ES2394047T3 - Escisión invasiva de ácidos nucleicos - Google Patents

Abstract

Un conjunto de reactivos para detectar una molécula de ácido nucleico diana que comprende:a) un oligonucleótido sonda, en el que al menos una parte de dicho oligonucleótido sonda escomplementario a dicho ácido nucleico diana; yb) una endonucleasa -1 Flap (FEN-1) termoestable purificada.

Description

Escisión invasiva de ácidos nucleicos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para la detección y la caracterización de secuencias de ácidos

5 nucleicos y de variaciones en las secuencias de ácidos nucleicos. La presente invención se refiere a procedimientos para formar una estructura de escisión de ácidos nucleicos sobre una secuencia diana y escindir la estructura de escisión de ácidos nucleicos en un modo de sitio específico. Se usa la actividad nucleasa 5’ de una variedad de enzimas para escindir la estructura de escisión dependiente de la diana, indicando así la presencia de secuencias de ácidos nucleicos específicas o variaciones específicas de las mismas. La presente invención proporciona además

10 nuevos procedimientos y dispositivos para la separación de moléculas de ácido nucleico basados en la carga. La presente invención proporciona además procedimientos para la detección de productos de escisión no diana mediante la formación de una región activada y completa de unión proteínica.

Antecedentes de la invención

La detección y la caracterización de secuencias de ácidos nucleicos específicas y de variaciones de secuencias se

15 han utilizado para detectar la presencia de secuencias de ácidos nucleicos víricos o bacterianos indicadores de una infección, la presencia de variantes o alelos de genes de mamíferos asociados con enfermedades y cánceres, y la identificación del origen de los ácidos nucleicos encontrados en muestras forenses, así como en determinaciones de paternidad.

Hay diversos procedimientos conocidos en la técnica que se pueden usar para detectar y caracterizar secuencias de

20 ácidos nucleicos específicas y variantes de secuencias específicas. No obstante, a medida que se van acumulando los datos de las secuencias de ácidos nucleicos del genoma humano, así como los genomas de organismos patógenos, continúa el crecimiento de la demanda de análisis rápidos, fiables, rentables y fáciles de usar para la detección de secuencias de ácidos nucleicos específicas. Lo más importante es que estos análisis deben ser capaces de crear una señal detectable procedente de muestras que contengan muy pocas copias de la secuencia

25 de interés. La siguiente descripción examina dos niveles de análisis de detección de ácidos nucleicos que se encuentran actualmente en uso: I. Tecnología de amplificación de señales para la detección de secuencias raras y II. Tecnología de detección directa para la detección cuantitativa de secuencias.

I. Procedimientos de tecnología de amplificación de señales para amplificación

La “reacción en cadena de la polimerasa” (PCR) comprende la primera generación de procedimientos para la

30 amplificación de ácidos nucleicos. Sin embargo, se han desarrollado otros diversos procedimientos que emplean las mismas bases de especificidad, pero creando la señal mediante diferentes mecanismos de amplificación. Estos procedimientos incluyen la “reacción en cadena de la ligasa” (LCR), “la reacción sintética auto–sostenida” (3SR/NASBA) y “la replicasa Q�” (Q�).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

35 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), según lo descrito en las patentes estadounidenses n.º: 4.683.195 y

4.683.202 concedidas a Mullis y Mullis et al., (cuyas revelaciones están incorporadas en la presente memoria por referencia), describe un procedimiento para aumentar la concentración de un segmento de secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin realizar una clonación ni una purificación. Esta tecnología proporciona un enfoque dirigido a los problemas sobre la baja concentración de secuencia diana. La PCR se puede usar para aumentar la 40 concentración de la diana hasta un nivel fácilmente detectable. Este procedimiento para amplificar la secuencia diana implica introducir un exceso molar de dos cebadores de oligonucleótido que sean complementarios a sus respectivas cadenas de la secuencia diana bicatenaria en la mezcla de ADN que contenga la secuencia diana deseada. Se desnaturaliza la mezcla y luego se permite la hibridación. Tras la hibridación, se amplían los cebadores con polimerasa para formar cadenas complementarias. Las etapas de desnaturalización, hibridación y ampliación

45 con polimerasa se pueden repetir de la manera habitual, según lo necesario, para obtener concentraciones relativamente elevadas de un segmento de la secuencia diana deseada.

La longitud del segmento de la secuencia diana deseada está determinada por las posiciones relativas de los cebadores entre sí, y por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. Como los segmentos deseados de la secuencia diana se vuelven secuencias dominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que están

50 “amplificados por PCR”.

Reacción en cadena de la ligasa (LCR o LAR)

La reacción en cadena de la ligasa (LCR; a veces denominada “reacción de amplificación de la ligasa” (LAR) descrita por Barany, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:189 (1991); Barany, “PCR Methods and Applic.” 1: 5 (1991); y Wu y Wallace, Genomics 4:560 (1989), ha evolucionado a un procedimiento alternativo muy reconocido para la 55 amplificación de ácidos nucleicos. En la LCR, cuatro oligonucleótidos, dos oligonucleótidos adyacentes que se hibridan de manera exclusiva con una cadena de ADN diana, y un conjunto complementario de oligonucleótidos adyacentes, que se hibrida con la cadena opuesta, se mezclan y se añade ADN ligasa a la mezcla. Siempre y cuando haya una complementariedad total en la unión, la ligasa se unirá mediante enlace covalente con cada conjunto de moléculas hibridadas. Lo importante es que, en la LCR, sólo se unen dos sondas cuando forman pares 5 de bases con secuencias en la muestra diana, sin huecos ni apareamientos erróneos. Los ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación y unión amplifican un segmento corto de ADN. La LCR también se ha usado en combinación con la PCR para mejorar la detección de cambios de una sola base. Segev, Public. PCT n.º W09001069 A1 (1990). Sin embargo, como los cuatro oligonucleótidos usados en este análisis se pueden aparear para formar dos fragmentos unibles cortos, existe la posibilidad de generar una señal de fondo independiente de la

10 diana. El uso de la LCR para la detección de mutantes se limita al examen de posiciones específicas de ácidos nucleicos.

Reacción sintética auto–sostenida (3SR/NASBA)

La reacción de replicación de secuencias auto–sostenida (3SR) (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:1874–1878 [1990], con una errata en Proc. Natl. Acad. Sci., 87:7797 [1990]) es un sistema de amplificación in vitro basado en la 15 transcripción (Kwok et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:1 173–1177 [1989]) que puede amplificar exponencialmente secuencias de ARN a una temperatura uniforme. El ARN amplificado se puede utilizar luego para la detección de mutaciones (Fahy et al., PCR Meth. Appl., 1:25–33 [1991]). En este procedimiento, se usa un cebador de oligonucleótido para añadir un promotor de ARN polimerasa de fago al extremo 5’ de la secuencia de interés. En una mezcla de enzimas y sustratos que incluye un segundo cebador, transcriptasa inversa, RNasa H, ARN polimerasa, y 20 trifosfatos de ribo– y desoxirribonucleósido, la secuencia diana se somete a repetidas series de transcripción, síntesis de ADNc y síntesis de segundas cadenas para amplificar la zona de interés. El uso de 3SR para detectar mutaciones está limitado cinéticamente para rastrear pequeños segmentos de ADN (p.ej., 200–300 pares de bases).

Replicasa Q–beta (QI)

En este procedimiento, se une una sonda que reconoce la secuencia de interés al molde de ARN replicativo para la

25 replicasa Q . Se ha abordado un problema importante identificado anteriormente con los falsos positivos resultantes de la replicación de sondas sin hibridar a través del uso de una etapa de unión de secuencia específica. Sin embargo, las ADN ligasas termoestables disponibles no son eficaces sobre este sustrato de ARN, por lo que la unión debe realizarse mediante ADN ligasa de T4 a temperaturas bajas (37°C). Esto evita el uso de temper atura elevada como un procedimiento para alcanzar la especificidad como en la LCR, pudiéndose usar el evento de unión

30 para detectar una mutación en el punto de unión, pero en ningún otro sitio.

En la tabla 1 que se presenta a continuación figuran algunas de las características deseables para los sistemas útiles en los diagnósticos de ácidos nucleicos sensibles y resume las capacidades de cada uno de los principales procedimientos de amplificación (véase, también, Landgren, “Trends in Genetics” 9: 199 [1993]).

Un procedimiento de diagnóstico satisfactorio debe ser muy específico. Un procedimiento sencillo para controlar la

35 especificidad de la hibridación de ácidos nucleicos consiste en controlar la temperatura de la reacción. Mientras que el 3SR/NASBA y los sistemas de Q son todos capaces de generar una gran cantidad de señal, una o más de las enzimas implicadas en cada uno no se pueden usar a una temperatura elevada (i.e., >55°C). Por lo tanto , las temperaturas de reacción no pueden ser elevadas para evitar la hibridación inespecífica de las sondas. Si se acortan las sondas para que se fundan más fácilmente a temperaturas bajas, aumenta la probabilidad de tener más de un

40 apareamiento perfecto en un genoma complejo. Por estas razones, la PCR y la LCR dominan actualmente el campo de la investigación en las tecnologías de detección.

TABLA 1

Característica

Procedimiento

PCR

LCR PCR y LCR 3SR NASBA QI

Amplifica la diana

+ + + +

Necesario el reconocimiento de secuencias independientes

+ + + + +

Se realiza a temp. alta

+ +

Funciona a una temp. fija

+ +

Amplificación exponencial

+ + - - +

Generación de señales genéricas

+

Fácilmente automatizable

La base del procedimiento de amplificación en la PCR y la LCR es el hecho de que los productos de un ciclo se vuelven moldes usables en todos los ciclos posteriores, doblando por consiguiente la población con cada ciclo. La producción final de cualquiera de tales sistemas de doblaje se puede expresar como: (1 + X)n = y, en la que “X” es la eficacia media (porcentaje copiado en cada ciclo), “n” es el número de ciclos e “y” es la eficacia total o el rendimiento

5 de la reacción (Mullis. PCR Methods Applic. 1:1 [1991]). Si cada copia de un ADN diana se utiliza como molde en cada ciclo de una reacción en cadena de la polimerasa, la eficacia media es del 100%. Si se realizan 20 ciclos de la PCR, entonces la producción será de 220 o 1.048,576 copias del material inicial. Si las condiciones de reacción reducen la eficacia media hasta el 85%, entonces la producción en aquellos 20 ciclos sólo será de 1,8520 ó 220.513 copias del material inicial. En otras palabras, una PCR ejecutada a una eficacia del 85% sólo producirá el 21% como mucho de producto final en comparación con una reacción ejecutada a una eficacia del 100%. Una reacción que se reduce hasta una eficacia media del 50% producirá menos del 1% del posible producto.

En la práctica, las reacciones en cadena de la polimerasa rutinarias raramente alcanzan la producción máxima teórica, y las PCR se ejecutan habitualmente durante más de 20 ciclos para compensar la producción inferior. A una eficacia media del 50%, se requerirían 34 ciclos para alcanzar la amplificación multiplicada por un millón

15 teóricamente posible en 20, y a eficacias inferiores, el número de ciclos requerido llega a ser prohibitivo. Además, cualquier producto de fondo que se amplifique con una mejor eficacia media que la diana deseada pasará a ser el producto dominante.

Es más, muchas variables pueden influir en la eficacia media de una PCR, incluyendo la longitud del ADN diana y la estructura secundaria, la longitud y el diseño del cebador, las concentraciones de cebador y dNTP, y la composición del tampón, por sólo nombrar alguna. La contaminación de la reacción con ADN exógeno (p. ej., ADN derramado sobre superficies de laboratorio) o la contaminación cruzada también son cuestiones trascendentales. Las condiciones de reacción deben ser optimizadas detenidamente para cada par de cebador diferente y secuencia diana, y el procedimiento puede llevar días, incluso para un investigador con experiencia. Lo laborioso de este procedimiento, incluyendo numerosas consideraciones técnicas y otros factores, presenta una desventaja

25 significativa al uso de la PCR en el marco clínico. De hecho, la PCR todavía tiene que penetrar en el mercado clínico de un modo significativo. Los mismos problemas surgen con la LCR, pues la LCR también se debe optimizar para usar diferentes secuencias de oligonucleótidos para cada secuencia diana. Además, ambos procedimientos requieren un equipamiento costoso, que sea capaz de llevar a cabo ciclos de temperatura exacta.

Muchas aplicaciones de las tecnologías de detección de ácidos nucleicos, tales como en estudios de variación alélica, no sólo implican la detección de una secuencia específica en un fondo complejo, sino además la discriminación entre secuencias con pocas o una única diferencia entre los nucleótidos. Un procedimiento para la detección de variantes de alelo específico mediante PCR se basa en la dificultad para la Taq polimerasa en sintetizar una cadena de ADN cuando hay un apareamiento erróneo entre la cadena de molde y el extremo 3' del cebador. Es posible detectar una variante de alelo específico mediante el uso de un cebador que esté apareado

35 perfectamente sólo con uno de los posibles alelos; actuando el apareamiento erróneo del otro alelo en la prevención de la prolongación del cebador, evitando así la amplificación de esa secuencia. Este procedimiento tiene una limitación sustancial en tanto en cuanto la composición de las bases del apareamiento erróneo influye en la capacidad de evitar la prolongación a través del apareamiento erróneo y que ciertos apareamientos erróneos no evitan la prolongación o sólo tienen un efecto mínimo (Kwok et al., Nucl. Acids Res., 18:999 [1990]).

Se usa una estrategia de apareamientos erróneos en 3’ similar con un mayor efecto en la prevención de la unión en la LCR (Barany. PCR Meth. Applic. 1: 5 [1991]). Cualquier apareamiento erróneo bloquea eficazmente la acción de la ligasa termoestable, pero la LCR sigue presentando la desventaja de los productos de unión de fondo independientes de la diana que inician la amplificación. Además, la combinación de la PCR con la posterior LCR para identificar los nucleótidos en posiciones individuales también es una propuesta claramente incómoda de

45 realizar para el laboratorio clínico.

II. Tecnología de detección directa

Cuando hay disponible una cantidad suficiente de un ácido nucleico por ser detectado, existen ventajas para detectar la secuencia directamente en lugar de hacer más copias de la diana, (p.ej., como en la PCR y la LCR). Lo más notable es que un procedimiento que no amplifique la señal exponencialmente es más susceptible a un análisis cuantitativo. Incluso si la señal se aumenta uniendo múltiples colorantes a un solo oligonucleótido, la correlación entre la intensidad de la señal final y la cantidad de diana es directa. Tal sistema tiene la ventaja adicional de que los productos de la reacción no promoverán por sí mismos más reacción, por lo que la contaminación de las superficies de laboratorio por los productos no supone un gran problema. Los procedimientos tradicionales de detección directa incluyendo la transferencia Northern y Southern, y los análisis de protección de Rnasa requieren habitualmente el

55 uso de radiactividad y no son susceptibles a una automatización. Las técnicas recientemente diseñadas han buscado eliminar el uso de la radiactividad y/o mejorar la sensibilidad en formatos automatizables. Dos ejemplos son la “reacción con sondas de ciclos” (CPR) y “el ADN ramificado” (ADNr).

La reacción con sondas de ciclos (CPR) (Duck el al., BioTech., 9: 142 [1990]) usa un largo oligonucleótido quimérico en el que hay una parte central hecha de ARN mientras que los dos terminales están hechos de ADN. La hibridación de la sonda con un ADN diana y la exposición a una RNasa H termoestable hace que la parte de ARN sea digerida.

Esto desestabiliza el resto de partes de ADN del dúplex, liberando el resto de la sonda del ADN diana y permitiendo que otra molécula de sonda repita el procedimiento. La señal, en forma de moléculas de sonda escindidas, se acumula a una velocidad lineal. Mientras que el procedimiento de repetición aumenta la señal, la parte de ARN del oligonucleótido es vulnerable a las RNasas que pueden ser transportadas a través de la preparación de la muestra.

5 El ADN ramificado (ADNr) descrito por Urdea et al., Gene 61: 253–264 (1987), implica oligonucleótidos con estructuras ramificadas que permiten que cada oligonucleótido individual transporte de 35 a 40 marcadores (p.ej., enzimas de fosfatasa alcalina). Aunque esto aumenta la señal desde un evento de hibridación, la señal procedente de una unión inespecífica se ve aumentada de manera similar.

Mientras que ambos de estos procedimientos tienen las ventajas de la detección directa descrita anteriormente, ni

10 los procedimientos de CPR ni el ADNr puede hacer uso de la especificidad permitida por la necesidad del reconocimiento independiente por dos o más secuencias de sondas (oligonucleótido), como es común en los procedimientos de amplificación de señales descritos en la sección I. anterior. El requisito de que dos oligonucleótidos se deben hibridar con un ácido nucleico diana para que se genere una señal detectable confiere otra medida más de las condiciones restrictivas de cualquier análisis de detección. La necesidad de que dos

15 oligonucleótidos se unan a un ácido nucleico diana reduce la posibilidad de que se produzcan resultados de falso “positivo” debido a la unión inespecífica de una sonda con la diana. El otro requisito de que dos oligonucleótidos se deben unir en un sentido específico en relación con la dianas, como es necesario en la PCR, donde los oligonucleótidos deben estar orientados opuestamente pero apropiadamente tal que la ADN polimerasa pueda cubrir el hueco entre los dos oligonucleótidos en ambos sentidos, aumenta aún más la especificidad de la reacción de

20 detección. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica saben que aunque la PCR utiliza dos oligonucleótidos sonda (denominadas cebadores) la amplificación “inespecífica” (i.e., la amplificación de secuencias no dirigida por los dos cebadores usados) es un algo común. Esto es, en parte, porque la ADN polimerasa usada en la PCR puede contener distancias muy largas, medidas en nucleótidos, entre los oligonucleótidos, habiendo así una gran ventana en la que la unión inespecífica de un oligonucleótido puede conducir a la amplificación exponencial del producto

25 inapropiado. La LCR, por el contrario, no puede continuar a no ser que los oligonucleótidos usados se unan a la diana adyacente a cada uno, consiguiéndose así el beneficio completo de la hibridación dual de oligonucleótidos.

Un procedimiento de detección directa ideal combinaría las ventajas de los análisis de detección directa (p. ej., una fácil cuantificación y un riesgo mínimo de contaminación remanente) con la especificidad proporcionada por un análisis de hibridación dual de oligonucleótidos.

30 Las nucleasas se conocen de la técnica anterior, véanse por ejemplo los documentos WO-A-94/29482, Lyamichev et al., 1993, SCIENCE, vol. 260, páginas 778-783, Harrington et al., 1995, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 270, nº. 9, páginas 4503-4508, y Harrington et al., 1994, EMBO JOURNAL, vol. 13, nº. 5, páginas 1235-1246. Borges et al. GenBank entrada que tiene nº de acceso W36094 desvela un fragmento de un gen de nucleasa supuesto de un organismo antiguo que no es una proteína purificada y no tiene suficiente similitud de secuencias

35 con o bien la enzima eubacteriana o los genes FEN-1 de mamífero proporcionando la guía útil en la secuencia de longitud completa de la nucleasa supuesta, o cómo purificarla y expresarla, en las condiciones en las que pudiera ser funcional, sobre la actividad de escisión que pudiera tener, o sobre su termoestabilidad. Las endonucleasas de los documentos WO-A-94/29482 y Lyamichev et al., 1993, SCIENCE, vol. 260, páginas 778-783 no son endonucleasas FEN-1 y las endonucleasas FEN-1 desveladas por Harrington et al., 1995, JOURNAL OF

40 BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 270, no. 9, páginas 4503-4508 y Harrington et al., 1994, EMBO JOURNAL, vol. 13, no. 5, páginas 1235-1246 no son termostables. Dichas referencias son completamente silenciosas en la endonucleasa FEN-1 termoestable según se reivindica en la reivindicación 1.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a medios para escindir una estructura de

45 escisión de ácidos nucleicos de un modo de sitio específico. En una realización preferida, el medio para la escisión es una nucleasa de estructura específica. Las nucleasas de estructura específica particularmente preferidas son nucleasas de estructura específica termoestables. En una realización, la nucleasa de estructura específica es una enzima que comprende nucleasas 5’ derivadas de ADN polimerasas termoestables. Estas polimerasas forman la base de un nuevo procedimiento de detección de secuencias de ácidos nucleicos específicas. La presente invención

50 contempla el uso de nuevos procedimientos de detección para diversos usos, incluyendo, pero no limitándose a, objetivos de diagnóstico clínico.

En una realización, la presente invención contempla una secuencia de ADN codificante de una ADN polimerasa modificada en secuencia (i.e., una ADN polimerasa “mutante”) en relación con la secuencia nativa, tal que presente una actividad de síntesis de ADN modificada con respecto a la ADN polimerasa nativa (i.e., “de tipo natural”). Es

55 preferible que la ADN polimerasa codificada esté modificada tal que presente una actividad de síntesis reducida en comparación con la de la ADN polimerasa nativa. De esta manera, las enzimas de la invención son predominantemente nucleasas 5’ y son capaces de escindir ácidos nucleicos de una manera de estructura específica en ausencia de interferir en la actividad de síntesis.

Lo que es más importante, las nucleasas 5’ de la presente invención son capaces de escindir estructuras dúplex lineales para crear productos de escisión diferenciados simples. Estas estructuras lineales bien 1) no son escindidas por enzimas de tipo natural (hasta cualquier grado significativo) o 2) son escindidas por las enzimas de tipo natural para crear múltiples productos. Se ha descubierto que esta característica de las nucleasas 5’ es una propiedad constante de las enzimas derivadas de esta manera de las polimerasas termoestables en todas las especies

5 termófilas eubacterianas.

No se pretende que la invención quede limitada por la naturaleza de la modificación necesaria para volver a la polimerasa sintéticamente deficiente. Tampoco se pretende que la invención esté limitada por el grado de deficiencia. La presente invención contempla diversas estructuras, incluyendo las estructuras modificadas (primarias, secundarias, etc.), así como estructuras nativas, que pueden ser inhibidas por inhibidores de la síntesis.

10 Cuando se modifica la estructura de la polimerasa, no se pretende que la invención esté limitada por los procedimientos mediante lo cuales se modifica la estructura. En una realización, la modificación de la secuencia de ADN nativa comprende un cambio en un solo nucleótido. En otra realización, la modificación de la secuencia de ADN nativa comprende una eliminación de uno o más nucleótidos. En otra realización más, la modificación de la secuencia de ADN nativa comprende una inserción de uno o más nucleótidos. Se contempla que el cambio en la

15 secuencia de ADN pueda manifestarse como un cambio en la secuencia de aminoácidos.

La presente invención contempla nucleasas de estructura específica de una variedad de orígenes, incluyendo organismos mesófilos, psicrófilos, termófilos e hipertermófilos. Las nucleasas de estructura específica preferidas son termoestables. Las nucleasas de estructura específica termoestables se contemplan como particularmente útiles en tanto en cuanto funcionan a temperaturas en las que la hibridación de los ácidos nucleicos es extremadamente 20 específica, permitiendo la detección de alelo específico (incluyendo apareamientos erróneos de una sola base). En una realización, las nucleasas de estructura específica termoestables son nucleasas 5' termoestables que se seleccionan del grupo constituido por polimerasas modificadas derivadas de polimerasas nativas de la especie Thermus, incluyendo, pero no limitándose a Thermus aquaticus, Thermus flavus y Thermus thermophilus. Sin embargo, la invención no se limita al uso de nucleasas 5' termoestables. Las nucleasas de estructura específica

25 termoestables de la clase de nucleasas FEN–1, RAD2 y XPG también son preferidas.

Por consiguiente, la presente invención proporciona mejores procedimientos de escisión enzimática. En una realización, la presente invención proporciona una nucleasa de estructura específica termoestable que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 61, 66, 69 y 72. En otra realización, la nucleasas está codificada por una secuencia de ADN seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 60, 65, 68 y

30 70.

La presente invención también proporciona un vector de ADN recombinante que comprende ADN que tiene una secuencia de nucleótidos codificante de una nucleasa de estructura específica, estando la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 60, 65, 68 y 70. En una realización preferida, la invención proporciona una célula huésped transformada con un vector de ADN recombinante que comprende ADN que tiene 35 una secuencia de nucleótidos codificante de una nucleasa de estructura específica, estando la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 60, 65, 68 y 70. La invención no está limitada por la naturaleza de la célula huésped empleada. La técnica conoce bien los vectores de expresión adecuados para la expresión de secuencias de nucleótidos codificantes de nucleasas de estructura específica que puedan ser expresadas en una variedad de células huésped procariotas y eucariotas. En una realización preferida, la célula

40 huésped es una célula de Escherichia coli.

La presente invención proporciona una endonucleasa FEN–1 de Pyrococcus woesii purificada. En una realización preferida, la endonucleasa FEN–1 de Pyrococcus woesii purificada tiene un peso molecular de aproximadamente 38,7 kilodaltons (pudiéndose estimar convenientemente el peso molecular usando electroforesis en gel de poliacrilamida–SDS según lo descrito en el Ej. 28).

45 La presente invención proporciona además un oligonucleótido aislado codificante de una endonucleasa FEN–1 de Pyrococcus woesii, teniendo el oligonucleótido una región capaz de hibridar una secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 80–83. En una realización preferida, el oligonucleótido codificante de la endonucleasa FEN–1 de Pyrococcus woesii está unido operativamente a un promotor heterólogo. La presente invención no está limitada por la naturaleza del promotor heterólogo empleado; en una realización preferida, el

50 promotor heterólogo es un promotor inducible (el promotor seleccionado dependerá de la célula huésped elegida para la expresión, como se sabe en la técnica). La invención no está limitada por la naturaleza del promotor inducible empleado. El promotor inducible preferido incluye el promotor A–PL, el promotor tac, el promotor trp y el promotor trc.

En otra realización preferida, la invención proporciona un vector de ADN recombinante que comprende un

55 oligonucleótido aislado codificante de una endonucleasa FEN–1 de Pyrococcus woesii (Pwo), teniendo el oligonucleótido una región capaz de hibridarse con una secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 80–83. Las células huésped transformadas con estos vectores recombinantes también se proporcionan. En una realización preferida, la invención proporciona una célula huésped transformada con un vector de ADN recombinante que comprende ADN que tiene una región capaz de hibridarse con una secuencia de oligonucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 80–83; comprendiendo estos vectores además un promotor heterólogo unido operativamente con polinucleótidos codificantes de FEN–1 de Pwo. La invención no está limitada por la naturaleza de la célula huésped empleada. La técnica conoce bien los vectores de expresión adecuados para la expresión de polinucleótidos codificantes de FEN–1 de Pwo que pueden ser expresados en una

5 variedad de células huésped procariotas y eucariotas. En una realización preferida, la célula huésped es una célula de Escherichia coli.

En otra realización más, la invención proporciona un oligonucleótido aislado que comprende un gen codificante de una endonucleasa FEN–1 de Pyrococcus woesii que tiene un peso molecular de aproximadamente 38,7 kilodaltons. En otra realización, el oligonucleótido codificante de la endonucleasa FEN–1 de Pyrococcus woesii está unido

10 operativamente a un promotor heterólogo. La presente invención no está limitada por la naturaleza del promotor heterólogo empleado; en una realización preferida, el promotor heterólogo es un promotor inducible (el promotor seleccionado dependerá de la célula huésped elegida para la expresión, como se sabe en la técnica). La invención no está limitada por la naturaleza del promotor inducible empleado. El promotor inducible preferido incluye el promotor A–PL, el promotor tac, el promotor trp y el promotor trc.

15 La invención proporciona además un vector de ADN recombinante que comprende ADN que tiene una secuencia de nucleótidos codificante de una endonucleasa FEN–1 de Pyrococcus woesii que tiene un peso molecular de aproximadamente 38.7 kilodaltons. Aún más, se proporciona una célula huésped transformada con un vector de ADN recombinante que comprende ADN que tiene una secuencia de nucleótidos codificante de una endonucleasa FEN–1 de Pyrococcus woesii que tiene un peso molecular de aproximadamente 38,7 kilodaltons. La invención no

20 está limitada por la naturaleza de la célula huésped empleada. La técnica conoce bien los vectores de expresión adecuados para la expresión de polinucleótidos codificantes de FEN–1 de Pwo que pueden ser expresados en una variedad de células huésped procariotas y eucariotas. En una realización preferida, la célula huésped es una célula de Escherichia coli.

Como se indica anteriormente, la presente invención contempla el uso de nucleasas de estructura específica en un

25 procedimiento de detección. En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia un ácido nucleico diana mediante la detección de productos de escisión no diana que comprende: a) proporcionar: i) un medio de escisión, ii) una fuente de ácido nucleico diana, teniendo el ácido nucleico diana una primera región, una segunda región y una tercera región, estando la primera región localizada adyacente a y secuencia abajo de la segunda región, y estando la segunda región localizada adyacente a y secuencia abajo de la

30 tercera región, iii) un primer oligonucleótido que tiene una parte 5’ y 3’, conteniendo la parte 5’ del primer oligonucleótido una secuencia complementaria a la segunda región del ácido nucleico diana y conteniendo la parte 3’ del primer oligonucleótido una secuencia complementaria a la tercera región del ácido nucleico diana, iv) un segundo oligonucleótido que tiene una parte 5’ y una parte 3’, conteniendo la parte 5’ del segundo oligonucleótido una secuencia complementaria a la primera región del ácido nucleico diana y conteniendo la parte 3’ del segundo

35 oligonucleótido una secuencia complementaria a la segunda región del ácido nucleico diana; b) mezclar el medio de escisión, el ácido nucleico diana, y el primer y segundo oligonucleótido para crear una mezcla de reacción en condiciones de reacción tales que al menos la parte 3’ del primer oligonucleótido se aparee con el ácido nucleico diana y que al menos la parte 5’ del segundo oligonucléotido se aparee con el ácido nucleico diana para crear una estructura de escisión, y teniendo lugar la escisión de la estructura de escisión para generar productos de escisión

40 no diana; y c) detectar los productos de escisión no diana.

Se contempla que la primera, la segunda y la tercera región de la diana están localizadas adyacentes entre sí. Sin embargo, la invención no está limitada por el uso de una diana en la que las tres regiones sean contiguas entre sí. De este modo, la presente invención contempla el uso de ácidos nucleicos diana, en los que estas tres regiones son contiguas entre sí, así como ácidos diana en los que estas tres regiones no son contiguas. También se contempla

45 que los huecos de aproximadamente 2–10 nucleótidos, que representan regiones de no complementariedad de los oligonucleótidos (p. ej., el primer y/o el segundo oligonucleótido) pueden estar presentes entre las tres regiones del ácido nucleico diana.

En al menos una realización, se pretende que la mezcla de la etapa b) se realice en condiciones tales que al menos la parte 3’ del primer oligonucleótido se aparee con el ácido nucleico diana y la parte 5’ del segundo oligonucleótido 50 se aparee con el ácido nucleico diana. De esta manera, se crea una estructura de escisión y se puede producir la escisión de esta estructura de escisión. Estas condiciones permiten el uso de diversos formatos. En un formato preferido, las condiciones de mezclado comprenden mezclar el ácido nucleico diana con el primer y el segundo oligonucleótido y el medio de escisión en una solución acuosa carente de una fuente de cationes divalentes. En este formato, la reacción de escisión se inicia mediante la adición de una solución que contenga iones Mn2- o Mg2+. En

55 otro formato preferido, las condiciones de mezclado comprenden mezclar el ácido nucleico diana, y el primer y el segundo oligonucleótido en una solución acuosa que contenga iones Mn2- o Mg2-, y luego añadir el medio de escisión a la mezcla de reacción.

Se contempla que los oligonucleótidos pueden ser marcados. De este modo, si la reacción de escisión emplea un primer oligonucleótido que contiene un marcador, la detección de los productos de escisión no diana puede 60 comprender la detección del marcador. La invención no está limitada por la naturaleza del marcador elegido, incluyendo, pero no limitándose a marcadores que comprenden un tinte o un radionucleótido (p. ej., 32P), un resto de

fluoresceína, un resto de biotina, restos luminogénicos, fluorogénicos, fosforescentes, o flujos en combinación con restos que pueden eliminar la emisión mediante transferencia de energía por fluorescencia (FET). Hay numerosos procedimientos disponibles para la detección de ácidos nucleicos que contienen cualquiera de los marcadores anteriormente enumerados. Por ejemplo, el o los oligonucleótidos marcados con biotina se pueden detectar usando

5 procedimientos de detección no isotópicos que emplean conjugados de estreptavidina–fosfatasa alcalina. El o los oligonucleótidos marcados con fluoresceína se pueden detectar usando un formador de imágenes de fluoresceína.

También se contempla que los oligonucleótidos marcados (escindidos o no escindidos) se pueden separar mediante procedimientos distintos de la electroforesis. Por ejemplo, los oligonucleótidos marcados con biotina se pueden separar del ácido nucleico presente en la mezcla de reacción usando perlas para–magnéticas o magnéticas, o 10 partículas que están revestidas con avidina (o estreptavidina). De esta manera, es posible separar físicamente el complejo de oligonucleótido biotinilado/perlas magnéticas con avidina de otros componentes de la mezcla exponiendo los complejos a un campo magnético. Además, es posible resolver la señal procedente de los oligonucleótidos escindidos de la de los oligonucleótidos no escindidos sin una separación física. Por ejemplo, se puede detectar un cambio del tamaño y, por tanto, de la velocidad de rotación en disolución de las moléculas

15 fluorescentes mediante un análisis de polarización de la fluorescencia.

En una realización preferida, las condiciones de reacción comprenden una temperatura de reacción de escisión que es menor que la temperatura de fusión del primer oligonucleótido y mayor que la temperatura de fusión de la parte 3’ del primer oligonucleótido. En una realización particularmente preferida, la temperatura de reacción es de entre aproximadamente 40–75°C. Se contempla que la tempera tura de reacción a la que tiene lugar la reacción de 20 escisión se selecciona con respecto a las directrices proporcionadas en el apartado de “Descripción de la invención”.

El procedimiento de la presente invención no está limitado por la naturaleza del ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana puede comprender ADN, ARN y/o híbridos de ADN/ARN mono o bicatenarios. Cuando se emplea un ácido nucleico diana bicatenario, la mezcla de reacción puede ser tratada tal que el ADN bicatenario se vuelva sustancialmente monocatenario. Un procedimiento preferido para volver el ADN bicatenario en sustancialmente

25 monocatenario es mediante el uso de un aumento de temperatura. Cuando se emplean ácidos nucleicos diana que comprenden ARN, los oligonucleótidos pueden comprender ADN, ARN o un oligonucleótido que comprenda una mezcla de ARN y ADN. No se pretende que la invención esté limitada por la naturaleza de los oligonucleótidos empleados.

Los oligonucleótidos pueden comprender ADN, ARN o un oligonucleótido que comprenda una mezcla de ARN y

30 ADN. La invención también contempla el uso de un segundo oligonucleótido (i. e., el oligonucleótido secuencia arriba) que comprende un grupo funcional (p. ej., una región peptídica 5’) que evite la disociación de la parte 5’ del segundo oligonucleótido de la primera región del ácido nucleico diana. Cuando tal grupo funcional está presente sobre el segundo oligonucleótido, es posible desestabilizar la interacción entre la parte 3’ del segundo oligonucleótido y la primera región del ácido nucleico diana (i.e., diseñada para que tenga una temperatura de fusión local inferior) a

35 través del uso de secuencias ricas en A–T, análogos de bases que formen menos enlaces de hidrógeno (p.ej., pares dG–dU) o a través del uso de esqueletos de fosforotioato, con el fin de permitir que la región 5’ del primer oligonucleótido compita satisfactoriamente para la hibridación.

La invención no se limita al uso de oligonucleótidos que sean completamente complementarios a sus secuencias

diana afines. En una realización, tanto el primer como el segundo oligonucleótido son completamente

40 complementarios al ácido nucleico diana. En otra realización, el primer oligonucleótido es parcialmente complementario al ácido nucleico diana. En otra realización más, el segundo oligonucleótido es parcialmente complementario al ácido nucleico diana. En otra realización más, tanto el primer como el segundo oligonucleótido son parcialmente complementarios al ácido nucleico diana.

Los procedimientos de la invención pueden emplear una fuente de ácido nucleico diana que comprende una muestra

45 que contiene ADN genómico. En una realización preferida, la muestra que contiene ADN genómico se selecciona entre el grupo que incluye, pero que no se limita a, sangre, saliva, fluido cerebroespinal, fluido pleural, leche, linfa, esputo y semen.

En una realización preferida, el procedimiento emplea las condiciones de reacción que comprenden proporcionar una fuente de cationes divalentes. En una realización particularmente preferida, el catión divalente se selecciona del

50 grupo que comprende iones de Mn2+ y Mg2+.

La invención también proporciona un procedimiento para detectar la presencia de un ácido nucleico diana en una muestra generando productos de escisión no diana, que comprende: a) proporcionar: i) un medio de escisión, ii) una muestra sospechosa de contener un ácido nucleico diana que tenga una primera región, una segunda región y una tercera región, estando la primera región localizada adyacente a y secuencia abajo de la segunda región, y estando 55 la segunda región localizada adyacente a y secuencia abajo de la tercera región, iii) un primer oligonucleótido que tiene una parte 5’ y 3’, conteniendo la parte 5’ del primer oligonucleótido una secuencia complementaria a la segunda región del ácido nucleico diana y conteniendo la parte 3’ del primer oligonucleótido una secuencia complementaria a la tercera región del ácido nucleico diana, iv) un segundo oligonucleótido que tiene una parte 5’ y una parte 3’, conteniendo la parte 5’ del segundo oligonucleótido una secuencia complementaria a la primera región

del ácido nucleico diana y conteniendo la parte 3’ del segundo oligonucleótido una secuencia complementaria a la segunda región del ácido nucleico diana; b) mezclar el medio de escisión, y el primer y segundo oligonucleótido para crear una mezcla de reacción en condiciones de reacción, en las que el ácido nucleico diana, y el primer y el segundo oligonucleótido forman una o más estructuras de escisión, y en las que el medio de escisión escinde las 5 estructuras de escisión, dando como resultado la escisión del primer oligonucleótido; y c) distinguir el primer oligonucleótido escindido del primer oligonucleótido sin escindir, el segundo oligonucleótido y el ácido nucleico diana. En una realización preferida, el primer oligonucleótido escindido se distingue del primer oligonucleótido sin escindir, del segundo oligonucleótido y del ácido nucleico diana mediante electroforesis de la mezcla de reacción una vez que la escisión ha tenido lugar, para separar el primer oligonucleótido escindido del primer oligonucleótido sin escindir,

10 del segundo oligonucleótido y del ácido nucleico diana, seguida por la visualización del primer oligonucleótido escindido separado. Como se indica anteriormente, la invención no se limita al uso de la separación física de los productos de reacción para distinguir el primer oligonucleótido escindido.

