CN101426930A - 检测癌症易感性的方法 - Google Patents

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Abstract

基于个体细胞对诱变剂(例如射线)的细胞响应，检测个体对癌症的易感性。在将个体细胞暴露给诱变剂前后，检测生长抑制标记物的水平。个体对由于诱变剂所引起的癌症的易感性与通过暴露给诱变剂所诱导的生长抑制标记物的程度相关。还公开了一种检测化合物在个体中预防癌症作用的方法，例如微生素或者食品提取物。将来自个体的细胞与至少一种化合物在体外进行孵育，或者将所述化合物直接施加给个体，之后将一些经过孵育的细胞以及未经过孵育的细胞暴露给诱变剂(例如射线)。接着将与所述化合物孵育的并暴露给诱变剂的细胞中的生长抑制标记物水平与在暴露给诱变剂的未孵育细胞中的水平进行比较。该化合物的预防癌症的作用与孵育的细胞中较高水平的标记物相关。

Description

检测癌症易感性的方法
发明背景
所涉及的申请
本申请是非临时申请，其根据第119(e)条要求临时专利申请No.60/574,248(2004年5月25日提交)的优先权。
发明领域
本发明涉及检测个体对癌症易感性的方法。本发明还涉及筛选对个体有预防癌症效果的化合物。
相关技术的描述
作为由于个体暴露给DNA损伤试剂所引起的体细胞DNA突变的结果，癌症会发展。这些试剂包括射线、化学试剂、食物以及自由基。尽管大部分DNA损伤可以被适当的细胞响应所修复，但是在关键的基因组位点累积的许多处DNA损伤会导致癌症。所以，癌症的易感性依赖于每个个体中DNA损伤和相应的细胞响应之间的平衡。已知，在少数疾病(例如共济失调性毛细血管扩张)中，减弱的DNA损伤响应会高频率地诱导癌症。
发明内容
在确定个体对癌症易感性的方法的一个实施方式中，在体外将个体的细胞暴露给诱变刺激物，检测在已暴露和未暴露的个体细胞中生长抑制标记物的水平，基于已暴露和未暴露的细胞中标记物水平的差别确定个体对癌症的易感性。
在该实施方式的一个方面中，所述细胞来自个体的全血。在该实施方式的另外一个方面中，所检测的水平是mRNA水平。在该实施方式的另外一个方面中，所述个体是人。在该实施方式的另外一个方面中，所述生长抑制标记物是抑制细胞生长的标记物。在该实施方式的另外一个方面中，所述抑制细胞生长的标记物是p21。在该实施方式的另外一个方面中，所述生长抑制标记物是杀细胞标记物。在该实施方式的另外一个方面中，所述杀细胞标记物是BAX。在该实施方式的另外一个方面中，所述杀细胞标记物是PUMA。
在该实施方式的另外一个方面中，所述诱变刺激物是离子射线。在该实施方式的另外一个方面中，当被暴露后，生长抑制标记物的水平大大提高，则对癌症的易感性被确定为降低。在该实施方式的另外一个方面中，当被暴露后，生长抑制标记物的水平不提高或者微弱提高，则对癌症的易感性被确定为提高。
在该实施方式的另外一个方面中，检测了多种生长抑制标记物的水平。在该实施方式的另外一个方面中，所述多种生长抑制标记物包括至少一种抑制细胞生长的标记物和一种杀细胞标记物。在该实施方式的另外一个方面中，所述抑制细胞生长的标记物是p21，所述杀细胞标记物是PUMA。
在确定个体对癌症易感性的方法的另一个实施方式中，来自多个个体物种成员的细胞，将所述细胞在体外暴露给诱变刺激物之后，以获得细胞中生长抑制标记物的基线平均检测水平，在体外将细胞暴露给诱变刺激物，在暴露之后，检测细胞内生长抑制标记物的水平；确定个体对癌症的易感性，其中比基线平均检测高的水平预示较低的癌症风险，比基线平均检测低的水平预示较高的癌症风险。
在该实施方式的一个方面中，所述细胞来自个体的全血。在该实施方式的另外一个方面中，所检测的水平是mRNA水平。在该实施方式的另外一个方面中，所述个体是人。在该实施方式的另外一个方面中，所述生长抑制标记物是抑制细胞生长的标记物。在该实施方式的另外一个方面中，所述抑制细胞生长的标记物是p21。在该实施方式的另外一个方面中，所述生长抑制标记物是杀细胞标记物。在该实施方式的另外一个方面中，所述杀细胞标记物是BAX。在该实施方式的另外一个方面中，所述杀细胞标记物是PUMA。
在该实施方式的另外一个方面中，所述诱变刺激物是离子射线。在该实施方式的另外一个方面中，检测了多种生长抑制标记物的水平。在该实施方式的另外一个方面中，所述多种生长抑制标记物包括至少一种抑制细胞生长的标记物和一种杀细胞标记物。在该实施方式的另外一个方面中，所述抑制细胞生长的标记物是p21，所述杀细胞标记物是PUMA。
在筛选用于个体中预防癌症作用的化合物的方法的一个实施方式中，将个体的细胞与所述化合物进行孵育，将个体的经过孵育的细胞和未孵育细胞在体外暴露给诱变刺激物，检测个体的在被暴露的细胞，以及在未孵育、未暴露的细胞中生长抑制标记物的水平，基于在暴露后，经过孵育的细胞和未孵育细胞中生长抑制标记物水平的差别鉴定具有预防癌症作用的化合物。在该实施方式的一个方面中，检测未受到诱变刺激的经过孵育的细胞中生长抑制标记物的水平。
在该实施方式的另外一个方面中，所述细胞来自个体的全血。在该实施方式的另外一个方面中，所检测的水平是mRNA水平。在该实施方式的另外一个方面中，所述个体是人。在该实施方式的另外一个方面中，所述生长抑制标记物是抑制细胞生长的标记物。在该实施方式的另外一个方面中，所述抑制细胞生长的标记物是p21。在该实施方式的另外一个方面中，所述生长抑制标记物是杀细胞标记物。在该实施方式的另外一个方面中，所述杀细胞标记物是BAX。在该实施方式的另外一个方面中，所述杀细胞标记物是PUMA。在该实施方式的另外一个方面中，所述诱变刺激物是离子射线。在该实施方式的另外一个方面中，检测多种生长抑制标记物的水平。在该实施方式的另外一个方面中，所述多种生长抑制标记物包括至少一种抑制细胞生长的标记物和一种杀细胞标记物。在该实施方式的另外一个方面中，所述抑制细胞生长的标记物是p21，所述杀细胞标记物是PUMA。
在该实施方式的另外一个方面中，在经过孵育的细胞中比在未孵育细胞中表现出较大提高的暴露后生长抑制标记物的水平的化合物被鉴定为具有预防癌症的作用。在该实施方式的另外一个方面中，在孵育未暴露的细胞中相对于未孵育未暴露的细胞中，表现出没有或者较少提高的生长抑制标记物水平的化合物，以及在经过孵育的细胞中比在未孵育的细胞中表现出较大提高的暴露后生长抑制标记物的水平的化合物被鉴定为具有预防癌症的作用并且具有较少的副作用风险。
在确定有效预防个体中癌症的化合物的方法的另一个实施方式中，将细胞从个体中取出，为个体施加至少一种化合物，在施加该化合物之后从个体取出细胞，在体外使在施加化合物前后取出的细胞暴露给诱变刺激物，检测在被暴露的细胞以及施加化合物之前取出的未暴露的细胞中生长抑制标记物的水平，并基于在施加化合物前后的细胞中，生长抑制标记物水平的在暴露后的差别确定该化合物的预防癌症的作用。在该实施方式的一个方面中，检测在施加化合物之后没有暴露给诱变刺激物的细胞中生长抑制标记物的水平。
