebador que contiene una secuencia complementaria a una cadena del ácido nucleico diana y que ceba la síntesis de un producto de extensión, y
un segundo cebador que contiene una secuencia complementaria a una región en una segunda cadena de la secuencia de ácido nucleico diana o complementaria a una región en el producto de extensión del primer cebador y ceba la síntesis de una cadena de DNA complementaria;
y en donde cada cebador se selecciona para que se hibride con su molde complementario corriente arriba de cualquier oligonucleótido marcado hibridado con la misma cadena de ácido nucleico; donde el oligonucleótido marcado contiene marcadores primeros y segundos estando el primer marcador separado del segundo por un sitio susceptible de escisión por una nucleasa y en el que los marcadores del oligonucleótido marcado son un par de marcadores generadores de señales interactivas situados sobre el oligonucleótido para apantallar la generación de señal detectable.
51. La mezcla de reacción de la reivindicación 50 en donde el oligonucleótido marcado está marcado en el extremo 5'.
52. La mezcla de reacción de cualquiera de las reivindicaciones 50 o 51 en donde el oligonucleótido marcado además comprenda una cola de ácidos no nucleicos o una secuencia de nucleótidos que no es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana.
53. La mezcla de reacción de la reivindicación 52 en donde el marcador en el oligonucleótido marcado está en el extremo 5' y está separado de la secuencia complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana por la cola o secuencias no complementarias.
54. La mezcla de reacción de la reivindicación 50, en donde en el oligonucleótido marcado, el primer marcador es un fluoróforo y el segundo marcador es un apantallador que interacciona con éste.
55. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 13 en donde se usan múltiples alelos o especies de sondas específicas para discriminar entre alelos o especies.
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