En una realización preferida, el primer oligonucleótido contiene un marcador fluorescente y la visualización del primer oligonucleótido escindido separado está constituida por la detección del marcador a través del uso de un

15 formador de imágenes fluorescentes.

En una realización particularmente preferida, el primer oligonucleótido está presente en exceso en relación con el ácido nucleico diana. En una realización, el primer oligonucleótido está presente preferiblemente en aproximadamente al menos un exceso molar 100 veces superior en relación con el ácido nucleico diana.

La invención contempla además un procedimiento en el que el primer oligonucleótido está presente en exceso en

20 relación en el ácido nucleico diana y se mide la cantidad del primer oligonucleótido escindido producido en la reacción de escisión, tal que es posible determinar la cantidad del ácido nucleico diana presente en la muestra.

En una realización preferida, las condiciones de la etapa b) comprenden el uso de una temperatura de reacción de escisión que es menor que la temperatura de fusión del primer oligonucleótido y mayor que la temperatura de fusión de la parte 3’ del primer oligonucleótido.

25 Según lo descrito anteriormente, la invención contempla que el medio de escisión comprenda una nucleasa 5’ termoestable, aunque la invención no se limita al uso de una nucleasa 5’ termoestable. Cuando se emplea una nucleasa 5’ termoestable, una parte de la secuencia de aminoácidos de la nucleasa puede ser homóloga a una parte de la secuencia de aminoácidos de una ADN polimerasa termoestable derivada de un organismo termófilo.

La presente invención proporciona además un procedimiento para detectar la variación secuencial en una pluralidad

30 de secuencias diana de ácido nucleico, difiriendo las secuencias de ácidos nucleicos en secuencia, que comprende las etapas de: a) proporcionar: i) un medio de escisión: ii) una muestra sospechosa de contener un primer ácido nucleico diana y un segundo ácido nucleico diana, teniendo el primer y el segundo ácido nucleico diana una primera región, una segunda región y una tercera región, estando la primera región localizada adyacente a y secuencia abajo de la segunda región, y estando la segunda región localizada adyacente a y secuencia abajo de la tercera

35 región, y difiriendo la secuencia de dicho primer y segundo ácido nucleico diana entre sí en al menos un nucleótido de sus respectivos terceras regiones; iii) un primer oligonucleótido que tiene una parte 5’ y 3’, conteniendo la parte 5’ del primer oligonucleótido una secuencia complementaria a la segunda región del primer y segundo ácido nucleico diana, y conteniendo la parte 3’ del primer oligonucleótido una secuencia complementaria a la tercera región del primer ácido nucleico diana, iv) un segundo oligonucleótido que tiene una parte 5’ y una parte 3’, conteniendo la

40 parte 5’ del segundo oligonucleótido una secuencia complementaria a la segunda región del primer y segundo ácido nucleico diana, y conteniendo la parte 3’ del segundo oligonucleótido una secuencia complementaria a la tercera región del segundo ácido nucleico diana; v) un tercer oligonucleótido que tiene una parte 5’ y una parte 3’, conteniendo la parte 5’ del tercer oligonucleótido una secuencia complementaria a la primera región del primer y segundo ácido nucleico diana, y conteniendo la parte 3’ del tercer oligonucleótido una secuencia complementaria a

45 la primera y segunda región de los ácidos nucleicos diana; b) mezclar el medio de escisión, el primer y segundo ácido nucleico diana, y el primer, segundo y tercer oligonucleótido para crear una mezcla de reacción en condiciones de reacción, tales que el primer y el segundo ácido nucleico diana, y el primer, el segundo y el tercer oligonucleótido formen una o más estructuras de escisión, y el medio de escisión escinda las estructuras de escisión, dando como resultado la escisión de uno o más del primer y el segundo oligonucleótido y c) distinguir el primer y el segundo

50 oligonucleótido escindido del primer y segundo oligonucleótido sin escindir, del tercer oligonucleótido, y del primer y segundo ácido nucleico diana.

La invención no se limita al uso de dos o más ácidos nucleicos diana que difieran entre sí en al menos un nucleótido de sus respectivas terceras regiones. También se pueden emplear moléculas de ácido nucleico que difieren entre sí en al menos un nucleótido de sus respectivas segundas regiones. En esta realización, se emplean un primer,

55 segundo y tercer oligonucleótido adecuadamente diseñados.

En una realización preferida del procedimiento que emplea ácidos nucleicos diana que difieren entre sí en al menos un nucleótido de sus respectivas terceras regiones, el primer oligonucleótido contiene un primer marcador y el segundo oligonucleótido contiene un segundo marcador.

En otra realización más, la distinción de la etapa c) comprende la separación del primer oligonucleótido escindido del primer oligonucleótido sin escindir, del segundo oligonucleótido y del ácido nucleico diana, comprendiendo además la etapa d) de detectar los productos escindidos y sin escindir separados para permitir una determinación de la presencia y la abundancia relativa del primer y el segundo ácido nucleico diana en la muestra.

5 En otra realización preferida más, las condiciones de la etapa b) comprenden el uso de una temperatura de reacción de escisión que sea menor que la temperatura de fusión del primer y segundo oligonucleótido, y mayor que la temperatura de fusión de la parte 3’ del primer oligonucleótido y la parte 3’ del segundo oligonucleótido. Según lo descrito anteriormente, los procedimientos de la invención emplean preferiblemente nucleasas 5’ termoestables como medios de escisión, aunque la invención no se limita al uso de nucleasas 5’ termoestables.

10 Los nuevos procedimientos de detección de la invención se pueden emplear para la detección de ácidos nucleicos diana incluyendo, pero no limitándose a, ácidos nucleicos diana que comprenden alelos de genes naturales y mutantes, incluyendo genes de seres humanos u otros animales que están o pueden estar asociados con enfermedades o cáncer. Además, los procedimientos de la invención se pueden usar para la detección de y/o la identificación de cepas de microorganismos, incluyendo bacterias, hongos, protozoos, microorganismos ciliares y

15 virus.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia un ARN diana mediante la detección de productos de escisión no diana que comprende: a) proporcionar: i) un medio de escisión, ii) una fuente de ARN diana, teniendo el ARN diana una primera región, una segunda región y una tercera región, estando la primera región localizada adyacente a y secuencia abajo de la segunda región, y estando la segunda 20 región localizada adyacente a y secuencia abajo de la tercera región, iii) un primer oligonucleótido que tiene una parte 5’ y 3’, conteniendo la parte 5’ del primer oligonucleótido una secuencia complementaria a la segunda región del ARN diana y conteniendo la parte 3’ del primer oligonucleótido una secuencia complementaria a la tercera región del ARN diana, iv) un segundo oligonucleótido que tiene una parte 5’ y una parte 3’, conteniendo la parte 5’ del segundo oligonucleótido una secuencia complementaria a la primera región del ARN diana y conteniendo la parte 3’ 25 del segundo oligonucleótido una secuencia complementaria a la segunda región del ARN diana; b) mezclar el medio de escisión, el ARN diana, y el primer y segundo oligonucleótido para crear una mezcla de reacción en condiciones de reacción tales que al menos la parte 3’ del primer oligonucleótido se aparee con el ARN diana y en las que al menos la parte 5’ del segundo oligonucléotido se aparee con el ARN diana para crear una estructura de escisión, y teniendo lugar la escisión de la estructura de escisión para generar productos de escisión no diana; c) detectar los

30 productos de escisión no diana.

Se contempla que la primera, la segunda y la tercera región de la diana estén localizadas adyacentes entre sí. Sin embargo, la invención no está limitada por el uso de una diana en la que las tres regiones sean contiguas entre sí. De este modo, la presente invención contempla el uso de ARN diana, en los que estas tres regiones son contiguas entre sí, así como ARN diana en los que estas tres regiones no son contiguas. También se contempla que los

35 huecos de aproximadamente 2–10 nucleótidos, que representan regiones de no complementariedad de los oligonucleótidos (p. ej., el primer y/o el segundo oligonucleótido) pueden estar presentes entre las tres regiones del ARN diana.

En al menos una realización, se pretende que la mezcla de la etapa b) se realice en condiciones tales que al menos la parte 3’ del primer oligonucleótido se aparee con el ARN diana y al menos la parte 5’ del segundo oligonucleótido 40 se aparee con el ARN diana. De esta manera, se crea una estructura de escisión y se puede producir la escisión de esta estructura de escisión. Estas condiciones permiten el uso de diversos formatos. En un formato preferido, las condiciones de mezclado comprenden mezclar el ARN diana con el primer y el segundo oligonucleótido y el medio de escisión en una solución acuosa carente de una fuente de cationes divalentes. En este formato, la reacción de escisión se inicia mediante la adición de una solución que contenga iones de Mn2- o Mg2+. En otro formato preferido,

45 las condiciones de mezclado comprenden mezclar el ARN diana, y el primer y el segundo oligonucleótido en una solución acuosa que contenga iones de Mn2+ o Mg2+, y luego añadir el medio de escisión a la mezcla de reacción.

La invención no está limitada por el procedimiento empleado para la detección de productos de escisión no diana. Por ejemplo, los productos generados mediante la reacción de escisión (i.e., los productos de escisión no diana) se pueden detectar mediante su separación de los productos de reacción sobre geles de agarosa o poliacrilamida, y la

50 tinción con bromuro de etidio. En la presente memoria, se proporcionan otros procedimientos de detección no basados en geles.

Se contempla que los oligonucleótidos pueden estar marcados. De este modo, si la reacción de escisión emplea un primer oligonucleótido que contiene un marcador, la detección de los productos de escisión no diana puede comprender la detección del marcador. La invención no está limitada por la naturaleza del marcador elegido, 55 incluyendo, pero no limitándose a marcadores que comprenden un colorante o un radionucleótido (p. ej., 32P), un resto de fluoresceína, un resto de biotina, restos luminogénicos, fluorogénicos, fosforescentes, o fluidos en combinación con restos que pueden eliminar la emisión mediante transferencia de energía por fluorescencia (FET). Hay numerosos procedimientos disponibles para la detección de ácidos nucleicos que contienen cualquiera de los marcadores anteriormente enumerados. Por ejemplo, el o los oligonucleótidos marcados con biotina se pueden 60 detectar usando procedimientos de detección no isotópicos que emplean conjugados de estreptavidina–fosfatasa

alcalina. El o los oligonucleótidos marcados con fluoresceína se pueden detectar usando un formador de imágenes de fluoresceína.

También se contempla que los oligonucleótidos marcados (escindidos o no escindidos) se pueden separar mediante procedimientos distintos de la electroforesis. Por ejemplo, los oligonucleótidos marcados con biotina se pueden 5 separar del ácido nucleico presente en la mezcla de reacción usando perlas para–magnéticas o magnéticas, o partículas que están revestidas con avidina (o estreptavidina). De esta manera, es posible separar físicamente el complejo de oligonucleótido biotinilado/perlas magnéticas con avidina de otros componentes de la mezcla exponiendo los complejos a un campo magnético. Además, es posible resolver la señal procedente de los oligonucleótidos escindidos de la de los oligonucleótidos no escindidos sin una separación física. Por ejemplo, se

10 puede detectar un cambio del tamaño y, por tanto, de la velocidad de rotación en disolución de las moléculas fluorescentes mediante un análisis de polarización de la fluorescencia.

En una realización preferida, las condiciones de reacción comprenden una temperatura de reacción de escisión que es menor que la temperatura de fusión del primer oligonucleótido y mayor que la temperatura de fusión de la parte 3’ del primer oligonucleótido. En una realización particularmente preferida, la temperatura de reacción es de entre 15 aproximadamente 40–65°C. Se contempla que la tempera tura de reacción a la que tiene lugar la reacción de escisión se selecciona con respecto a las directrices proporcionadas en el apartado de “Descripción de la invención”.

La invención no está limitada por la naturaleza del oligonucleótido empleado. Usando un ARN diana, los oligonucleótidos pueden comprender ADN, ARN o un oligonucleótido que comprenda una mezcla de ARN y ADN.

La invención también contempla el uso de un segundo oligonucleótido (i. e., el oligonucleótido secuencia arriba) que

20 comprende un grupo funcional (p. ej., una región peptídica 5’) que evite la disociación de la parte 5’ del segundo oligonucleótido de la primera región del ARN diana. Cuando tal grupo funcional está presente sobre el segundo oligonucleótido, es posible desestabilizar la interacción entre la parte 3 del segundo oligonucleótido y la primera región del ARN diana (i.e., diseñada para que tenga una temperatura de fusión local inferior) a través del uso de secuencias ricas en A–T (o A–U), análogos de bases que formen menos enlaces de hidrógeno (p.ej., pares dG–dU)

25 o a través del uso de esqueletos de fosforotioato, con el fin de permitir que la región 5’ del primer oligonucleótido compita satisfactoriamente para la hibridación.

La presente invención utiliza nucleasas de estructura específica en los procedimientos de detección y caracterización de secuencias de ácidos nucleicos y cambios secuenciales. La presente invención también se refiere a procedimientos para escindir una estructura de escisión de ácidos nucleicos de un modo de sitio específico. La

30 actividad nucleasa se usa para detectar mutaciones conocidas y desconocidas, incluyendo cambios de una sola base en ácidos nucleicos.

La invención no se limita al uso de oligonucleótidos que sean completamente complementarios a sus secuencias diana afines. En una realización, tanto el primer como el segundo oligonucleótido son completamente complementarios al ARN diana. En otra realización, el primer oligonucleótido es parcialmente complementario al

35 ARN diana. En otra realización más, el segundo oligonucleótido es parcialmente complementario al ARN diana. En otra realización más, tanto el primer como el segundo oligonucleótido son parcialmente complementarios al ARN diana.

En una realización preferida, los procedimientos de la invención emplean una fuente de ARN diana que comprende una muestra que se selecciona entre el grupo que incluye, pero que no se limita a, sangre, saliva, fluido

40 cerebroespinal, fluido pleural, leche, linfa, esputo y semen.

En una realización preferida, el procedimiento de la invención emplea las condiciones de reacción que comprenden proporcionar una fuente de cationes divalentes. En una realización particularmente preferida, el catión divalente se selecciona del grupo que comprende iones de Mn2+ y Mg2+.

Los nuevos procedimientos de detección de la invención se pueden emplear para la detección de ARN diana

45 incluyendo, pero no limitándose a, ARN diana que comprenden alelos de genes naturales y mutantes, incluyendo genes de seres humanos u otros animales que están o pueden estar asociados con enfermedades o cáncer. Además, los procedimientos de la invención se pueden usar para la detección de y/o la identificación de cepas de microorganismos, incluyendo bacterias, hongos, protozoos, microorganismos ciliares y virus (y en particular, para la detección y la identificación de virus de ARN, tales como el VHC).

50 La presente invención proporciona además un procedimiento para separar moléculas de ácido nucleico que comprende: a) proporcionar: i) un oligonucleótido de carga equilibrada e ii) un reactivo; b) mezclar el oligonucleótido de carga equilibrada con el reactivo para crear una mezcla de reacción en condiciones tales que se produzca un oligonucleótido de carga desequilibrada; y c) separar el oligonucleótido de carga desequilibrada de la mezcla de reacción.

55 El procedimiento de la presente invención no está limitado por la naturaleza del reactivo empleado. En una realización preferida, el reactivo comprende un medio de escisión. En una realización particularmente preferida, el medio de escisión es una endonucleasa. En otra realización, el medio de escisión es una exonucleasa. En otra realización más, el reactivo comprende un medio de polimerización. En otra realización, el reactivo comprende un medio de unión.

En una realización preferida, el oligonucleótido de carga equilibrada comprende un marcador. La invención no está limitada por la naturaleza del marcador elegido, incluyendo, pero no limitándose a marcadores que comprenden un

5 colorante o un radionucleótido (p. ej., 32P), un resto de fluoresceína, un resto de biotina, restos luminogénicos, fluorogénicos, fosforescentes, o fluidos en combinación con restos que pueden eliminar la emisión mediante transferencia de energía por fluorescencia (FET). El marcador puede ser un resto cargado o, alternativamente, puede ser un resto neutro.

En otra realización preferida, el oligonucleótido de carga equilibrada comprende uno o más grupos fosfonato. En una 10 realización preferida, el grupo fosfonato es un grupo metilfosfonato.

En una realización, el oligonucleótido de carga equilibrada tiene una carga neutra neta y el oligonucleótido de carga desequilibrada tiene una carga positiva neta. Alternativamente, el oligonucleótido de carga equilibrada tiene una carga neutra neta y el oligonucleótido de carga desequilibrada tiene una carga negativa neta. En otra realización más, el oligonucleótido de carga equilibrada tiene una carga negativa neta y el oligonucleótido de carga

15 desequilibrada tiene una carga positiva neta. En otra realización, el oligonucleótido de carga equilibrada tiene una carga negativa neta y el oligonucleótido de carga desequilibrada tiene una carga neutra neta. En otra realización, el oligonucleótido de carga equilibrada tiene una carga positiva neta y el oligonucleótido de carga desequilibrada tiene una carga neutra neta. Aún más, el oligonucleótido de carga equilibrada tiene una carga positiva neta y el oligonucleótido de carga desequilibrada tiene una carga negativa neta.

20 En una realización preferida, el oligonucleótido de carga equilibrada comprende ADN que contiene uno o más aductos cargados positivamente. En una realización preferida, el oligonucleótido de carga equilibrada comprende ADN que contiene uno o más aductos cargados positivamente, y el medio de escisión retira uno o más nucleótidos del oligonucleótido de carga equilibrada para producir el oligonucleótido de carga desequilibrada, teniendo el oligonucleótido de carga desequilibrada una carga positiva neta. En otra realización preferida, el oligonucleótido de

25 carga equilibrada comprende ADN que contiene uno o más aductos cargados positivamente, y el medio de escisión retira uno o más nucleótidos del oligonucleótido de carga equilibrada para producir el oligonucleótido de carga desequilibrada, teniendo el oligonucleótido de carga desequilibrada una carga neutra neta. Aún más, el oligonucleótido de carga equilibrada comprende ADN que contiene uno o más aductos cargados positivamente, y el medio de escisión retira uno o más nucleótidos del oligonucleótido de carga equilibrada para producir el

30 oligonucleótido de carga desequilibrada, teniendo el oligonucleótido de carga desequilibrada una carga negativa neta.

En una realización preferida, el oligonucleótido de carga equilibrada comprende ADN que contiene uno o más aductos cargados negativamente (p. ej., aminoácidos cargados negativamente). Los ejemplos de aductos cargados negativamente incluyen aminoácidos cargados negativamente (p. ej., aspartato y glutamato). En una realización 35 preferida, el oligonucleótido de carga equilibrada comprende ADN que contiene uno o más aductos cargados negativamente, y el medio de escisión retira uno o más nucleótidos del oligonucleótido de carga equilibrada para producir el oligonucleótido de carga desequilibrada, teniendo el oligonucleótido de carga equilibrada una carga negativa neta. En una realización preferida, el oligonucleótido de carga equilibrada comprende ADN que contiene uno o más aductos cargados negativamente, y el medio de escisión retira uno o más nucleótidos del oligonucleótido

40 de carga equilibrada para producir el oligonucleótido de carga desequilibrada, teniendo el oligonucleótido de carga desequilibrada una carga neutra neta. En una realización preferida, el oligonucleótido de carga equilibrada comprende ADN que contiene uno o más aductos cargados negativamente, y el medio de escisión retira uno o más nucleótidos del oligonucleótido de carga equilibrada para producir el oligonucleótido de carga desequilibrada, teniendo el oligonucleótido de carga desequilibrada una carga negativa neta.

45 La presente invención no está limitada por la naturaleza del o de los aductos cargados positivamente empleados. En una realización preferida, los aductos cargados positivamente se seleccionan del grupo constituido por tintes de indodicarbocianina (p. ej., Cy3 y Cy5), nucleótidos amino–sustituidos, bromuro de etidio, homodímero de etidio, (1,3– propandiamin)propidio, (dietilentriamin)propidio, naranja de tiazol, naranja de tiazol de (N–N’–tetrametil–1,3– propandiamin)propilo, naranja de tiazol de (N–N’–tetrametil–1,2–etandiamin)propilo, homodímero de naranja de

50 tiazol–naranja de tiazol (TOTO), heterodímero de naranja de tiazol–azul de tiazol (TOTAB), heterodímero 1 de naranja de tiazol–etidio (TOED1), heterodímero 2 de naranja de tiazol–etidio (TOED2), heterodímero de fluoresceína–etidio (FED) y aminoácidos cargados positivamente.

En otra realización preferida, la etapa de separación comprende someter la mezcla de reacción a un campo eléctrico que comprende un polo positivo y un polo negativo en condiciones tales que el oligonucleótido de carga

55 desequilibrada emigra hacia el polo positivo (i.e., electrodo). En otra realización, la etapa de separación comprende someter la mezcla de reacción a un campo eléctrico que comprende un polo positivo y un polo negativo en condiciones tales que el oligonucleótido de carga desequilibrada emigra hacia el polo negativo.

En otra realización más, el procedimiento de la presente invención comprende además detectar la presencia del oligonucleótido de carga desequilibrada separado. La presente invención no está limitada por el procedimiento de detección empleado, el procedimiento de detección seleccionado variará en función de la naturaleza del marcador empleado (de emplearse uno).

La presente invención comprende además un procedimiento para detectar moléculas nucleicas escindidas, que comprende: a) proporcionar: i) una pluralidad homogénea de oligonucleótidos de carga equilibrada; ii) una muestra 5 sospechosa de contener un ácido nucleico diana que tiene una secuencia que comprende una primera región complementaria a dicho oligonucleótido de carga equilibrada; iii) un medio de escisión; e iv) una cuba de reacción; b) añadir a dicha cuba, en cualquier orden, la muestra, los oligonucleótidos de carga equilibrada y el medio de escisión para crear una mezcla de reacción en condiciones tales que una parte de los oligonucleótidos de carga equilibrada se una al ácido nucleico diana complementario para crear una población unida (i.e., apareada), y tal que el medio de

10 escisión escinda al menos una parte de dicha población unida de oligonucleótidos de carga equilibrada para producir una población de oligonucleótidos de carga desequilibrada sin unir; y c) separar los oligonucleótidos de carga desequilibrada sin unir de la mezcla de reacción.

En una realización preferida, el procedimiento comprende además proporcionar una pluralidad homogénea de oligonucleótidos complementarios a una segunda región del ácido nucleico diana, siendo los oligonucleótidos 15 capaces de unirse al ácido nucleico diana secuencia arriba de los oligonucleótidos de carga equilibrada. En otra realización preferida, la primera y la segunda región del ácido nucleico diana comparten una región de solapamiento.

La invención no está limitada por la naturaleza del medio de escisión empleado. En una realización, el medio de escisión comprende una nucleasa 5’ termoestable. En una realización preferida, una parte de la secuencia de aminoácidos de la nucleasa 5’ es homóloga a una parte de la secuencia de aminoácidos de una ADN polimerasa

20 termoestable derivada de un organismo termófilo. En una realización preferida, el organismo se selecciona del grupo constituido por Thermus aquaticus, Thermus flavus y Thermus thermophilus. En otra realización preferida, la nucleasa está codificada por una secuencia de ADN seleccionada del grupo constituido por las SEC ID N.º 1–3, 9, 10, 12, 21, 25 y 26.

La invención no está limitada por la naturaleza del ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana puede comprender

25 ADN monocatenario, ADN o ARN bicatenario. En una realización preferida, el ácido nucleico diana comprende ADN bicatenario, y antes de la adición del medio de escisión, se trata le mezcla de reacción tal que el ADN bicatenario se vuelva sustancialmente monocatenario, preferiblemente, aumentando la temperatura.

La invención proporciona además un procedimiento para separar moléculas de ácido nucleico que comprende: a) modificar un oligonucleótido para que produzca un oligonucleótido de carga equilibrada; b) proporcionar: i) un dicho

30 oligonucleótido de carga equilibrada e ii) un reactivo; c) mezclar dicho oligonucleótido de carga equilibrada con dicho reactivo para crear una mezcla de reacción en condiciones tales que se produzca un oligonucleótido de carga desequilibrada; y d) separar el oligonucleótido de carga desequilibrada de dicha mezcla de reacción.

La invención no está limitada por la naturaleza de la modificación. En una realización preferida, la etapa de modificación comprende la unión mediante enlace covalente de un aducto cargado positivamente con una o más 35 bases del oligonucleótido. En otra realización preferida, la etapa de modificación comprende la unión mediante enlace covalente de un aducto cargado negativamente con una o más bases del oligonucleótido. En otra realización más, la modificación comprende la incorporación de una o más bases amino–sustituidas durante la síntesis del oligonucleótido. En otra realización, la modificación comprende la incorporación de uno o más grupos fosfonato durante la síntesis de dicho oligonucleótido. En una realización preferida, el grupo fosfonato es un grupo

40 metilfosfonato.

La invención proporciona además un procedimiento para tratar un molécula de ácido nucleico que comprende: a) proporcionar: i) un oligonucleótido de carga equilibrada e ii) un reactivo; b) mezclar dicho oligonucleótido de carga equilibrada con dicho reactivo para crear una mezcla de reacción en condiciones tales que se produzca un oligonucleótido de carga desequilibrada.

45 La invención proporciona además un procedimiento para tratar un molécula de ácido nucleico que comprende: a) modificar un oligonucleótido para producir un oligonucleótido de carga equilibrada; b) proporcionar: i) dicho oligonucleótido de carga equilibrada e ii) un reactivo; c) mezclar el oligonucleótido de carga equilibrada con el reactivo para crear una mezcla de reacción en condiciones tales que se produzca un oligonucleótido de carga desequilibrada;

50 La presente invención proporciona una composición que comprende una estructura de escisión, comprendiendo dicha estructura de escisión: a) un ácido nucleico diana, teniendo dicho ácido nucleico diana una primera región, una segunda región, una tercera región y una cuarta región, estando dicha primera región localizada adyacente a y secuencia abajo de dicha segunda región, estando dicha segunda región localizada adyacente a y secuencia abajo de dicha tercera región, y estando dicha tercera región localizada adyacente a y secuencia abajo de dicha cuarta

55 región; b) un primer oligonucleótido complementario a dicha cuarta región de dicho ácido nucleico diana; c) un segundo oligonucleótido que tiene una parte 5’ y una parte 3’, conteniendo dicha parte 5’ de dicho segundo oligonucleótido una secuencia complementaria a dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana y conteniendo dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido una secuencia complementaria a dicha tercera región de dicho ácido nucleico diana; y d) un tercer oligonucleótido que tiene una parte 5’ y una parte 3’, conteniendo dicha parte 5’ de dicho tercer oligonucleótido una secuencia complementaria a dicha primera región de dicho ácido nucleico diana y conteniendo dicha parte 3’ de dicho tercer oligonucleótido una secuencia complementaria a dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana.

5 La presente invención no está limitada por la longitud de las cuatro regiones del ácido nucleico diana. En una realización, la primera región del ácido nucleico diana tiene una longitud de 11 a 50 nucleótidos. En otra realización, la segunda región del ácido nucleico diana tiene una longitud de uno a tres nucleótidos. En otra realización, la tercera región del ácido nucleico diana tiene una longitud de seis a nueve nucleótidos. En otra realización más, la cuarta región del ácido nucleico diana tiene una longitud de 6 a 50 nucleótidos.

10 La invención no está limitada por la naturaleza o la composición del primer, segundo, tercer y cuarto oligonucleótido, pudiendo comprender estos oligonucleótidos ADN, ARN, APN y combinaciones de los mismos, así como comprender nucleótidos modificados, bases universales, aductos, etc. Además, uno o más del primer, segundo, tercer y cuarto oligonucleótido puede contener un didesoxinucléotido en el terminal 3’.

En una realización preferida, el ácido nucleico diana no es completamente complementario a al menos uno de entre

15 el primer, segundo, tercer y cuarto oligonucleótido. En una realización particularmente preferida, el ácido nucleico diana no es completamente complementario al segundo oligonucleótido.

Como se indica anteriormente, la presente invención contempla el uso de nucleasas de estructura específica en un procedimiento de detección. En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico diana mediante la detección de productos de escisión no diana que 20 comprende: a) proporcionar: i) un medio de escisión; ii) una fuente de ácido nucleico diana, teniendo el ácido nucleico diana una primera región, una segunda región, una tercera región y una cuarta región, estando la primera región localizada adyacente a y secuencia abajo la segunda región, estando la segunda región localizada adyacente a y secuencia abajo de la tercera región, y estando la tercera región localizada adyacente a y secuencia abajo de la cuarta región; iii) un primer oligonucleótido complementario a la cuarta región del ácido nucleico diana; iv) un 25 segundo oligonucleótido que tiene una parte 5’ y una parte 3’, conteniendo la parte 5’ del segundo oligonucleótido una secuencia complementaria a la segunda región de dicho ácido nucleico diana y conteniendo la parte 3’ del segundo oligonucleótido una secuencia complementaria a la tercera región del ácido nucleico diana; iv) un tercer oligonucleótido que tiene una parte 5’ y una parte 3’, conteniendo la parte 5’ del tercer oligonucleótido una secuencia complementaria a la primera región del ácido nucleico diana y conteniendo la parte 3’ del tercer oligonucleótido una 30 secuencia complementaria a la segunda región del ácido nucleico diana; b) mezclar el medio de escisión, el ácido nucleico diana, el primer oligonucleótido, el segundo oligonucleótido y el tercer oligonucleótido para crear una mezcla de reacción en condiciones de reacción tales que el primer oligonucleótido se aparee con la cuarta región del ácido nucleico diana y en las que al menos la parte 3’ del segundo oligonucleótido se aparee con el ácido nucleico diana, y en las que al menos la parte 5’ del tercer oligonucleótido se aparee con el ácido nucleico diana para crear

35 una estructura de escisión, teniendo lugar la escisión de la estructura de escisión para generar productos de escisión no diana, teniendo cada producto de escisión no diana un grupo hidroxilo en 3’; y c) detectar los productos de escisión no diana.

La invención no está limitada por la naturaleza del ácido nucleico diana. En una realización, el ácido nucleico diana comprende ADN monocatenario. En otra realización, el ácido nucleico diana comprende ADN bicatenario y antes de

40 la etapa c), se trata la mezcla de reacción tal que el ADN bicatenario se vuelva sustancialmente monocatenario. En otra realización, el ácido nucleico diana comprende ARN, y el primer y segundo oligonucleótido comprenden ADN.

La invención no está limitada por la naturaleza del medio de escisión. En una realización, el medio de escisión es una nucleasa de estructura específica; las nucleasas de estructura específica particularmente preferidas son nucleasas de estructura específica termoestables. En una realización preferida, la nucleasa de estructura específica

45 termoestable está codificada por una secuencia de ADN seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 1–3, 9, 10, 12, 21, 25, 26, 60, 65, 68, 70, 74 y 78. En otra realización preferida, la nucleasa de estructura específica termoestable es una nucleasa de la clase de nucleasas FEN–1/RAD2/XPG.

En una realización preferida, la detección de los productos de escisión no diana comprende la separación electroforética de los productos de la reacción seguida por la visualización de los productos de escisión no diana

50 separados.

En otra realización preferida, uno o más del primer, segundo y tercer oligonucleótido contiene un didesoxinucléotido en el terminal 3’. Cuando se emplean oligonucleótidos que contienen un didesoxinucleótido, la detección de los productos de escisión no diana comprende preferiblemente: a) incubar dichos productos de escisión no diana con una polimerasa independiente del molde y al menos un nucleósido trifosfato marcado en condiciones tales que se 55 añada al menos un nucleótido marcado al grupo hidroxilo de 3’ de dichos productos de escisión no diana para generar productos de escisión no diana marcados; y b) detectar la presencia de dichos productos de escisión no diana marcados. La invención no está limitada por la naturaleza de la polimerasa independiente del molde empleada; en una realización, la polimerasa independiente del molde se selecciona del grupo constituido por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y poli(A) polimerasa. Cuando se emplean TdT y poli(A) polimerasa, en la etapa de

detección, el segundo oligonucleótido puede contener un marcador del extremo 5', siendo el marcador del extremo 5’ un marcador diferente del marcador presente sobre el nucleósido trifosfato marcado. La invención no está limitada por la naturaleza del marcador del extremo 5'. Se conoce en la técnica una amplia variedad de marcadores del extremo 5' adecuados e incluyen biotina, fluoresceína, tetraclorofluoresceína, hexaclorofluoresceína, Cy3, Cy5 y

5 digoxigenina.

En otra realización, la detección de los productos de escisión no diana comprende: a) incubar dichos productos de escisión no diana con una polimerasa independiente del molde y al menos un nucleósido trifosfato en condiciones tales que se añada al menos un nucleótido al grupo hidroxilo de 3’ de los productos de escisión no diana para generar productos de escisión no diana prolongados; y b) detectar la presencia de los productos de escisión no 10 diana prolongados. La invención no está limitada por la naturaleza de la polimerasa independiente del molde empleada; en una realización, la polimerasa independiente del molde se selecciona del grupo constituido por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y poli(A) polimerasa. Cuando se emplean TdT y poli(A) polimerasa, en la etapa de detección, el segundo oligonucleótido puede contener un marcador del extremo 5’. La invención no está limitada por la naturaleza del marcador del extremo 5’; se conoce en la técnica una amplia variedad de marcadores

15 del extremo 5' adecuados e incluyen biotina, fluoresceína, tetraclorofluoresceína, hexaclorofluoresceína, Cy3, Cy5 y digoxigenina.

En una realización preferida, las condiciones de reacción comprenden proporcionar una fuente de cationes divalentes, siendo los cationes divalentes particularmente preferidos iones de Mn2– y Mg2–.

La presente invención proporciona además un procedimiento para detectar la presencia de una molécula de ácido

20 nucleico diana mediante la detección de productos de escisión no diana que comprende: a) proporcionar: i) un medio de escisión; ii) una fuente de ácido nucleico diana, teniendo dicho ácido nucleico diana una primera región, una segunda región y una tercera región, estando dicha primera región localizada adyacente a y secuencia abajo de dicha segunda región, y estando dicha segunda región localizada adyacente a y secuencia abajo de dicha tercera región; iii) un primer oligonucleótido que tiene una parte 5’ y una parte 3’, conteniendo dicha parte 5’ de dicho primer

25 oligonucleótido una secuencia complementaria a dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana y conteniendo dicha parte 3’ de dicho primer oligonucleótido una secuencia complementaria a dicha tercera región de dicho ácido nucleico diana; iv) un segundo oligonucleótido que tiene una longitud de entre once y quince nucleótidos, y que tiene además una parte 5’ y una parte 3’, conteniendo dicha parte 5’ de dicho segundo oligonucleótido una secuencia complementaria a dicha primera región de dicho ácido nucleico diana y conteniendo dicha parte 3’ de dicho segundo

30 oligonucleótido una secuencia complementaria a dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana; b) mezclar dicho medio de escisión, dicho ácido nucleico diana, dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido para crear una mezcla de reacción en condiciones de reacción tales que al menos dicha parte 3’ de dicho primer oligonucleótido se aparee con dicho ácido nucleico diana y al menos dicha parte 5’ de dicho segundo oligonucleótido se aparee con dicho ácido nucleico diana para crear una estructura de escisión, y teniendo lugar la escisión de dicha

35 estructura de escisión para generar productos de escisión no diana, teniendo cada producto de escisión no diana un grupo hidroxilo en 3’; y c) detectar dichos productos de escisión no diana. En una realización preferida, el medio de escisión es una nucleasa de estructura específica, preferiblemente, una nucleasa de estructura específica termoestable.

La invención no está limitada por la longitud de las diversas regiones del ácido nucleico diana. En una realización

40 preferida, la segunda región de dicho ácido nucleico diana tiene una longitud de entre uno a cinco nucleótidos. En otra realización preferida, uno o más del primer y el segundo oligonucleótido contiene un didesoxinucléotido en el terminal 3’. Cuando se emplean oligonucleótidos que contienen un didesoxinucleótido, la detección de los productos de escisión no diana comprende preferiblemente: a) incubar dichos productos de escisión no diana con una polimerasa independiente del molde y al menos un nucleósido trifosfato marcado en condiciones tales que se añada

45 al menos un nucleótido marcado al grupo hidroxilo de 3’ de dichos productos de escisión no diana para generar productos de escisión no diana marcados; y b) detectar la presencia de dichos productos de escisión no diana marcados. La invención no está limitada por la naturaleza de la polimerasa independiente del molde empleada; en una realización, la polimerasa independiente del molde se selecciona del grupo constituido por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y poli(A) polimerasa. Cuando se emplean TdT y poli(A) polimerasa, en la etapa de

50 detección, el segundo oligonucleótido puede contener un marcador del extremo 5’, siendo el marcador del extremo 5’ un marcador diferente del marcador presente sobre el nucleósido trifosfato marcado. La invención no está limitada por la naturaleza del marcador del extremo 5’; se conoce en la técnica una amplia variedad de marcadores del extremo 5' adecuados e incluyen biotina, fluoresceína, tetraclorofluoresceína, hexaclorofluoresceína, Cy3, Cy5 y digoxigenina.

55 En otra realización, la detección de los productos de escisión no diana comprende: a) incubar dichos productos de escisión no diana con una polimerasa independiente del molde y al menos un nucleósido trifosfato en condiciones tales que se añada al menos un nucleótido al grupo hidroxilo de 3’ de dichos productos de escisión no diana para generar productos de escisión no diana prolongados; y b) detectar la presencia de los productos de escisión no diana prolongados. La invención no está limitada por la naturaleza de la polimerasa independiente del molde

60 empleada; en una realización, la polimerasa independiente del molde se selecciona del grupo constituido por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y poli(A) polimerasa. Cuando se emplean TdT y poli(A) polimerasa en la etapa de detección, el segundo oligonucleótido puede contener un marcador del extremo 5’. La invención no está limitada por la naturaleza del marcador del extremo 5’; se conoce en la técnica una amplia variedad de marcadores del extremo 5' adecuados e incluyen biotina, fluoresceína, tetraclorofluoresceína, hexaclorofluoresceína, Cy3, Cy5 y digoxigenina.