在该实施方式的另外一个方面中，所述细胞来自个体的全血。在该实施方式的另外一个方面中，所检测的水平是mRNA水平。在该实施方式的另外一个方面中，所述个体是人。在该实施方式的另外一个方面中，所述生长抑制标记物是抑制细胞生长的标记物。在该实施方式的另外一个方面中，所述抑制细胞生长的标记物是p21。在该实施方式的另外一个方面中，所述生长抑制标记物是杀细胞标记物。在该实施方式的另外一个方面中，所述杀细胞标记物是BAX。在该实施方式的另外一个方面中，所述杀细胞标记物是PUMA。
在该实施方式的另外一个方面中，所述诱变刺激物是离子射线。在该实施方式的另外一个方面中，检测了多个生长抑制标记物的水平。在该实施方式的另外一个方面中，所述多个生长抑制标记物包括至少一种抑制细胞生长的标记物和一种杀细胞标记物。在该实施方式的另外一个方面中，所述抑制细胞生长的标记物是p21，所述杀细胞标记物是PUMA。
在该实施方式的另外一个方面中，在施加化合物之后取出的细胞中比在施加化合物之前取出的细胞中表现出较大提高的生长抑制标记物的暴露后水平的化合物，被鉴定为具有预防癌症的作用。在该实施方式的另外一个方面中，在施加化合物之后未暴露的细胞中相对于在施加化合物之前未暴露的细胞中表现出没有或较少提高的生长抑制标记物水平的化合物，以及在施加化合物之后的细胞中比施加化合物之前取出的细胞中表现出较大提高的生长抑制标记物的暴露后水平的化合物被鉴定为具有预防癌症的作用，并具有较少的副作用风险。
附图说明
图1表示在肝素化全血中射线诱导的p21诱导。
图2表示在健康成年人(●)和癌症患者(○)中射线诱导的p21诱导。
图3表示在健康成年人(●)和癌症患者(○)中射线诱导的BAX诱导。
图4表示在健康成年人(●，◆，▲)和癌症患者(○)中射线诱导的p21和BAX诱导。
图5表示通过各种饮食补充物的射线诱导的p21的沉默。
优选的实施方式的详细描述
不希望受到任何特定理论的限制，发明人认为发展为癌症的风险可能来自对DNA损伤响应的改变。而且，对DNA损伤响应的提高可以显示对防御癌症的能力的提高。因此，本发明的一个方面涉及检测癌症易感性以及分析化合物在特定个体中预防癌症的作用的方法，其基于DNA损伤对个体细胞的影响。该方法的一个实施方式依赖于检测细胞(如全血细胞)中标记物mRNA的水平。在美国专利申请公开No.2004/0265864中公开了适合该目的的完成检测mRNA水平的方法，这里将其作为参考加以引用。在本发明的方法中，该mRNA检测方法可以总结如下：
全血中mRNA的检测
在所公开的方法中采用的mRNA检测方案能够分析大量的未做任何准备的全血，其提供了一种分析mRNA的有效方法，其中所述mRNA仅仅来自于白细胞；去除了rRNA和tRNA，提供了可靠的mRNA回收，并容易适合自动化操作。提供了灵敏的定量系统，其包括：使用实时PCR，以及变化系数在20～25％之间的卓越再现性。
该检测程序包括3个主要步骤：1)分离白细胞以及在过滤板上裂解白细胞；2)分离mRNA，进行反向引物杂交以及在固定寡聚(dT)的微孔板上进行cDNA合成；以及3)实时PCR。简单的说，将过滤板置于收集板上，并使用150μL 5mmol/L Tris(pH 7.4)润湿过滤膜。4℃下120×g离心1分钟以从过滤板去除溶液，接着在每个孔中使用50μL充分混合的血样，并立即在4℃下120×g离心2分钟，接着使用300μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)对每个孔进行清洗一次，并在4℃下2000×g离心5分钟。接着，将60μL裂解缓冲液贮液应用到过滤板，接着在37℃下孵育10分钟，其中所述裂解缓冲液贮液补充有1％2-巯基乙醇(Bio Rad)、0.5mg/mL蛋白酶K(Pierce)、0.1mg/mL鲑鱼精子DNA(5 Prime Eppendorf/Brinkmann)、0.1mg/mL大肠杆菌(E.coli)tRNA(Sigma)、10mmol/L每种特异性反向引物以及107分子/mL的合成RNA34作为内标。接着将过滤板置于固定寡聚(dT)的微孔板(GenePlate，RNAture)上，并在4℃下2000×g离心5分钟。在4℃下存储过夜后，使用100μL清澈的裂解缓冲液对微孔板进行清洗3次，接着在4℃下使用150μL清洗缓冲液(0.5mol/L NaCl，10mmol/L Tris(pH 7.4)，1mmol/L EDTA)清洗3次。通过加入30μL含有1×RT-缓冲液(50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，5.5mmol/L MgCl2，不含二硫苏糖醇)、1.25mmol/L每种dNTP、4单位rRNasin以及80单位MMLV反转录酶(Promega)(不含引物)，并在37℃下孵育2小时，在每个孔中直接合成cDNA。将所得到的4μLcDNA直接转到384孔PCR板中，向其中加入5μLTaqMan(由Biosystems提供)以及1μL寡聚核苷酸混合物(正向和反向引物分别为15μmol/L以及3-6μmol/L TaqMan探针)，在PRISM7900HT(由Biosystems提供)中进行PCR，其通过一个循环95℃10分钟，接着45个循环的95℃30秒，55℃30秒以及60℃1分钟。在单独的孔中扩增每一个基因。使用分析软件(SDS，由Biosystems提供)确定循环极限(Ct)，其为产生一定量PCR产物(荧光)的PCR循环。可以使用iCycler(BioRad)在GenePlate中直接进行PCR。
采用从全血简单的、可重复的高通量mRNA定量方法。该快速的方案将取血后的mRNA二次诱导或者降解最小化，并且96孔过滤板以及微孔板的使用可以同时操作96个样品。在程序中最少的操作提供了非常小的样品间变化，其中变化系数(CV)值小于30％，即使在使用PCR作为定量的方法时。
在该实施方式中，过滤板可以按如下进行制备。使用玻璃纤维膜或者白细胞过滤膜来捕获白细胞。为了简化该检测，使用玻璃纤维膜或者白细胞过滤膜来构建多孔过滤板，以能够同时处理多个血样。在美国专利No.4,925,572和4,880,548中公开了用来捕获白细胞过滤器的实施例，在这里引入其所公开的内容作为参考。这些参考文献整体上公开了用于清除血产品或者血小板浓缩物中白细胞的设备。美国专利No.4,925,572所公开的用于血产品的设备包括：上游多孔元件，其包括用于去除凝胶的设备例如针状纤维无纺网；至少一种中间多孔元件，其包括用于去除微聚集体的设备例如两层或者三层熔喷法制备的网；以及下游元件，其包括通过吸附和过滤去除白细胞的设备，例如多层相对小直径的纤维网，优选为至少一种元件已经被修饰为临界湿润表面张力超过53达因/cm。美国专利No.4,880,548所公开的用于血小板浓缩物的设备包括修饰的多孔纺织介质，其具有至少大约90达因/cm的临界湿润表面张力。该专利还公开了一种清除白细胞含量以及提浓血小板的方法，其包括将血小板浓缩物通过多孔介质。
通常采用将白细胞吸附在过滤器表面作为去除白细胞的机制。由于给定重量纤维的表面与纤维的直径成反比，因此，预期更细的纤维将具有更高的能力，并且如果所使用纤维直径更小，达到期望效率所必需的纤维重量将更小。大量通常使用的纤维包括聚酯、聚酰胺和丙烯酸树脂，对其进行辐射枝接，由于其对在所需接枝水平的γ-射线所引起的降解有充分抗性，并且具有与有用的单体进行反应的结构。PBT已经成为用于开发本发明产品的主要树脂，并且是实施例中所使用的树脂。然而，需要注意的是发现其它树脂可以纤维化并且收集作为1.5微米或更小的纤维垫或者纤维网，以及临界湿润表面张力被调节到最优范围内的产品，可以很好的适合制造相同效率但更少白细胞损失的设备。相似的，适当处理的玻璃纤维可用于制造有效设备。当使用PBT基过滤器时，CD4mRNA的吸附效果是玻璃纤维基过滤器的高达4倍。在一个优选的实施方式中，多个过滤膜被层叠在一起来提高从全血中捕获白细胞的量。在另一个优选的实施方式中，过滤板用塑料胶带(Bio-Rad223-9444)密封，并且该胶带被切割使得允许进入希望数目的孔。在另一优选的实施方式中，用低渗缓冲液(20μL 5mM Tris，pH7.4)对将要加入样品的每个孔进行清洗。
该方法优选包括收集血、将血加到多孔过滤板以及去除红细胞和其它非白细胞组分。在一个优选的实施方式中，全血被吸入含有抗凝血剂的血收集管中，其提高了白细胞的过滤效率。抗凝血剂肝素，在提高白细胞过滤效率方面是特别有效的。也可以采用其它抗凝血及例如ACD和EDTA，但在所得到mRNA检测中的信号强度会被降低。在一个优选的实施方式中，血样品可以被冷冻，这去除了某些破坏mRNA的RNA酶。可以用低渗缓冲液对孔进行清洗。一旦血被加入到过滤板上的期望数目的孔中，将血过滤通过过滤膜。可以通过本领域技术人员任何已知的技术来实施过滤例如：离心、真空吸引或者正压。
该方法包括细胞裂解以及将mRNA杂交到固定在mRNA捕获区内的寡聚(dT)上。将裂解缓冲液应用到过滤板孔(40μL/孔)，并进行孵育(室温下进行20分钟)以从被捕获的白细胞中释放出mRNA。在一个优选的实施方式中，将多孔过滤板密封在塑料包中并进行离心(IEC MultiRF，2000转/分钟，4℃下1分钟)。接着再加入裂解缓冲液(20μL/孔)，接下来进行离心(IECMultiRF，3000转/分钟，4℃下5分钟)。接着从离心机中取出多孔过滤板并进行孵育(室温下2小时)。
根据优选的实施方式，裂解缓冲液含有去污剂、盐、pH缓冲液、硫氰酸胍和蛋白酶K。
裂解缓冲液的优选的实施方式含有至少一种去污剂，但可以含有一种以上的去污剂。本领域技术人员可以利用具有不同强度的去污剂浓度的不同组合来达到对各种类型细胞不同膜的不同水平的裂解。例如，IGEPAL CA-630是比N-月桂酰肌氨酸弱的去污剂，在一个实施方式中，单独IGEPAL CA-630足以裂解细胞质膜。在另一个实施方式中，强去污剂(例如N-月桂肌氨酸)可以与一种或者多种弱去污剂结合使用以优化对细胞核膜的裂解。所述去污剂优选足以裂解至少细胞质膜。另一优选的实施方式包括足以裂解细胞核膜的去污剂，因为显著量的mRNA存在于在细胞核中。在某些情况下，希望只检测细胞质mRNA，而其它情况下希望检测细胞质和细胞核中的mRNA。
裂解缓冲液的强去污剂优选包括但不限于N-月桂酰肌氨酸(N-lauroylsarcosine)、S.D.S、脱氧胆酸钠和十六烷基三甲基溴化铵。
弱去污剂包括IGEPAL CA-630、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、辛基-β-D-吡喃型葡萄糖苷或者其它本领域技术人员已知的去污剂。裂解缓冲液中可以使用0.05～2％的去污剂。裂解缓冲液的一个特别优选的实施方式含有0.5％N-月桂酰肌氨酸。另一个优选的裂解缓冲液实施方式含有0.1～2％ IGEPALCA-630。特别优选的实施方式含有0.1％ IGEPAL CA-630。
盐和螯合剂的组合也可以作为裂解剂。例如75μM NaCl和24μMNa-EDTA可以作为裂解剂。裂解剂的实施方式可以包括本领域技术人员已知的其它裂解剂。
所述裂解缓冲液的盐作为mRNA-寡聚(dT)杂交剂。按照本领域技术人员可以确定的，盐应该优选具有不超过4×SSC的严格程度(与其互补DNA序列杂交在一起的严格程度)。裂解缓冲液的其它实施方式包括NaCl或者其它本领域技术人员已知的盐。
优选裂解缓冲液贮液的pH缓冲液保持7.0～8.0的pH。一个实施方式含有1mM～100mM Tris HCl(pH7.4)。在特别优选的实施方式中，pH缓冲液含有10mM Tris HCl(pH7.4)。裂解缓冲液的其它优选的实施方式包括本领域技术人员已知的pH缓冲液，其包括具有0.03％H2O2的0.1M柠檬酸盐-磷酸盐(pH5.0)。
根据裂解缓冲液特别优选的实施方式，硫氰酸胍作为RNA酶失活剂。我们已经发现，在现有技术中通常以不足以有效的浓度使用硫氰酸胍。因此，优选，硫氰酸胍的浓度高于1.4M。硫氰酸胍浓度可以高到10M，更优选不高于2M。然而，浓度超过1.7M时，裂解缓冲液的效率会降低。因此，优选的实施方式使用大约1.4～大约1.75M的硫氰酸胍。一个优选的实施方式含有1.7～1.8M硫氰酸胍。发挥作用的裂解缓冲液可以从贮液制备，以达到1.791M硫氰酸胍的精确浓度。在将其它试剂加入到裂解缓冲液时，硫氰酸胍的浓度被稀释。所述裂解缓冲液优选含有浓度为大约1.6～大约1.7M的硫氰酸胍。
特别优选的实施方式还含有20mg/ml的蛋白酶K作为RNA酶失活剂。裂解缓冲液的一个优选的实施方式含有200μg/ml～20mg/ml的蛋白酶K。另一优选的实施方式含有200μg/ml～1.0mg/ml的蛋白酶K。另一优选的实施方式含有200μg/ml～500μg/ml的蛋白酶K。十二烷基硫酸钠也可以作为RNA酶失活剂。另一实施方式含有0.1～10％的2-巯基乙醇作为RNA酶失活剂。一个特别优选的实施例包括1％的2-巯基乙醇。RNA酶失活剂的其它实施方式可以优选包括本领域技术人员已知的还原RNA酶中二硫键的材料。
裂解缓冲液的优选的实施方式还含有螯合Mg2+和Ca2+的螯合剂。一个优选的实施方式含有0.1mM～5mM EDTA。特别优选的实施方式含有1mMEDTA。裂解缓冲液贮液的其它优选的实施方式含有本领域技术人员已知的螯合剂，其包括但不限于EDTMP、2，3-二巯基丙醇和EGTA。
裂解缓冲液的优选的实施方式可以含有tRNA，其来自各种来源并含有其以抑制来自血的DNA和RNA非特异性吸附到过滤板上。另外，tRNA的存在防止来自血的RNA的降解。在优选的实施方式中，发挥作用的裂解缓冲液的tRNA包括0.1～10mg/ml大肠杆菌(E.coli)tRNA。其它实施方式可以含有来自任何本领域技术人员已知来源的tRNA。
裂解缓冲液的优选的实施方式可以含有来自广泛多种来源的DNA，其被加入以抑制来自血的DNA和RNA非特异性吸附到过滤板上。发挥作用的裂解缓冲液的DNA包括0.1～10mg/ml的超声降解的鲑鱼精子DNA。在其它实施方式中，可以使用来自其它生物的DNA。
裂解缓冲液的优选的实施方式可以含有掺标对照的RNA，以计算在原始样品中的目标mRNA的精确量。在本发明的实施方式之前，由于原理间的变化且缺乏标准，所以一个实验得出的结果很难与其他实验的结果相比较。然而，在本发明的优选实施方法中，通过将用TaqMan或其他PCR检测所获得的值除以用每个样品中掺标对照的RNA剂量的回收百分比，即可确定目标mRNA的精确量。