Los nuevos procedimientos de detección de la invención se pueden emplear para la detección de ADN y ARN diana

5 incluyendo, pero no limitándose a, ADN y ARN diana que comprenden alelos de genes naturales y mutantes, incluyendo genes de seres humanos u otros animales que están o pueden estar asociados con enfermedades o cáncer. Además, los procedimientos de la invención se pueden usar para la detección de y/o la identificación de cepas de microorganismos, incluyendo bacterias, hongos, protozoos, microorganismos ciliares y virus (y en particular, para la detección y la identificación de virus de ARN, tales como el VHC).

10 La presente invención proporciona además una composición que comprende: a) una primera cadena continua simple de ácido nucleico, que tiene una primera y una segunda parte, que comprende una secuencia que define la cadena molde de una región de unión proteínica; b) una segunda cadena continua simple de ácido nucleico que tiene un extremo 5’ y un extremo 3’, comprendiendo dicho segundo ácido nucleico una región complementaria a dicha primera parte de dicha región de unión proteínica; c) una tercera cadena continua simple de ácido nucleico

15 que tiene un extremo 5’ y un extremo 3’, comprendiendo dicho tercer ácido nucleico una región complementaria a dicha segunda parte de dicha región de unión proteínica, y estando dicho segundo y dicho tercer ácido nucleico apareados a dicha región de unión proteína tal que se forme una región de unión proteínica bicatenaria completa. La presente invención no está limitada por la naturaleza de la región de unión proteínica empleada. En una realización preferida, la región de unión proteínica es una región de unión de ARN polimerasa dependiente del molde,

20 preferiblemente, la región de unión de la ARN polimerasa de T7.

En una realización preferida, el segundo y el tercer ácido nucleico apareado están además apareados entre sí. En otra realización, el segundo ácido nucleico comprende una cola 3’ monocatenaria que no es capaz de aparearse a dicho primer ácido nucleico. En otra realización más, el tercer ácido nucleico comprende una cola 5’ monocatenaria que no es capaz de aparearse a dicho primer ácido nucleico. En otra realización más, al menos uno de dicho

25 segundo y dicho tercero ácido nucleico comprende una región que no está apareada a dicho primer ácido nucleico. Cuando al menos uno de dicho segundo y dicho tercer ácido nucleico comprende una región que no está apareada con dicho primer ácido nucleico, el segundo ácido nucleico puede comprender una cola 3’ monocatenaria que no está apareada con el primer ácido nucleico y el tercer ácido nucleico puede comprender una cola 5’ monocatenaria que no está apareada con el primer ácido nucleico.

30 En otra realización, la presente invención proporciona una composición que comprende: a) una primera cadena continua simple de ácido nucleico, que tiene una primera y una segunda parte, que comprende una secuencia que define la cadena molde de una región de unión proteínica; b) una segunda cadena continua simple de ácido nucleico que tiene un extremo 5’ y un extremo 3’, comprendiendo dicho segundo ácido nucleico una región complementaria a dicha primera parte de dicha región de unión proteínica; c) una tercera cadena continua simple de ácido nucleico

35 que tiene un extremo 5’ y un extremo 3’, comprendiendo dicho tercer ácido nucleico una región complementaria a dicha segunda parte de dicha región de unión proteínica; y estando dicho segundo y dicho tercer ácido nucleico apareado a dicha región de unión proteínica tal que se forme una región de unión proteínica bicatenaria completa, y colindando el extremo 3’ de dicho segundo ácido nucleico apareado con el extremo 5' de dicho tercer ácido nucleico apareado.

40 La invención también proporciona un procedimiento para producir transcriptos de ARN que comprende: a) proporcionar una composición que comprende: i) una primera cadena continua simple de ácido nucleico que comprenden una secuencia que define la cadena molde de una región de unión de ARN polimerasa; ii) una segunda cadena continua simple de ácido nucleico que tiene un extremo 5’ y un extremo 3’, comprendiendo dicho segundo ácido nucleico una región complementaria a una primera parte de dicho primer ácido nucleico; iii) una tercera

45 cadena continua simple de ácido nucleico que tiene un extremo 5’ y un extremo 3’, comprendiendo dicho tercer ácido nucleico una región complementaria a una segunda parte de dicho primer ácido nucleico; y estando dicho segundo y dicho tercer ácido nucleico apareado a dicho primer ácido nucleico tal que se forme una región de unión de ARN polimerasa bicatenaria completa; y b) exponer dicha composición a condiciones tales que se produzca la transcripción.

50 La invención proporciona además un procedimiento para detectar los productos de escisión no diana producidos en el análisis de la escisión dirigida por Invader™(p. ej., reivindicaciones 25, 26, 29, 35–38 y 41–43) que comprende: a) proporcionar: i) dichos productos de escisión no diana; ii) una composición que comprende dos ácidos nucleicos monocatenarios apareados para definir una parte monocatenaria de una región de unión proteínica; iii) una proteína productora de ácido nucleico; b) exponer dichos productos de escisión no diana a dicha parte monocatenaria de

55 dicha región de unión proteínica en condiciones tales que dicha proteína productora de ácido nucleico se una a dicha región de unión proteínica y produzca ácido nucleico. En una realización preferida, la parte monocatenaria de la región de unión proteínica comprende: a) una primera cadena continua simple de ácido nucleico que comprenden una secuencia que define la cadena molde de una región de unión de ARN polimerasa; y b) una segunda cadena continua simple de ácido nucleico que tiene un extremo 5’ y un extremo 3’, comprendiendo dicho segundo ácido

60 nucleico una región complementaria a una parte de dicho primer ácido nucleico, estando dicho segundo ácido nucleico apareado a dicho primer ácido nucleico para definir dicha parte monocatenaria de dicha región de unión proteínica.

La invención no está limitada por la naturaleza de la región de unión proteínica empleada. En una realización preferida, la región de unión proteínica es una región de unión de ARN polimerasa dependiente del molde, más preferiblemente, la región de unión de la ARN polimerasa de T7.

5 La invención proporciona además un procedimiento para detectar los productos de escisión no diana producidos en el análisis de la escisión dirigida por Invader™(p. ej., reivindicaciones 25, 26, 29, 35–38 y 41–43) que comprende: a) proporcionar: i) dichos productos de escisión no diana; ii) una cadena continua simple de ácido nucleico que comprende una secuencia que define una cadena simple de una región de unión de ARN polimerasa; iii) una ADN polimerasa dependiente del molde; iv) una ARN polimerasa dependiente del molde; b) exponer dichos productos de

10 escisión no diana a dicha región de unión de ARN polimerasa en condiciones tales que dicho producto de escisión no diana se una a una parte de dicha cadena simple de dicha región de unión de ARN polimerasa; c) exponer dicho producto de escisión no diana unido a dicha ADN polimerasa dependiente del molde en condiciones tales que se produzca una región de unión de ARN polimerasa bicatenaria; d) exponer dicha región de unión de ARN polimerasa bicatenaria a dicha ARN polimerasa dependiente del molde en condiciones tales que se produzcan transcriptos de

15 ARN. En una realización preferida, el procedimiento comprende además detectar los transcriptos de ARN.

La invención no está limitada por la naturaleza de la región de unión proteínica empleada. En una realización preferida, la región de unión proteínica es una región de unión de ARN polimerasa dependiente del molde, más preferiblemente, la región de unión de la ARN polimerasa de T7.

Descripción de las figuras

20 La Fig. 1 es una comparación de la estructura nucleotídica de los genes de ADNp aislados de Thermus aquaticus (SEC ID N.º 1), Thermus flavus (SEC ID N.º 2) y Thermus thermophilus (SEC ID N.º 3); la secuencia consenso (SEC ID N.º 7) se muestra en la parte superior de cada fila

La Fig. 2 es una comparación de la secuencia de aminoácidos de los genes de ADNp aislados de Thermus aquaticus (SEC ID N.º 4), Thermus flavus (SEC ID N.º 5) y Thermus thermophilus (SEC ID N.º 6); la secuencia

25 consenso (SEC ID N.º 8) se muestra en la parte superior de cada fila

Las Fig. 3A–G son un conjunto de diagramas de genes de ADNpTaq sintéticamente deficientes y de tipo natural.

La Fig. 4A representa el gen de la polimerasa de Thermus flavus de tipo natural.

La Fig. 4B representa el gen de la polimerasa de Thermus flavus sintéticamente deficiente.

La Fig. 5 representa una estructura que no puede ser amplificada usando ADNpTaq; esta figura muestra la SEC ID 30 N.º 17 (cebador) y la SEC ID N.º 15 (horquilla).

La Fig. 6 es un gel teñido con bromuro de etidio que demuestra los intentos por amplificar un dúplex bifurcado usando bien ADNpTaq o ADNpStf (i.e., el fragmento de Stoffel de ADNpTaq).

La Fig. 7 es un autorradiograma de un gel que analiza la escisión de un dúplex bifurcado por ADNpTaq y la falta de la escisión por ADNpStf.

35 Las Fig. 8A–B son un conjunto de autorradiogramas de geles que analizan la escisión o la falta de escisión tras la adición de diferentes componentes de reacción y el cambio de la temperatura de incubación durante los intentos por escindir un dúplex bifurcado con ADNpTaq.

Las Fig. 9A–B son un autorradiograma que muestra las reacciones de escisión reguladas con y sin cebador.

Las Fig. 10A–B son un conjunto de autorradiogramas de geles que demuestran los intentos por escindir un dúplex 40 bifurcado (con y sin cebador) con diversas ADNp.

La Fig. 11A muestra el sustrato y los oligonucleótidos [19–12 (SEC ID N.º 18) y 30–12 (SEC ID N.º 19] usados para analizar la escisión específica de los ADN de sustrato dirigida por oligonucleótidos piloto.

La Fig. 11B muestra un autorradiograma de un gel que muestra los resultados de las reacciones de escisión usando los sustratos y los oligonucleótidos mostrados en la Fig. 12A.

45 La Fig. 12A muestra el sustrato y el oligonucleótido [30–0 (SEC ID N.º 20)] usados para analizar la escisión específica de un ARN de sustrato dirigida por un oligonucleótido piloto.

La Fig. 12B muestra un autorradiograma de un gel que muestra los resultados de una reacción de escisión usando el sustrato y el oligonucleótido mostrados en la Fig. 13A.

La Fig. 13 es un diagrama del vector pTTQ18.

La Fig. 14 es un diagrama del vector pET–3c.

Las Fig. 15A–E representan un conjunto de moléculas que son sustratos adecuados para la escisión mediante la actividad nucleasa 5’ de varias ADNp (las SEC ID N.º 15 y 17 están representadas en la Fig. 15E).

La Fig. 16 es un autorradiograma de un gel que muestra los resultados de una reacción de escisión ejecutada con 5 ADNp sintéticamente deficientes.

La Fig. 17 es un autorradiograma de un cromatograma de PEI que resuelve los productos de un análisis para la actividad sintética en clones de ADNpTaq sintéticamente deficientes.

La Fig. 18A representa la molécula de sustrato (SEC ID N.º 15 y 17) usada para analizar la capacidad de las DNAp sintéticamente deficientes para escindir estructuras de horquilla cortas.

10 La Fig. 18B muestra un autorradiograma de un gel que resuelve los productos de una reacción de escisión ejecutada usando el sustrato mostrado en la Fig. 19A.

La Fig. 19 proporciona la secuencia completa del dúplex 206–mero (SEC ID N.º 27) empleada como sustrato para las nucleasas 5' de la presente invención.

Las Fig. 20A y B muestran la escisión de sustratos de ácido nucleico lineal (basados en el 206–mero de la Fig. 21) 15 por ADNp de tipo natural y nucleasas 5' aisladas de Thermus aquaticus y Thermus flavus.

La Fig. 21A muestra el fenómeno de “mordisqueado” detectado con las ADNp de la presente invención.

La Fig. 21B muestra que el “mordisqueado” de la Fig. 25A es una escisión nucleolítica 5’ y no una escisión de fosfatasa.

La Fig. 22 demuestra que el fenómeno de “mordisqueado” es dependiente del dúplex.

20 La Fig. 23 es un esquema que muestra cómo se puede emplear el “mordisqueado” en un análisis de detección.

Las Fig. 24A y B demuestran que el “mordisqueado” puede ser dirigido a una diana.

La Fig. 25 proporciona un dibujo esquemático de un ácido nucleico diana con un oligonucleótido invasor y un oligonucleótido sonda apareados a la diana.

La Fig. 26 proporciona un esquema que muestra el oligonucleótido de horquilla S–60 (SEC ID N.º 29) con el 25 oligonucleótido P–15 apareado (SEC ID N.º 30).

La Fig. 27 es un autorradiograma de un gel que muestra los resultados de una reacción de escisión ejecutada usando la horquilla S–60 en presencia o en ausencia del oligonucleótido P–15.

La Fig. 28 proporciona un esquema que muestra tres disposiciones diferentes de oligonucleótidos de diana específica y su hibridación con un ácido nucleico diana que también tiene un oligonucleótido sonda apareado al 30 mismo (SEC ID N.º 31–35).

La Fig. 29 es una imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra que la presencia de un oligonucleótido invasor produce un desplazamiento en el punto de escisión de un dúplex de sonda/diana.

La Fig. 30 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos de los análisis de la escisión dirigida por un invasor ejecutados usando los tres oligonucleótidos de diana específica que se 35 representan en la Fig. 28.

La Fig. 31 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos de análisis de la escisión dirigida por un invasor ejecutados en presencia o en ausencia de moléculas de ácido nucleico no diana.

La Fig. 32 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos de 40 análisis de la escisión dirigida por un invasor ejecutados en presencia de cantidades decrecientes de moléculas de ácido nucleico diana.

La Fig. 33 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos de análisis de la escisión dirigida por un invasor ejecutados en presencia o en ausencia de extracto de saliva usando diversas nucleasas 5’ termoestables o ADN polimerasas.

45 La Fig. 34 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos de análisis de la escisión dirigida por un invasor ejecutados usando diversas nucleasas 5‘.

La Fig. 35 es una imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos de análisis de la escisión dirigida por invasores ejecutados usando dos ácidos nucleicos diana que difieren en un solo par de bases a dos temperaturas de reacción diferentes.

La Fig. 36A proporciona un esquema que muestra el efecto de la temperatura elevada sobre el apareamiento y la escisión de un oligonucleótido sonda a lo largo de un ácido nucleico diana, conteniendo la sonda una región de no 5 complementariedad con la diana.

La Fig. 36B proporciona un esquema que muestra el efecto de añadir un oligonucleótido secuencia arriba sobre el apareamiento y la escisión de un oligonucleótido sonda a lo largo de un ácido nucleico diana, conteniendo la sonda una región de no complementariedad con la diana.

La Fig. 37 proporciona un esquema que muestra una disposición de un oligonucleótido invasor de diana específica

10 (SEC ID N.º 39) y un oligonucleótido sonda de diana específica (SEC ID N.º 38) que portan un marcador Cy3 de 5’ a lo largo de un ácido nucleico diana (SEC ID N.º 31).

La Fig. 38 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos de análisis de la escisión dirigida por un invasor ejecutados en presencia de concentraciones crecientes de KCl.

La Fig. 39 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos de

15 análisis de la escisión dirigida por un invasor ejecutados en presencia de concentraciones crecientes de MnCl2 y MgCl2.

La Fig. 40 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos de análisis de la escisión dirigida por un invasor ejecutados en presencia de concentraciones crecientes de ADN genómico o ARNt.

20 La Fig. 41 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos de análisis de la escisión dirigida por un invasor ejecutados usando una diana de ARN del VHC.

La Fig. 42 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos de análisis de la escisión dirigida por un invasor ejecutados usando una diana de ARN del VHC y demuestra la estabilidad de las dianas de ARN en condiciones de análisis de la escisión dirigida por un invasor.

25 La Fig. 43 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra la sensibilidad de la detección y la estabilidad del ARN en análisis de la escisión dirigida por un invasor ejecutados usando una diana de ARN del VHC.

La Fig. 44 es una imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra la degradación térmica de oligonucleótidos que contienen o carecen de un grupo fosfato en 3’.

30 La Fig. 45 representa la estructura de los oligonucleótidos amino–modificados 70 y 74.

La Fig. 46 representa la estructura del oligonucleótido amino–modificado 75.

La Fig. 47 representa la estructura del oligonucleótido amino–modificado 76.

La Fig. 48 es la imagen generada por un escáner generador de imágenes fluorescentes de un gel de IEF que muestra la emigración de los sustratos 70, 70dp, 74, 74dp, 75, 75dp, 76 y 76dp.

35 La Fig. 49A proporciona un esquema que muestra la disposición de un oligonucleótido invasor de diana específica (SEC ID N.º 50) y un oligonucleótido sonda de diana específica (SEC ID N.º 51) que portan un marcador Cy3 de 5’ a lo largo de un ácido nucleico diana (SEC ID N.º 52).

La Fig. 49B es la imagen generada por un generador de imágenes que muestra la detección de productos de escisión específicos generados en un análisis de escisión invasiva usando la inversión de cargas (i.e., la separación

40 basada en la carga de los productos de escisión).

La Fig. 50 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que representa la sensibilidad de la detección de productos de escisión específicos generados en un análisis de escisión invasiva usando la inversión de cargas.

La Fig. 51 representa una primera realización de un dispositivo para la separación basada en la carga de 45 oligonucleótidos.

La Fig. 52 representa una segunda realización de un dispositivo para la separación basada en la carga de oligonucleótidos.

La Fig. 53 muestra un autorradiograma de un gel que muestra los resultados de las reacciones de escisión ejecutadas en presencia o en ausencia de un oligonucleótido cebador; mostrándose una escalera de secuenciación

50 como marcador del tamaño.

Las Fig. 54A–D representan cuatro pares de oligonucleótidos; en cada par mostrado, la disposición superior de una sonda apareada con un ácido nucleico diana carece de un oligonucleótido secuencia arriba y la disposición inferior contiene un oligonucleótido secuencia arriba (las SEC ID N.º 32 y 54–58 se muestran en las Fig. 54A–D).

La Fig. 55 muestra la estructura química de varios colorantes de unión de ADN heterodiméricos cargados 5 positivamente.

La Fig. 56 es un esquema que muestra procedimientos alternativos para la prolongación y la detección de productos de escisión específicos en el contexto del análisis de la escisión dirigida por InvaderTM.

La Fig. 57 proporciona un dibujo esquemátido de un ácido nucleico diana con un oligonucleótido Invader™, una minisonda y un oligonucleótido apilador apareado a la diana.

10 La Fig. 58 proporciona un modelo de llenado de espacios de la estructura tridimensional de la exonucleasa 5’ de T5.

La Fig. 59 proporciona un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de varias nucleasas FEN–1 incluyendo la proteína FEN–1 de Methanococcus jannaschii (MJAFEN1.PRO), la proteína FEN–1 de Pyrococcus furiosus (PFUFEN1.PRO), la proteína FEN–1 humana (HUMFEN1.PRO), la proteína FEN–1 de ratón (MUSFEN1.PRO), la proteína YKL510 de Saccharomyces cerevisiae (YST510.PRO), la proteína RAD2 de Saccharomyces cerevisiae 15 (YSTRAD2.PRO), la proteína RAD13 de Shizosaccharomyces pombe (SPORAD13.PRO), la proteína XPG humana (HUMXPG.PRO), la proteína XPG de ratón (MUSXPG.PRO), la proteína XPG de Xenopus laevis (XENXPG.PRO) y la proteína RAD2 de C. elegans (CELRAD2.PRO) (SEC ID N.º 135–145, respectivamente); algunas partes de la secuencia de aminoácidos de alguna de estas proteínas no se muestran para maximizar el alineamiento entre proteínas (específicamente, se eliminaron los aminoácidos 122 a 765 de la secuencia de YSTRAD2; se eliminaron

20 los aminoácidos 122 a 746 de las secuencia de SPORAD13; se eliminaron los aminoácidos 122 a 757 de HUMXPG; se eliminaron los aminoácidos 122 a 770 de la secuencia de MUSXPG; y se eliminaron los aminoácidos de 122 a 790 de la secuencia de XENXPG). Los números de la izquierda de cada línea de secuencia se refieren al número del residuo de aminoácido; los guiones representan huecos introducidos para maximizar el alineamiento.

La Fig. 60 es un esquema que muestra el oligonucleótidos S–33 (SEC ID N.º 84) y 11–8–0 (SEC ID N.º 85) en una 25 configuración plegada; el sitio de escisión se indica con una punta de flecha.

La Fig. 61 muestra un gel de electroforesis en gel de poliacrilamida–SDS teñido con Coomassie que muestra la digestión con trombina usando trombina/BN Cleavase®.

La Fig. 62 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos mediante la escisión de la horquilla S–60 usando trombina/BN Cleavase® (antes y después de la 30 digestión con trombina).

La Fig. 63 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos mediante la escisión de ADN de M13 circular usando trombina/BN Cleavase®.

La Fig. 64 es un gel de electroforesis en gel de poliacrilamida–SDS que muestra la emigración de la nucleasa BN Cleavase® purificada, de FEN–1 de Pfu, de FEN–1 de Pwo y de FEN–1 de Mja.

35 La Fig. 65 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos por la escisión de los oligonucleótidos S–33 y 11–8–0 por las nucleasas BN Cleavase® y FEN–1 de Mja.

La Fig. 66 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos por la incubación de un oligonucleótido que bien tiene o carece de un grupo OH de 3’ con TdT.

La Fig. 67 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos 40 producidos por la incubación de productos de escisión con TdT.

La Fig. 68 es una fotografía de una tarjeta GeneComb™ universal que muestra la captura y la detección de productos de escisión sobre un soporte de nitrocelulosa.

La Fig. 69 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos usando las nucleasas A/G Cleavase® y FEN–1 de Pfu, y una sonda marcada con fluoresceína.

45 La Fig. 70 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos usando las nucleasas A/G Cleavase® y FEN–1 de Pfu, y una sonda marcada con Cy3.

La Fig. 71 es la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos usando las nucleasas A/G Cleavase® y FEN–1 de Pfu, y una sonda marcada con TET.

Las Fig. 72A y 72B son imágenes generadas por un generador de imágenes fluorescentes que muestran los 50 productos producidos usando las nucleasas A/G Cleavase® y FEN–1 de Pfu, y sondas que tienen o que carecen de una carga positiva en 5’; el gel mostrado en la Fig. 83A fue ejecutado en el sentido estándar y el gel mostrado en la

Fig. 84B fue ejecutado en el sentido inverso.

La Fig. 73 muestra la estructura de 3–nitropirrol y 5–nitroindol.

La Fig. 74 muestra la secuencia de los oligos 109, 61 y 67 (SEC ID N.º 97, 50 y 51) apareados en una estructura de escisión, así como la secuencia del oligo 67 (SEC ID N.º 51) y un compuesto de las SEC ID N.º 98, 99, 101 y 102.

5 La Fig. 75A–C muestra imágenes generadas por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos en un análisis de escisión dirigido por Invader™ realizado a diversas temperaturas usando una minisonda que bien es completamente complementaria a la diana o que contiene un solo apareamiento erróneo con la diana.

La Fig. 76 muestra la secuencia de los oligos 166 (SEC ID N.º 103), 165 (SEC ID N.º 104), 161 (SEC ID N.º 106), 10 162 (SEC ID N.º 105) y 164 (SEC ID N.º 107), así como una estructura de escisión.

La Fig. 77 muestra la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos por un análisis de escisión dirigido por Invader™ realizado usando secuencias del gen ras como diana.

Las Fig. 78A–C muestran la secuencia de la horquilla S–60 (SEC ID N.º 29) (A) y el oligo P–15 (SEC ID N.º 30) (mostrado apareado a la horquilla S–60 en B) y la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes

15 que muestra los productos producidos por la escisión de la horquilla S–60 en presencia de diversos oligos de InvaderTM.

La Fig. 79 muestra la estructura de diversos sustituyentes del extremo 3'.

La Fig. 80 es un gráfico compuesto que muestra el efecto de la concentración de sonda, la temperatura y un oligonucleótido apilador sobre la escisión de minisondas.

20 La Fig. 81 muestra la secuencia del oligonucleótido IT–2 (SEC ID N.º 115 mostrada en la configuración plegada), así como la secuencia de los oligos IT–1 (SEC ID N.º 116) e IT–A (SEC ID N.º 117).

La Fig. 82 muestra la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra los productos producidos mediante la escisión de los oligos mostrados en la Fig. 92 por la nucleasa A/G Cleavase®.

La Fig. 83 muestra la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que proporciona una 25 comparación de las velocidades de escisión de las nucleasas FEN–1 de Pfu y FEN–1 de Mja.

La Fig. 84 muestra la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que representa la detección de dianas de ARN que usan una minisonda y oligonucleótidos apilador.

Las Fig. 85A–C proporcionan esquemas que muestran realizaciones particulares de la presente invención en las que una región del promotor de T7 y un molde de copia se aparearon bien sin oligo (A), con un oligo promotor completo

30 (B) o con un oligo promotor completo con una cola 3’ (C); estando una cadena de la región del promotor de T7 indicada con una línea discontinua.

Las Fig. 86A–D proporcionan esquemas que muestran realizaciones particulares de la presente invención en las que una región del promotor de T7 y molde de copia se aparearon con bien una sonda cortada (A), un oligo promotor parcial (B), un oligo sin cortar (C) o tanto una sonda sin cortar como un oligo promotor parcial (D).

35 La Fig. 87 proporciona un esquema que ilustra una realización de la presente invención en la que se usa una ADN polimerasa dependiente del molde para ampliar una sonda cortada hasta completar una región del promotor de T7 y permitir así la transcripción.

La Fig. 88 proporciona un esquema que ilustra que una sonda sin cortar combinada con un oligo promotor parcial no permite la transcripción, mientras que una sonda cortada combinada con un oligo promotor parcial genera un

40 promotor completo (pero mellado) que permite la transcripción.

La Fig. 89 muestra la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra que se puede usar la extensión de un cebador para completar un promotor parcial formado por una sonda cortada (vías 1–5) y que el apareamiento de una sonda cortada generada en un análisis de escisión invasivo puede completar un promotor de T7 parcial para permitir la transcripción (vías 6–9).

45 Las Fig. 90A–C proporcionan esquemas que muestran las realizaciones particulares de la presente invención que ilustran que el uso de un oligo promotor parcial con una cola 5’ apareada se puede usar para bloquear la transcripción desde un promotor compuesto formado por el apareamiento de una sonda sin cortar.

La Fig. 91 muestra la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra que la transcripción desde un promotor compuesto de T7 ramificado “agujereado” se puede cerrar mediante el uso de un

50 oligo promotor parcial secuencia abajo que tenga una cola 5’ apareada.

La Fig. 92 muestra la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra que la localización del sitio de la mella en un promotor de T7 compuesto mellado puede afectar a la eficacia de la transcripción.

La Fig. 93 muestra la imagen generada por un generador de imágenes fluorescentes que muestra que la presencia de una cola 3’ sin aparear sobre un oligo promotor de longitud completa disminuye pero no suprime la transcripción. 5 Bajo la imagen hay esquemas que muestran los ácidos nucleicos analizados en las reacciones 1–4; estos esquemas muestran las SEC ID N.º 123–125.

La Fig. 94 es un esquema que ilustra una realización de la presente invención en la que se crea una región del promotor de T7 compuesto mediante la unión del oligo sonda cortado secuencia abajo del oligo promotor parcial.

Las Fig. 95A–D proporcionan esquemas que muestran realizaciones particulares de la presente invención que

10 muestran diversos modos en los que se puede formar un promotor compuesto, estando la mella localizada en la cadena del molde (o inferior).

Definiciones

Como se usan en la presente memoria, los términos “complementario” o “complementariedad” se usan en referencia a polinucleótidos (i.e., una secuencia de nucleótidos tal como un oligonucleótido o un ácido nucleico diana) 15 relacionados por las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia “A–G–T” es complementaria a la secuencia “T–C–A”. La complementariedad puede ser “parcial”, en la que sólo algunas de las bases de ácidos nucleicos están apareadas según las reglas de apareamiento de bases. O, puede haber una complementariedad “completa” o “total” entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficacia y la fuerza de hibridación entre las cadenas de ácido nucleico. Esto es

20 de particular importancia en las reacciones de amplificación, así como en los procedimientos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos.

El término “homología” se refiere a un grado de identidad. Puede haber una homología parcial o una homología completa. Una secuencia parcialmente idéntica es una que es menos del 100% idéntica a otra secuencia.

Como se usa en la presente memoria, el término “hibridación” se usa en referencia al apareamiento de ácidos

25 nucleicos complementarios. La hibridación y la fuerza de hibridación (i.e., la fuerza de asociación entre los ácidos nucleicos) se ve afectada por factores tales como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, el carácter restrictivo de las condiciones implicadas, la Tf del híbrido formado y la proporción de G:C en los ácidos nucleicos.

Como se usa en la presente memoria, el término “Tf” se usa en referencia a la “temperatura de fusión”. La

30 temperatura de fusión es la temperatura a la que una población de moléculas de ácido nucleico bicatenario se disocian en cadenas simples. La ecuación para calcular la Tf de los ácidos nucleicos es conocida en la técnica. Según lo indicado por referencias estándar, es posible hacer una estimación simple del valor de la Tf mediante la ecuación: Tf = 81,5 + 0,41(% G+C), cuando un ácido nucleico está en disolución acuosa a NaCl 1M (véase, p. ej., Anderson y Young. “Quantitative Filter Hybridization in Nucleic Acid Hybridization” (1985). Otras referencias incluyen

35 cálculos más sofisticados que tienen en cuenta características estructurales así como secuenciales para el cálculo de la Tf.

Como se usa en la presente memoria, el término “carácter restrictivo” se usa en referencia a las condiciones de temperatura, fuerza iónica y la presencia de otros compuestos, en las que se realizan las hibridaciones de ácidos nucleicos. Con condiciones “muy restrictivas”, el apareamiento de bases de ácido nucleico sólo tendrá lugar entre

40 fragmentos de ácido nucleico que tengan una frecuencia elevada de secuencias de bases complementarias. De este modo, las condiciones “débilmente” o “poco” restrictivas se requieren habitualmente cuando se desea que los ácidos nucleicos que no son completamente complementarios entre sí se hibriden o se apareen.

El término “gen” se refiere a una secuencia de ADN que comprende secuencias control y codificantes necesarias para la producción de un polipéptido o un precursor. El polipéptido puede estar codificado por una secuencia

45 codificante de longitud completa o por cualquier parte de la secuencia codificante, siempre y cuando se conserve la actividad enzimática deseada.

El término “tipo natural” se refiere a un gen o a un producto génico que tiene las características de ese gen o producto génico cuando se aísla de una fuente natural. Un gen de tipo natural es el que se observa con mayor frecuencia en una población, designándose por tanto arbitrariamente como la forma “normal” o “de tipo natural” del

50 gen. Por el contrario, el término “modificado” o “mutante” se refiere a un gen o un producto génico que presenta modificaciones en la secuencia y/o las propiedades funcionales (i.e., características modificadas) si se compara con el gen o el producto génico de tipo natural. Obsérvese que los mutantes naturales se pueden aislar; estando éstos identificados por el hecho de que tienen características modificadas en comparación con el gen o el producto génico de tipo natural.

55 El término “vector de ADN recombinante”, como se usa en la presente memoria, se refiere a secuencias de ADN que contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de ADN apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida operativamente en un determinado organismo huésped. Las secuencias de ADN necesarias para la expresión en procariotas incluyen un promotor, opcionalmente, una secuencia operadora, un sitio de unión al ribosoma y, posiblemente, otras secuencias. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

5 El término “LTR”, como se usa en la presente memoria, se refiere a la repetición terminal larga encontrada en cada extremo de un provirus (i.e., la forma integrada de un retrovirus). La LTR contiene numerosas señales reguladoras que incluyen elementos de control transcripcional, señales de poliadenilación y secuencias necesarias para la replicación y la integración del genoma vírico. La LTR vírica se divide en tres regiones denominadas U3, R y U5.

La región U3 contiene el potenciador y los elementos promotores. La región U5 contiene las señales de

10 poliadenilación. La región R (repetición) separa las regiones U3 y U5, y las secuencias transcritas de la región R aparecen en ambos extremos 5’ y 3’ del ARN vírico.

El término “oligonucleótido”, como se usa en la presente memoria, se define como una molécula compuesta por dos

o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos , preferiblemente, al menos 5 nucleótidos, más preferiblemente, al menos aproximadamente 10–15 nucleótidos, y más preferiblemente, al menos aproximadamente de 15 a 30

15 nucleótidos. El tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de la función final o del uso del oligonucleótido. El oligonucleótido puede ser generado de cualquier manera, incluyendo síntesis química, replicación de ADN, transcripción inversa o una combinación de las mismas.

Como los mononucleótidos se hacen reaccionar para formar oligonucleótidos de una manera tal que el fosfato 5’ de un anillo de pentosa de mononucleótido se una al oxígeno 3’ de su vecino en un sentido mediante un enlace 20 fosfodiéster, un extremo de un oligonucleótido se denomina el “extremo 5’” si su fosfato 5’ no está unido al oxígeno 3’ de un anillo de penosa de mononucleótido, y “extremo 3’” si su oxígeno 3’ no está unido a un fosfato 5’ de un anillo de pentosa de mononucleótido posterior. Como se usa en la presente memoria, una secuencia de ácidos nucleicos, incluso una perteneciente a un oligonucleótido más largo, también se puede decir que tiene extremos 5’ y 3’. Una primera región de una cadena de ácido nucleico se dice que está secuencia arriba de otra región si el

25 extremo 3' de la primera región está antes del extremo 5' de la segunda región, moviéndose a lo largo de una cadena de ácido nucleico en el sentido de 5’ a 3’.

Cuando dos oligonucleótidos diferentes no solapantes se aparean a diferentes regiones de la misma secuencia de ácido nucleico complementaria lineal, y el extremo 3' de uno de los oligonucleótidos señala hacia el extremo 5' del otro, el primero se puede denominar oligonucleótido de “secuencia arriba” y el último oligonucleótido de “secuencia

30 abajo”.

El término “cebador” se refiere a un oligonucleótido que es capaz de actuar como punto de iniciación de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que se inicie una prolongación del cebador. Un oligonucleótido “cebador” puede ser natural, como en un digesto de restricción purificado, o puede ser producido sintéticamente.

Un cebador se selecciona para que sea “sustancialmente” complementario a una cadena de secuencia específica

35 del molde. Un cebador debe ser suficientemente complementario como para hibridarse con una cadena molde para que tenga lugar el alargamiento del cebador. Una secuencia de cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, se puede unir un fragmento de nucleótidos no complementario al extremo 5’ del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador sustancialmente complementaria a la cadena. Se pueden intercalar bases o secuencias más largas no complementarias en el cebador, siempre y cuando la secuencia del cebador tenga

40 suficiente complementariedad con la secuencia del molde para hibridarse y formar así un complejo de molde– cebador para la síntesis del producto de prolongación del cebador.

Los procedimientos de “hibridación” implican el apareamiento de una secuencia complementaria al ácido nucleico diana (la secuencia por ser detectada; la detección de esta secuencia puede ser por cualquier procedimiento directo

o indirecto). La capacidad de dos polímeros de ácido nucleico que contienen secuencias complementarias de

45 encontrarse entre sí y aparearse a través de interacciones de apareamiento de bases es un fenómeno ampliamente reconocido. Las observaciones iniciales del procedimiento de “hibridación” realizadas por Marmur y Lane. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 46:453 (1960) y Doty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 46:461 (1960) han sido seguidas por el perfeccionamiento de este procedimiento en una herramienta esencial para la Biología moderna.

Con respecto a la complementariedad, es importante para algunas aplicaciones de diagnóstico determinar si la

50 hibridación representa una complementariedad completa o parcial. Por ejemplo, si simplemente se desea detectar la presencia o la ausencia de ADN patógeno (tal como el procedente de un virus, una bacteria, un hongo, un micoplasma, un protozoo), sólo es importante que el procedimiento de hibridación garantice la hibridación cuando la secuencia relevante esté presente, pudiéndose seleccionar las condiciones cuando las sondas tanto parcialmente complementarias como completamente complementarias se hibriden. Otras aplicaciones de diagnóstico, sin

55 embargo, pueden requerir que el procedimiento de hibridación distinga entre una complementariedad parcial y completa. Puede ser de interés detectar polimorfismos genéticos. Por ejemplo, la hemoglobina humana está compuesta, en parte, por cuatro cadenas polipeptídicas. Dos de estas cadenas son cadenas idénticas de 141 aminoácidos (cadenas alfa) y dos de estas cadenas son cadenas idénticas de 146 aminoácidos (cadenas beta). Se sabe que el gen codificante de la cadena beta presenta polimorfismo. El alelo normal codifica una cadena beta que tiene ácido glutámico en la sexta posición. El alelo mutante codifica una cadena beta que tiene valina en la sexta posición. Esta diferencia en los aminoácidos tiene un profundo (más profundo cuando el individuo es homocigótico para el alelo mutante) impacto fisiológico conocido clínicamente como anemia falciforme. Se sabe que la base

5 genética del cambio de los aminoácidos implica la diferencia de una sola base entre la secuencia de ADN alélico normal y la secuencia de ADN alélico mutante.

El complemento de una secuencia de ácido nucleico, como se usa en la presente memoria, se refiere a un oligonucleótido que, cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico tal que el extremo 5' de una secuencia está apareado con el extremo 3' de la otra, está en “asociación antiparalela”. Ciertas bases que no se encuentran 10 comúnmente en los ácidos nucleicos naturales pueden estar incluidas en los ácidos nucleicos de la presente invención e incluyen, por ejemplo, inosina y 7–deazaguanina. La complementariedad no necesita ser perfecta. Los dúplex estables pueden contener pares de bases apareadas erróneamente o bases sin aparear. Los expertos en la técnica de la tecnología de ácidos nucleicos pueden determinar la estabilidad de los dúplex empíricamente considerando un número de variables, incluyendo, por ejemplo, la longitud del oligonucleótido, la composición de las

15 bases y la secuencia del oligonucleótido, la fuerza iónica y la incidencia de los pares de bases apareados erróneamente.

La estabilidad de un dúplex de ácido nucleico se mide por la temperatura de fusión o “Tf”. La Tf de un determinado dúplex de ácido nucleico en condiciones especificadas es la temperatura a la que como media la mitad de los pares de bases se han disociado.