裂解缓冲液的特别优选的实施方式每孔含有10～1×e10，更优选1×e5～1×e10个拷贝的掺标RNA。在优选的实施方式中，所使用对照RNA的量至少足以被检测，但不能多到显著地干涉需要定量的目标mRNA的量。在优选的实施方式中，加入到裂解缓冲液中的对照RNA是多聚(A)+RNA。在特别优选的实施方式中，其中检测样品是人血，对照RNA与人血中存在的RNA不同源。在某些优选的实施方式中，对照RNA的序列与目标mRNA的同源性小于90％，或者与目标mRNA在长度上有大于10％的差异。在其它优选的实施方式中，对照RNA的序列与目标mRNA的同源性小于85％，或者与目标mRNA在长度上有大于5％的差异。在进一步的实施方式中，对照RNA的序列与目标mRNA的同源性小于75％，或者与目标mRNA在长度上有大于2％的差异。在可以替代的实施方式中，对照RNA的序列与目标mRNA的同源性小于65％，或者与目标mRNA在长度上有大于1％的差异。在一个实施方式中，对照RNA可以优选地通过PCR方法扩增模板寡聚核苷酸来制备。因此，可以使用正向引物(SEQ ID No：3、4、7和1)、反向引物(SEQ ID NO：2和8)以及TaqMan探针(FAM-SEQ ID NO 6-TAMRA、FAM-SEQ ID NO9-TAMRA和FAM-SEQ ID NO 5-TAMRA)来扩增各种对照RNA寡聚核苷酸。可替代的实施方式包括使用多个不同的需要定量的目标mRNA。进一步的实施方式包括使用多个对照RNA。
该方法包括对mRNA进行定量，在优选的实施方式中需要由mRNA合成cDNA和使用PCR扩增cDNA。在一个优选的实施方式中，使用裂解缓冲液(150μl/孔×3次，手工)和清洗缓冲液(150μL/孔×3次，手工或者BioTek#G4)对多孔过滤板进行清洗。接着，将cDNA合成缓冲液加入到多孔过滤板(40μl/孔，手工或者I&J#6)。可以将Axymat(Amgen AM-96-PCR-RD)放置在多孔过滤板上，接着将其放在热块(37℃，VWR)上并孵育(>90分钟)。然后，将多孔过滤板进行离心(2000转/分钟，4℃下1分钟)。将PCR引物加入384孔PCR板，将cDNA从多孔过滤板转移到384孔PCR板。对PCR板进行离心(2000转/分钟，4℃下1分钟)，开始实时PCR(TaqMan/SYBER)。
另一优选实施方式包括在mRNA杂交或者cDNA合成的过程中应用特异性反义引物。优选在mRNA杂交的过程中加入所述引物，这样可以在cDNA合成之前去除多余的反义引物，以避免遗留效应。寡聚(dT)和特异性引物(NNNN)同时在多聚-A RNA的不同位置引导cDNA的合成。特异性引物(NNNN)和寡聚(dT)在扩增过程中引起cDNA的形成。即使当通过在95℃下对每个孔加热2分钟将特异性引物衍生的cDNA从GenePlate去除时，由加热变性处理(使用TaqMan定量PCR)所得到特异性CD4cDNA的量也与由未加热阴性对照中所得到的量相似。不希望被任何解释或者理论所限制，这种结果一个可能的解释就是在扩增过程中寡聚(dT)衍生的cDNA可以替换引物衍生的cDNA。这是特别方便的，因为加热变性程序被完全省略了。而且，为不同目的加入多种反义引物，可以从试样的cDNA扩增出每种基因，将GenePlate内的寡聚(dT)衍生的cDNA贮存以将来使用。
本发明的另一优选实施方式包括对来自全血mRNA进行高通量定量的设备。该设备包括多孔过滤板，其含有：多个样品传输孔、在样品传输孔下方捕获白细胞的过滤器、以及在滤器下方的mRNA捕获区，其含有固定在mRNA捕获区的孔中的寡聚(dT)。为了提高白细胞的收集效率，可以将多个过滤膜层叠在一起。
尽管许多传统的扩增技术可以与本发明的检测方法结合使用，但本发明特别优选的实施方式包括使用来自全血的RNA和对照RNA进行实时定量PCR(TaqMan)。Holland等人的PNAS 88：7276～7280(1991)描述了一种称作TaqMan检测的检测。在聚合酶链式反应产物检测系统中采用Taq聚合酶的5＇→3＇核酸外切酶活性，以随着扩增产生特异性可检测的信号。3＇末端不能延伸，5＇末端被标记的一种寡聚核苷酸探针被设计成在目标序列内部杂交，将该探针引入到聚合酶链式反应检测中。在扩增过程中，探针与聚合酶链式反应产物链中之一的退火产生了适合核酸外切酶活性的底物。在扩增过程中，Taq聚合酶的5＇→3＇核酸外切酶活性把探针降解成更小的片段，其可以与未降解的探针区别开。这种检测是灵敏和特异性的，并且相对于更多麻烦的检测方法有显著的改进。Gelfand等人的美国专利No.5,210,015描述了该检测一个版本。该专利公开了一种方法，其包括：(a)提供PCR检测，其含有样品，至少一种含有与目标核酸区域互补的序列的被标记的寡聚核苷酸，其中被标记的寡聚核苷酸退火至被步骤(b)中寡聚核苷酸引物限定的目标核酸序列内；(b)提供一组寡聚核苷酸引物，其中第一引物含有与目标核酸序列一条链中的区域互补的序列并引导互补DNA链的合成，第二引物含有与目标核酸序列的第二条链中的区域互补的序列并引导互补DNA链的合成；其中每种寡聚核苷酸引物被选择为退火至任何被标记寡聚核苷酸的互补模版上游，其中所述被标记的寡聚核苷酸退火至相同的核酸链；(c)采用具有5＇→3＇核酸酶活性的核酸聚合酶作为模板依赖聚合剂对目标核酸序列进行扩增，其在允许PCR下列循环步骤的条件下进行(i)将引物和被标记的寡聚核苷酸退火至包含在目标区域内的模板核酸序列，以及(ii)延伸引物，其中所述核酸聚合酶合成引物延伸产物，而核酸聚合酶的5＇→3＇核酸酶活性同时将标记的片断从退火的含有被标记的寡聚核苷酸及其互补模板核酸序列的双链中释放出来，这样形成了可检测的被标记的片断；以及(d)检验和/或检测被标记的片断的释放，以确定样品中是否出现目标序列。这里将Gelfand等人的美国专利No.5,210,015和Holland等人的PNAS 88：7276-7280(1991)作为参考加以引入。
进一步，Fisher等人的美国专利No.5,491,063提供了TaqMan型检测。Fisher等人的方法提供了一种反应，其导致被发射光标记所标记的单链寡聚核苷酸探针的剪切，其中该反应是在存在结合DNA的、对标记有影响以改变标记的发射光的化合物下进行的。该方法利用被标记探针的发射光变化，其来自于探针的降解。该方法通常可以应用于利用导致寡聚核苷酸探针剪切的反应的检测，特别的，可以应用于同源扩增/检验的检测，其中杂交的探针随着引物的延伸而被剪切。提供了同源扩增/检验的检测，其可以同时进行扩增目标累积的检验和目标序列的序列特异性检测。在此引入Fisher等人的美国专利No.5,491,063作为参考。
TaqMan检验的检测为经典的PCR检测提供了多种优点。首先，TaqMan检测将PCR的灵敏性以及存在于目标序列中的内部寡聚核苷酸序列的杂交结合在一起。PCR后，不需要必须在琼脂糖凝胶上分离样品，并且取消了用来确定PCR产物同一性所必须的后续Southern印迹和杂交步骤。为了进行精确的确定，这些附加的PCR后确认步骤可能容易地增加多天时间。使用TaqMan系统，在2.5小时内完成该检测。进一步，检测过程中所采用的方法使有效地处理大量样品而没有交叉污染成为可能，因此其适合遥控取样。其结果是，使用TaqMan检验可以在非常短的时间内处理大量的检测样品。TaqMan系统的另一个优点是用于多元化的潜力。由于可以使用不同的荧光报告子染色剂来构建探针，因此在相同的PCR反应中可以结合几种不同的HIV系统，这样降低了在单独进行每个检验的情况下会发生的劳力成本。快速和最终数据的优点结合劳力和成本效率使得使用本发明特异性引物的TaqMan检测系统成为用于监测存在HIV的非常有利的系统。
也可以采用其它的实时PCR模式。一种模式采用插入染料例如SYBR绿。该染料在结合双链DNA上提供强荧光信号；该信号可以对所扩增的DNA进行定量。尽管该模式不能够对扩增进行序列特异性检测，但是它能够对所扩增DNA进行直接定量，而不需要任何被标记的探针(参见例如Ponchel等人(2003)Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence：An alternative to theTaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements，geneamplifications and micro gene deletions.BMC Biotechnology 3：18)。可以采用的其它这类荧光染料是SYBR Gold、YO-PRO染料和Yo Yo染料。
另一种可以采用的实时PCR模式使用报告探针，其杂交到扩增子上以产生荧光信号。该杂交事件将探针上的报告部分和淬灭部分分离，或者将它们拉得更近。这些探针本身并不被降解，并且报告子荧光信号自身在反应中并不累积。通过当探针杂交到扩增子时报告子荧光信号的提高，监测在PCR过程中产物的累积。该类的模式包括分子信标(Sanjay，T and Russell，K(1996)Molecular Beacons：Probes that Fluoresce upon Hybridization.Nature Biotech.Vol.14，March，pp303-308)、双-Hyde探针(Cardullo等人(1988)Detection ofnucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer.PNAS USA 85：8790-8794)、Sunrise或Amplifluor(Nazarenko等人(1997)Aclosed tube format for amplification and detection of DNA based on energytransfer.Nucleic Acid Res.25：2516-2521)以及Scorpion(Whitcombe等人(1999)Detection of PCR products using self quenching probing amplicons andfluorescence.Nature Biotech.17：804-807)实时PCR检测。
另一种可以采用的实时PCR模式是所谓的“警察”系统。在该系统中，引物包括荧光部分(例如FAM)，以及能够淬灭荧光部分的荧光的淬灭子部分(例如TAMRA，其共价结合到引物3’末端的至少一个核苷酸碱基上)。在3’末端，该引物具有至少一个错配碱基，因此在所述错配碱基处不能够与核酸样品互补。通过使用具有3＇→5＇核酸外切酶活性的聚合酶(例如Pfu酶)的PCR对模板核酸序列进行扩增以产生PCR产物。通过3＇→5＇核酸外切酶活性将结合到淬灭子部分上的错配碱基从PCR产物的3’末端剪切掉。在PCR过程中的至少一个时间点，对当错配的碱基与共价结合的淬灭子部分被聚合酶剪切掉，进而去除了其对荧光部分的淬灭作用下，对所得到的荧光进行检验和/或定量。在背景上的荧光表明合成的核酸样品的存在。在美国专利申请No.10/309,691中对这种PCR模式进行了详细描述，这里将引入以作为参考。
在优选的实施方式中，通过简单地改变每个目标的引物和探针，可以对各种mRNA进行定量。因为肝素含有胞外Ca++，而这这对于最大的生物活性是重要的因子，因此在全血中可以分析药物作用，而不需要分离白细胞。
在本发明优选的实施方式中，通过使用已知量掺标RNA确定给定样品的总效率的能力来自于不依赖剂量和不依赖序列的实施方式。使用已知量的对照RNA可以使PCR检测能够转化成原始样品中目标mRNA的量。
另一个优选的实施方式包括一种高通量定量全血中mRNA的试剂盒。该试剂盒包括：用于高通量定量全血中mRNA的设备；含肝素的血收集管；低渗缓冲液；和裂解缓冲液。
另一个优选的实施方式包括一种用于进行高通量定量全血中mRNA的全自动系统，其包括：向设备加入血样、低渗缓冲液和裂解缓冲液的遥控设备；自动真空吸引仪和离心机，以及自动PCR仪。
这里所公开的检测癌症易感性的方法还可以采用其它不同于这里所描述的检测mRNA的方法。其它可以采用的方法包括例如：Northern印迹分析、RNA酶保护、溶液杂交方法、半定量RT-PCR以及原位杂交。
而且，也可以采用除了来自全血的细胞外的细胞。例如，也可以采用来自其它组织的细胞悬浮液(例如成纤维细胞)。
检测癌症易感性
本发明检测个体全血中生长抑制标记物的水平。在优选的实施方式中，所检测的标记物水平是mRNA水平。然而，也可以用本领域技术人员所已知的其它方法对标记物的水平进行检测，例如通过确定个体细胞中所存在的标记物蛋白质的水平。在本申请中所使用的“个体”可以是任何物种的动物，其包括人类。而且，在本申请中所使用的“生长抑制”mRNA包括使细胞增殖停止的抑制细胞生长的mRNA，以及杀死细胞的杀细胞mRNA。在下面的实施例中，在诱变刺激后生长抑制mRNA水平较大的提高预示较低的癌症风险，而降低则预示较高的癌症风险。然而，其它标记物也可以表现出相反的特征：诱变刺激后mRNA水平较大的降低预示较低的癌症风险，而提高则预示较高的癌症风险。
使用本发明的方法，个体对癌症易感性的检测与抑制细胞生长的标记物mRNA的提高相关，其中所述提高来自于暴露给诱变刺激物(例如离子射线)。响应刺激，标记物mRNA的提高越大，对能够导致癌症的DNA损伤积累的个体的易感性就越低。然而，如果个体针对诱变刺激表现出很少或者没有标记物mRNA诱导，则可能DNA损伤会在增殖的细胞中累积，这最终将导致癌症的发展。
尽管下面的实施例采用优选的方案检测个体中直接在受到诱变刺激前后的标记物mRNA水平的变化，但是也可以从许多相同物种的个体中得到标记物mRNA水平在未暴露的细胞中的平均基线，并将暴露后个体细胞内标记物mRNA水平与平均基线进行比较以确定标记物mRNA水平的改变。这样的优点是只需要检测一次mRNA水平来确定个体的癌症易感性。优选基于来自至少10个个体的标记物mRNA检测来获得平均基线检测。更优选基于来自至少20个个体的标记物mRNA检测来获得平均基线检测。最优选基于来自至少50个个体的标记物mRNA检测来获得平均基线检测。