20 El término “marcador”, como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier átomo o molécula que se pueda usar para proporcionar una señal detectable (preferiblemente, cuantificable), y que se pueda unir a un ácido nucleico

o a una proteína. Los marcadores pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radiactividad, colorometría, gravimetría, difracción o absorción de rayos X, magnetismo, actividad enzimática y similares. Un marcador puede ser un resto cargado (carga positiva o negativa) o, alternativamente, puede ser una carga neutra.

25 El término “estructura de escisión”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una estructura que se forma mediante la interacción de un oligonucleótido sonda y un ácido nucleico diana para formar un dúplex, siendo dicha estructura resultante escindible por un medio de escisión, incluyendo pero no limitándose a una enzima. La estructura de escisión es un sustrato para la escisión específica por dicho medio de escisión, al contrario de una molécula de ácido nucleico, que es un sustrato para la escisión inespecífica por agentes tales como fosfodiesterasas

30 que escinden moléculas de ácido nucleico sin considerar la estructura secundaria (i.e., sin requerirse la formación de una estructura de dúplex).

El término “medio de escisión”, como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier medio que sea capaz de escindir una estructura de escisión, incluyendo pero no limitándose a enzimas. El medio de escisión puede incluir ADNp nativas que tengan actividad nucleasa 5’ (p. ej., ADN polimerasa de Taq, ADN polimerasa I de E. coli) y, más 35 específicamente, ADNp modificadas que tengan nucleasa 5’ pero que carezcan de actividad sintética. La capacidad de las nucleasas 5' para escindir estructuras naturales en moldes de ácido nucleico (escisión de estructura específica) es útil para detectar diferencias secuenciales internas en los ácidos nucleicos sin un conocimiento previo de la secuencia específica del ácido nucleico. De esta manera, son enzimas de estructura específica. “Las nucleasas de estructura específica” o “enzimas de estructura específica” son enzimas que reconocen las estructuras

40 secundarias específicas de una molécula nucleica y escinden estas estructuras. El medio de escisión de la invención escinde una molécula de ácido nucleico como respuesta a la formación de estructuras de escisión, no siendo necesario que el medio de escisión escinda la estructura de escisión en algún punto concreto de la estructura de escisión.

El medio de escisión no está restringido a las enzimas que tienen únicamente actividad nucleasa 5’. El medio de

45 escisión puede incluir actividad nucleasa proporcionada por una variedad de fuentes que incluyen las enzimas Cleavase®, las endonucleasas FEN–1 (incluyendo las proteínas RAD2 y XPG), la ADN polimerasa de Taq y la ADN polimerasa I de E. coli.

El término “termoestable” cuando se usa en referencia a una enzima tal como una nucleasa 5’, indica que la enzima es funcional o activa (i.e., puede realizar una catálisis) a una temperatura elevada, i.e., a aproximadamente 55°C o

50 más.

El término “productos de escisión”, como se usa en la presente memoria, se refiere a productos generados por la reacción de un medio de escisión con una estructura de escisión (i.e., el tratamiento de una estructura de escisión con un medio de escisión).

El término “ácido nucleico diana” se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia que tiene

55 al menos una complementariedad parcial con al menos un oligonucleótido sonda y que puede tener también al menos una complementariedad parcial con un oligonucleótido invasor. El ácido nucleico diana puede comprender ADN o ARN monocatenario o bicatenario.

El término “oligonucleótido sonda” se refiere a oligonucleótido que interactúa con un ácido nucleico diana para formar una estructura de escisión en presencia o en ausencia de un oligonucleótido invasor. Cuando se aparea con el ácido nucleico diana, el oligonucleótido sonda y la diana forman una estructura de escisión y se produce la escisión dentro del oligonucleótido sonda. En presencia de un oligonucleótido invasor secuencia arriba del oligonucleótido sonda a lo largo del ácido nucleico diana, el sitio de escisión se desplazará dentro del oligonucleótido

5 sonda (en relación con el punto de escisión en ausencia del invasor).

El término “producto de escisión no diana” se refiere a un producto de una reacción de escisión que no deriva del ácido nucleico diana. Según lo descrito anteriormente, en los procedimientos de la presente invención, la escisión de la estructura de escisión tiene lugar dentro del oligonucleótido sonda. Los fragmentos del oligonucleótido sonda generados por esta escisión dependiente del ácido nucleico diana son “productos de escisión no diana”.

10 El término “oligonucleótido invasor” se refiere a un oligonucleótido que contiene secuencias en su extremo 3' que son sustancialmente iguales a las secuencias localizadas en el extremo 5' de un oligonucleótido sonda, compitiendo estas regiones por la hibridación con el mismo segmento de un ácido nucleico diana complementario.

El término “sustancialmente monocatenario”, cuando se usa en referencia a un sustrato de ácido nucleico, significa que la molécula sustrato existe principalmente como una cadena simple de ácido nucleico, a diferencia de una

15 sustrato bicatenario, que existe como dos cadenas de ácido nucleico que se mantienen unidas mediante interacciones de apareamiento de bases entre las cadenas.

El término “variación secuencial”, como se usa en la presente memoria, se refiere a diferencias en la secuencia de ácido nucleico entre dos ácidos nucleicos. Por ejemplo, un gen estructural de tipo natural y una forma mutante de este gen estructural de tipo natural pueden variar en secuencia por la presencia de sustituciones de una sola base

20 y/o eliminaciones o inserciones de uno o más nucleótidos. Estas dos formas del gen estructural se dice que varían secuencialmente entre sí. Puede existir una segunda forma mutante del gen estructural. Esta segunda forma mutante se dice que varía secuencialmente con respecto tanto al gen de tipo natural como a la primera forma mutante del gen.

El término “liberar”, como se usa en la presente memoria, se refiere a la liberación de un fragmento de ácido

25 nucleico de un fragmento de ácido nucleico más largo, tal como un oligonucleótido, por la acción de una nucleasa 5’ tal que el fragmento liberado ya no esté unido covalentemente con el resto del oligonucleótido.

El término “Km”, como se usa en la presente memoria, se refiere a la constante de Michaelis–Menten para una enzima y se define como la concentración del sustrato específico en el que una enzima dada tiene un rendimiento de la mitad de su velocidad máxima en una reacción catalizada enzimáticamente.

30 El término “análogo de nucleótido”, como se usa en la presente memoria, se refiere a nucleótidos modificados o no naturales tales como 7–deaza–purinas (i.e., 7–deaza–dATP y 7–deaza–dGTP). Los análogos de nucleótido incluyen análogos de bases y comprenden formas modificadas de desoxirribonucleótidos, así como ribonucleótidos.

El término “locus polimórfico” es un locus presente en una población que muestra una variación entre los miembros de la población (i.e., el alelo más común tiene una frecuencia de menos de 0,95). Por el contrario, un “locus

35 monomórfico” es un locus genético con pocas o ninguna variación observada entre los miembros de la población (generalmente, se considera que es un locus en el que el alelo más común supera una frecuencia de 0,95 en la mezcla de genes de la población).

El término “microorganismo”, como se usa en la presente memoria, significa un organismo demasiado pequeño como para poder ser observado a simple vista, e incluye, pero no se limita a, bacterias, virus, protozoos, hongos y

40 microorganismos ciliares.

El término “secuencias de genes microbianos” se refiere a secuencias de genes derivadas de un microorganismo.

El término “bacteria” se refiere a cualquier especie bacteriana, incluyendo especies eubactarianas y arcaebacterianas.

El término “virus” se refiere a parásitos intracelulares ultramicroscópicos obligatorios incapaces de realizar una 45 replicación autónoma (i.e., la replicación requiere el uso de la maquinaria de la célula huésped).

El término “multi–farmacológicamente resistente” o “resistente a múltiples fármacos” se refiere a un microorganismo que es resistente a más de uno de los antibióticos o agentes antimicrobianos usados en el tratamiento de dicho microorganismo.

El término “muestra” en la presente memoria y las reivindicaciones se usa en su sentido más amplio. Por un lado,

50 pretende incluir un espécimen o un cultivo (p.ej., cultivos microbiológicos). Por otro lado, pretende incluir tanto muestras biológicas como ambientales.

Las muestras biológicas pueden ser animales, incluyendo de seres humanos, fluidos, sólidos (p. ej., deposición) o titulares, así como alimentos, o productos alimentarios e ingredientes líquidos y sólidos, tales como productos lácteos, vegetales, cárnicos y subproductos cárnicos, y desechos. Las muestras biológicas se pueden obtener de entre todo tipo de las diversas familias de animales domésticos, así como, de animales asilvestrados o salvajes, incluyendo, pero no limitándose a animales tales como ungulados, oso, peces, lagamorfos y roedores, etc.

Las muestras ambientales incluyen material ambiental tales como muestras de materia superficial, suelo, agua e industriales, así como muestras obtenidas de instrumentos, aparatos, equipos, utensilios, elementos desechables y 5 no desechables de procesamiento de alimentos y lácteos. Estos ejemplos no pretenden limitar los tipos de muestras aplicables a la presente invención.

El término “fuente del ácido nucleico diana” se refiere a cualquier muestra que contenga ácidos nucleicos (ARN o ADN). Las fuentes de ácidos nucleicos diana particularmente preferidas son muestras biológicas que incluyen, pero no se limitan a, sangre, saliva, fluido cerebroespinal, fluido pleural, leche, linfa, esputo y semen.

10 Se dice que un oligonucleótido está presente en “exceso” en relación con otro oligonucleótido (o secuencia de ácido nucleico diana) si ese oligonucleótido está presente a una concentración molar superior que el otro oligonucleótido (o secuencia de ácido nucleico diana). Cuando hay un oligonucleótido, tal como un oligonucleótido sonda, presente en una reacción de escisión en exceso en relación con la concentración de la secuencia de ácido nucleico diana complementaria, se puede usar la reacción para indicar la cantidad del ácido nucleico diana presente. Comúnmente,

15 cuando está presente en exceso, el oligonucleótido sonda estará presente en un exceso de al menos 100 veces mayor; comúnmente, se usaría al menos 1 pmol de cada oligonucleótido sonda cuando la secuencia de ácido nucleico diana estuviera presente a aproximadamente 10 fmoles o menos.

Una muestra “sospechosa de contener” un primer y un segundo ácido nucleico diana puede contener bien ambas o ninguna molécula de ácido nucleico diana.

20 El término oligonucleótido “de carga equilibrada” se refiere a un oligonucleótido (el oligonucleótido de entrada de una reacción) que ha sido modificado tal que el oligonucleótido modificado lleva una carga, tal que cuando el oligonucleótido modificado es bien escindido (i.e., acortado) o alargado, un producto resultante lleva una carga diferente del oligonucleótido de entrada (el oligonucleótido “de carga desequilibrada”), permitiendo así la separación de los oligonucleótidos de entrada y reaccionado en base a la carga. El término “de carga equilibrada” no implica

25 que el oligonucleótido modificado o equilibrado tenga una carga neutra neta (aunque puede ser el caso). Equilibrio de cargas se refiere al diseño y a la modificación de un oligonucleótido tal que se pueda separar un producto de reacción específico generado a partir de este oligonucleótido de entrada en base a la carga del oligonucleótido de entrada.

Por ejemplo, en un análisis de la escisión dirigida por un invasor en el que el oligonucleótido sonda lleva la

30 secuencia: 5'–TTCTTTTCACCAGCGAGACGGG–3’ (i.e., SEC ID N.º 50 sin las bases modificadas) y la escisión de la sonda tiene lugar entre el segundo y el tercer residuo, una versión de carga equilibrada posible de este oligonucleótido sería: 5'–Cy3–AminoT–Amino–TCTTTTCACCAGCGAGAC GGG–3’. Este oligonucleótido modificado lleva una carga negativa neta. Tras la escisión, se generan los siguientes oligonucleótidos: 5'–Cy3–AminoT–Amino– T–3’ y 5'–CTTTTCACCAGCGAGACGGG–3’ (residuos 3–22 de SEC ID N.º 50). 5'–Cy3–AminoT–Amino–T–3’ lleva

35 un resto detectable (un colorante de Cy3 cargado positivamente) y dos bases amino–modificadas. Las bases amino– modificadas y el colorante de Cy3 aportan las cargas positivas en exceso de las cargas negativas aportadas por los grupos fosfato y así el oligonucleótido 5'–Cy3–AminoT–Amino–T–3’ tiene una carga positiva neta. El otro fragmento de escisión más largo, como la sonda de entrada, porta una carga negativa neta. Como el fragmento 5’–Cy3– AminoT–Amino–T–3’ es separable en base a la carga de la sonda de entrada (el oligonucleótido de carga

40 equilibrada), se denomina oligonucleótido desequilibrado. El producto de escisión más largo no puede ser separado en base a la carga del oligonucleótido de entrada, pues ambos oligonucleótidos portan una carga negativa neta; de este modo, el producto de escisión más largo no es un oligonucleótido de carga desequilibrada.

El término “carga neutra neta”, cuando se usa en referencia a un oligonucleótido, incluyendo oligonucleótidos modificados, indica que la suma de las cargas presentes (i.e., grupos R–NH3+ sobre timidinas, el nitrógeno N3 de

45 citosina, la presencia o ausencia de de grupos fosfato, etc.) en las condiciones de reacción deseadas es esencialmente cero. Un oligonucleótido con una carga neutra neta no emigraría en un campo eléctrico.

El término “carga positiva neta”, cuando se usa en referencia a un oligonucleótido, incluyendo oligonucleótidos modificados, indica que la suma de las cargas presentes (i.e., grupos R–NH3+ sobre timidinas, el nitrógeno N3 de citosina, la presencia o ausencia de de grupos fosfato, etc.) en las condiciones de reacción deseadas es +1 o mayor.

50 Un oligonucleótido con una carga positiva neta emigraría hacia el electrodo negativo en un campo eléctrico.

El término “carga negativa neta”, cuando se usa en referencia a un oligonucleótido, incluyendo oligonucleótidos modificados, indica que la suma de las cargas presentes (i.e., grupos R–NH3+ sobre timidinas, el nitrógeno N3 de citosina, la presencia o ausencia de de grupos fosfato, etc.) en las condiciones de reacción deseadas es –1 o menor. Un oligonucleótido con una carga negativa neta emigraría hacia el electrodo positivo en un campo eléctrico.

55 El término “medio de polimerización” se refiere a cualquier agente capaz de facilitar la adición de nucleósidos trifosfato a un oligonucleótido. El medio de polimerización comprende ADN polimerasas.

El término “medio de unión” se refiere a cualquier agente capaz de facilitar la unión (i.e., la formación de un enlace tipo fosfodiéster entre un OH de 3’ y un P de 5’ localizados en los terminales de dos cadenas de ácido nucleico). El medio de unión preferido comprende ADN ligasas y ARN ligasas.

El término “reactivo” se usa en la presente memoria en su sentido más amplio. El reactivo puede comprender un reactivo enzimático, un reactivo químico o una luz ultravioleta (la luz ultravioleta, particularmente, la luz ultravioleta

5 de longitud de onda corta es conocida por romper las cadenas de oligonucleótido). Cualquier agente capaz de reaccionar con un oligonucleótido para bien acortar (i.e., escindir) o alargar el oligonucleótido está englobado en el término de “reactivo”.

El término “aducto” se usa en la presente memoria en su sentido más amplio para indicar cualquier compuesto o elemento que se puede añadir a un oligonucleótido. Un aducto puede estar cargado (positiva o negativamente) o 10 puede ser de carga neutra. Los aductos se pueden añadir a los oligonucleótidos mediante enlaces covalentes o no covalentes. Los ejemplos de aductos incluyen, pero no se limitan a, colorantes de indodicarbocianina (p. ej., Cy3 y Cy5), nucleótidos amino–sustituidos, bromuro de etidio, homodímero de etidio, (1,3–propandiamin)propidio, (dietilentriamin)propidio, naranja de tiazol, naranja de tiazol de (N–N’–tetrametil–1,3–propandiamin)propilo, naranja de tiazol de (N–N’–tetrametil–1,2–etandiamin)propilo, homodímero de naranja de tiazol–naranja de tiazol (TOTO),

15 heterodímero de naranja de tiazol–azul de tiazol (TOTAB), heterodímero 1 de naranja de tiazol–etidio (TOED1), heterodímero 2 de naranja de tiazol–etidio (TOED2) y heterodímero de fluoresceína–etidio (FED), psoralenos, biotina, estraptavidina, avidina, etc.

Cuando un primer oligonucleótido es complementario a una región de un ácido nucleico diana y un segundo oligonucleótido tiene una complementariedad con la misma región (o una parte de esta región), existe una “región de

20 solapamiento” a lo largo del ácido nucleico diana. El grado de solapamiento variará en función de la naturaleza de la complementariedad (véase, p.ej., la región “X” de las Fig. 25 y 56, y las explicaciones que las acompañan).

Como se usa en la presente memoria, el término “purificada” o “purificar” se refiere a la eliminación de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, las nucleasas Cleavase® recombinantes se expresan en células huésped bacterianas y las nucleasas se purifican mediante la eliminación de las proteínas de la célula huésped,

25 aumentándose así el porcentaje de estas nucleasas recombinantes en la muestra.

El término “molécula de ADN recombinante”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de ADN que está compuesta por segmentos de ADN unidos por medio de técnicas de Biología Molecular.

El término “proteína recombinante” o “polipéptido recombinante”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de proteína que se expresa a partir de una molécula de ADN recombinante.

30 Como se usa en la presente memoria, el término “parte” en referencia a una proteína (como en “una parte de una proteína dada”) se refiere a fragmentos de esa proteína. Los fragmentos pueden variar en tamaño de cuatro residuos de aminoácido a toda la secuencia de ácido nucleico menos un aminoácido.

La “secuencia de ácido nucleico”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un oligonucleótido, nucleótido o polinucleótido, y a fragmentos o partes de los mismos, y a ADN o ARN de origen genómico o sintético que puede ser

35 mono o bicatenario, y representan la cadena sentido o antisentido. De manera similar, “secuencia de aminoácidos”, como se usa en la presente memoria, se refiere a secuencia peptídica o proteínica.

“Ácido nucleico peptídico” (“ANP”), como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula que comprende un oligómero al que se ha añadido un residuo de aminoácido, tal como lisina, y un grupo amino. Estas moléculas pequeñas, también denominadas agentes antigénicos, detienen el alargamiento de transcriptos uniéndose a su

40 cadena complementaria de ácido nucleico [Nielsen PE et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53–63].

Como se usan en la presente memoria, los términos “purificadas” o “sustancialmente purificadas” se refieren a moléculas, bien secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos, que son eliminadas de su medio natural, aisladas o separadas, y que están al menos un 60% libres, preferiblemente, un 75% libres, y más preferiblemente, un 90% libres de otros componentes con los que están asociadas de manera natural. Un “polinucleótido aislado” o un

45 “oligonucleótido aislado” es por tanto un polinucleótido sustancialmente purificado.

Un oligonucleótido (o un polinucleótido) aislado codificante de una endonucleasa FEN–1 de Pyrococcus woesei (Pwo) que tiene una región capaz de hibridarse con SEC ID N.º 80 es un oligonucleótido que contiene secuencias codificantes de al menos la parte amino–terminal de la endonucleasa FEN–1 de Pwo. Un oligonucleótido (o un polinucleótido) aislado codificante de una endonucleasa FEN–1 de Pwo que tiene una región capaz de hibridarse 50 con SEC ID N.º 81 es un oligonucleótido que contiene secuencias codificantes de al menos la parte carboxi–terminal de la endonucleasa FEN–1 de Pwo. Un oligonucleótido (o un polinucleótido) aislado codificante de una endonucleasa FEN–1 de Pwo que tiene una región capaz de hibridarse con SEC ID N.º 82 y 83 es un oligonucleótido que contiene secuencias codificantes de al menos partes de la proteína endonucleasa FEN–1 de Pwo localizada internamente en bien el terminal amino o el terminal carboxilo de la proteína endonucleasa FEN–1 de

55 Pwo.

Como se usa en la presente memoria, el término “proteína de fusión” se refiere a una proteína quimérica que contiene la proteína de interés (i.e., la nucleasa trombina/BN Cleavase® y partes o fragmentos de la misma) unida a un fragmento de proteína exógena (la pareja de fusión que está constituida por una proteína no trombina/BN Cleavase®). La pareja de fusión puede aumentar la solubilidad de la proteína quimérica recombinante (p.ej., la nucleasa trombina/BN Cleavase®) como la expresada en una célula huésped, puede proporcionar una etiqueta de

5 afinidad (p.ej., una etiqueta his) para permitir la purificación de la proteína de fusión recombinante de la célula huésped o el sobrenadante tisular, o ambos. Si se desea, es posible retirar la proteína de fusión de la proteína de interés (p.ej., la nucleasa trombina/BN Cleavase® o fragmentos de la misma) mediante una variedad de procedimientos enzimáticos y químicos conocidos en la técnica.

El término “endonucleasa FEN–1 de Pfu purificada que tiene un peso molecular de aproximadamente 38,7

10 kilodaltons” se refiere a una endonucleasa FEN–1 aislada de Pyrococcus woesei que tiene un peso molecular sobre geles de electroforesis en gel de poliacrilamida–SDS de aproximadamente 38,7 kDa, cuando la electroforesis en gel de poliacrilamida–SDS se realiza en las condiciones descritas en el Ej. 28. Los expertos en la técnica entienden que la misma preparación de proteína aplicada a geles separados de aparentemente la misma composición puede producir pesos moleculares estimados que varían algo de uno a otro (aproximadamente del 5–15%).

15 El término “cadena continua de ácido nucleico”, como se usa en la presente memoria, significa una cadena de ácido nucleico que tiene una estructura de esqueleto continua unida covalentemente sin mellas ni otras interrupciones. La disposición de la parte de bases de cada nucleótido, bien apareada, monocatenaria o apareada erróneamente, no es un elemento en la definición de una cadena continua. El esqueleto de la cadena continua no está limitado a las composiciones de ribosa–fosfato o al desoxirribosa–fosfato que se encuentran en los ácidos nucleicos sin modificar

20 naturales. Un ácido nucleico de la presente invención puede comprender modificaciones en la estructura del esqueleto, incluyendo pero no limitándose a residuos de fosforotioato, residuos de fosfonato, residuos de ribosa 2’ sustituida (p.ej., 2’–O–metil–ribosa) y residuos que contienen azúcares alternativos (p.ej., arabinosa).

El término “dúplex continuo”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una región de un ácido nucleico bicatenario en la que no hay interrupción en la progresión de los pares de bases del dúplex, i.e., los pares de bases

25 del dúplex no están deformados para albergar un hueco, un bulto o un apareamiento erróneo con los límites de la región dúplex continua. Como se usa en la presente memoria, el término sólo se refiere a la disposición de los pares de bases dentro del dúplex, sin la implicación de continuidad en la parte del esqueleto de la cadena de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos del dúplex con apareamiento de bases ininterrumpido, pero con mellas en una o ambas cadenas pertenecen a la definición de un dúplex continuo.

30 El término “dúplex” se refiere al estado de los ácidos nucleicos en los que las partes de bases de los nucleótidos de una cadena están unidas a través de enlaces de hidrógeno a sus bases complementarias dispuestas sobre una segunda cadena. La condición de estar en una forma de dúplex se refleja en el estado de las bases de un ácido nucleico. En virtud del apareamiento de bases, las cadenas del ácido nucleico también adoptan generalmente la estructura terciaria de una doble hélice, que tienen una muesca mayor o menor. La adopción de la forma helicoidal

35 es implícita al hecho de convertirse en un dúplex.

El término “unión proteínica dependiente de un dúplex” se refiere a la unión proteínica al ácido nucleico que es dependiente de que el ácido nucleico esté en una forma de dúplex o helicoidal.

El término “sitios o regiones de unión proteínica dependientes de un dúplex”, como se usa en la presente memoria, se refiere a regiones o secuencias diferenciadas de un ácido nucleico que están unidas con una determinada

40 afinidad por proteínas específicas de unión a ácidos nucleicos dependientes de un dúplex. Esto se diferencia de la unión generalizada dependiente de un dúplex de proteínas que no son específicas de sitio, tales como las proteínas histonas que se unen a cromatina con poca referencia a secuencias o sitios específicos.

El término “región de unión proteínica”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una región de ácido nucleico identificada por una secuencia o una estructura que se une a una determinada proteína o clase de

45 proteínas. Pertenece al ámbito de esta definición incluir aquellas regiones que contienen suficiente información genética como para permitir identificaciones de la región por comparación con secuencias conocidas, pero que podrían no tener la estructura necesaria para una unión real (p. ej., una cadena simple de un sitio proteínico de unión a un ácido nucleico dependiente de un dúplex). Como se usa en la presente memoria, “región de unión proteínica” excluye las regiones de unión de las endonucleasas de restricción.

50 El término “región de unión de un proteína bicatenaria completa”, como se usa en la presente memoria, se refiere a la mínima región de dúplex continuo necesaria para permitir la unión u otra actividad de una proteína dependiente de un dúplex. Esta definición pretende englobar la observación de que algunas proteínas de unión a ácidos nucleicos dependientes de un dúplex pueden interactuar con actividad completa con regiones de dúplex que pueden ser más cortas que una región de unión proteínica canónica como se observa en una o la otra de las dos cadenas simples.

55 En otras palabras, es posible permitir que uno o más nucleótidos de la región no se apareen sin que por ello se suprima la unión. Como se usa en la presente memoria, el término “región de unión bicatenaria completa” se refiere a la secuencia mínima que albergará la función de unión. Como algunas de tales regiones pueden tolerar secuencias de no dúplex en múltiples lugares, aunque no necesariamente simultáneamente, una sola región de unión proteínica podría tener varias sub–regiones más cortas que, cuando formaran un dúplex, serían completamente competentes para la unión proteínica.

El término “molde” se refiere a una cadena de ácido nucleico sobre la que se construye una copia complementaria procedente de nucleósidos trifosfato a través de la actividad de una polimerasa de ácido nucleico dependiente del molde. Dentro de un dúplex, la cadena de molde se representa y se describe, por norma, como la cadena “inferior”.

5 De manera similar, la cadena no molde se representa y se describe habitualmente como la cadena “superior”.

El término “ARN polimerasa dependiente del molde” se refiere a una polimerasa de ácido nucleico que crea nuevas cadenas de ARN a través del copiado de una cadena de molde según lo descrito anteriormente y que no sintetiza ARN en ausencia de un molde. Esto se diferencia de la actividad de las polimeras de ácido nucleico independientes del molde, que sintetizan o amplían ácidos nucleicos sin referencia a un molde, tales como la desoxinucleotidil

10 transferasa terminal o la poli(A) polimerasa.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones para tratar ácido nucleico, y en concreto, a procedimientos y composiciones para la detección y la caracterización de secuencias de ácido nucleico y cambios secuenciales.

15 La presente invención se refiere a procedimientos para escindir una estructura de escisión de ácidos nucleicos de un modo de sitio específico. En particular, la presente invención se refiere a una enzima de escisión que tiene actividad nucleasa 5’ sin interferir en la capacidad sintética de ácido nucleico.

Esta invención proporciona nucleasas 5' derivadas de ADN polimerasas termoestables que presentan actividad

sintética de ADN modificada con respecto a la de las ADN polimerasas termoestables nativas. La actividad nucleasa

20 5’ de la polimerasa se conserva, mientras que la actividad sintética se reduce o está ausente. Tales nucleasas 5’ son capaces de catalizar la escisión de estructura específica de ácidos nucleicos sin interferir en la actividad de síntesis. La falta de actividad sintética durante una reacción de escisión da como resultado productos de escisión de ácidos nucleicos de un tamaño uniforme.

Las nuevas propiedades de las nucleasas de la invención forman la base de un procedimiento para la detección de

25 secuencias de ácidos nucleicos específicas. Este procedimiento se basa en la amplificación de la molécula de detección en lugar de la amplificación de la propia secuencia diana, como hacen los procedimientos existentes de detección de secuencias diana específicas.

Las ADN polimerasas (ADNp) tales como aquéllas aisladas de E. coli o de bacterias termófilas del género Thermus son enzimas que sintetizan nuevas cadenas de ADN. Varios de las ADNp conocidas contienen actividades nucleasa

30 asociadas además de la actividad sintética de la enzima.

Algunas ADNp son conocidas por eliminar nucleótidos de los extremos 5’ y 3’ de las cadenas de ADN [Kornberg, “DNA Replication”, W. H. Freeman y Co., San Francisco, pp. 127–139 (1980)]. Estas actividades nucleasa se denominan habitualmente actividades exonucleasa 5’ y exonucleasa 3’, respectivamente. Por ejemplo, la actividad exonucleasa 5’ localizada en el dominio N–terminal de varias ADNp participa en la eliminación de cebadores de ARN

35 durante el aislamiento de la síntesis de cadenas producido durante la replicación de ADN y en la eliminación de los nucleótidos dañados durante la reparación. Algunas ADNp tales como la ADN polimerasa de E. coli (ADNpEc1), también tienen una actividad exonucleasa 3’ responsable de la corrección de pruebas durante la síntesis del ADN (Kornberg, supra).

Una ADNp aislada de Thermus aquaticus, denominada ADN polimerasa de Taq (ADNpTaq), tiene una actividad

40 exonucleasa 5’, pero carece de un dominio exonucleolítico 3’ funcional [Tindall y Kunkell. Biochem. 27:6008 (1988)]. Los derivados de ADNpEc1 y ADNpTaq, respectivamente denominados fragmentos de Klenow y de Stoffel, carecen de dominios exonucleasa 5’ como resultado de las manipulaciones enzimáticas o genéticas [Brutiag et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 37:982 (1969); Erlich et al., Science 252: 1643 (1991); Setlow y Kornberg, J. Biol. Chem.

247:232 (1972)].

45 Se informó que la actividad exonucleasa 5’ de ADNpTaq requiere una síntesis simultánea [Gelfand. “PCR Technology – Principles and Applications for DNA Amplification” (H.A. Erlich. Ed.), Stockton Press. Nueva York, p. 19 (1989)]. Aunque los mononucléotidos predominan entre los productos de digestión de las exonucleasas 5’ de ADNpTaq y ADNpEc1, también se pueden observar oligonucleótidos cortos (: 12 nucleótidos), lo que implica que estas denominadas exonucleasas 5’ funcionan endonucleolíticamente [Setlow, supra: Holland et al., Proc. Natl. Acad.

50 Sci. EE.UU. 88:7276 (1991)].

En el documento WO 92/06200, Gelfand et al., muestran que el sustrato preferido de la actividad exonucleasa 5’ de las ADN polimerasas termoestables es ADN monocatenario reemplazado. La hidrólisis del enlace fosfodiéster tiene lugar entre el ADN monocatenario reemplazado y el ADN de doble hélice, siendo el sitio de escisión preferido de la exonucleasa un enlace fosfodiéster de la región de doble hélice. De este modo, la actividad exonucleasa 5' 55 habitualmente asociada con las ADNp es una endonucleasa monocatenaria dependiente de la estructura, siendo denominada de manera más apropiada nucleasa 5’. Las exonucleasas son enzimas que escinden moléculas de

nucleótidos de los extremos de la molécula de ácido nucleico. Las endonucleasas, por otro lado, son enzimas que escinden la molécula de ácido nucleico en sitios internos en lugar de terminales. La actividad nucleasa asociada con algunas ADN polimerasas termoestables escinde endonucleolíticamente, pero esta escisión requiere el contacto con el extremo 5' de la molécula que está siendo escindida. Por lo tanto, estas nucleasas se denominan nucleasas 5'.

5 Cuando una actividad nucleasa 5’ se asocia con una ADN polimerasa de tipo A eubactariana, se encuentra en el tercio de la región N–terminal de la proteína como un dominio funcional independiente. Los dos tercios C–terminales de la molécula constituyen el dominio de polimerización que es responsable de la síntesis de ADN. Algunos tipos de ADN polimerasa de tipo A también tienen una actividad exonucleasa 3’ asociada con los dos tercios de la región C– terminal de la molécula.

10 La actividad exonucleasa 5' y la actividad de polimerización de las ADNp han sido separadas mediante escisión proteolítica o manipulación genética de la molécula de polimerasa. Hasta la fecha, las ADNp termoestables han sido modificadas para eliminar o reducir la cantidad de actividad nucleasa 5’, dejando la actividad polimerasa intacta.

El fragmento de escisión proteolítica de Klenow o largo de la ADNpEc1 contiene la actividad polimerasa y exonucleasa 3’, pero carece de la actividad nucleasa 5’. El fragmento de Stoffel de la ADNPTaq (ADNpStf) carece

15 de la actividad nucleasa 5’ debido a una manipulación genética que eliminó los 289 aminoácidos N–terminales de la molécula de polimerasa [Erlich et al., Science 252:1643 (1991)]. El documento WO 92/06200 describe una ADNp termoestable con un nivel modificado de exonucleasa 5’ a 3’. La patente estadounidense n.º: 5.108.892 describe una ADNp de Thermus aquaticus sin una exonucleasa de 5’ a 3’. Sin embargo, la técnica de la biología molecular carece de una ADN polimerasa termoestable con una cantidad reducida de actividad sintética.

20 La presente invención proporciona nucleasas 5' derivadas de ADN polimerasas de tipo A termoestables que conservan la actividad nucleasa 5’, pero que tienen una actividad sintética reducida o ausente. La capacidad de desacoplar la actividad sintética de la enzima de la actividad nucleasa 5’ demuestra que la actividad nucleasa 5’ no requiere una síntesis de ADN simultánea, como se indicó anteriormente (Gelfand, PCR Technology, supra).

La descripción de la invención se divide en: I. Generación de nucleasas 5' derivadas de ADN polimerasas

25 termoestables; II. Detección de secuencias de ácidos nucleicos específicas usando nucleasas 5' en un análisis de escisión dirigida por un invasor; III. Una comparación entre la escisión invasiva y la escisión dirigida por un cebador;

IV. Fraccionamiento de ácidos nucleicos específicos mediante inversión selectiva de cargas; V. Escisión dirigida por Invader™ usando minisondas y sondas de rango medio; VI. Ampliación de señales mediante la prolongación de productos de reacción en el análisis de escisión dirigido por Invader™; y VII. Enzimas mejoradas para su uso en

30 reacciones de escisión dirigidas por Invader™.

I. Generación de nucleasas 5' a partir de ADN polimerasas termoestables

Los genes codificantes de las ADN polimerasas de tipo A comparten una homología del aproximadamente 85% entre sí en el nivel de secuencia de ADN. Los ejemplos preferidos de polimerasas termoestables incluyen aquéllas aisladas de Thermus aquaticus, Thermus flavus y Thermus thermophilus. Sin embargo, también son adecuadas 35 otras polimerasas de tipo A termoestables que tienen actividad nucleasa 5’. Las Fig. 1 y 2 comparan las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las tres polimerasas anteriormente mencionadas. En las Fig. 1 y 2, la secuencia consenso o mayoría derivada de una comparación de la secuencia de nucleótidos (Fig. 1) o de aminoácidos (Fig. 2) de las tres ADN polimerasas termoestables se muestra en la línea superior. En las secuencias de cada una de estas tres polimerasas aparece un punto siempre que un residuo de aminoácido de una determinada secuencia sea 40 idéntico al contenido en la secuencia de aminoácidos consenso. Los guiones se usan para introducir huecos con el fin de maximizar el alineamiento entre las secuencias mostradas. Cuando no hay presente ningún nucleótido o aminoácido consenso en una determinada posición, se coloca una “X” en la secuencia consenso. Las SEC ID N.º 1– 3 muestran las secuencias de nucleótidos y las SEC ID N.º 4–6 muestran las secuencias de aminoácidos de las tres polimerasas de tipo natural. La SEC ID N.º 1 corresponde a la secuencia de ácido nucleico del gen de ADN 45 polimerasa de Thermus aquaticus de tipo natural aislado de la cepa YT–1 [Lawyer et al., J. Biol. Chem. 264:6427 (1989)]. La SEC ID N.º 2 corresponde a la secuencia de ácido nucleico del gen de ADN polimerasa de Thermus flavus de tipo natural [Akhmetzjanov y Vakhitov. Nucl. Acids Res. 20:5839 (1992)]. La SEC ID N.º 3 corresponde a la secuencia de ácido nucleico del gen de ADN polimerasa de Thermus thermophilus de tipo natural [Gelfand et al., WO 91/09950 ( 1991)]. Las SEC ID N.º 7–8 representan las secuencias de nucleótidos y aminoácidos consenso,

50 respectivamente para las tres ADNp anteriores (también mostradas en la fila superior de las Fig. 2 y 3).

Las nucleasas 5' de la invención derivadas de polimerasas termoestables tienen una capacidad sintética reducida, pero conservan sustancialmente la misma actividad exonucleasa 5' que la ADN polimerasa nativa. El término “sustancialmente la misma actividad nucleasa 5’”, como se usa en la presente memoria, significa que la actividad nucleasa 5’ de la enzima modificada conserva la capacidad de funcionar como una endonucleasa monocatenaria

55 dependiente de la estructura, pero no necesariamente a la misma velocidad de escisión en comparación con la enzima sin modificar. Las ADN polimerasas de tipo A también pueden ser modificadas para que produzcan una enzima que tenga una mayor actividad nucleasa 5’, teniendo a la vez un nivel reducido de actividad sintética. Las enzimas modificadas que tienen una actividad sintética reducida y una actividad nucleasa 5’ aumentada también están englobadas por la presente invención.

El término “actividad sintética reducida”, como se usa en la presente memoria, pretende significar que la enzima modificada tiene un nivel de actividad sintética menor que el encontrado en la enzima sin modificar o “nativa”. La enzima modificada puede no tener actividad sintética restante o puede tener ese nivel de actividad sintética que no interfiera en el uso de la enzima modificada en el análisis de detección descrito más adelante. Las nucleasas 5' de la

5 presente invención son ventajosas en situaciones en las que se desea la actividad de escisión de la polimerasa, pero no la capacidad sintética (tal como en el análisis de detección de la invención).

Como se indica anteriormente, no se pretende que la invención quede limitada por la naturaleza de la modificación necesaria para convertir la polimerasa en sintéticamente deficiente. La presente invención contempla una variedad de procedimientos, incluyendo pero no limitándose a: 1) proteolisis; 2) construcciones recombinantes (incluyendo

10 mutantes); y 3) modificación y/o inhibición física y/o química.