在本发明的方法中可以采用很多种诱变刺激物。这样的诱变刺激物可以包括例如物理因子(如热、紫外线或者离子射线(如X-射线或者γ-射线))。所述诱变刺激物也可以是化学试剂，其包括碱基类似物例如：溴尿嘧啶和氨基嘌呤；改变碱基结构和配对特性的试剂例如亚硝酸、亚硝基胍、甲基磺酸乙酯和甲基磺酸甲酯；以及插入试剂例如吖啶橙、二氨基吖啶和溴化乙啶；改变结构的试剂例如NAAAF、补骨脂素和过氧化物；以及抗肿瘤药物例如争光霉素和依托泊苷(VP-16)。还可以预计使用可转位的因子，如反转录病毒。
已经知道了许多抑制细胞生长的标记物例如：p21、p27Kip1和p16/p15INK4。因为熟知p21能够响应DNA损伤来停止细胞增殖，所以在实施例中使用p21作为射线诱导的细胞停止(cell arrest)的抑制细胞生长的标记物。然而，还可以检测本领域技术人员已知的其它抑制细胞生长的标记物mRNA，例如p27Kip1和p16/p15INK4。
类似的，在实施例中，检测了杀细胞标记物BAX和PUMA，已知其具有强前凋亡作用。本发明的发明人确定PUMA是人血中主要的前凋亡mRNA，如美国临时专利申请No.60/653,557所公开的，这里将该专利申请引入作为参考。然而，还可以检测本领域技术人员已知的其它杀细胞标记例如：Bak、Bok、Bcl-XS、Bid、Bad、Bik、Bim和NOXA。
实施例1
在本实施例中所采用的检测mRNA水平的方案如下。该检测程序包括3个主要步骤：1)分离白细胞以及在过滤板上裂解白细胞；2)分离mRNA，反向引物杂交以及在固定寡聚(dT)的微孔板上进行cDNA合成；以及3)实时PCR。简单的说，将过滤板置于收集板上，并使用150μL 5mmol/L Tris(pH 7.4)以润湿过滤膜。在4℃下120×g离心1分钟以过滤板去除溶液之后，在每个孔中使用50μL充分混合的血样，并立即在4℃下120×g离心2分钟，接着使用300μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)对每个孔进行清洗一次，并在4℃下2000×g离心5分钟。接着，将60μL裂解缓冲液贮液(见后)应用到过滤板，接着在37℃下孵育10分钟，其中所述裂解缓冲液贮液补充有1％2-巯基乙醇(BioRad)、0.5mg/mL蛋白酶K(Pierce)、0.1mg/mL鲑鱼精子DNA(5 PrimeEppendorf/Brinkmann)、0.1mg/mL大肠杆菌(E.coli)tRNA(Sigma)、10mmol/L每种特异性反向引物以及107分子/mL的合成RNA34作为内标。接着将过滤板置于固定寡聚(dT)的微孔板(GenePlate，RNAture)上，并在4℃下2000×g离心5分钟。在4℃下存储过夜后，使用100μL清澈的裂解缓冲液对微孔板进行清洗3次，接着在4℃下使用150μL清洗缓冲液(0.5mol/L NaCl，10mmol/LTris(pH 7.4)，1mmol/L EDTA)清洗3次。通过加入30μL含有1×RT-缓冲液(50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，5.5mmol/L MgCl2，不含二硫苏糖醇)、1.25mmol/L每种dNTP、4单位rRNasin以及80单位MMLV反转录酶(Promega)(不含引物)的缓冲液并在37℃下孵育2小时，在每个孔中直接合成cDNA。将所得到的4μL cDNA直接转到384孔PCR板中，向其中加入5μL TaqMan通用主体混合物(Applied Biosystems)以及1μL寡聚核苷酸混合物(正向和反向引物分别为15μmol/L以及3-6μmol/L TaqMan探针)，在PRISM7900HT(Applied Biosystems)中进行PCR，其通过一个循环的95℃10分钟，接着45个循环的95℃30秒，55℃30秒以及60℃1分钟。在单独的孔中扩增每一个基因。使用分析软件(SDS，Applied Biosystems)确定循环极限(Ct)，其为产生一定量PCR产物(荧光)的PCR循环。可以使用iCycler(BioRad)在GenePlate中直接进行PCR。
裂解缓冲液贮液
0.5％月桂酰肌氨酸
4×SSC
10mM Tris HCl，PH7.4
1mM EDTA
0.1％ IGEPAL CA-630
1.791M硫氰酸胍。
在暴露到不同剂量离子射线前后都进行对p21 mRNA的检测。其结果如图1所示。该结果说明当在体外将肝素化的全血暴露到离子射线时，p21mRNA被以依赖于剂量的方式诱导。在暴露到射线之后2个小时，其表达达到最大值。而且，如图2所示，当使用相同的方案检测患有2种独立的恶性癌症和1种独立的良性肿瘤的患者时，p21 mRNA的诱导非常低(空心圆)。
实施例2
使用上述相同的方案对杀细胞标记物BAX的mRNA水平进行检测。BAX被认为是杀细胞标记物，因为在细胞凋亡的早期BAX mRNA被诱导。如图3所示，通过10Gy的射线刺激实施例1中的癌症患者表现出降低的BAXmRNA，而所检测的大部分健康成年人在经过射线刺激后表现出提高的BAXmRNA。
当结合图2和图3，并加入更多的健康成年人的数据(图4)时，癌症患者表现出对p21和BAX的差响应。在图4中，在不同的日期从相同的个体得到了4个数据点(◆)和2个数据点(▲)。健康的成年人表现出差的BAX响应，但这被提高的p21响应所弥补(图4，←)。类似的，表现出差21响应的健康成年人表现出补偿的提高的BAX响应(图4，此，通过抑制细胞生长的标记物基因(p21)和杀细胞标记物基因(BAX)的响应可以鉴定癌症易感性或者癌症风险。
实施例3
使用上述相同的方案对杀细胞标记物PUMA的mRNA水平进行检测。在人血中，已经发现PUMA mRNA具有BAX基因家族中最强的前凋亡作用。使用10Gy射线刺激的癌症患者的血表现出差的PUMA响应，而大部分健康成年人在射线刺激后表现出提高的PUMA mRNA。
检测化合物在个体中预防癌症的作用的方法
感兴趣的是，图4的数值在同一个体中并不固定(◆，▲)，随着时间而变化。这预示可以改变癌症风险(DNA损伤响应)。因此，这项测试可以用于鉴定对于在体内每个个体的防止癌症的方案，或者通过在体外将全血与候选化合物进行孵育。
图5表示了筛选防止癌症的个体化药物的结果。首先，将肝素化全血与各种饮食补充物在37℃下进行孵育1个小时(每种化合物2管)。接着将1管暴露到1Gy离子射线，接着将两管均在37℃下再进行孵育2个小时。通过上述的对p21 mRNA进行定量。如图5所示，不使用任何补充物得到了最左边的数据点组(标记为(-))，并确认了射线诱导的p21诱导，这与图1～3的结果类似。在图5中，每个数据点为使用(●)或者不使用(○)1Gy射线的p21mRNA的平均值±标准偏差。饮食补充物分别是：维生素A(10μM)、维生素C(10μg/mL)、维生素D(100nM)和维生素E(1:1000)、表没食子儿茶素(EGC，绿茶提取物)(10μM)，γ-亚油酸(rLA)(10μg/mL)、染料木黄酮(Gen，大豆提取物)(10μM)、姜黄色素(Cur，香料)(1μM)、槲皮素(Que，植物类黄酮)(100nM)、Agaricus(Aga，蘑菇提取物)(1:100)、蜂胶(Pro，蜂巢提取物)(1:1000)、Shimemakobu(Shi，蘑菇提取物)(少量，30mg/mL)以及烷氧基甘油(Alkoxy，鲨鱼提取物)(1:100)。被圆包围的数据预示p<0.05。
感兴趣的是，某些饮食补充物例如表没食子儿茶素没食子酸酯(绿茶提取物)显著地增强了射线诱导的p21表达，而对照血(没有射线处理)的p21水平未表现出任何改变，γ-亚油酸和姜黄色素(香料)也增强了射线诱导的p21表达，尽管这些化合物业提高了p21的背景水平。背景mRNA表达的提高可以预示某些副作用或者毒性。表现出稍稍提高的背景标记物mRNA表达的化合物可能具有这样的副作用。这里所述的mRNA表达的“少”或者“微弱”的提高优选为小于400％的表达水平的提高，更优选为小于200％的表达水平的提高，更加优选的是小于100％的表达水平的提高，最优选的是小于50％的表达水平的提高。较大的提高被认为是“大幅度(strong)”提高。这些数据预示这些饮食补充物提高了对DNA损伤的响应，这可能预示着防止癌症。
如上所述，也可以在检测生长抑制标记物之前通过将化合物施加给个体来体内筛选这些化合物。所述施加可以以本领域技术人员已知的方式进行，例如口服或者经静脉。适当的剂量根据所施加的化合物而变化，也可以根据本领域抑制的标准剂量方案来确定。
也可以对上面的作为提取物的这些化合物进行进一步检测以鉴定其活性组分。希望这能够增强预防癌症的作用，并可以降低任何副作用或者毒性。
如来自单个个体的图5的结果所示，可以鉴定对于个体增强个体预防癌症发展的适当的化合物。换句话说，可以开发适合个体特制的癌症预防方案。
而且，如果某些化合物在许多其他个体中表现出相似的结果，则这些化合物可以被认为具有通用的预防癌症的作用，并被公众采用以降低癌症风险。
序列表
<110>日立化成工业株式会社日立化成研究中心公司
<120>检测癌症易感性的方法
<130>HITACHI.065VPC
<140>60/574,248
<141>2004-05-25
<160>9
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<400>1
Figure A200580016467D00271
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<400>2
Figure A200580016467D00272
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<400>3
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<400>4
Figure A200580016467D00281
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探针序列
<400>5
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探针序列
<400>6
Figure A200580016467D00283
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<400>7
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸引物序列
<400>8
Figure A200580016467D00285
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡聚核苷酸探针序列
<400>9
Figure A200580016467D00291
1727956
052505
1728863
052505

Claims (60)

1.一种确定个体对癌症易感性的方法，其包括：
在体外将个体的细胞暴露给诱变刺激物；
检测在被暴露和未暴露的个体细胞中生长抑制标记物的水平；以及
基于被暴露和未暴露的细胞中标记物水平的差别确定个体对癌症的易感性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞来自个体的全血。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所检测的水平是mRNA水平。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体是人。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生长抑制标记物是抑制细胞生长的标记物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抑制细胞生长的标记物是p21。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述生长抑制标记物是杀细胞标记物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述杀细胞标记物是BAX。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述杀细胞标记物是PUMA。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述诱变刺激物是离子射线。
11.根据权利要求1所述的方法，其中如果在暴露后，生长抑制标记物的水平大幅度提高，则对癌症的易感性被确定为降低。
12.根据权利要求1所述的方法，其中如果在被暴露后，生长抑制标记物的水平不提高或者微弱提高，则对癌症的易感性被确定为提高。
13.根据权利要求1所述的方法，其中检测多种生长抑制标记物的水平。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述多种生长抑制标记物包括至少一种抑制细胞生长的标记物和一种杀细胞标记物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述抑制细胞生长的标记物是p21，所述杀细胞标记物是PUMA。
16.一种确定个体对癌症易感性的方法，其包括：
在体外将细胞暴露给诱变刺激物之后，从多个个体物种成员获得细胞中生长抑制标记物的基线平均检测水平；
在体外将个体的细胞暴露给诱变刺激物；
在暴露之后，检测细胞中生长抑制标记物的水平；以及