1. Proteolisis

Las ADN polimerasas termoestables que tienen un nivel reducido de actividad sintética se producen mediante la escisión física de la enzima sin modificar con enzimas proteolíticas para producir fragmentos de la enzima que sean deficientes en actividad sintética, pero que conserven la actividad nucleasa 5’. Tras la digestión proteolítica, los

15 fragmentos resultantes se separan mediante técnicas cromatográficas estándar y se analizan en cuanto a su capacidad para sintetizar ADN y actuar como una nucleasa 5’. Más adelante se describen los análisis para determinar la actividad sintética y la actividad nucleasa 5'.

2. Construcciones recombinantes

20 Los siguientes ejemplos describen un procedimiento preferido para crear una construcción codificante de una nucleasa 5' derivada de una ADN polimerasa termoestable. Como las ADN polimerasas de tipo A son similares en la secuencia de ADN, las estrategias de clonación empleadas para las polimerasas de Thermus aquaticus y flavus son aplicables a otras polimerasas de tipo A termoestables. En general, una ADN polimerasa termoestable se clona aislando ADN genómico mediante procedimientos de Biología Molecular a partir de una bacteria que contiene una

25 ADN polimerasa de tipo A termoestable. Este ADN genómico se expone a cebadores que son capaces de amplificar el gen de polimerasa por PCR.

Esta secuencia de polimerasa amplificada es luego sometida a procedimientos de eliminación estándar para eliminar la parte de polimerasa del gen. En los siguientes ejemplos, se describen procedimientos de eliminación adecuados.

El ejemplo que se presenta a continuación describe la estrategia usada para determinar qué porciones del dominio

30 polimerasa de ADNPTaq podrían ser eliminadas sin eliminar la actividad nucleasa 5'. La eliminación de aminoácidos de la proteína se puede realizar bien mediante la eliminación del material genético codificante o mediante la introducción de un codón de terminación de la traducción por mutación o desplazamiento de marcos. Además, se puede realizar un tratamiento proteolítico de la molécula proteínica para eliminar segmentos de la proteína.

En los ejemplos que se presentan a continuación, las modificaciones específicas del gen Taq fueron: una

35 eliminación entre los nucleótidos 1601 y 2502 (el extremo de la región codificante), una inserción de 4 nucleótidos en la posición 2043 y eliminaciones entre los nucleótidos 1614 y 1848, y entre los nucleótidos 875 y 1778 (la numeración es como en SEC ID N.º 1). Estas secuencias modificadas se describen a continuación en los ejemplos y en las SEC ID N.º 9–12.

Los expertos en la técnica entienden que los cambios de un solo par de bases pueden ser inocuos en términos de

40 estructura y función enzimática. De manera similar, las pequeñas adiciones y eliminaciones pueden estar presentes sin cambiar sustancialmente la función exonucleasa o polimerasa de estas enzimas.

También hay otras eliminaciones adecuadas para crear las nucleasas 5' de la presente invención. Es preferible que la eliminación disminuya la actividad polimerasa de las nucleasas 5' hasta un nivel al que la actividad sintética no interfiera en el uso de la nucleasa 5' en el análisis de detección de la invención. Lo más preferible es que la

45 capacidad sintética esté ausente. Las polimerasas modificadas se analizan en cuanto a la presencia de actividad sintética y nucleasa 5' como en los análisis descritos más adelante. Si se tienen en cuenta estos análisis es posible rastrear enzimas candidatas cuya estructura sea hasta el momento todavía desconocida. En otras palabras, es posible evaluar la construcción “X” según el protocolo descrito más adelante para determinar si es un miembro del género de nucleasas 5' de la presente invención según lo definido funcionalmente, más que estructuralmente.

50 En el siguiente ejemplo, el producto obtenido por PCR del ADN genómico de Thermus aquaticus amplificado no tenía la estructura de nucleótidos idéntica al ADN genómico nativo y no tenía la misma capacidad sintética que el clon original. Los cambios en los pares de bases que resultan por la infidelidad de ADNPTaq durante la amplificación de la PCR de un gen de polimerasa también son un procedimiento mediante el cual se puede desactivar la capacidad sintética de un gen de polimerasa. Los siguientes ejemplos y las Fig. 3A y 4A indican las regiones de las

55 ADN polimerasas de Thermus aquaticus y flavus nativas que tienden a ser importantes para la actividad sintética. Hay otros cambios y sustituciones en los pares de bases que probablemente también desactiven la polimerasa.

No es necesario, sin embargo, comenzar el procedimiento de producción de una nucleasa 5' a partir de ADN polimerasa con tal producto amplificado mutado. Este es el procedimiento mediante el cual los siguientes ejemplos se realizaron para generar los mutantes de ADNPTaq sintéticamente deficientes, pero los expertos en la técnica entienden que se puede usar una secuencia de ADN polimerasa de tipo natural como material inicial para la

5 introducción de eliminaciones, inserciones y sustituciones para producir una nucleasa 5'. Por ejemplo, para generar el mutante de ADNpTfl sintéticamente deficiente, se usaron los cebadores que figuran en las SEC ID N.º 13–14 para amplificar el gen de ADN polimerasa de tipo natural de la cepa AT–62 de Thermus flavus. Entonces se sometió el gen de polimerasa amplificado a una digestión con enzima de restricción para eliminar una parte de gran tamaño del dominio codificante de la actividad sintética.

10 La presente invención contempla que la construcción de ácido nucleico de la presente invención sea capaz de expresarse en un huésped adecuado. Los expertos en la técnica conocen procedimientos para unir diversos promotores y secuencias 3’ a una estructura génica para conseguir una expresión eficiente. Los siguientes ejemplos revelan dos vectores adecuados y seis construcciones de vectores adecuadas. Por supuesto, hay otras combinaciones de promotor/vector que serían adecuadas. No es necesario usar un organismo huésped para la

15 expresión de construcciones de ácido nucleico de la invención. Por ejemplo, se puede lograr la expresión de la proteína codificada por una construcción de ácido nucleico a través del uso de un sistema de transcripción/traducción in vitro libre de células. Un ejemplo de tal sistema libre de células es el sistema de lisados de reticulocitos acoplados TNTTM comercialmente disponible (Promega Corporation, Madison, WI).

Una vez fabricado una construcción de ácido nucleico adecuado, se puede producir la nucleasa 5' a partir de la

20 construcción. Los siguientes ejemplos y enseñanzas de la Biología Molecular estándar permiten la manipulación de la construcción mediante diferentes procedimientos adecuados.

Una vez expresada la nucleasa 5', se analiza la polimerasa tanto en cuanto a la actividad sintética como a la actividad nucleasa según lo descrito más adelante.

3. Modificación y/o inhibición física y/o química

25 Es posible reducir la actividad sintética de una ADN polimerasa termoestable mediante procedimientos químicos y/o físicos. En una realización, la reacción de escisión catalizada por la actividad nucleasa 5' de la polimerasa se ejecuta en condiciones que inhiben preferiblemente la actividad sintética de la polimerasa. El nivel de actividad sintética sólo necesita ser reducido hasta el nivel de actividad que no interfiera con las reacciones de escisión que no requieran una actividad sintética significativa.

30 Como se observa en los siguientes ejemplos, las concentraciones de Mg--mayores de 5mM inhiben la actividad de polimerización de la ADNpTaq nativa. La capacidad de la nucleasa 5' para funcionar en condiciones en las que se inhiba la actividad sintética se analiza mediante la realización de análisis de la actividad sintética y nucleasa 5’, descritas más adelante, en presencia de un intervalo de concentraciones de Mg--(5 a 10mM). El efecto de una determinada concentración de Mg--se determina mediante la cuantificación de la cantidad de síntesis y escisión en

35 la reacción de análisis en comparación con la reacción estándar de cada análisis.

El efecto inhibidor de otros iones, poliaminas, desnaturalizantes, tales como la urea, la formamida, el dimetilsulfóxido, el glicerol y detergentes no iónicos (Triton X–100 y Tween–20), compuestos químicos de unión de ácidos nucleicos, tales como la actinomicina D, el bromuro de etidio y psoralenos, se analiza mediante su adición a tampones de reacción estándar para los análisis de síntesis y nucleasa 5'. Entonces se usan aquellos compuestos que tienen un

40 efecto inhibidor preferencial sobre la actividad sintética de una polimerasa termoestable para crear condiciones de reacción bajo las que se conserve la actividad nucleasa 5' (de escisión) mientras que se reduce o se elimina la actividad sintética.

Se pueden usar procedimientos físicos para inhibir preferiblemente la actividad sintética de una polimerasa. Por ejemplo, la actividad sintética de las polimerasas termoestables se destruye mediante la exposición de la polimerasa

45 a un calor extremo (comúnmente, de 96 a 100°C) dura nte períodos prolongados de tiempo (mayores de o iguales a 20 minutos). Aunque éstas son diferencias menores con respecto a la tolerancia al calor específica de cada una de las enzimas, éstas se determinan fácilmente. Se tratan las polimerasas con calor durante diversos períodos de tiempo y se determina el efecto del tratamiento con calor en la actividad sintética y nucleasa 5'.

II. Detección de secuencias de ácidos nucleicos específicas usando nucleasas 5' en un análisis de la 50 escisión dirigida por un invasor

La presente invención proporciona procedimientos para la formación de una estructura de escisión de ácidos nucleicos que es dependiente de la presencia de un ácido nucleico diana y la escisión de la estructura de escisión de ácidos nucleicos para liberar productos de escisión característicos. La actividad nucleasa 5' se usa para escindir la estructura de escisión dependiente de la diana, siendo los productos de escisión resultantes indicadores de la

55 presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana específicas en la muestra.

La presente invención proporciona además análisis en los que el ácido nucleico diana se reutiliza o recicla durante múltiples series de hibridación con sondas de oligonucleótido y la escisión sin la necesidad de usar ciclos de temperatura (i.e., para la desnaturalización periódica de las cadenas de ácido nucleico diana) o síntesis de ácidos nucleicos (i.e., para la sustitución de cadenas de ácido nucleico diana). A través de la interacción del medio de escisión (p.ej., una nucleasa 5'), un oligonucleótido secuencia arriba, se puede formar el medio de escisión para que escinda un oligonucleótido secuencia abajo en un sitio interno de tal modo que los fragmentos resultantes del

5 oligonucleótido secuencia abajo se disocien del ácido nucleico diana, haciendo así que la región del ácido nucleico diana esté disponible para la hibridación con otra copia sin escindir del oligonucleótido secuencia abajo.

Según lo ilustrado en la Fig. 25, los procedimientos de la presente invención emplean al menos un par de oligonucleótidos que interactúan con un ácido nucleico diana para formar una estructura de escisión para una nucleasa de estructura específica. Más específicamente, la estructura de escisión comprende: i) un ácido nucleico 10 diana que puede ser bien monocatenario o bicatenario (cuando se emplea un ácido nucleico diana bicatenario, se puede hacer monocatenario, p.ej., calentándolo); ii) un primer oligonucleótido, denominado “sonda”, que define una primera región de la secuencia de ácido nucleico diana siendo el complemento de esa región (las regiones X y Z de la diana se muestran en la Fig. 25); e iii) un segundo oligonucleótido, denominado “invasor”, cuya parte 5’ define una segunda región de la misma secuencia de ácido nucleico diana (regiones Y y X de la Fig. 25), adyacente a y

15 secuencia abajo de la primera región diana (regiones X y Z), y cuya segunda parte se solapa en la región definida por el primer oligonucleótido (la región X representa la región de solapamiento). La estructura resultante se representa en un diagrama en la Fig. 25.

Aunque sin limitar la invención o la presente descripción a ningún mecanismo de acción en concreto, el diagrama de la Fig. 25 representa el efecto sobre el sitio de escisión causado por este tipo de disposición de un par de 20 oligonucleótidos. El diseño de tal par de oligonucleótidos se describe a continuación detalladamente. En la Fig. 25, los extremos 3’ de los ácidos nucleicos (i.e., la diana y los oligonucleótidos) se indican por el uso de puntas de flecha en los extremos de las líneas que representan las cadenas de los ácidos nucleicos (y cuando lo permite el espacio, estos extremos también están marcados con “3’” Se aprecia fácilmente que los dos oligonucleótidos (el invasor y la sonda) están dispuestos en una orientación paralela entre sí, mientras que la cadena de ácido nucleico diana está 25 dispuesta en una orientación antiparalela en relación con los dos oligonucleótidos. Además, está claro que el oligonucleótido invasor se localiza secuencia arriba del oligonucleótido sonda y que, con respecto a la cadena de ácido nucleico diana, la región Z está secuencia arriba de la región X, y la región X está secuencia arriba de la región Y (es decir, la región Y está secuencia abajo de la región X y la región X está secuencia abajo de la región Z). Las regiones de complementariedad entre las cadenas opuestas se indican con líneas verticales cortas. Aunque no 30 se pretende indicar la localización precisa del sitio o de los sitios de escisión, la zona a la que es desplazado el sitio de escisión del oligonucleótido sonda por la presencia del oligonucleótido invasor se indica con la punta de flecha vertical continua. Una representación alternativa de la estructura de escisión de diana/invasor/sonda se muestra en la Fig. 28C. Ningún diagrama (i.e., Fig. 25 o Fig. 28C) pretende representar el mecanismo real de acción o la disposición física de la estructura de escisión y, además, no se pretende que el procedimiento de la presente

35 invención se limite a ningún mecanismo de acción concreto.

Se puede considerar que la unión de estos oligonucleótidos divide el ácido nucleico diana en tres regiones distintas: una región que sólo tiene complementariedad con la sonda (mostrada como “Z”); una región que sólo tiene complementariedad con el invasor (mostrada como “Y”); y una región que tiene complementariedad con ambos oligonucleótidos (mostrada como “X”).

40 El diseño de estos oligonucleótidos (i.e., el invasor y la sonda) se realiza usando prácticas que son estándar en la técnica. Por ejemplo, en general, se evitan las secuencias que tienen auto–complementariedad, tal que los oligonucleótidos resultantes se plieguen bien en sí mismos o se hibriden entre sí a expensas de la unión al ácido nucleico diana.

Una consideración en la elección de una longitud para estos oligonucleótidos es la complejidad de la muestra que

45 contiene el ácido nucleico diana. Por ejemplo, el genoma humano es de una longitud de aproximadamente 3 x 109 pares de bases. Cualquier secuencia de 10 nucleótidos aparecerá con una frecuencia de 1:410 ó 1:1048,576 en una cadena aleatoria de nucleótidos, que sería aproximadamente 2,861 veces en 3 mil millones de pares de bases. Claramente, un oligonucleótido de esta longitud tendría poca probabilidad de unirse únicamente con una región de 10 nucleótidos de una diana que tuviera una secuencia con el tamaño del genoma humano. Si la secuencia diana

50 estuviera en un plásmido de 3 kb, sin embargo, tal oligonucleótido podría tener una probabilidad muy razonable de unirse de forma exclusiva. Mediante este mismo cálculo, se puede observar que un oligonucleótido de 16 nucleótidos (i.e., un 16–mero) es la longitud mínima de una secuencia que tiene una probabilidad matemática de aparecer una vez en 3 x 109 pares de bases.

Una segunda consideración en la elección de la longitud del oligonucleótido es el intervalo de temperaturas en el

55 que se esperará que funcionen los oligonucleótidos. Un 16–mero de un contenido medio de bases (50% de pares de bases G–C) tendrá una Tf calculada (la temperatura a la que el 50% de la secuencia se disocia) de aproximadamente 41°C, en función de, entre otras co sas, la concentración del oligonucleótido y su diana, el contenido de sales de la reacción y el orden exacto de los nucleótidos. Como cuestión práctica, habitualmente, se seleccionan los oligonucleótidos más largos para aumentar la especificidad de la hibridación. Los oligonucleótidos de

60 20 a 25 nucleótidos de longitud se usan habitualmente pues tienen una alta probabilidad de ser específicos si se usan en reacciones llevadas a cabo a temperaturas que son cercanas a sus Tf (± aproximadamente 5ºC de la Tf).

Además, con Tf calculadas en el intervalo de 50º a 70°C, tales oli gonucleótidos (i.e., 20 a 25–meros) se usan apropiadamente en reacciones catalizadas por enzimas termoestables, que habitualmente presentan una actividad óptima cerca de este intervalo de temperatura.

La longitud máxima del oligonucleótido seleccionado también se basa en la especificidad deseada. Se debe evitar 5 elegir secuencias que sean tan largas que estén bien en riesgo de unirse establemente con complementos parciales

o que no se puedan desplazar fácilmente cuando así se desee (p. ej., que no se disocien de la diana una vez que haya ocurrido la escisión).

La primera etapa de diseño y selección de los oligonucleótidos para la escisión dirigida por un invasor se hace de acuerdo a estos principios generales de muestras. Considerados individualmente como sondas de secuencia 10 específica, es posible seleccionar cada oligonucleótido según las directrices que figuran anteriormente. Es decir, cada oligonucleótido, generalmente, será lo suficientemente largo como para que sea razonable pensar que se hibride sólo con la secuencia diana deseada en una muestra compleja, habitualmente en el intervalo de los 20 a 40 nucleótidos. Alternativamente, como el análisis de la escisión dirigida por un invasor depende de la acción concertada de estos oligonucleótidos, es posible seleccionar la longitud del compuesto de los 2 oligonucleótidos que 15 abarca/se hibrida con las regiones X, Y y Z para que pertenezca a este intervalo, estando cada uno de los oligonucleótidos individuales en el intervalo de aproximadamente 13 a 17 nucleótidos. Se podría emplear tal diseño si se empleara un medio de escisión no termoestable en la reacción, siendo necesario que las reacciones se llevaran a cabo a una temperatura más baja que la usada al emplear medios de escisión termoestables. En algunos casos, puede ser deseable tener estos oligonucleótidos unidos múltiples veces en un ácido nucleico diana (p. ej.,

20 que se unan a múltiples variantes o múltiples secuencias similares de una diana). No se pretende que el procedimiento de la presente invención se limite a un tamaño en particular del oligonucleótido sonda o invasor.

La segunda etapa del diseño de un par de oligonucleótidos para este análisis consiste en elegir el grado al que la secuencia de oligonucleótido “invasor” de secuencia arriba se solapará en la secuencia de oligonucleótido “sonda” de secuencia abajo, y por consiguiente, los tamaños en los que se escindirá la sonda. Una característica clave de

25 este análisis es que se puede hacer que el oligonucleótido sonda se renueve. Es decir, se puede hacer salir la sonda escindida para permitir la unión y la escisión de otras copias de la molécula de sonda, sin la necesidad de una desnaturalización térmica ni el reemplazo por polimerización. Aunque, en una realización de este análisis, la renovación de la sonda puede verse facilitada por una digestión exonucleolítica mediante el agente de escisión, es crucial para la presente invención que la renovación no requiera esta actividad exonucleolítica.

30 Elección de la cantidad de solapamiento (longitud de la región X)

Se puede prever un modo de realizar tal renovación considerando el diagrama de la Fig. 25. Se puede observar que la Tf de cada oligonucleótido será una función de la longitud completa de ese oligonucleótido, i.e., la Tf del invasor = Tf(Y–X), y la Tf de la sonda = Tf(X-Y) para la sonda. Cuando se escinde la sonda, se libera la región X, dejando la sección Z. Si la Tf de Z es menor que la temperatura de reacción, y la temperatura de reacción es menor que la

35 Tf(X–Z), entonces la escisión de la sonda conducirá a la salida de Z, permitiendo así que un nuevo (X+Z) se hibride. Se puede observar a partir de este ejemplo que la región X debe ser suficientemente larga como para que la liberación de X baje la Tf de la sección de sonda restante por debajo de la temperatura de reacción: una sección X rica en G–C puede ser mucho más corta que una sección X rica en A–T sin que se deje de producir este cambio de la estabilidad.

40 Diseño de oligonucleótidos que interactúan con las regiones Y y Z

Si la unión del oligonucleótido invasor con la diana es más estable que la unión de la sonda (p. ej., si es larga o es rica en pares de bases de G–C en la región Y), entonces la copia de X asociada con el invasor puede ser favorecida en la competición por la unión con respecto a la región X de la diana, pudiéndose por consiguiente hibridar la sonda ineficazmente y pudiendo proporcionar el análisis una señal baja. Alternativamente, si la unión de la sonda es

45 particularmente fuerte en la región Z, el invasor seguirá causando la escisión interna, porque ésta está mediada por la enzima, pero parte del oligonucleótido sonda unido a la región Z puede no disociarse a la temperatura de reacción, la renovación puede ser escasa y el análisis puede volver a proporcionar una señal baja.

Es claramente beneficioso para las partes del oligonucleótido que interactúan con las regiones Y y Z ser similares en

estabilidad, i.e., deben tener temperaturas de fusión similares. Esto no significa que estas regiones deban ser de la

50 misma longitud. Según lo indicado anteriormente, además de la longitud, la temperatura de fusión también será afectada por el contenido de bases y la secuencia específica de aquellas bases. La estabilidad específica diseñada en las secuencias de invasor y sonda dependerá de la temperatura a la que se desee realizar la reacción.

Esta descripción pretende ilustrar que (según las directrices básicas para la especificidad de oligonucleótidos tratadas anteriormente), es el equilibrio alcanzado entre las estabilidades de la secuencia de sonda e invasor, y sus

55 secuencias de componente X e Y, más que los valores absolutos de estas estabilidades, la principal consideración en la selección de las secuencias de sonda e invasor.

Diseño de las condiciones de reacción

Los ácidos nucleicos diana que se pueden analizar usando los procedimientos de la presente invención que emplean una nucleasa 5' como medio de escisión incluyen muchos tipos de tanto ARN como ADN. Tales ácidos nucleicos se pueden obtener usando técnicas de Biología Molecular estándar. Por ejemplo, los ácidos nucleicos (ARN o ADN) se pueden aislar de una muestra de tejido (p. ej. una muestra de biopsia), células de cultivo tisular,

5 muestras que contienen bacterias y/o virus (incluyendo cultivos de bacterias y/o virus), etc. El ácido nucleico diana también se puede transcribir in vitro a partir de un molde de ADN o se puede sintetizar químicamente o generar en una PCR. Además, los ácidos nucleicos se pueden aislar de un organismo, bien como material genómico o como un plásmido o ADN extracromosómico similar, o pueden ser un fragmento de tal material generado mediante el tratamiento con una endonucleasa de restricción u otros agentes de escisión, o pueden ser sintéticos.

10 La unión de los ácidos nucleicos diana, sonda e invasor en la reacción de escisión de la presente invención usa los principios comúnmente usados en el diseño de análisis enzimáticos de bases de oligonucleótido, tales como la secuenciación de didesoxinucleótidos y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como se hace en estos análisis, los oligonucleótidos se proporcionan en un exceso suficiente como para que la velocidad de hibridación con el ácido nucleico diana sea muy alta. Estos análisis se realizan comúnmente con 50 fmoles a 2 pmoles de cada

15 oligonucleótido por cada 1l de mezcla de reacción. En los ejemplos descritos en la presente memoria, se usaron cantidades de oligonucleótidos que variaban de 250 fmoles a 5 pmoles por cada 1l de volumen de reacción. Estos valores se seleccionaron a efectos de facilitar la demostración y no pretenden limitar el rendimiento de la presente invención a estas concentraciones. También se contemplan otras concentraciones de oligonucleótido (p. ej., más bajas) comúnmente usadas en otras reacciones de Biología Molecular.

20 Es deseable que haya un oligonucleótido invasor inmediatamente disponible para dirigir la escisión de cada oligonucleótido sonda que se hibrida con un ácido nucleico diana. Por esta razón, en los ejemplos descritos en la presente memoria, el oligonucleótido invasor se proporciona en exceso frente al oligonucleótido sonda; a menudo este exceso es de 10 veces más. Aunque ésta sea una proporción eficaz, no se pretende que la práctica de la presente invención se limite a una proporción en particular de invasor:sonda (se contempla una proporción de 2 a

25 100 veces).

Las condiciones del tampón deben ser seleccionadas para que sean compatibles tanto con la hibridación de oligonucleótido/diana como con la actividad del agente de escisión. Las condiciones óptimas de tamponamiento para las enzimas de modificación de ácidos nucleicos, y particularmente, para las enzimas de modificación de ADN, incluyeron generalmente suficientes sales mono– y di–valentes como para permitir la asociación de cadenas de 30 ácido nucleico mediante el apareamiento de bases. Si el procedimiento de la presente invención se realiza usando un agente de escisión enzimático distinto de aquéllos descritos específicamente aquí, las reacciones se pueden realizar generalmente en cualquier tampón presentado como óptimo para la función nucleasa del agente de escisión. En general, para analizar la utilidad de cualquier agente de escisión, en este procedimiento, se llevan a cabo reacciones analíticas en las que el agente de escisión de interés es analizado en el tampón de MOPS/MnCl2/KCl o

35 en tampones que contienen Mg descritos en la presente memoria y en cualquier tampón que se haya presentado como adecuado para su uso con ese agente, en una hoja de datos del fabricante, un artículo de revista o en una comunicación personal.

Los productos de la reacción de escisión dirigida por un invasor son fragmentos generados mediante la escisión de estructura específica de los oligonucleótidos de entrada. Los oligonucleótidos escindidos y/o sin escindir resultantes 40 se pueden analizar y resolver mediante un número de procedimientos incluyendo la electroforesis (sobre una variedad de soportes incluyendo geles de acrilamida o de agarosa, papel, etc.), cromatografía, polarización de fluorescencia, espectrometría de masas e hibridación de virutas. La invención se ilustra usando separación electroforética para el análisis de los productos de las reacciones de escisión. Sin embargo, se indica que la resolución de los productos de escisión no se limita a la electroforesis. Se elige la electroforesis para ilustrar el

45 procedimiento de la invención, porque la electroforesis se utiliza ampliamente en la técnica y es de fácil acceso para el profesional medio.

Los oligonucleótidos sonda e invasor pueden contener un marcador para ayudar en su detección tras la reacción de escisión. El marcador puede ser un radioisótopo (p. ej., un nucleótido marcado con 32P o 35S) colocado bien en el extremo 5’ o en el 3’ del oligonucleótido o, alternativamente, el marcador puede estar distribuido por el 50 oligonucleótido (i.e., un oligonucleótido marcado uniformemente). El marcador puede ser un resto detectable no isotópico, tal como un fluoróforo, que se pueda detectar directamente o un grupo reactivo que permita el reconocimiento específico por un agente secundario. Por ejemplo, los oligonucleótidos biotinilados se pueden detectar sondando con una molécula de estreptavidina que se acople a un indicador (p. ej., fosfatasa alcalina o un fluoróforo) o un hapteno, tal como la digoxigenina, se puede detectar usando un anticuerpo específico acoplado a un

55 indicador similar.

Optimización de las condiciones de reacción

La reacción de escisión dirigida por un invasor es útil para detectar la presencia de ácidos nucleicos específicos. Además de las consideraciones que figuran anteriormente para la selección y el diseño de los oligonucleótidos invasor y sonda, se pueden optimizar las condiciones bajo las cuales la reacción se vaya a realizar para la detección

60 de una secuencia diana específica.

Un objetivo en la optimización del análisis de escisión dirigido por un invasor consiste en permitir la detección específica de las menores copias de un ácido nucleico diana. Para lograr este objetivo, es deseable que los elementos combinados de la reacción interactúen con la máxima eficacia, tal que la velocidad de la reacción (p. ej., el número de eventos de escisión por minuto) se maximice. Los elementos que contribuyen a la eficacia global de la

5 reacción incluyen la velocidad de hibridación, la velocidad de escisión y la eficacia de la liberación de la sonda escindida.

La velocidad de escisión será función del medio de escisión elegido, y se puede hacer óptima según las instrucciones del fabricante cuando se usan preparaciones comerciales de enzimas o según lo descrito en los ejemplos de la presente memoria. El resto de elementos (la velocidad de hibridación, la eficacia de liberación)

10 depende de la ejecución de la reacción, y la optimización de estos elementos se trata más adelante.

Los tres elementos de la reacción de escisión que afectan significativamente a la velocidad de hibridación de los ácidos nucleicos son la concentración de los ácidos nucleicos, la temperatura a la que se realiza la reacción de escisión y la concentración de sales y/o otros iones de protección de la carga de la solución de reacción.

Las concentraciones a las que se usan las sondas de oligonucleótido en los análisis de este tipo son conocidas en la

15 técnica y se tratan anteriormente. Un ejemplo de un enfoque común para optimizar una concentración de oligonucleótido consiste en seleccionar una cantidad inicial de oligonucleótido para los análisis piloto; 0,01 a 2 1M es un intervalo de concentración usado en muchos análisis basados en oligonucleótidos. Cuando se realizan reacciones de escisión iniciales, se pueden plantear las siguientes cuestiones acerca de los datos: ¿Se realiza la reacción en ausencia de ácido nucleico diana sustancialmente libre del producto de escisión?; ¿Se desplaza el sitio

20 de escisión específicamente según el diseño del oligonucleótido invasor?; ¿Se detecta el producto de escisión específico fácilmente en presencia de la sonda sin escindir (o la cantidad del material sin cortar está inundando el procedimiento de visualización seleccionado)?

Una respuesta negativa a cualquiera de estas cuestiones sugeriría que la concentración de sonda es demasiado elevada y que se debería realizar un conjunto de reacciones usando diluciones en serie de la sonda hasta que se

25 identificara la cantidad apropiada. Una vez identificada para un determinado ácido nucleico diana en un determinado tipo de muestra (p. ej., ADN genómico purificado, extracto de fluido corporal, extracto bacteriano lisado), no debería ser necesario que fuera reoptimizada. El tipo de muestra es importante porque la complejidad del material presente puede influir en la sonda óptima.

Por el contrario, si la concentración de sonda inicial seleccionada es demasiado baja, la reacción puede ser lenta

30 debido a una hibridación ineficiente. Los análisis con cantidades crecientes de sonda identificarán el punto al que la concentración supera el punto óptimo. Como la hibridación será facilitada por el exceso de sonda, es deseable, pero no necesario, que la reacción se realice usando concentraciones de sonda justo por debajo de este punto.

La concentración de oligonucleótido invasor se puede seleccionar en base a las consideraciones de diseño anteriormente descritas. En una realización preferida, el oligonucleótido invasor está en exceso con respecto al

35 oligonucleótido sonda. En una realización particularmente preferida, el invasor es aproximadamente 10 veces más abundante que la sonda.

La temperatura también es un factor importante en la hibridación de oligonucleótidos. El intervalo de temperatura analizado dependerá en gran parte del diseño de los oligonucleótidos, según lo tratado anteriormente. En una realización preferida, las reacciones se realizan a temperaturas ligeramente por debajo de la Tf del oligonucleótido 40 menos estable de la reacción. Las temperaturas de fusión para los oligonucleótidos y para las regiones de sus componentes (X, Y y Z, Fig. 25), se pueden estimar a través del uso de un programa informático, para una mayor aproximación, asignando el valor de 2°C por par de bases de A–T, y de 4°C por par de bases de G–C, y t omando la suma a través de una prolongación de ácido nucleico. El último procedimiento se puede usar para los oligonucleótidos de aproximadamente 10–30 nucleótidos de longitud. Como incluso la predicción por ordenador de la

45 Tf de un ácido nucleico sólo es una aproximación, las temperaturas de reacción elegidas para los análisis iniciales deberían tener entre paréntesis la Tf calculada. Aunque las optimizaciones no se limitan a esto, los incrementos de 5°C son intervalos de análisis convenientes en esto s análisis de optimización.

Cuando se analizan las temperaturas, se pueden analizar los resultados en cuanto a la especificidad (las dos primeras cuestiones que figuran arriba) del mismo modo para las determinaciones de la concentración de 50 oligonucleótido. La escisión inespecífica (i.e., la escisión de la sonda en muchas o todas las posiciones en toda su longitud) indicaría interacciones inespecíficas entre la sonda y el material de muestra, y sugeriría que se debería emplear una temperatura elevada. Por el contrario, poca o ninguna escisión sugeriría que se está evitando incluso la hibridación deseada y sugeriría el uso de temperaturas más bajas. Mediante el análisis de varias temperaturas, es posible identificar una temperatura óptima aproximada, a la que la velocidad de escisión específica de la sonda sea

55 la más elevada. Si los oligonucleótidos se han diseñado según lo descrito anteriormente, la Tf de la región Z del oligonucleótido sonda debería estar por debajo de esta temperatura, de manera que se garantice la renovación.

Un tercer factor determinante de la eficacia de hibridación es la concentración salina de la reacción. En gran parte, la selección de las condiciones de la solución dependerá de los requisitos del agente de escisión, y para los reactivos obtenidos comercialmente, las instrucciones del fabricante son un recurso para obtener esta información. Cuando se desarrolla un análisis que utiliza un determinado agente de escisión, el oligonucleótido y las optimizaciones de temperatura descritas anteriormente se deberían realizar en las condiciones de tamponamiento que se adapten mejor al agente de escisión.

5 Un control “no enzimático” permite el cálculo de la estabilidad de los oligonucleótidos marcados en determinadas condiciones de reacción, o en presencia de la muestra por ser analizada (i.e., en la evaluación de la muestra en cuanto a nucleasas contaminantes). De esta manera, se colocan el sustrato y los oligonucleótidos en un tubo que contiene todos los componentes de reacción, a excepción de la enzima, y se tratan igual que las reacciones que contienen enzimas. También se pueden incluir otros controles. Por ejemplo, una reacción con todos los

10 componentes a excepción del ácido nucleico diana servirá para confirmar la dependencia que tiene la escisión de la presencia de la secuencia diana.

Sondar para múltiples alelos

La reacción de escisión dirigida por un invasor también es útil en la detección y la cuantificación de variantes o alelos individuales de una población de muestras mixta. A modo de ejemplo, tal necesidad existe en los análisis de material 15 tumoral para las mutaciones de genes asociados con cánceres. El material de biopsia procedente de un tumor puede tener un complemento significativo de células normales, por lo que es deseable detectar mutaciones incluso cuando están presentes en menos del 5% de las copias del ácido nucleico diana en una muestra. En este caso, también es deseable medir qué fracción de la población porta la mutación. También se pueden hacer análisis similares para examinar la variación alélica de otros sistemas génicos, y no se pretende que el procedimiento de la

20 presente invención se limite al análisis de tumores.

Como se demuestra más adelante, las reacciones se pueden realizar en condiciones que eviten la escisión de sondas que porten incluso un apareamiento erróneo de diferencia de un solo nucleótido en la región del ácido nucleico diana denominada “Z” en la Fig. 25, pero eso permite la escisión de una sonda similar que es completamente complementaria a la diana de esta región. De este modo, el análisis se puede usar para cuantificar

25 variantes o alelos individuales de una muestra mixta.

También se contempla el uso de múltiples sondas marcadas de manera diferente en tal análisis. Para evaluar la representación de las diferentes variantes o alelos de una muestra, se proporcionaría una muestra de sondas tal que cada alelo o variante por ser detectado tendría una sonda específica (i.e., apareada perfectamente a la región Z de la secuencia diana) con un marcador único (p. ej., no se usarían dos sondas de variante con el mismo marcador en 30 una sola reacción). Estas sondas serían caracterizadas antes para garantizar que pudieran ser fabricadas en un solo conjunto de condiciones de reacción para proporcionar la misma velocidad de acumulación de señal cuando se mezclaran con sus respectivos ácidos nucleicos diana. La preparación de una reacción de escisión que comprende el conjunto de sondas mixto, un correspondiente oligonucleótido invasor, la muestra de ácido nucleico diana y el apropiado agente de escisión, junto con la realización de la reacción de escisión en condiciones tales que sólo las

35 sondas apareadas se escindieran, permitiría la cuantificación independiente de cada una de las especies presentes y, por lo tanto, indicaría su representación relativa en la muestra diana.

III. Una comparación entre la escisión invasiva y la escisión dirigida por un cebador

Según lo tratado en la presente memoria, los términos escisión “invasiva” o “dirigida por un invasor” denotan específicamente el uso de un primer oligonucleótido secuencia arriba, según lo definido más adelante, para provocar 40 la escisión específica en un sitio de una segunda secuencia de secuencia abajo. Para efectuar tal dirección de la escisión a una región de un dúplex, es necesario que el primer y el segundo oligonucleótido se solapen en la secuencia. Es decir, una parte del oligonucleótido de secuencia arriba, denominado “invasor”, tiene una homología significativa con una parte del oligonucleótido “sonda” de secuencia abajo, tal que estas regiones tenderían a aparearse con la misma región complementaria del ácido nucleico diana por ser detectado. Aunque sin limitar la 45 presente invención a ningún mecanismo concreto, se esperaría que las regiones de solapamiento se alternaran en su ocupación del sitio de hibridación compartido. Cuando el oligonucleótido sonda se aparea completamente con el ácido nucleico diana y, por tanto, fuerza a la región 3’ del invasor a permanecer sin aparearse, la estructura así formada no es un sustrato para las nucleasas 5' de la presente invención. Por el contrario, cuando sucede a la inversa, la estructura así formada es sustrato para estas enzimas, permitiendo la escisión y la liberación de la parte

50 del oligonucleótido sonda que es reemplazada por el oligonucleótido invasor. El desplazamiento del sitio de escisión a una región en la que el oligonucleótido sonda de otro modo se aparearía con la secuencia diana es un distintivo del análisis de escisión invasiva (i.e., el análisis de escisión dirigido por un invasor) de la presente invención.

En este punto es beneficioso contrastar la escisión invasiva según lo descrito anteriormente con otras dos formas de escisión de sondas que pueden conducir a una escisión interna de un oligonucleótido sonda, pero que no 55 comprenden la escisión invasiva. En el primer caso, se puede someter una sonda hibridada a un “mordisqueado” con una exonucleasa de 5’ a 3’ dependiente de un dúplex, tal que el oligonucleótido sea acortado desde el extremo 5' hasta que no pueda quedar unido a la diana (véanse, p. ej., los ejemplos 5–7 y las Figs. 26–28). El sitio en el que se detiene tal mordisqueado puede resultar estar diferenciado y, en función de la diferencia entre la temperatura de fusión de la sonda de longitud completa y la temperatura de la reacción, este punto de detención puede ser 1 o

varios nucleótidos del interior de la secuencia del oligonucleótido sonda. Tal “mordisqueado” se indica habitualmente por la presencia de una “escalera” de productos más largos que crecen en tamaño hasta el de la longitud completa de la sonda, pero éste no es siempre el caso. Aunque se puede fabricar uno cualquiera de los productos de tal reacción de mordisqueado para que coincida en tamaño y sitio de escisión con los productos de una reacción de

5 escisión invasiva, la creación de estos productos de mordisqueado sería muy dependiente de la temperatura de la reacción y de la naturaleza del agente de escisión, pero sería independiente de la acción de un oligonucleótido secuencia arriba, y por tanto, no podrían ser construidos para implicar una escisión invasiva.