确定个体对癌症的易感性，其中比基线平均检测高的水平预示较低的癌症风险，比基线平均检测低的水平预示较高的癌症风险。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞来自个体的全血。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所检测的水平是mRNA水平。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述个体是人。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述生长抑制标记物是抑制细胞生长的标记物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述抑制细胞生长的标记物是p21。
22.根据权利要求16所述的方法，其中所述生长抑制标记物是杀细胞标记物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述杀细胞标记物是BAX。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述杀细胞标记物是PUMA。
25.根据权利要求16所述的方法，其中所述诱变刺激物是离子射线。
26.根据权利要求16所述的方法，其中检测多种生长抑制标记物的水平。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述多种生长抑制标记物包括至少一种抑制细胞生长的标记物和一种杀细胞标记物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抑制细胞生长的标记物是p21，所述杀细胞标记物是PUMA。
29.一种对个体有癌症预防作用的化合物的筛选方法，其包括：
将个体的细胞与所述化合物进行孵育；
在体外，将个体的经过孵育的细胞和未孵育细胞暴露给诱变刺激物；
检测在个体的被暴露的细胞，以及在未孵育、未暴露的细胞中生长抑制标记物的水平；以及
基于在暴露后，经过孵育的细胞和未孵育细胞中生长抑制标记物水平的差别，鉴定具有预防癌症作用的化合物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中检测未暴露给诱变刺激物的经过孵育的细胞中生长抑制标记物的水平。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述细胞来自个体的全血。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所检测的水平是mRNA水平。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述个体是人。
34.根据权利要求29所述的方法，其中所述生长抑制标记物是抑制细胞生长的标记物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述抑制细胞生长的标记物是p21。
36.根据权利要求29所述的方法，其中所述生长抑制标记物是杀细胞标记物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述杀细胞标记物是BAX。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述杀细胞标记物是PUMA。
39.根据权利要求29所述的方法，其中所述诱变刺激物是离子射线。
40.根据权利要求29所述的方法，其中检测多种生长抑制标记物的水平。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述多种生长抑制标记物包括至少一种抑制细胞生长的标记物和一种杀细胞标记物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述抑制细胞生长的标记物是p21，所述杀细胞标记物是PUMA。
43.根据权利要求29所述的方法，其中在经过孵育的细胞中比在未孵育细胞中表现出较大提高的暴露后生长抑制标记物水平的化合物，被鉴定为具有预防癌症的作用。
44.根据权利要求30所述的方法，其中在经过孵育未暴露的细胞中相对于未孵育未暴露的细胞中表现出没有或者较少提高的生长抑制标记物水平的化合物，以及在经过孵育的细胞中比在未孵育的细胞中表现出较大提高的暴露后生长抑制标记物的水平的化合物，被鉴定为具有预防癌症的作用并且具有较少的副作用风险。
45.一种对个体癌症预防有效的化合物的确定方法，其包括：
将细胞从个体中取出；
为个体施加至少一种化合物；
在施加该化合物之后从个体中取出细胞；
在体外，将施加化合物前后所取出的细胞暴露给诱变刺激物；
检测在被暴露的细胞以及施加化合物之前取出的未暴露的细胞中生长抑制标记物的水平；以及
基于在施加化合物前后的细胞中，暴露后生长抑制标记物水平的差别确定所述化合物的预防癌症的作用。
46.根据权利要求45所述的方法，其中检测在施加化合物之后取出的、未暴露给诱变刺激物的细胞中生长抑制标记物的水平。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述细胞来自个体的全血。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所检测的水平是mRNA水平。
49.根据权利要求45所述的方法，其中所述个体是人。
50.根据权利要求45所述的方法，其中所述生长抑制标记物是抑制细胞生长的标记物。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述抑制细胞生长的标记物是p21。
52.根据权利要求45所述的方法，其中所述生长抑制标记物是杀细胞标记物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述杀细胞标记物是BAX。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述杀细胞标记物是PUMA。
55.根据权利要求45所述的方法，其中所述诱变刺激物是离子射线。
56.根据权利要求45所述的方法，其中检测多种生长抑制标记物的水平。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述多种生长抑制标记物包括至少一种抑制细胞生长的标记物和一种杀细胞标记物。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述抑制细胞生长的标记物是p21，所述杀细胞标记物是PUMA。
59.根据权利要求45所述的方法，其中在施加化合物之后取出的细胞中比在施加化合物之前取出的细胞中表现出较大提高的暴露后的生长抑制标记物水平的化合物，被鉴定为具有预防癌症的作用。
60.根据权利要求46所述的方法，其中在施加化合物之后未暴露的细胞中相对于在施加化合物之前未暴露的细胞中表现出没有或较少提高的生长抑制标记物水平的化合物，以及在施加化合物之后取出的细胞中比施加化合物之前取出的细胞中表现出较大提高的暴露后的生长抑制标记物的水平的化合物，被鉴定为具有预防癌症的作用，并具有较少的副作用风险。
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