Una segunda estructura de escisión que se puede considerar es una en la que un oligonucleótido sonda tiene varias regiones de complementariedad con el ácido nucleico diana, intercaladas con una o más regiones de nucleótidos de 10 no complementariedad. Estas regiones de no complementariedad pueden ser consideradas como “burbujas” del dúplex de ácido nucleico. Cuando se eleva la temperatura, se puede esperar que las regiones de complementariedad se “fundan” para su estabilidad, de la más baja a la más alta. Cuando una región de estabilidad más baja está cerca del extremo de un segmento de dúplex, y la siguiente región de complementariedad de la cadena tiene una temperatura de fusión más elevada, se puede encontrar una temperatura que haga que la región

15 terminal del dúplex se funda primero, abriendo la primera burbuja, y creando así una estructura sustrato preferida de escisión mediante las nucleasas 5' de la presente invención (Fig. 36A). Se esperaría que el sitio de tal escisión estuviera en el brazo 5’, en dos nucleótidos de la unión entre las regiones mono– y bicatenaria (Lyamichev et al., supra, y la patente estadounidense n.º: 5.422.253).

Se podría introducir otro oligonucleótido para que se apareara a lo largo del ácido nucleico diana y tendría un efecto

20 similar de apertura de esta burbuja para la escisión posterior del brazo 5’ desapareado (Fig. 36B y Fig. 6). Obsérvese en este caso que los nucleótidos del terminal 3’ del oligonucleótido secuencia arriba se aparean a lo largo de la secuencia de ácido nucleico diana de tal manera que el extremo 3’ se localiza dentro de la región “burbuja”. En función de la ubicación exacta del extremo 3' de este oligonucleótido, el sitio de escisión puede estar a lo largo de un brazo 5’ recién desapareado, o en el sitio esperado para la estructura de burbuja abierta térmicamente

25 descrita anteriormente. En el primer caso, la escisión no está dentro de una región de dúplex, y por tanto no es una escisión invasiva, mientras que, en el último caso, el oligonucleótido es simplemente un ayudante en la inducción de la escisión en un sitio que, de otro modo, podría ser expuesto mediante el único uso de la temperatura (i.e., en ausencia del otro oligonucleótido), no siendo así considerada una escisión invasiva.

En resumen, se puede analizar cualquier disposición de oligonucleótidos usada para la detección basada en la

30 escisión de una secuencia diana con el fin de determinar si la disposición es una estructura de escisión invasiva según lo contemplado en la presente memoria. Una estructura de escisión invasiva permite la escisión de la sonda en una región de la que, en ausencia de un oligonucleótido secuencia arriba, se esperaría que se emparejara con el ácido nucleico diana.

El ejemplo 26 que se presenta más adelante proporciona una mayor orientación sobre el diseño y la ejecución de

35 experimentos que permitan la determinación de si una determinada disposición de un par de oligonucleótidos secuencia arriba y secuencia abajo (i.e., la sonda) cuando se aparean a lo largo de un ácido nucleico diana formaría una estructura de escisión invasiva.

IV. Fraccionamiento de ácidos nucleicos específicos por inversión selectiva de cargas

Algunos análisis de detección basados en ácidos nucleicos implican el alargamiento y/o el acortamiento de sondas

40 de oligonucleótido. Por ejemplo, según lo descrito en la presente memoria, los análisis de escisión dirigidos por un cebador, los independientes de un cebador y los dirigidos por un invasor, así como el análisis de “mordisqueado”, implican la escisión (i.e., el acortamiento) de oligonucleótidos como un medio para detectar la presencia de una secuencia nucleica diana. Los ejemplos de otros análisis de detección que implican el acortamiento de una sonda de oligonucleótido incluyen el análisis por PCR de traducción de mellas o “TaqMan” descrito en la patente

45 estadounidense n.º 5.210.015 concedida a Gelfand et al., (cuya revelación se incorpora en la presente memoria por referencia), los análisis descritos en las patentes estadounidense n.º 4.775.619 y 5.118.605 concedidas de Urdea (cuyas revelaciones se encuentran en la presente memoria por referencia), el análisis de amplificación de la hibridación catalítica descrito en la patente estadounidense n.º 5.403.711 concedida a Walder y Walder (cuya revelación se encuentra en la presente memoria por referencia) y el análisis de sondas de ciclos descrito en las

50 patentes estadounidenses n.º 4.876.187 y 5.011.769 concedidas a Duck et al., (cuyas revelaciones se encuentran en la presente memoria por referencia). Los ejemplos de análisis de detección que implican el alargamiento de una sonda (o cebador) de oligonucleótido incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrita en las patentes estadounidenses n.º 4.683.195 y 4.683.202 concedidas a Mullis y Mullis et al., (cuyas revelaciones se incorporan en la presente memoria por referencia) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR) descrita en las

55 patentes estadounidenses n.º 5.427.930 y 5.494.810 concedidas de Birkenmeyer et al., y Barany et al., (cuyas revelaciones se incorporan en la presente memoria por referencia). Los ejemplos anteriores pretenden ser ilustrativos de los análisis de detección basados en ácidos nucleicos que implican el alargamiento y/o el acortamiento de sondas de oligonucleótido, y no proporcionan una lista exhaustiva.

Comúnmente, los análisis de detección basados en ácidos nucleicos que implican el alargamiento y/o el 60 acortamiento de sondas de oligonucleótido requieren un análisis de reacción posterior para detectar los productos de la reacción. Lo común es que el o los productos de reacción específicos se deben separar del resto de componentes de reacción, incluyendo la sonda de oligonucleótido de entrada o sin reaccionar. Una técnica de detección implica la separación electroforética de la sonda de oligonucleótido reaccionada y sin reaccionar. Cuando el análisis implica la escisión o el acortamiento de la sonda, el producto sin reaccionar será más largo que el producto reaccionado o

5 escindido. Cuando el análisis implica el alargamiento de la sonda (o el cebador), los productos de reacción serán de una longitud mayor que los de entrada. La electroforesis basada en gel de una muestra que contiene moléculas de ácido nucleico de diferentes longitudes separa estos fragmentos principalmente en base al tamaño. Esto se debe al hecho de que en soluciones que tienen un pH neutro o alcalino, los ácidos nucleicos que tienen tamaños ampliamente diferentes (i.e., pesos moleculares) poseen proporciones de carga y masa muy similares, y no se separan [Andrews, Electrophoresis, 2ª Edición, Oxford University Press (1986), pp. 153–154]. La matriz de gel actúa como tamiz molecular y permite la separación de los ácidos nucleicos en base al tamaño y la forma (p. ej., lineal, circular relajada o círculos super–enrrollados cerrados covalentemente).

Los ácidos nucleicos sin modificar tienen una carga negativa neta debida a la presencia de grupos fosfato cargados negativamente contenidos dentro del esqueleto de azúcar–fosfato del ácido nucleico. Comúnmente, la muestra se

15 aplica al gel cerca del polo negativo y los fragmentos de ácido nucleico emigran en el gel hacia el polo positivo, moviéndose los fragmentos más pequeños más rápido a través del gel.

La presente invención proporciona un nuevo procedimiento para fraccionar los fragmentos de ácido nucleico en base a la carga. Esta nueva técnica de separación se refiere a la observación de que los aductos cargados positivamente pueden afectar al comportamiento electroforético de oligonucleótidos pequeños, porque la carga del aducto es significativa en relación con la carga del complejo total. Además del uso de aductos cargados positivamente (p. ej., colorantes fluorescentes de Cy3 y Cy5, colorantes de unión de ADN heterodiméricos cargados positivamente mostrados en la Fig. 66, etc.), el oligonucleótido puede contener aminoácidos (los aminoácidos particularmente útiles son los aminoácidos cargados: lisina, arginina, aspartato, glutamato), bases modificadas, tales como bases amino– modificadas, y/o un esqueleto de fosfonato (en todas o un subconjunto de las posiciones). Además de lo que se

25 describe más detalladamente más adelante, se puede emplear un colorante neutro o un resto de detección (p. ej., biotina, estreptavidina, etc.) en lugar de un aducto cargado positivamente en combinación con el uso de bases amino–modificadas y/o un esqueleto de fosfonato completo o parcial.

Este efecto observado es de particular utilidad en los análisis basados en la escisión de moléculas de ADN. Mediante el uso de análisis descritos en la presente memoria como ejemplo, cuando se acorta un oligonucleótido mediante la acción de una enzima Cleavase® u otro agente de escisión, se puede formar la carga positiva no sólo hasta reducir significativamente la carga negativa neta, sino hasta, en realidad, anularla, “dando la vuelta” eficazmente a la carga neta de la entidad marcada. Esta inversión de la carga permite la separación de los productos de escisión de diana específica de la sonda sin escindir mediante procedimientos extremadamente sencillos. Por ejemplo, se puede hacer que los productos de escisión emigren hacia un electrodo negativo colocado

35 en cualquier punto de una cuba de reacción, para una detección focalizada sin electroforesis basada en gel; el ejemplo 24 proporciona ejemplos de dispositivos adecuados para la detección focalizada sin electroforesis basada en gel. Cuando se usa una lámina de gel, los pocillos de muestras se pueden colocar en el centro del gel, tal que sea posible observar la emigración de las sondas escindidas y sin escindir en sentidos opuestos. Alternativamente, se puede usar un gel vertical tradicional, pero con los electrodos invertidos con respecto a los geles de ADN habituales (i.e., el electrodo positivo en la parte superior y el electrodo negativo en la inferior) tal que las moléculas escindidas entren en el gel, mientras que las no escindidas entren en el depósito superior del tampón de electroforesis.

Un beneficio importante de este tipo de lectura es la naturaleza absoluta de la separación de los productos de los sustratos, i.e., la separación es casi del 100%. Esto significa que se puede suministrar una abundancia de sonda sin

45 escindir para dirigir la etapa de hibridación del análisis basado en una sonda, pudiendo ser la sonda sin consumir (i.e., sin reaccionar), en esencia, restada del resultado para reducir el fondo en virtud del hecho de que la sonda sin reaccionar no emigrará hacia el mismo polo que el producto de reacción específico.

Mediante el uso de múltiples aductos cargados positivamente, las moléculas sintéticas se pueden construir con una modificación suficiente como para que la cadena cargada negativamente normalmente se vuelva casi neutra. Cuando se construye así, la presencia o la ausencia de un solo grupo fosfato puede significar la diferencia entre una carga negativa neta o una carga positiva neta. Esta observación tiene una utilidad particular cuando uno de los objetivos es diferenciar entre los fragmentos de ADN generados enzimáticamente, que carecen de fosfato 3’, y los productos de degradación térmica, que conservan un fosfato 3’ (y así dos cargas negativas más). Los ejemplos 22 y 23 demuestran la capacidad de separar productos de reacción cargados positivamente de un oligonucleótido

55 sustrato con una carga negativa neta. Según lo tratado en estos ejemplos, los oligonucleótidos se pueden transformar de compuestos con una carga negativa neta a compuestos con una carga positiva neta. En el ejemplo 23, se incorporó el colorante cargado positivamente, Cy3, en el extremo 5' de un 22–mero (SEC ID N.º 50) que también contenía dos residuos amino–sustituidos en el extremo 5' del oligonucleótido; esta sonda de oligonucleótido porta una carga negativa neta. Tras la escisión, que sucedió 2 nucleótidos dentro de la sonda, se liberó el siguiente oligonucleótido marcado: 5'–Cy3–AminoT–AminoT–3’ (así como los 20 nucleótidos restantes de SEC ID N.º 50). Este fragmento corto porta una carga positiva neta, mientras que el resto del oligonucleótido escindido y el oligonucleótido sin reaccionar o de entrada portan cargas negativas netas.

La presente invención contempla realizaciones en las que es posible diseñar el producto de reacción específico producido mediante cualquier escisión de cualquier oligonucleótido para que porte una carga positiva neta, mientras que la sonda sin reaccionar tenga una carga neutra o porte una carga negativa neutra. La presente invención también contempla realizaciones en las que es posible diseñar el producto liberado para que porte una carga 5 negativa neta, mientras que el ácido nucleico de entrada porte una carga positiva neta. En función de la longitud del producto liberado por ser detectado, se pueden incorporar colorantes cargados positivamente en un extremo de la sonda y las bases modificadas se pueden colocar a lo largo del oligonucleótido tal que tras la escisión, el fragmento liberado que contiene el colorante cargado positivamente porte una carga positiva neta. Se pueden usar bases amino–modificadas para equilibrar la carga del fragmento liberado en los casos en los que la sola presencia del aducto cargado positivamente (p. ej., el colorante) no sea suficiente para conferir una carga positiva neta al fragmento liberado. Además, se puede reemplazar el esqueleto de fosfato por un esqueleto de fosfonato a un nivel suficiente como para conferir una carga positiva neta (esto es particularmente útil cuando la secuencia del oligonucleótido no se adapta al uso de bases amino–sustituidas). Las Fig. 45 y 46 muestran la estructura de los oligonucleótidos cortos que contienen un grupo fosfonato en el segundo residuo T. Un oligonucleótido que contiene

15 un esqueleto completamente fosfonato–sustituido sería de carga neutra (sin la presencia de residuos cargados modificados que porten una carga o sin la presencia de un aducto cargado) debido a la ausencia de grupos fosfato cargados negativamente. Los nucleótidos que contienen fosfonato (p. ej., nucleótidos que contienen metilfosfonato) se encuentran fácilmente disponibles y se pueden incorporar en cualquier posición de un oligonucleótido durante la síntesis usando técnicas que son conocidas en la técnica.

En esencia, la invención contempla el uso de la separación en base a la carga para permitir la separación de productos de reacción específicos de los oligonucleótidos de entrada en análisis de detección basados en ácidos nucleicos. La base de esta nueva técnica es el diseño y el uso de sondas de oligonucleótido (comúnmente denominadas “cebadores” en el caso de la PCR) que tienen una “carga equilibrada”, tal que tras bien la escisión o el alargamiento de la sonda, ésta pase a tener una “carga desequilibrada”, y los productos de reacción específicos

25 puedan ser separados de los reactivos de entrada en base a la carga neta.

En el contexto de los análisis que implican el alargamiento de una sonda de oligonucleótido (i.e., un cebador), tales como es el caso de la PCR, los cebadores de entrada se diseñan para que porten una carga positiva neta. El alargamiento del cebador de oligonucleótido corto durante la polimerización generará productos de la PCR que desde ese momento portarán una carga negativa neta. Entonces es posible separar fácilmente los productos de reacción específicos y concentrarlos lejos de los cebadores de entrada usando la técnica de separación en base a la carga descrita en la presente memoria (los electrodos serán invertidos en relación con la descripción del ejemplo 23, pues el producto por ser separado y concentrado tras una PCR portará una carga negativa).

V. Escisión dirigida por invaderTM usando minisondas y sondas de rango medio

Según lo tratado en el apartado III anterior, es posible realizar el análisis de escisión dirigido por invaderTM usando

35 oligonucleótidos invasor y sonda que tengan una longitud de aproximadamente 13–25 nucleótidos (comúnmente 20– 25 nucleótidos). También se contempla la posibilidad de que los oligonucleótidos que abarcan las regiones X, Y y Z (véase la Fig. 25), los oligonucleótidos invasor y sonda, estén compuestos por las secuencias de oligonucleótidos más cortas que se alinean a lo largo de la cadena diana, pero que no están unidas mediante enlace covalente. Esto significa que hay una mella en el esqueleto de azúcar–fosfato del oligonucleótido compuesto, pero que no hay interrupción alguna en la progresión de los nucleótidos con apareamiento de bases en el dúplex resultante. Cuando se alinean de manera contigua cadenas cortas de ácido nucleico a lo largo de una cadena más larga, la hibridación de cada una se estabiliza mediante la hibridación de los fragmentos vecinos, porque los pares de bases pueden apilarse a lo largo de la hélice como si la estructura estuviera de hecho ininterrumpida. Esta colaboración en la unión puede aportar a cada segmento una estabilidad de interacción superior a la que sería esperada para la hibridación

45 de segmentos con el ácido nucleico más largo solo. Una aplicación de esta observación ha sido la de ensamblar cebadores para la secuenciación de ADN, comúnmente aproximadamente de 18 nucleótidos de longitud, procedentes de conjuntos de tres oligonucleótidos hexámeros que están diseñados para que se hibriden de este modo [Kotler, L.E., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:4241]. El cebador doblemente mellado resultante se puede alargar enzimáticamente en reacciones llevadas a cabo a temperaturas de las que se podría esperar que interrumpieran la hibridación de hexámeros, pero no de 18–meros.

El uso de oligonucleótidos compuestos o partidos se aplica con éxito en el análisis de la escisión dirigida por InvaderTM. El oligonucleótido sonda puede ser partido en dos oligonucleótidos que se aparean de un modo contiguo y adyacente a lo largo de un oligonucleótido diana según lo representado en el diagrama de la Fig. 57. En esta figura, el oligonucleótido de secuencia abajo (análogo a la sonda de la Fig. 25) se ensambla a partir de dos piezas más

55 pequeñas: un segmento corto de 6–10 nt (denominado “minisonda”), que se va a escindir durante la reacción de detección, y un oligonucleótido que se hibrida inmediatamente secuencia abajo de la minisonda (denominado “apilador”), que sirve para estabilizar la hibridación de la sonda. Para formar la estructura de escisión, se proporciona un oligonucleótido secuencia arriba (el oligo “invaderTM”) para dirigir la actividad de escisión hasta una región deseada de la minisonda. El ensamblaje de la sonda a partir de piezas no unidas de ácido nucleico (i.e., la minisonda y el apilador) permite cambiar las regiones de secuencias sin la necesidad de volver a sintetizar la secuencia probada completa, mejorando así los costes y la flexibilidad del sistema de detección. Además, el uso de oligonucleótidos compuestos no enlazados aumenta el carácter restrictivo del sistema en su necesidad por una hibridación de apareamiento perfecto con el fin de conseguir una generación de señales, permitiendo su uso como

un medio sensible de detección de mutaciones o cambios en las secuencias de ácidos nucleicos diana.

Según lo ilustrado en la Fig. 57, en una realización, los procedimientos de la presente invención emplean al menos tres oligonucleótidos que interactúan con un ácido nucleico diana para formar una estructura de escisión para una 5 nucleasa de estructura específica. Más específicamente, la estructura de escisión comprende: i) un ácido nucleico diana que puede ser bien monocatenario o bicatenario (cuando se emplea un ácido nucleico diana bicatenario, se puede convertir en monocatenario, p.ej., calentándolo); ii) un primer oligonucleótido, denominado “apilador” que define una primera región de la secuencia de ácido nucleico diana siendo el complemento de esa región (región W de la diana como se muestra en la Fig. 57); iii) un segundo oligonucleótido, denominado la “minisonda”, que define 10 una segunda región de la secuencia de ácido nucleico diana, siendo el complemento de esa región (regiones X y Z de la diana como se muestran en la Fig. 57); iv) un tercer oligonucleótido, denominado el “invasor”, definiendo la parte 5’ del mismo una tercera región de la misma secuencia de ácido nucleico diana (regiones Y y X de la Fig. 57), adyacente a y secuencia abajo de la segunda región diana (regiones X y Z), y solapándose la segunda o parte 3’ del mismo en la región definida por el segundo oligonucleótido (la región X representa la región de solapamiento). La

15 estructura resultante se representa en un diagrama en la Fig. 57.

Aunque sin limitar la invención o la presente descripción a ningún mecanismo de acción en concreto, el diagrama de la Fig. 57 representa el efecto sobre el sitio de escisión causado por este tipo de disposición de tres oligonucleótidos. El diseño de estos tres oligonucleótidos se describe a continuación detalladamente. En la Fig. 57, los extremos 3’ de los ácidos nucleicos (i.e., la diana y los oligonucleótidos) se indican por el uso de puntas de flecha en los extremos 20 de las líneas que representan las cadenas de los ácidos nucleicos (y cuando lo permite el espacio, estos extremos también están marcados con “3’”). Se aprecia fácilmente que los tres oligonucleótidos (el invasor, la minisonda y el apilador) están dispuestos en una orientación paralela entre sí, mientras que la cadena de ácido nucleico diana está dispuesta en una orientación antiparalela en relación con los tres oligonucleótidos. Además, está claro que el oligonucleótido invasor se localiza secuencia arriba del oligonucleótido minisonda y que el oligonucleótido minisonda 25 está localizado secuencia arriba del oligonucleótido apilador, y que con respecto a la cadena de ácido nucleico diana, la región W está secuencia arriba de la región Z, la región Z está secuencia arriba de la región X y la región X está secuencia arriba de la región Y (es decir, la región Y está secuencia abajo de la región X, la región X está secuencia abajo de la región Z y la región Z está secuencia abajo de la región W). Las regiones de complementariedad entre las cadenas opuestas se indican con líneas verticales cortas. Aunque no se pretende indicar la localización precisa

30 del o de los sitios de escisión, la zona a la que es desplazado el sitio de escisión del oligonucleótido minisonda por la presencia del oligonucleótido invasor se indica con la punta de flecha vertical continua. La Fig. 57 no pretende representar el mecanismo real de acción o la disposición física de la estructura de escisión y, además, no se pretende limitar el procedimiento de la presente invención a un mecanismo de acción en concreto.

Se puede considerar que la unión de estos oligonucleótidos divide el ácido nucleico diana en cuatro regiones

35 distintas: una región que sólo tiene complementariedad con el invasor (mostrada como “W”); una región que sólo tiene complementariedad con la minisonda (mostrada como “Z”); una región que sólo tiene complementariedad con el oligo InvaderTM (mostrada como “Y”); y una región que tiene complementariedad con el oligonucleótido InvaderTM y la minisonda (mostrada como “X”).

Además de los beneficios citados anteriormente, el uso de un diseño compuesto para los oligonucleótidos que

40 forman la estructura de escisión permite una mayor flexibilidad en el diseño de las condiciones de reacción para realizar el análisis de la escisión dirigida por InvaderTM. Cuando se usa una sonda más larga (p. ej., 16–25 nt), según lo descrito en el apartado II anterior, para la detección en reacciones que son llevadas a cabo a temperaturas por debajo de la Tf de esa sonda, la escisión de la sonda puede desempeñar un papel significativo en la desestabilización del dúplex del que forma parte, permitiendo así la renovación y la reutilización del sitio de

45 reconocimiento sobre el ácido nucleico diana. Por el contrario, con minisondas, las temperaturas de reacción que están a o por encima de la Tf de la sonda significan que las moléculas de sonda se están hibridando y liberando de la diana muy rápidamente incluso sin la escisión de la sonda. Cuando se proporcionan un oligonucleótido InvaderTM secuencia arriba y un medio de escisión, la minisonda será escindida específicamente, pero la escisión no será necesaria para la renovación de la minisonda. Si se fuera a usar una sonda larga (p. ej., 16–25 nt) de este modo, las

50 temperaturas necesarias para lograr este estado serían bastante altas, alrededor de 65 a 70°C para un 25–mero de una composición de bases media. La necesidad del uso de tales temperaturas elevadas limita la elección de los agentes de escisión a aquéllos que son muy termoestables y pueden contribuir al fondo en las reacciones, dependiendo del medio de detección, a través de la degradación térmica de los oligonucleótidos sonda. De este modo, las sondas más cortas son preferibles para un uso de este modo.

55 La minisonda de la presente invención puede variar en tamaño en función de la aplicación deseada. En una realización, la sonda puede ser relativamente corta en comparación con una sonda estándar (p. ej., 16–25 nt), en el intervalo de 6 a 10 nucleótidos. Cuando se usa tal sonda corta, se pueden elegir condiciones de reacción que eviten la hibridación de la minisonda en ausencia del oligonucleótido apilador. De este modo, se puede elaborar una sonda corta que adopte la especificidad y selectividad estadística de una secuencia más larga. En el caso de una

60 perturbación en la unión cooperativa de los ácidos nucleicos minisonda y apilador, como podría ocurrir por un apareamiento erróneo en la secuencia corta (i.e., la región “Z” que es la región de la minisonda que no se solapa con el invasor) o en la unión entre los dúplex contiguos, esta colaboración se puede perder, reduciéndose de manera espectacular la estabilidad del oligonucleótido más corto (i.e., la minisonda) y reduciendo así el nivel de producto escindido en el análisis de la presente invención.

También se contempla la posibilidad de usar sondas de tamaño intermedio. Tales sondas, en el intervalo de 11 a 15 nucleótidos, pueden combinar alguna de las características asociadas con las sondas más largas según lo descrito

5 al principio, incluyendo estas características la capacidad de hibridarse y de ser escindidas sin la ayuda de un oligonucleótido apilador. A temperaturas por debajo de la Tf esperada de tales sondas, los mecanismos de renovación pueden ser como los descritos anteriormente para las sondas en el intervalo de 20 nt, y pueden depender de la eliminación de la secuencia de la región “X” para la desestabilización y los ciclos.

Las sondas de rango medio también se pueden usar a temperaturas elevadas, a o por encima de sus Tf esperadas,

10 para permitir la combinación más que la escisión con el fin de promover la renovación de la sonda. Sin embargo, a diferencia de las sondas más largas descritas anteriormente, las temperaturas necesarias para permitir el uso de tal renovación dirigida térmicamente son mucho más bajas (aproximadamente 40 a 60°C), preservando así de l a degradación térmica tanto el medio de escisión como los ácidos nucleicos en la reacción. De este modo, las sondas de rango medio pueden actuar en algunos casos como las minisondas descritas anteriormente. En una mayor

15 similitud con las minisondas, la acumulación de señal de escisión procedente de la sonda de rango medio puede verse potenciada en algunas condiciones de reacción por la presencia de un apilador.

En resumen, una sonda larga estándar habitualmente no se beneficia de la presencia de un oligonucleótido apilador secuencia abajo (siendo la excepción los casos en los que tal oligonucleótido también puede interrumpir estructuras en el ácido nucleico diana que interfieren con la unión de la sonda), y se usa habitualmente en condiciones que

20 requieren la eliminación de varios nucleótidos para permitir la liberación del oligonucleótido de la diana de una manera eficaz.

La minisonda es muy corta y actúa de manera óptima en presencia de un oligonucleótido apilador secuencia abajo. Las minisondas están bien adaptadas a condiciones de reacción que usan la temperatura de la reacción para dirigir un intercambio rápido de las sondas sobre la diana independientemente de si se ha escindido alguna base. En las

25 reacciones con cantidad suficiente de medio de escisión, las sondas que se unen serán rápidamente escindidas antes de su fusión.

La sonda de rango medio o la sonda media combina las características de estas sondas y se puede usar en reacciones como aquéllas denominadas sondas largas, con regiones más largas de solapamiento (regiones “X”) para dirigir la renovación de la sonda a temperatura más baja. En una realización preferida, las sondas de rango 30 medio se usan a temperaturas suficientemente elevadas como para que las sondas se hibriden a la diana y se liberen rápidamente independientemente de la escisión. Esto es lo que se conoce como el comportamiento de los oligonucleótidos a o cerca de su temperatura de fusión. Este modo de renovación es más similar al usado con combinaciones de minisonda/apilador que al usado con sondas largas. La sonda de rango medio puede tener un mayor rendimiento en presencia de un apilador en las mismas circunstancias. Por ejemplo, con una sonda en el

35 extremo inferior del rango medio, p. ej., 11 nt, o una con un contenido excepcional de A/T, en una reacción realizada adecuadamente con una Tf de la sonda en exceso (p. ej., >10°C que antes), l a presencia de un apilador tendría probabilidad de aumentar el rendimiento de la sonda, mientras que a una temperatura más moderada, la sonda puede ser indiferente al apilador.

No se contempla que las distinciones entre la minisonda, la sonda media (i.e., de rango medio) y la sonda larga sean

40 inflexibles y sólo se basen en la longitud. El rendimiento de cualquier sonda dada puede variar con su secuencia específica, la elección de las condiciones de la solución, la elección de la temperatura y el medio de escisión seleccionado.

En el ejemplo 18, se muestra que el ensamblaje de oligonucleótidos que comprende la estructura de escisión de la presente invención es sensible a los apareamientos erróneos entre la sonda y la diana. El sitio del apareamiento 45 erróneo usado en el Ej. 8 proporciona un ejemplo y no pretende ser una limitación de la ubicación de un apareamiento erróneo que afecte a la escisión. También se contempla el uso de un apareamiento erróneo entre el oligonucleótido InvaderTM y la diana para distinguir secuencias diana relacionadas. En el sistema de 3 oligonucleótidos, que comprende un oligonucleótido InvaderTM, sonda y apilador, se contempla que los apareamientos erróneos pueden estar localizados dentro de cualquiera de las regiones del dúplex formado entre

50 estos oligonucleótidos y la secuencia diana. En una realización preferida, un apareamiento erróneo por ser detectado se localiza en la sonda. En una realización particularmente preferida, el apareamiento erróneo está en la sonda, en el par de bases situado inmediatamente secuencia arriba (i.e., 5’) del sitio que es escindido cuando la sonda no está apareada erróneamente con la diana.

En otra realización preferida, un apareamiento erróneo por ser detectado se localiza en la región “Z” definida por la

55 hibridación de una minisonda. En una realización particularmente preferida, el apareamiento erróneo está en la minisonda, en el par de bases inmediatamente secuencia arriba (i.e., 5’) del sitio que es escindido cuando la minisonda no está apareada erróneamente con la diana.

También se contempla la posibilidad de detectar diferentes secuencias en una sola reacción. Las sondas específicas para las secuencias diferentes pueden estar marcadas diferencialmente. Por ejemplo, las sondas pueden tener diferentes colorantes u otros restos detectables, diferentes longitudes, o pueden tener diferencias en las cargas netas de los productos tras la escisión. Cuando se marca diferencialmente en uno de estos modos, se puede contar la contribución de cada secuencia diana específica al producto final. Esto tiene aplicación en la detección de

5 cantidades de diferentes versiones de un gen dentro de una mezcla. Los diferentes genes de una mezcla por ser detectados y cuantificados pueden ser de tipo natural y genes mutantes, p. ej., como los que se pueden encontrar en una muestra tumoral (p.ej., una biopsia). En esta realización, se podrían diseñar las sondas hasta exactamente el mismo sitio, pero una para que se aparee con la secuencia de tipo natural y una para que se aparee con la mutante. La detección cuantitativa de los productos de escisión de una reacción llevada a cabo durante una determinada cantidad de tiempo revelará la proporción de los dos genes en la mezcla. Tal análisis también se puede realizar en genes no relacionados de una mezcla. Este tipo de análisis no pretende limitarse a dos genes. Se pueden medir de manera similar muchas variantes de una mezcla.

Alternativamente, se pueden controlar y cuantificar diferentes sitios de un solo gen para verificar la medición de ese

gen. En esta realización, se esperaría que la señal procedente de cada sonda fuera la misma.

15 También se contempla la posibilidad de usar múltiples sondas que no estén marcadas diferencialmente, tal que se mida la señal total. Esto puede ser deseable cuando se usan muchas sondas diseñadas para detectar un solo gen para aumentar la señal procedente de ese gen. Esta configuración también se puede usar para la detección de secuencias no relacionadas de una mezcla. Por ejemplo, en un banco de sangre, es deseable saber si uno cualquiera de un huésped de agentes infecciosos está presente en una muestra de sangre. Como la sangre se desecha independientemente de qué agente esté presente, no se necesitarían diferentes señales sobre las sondas en tal aplicación de la presente invención, pudiendo ser en realidad indeseables por razones de confidencialidad.

Tal y como se describe para el sistema de dos oligonucleótidos anterior, la especificidad de la reacción de detección será influida por la longitud total de las secuencias de ácido nucleico diana implicadas en la hibridación del conjunto completo de los oligonucleótidos de detección. Por ejemplo, puede haber aplicaciones en las que sea deseable

25 detectar una sola señal dentro de un genoma complejo. En tal caso, se puede seleccionar el conjunto de oligonucleótidos para que necesite el reconocimiento exacto mediante la hibridación de un segmento más largo de un ácido nucleico diana, habitualmente en el intervalo de 20 a 40 nucleótidos. En otros casos, puede ser deseable tener el conjunto de oligonucleótidos en interacción con múltiples sitios de una muestra diana. En estos casos, un enfoque sería usar un conjunto de oligonucleótidos que reconociera un segmento más pequeño y, por tanto, estadísticamente más común de secuencia de ácido nucleico diana.

En una realización preferida, el oligonucleótido invasor y apilador se pueden diseñar para que sean máximamente estables, tal que permanezcan unidos a la secuencia diana durante períodos prolongados de la reacción. Esto se puede lograr a través de una cualquiera de un número de medidas conocidas por los expertos en la técnica, tales como añadir más secuencias hibridantes a la longitud del oligonucleótido (hasta aproximadamente 50 nt de longitud

35 total) o mediante el uso de residuos con carga negativa reducida, tales como fosforotioatos o residuos de ácido nucleico peptídico, tal que las cadenas complementarias no se repelan entre sí hasta el grado que lo hacen las cadenas naturales. Tales modificaciones también pueden servir para hacer estos oligonucleótidos flanqueantes resistentes a nucleasas contaminantes, garantizando así aún más su presencia continuada sobre la cadena diana durante el transcurso de la reacción. Además, el oligonucleótido InvaderTM y apilador pueden ser unidos covalentemente a la diana (p. ej., a través del uso de un entrecruzamiento con psoralenos).

El uso de temperaturas de reacción en o cerca de la Tf del oligonucleótido sonda, en lugar de las usadas para la escisión, para dirigir la renovación del oligonucleótido sonda en estas reacciones de detección significa que la cantidad del oligonucleótido sonda escindido puede ser reducida sustancialmente sin afectar de manera negativa a la velocidad de renovación. Se ha determinado que la relación entre el extremo 3' del oligonucleótido secuencia 45 arriba y el sitio deseado de escisión de la sonda debe ser diseñada detenidamente. Se sabe que el sitio preferido de escisión para los tipos de endonucleasas de estructura específica empleados en la presente memoria es un par de bases de un dúplex (Lyamichev et al., supra). Antes se creía que la presencia de un oligonucleótido o un cebador secuencia arriba permitía el desplazamiento del sitio de escisión lejos de este sitio preferido, a la región monocatenaria del brazo 5’ (Lyamichev et al., supra y la patente estadounidense n.º 5.422.253). A diferencia de este mecanismo anteriormente propuesto, y sin limitar la presente invención a ningún mecanismo en concreto, se cree que el nucleótido inmediatamente 5’, o secuencia arriba del sitio de escisión de la sonda (incluyendo la minisonda y las sondas de rango medio) debe ser capaz de aparearse con la diana para que tenga lugar una escisión eficiente. En el caso de la presente invención, éste sería el nucleótido de la secuencia de sonda inmediatamente secuencia arriba del sitio de escisión deseado. Además, según lo descrito en la presente memoria, se ha observado que para

55 dirigir la escisión hacia ese mismo sitio de la sonda, el oligonucleótido secuencia arriba debe tener su base 3’ (i.e., nt) inmediatamente secuencia arriba del sitio de escisión deseado de la sonda. Esto coloca al nucleótido del terminal 3’ del oligonucleótido secuencia arriba y la base del oligonucleótido sonda en 5’ del sitio de escisión en competición para el apareamiento con el correspondiente nucleótido de la cadena diana.

Para examinar el resultado de esta competición, i.e., qué base se aparea durante una escisión satisfactoria, se realizaron sustituciones en el oligonucleótido sonda e invasor tal que bien el oligonucleótido sonda o el Invader™ fueron apareados erróneamente con la secuencia diana en esta posición. Se examinaron los efectos de ambas disposiciones sobre las velocidades de escisión. Cuando el oligonucleótido Invader™estaba desapareado en el extremo 3', no se redujo la velocidad de escisión. Sin embargo, cuando se retiró esta base, el sitio de escisión se desplazó secuencia arriba del sitio deseado. Por el contrario, si el oligonucleótido sonda no tenía apareamiento de bases con la diana justo secuencia arriba del sitio al que el oligonucleótido Invader™estaba dirigiendo la escisión, la

5 velocidad de escisión se redujo de manera espectacular, lo que sugiere que cuando existe competición, el oligonucleótido sonda es la molécula que se aparea en esta posición.

Parece que el extremo 3' del oligonucleótido invasor secuencia arriba es desapareado durante la escisión y sigue siendo necesario para un posicionamiento exacto de la escisión. Para examinar qué parte o partes del nucleótido del terminal 3’ se necesitan para posicionar la escisión, se diseñaron oligonucleótidos Invader™que terminaban en este 10 extremo con nucleótidos que estaban modificados en una variedad de modos. Los azúcares examinados incluyeron 2’desoxirribosa con un grupo fosfato 3’, una didesoxirribosa, 3’desoxirribosa, 2’O–metil–ribosa, arabinosa y arabinosa con un fosfato 3’. Se analizaron ribosas abásicas con y sin fosfato 3’. Se analizaron bases “universales” sintéticas tales como en 3–nitropirrol y 5–3nitroindol sobre azúcares ribosa. Finalmente, se analizó una estructura de anillo aromático de tipo base, acridina, unida al extremo 3' del nucleótido anterior sin un grupo azúcar. Los

15 resultados obtenidos apoyan la conclusión de que el anillo aromático de la base (en el extremo 3' del oligonucleótido invasor) es el resto necesario para realizar la dirección de la escisión hacia el sitio deseado de la sonda secuencia abajo.

VI. Aumento de señales mediante la prolongación de productos de reacción en el análisis de escisión dirigido por InvaderTM

20 Se ha determinado que cuando se usan sondas de oligonucleótido en los análisis de detección de la escisión a temperatura elevada, se habrá acortado alguna fracción de las sondas truncadas mediante degradación térmica inespecífica, y que tales productos de ruptura pueden dificultar el análisis de los datos de la escisión de diana específica. La escisión de fondo tal como ésta, cuando no se resuelve a partir de productos de escisión específicos, puede reducir la exactitud de la cuantificación de los ácidos nucleicos diana en base a la cantidad de producto

25 acumulado en un determinado marco temporal. Un medio de distinguir los productos específicos de los inespecíficos se revela anteriormente, y se basa en dividir los productos de estas reacciones según las diferencias en las cargas netas portadas por las diferentes especies moleculares en la reacción. Como se señaló en esa descripción, los productos de ruptura térmica habitualmente conservan los fosfatos 3’ tras la ruptura, mientras que los productos escindidos enzimáticamente no. Las dos cargas negativas del fosfato facilitan la división en base a la carga de los

30 productos.

La ausencia de un fosfato 3’ sobre el subconjunto deseado de los fragmentos de sonda se puede usar como ventaja también en los análisis enzimáticos. Las polimerasas de ácido nucleico tanto las que carecen de molde (p. ej., desoxinucleotidil transferasa terminal, poli(A) polimerasa) como las dependientes del molde (p. ej., ADN polimerasas de tipo Pol I), requieren un hidroxililo 3’ disponible mediante el que unir más nucleótidos. Esta selección enzimática

35 de la estructura de extremo 3' se puede usar como un medio eficaz de división entre los productos específicos e inespecíficos.

Además de los beneficios de la división descritos anteriormente, la adición de nucleótidos en el extremo del producto específico de una escisión de invasor específico ofrece la oportunidad de bien añadir un marcador a los productos, de añadir colas capturables para facilitar los sistemas de lectura basados en soportes sólidos o de hacer ambas

40 cosas al mismo tiempo. En la Fig. 56, se ilustran algunas realizaciones posibles de este concepto.

En la Fig. 56, se muestra una estructura de escisión por Invader™que comprende un oligonucleótido Invader™que contiene un extremo 3' bloqueado o no prolongable (p. ej., un didesoxinucleótido 3’) y un oligonucleótido sonda que contiene un extremo 3' bloqueado o no prolongable (el círculo abierto del extremo 3' de los oligonucleótidos representa un nucleótido no prolongable) y un ácido nucleico diana; el oligonucleótido sonda puede contener un 45 marcador del extremo 5' tal como un marcador de biotina o de fluoresceína (indicado por las estrellas). (Las estructuras de escisión que emplean una sonda marcada con biotina en 5’ o una sonda marcada con fluoresceína en 5’ se muestran debajo del diagrama grande de la estructura de escisión a la izquierda y la derecha, respectivamente). Tras la escisión de la sonda (el sitio de escisión se indica con una gran punta de flecha), se alarga la sonda marcada con biotina escindida usando una polimerasa independiente del molde (p. ej., TdT) y nucleótidos trifosfato marcados

50 con fluoresceína. Entonces se captura la molécula de sonda escindida prolongada con fluoresceína mediante la unión a través de su marcador de biotina de 5’ con estreptavidina, y luego se mide la fluoresceína. Alternativamente, tras la escisión de una sonda marcada con fluoresceína en 5’, se alarga la sonda escindida usando una polimerasa independiente del molde (p. ej., TdT) y dATP. Entonces se captura la molécula de sonda escindida (prolongada con A) poliadenilada mediante la unión a través de la cola de poli(A) con oligo dT unido a un soporte sólido.

55 Los ejemplos descritos en la Fig. 56 se basan en el uso de TdT para prolongar los productos específicos de escisión dirigida por Invader™. La descripción del uso de esta enzima concreta se presenta a modo de ejemplo y no pretende ser considerada una limitación (de hecho, cuando se emplean oligos sonda que comprenden ARN, se pueden alargar sondas de ARN escindidas usando polimerasa poli(A)). Se contempla la posibilidad de configurar un análisis de este tipo para usar una polimerasa dependiente del molde según lo descrito anteriormente. Mientras que esto

60 requeriría la presencia de un molde de copia adecuado distinto del ácido nucleico diana, sobre el que el oligonucleótido truncado podría cebar la síntesis, es posible prever la posibilidad de activar una sonda que, antes de la escisión, fuera improlongable, debido bien a un apareamiento erróneo o una modificación del extremo 3', como un cebador cuando se escinde mediante una escisión dirigida por un invasor. La reacción de prolongación dirigida por un molde también tiene la ventaja de permitir una mayor selección y control de los nucleótidos incorporados.

5 El uso de una prolongación sin molde no requiere la presencia de ningún otro ácido nucleico en la reacción de detección, evitando una etapa de desarrollo y resolución de problemas del análisis. Además, el uso de una síntesis sin molde eliminó la etapa de hibridación, acelerando posiblemente el análisis. Además, la enzima TdT es rápida, capaz de añadir al menos >700 nucleótidos a los oligonucleótidos sustrato en una reacción de 15 minutos.

Como se menciona anteriormente, las colas añadidas se pueden usar en un número de modos. Se puede usar como

10 un modo directo de añadir restos marcados al producto de escisión para aumentar la señal procedente de cada escisión. Tal reacción se representa en el lado izquierdo de la Fig. 66. Los restos marcados pueden ser cualquier cosa que pueda ser añadida, cuando esté unida a un nucleótido, por la enzima de prolongación, tal como moléculas de colorante, haptenos tales como digoxigenina u otros grupos de unión tales como la biotina.

En una realización preferida, el análisis incluye un procedimiento para capturar o separar específicamente los

15 productos de escisión dirigida por un invasor prolongado en la mezcla. Se puede observar que los ácidos nucleicos diana de la mezcla se pueden prolongar durante la reacción. Si se añade un marcador, es deseable separar los productos de escisión dirigida por un invasor prolongado de estas otras moléculas marcadas para evitar el fondo en los resultados. Esto se hace fácilmente si sólo el producto de escisión es capaz de ser capturado. Por ejemplo, supongamos un análisis de escisión de la presente invención en el que la sonda usada tiene una biotina sobre el

20 extremo 5' y está bloqueada desde la prolongación sobre el extremo 3', y a la que se añade un colorante durante la prolongación. Supongamos además que los productos van a ser capturados sobre un soporte a través de un resto de biotina, y el colorante capturado va a ser medido para evaluar la presencia del ácido nucleico diana. Cuando se añade el marcador mediante la prolongación, sólo se marcarán las sondas escindidas específicamente. Las sondas sin cortar residuales pueden todavía unirse en la etapa de captura final, pero no contribuirán a la señal. En la misma

25 reacción, las mellas y los cortes del ácido nucleico diana pueden ser prolongados por la enzima, quedando así marcados con colorante. En la captura final, estas dianas marcadas no se unirán al soporte, y por tanto, aunque marcadas, no contribuirán a la señal. Si suponemos que el producto específico final está constituido por dos partes, la parte derivada de la sonda y la parte de la cola, se puede observar a partir de esta descripción que es particularmente preferible que cuando se use la parte derivada de la sonda para una captura específica, bien

30 mediante hibridación, biotina/estreptavidina u otro procedimiento, el marcador esté asociado con la parte de la cola. Por el contrario, si se une el marcador a la parte derivada de la sonda, entonces la parte de la cola se puede hacer adecuada para la captura, según lo representado en el lado derecho de la Fig. 66. Las colas se pueden capturar de un número de modos, incluyendo la hibridación, la incorporación de biotina con captura de estreptavidina, o en virtud del hecho de que moléculas de mayor tamaño se unen más predecible y eficazmente con un número de matrices de

35 ácidos nucleicos, tales como nitrocelulosa, nylon o vidrio, en membrana, papel, resina u otra forma. Aunque no es necesaria para este análisis, esta separación de funciones permite la exclusión eficaz de la señal de tanto la sonda sin reaccionar como del ácido nucleico diana prolongado.

Además de los soportes descritos anteriormente, los productos prolongados se pueden capturar sobre cualquier

soporte que contenga un resto de captura adecuado. Por ejemplo, los productos biotinilados se capturan

40 generalmente con superficies tratadas con avidina. Estas superficies de avidina pueden estar en pocillos de placas de microvaloración, sobre perlas, sobre varillas medidoras, por nombrar solo unas cuantas de las posibilidades. Tales superficies también se pueden modificar para que contengan oligonucleótidos específicos, permitiendo la captura del producto por hibridación. Los expertos en la técnica conocen en general las superficies de captura según lo descrito aquí e incluyen varillas de medición de nitrocelulosa (p.ej., GeneComb™, BioRad, Hercules, CA).

45 VII. Enzimas mejoradas para su uso en reacciones de escisión dirigidas por Invader™

Una estructura de escisión se define en la presente memoria como una estructura que se forma mediante la interacción de un oligonucleótido sonda y un ácido nucleico diana para formar un dúplex, siendo dicha estructura resultante escindible por un medio de escisión, incluyendo pero no limitándose a una enzima. La estructura de escisión se define además como un sustrato para la escisión específica por el medio de escisión a diferencia de una 50 molécula de ácido nucleico, que es un sustrato para la escisión inespecífica por agentes tales como fosfodiesterasas. Los ejemplos de algunas estructuras de escisión posibles se muestran en la Fig. 15. Considerando mejoras en los medios de escisión enzimática, se puede considerar la acción de dichas enzimas sobre cualquiera de estas estructuras y sobre cualquier otra estructura que se ajuste a la definición de una estructura de escisión. Los sitios de escisión indicados sobre las estructuras de la Fig. 15 se presentan a modo de ejemplo. Se contempla la escisión

55 específica en cualquier sitio de tal estructura.

Las mejoras en una enzima pueden ser una velocidad mayor o menor de escisión de uno o más tipos de estructuras. Las mejoras también pueden resultar en más o menos sitios de escisión sobre una o más de dichas estructuras de escisión. En el desarrollo de una genoteca de nuevas nucleasas de estructura específica para su uso en análisis de escisión de ácidos nucleicos, las mejoras pueden tener muchas realizaciones diferentes, cada una relacionada con

60 la estructura del sustrato específica usada en un determinado análisis.

Como ejemplo, se puede considerar una realización del análisis de la escisión dirigida por Invader™de la presente invención. En el análisis de la escisión dirigida por Invader™, la acumulación de material escindido se ve influida por varias características del comportamiento enzimático. No es sorprendente que la velocidad de renovación o el número de estructuras que pueden ser escindidas por una sola molécula de enzima en una determinada cantidad de

5 tiempo es muy importante en la determinación de la cantidad de material procesado durante el transcurso de una reacción de análisis. Si una enzima requiere mucho tiempo para reconocer un sustrato (p. ej., si se presenta con una estructura inferior a la óptima) o si le lleva mucho tiempo ejecutar la escisión, la velocidad de acumulación de producto es inferior que si estas etapas se llevan a cabo rápidamente. Si estas etapas son rápidas, pero la enzima sigue “sujeta” a la estructura escindida y no pasa inmediatamente a otra estructura sin cortar, la velocidad se verá afectada negativamente.

La renovación enzimática no es el único modo en el que el comportamiento enzimático puede afectar negativamente a la velocidad de acumulación del producto. Cuando el medio usado para visualizar o medir producto es específico de un producto definido con exactitud, los productos que se apartan de la definición pueden escapar de la detección, pudiendo así parecer la velocidad de acumulación del producto más baja de lo que es. Por ejemplo, si se tuviera un 15 detector sensible para trinucleótidos que no pudiera ver di– o tetranucleótidos, o algún otro oligonucleótido de un tamaño distinto a 3 residuos, en el análisis de la escisión dirigida por Invader™de la presente invención, cualquier escisión errada reduciría la señal detectable proporcionablemente. A partir de los datos de escisión presentados aquí, se puede observar que, mientras que habitualmente hay un sitio de una sonda que es favorecido por la escisión, a menudo hay productos que surgen de la escisión uno o más nucleótidos más allá del sitio de escisión principal. Estos son productos que dependen de la diana y, por tanto, no son fondo inespecífico. No obstante, si un sistema de visualización posterior puede detectar sólo el producto principal, éstos representan una pérdida de señal. Un ejemplo de tal sistema de visualización selectiva es la lectura de inversión de cargas presentada en la presente memoria, en la que el equilibrio de las cargas positivas y negativas determina el comportamiento de los productos. En tal sistema, la presencia de un nucleótido más o la ausencia de un nucleótido esperado pueden excluir un

25 producto de escisión legítimo de la detección final dejando ese producto con el balance erróneo de carga. Se puede observar fácilmente que la sensibilidad de cualquier análisis que pueda distinguir sensiblemente el contenido de nucleótidos de un oligonucleótido, tal como una hibridación estándar en condiciones restrictivas, se ve afectada cuando alguna fracción del producto legítimo no reúne los requisitos necesarios para una detección satisfactoria mediante ese análisis.

Estas descripciones sugieren dos rasgos muy deseables en cualquier enzima por usar en el procedimiento de la presente invención. Para empezar, cuanto más rápido ejecuta la enzima una reacción de escisión completa, incluyendo el reconocimiento, la escisión y la liberación, más señal se puede crear en el análisis de escisión dirigido por un invasor. En segundo lugar, cuanto más satisfactoria sea una enzima en la focalización hacia un solo sitio de escisión de una estructura, más producto de escisión podrá ser detectado satisfactoriamente en una lectura selectiva.

35 Las razones citadas anteriormente para mejorar las enzimas por ser usadas en el análisis de escisión dirigido por Invader™pretenden servir como ejemplo de una dirección que permitiría buscar tales mejoras, pero no como un límite de bien la naturaleza o las aplicaciones de las actividades enzimáticas mejoradas. Como otra dirección del cambio de actividad que podría ser considerada apropiadamente como mejora, se pueden usar como ejemplo las nucleasas 5' asociadas a ADNp. Al crear alguna de las nucleasas 5' deficientes en polimerasa descritas en la presente memoria, se descubrió que aquéllas que fueron creadas mediante la eliminación de partes sustanciales del dominio polimerasa, según lo representado en la Fig. 4, adoptaron actividades que eran débiles o ausentes en las proteínas precursoras. Estas actividades incluían la capacidad de escindir la estructura no ahorquillada mostrada en la Fig. 15D, una capacidad enormemente aumentada de eliminar exonucleolíticamente nucleótidos de los extremos 5’ de las cadenas duplicadas, y una capacidad incipiente de escindir moléculas circulares sin el beneficio de un

45 extremo 5' libre.

Además de las nucleasas 5' derivadas de las ADN polimerasas, la presente invención también contempla el uso de nucleasas de estructura específica que no derivan de las ADN polimerasas. Por ejemplo, se ha identificado una clase de endonucleasas eucariotas y arqueabacterianas que tienen una especificidad de sustrato similar a las nucleasas 5' de ADN polimerasas de tipo Pol I. Estas son la proteínas FEN1 (Flap EndoNuclease), RAD2 y XPG (Xerderma Pigmentoso del grupo de complementación G). Estas proteínas están implicadas en la reparación del ADN y se ha observado que favorecen la escisión de estructuras que se asemejan a un brazo 5’ que ha sido reemplazado por un cebador de prolongación durante la polimerización, similar al modelo representado en la Fig. 15B. Se han aislado enzimas de reparación de ADN similares de eucariotas de una sola célula y superiores y de arqueas, y hay proteínas de reparación de ADN relacionadas en las eubacterias. Nucleasas 5' similares han sido

55 también asociadas con bacteriófagos tales como T5 y T7.

Recientemente, se determinaron estructuras tridimensionales de ADNPTaq y exonucleasa 5’ del fago T5 (Fig. 58) por difracción de rayos X [Kim et al. (1995) Nature 376:612 y Ceska et al. (1995) Nature 382:90)]. Las dos enzimas tienen estructuras tridimensionales muy similares a pesar de la limitada similitud de la secuencia de aminoácidos. La característica más asombrosa de la estructura de la exonucleasa 5’ de T5 es la existencia de un orificio triangular formado por el sitio activo de la proteína y dos hélices alfa (Fig. 58). Esta misma región de ADNPTaq está desordenada en la estructura de cristal, lo que indica que esta región es flexible, y que, por tanto, no se observa en la estructura tridimensional publicada. Sin embargo, el dominio nucleasa 5' de ADNPTaq es probable que tenga la misma estructura, en base a su similitud tridimensional con la exonucleasa 5’ de T5, y que los aminoácidos de la región desordenada de la proteína ADNPTaq sean aquéllos asociados con la formación de la hélice alfa. La existencia de tal orificio o muesca en el dominio nucleasa 5' de ADNPTaq fue predicha en base a su especificidad de sustrato [Lyamichev et al., supra].

5 Se ha sugerido que el brazo 5’ de una estructura de escisión debe pasar por el arco helicoidal descrito anteriormente para colocar dicha estructura correctamente para la escisión (Ceska et al., supra). Una de las modificaciones de las nucleasas 5' descritas en la presente memoria abrió la parte del arco helicoidal de la proteína para permitir una mejor escisión de las estructuras que cortan poco o nada en absoluto (p. ej., las estructuras de las dianas de ADN circular que descartarían tal paso de un brazo 5’). La construcción génica que fue elegido como modelo para

10 analizar este enfoque fue el denominado BN Cleavase®, que fue derivado de ADNPTaq pero que no contiene el dominio polimerasa (Ej. 2). Éste comprende todo el dominio nucleasa 5' de ADNpTaq y, por tanto, debería tener una estructura muy cerrada a la exonucleasa 5’ de T5. Esta nucleasa 5' se seleccionó para demostrar el principio de tal modificación física sobre proteínas de este tipo. La modificación de apertura de arco de la presente invención no pretende limitarse a los dominios nucleasa 5' de las ADN polimerasas, y se contempla para su uso sobre cualquier

15 nucleasa de estructura específica que incluya tal apertura como una limitación de la actividad de escisión. La presente invención contempla la inserción de un sitio de escisión de trombina en el arco helicoidal de ADNp derivadas del género Thermus, así como nucleasas 5' derivadas de ADNp derivadas del género Thermus. El ejemplo específico mostrado en la presente memoria, en el que se usa la nucleasa trombina/BN Cleavase®, simplemente ilustra el concepto de apertura del arco helicoidal localizado en el dominio nucleasa. Como la

20 secuencia de aminoácidos de las ADNp derivadas del género Thermus están muy conservadas, las enseñanzas de la presente invención permiten la inserción de un sitio de trombina en el arco helicoidal presente en estas ADNp y nucleasas 5' derivadas de estas ADNp.

La apertura del arco helicoidal se realizó mediante la inserción de un sitio de proteasa en el arco. Esto permitió la digestión post–traduccional de la proteína expresada con la proteasa apropiada para abrir el arco en su vértice. Las 25 proteasas de este tipo reconocen tramos cortos de secuencia de aminoácidos específica. Tales proteasas incluyen la trombina y el factor Xa. La escisión de una proteína con tal proteasa depende de tanto la presencia de ese sitio en la secuencia de aminoácidos de la proteína como de la accesibilidad de ese sitio sobre la proteína intacta plegada. Incluso con una estructura de cristal, puede resultar difícil predecir la susceptibilidad de una determinada región de una proteína a la escisión realizada por la proteasa. Si la estructura de cristal está ausente, debe ser determinada

30 empíricamente.

En la selección de una proteasa para una escisión de sitio específico de una proteína que ha sido modificada para que contenga un sitio de escisión de proteasa, una primera etapa consiste en analizar la proteína sin modificar para la escisión en sitios alternativos. Por ejemplo, se incubaron la ADNPTaq y la nucleasa BN Cleavase® en condiciones de escisión de proteasa con la proteasa factor Xa y la proteasa trombina. Se cortaron ambas proteínas nucleasas

35 con factor Xa en el dominio nucleasa 5', pero ninguna nucleasa fue digerida con cantidades grandes de trombina. De este modo, se eligió la trombina para los análisis iniciales de la apertura del arco de la enzima BN Cleavase®.

En las modificaciones con proteasa/Cleavase® descritas en la presente memoria, la proteasa factor Xa escindió fuertemente en una posición inaceptable de la proteína nucleasa sin modificar, en una región propensa a comprometer la actividad del producto final. Otras nucleasas sin modificar contempladas en la presente memoria

40 peden ser insensibles al factor Xa, pero ser sensibles a la trombina o a otra de tales proteasas. Alternativamente, pueden ser sensibles a éstas y otras proteasas tales en puntos que son irrelevantes para la función de la nucleasa que se busca modificar. Al aproximarse a cualquier proteína para su modificación mediante la adición de un sitio de escisión de proteasa, la proteína sin modificar debería ser analizada con las proteasas teniendo en cuenta la determinación de qué proteasas proporcionan niveles aceptables de escisión en otras regiones.

45 Trabajando con el segmento clonado de ADNPTaq desde el que se expresa la proteína BN Cleavase®, se introdujeron nucleótidos codificantes de un sitio de escisión de trombina en marco cerca de la secuencia codificante del aminoácido 90 del gen de nucleasa. Se determinó esta posición en o cerca del vértice del arco helicoidal en referencia a tanto la estructura tridimensional de la ADNPTaq como a la estructura de la exonucleasa 5’ de T5. La secuencia de aminoácidos codificada, LVPRGS, fue insertada en el vértice del arco helicoidal mediante mutagénesis

50 de sitio dirigida del gen de nucleasa. La prolina (P) del sitio de escisión de trombina fue colocada para reemplazar una prolina que se encuentra normalmente en esta posición en la BN Cleavase®, porque la prolina es un aminoácido que rompe la hélice alfa y puede ser importante para la estructura tridimensional de este arco. Se expresó este constructo, se purificó y luego se digirió con trombina. Se analizó la enzima digerida en cuanto a su capacidad para escindir un ácido nucleico diana, ADN genómico del bacteriófago M13, que no proporciona extremos

55 5’ libres para facilitar la escisión mediante el modelo de paso por el arco helicoidal.

Aunque el arco helicoidal de esta nucleasa se abrió mediante escisión con proteasa, se contempla la posibilidad de usar un número de otras técnicas para conseguir el mismo fin. Por ejemplo, se podría reorganizar la secuencia de nucleótidos tal que, tras la expresión, la proteína resultante estuviera configurada tal que la parte superior del arco helicoidal (aminoácido 90) estuviera en el terminal amino de la proteína, que los terminales carboxilo y amino 60 naturales de la secuencia proteínica estuvieran unidos y que el nuevo terminal carboxilo se encontrara en el aminoácido natural 89. Este enfoque tiene el beneficio de que no se introduce ninguna secuencia foránea y la

enzima es una sola cadena de aminoácidos, pudiendo ser así más estable que la nucleasa 5' escindida. En la estructura de cristal de la ADNPTaq, los terminales amino y carboxilo del dominio exonucleasa 5’ se encuentran muy próximos entre sí, lo que sugiere que los extremos pueden ser unidos directamente sin el uso de la secuencia peptídica ligadora flexible que algunas veces es necesaria. Tal reorganización del gen, con la posterior clonación y

5 expresión, se podría realizar mediante técnicas de clonación y recombinación por PCR estándar conocidas por los expertos en la técnica.

La presente invención también contempla el uso de nucleasas aisladas de organismos que crecen en una variedad de condiciones. Los genes para la clase de enzimas FEN–1/XPG se encuentran en organismos que varían de bacteriófagos a seres humanos, a los termófilos extremos del Reino Arquea. Para los análisis en los que se vaya a

10 usar una temperatura elevada, se contempla que las enzimas aisladas de termófilos extremos pueden presentar la termoestabilidad requerida de tal análisis. Para los análisis en los que podría ser deseable tener una actividad enzimática máxima a una temperatura moderada o en los que podría ser deseable destruir la enzima con temperatura elevada, pueden ser particularmente valiosas aquellas enzimas procedentes de organismos que favorecen las temperaturas moderadas para el crecimiento.

15 En las Fig. 59A–E (SEC ID N.º 135–145), se muestra un alineamiento de una colección de proteínas FEN–1 secuenciadas por otras. Se puede observar a partir de este alineamiento que hay algunas regiones de conservación en esta clase de proteínas, lo que sugiere que están relacionadas funcionalmente, y posiblemente, estructuralmente. Se pueden usar regiones de similitud en el nivel de secuencia de aminoácidos para diseñar cebadores para la amplificación in vitro (PCR) mediante un procedimiento de retrotraducción de la secuencia de aminoácidos en las

20 posibles secuencias de ácidos nucleicos, seleccionando luego cebadores con las menores variaciones posibles dentro de las secuencias. Estas se pueden usar en una PCR de condiciones poco restrictivas para buscar las secuencias de ADN relacionadas. Este enfoque permite la amplificación de ADN codificante de una nucleasa FEN–1 sin el conocimiento previo de la secuencia de ADN real.

También se puede observar a partir de este alineamiento que hay regiones de las secuencias que no están

25 completamente conservadas. El grado de diferencia observado sugiere que las proteínas pueden tener diferencias leves o marcadas en la especificidad por el sustrato. En otras palabras, pueden tener diferentes niveles de actividad de escisión sobre las estructuras de escisión de la presente invención. Cuando se escinde una determinada estructura a una velocidad mayor que el resto, a ésta se le denomina sustrato preferido, mientras que una estructura que es escindida lentamente es considerada como un sustrato menos preferido. La denominación de sustratos

30 preferidos o menos preferidos en este contexto no pretende ser una limitación de la presente invención. Se contempla que algunas realizaciones de la presente invención harán uso de las interacciones de una enzima con un sustrato menos preferido. Las enzimas candidatas se analizan en cuanto a su idoneidad en los análisis de escisión de la presente invención usando los análisis descritos a continuación.

1. Análisis de nucleasas de estructura específica

35 El análisis de nucleasas candidatas para actividades de estructura específica en estos análisis se realiza en gran parte del mismo modo que lo descrito para analizar ADN polimerasas modificadas en el ejemplo 2, pero con el uso de una genoteca diferente de estructuras modelo. Además de evaluar el rendimiento enzimático en la escisión independiente de un cebador y dirigida por un cebador, se usa un conjunto de horquillas sintéticas para examinar la longitud del dúplex secuencia abajo del sitio de escisión preferido por la enzima.

40 Las nucleasas 5’ FEN–1 y XPG usadas en la presente invención deben ser analizadas en cuanto a su actividad en los análisis en los que pretenden ser usadas, incluyendo pero no limitándose al análisis de detección de la escisión dirigida por InvaderTM de la presente invención y al procedimiento CFLP® de caracterización de ácidos nucleicos (el procedimiento CFLP® se describe en las solicitudes co–pendientes con n.º de serie 08/337.164; 08/402.601; 08/484.956 y 08/520.946; las revelaciones de estas solicitudes se encuentran incorporadas en la presente memoria

45 por referencia). El análisis InvaderTM usa un modo de escisión que ha sido denominado “dirigido por un cebador” o “dependiente de un cebador” para reflejar la influencia del oligonucleótido hibridado con el ácido nucleico diana secuencia arriba del sitio de escisión. Por el contrario, la reacción CFLP® se basa en la escisión de estructura plegada u horquillas del ácido nucleico diana, en ausencia de cualquier oligonucleótido hibridado. Los análisis descritos en la presente memoria no pretenden limitarse al análisis de nucleasas con un sitio de escisión en concreto

50 o a un modo de reconocimiento de estructuras sustrato en particular. Se contempla que las enzimas se pueden describir como nucleasas 3’, utilizando el extremo 3’ como punto de referencia para reconocer estructuras, o pueden tener otro modo diferente de reconocimiento. Además, el uso del término nucleasas 5' no pretende limitar la consideración a enzimas que escinden las estructuras de escisión en un determinado sitio. Se refiere a una clase general de enzimas que requieren alguna referencia o acceso a un extremo 5' para efectuar la escisión de una

55 estructura.

Se ha creado un conjunto de estructuras de escisión modelo para permitir la evaluación de la capacidad de escisión de enzimas desconocidas sobre tales estructuras. Cada una de las estructuras modelo está construida con uno o más oligonucleótidos sintéticos elaborados por síntesis química de ADN estándar. En las Fig. 26 y 60, se muestranlos ejemplos de tales estructuras sustrato modelo sintéticas. Éstas sólo pretenden representar la configuración 60 plegada general deseable en tales estructuras de análisis. Aunque se indica en las figuras una secuencia que

adoptaría tal estructura, hay otras numerosas disposiciones secuenciales de los nucleótidos de las que se esperaría su plegamiento de tales modos. Las características esenciales por diseñar en un conjunto de oligonucleótidos destinados a realizar los análisis descritos en la presente memoria son la presencia o la ausencia de un brazo 3’ suficientemente largo como para permitir la hibridación de un ácido nucleico adicional para analizar la escisión de un

5 modo “dirigido por un cebador”, y la longitud de la región dúplex. En el conjunto representado en la Fig. 60, las longitudes de los dúplex de las estructuras S–33 y 11–8–0 son de 12 y 8 pares de bases, respectivamente. Esta diferencia en longitud de las moléculas de análisis facilita la detección de la discriminación realizada por la nucleasa candidata entre los dúplex más largos y más cortos. Se pueden usar adiciones a estas series que expandan el intervalo de moléculas del dúplex que se presentan a las enzimas, tanto el más corto como el más largo. El uso de un tetrabucle de ADN estabilizante [Antao et al., (1991) Nucl. Acids Res. 19:5901] o un tribucle [Hiraro et al., (1994) Nuc Acids Res. 22:576] en el extremo cerrado del dúplex ayuda a garantizar la formación de la estructura esperada por parte del oligonucleótido.

En el ejemplo 11, se describe el sustrato modelo para analizar la escisión dirigida por un cebador, la “horquilla S–60”

(SEC ID N.º 40). En ausencia de un cebador, esta horquilla se escinde habitualmente para liberar fragmentos del

15 brazo 5’ de una longitud de 18 y 19 nucleótidos. Un oligonucleótido, denominado P–14 (5'–CGAGAGACCACGCT–3’; SEC ID N.º 108), que se extiende hasta la base del dúplex cuando está hibridado con el brazo 3’ de la horquilla S–60, proporciona productos de escisión del mismo tamaño, pero a una velocidad de escisión mayor.

Para analizar la escisión invasiva, se usa un cebador diferente denominado P–15 (5'–CGAGAGACCACGCTG–3’; SEC ID N.º 30). En una escisión invasiva satisfactoria, la presencia de este cebador desplaza el sitio de escisión de S–60 a la región dúplex, habitualmente liberando productos de una longitud de 21 y 22 nucleótidos.

La horquilla S–60 también se puede usar para analizar los efectos de las modificaciones de la estructura de escisión sobre la escisión bien invasiva o dirigida por un cebador. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan al uso de apareamientos erróneos o análogos de bases en el dúplex horquilla en una, unas cuantas o todas las posiciones, interrupciones o modificaciones similares en el dúplex entre el cebador y el brazo 3’ de S–60, modificaciones

25 químicas o de otro tipo en uno o ambos extremos de la secuencia de cebador, o la unión de restos al, u otras modificaciones del brazo 5’ de la estructura. En todos los análisis en los que se usa S–60 o una horquilla similar descrita en la presente memoria, es posible comparar la actividad con y sin un cebador usando la misma estructura de horquilla.

La unión de estas reacciones analíticas, incluyendo cantidades apropiadas de horquilla, cebador y nucleasa candidata se describe en el ejemplo 2. Como se cita en la presente memoria, la presencia de los productos de escisión se indica por la presencia de moléculas que emigran a un peso molecular inferior de lo que lo hace la estructura de análisis sin escindir. Cuando se usa la inversión de carga de un marcador, los productos portarán una carga neta diferente que la del material sin escindir. Cualquiera de estos productos de escisión indica que la nucleasa candidata tiene la actividad nucleasa de estructura específica deseada. “Actividad nucleasa de estructura

35 específica deseada” pretende significar sólo que la nucleasa candidata escinde una o más moléculas de análisis. No es necesario que la nucleasa candidata escinda a una velocidad o en un sitio de escisión en particular para que se pueda considerar una escisión satisfactoria.

IX. Ampliación de señales mediante la finalización de un sitio de unión proteínica activado

Además de la reacción de prolongación con ADN polimerasa descrita anteriormente, la presente invención también contempla el uso de los productos de la reacción de escisión invasiva para formar sitios de unión proteínica activados, tales como dúplex promotores de ARN polimerasa, permitiendo así la interacción del sitio completado por ser usado como un indicador de la presencia del ácido nucleico que es la diana de la reacción de escisión invasiva. A modo de ejemplo, cuando se activa un dúplex promotor de ARN polimerasa completándolo (i.e., bicatenario sobre esa parte de la región promotora necesaria para la unión de la polimerasa) a través de la hibridación del producto de

45 oligonucleótido de la reacción de escisión invasiva, se puede usar la síntesis de ARN como tal indicador.

No se pretende que la reacción de transcripción de la presente invención se limite al uso de una ARN polimerasa o una región promotora de la ARN polimerasa en concreto. Las secuencias promotoras están bien caracterizadas para varios bacteriófagos, incluyendo el bacteriófago SP6, T7 y T3. Además, las secuencias promotoras han sido bien caracterizadas para un número de ARN polimerasas tanto eucariotas como procariotas. En una realización preferida, el promotor usado permite la transcripción desde una de las ARN polimerasas de bacteriófago. En una realización particularmente preferida, el promotor usado permite la transcripción por parte de la ARN polimerasa de T7. Los procedimientos para realizar una transcripción in vitro son conocidos en la técnica y hay equipos comerciales disponibles para realizar la transcripción con ARN polimerasas eucariotas, procariotas o de bacteriófago (p.ej., de Promega).

55 Las regiones de unión proteínica de la presente invención no se limitan a los promotores de ARN polimerasa de bacteriófago descritos anteriormente. Otras secuencias promotoras que están contempladas son aquéllas de procariotas o eucariotas. Por ejemplo, se usan muchas cepas de bacterias y hongos para la expresión de proteínas heterólogas. Los promotores mínimos necesarios para la transcripción por parte de las ARN polimerasas de organismos tales como levadura y otros hongos, eubacterias, nematodos y células de mamífero cultivadas están bien descritos en la bibliografía y en los catálogos de proveedores comerciales de vectores de ADN para la

expresión de proteínas foráneas en estos organismos.

Los sitios de unión para otros tipos de proteínas de unión de ácidos nucleicos (p.ej., ADN) se contemplan para su uso en la presente invención. Por ejemplo, las proteínas implicadas en la regulación de genes ejercen sus efectos 5 mediante la unión al ADN en las proximidades del promotor desde el que se transcribe el ARN procedente de ese gen. El operador lac de E. coli es un ejemplo de un sistema de regulación génica particularmente bien caracterizado y comúnmente usado en el que la proteína represora lac se une a secuencias específicas que solapan, y por tanto bloquean, al promotor para los genes que se encuentran bajo el control represor [Jacob y Monod (1961) Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biol. XXVI: 193–211]. Se han descrito muchos sistemas similares en bacterias,

10 incluyendo los sistemas reguladores de trp y AraC. Dada la enorme cantidad de información disponible acerca de los promotores bacterianos, las etapas descritas a continuación para el diseño de promotores parciales adecuados para las ARN polimerasas de bacteriófago se pueden adaptar fácilmente al diseño de los sistema de detección basados en estos otros promotores.

Como se indica anteriormente, muchos de los promotores bacterianos están bajo el control de una proteína

15 represora u otra proteína reguladora. Se considera dentro del ámbito de la presente invención incluir la creación de sitios de unión compuestos para estas proteínas reguladoras a través del suministro de un fragmento de ácido nucleico (p. ej., un producto de escisión no diana generado en una reacción de escisión invasiva). Es posible evaluar la unión de la proteína reguladora con la región de unión proteínica completada (p. ej., la región de unión compuesta) mediante uno cualquiera de un número de procedimientos, incluyendo la emigración electroforética retardada de

20 bien la proteína o del fragmento de ADN, o mediante un cambio de configuración de la proteína o del ADN tras la unión. Además, se puede controlar la transcripción de un promotor secuencia abajo para la regulación secuencia arriba o secuencia abajo como resultado de la unión de la proteína reguladora con la región de unión proteínica completada.

Además de los sistemas bacterianos descritos anteriormente, también se ha descubierto que muchos genes de

25 sistemas eucariotas están bajo el control de proteínas específicas que se unen a regiones específicas del ADN del dúplex. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, proteínas OCT–1, OCT–2 y AP–4 en mamíferos y proteínas GAL4 y GCN4 en levadura. Tales proteínas reguladoras tienen habitualmente un motivo estructural asociado con la unión de los ácidos nucleicos del dúplex, tal como hélice–giro–hélice, un dedo de cinc o una cremallera de leucina [para consultas, véase, “Molecular and Cellular Biology” (1993) S.L. Wolfe, Ed., Wadswonh Publishing Co., Belmont,

30 CA, pp. 694–715].

Para simplificar, la reacción de análisis descrita aquí hará referencia a la ARN polimerasa de T7 y a su promotor. Esto no pretende limitar la invención al uso de esta ARN polimerasa, y los expertos en la técnica de Biología Molecular serían capaces de adaptar fácilmente este análisis descrito al examen de cualquiera de las proteínas de unión al ADN, de ARN polimerasas y su unión o de sitios promotores descritos anteriormente.

35 Se sabe en la técnica que es posible formar promotores T7 activos mediante la hibridación de dos oligonucleótidos, comprendiendo cada uno bien la cadena superior o la inferior de la secuencia promotora, tal que se forme un dúplex promotor no mellado completo [J.F. Milligan, D.R. Groebe, G.W. Witherall, O.C. Uhlenbeck, Nucl. Acids Res. 15:21. 8783–8798 (1987)]. Aquí se muestra que un modo de hacer el inicio de la transcripción dependiente de los productos de una reacción de escisión invasiva consiste en diseñar la sonda para la reacción de escisión tal que una

40 parte de un promotor de ARN polimerasa se libere como producto. La parte o las partes de ADN restantes necesarias para ensamblar un dúplex promotor se pueden proporcionar bien como elementos en la mezcla de reacción o se pueden producir mediante escisiones invasivas. Si se diseñan las partes de oligonucleótido para comprometer regiones apropiadas de complementariedad, pueden ser sometidas a apareamiento de bases para formar un dúplex promotor completo compuesto por tres o más fragmentos de ácido nucleico, según lo representado

45 en la Fig. 88B. Un promotor ensamblado de este modo tendrá mellas en el esqueleto de una o más cadenas. En una realización, estas mellas pueden ser cerradas covalentemente a través del uso de una enzima ADN ligasa. En una realización preferida, las mellas están localizadas tal que la transcripción pueda continuar sin unión. Al seleccionar el sitio de una mella creada mediante el ensamblaje del fragmento de promotor parcial, al menos una mella debería estar en la región promotora reconocida para la ARN polimerasa por usar. Cuando se usa un promotor de

50 bacteriófago, debería haber una mella entre los nucleótidos –17 y –1, medidos desde el sitio de iniciación de la transcripción situado en +1. En una realización preferida, la mella estará entre los nucleótidos –13 y –8. En una realización particularmente preferida, habrá una mella entre los nucleótidos –12 y –10 sobre la cadena no molde del promotor de bacteriófago.

Cuando se van a dejar las mellas sin reparar (i.e., no cerradas covalentemente con una ADN ligasa), es importante

55 evaluar el efecto de la ubicación de la mella sobre el nivel de transcripción desde el promotor ensamblado. Una prueba simple consiste en combinar los oligonucleótidos que comprenden las partes separadas del promotor con un oligonucleótido que comprende una cadena entera del promotor por ser ensamblado, formando así un promotor dúplex con una mella en una cadena. Si la mella está en la parte superior o en la cadena no molde del promotor, entonces se hace que el oligonucleótido que comprende el promotor completo incluya más secuencia no promotora

60 sobre su extremo 5' para servir como molde por ser copiado en la transcripción. Esta disposición se representa en la Fig. 88B. Alternativamente, si la mella va a estar en la parte inferior o cadena molde del promotor, entonces el oligonucleótido promotor parcial que cubre la posición +1, el sitio de inicio de la transcripción, incluirá la otra secuencia molde. Esta disposición se representa en las Fig. 95A–D (esta figura muestra varias realizaciones diferentes en las que se usa una sonda cortada o un producto de escisión no diana para formar un promotor compuesto que contiene una o más mellas sobre la cadena molde). En cualquier caso, los oligonucleótidos

5 separados se combinan para formar el promotor completo, y el ensamblaje se usa en una reacción de transcripción para crear ARN.

Para medir el efecto de la mella, se crea un fragmento de promotor sustancialmente idéntico por hibridación de dos oligonucleótidos, comprendiendo cada uno una cadena del promotor de longitud completa, para crear una versión no mellada del mismo promotor. Estos dos ensamblajes moleculares se analizan en reacciones de transcripción 10 paralelas y se mide la cantidad de ARN esperada que se produce en cada reacción tanto para el tamaño como para el rendimiento. Un procedimiento preferido para evaluar el tamaño del ARN es mediante electroforesis con la posterior visualización. Si se usa un nucleótido marcado (p. ej., GTP marcado con 32P o UTP marcado con fluoresceína) en la transcripción, es posible detectar y cuantificar el ARN mediante autorradiografía, generación de imágenes fluorescentes o mediante la transferencia a una membrana de soporte con la posterior detección, p.ej.,

15 sondeo de anticuerpos o de hibridación. Alternativamente, si se produce ARN sin marcar, es posible determinar las cantidades mediante otros procedimientos conocidos en la técnica, tales como mediante espectrofotometría o mediante electroforesis con la posterior tinción y la comparación con patrones conocidos.

Si el tamaño del ARN es según lo predicho por la secuencia molde, o si coincide con el producido desde el promotor de control, se puede suponer haber iniciado la transcripción en el mismo sitio del complejo, y haber producido 20 esencialmente el mismo producto de ARN. Si el producto es mucho más corto, entonces la transcripción bien está iniciándose en un sitio interno o está terminando de manera prematura [E.T. Schenborn y R.C. Mierendorf, Jr. Nucl. Acids Res. 13: 17, 6223 (1985); Milligan et al., supra]. Aunque esto no indica que el ensamblaje analizado sea completamente inadecuado para el análisis, los transcriptos parciales reducirán la cantidad bruta de ARN creado, comprometiendo quizás la señal procedente del análisis, y tales productos requerirían una mayor caracterización

25 (p.ej., impresión digital o secuenciación) para identificar el contenido de nucleótidos del producto. Es preferible que el tamaño del ARN producido coincida con el del ARN producido en la reacción de control.

También se examina el rendimiento de la reacción. No es necesario que el nivel de la transcripción coincida con la reacción control. En algunos casos (véase el Ej. 41 que figura más adelante), el promotor mellado puede tener una mayor velocidad de transcripción, mientras que en otras disposiciones, la transcripción puede ser reducida (en

30 relación con la velocidad del ensamblaje del promotor no mellado). Sólo es necesario que la cantidad de producto esté dentro de los límites de detección del procedimiento por ser usado con el promotor de análisis.

Se ha informado que la transcripción desde un promotor de bacteriófago puede producir de 200 a 1.000 copias de cada molde de transcripción (molde más promotor activo) en una reacción. Estos niveles de transcripción no son necesarios para la presente invención. También se contemplan las reacciones en las que se produce un ARN por

35 cada molde.

El análisis anteriormente descrito permitirá la evaluación de un promotor con una mella en cualquier posición en cuanto a su utilidad en este análisis. Un objetivo de esta invención consiste en proporcionar uno o más de los oligos que comprenden una región promotora parcial a través de escisión o escisiones invasivas. En esta realización, las secuencias promotoras parciales son unidas al oligonucleótido sonda en un análisis de escisión invasiva y son

40 liberadas mediante escisión en un sitio específico, como la dirigida por el oligonucleótido InvaderTM. También se pretende que la transcripción sea muy pobre o inexistente en ausencia de la sonda escindida correctamente. Para evaluar la capacidad de cualquier diseño de oligonucleótidos para cumplir estos objetivos, se pueden llevar a cabo varios análisis de reacciones de transcripción.

Para un ensamblaje de promotores que tendrá una mella sobre la cadena no molde, en las Fig. 86A–D, se muestran

45 varios ensamblajes parciales que deberían ser analizados. A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, esta figura representa las pruebas para un promotor mellado en el que la secuencia arriba, o la parte 5’ de la cadena no molde, se va a proporcionar mediante un análisis de escisión invasiva. Este fragmento se observa en la Fig. 86A marcado como “sonda cortada”. Las reacciones de transcripción incubadas en presencia del dúplex mostrado en la Fig. 86A analizarán la capacidad del promotor parcial de secuencia arriba para permitir la iniciación de la

50 transcripción cuando esté hibridado con una cadena inferior denominada “molde de copia”. De manera similar, una reacción llevada a cabo en presencia del dúplex representado en la Fig. 86B analizará la capacidad del fragmento de promotor parcial más cercano al sitio de iniciación (el sitio +1, según lo indicado en la Fig. 85B) para mantener la transcripción del molde de copia. Una importante característica de la presente invención es que ninguno de estos dúplex promotores parciales sea capaz de soportar la transcripción al mismo nivel que se observaría en la

55 transcripción desde un promotor intacto según lo representado en la Fig. 85B. Es preferible que ninguno de estos promotores parciales sea suficiente como para iniciar una transcripción detectable en el transcurso de tiempo de una reacción de transcripción media, i.e., en aproximadamente una hora de incubación.

Las Fig. 86C y 86D representan las disposiciones de otros dos dúplex diseñadas para analizar el efecto de una sonda sin cortar en la reacción de transcripción. La Fig. 86C representa el dúplex formado entre sólo la sonda sin 60 cortar y el molde de copia, mientras que la Fig. 86D incluye la otra parte del promotor. La región 3’ de la sonda no es

complementaria a la secuencia promotora y, por tanto, produce una ramificación sin aparear en la mitad del promotor. Una importante característica de la presente invención es que ninguno de estos dúplex promotores ramificados sea capaz de soportar la transcripción al mismo nivel que se observaría en la transcripción desde un promotor intacto según lo representado en la Fig. 85B. Es preferible que ninguno de estos promotores ramificados

5 sea suficiente como para iniciar una transcripción detectable en el transcurso de tiempo de una reacción de transcripción media, i.e., en aproximadamente una hora de incubación.

En una realización del sistema de transcripción de la presente invención, se evita la iniciación de la transcripción desde el molde de copia en ausencia de un promotor completo o en presencia de un promotor ramificado, mediante la colocación acertada de la mella o de las mellas en el promotor compuesto. Por ejemplo, como se observa en los 10 ejemplos que figuran a continuación, la colocación de una mella entre los nucleótidos –12 y –11 de la cadena no molde del promotor de bacteriófago T7 permite que la transcripción tenga lugar sólo cuando la sonda haya sido cortada correctamente, como en una reacción de escisión invasiva. Sin embargo, en algunos casos en los que la reacción de escisión invasiva va a proporcionar la parte de secuencia arriba de la cadena no molde del promotor (p. ej., según lo representado en la Fig. 88B), puede ser necesario o deseable colocar la mella sobre esa cadena en una 15 determinada posición por razones distintas a la de proporcionar un promotor compuesto óptimo (i.e., uno que sea inactivo en ausencia de una cualquiera de las partes del promotor). Puede ser necesario o deseable colocar la mella de tal modo que la creación de un promotor completo ramificado (Fig. 86D) tenga un nivel indeseable de transcripción, reduciendo la dependencia de la producción de ARN en el éxito de la etapa de escisión invasiva. Se observa en los siguientes ejemplos que la transcripción desde tal promotor ramificado se puede suprimir mediante 20 una modificación de la parte de promotor no molde de secuencia abajo, mostrada como el “oligonucleótido promotor parcial” en las Fig. 86, 88, 90 y 95D. Según lo representado en la Fig. 90, se puede proporcionar el oligonucleótido promotor parcial con una “cola” 5’ de nucleótidos que no sean complementarios con la cadena molde del promotor, pero que sean complementarias con la parte 3’ del oligonucleótido sonda que sería eliminada en la reacción de escisión invasiva. Cuando la sonda sin cortar se hibrida con el molde de copia unido con el oligonucleótido promotor 25 parcial prolongado en 5’, la cola 5’ puede hacer un apareamiento de bases con la región 3’ de la sonda, formando una unión de tres vías según lo descrito en la Fig. 90A. Esto puede cortar eficazmente la transcripción, como se muestra más adelante. Cuando una sonda cortada se hibrida, según lo mostrado en la Fig. 90B, se forma un promotor con una pequeña ramificación, y en la presente memoria se observa que tal promotor ramificado puede iniciar la transcripción. Además, si se tiene cuidado en la selección de la secuencia de la cola 5’ (i.e., si la primera

30 base desapareada es el mismo nucleótido en el nucleótido 3’ de la sonda cortada, tal que compitan por la hibridación con la misma base de la cadena molde), la estructura ramificada resultante también puede ser escindida por una de las nucleasas de estructura específica de la presente invención, creando el promotor desramificado representado en la Fig. 90C, en algunos casos aumentando la transcripción frente a la observada con el promotor de la Fig. 90B.

El dúplex promotor que pretende ser creado, en esta realización, mediante la ejecución correcta del análisis de la

35 escisión dirigida por InvaderTM incluirá tanto la “sonda cortada” como el oligonucleótido promotor parcial representado en las Fig. 86A y B alineados sobre un solo ácido nucleico del molde de copia. El análisis de la eficacia de la transcripción de tal segmento de promotor mellado en comparación con el promotor intacto se describe anteriormente. Todos los oligonucleótidos descritos para estas moléculas de prueba se pueden crear usando químicas de síntesis estándar.

40 El conjunto de moléculas de prueba representado en la Fig. 86 está diseñado para evaluar las capacidades de transcripción de la variedad de estructuras que pueden estar presentes en las reacciones en las que la parte 5’ de la cadena no molde del promotor va a ser suministrada por la escisión dirigida por un invasor. También se prevé la posibilidad de proporcionar una parte diferente del promotor parcial mediante la reacción de escisión invasiva, p. ej., el segmento de secuencia abajo de la cadena no molde del promotor, como se muestra en la Fig. 94. También se

45 pueden proporcionar partes de la cadena molde del promotor mediante la sonda corta, según lo mostrado en las figuras 95A–D. Se puede crear un conjunto análogo de moléculas de prueba, incluyendo versiones “cortadas” y sin cortar de la sonda por ser usada en el análisis de escisión invasiva para analizar cualquier diseño alternativo, bien si la mella se va a localizar en la cadena molde o en la cadena no molde del promotor.

Los procedimientos de visualización basados en la transcripción de la presente invención también se pueden usar

50 de múltiple forma. Se pueden elaborar las reacciones tal que la presencia de una determinada diana conduzca a la transcripción desde un tipo de promotor, mientras que la presencia de una secuencia diana diferente (p. ej., una mutante o variante) u otra diana sospechosa de estar presente pueda conducir la transcripción desde un tipo diferente (i.e., un segundo tipo) de promotor. En tal realización, se podría deducir la identidad del promotor desde el que se inició la transcripción a partir del tipo o el tamaño del ARN producido.

55 A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, es posible comparar los promotores de bacteriófago con tal aplicación deseada. Los promotores para el fago T7, T3 y SP6 son bastante similares, siendo cada uno de una longitud de aproximadamente 15 a 20 pares de bases, y compartiendo una identidad del aproximadamente 45% entre los nucleótidos –17 y –1, en relación con el inicio de la transcripción. A pesar de estas similitudes, las ARN polimerasas de estos fagos son muy específicas de sus promotores afines, tal que el resto de promotores pueden

60 estar presentes en una reacción, pero no serán transcrito [Chamberlin y Ryan (1982) “The Enzymes XV”:87–108]. Como estos promotores son similares en tamaño y en el modo en el que son reconocidos por sus polimerasas [Li et al., (1996) Biochem. 35:3722], se pueden diseñar versiones melladas similares de los promotores para su uso en los procedimientos de la presente invención por analogía con los ejemplos descritos en la presente memoria que emplean el promotor de T7. Debido al alto grado de especificidad de las ARN polimerasas, estos promotores mellados se pueden usar conjuntamente para detectar múltiples dianas en una sola reacción. Hay muchos ejemplos en los que sería muy deseable detectar múltiples dianas de ácido nucleico en una sola muestra, incluyendo los

5 casos en los que puede haber presentes múltiples agentes infecciosos, o en los que se pueda necesitar identificar variantes de un solo tipo de diana. Alternativamente, a menudo es deseable usar una combinación de sondas para detectar tanto una secuencia diana como una secuencia control interna, con el fin de evaluar los efectos de los contaminantes de la muestra en el resultado del análisis. El uso de múltiples promotores permite la posibilidad de evaluar la reacción tanto en cuanto a la eficacia de la escisión invasiva como en cuanto a la solidez de la transcripción.

Como se afirma anteriormente, los promotores de fago fueron descritos detalladamente como un ejemplo de regiones de unión proteínica adecuadas (p. ej., que se pueden usar para generar un promotor compuesto) para su uso en los procedimientos de la presente invención. La invención no se limita al uso de las regiones de promotores de ARN polimerasa de fago, en particular, ni a las regiones de promotores de ARN polimerasa, en general. Tanto en

15 los sistemas procariotas como eucariotas, se encuentran promotores adecuadamente específicos bien caracterizados.

El ARN que se produce de una manera que es dependiente de la correcta detección del ácido nucleico diana en la reacción de escisión invasiva se puede detectar en uno cualquiera de varios modos. Si se incorpora un nucleótido marcado en el ARN durante la transcripción, es posible detectar el ARN directamente tras la separación, p. ej., mediante electroforesis o cromatografía. El ARN marcado también se puede capturar sobre un soporte sólido, tal como una placa de microvaloración, un perla o una varilla de medición, p. ej., mediante hibridación, captura de anticuerpos, o a través de una interacción de afinidad tal como la que se produce entre la biotina y la avidina. La captura puede facilitar la medición de marcador incorporado, o puede ser una etapa intermedia anterior a la hibridación de la sonda o de medios de detección similares. Si se desea la incorporación de la máxima cantidad de

25 marcador en cada transcripto, es preferible que el molde de copia sea muy largo, de alrededor de 3 a 10 kilobases, tal que cada molécula de ARN porte muchos marcadores. Alternativamente, puede ser deseable que un solo sitio o un número limitado de sitios del transcripto estén marcados específicamente. En este caso, puede ser deseable tener un molde de copia corto con sólo uno o unos pocos residuos que permitan la incorporación del nucleótido marcado.

También es posible seleccionar el molde de copia para producir ARN que realicen funciones especificadas. En un caso simple, si se va a usar un fluoróforo de intercalación dependiente de un dúplex para detectar el producto de ARN, puede ser deseable transcribir un ARN que sea conocido para formar las estructuras secundarias dobles, tal como un ARN ribosómico o un ARNt. En otra realización, es posible diseñar el ARN para que interactúe específicamente, o con una determinada afinidad, con una sustancia diferente. Se ha observado la posibilidad de 35 usar un procedimiento de etapas alternas de selección (p. ej., mediante la unión a una sustancia diana) y en amplificación in vitro (p. ej., por PCR) para identificar ligandos de ácido nucleico con propiedades nuevas y útiles [Tuerk y Gold (1990) Science 249:505]. Este sistema se ha usado para identificar ARN, denominados ligandos o aptómeros, que se unan estrecha y específicamente con proteínas y otros tipos de moléculas, tales como antibióticos [Wang et al., (1996) Biochem. 35:12338] y hormonas. Incluso se pueden seleccionar los ARN para que se unan a otros ARN a través de interacciones no Watson–Crick [Schmidt et al. (1996) Ann. N.Y. Acad. Sci. 782:526]. Se puede usar un ARN ligando para bien desactivar o aumentar la actividad de una molécula a la que se une. También se puede producir cualquier segmento de ARN identificado a través de tal procedimiento mediante los procedimientos de la presente invención, tal que se pueda usar la observación de la actividad del ligando de ARN como una señal específica de la presencia del material diana en la reacción de escisión invasiva. La unión de un

45 ligando con su pareja específica también se puede usar como otro modo de capturar una señal de lectura hacia un soporte sólido.

También sería posible diseñar el producto de ARN para que tuviera una función catalítica, p. ej., para actuar como una ribozima, permitiendo que la escisión de otra molécula fuera un indicador de una reacción de escisión invasiva principal correcta [Uhlenbeck (1987) Nature 328:596]. En otra realización más, se puede elaborar el ARN para que codifique una secuencia peptídica. Cuando está acoplado a un sistema de traducción in vitro (p. ej., el sistema S–30 derivado de E. coli [Lesley (1985) Methods Mol. Biol. 37:265] o un sistema de lisados de reticulocitos de conejo [Dasso y Jackson (1989) Nucleic Acids Res. 17:3129], disponibles en Promega), es posible detectar la producción de la proteína apropiada. En una realización preferida, las proteínas producidas incluyen aquéllas que permiten una detección bien colorimétrica o luminiscente, tal como la beta–galactosidasa (lac–Z) o la luciferasa, respectivamente.

55 La descripción anterior se ha centrado en el uso de los presentes procedimientos de visualización de la transcripción en el contexto del análisis de la escisión dirigida por InvaderTM (i.e., los productos de escisión no diana producidos en el análisis con InvaderTM se usaron para completar y activar una región de unión proteínica, tal como una región promotora). Sin embargo, los procedimientos de visualización de la transcripción no se limitan a este contexto. Se puede usar cualquier análisis que produzca un producto de oligonucleótido que tenga extremos relativamente diferenciados en combinación con los presentes procedimientos de visualización de la transcripción. Por ejemplo, el análisis homogéneo descrito en la patente estadounidense n.º 5.210.015, particularmente cuando se lleva a cabo en condiciones en las que no se puede producir una polimerización, produce fragmentos cortos de oligonucleótido como resultado de la escisión de una sonda. Si se realiza este análisis en condiciones en las que hay polimerasa, el sitio de escisión de la sonda puede ser focalizado a través del uso de análogos de nucleótido que tengan enlaces no escindibles en determinadas posiciones de la sonda. Estos oligonucleótidos cortos se pueden emplear de una manera análoga a la sonda cortada o a los productos de escisión no diana producidos en las reacciones de escisión

5 invasiva de la presente invención. Hay más análisis que generan productos de oligonucleótido adecuados conocidos en la técnica. Por ejemplo, los productos de escisión no diana producidos en análisis tales como la “reacción con sondas de ciclo” (Duck et al., BioTech., 9:142 [1990] y las patentes estadounidenses n.º 4.876.187 y 5.011.769) en los que se liberan oligonucleótidos más cortos desde los oligonucleótidos más largos tras la hibridación con una secuencia diana serían adecuados, como lo serían los fragmentos de restricción cortos liberados en análisis en los que se diseña una sonda para ser escindida cuando se hibrida correctamente con una secuencia de reconocimiento de la restricción apropiada (patente estadounidense n.º 4.683.194).

También se pueden emplear análisis que generan oligonucleótidos cortos que tienen extremos 3’ “irregulares” (i.e., no diferenciados) con éxito en las reacciones de transcripción de la presente invención, cuando el oligonucleótido proporcionado por esta reacción de no transcripción se usa para proporcionar una parte de la región promotora

15 localizada secuencia abajo del o de los otros oligonucleótidos que son necesarios para completar la región promotora (es decir, se puede tolerar una cola 3’ o una prolongación desapareada cuando el oligo se esté usando como “sonda cortada” como en las Fig. 94 y 95A).

Parte experimental

En la revelación que se presenta a continuación, se aplican las siguientes abreviaturas: °C (grados cen tígrados); fig (figura); g (campo gravitatorio); h (hora); min (minuto); oligo (oligonucleótido); rxn (reacción); vol (volumen); p/v (peso en volumen); v/v (volumen en volumen); ASB (albúmina de suero bovino); CTAB (bomuro de cetiltrimetilamonio); HPLC (cromatografía en fase líquida de alta resolución); ADN (ácido desoxirribonucleico); p (plásmido); 1l (microlitros); ml (mililitros); 1g (microgramos); pmoles (picomoles); mg (miligramos); M (molar); mM (miliMolar); 1M (microMolar); nm (nanómetros); kdal (kilodaltons); DO (densidad óptica); EDTA (ácido etilendiamintetracético); FITC

25 (isotiocianato de fluoresceína); SDS (dodecilsulfato de sodio); NaPO4 (fosfato de sodio); NP–40 (Nonidet P–40); Tris (tris(hidroximetil)–aminometano); PMSF (fenilmetilsulfonilfluoruro); TBE (Tris–Borato–EDTA, i.e., tampón de Tris valorado con ácido bórico en lugar de con HCl y que contiene EDTA); PBS (solución salina tamponada con fosfato); PPBS (solución salina tamponada con fosfato que contiene PMSF 1mM); PAGE (electroforesis sobre gel de poliacrilamida); Tween (polioxietilen–sorbitán); Ambion (Ambion, Inc., Austin, TX); Boehringer (Boehringer Mannheim Biochemical, Indianápolis, IN); Dynal (Dynal A. S., Oslo, Noruega); Epicentre (Epicentre Technologies, Madison, WI); MJ Research (MJ Research, Watertown, MA); National Biosciences (Plymouth, MN); New England Biolabs (Beverly, MA); Novagen (Novagen. Inc., Madison, WI); Perkin Elmer (Norwalk, CT); Promega (Promega Corp., Madison. WI); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); USB (U.S. Biochemical, Cleveland, OH).

Ejemplo 1

35 Características de ADN polimerasas termoestables nativas

A. Actividad nucleasa 5' de la ADNPTaq

Durante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [Saiki et al., Science 239:487 (1988); Mullis y Faloona, “Methods in Enzymology” 155:335 (1987)], la ADNPTaq es capaz de amplificar muchas, pero no todas las secuencias de ADN. En la Fig. 5, se muestra una secuencia que no puede ser amplificada usando DNAPTaq (la estructura de horquilla es la SEC ID N.º 15. La Fig. 5 también muestra un cebador: SEC ID N.º 17). Esta secuencia de ADN tiene la característica diferenciadora de ser capaz de plegarse para formar una horquilla con dos brazos monocatenarios que corresponden a los cebadores usados en la PCR.

Para analizar si esta falta de amplificación se debe a la actividad nucleasa 5' de la enzima, se han comparado las capacidades de la ADNPTaq y la ADNpStf para amplificar esta secuencia de ADN durante 30 ciclos de la PCR. Los

45 oligonucleótidos sintéticos se obtuvieron en el Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin–Madison. La ADNpTaq y la ADNpStf fueron adquiridas en Perkin Elmer (i.e., ADN polimerasa Amplitaq™ y el fragmento de Stoffel de ADN polimerasa Amplitaq™). El ADN sustrato comprendía la estructura de horquilla mostrada en la Fig. 6 clonada en una forma bicatenaria en pUC19. Los cebadores usados en la amplificación figuran como las SEC ID N.º 16–17. La SEC ID N.º 17 del cebador se muestra apareada al brazo 3’ de la estructura de horquilla en la Fig. 5. La SEC ID N.º 16 se muestra como los 20 primeros nucleótidos en negrita sobre el brazo 5’ de la horquilla en la Fig. 5.

Las reacciones en cadena de la polimerasa comprendieron 1 ng de ADN diana de plásmido súper–enrollado, 5 pmoles de cada cebador, 40 1M de cada dNTP y 2,5 unidades de ADNPTaq o ADNpStf en una solución de 50 1l de Tris•Cl 10mM, pH 8,3. Las reacciones con ADNPTaq incluyeron KCl 50mM y MgCl2 1,5mM. El perfil de temperatura fue de 95°C durante 30 s, de 55°C durante 1 min y d e 72°C durante 1 min, a lo largo de 30 ciclos. Se an alizó el diez

55 por ciento de cada reacción mediante electroforesis sobre gel a través de poliacrilamida al 6% (entrecruzada 29:1) en un tampón de TrisBorato 45mM, pH 8,3 y EDTA 1,4mM.

En la Fig. 6, se muestran los resultados. El producto esperado se elaboró mediante ADNpStf (indicada simplemente como “S”), y no mediante ADNPTaq (indicada como “T”). Se concluye que la actividad nucleasa 5' de ADNpTaq es

responsable de la falta de amplificación de esta secuencia de ADN.

Para analizar si los nucleótidos desapareados de 5’ de la región sustrato de este ADN estructurado son eliminados por ADNpTaq, se comparó la suerte del brazo 5’ marcado terminalmente durante cuatro ciclos de la PCR usando las dos mismas polimerasas (Fig. 7). Los moldes horquilla, tales como el descrito en la Fig. 5, se elaboraron usando 5 ADNpStf y un cebador marcado en el extremo 5’ con 32P. El extremo 5’ del ADN fue liberado como unos cuantos fragmentos largos por DNAPTaq pero no por ADNpStf. Los tamaños de estos fragmentos (en base a su movilidad) muestran que contienen la mayoría o todo el brazo 5’ desapareado del ADN. De este modo, la escisión tiene lugar en o cerca de la base del dúplex bifurcado. Estos fragmentos liberados terminan con grupos OH 3’, según lo probado por el análisis secuencial directo y las capacidades de los fragmentos de ser prolongados por

10 desoxinucleotidil transferasa terminal.

Las Fig. 8–10 muestran los resultados de los experimentos diseñados para caracterizar la reacción de escisión catalizada por ADNPTaq. A no ser que se especifique lo contrario, las reacciones de escisión comprendieron 0,01 pmoles de ADN en forma de horquilla marcado terminalmente desnaturalizado térmicamente (con la cadena complementaria sin marcar también presente), 1 pmol de cebador (complementario al brazo 3’) y 0,5 unidades de

15 ADNpTaq (estimados como 0,026 pmoles) en un volumen total de 10 1l de Tris–Cl 10mM, pH 8,5, KCl 50mM y MgCl2 1,5mM. Según lo indicado, algunas reacciones tenían diferentes concentraciones de KCl, y las temperaturas y los tiempos exactos usados en cada experimento se indican en las figuras individuales. Las reacciones que incluían un cebador usaron el que se muestra en la Fig. 5 (SEC ID N.º 17). En algunos casos, el cebador fue prolongado hasta el sitio de unión proporcionando polimerasa y nucleótidos seleccionados.

20 Las reacciones se iniciaron a la temperatura de reacción final mediante la adición de bien MgCl2 o enzima. Las reacciones se detuvieron a sus temperaturas de incubación mediante la adición de 8 1l de formamida al 95% con EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05%. Los cálculos de la Tf enumerados se realizaron usando el programade análisis de cebadores Oligo™de National Biosciences, Inc. Éstos fueron determinados usando 0,25 1M como la concentración de ADN, a un contenido total de sales de bien 15 ó 65mM (al MgCl2 1,5mM de todas las reacciones le

25 fue dado el valor de sal 15mM para estos cálculos).

La Fig. 8 es un autorradiograma que contiene los resultados de un conjunto de experimentos y condiciones sobre el sitio de escisión. La Fig. 8A es una determinación de los componentes de reacción que permiten la escisión. La incubación del ADN en horquilla marcado en el extremo 5’ duró 30 minutos a 55°C, con los componentes in dicados. Los productos fueron resueltos mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante, indicándose las

30 longitudes de los productos en nucleótidos. La Fig. 8B describe el efecto de la temperatura sobre el sitio de escisión sin la adición de cebador. Las reacciones se incubaron en ausencia de KCl durante 10 minutos a las temperaturas indicadas. Se indican las longitudes de los productos en nucleótidos.

Sorprendentemente, la escisión realizada por ADNPTaq no requiere un cebador ni dNTP (véase la Fig. 8A). De este modo, se puede desacoplar la actividad nucleasa 5' de la polimerización. La actividad nucleasa requiere iones de

35 magnesio, aunque se pueden sustituir por iones de manganeso, aunque con posibles cambios en la especificidad y en la actividad. Ni los iones de cinc ni los de calcio mantienen la reacción de escisión. La reacción tiene lugar en un amplio intervalo de temperatura, de 25°C a 85°C, au mentando la velocidad de escisión a temperaturas más elevadas.

De nuevo en referencia a la Fig. 8, el cebador no es prolongado sin la adición de dNTP. Sin embargo, el cebador

40 influye tanto en el sitio como en la velocidad de escisión de la horquilla. El cambio en el sitio de escisión (Fig. 8A) es el resultado aparente de la interrupción de un dúplex corto formado entre los brazos del sustrato de ADN. En ausencia de cebador, las secuencias indicadas con un subrayado en la Fig. 5, se podrían aparear formando un dúplex prolongado. La escisión en el extremo del dúplex prolongado liberaría el fragmento de 11 nucleótidos observado sobre los carriles de la Fig. 8A sin adición de cebador. La adición de un exceso de cebador (vías 3 y 4 de

45 la Fig. 8A) o la incubación a una temperatura elevada (Fig. 8B) interrumpe la prolongación corta del dúplex y resulta en un brazo 5’ más largo y, por consiguiente, productos de escisión más largos.

La localización del extremo 3' del cebador puede influir en el sitio de escisión exacto. El análisis electroforético reveló que, en ausencia de cebador (Fig. 8B), la escisión tiene lugar en el extremo del dúplex sustrato (bien la forma prolongada o acortada, en función de la temperatura) entre el primer y el segundo par de bases. Cuando el cebador

50 se prolonga hasta la base del dúplex, la escisión también tiene lugar en un nucleótido dentro del dúplex. Sin embargo, cuando hay un hueco de cuatro a seis nucleótidos entre el extremo 3' del cebador y el dúplex sustrato, el sitio de escisión es desplazado cuatro a seis nucleótidos en el sentido 5’.

La Fig. 9 describe las cinéticas de la escisión en presencia (Fig. 9A) o en ausencia (Fig. 9B) de un oligonucleótido cebador. Las reacciones fueron realizadas a 55°C bi en con KCl 50mM (Fig. 9A) o KCl 20mM (Fig. 9B). Los

55 productos fueron resueltos mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante, indicándose las longitudes de los productos en nucleótidos. “M”, que india un marcador, es un oligonucleótido de 19–nt marcado en el extremo 5'. En estas condiciones de sales, las Fig. 9A y 9B indican que la reacción parece ser aproximadamente veinte veces más rápida en presencia de cebador que en ausencia de cebador. Este efecto sobre la eficacia puede ser atribuible al alineamiento adecuado y a la estabilización de la enzima sobre el sustrato.

La influencia relativa del cebador sobre las velocidades de escisión se vuelve mayor cuando ambas reacciones son ejecutadas en KCl 50mM. En presencia de cebador, la velocidad de escisión aumenta con la concentración de KCl hasta aproximadamente 50mM. Sin embargo, la inhibición de esta reacción en presencia de cebador es aparente a KCl 100mM y es completa a KCl 150mM. Por el contrario, en ausencia de cebador, la velocidad es aumentada por la

5 concentración de KCl hasta 20mM, pero es reducida a concentraciones por encima de 30mM. A KCl 50mM, la reacción es inhibida casi completamente. La inhibición de la escisión por el KCl en ausencia de cebador se ve afectada por la temperatura, siendo más pronunciada a temperaturas más bajas.

El reconocimiento del extremo 5' del brazo por ser cortado parece ser una característica importante de la precognición del sustrato. Los sustratos que carecen de un extremo 5' libre, tales como el ADN de M13 circular, no 10 pueden ser escindidos en ninguna condición analizada. Incluso con sustratos que tienen brazos 5’ definidos, la velocidad de escisión realizada por ADNPTaq es influida por la longitud del brazo. En presencia de cebador y KCl 50mM, la escisión de una prolongación de 5’ que sea de una longitud de 27 nucleótidos se completa esencialmente en 2 minutos a 55°C. Por el contrario, las escisione s de moléculas con brazos 5’ de 84 y 188 nucleótidos sólo se completan en aproximadamente un 90% y un 40% tras 20 minutos. La incubación a temperaturas más elevadas 15 reduce los efectos inhibidores de las prolongaciones largas, indicando que la estructura secundaria del brazo 5’ o una estructura lábil al calor de la enzima puede inhibir la reacción. Un experimento de mezclado, ejecutado en condiciones de exceso de sustrato, muestra que las moléculas con brazos largos no paralizan preferiblemente la enzima disponible en complejos no productivos. Estos resultados pueden indicar que el dominio nucleasa 5' accede al sitio de escisión por el extremo del dúplex bifurcado moviendo hacia abajo el brazo 5’ de un extremo al otro. Se

20 esperaría que los brazos 5’ más largos tuvieran estructuras secundarias más adventicias (particularmente cuando las concentraciones de KCl son elevadas) que tendrían probabilidad de impedir este movimiento.

La escisión no parece ser inhibida por los brazos 3’ largos de bien la molécula diana de la cadena sustrato o del ácido nucleico piloto, al menos hasta 2 kilobases. En el otro extremo, los brazos 3’ del ácido nucleico piloto tan cortos como un nucleótido pueden mantener la escisión en una reacción independiente del cebador, aunque

25 ineficazmente. Los oligonucleótidos completamente apareados no provocan la escisión de moldes de ADN durante la prolongación del cebador.

La capacidad de las ADNPTaq de escindir moléculas incluso cuando la cadena complementaria sólo contiene un nucleótido 3’ desapareado puede ser útil en la optimización de la PCR de alelo específico. Los cebadores de la PCR que tienen extremos 3’ desapareados podrían actuar como oligonucleótidos piloto para dirigir la escisión selectiva de

30 moldes no deseados durante la preincubación de posibles complejos de molde–cebador con ADNpTaq en ausencia de nucleósidos trifosfato.

B. Actividades nucleasa 5' de otras ADNp

Para determinar si otras nucleasas 5' de otras ADNp serían adecuadas para la presente invención, se examinó una selección de enzimas, varias de las cuales fueron presentadas en la bibliografía como libres de una actividad

35 nucleasa 5’ aparente. La capacidad de estas otras enzimas para escindir ácidos nucleicos de una manera de estructura específica se analizó usando el sustrato en horquilla mostrado en la Fig. 5 en condiciones presentadas como óptimas para la síntesis realizada por cada enzima.

La ADNpEc1 y el fragmento de Kenow de ADNp se obtuvieron en Promega Corporation; la ADNp de Pyrococcus furious ["Pfu". Bargseid et al., “Strategies” 4:34 (1991)] era de Stratagene; la ADNp de Thermococcus litoralis ["Tli".

40 Vent™(exo–); Perler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:5577 (1992)] era de New England Biolabs; la ADNp de Thermus flavus ["Tfl". Kaledin et al.,”Biokhimiya” 46:1576 (1981)] era de Epicentre Technologies, y la ADNp deThermus thermophilus ["Tth", Carballeira et al., “Biotechniques” 9:276 (1990); Myers et al., Biochem. 30:7661 (1991)] era de U.S. Biochemicals.

Se analizaron 0,5 unidades de cada ADN polimerasa en una reacción de 20 1l, usando bien los tampones

45 suministrados por los fabricantes para las reacciones dependientes del cebador, o Tris•Cl 10mM, pH 8,5; MgCl2 1,5mM y KCl 20mM. Las mezclas de reacción se mantuvieron a 72°C antes de la adición de enzima.

La Fig. 10 es un autorradiograma que registra los resultados de estos análisis. La Fig. 10A demuestra las reacciones de endonucleasas de ADNp de varias bacterias termófilas. Se incubaron las reacciones a 55°C durante 10 m inutos en presencia de cebador o a 72°C durante 30 minutos en ausencia de cebador, y se resolvieron los productos 50 mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante. Las longitudes de los productos se indican en nucleótidos. La Fig. 10B demuestra la escisión endonucleolítica realizada por la nucleasa 5’ de la ADNpEc1. Las reacciones con Klenow de ADNpEc1 y ADNp fueron incubadas durante 5 minutos a 37°C. Obsérvese la banda cla ra de productos de escisión de 25 y 11 nucleótidos de los carriles de ADNpEc1 (hechas en presencia y en ausencia de cebador, respectivamente). La Fig. 8A también demuestra las reacciones con ADNPTaq en presencia (+) o en

55 ausencia (–) de cebador. Estas reacciones fueron ejecutadas en KCl 50mM y 20mM, respectivamente, y se incubaron a 55°C durante 10 minutos.

En referencia a la Fig. 10A, las ADNp de las eubacterias Thermus thermophilus y Thermus flavus escinden el sustrato en el mismo lugar que la ADNPTaq, tanto en presencia como en ausencia de cebador. Por el contrario, las ADNp procedentes de las arqueabacterias Pyrococcus furiosus y Thermococcus litorales son incapaces de escindir los sustratos endonucleolíticamente. Las ADNp de Pyrococcus furiosus y Thermococcus litoralis comparten poca homología secuencial con las enzimas eubacterianas (Ito et al., Nucl. Acids Res. 19:4045 (1991); Mathur et al., Nucl. Acids. Res. 19:6952 (1991); véase también Perler et al.). En referencia a la Fig. 10B, la ADNpEc1 también escinde el

5 sustrato, pero los productos de escisión resultantes son difíciles de detectar a no ser que la exonucleasa 3’ esté inhibida. Las secuencias de aminoácidos de los dominios nucleasa 5’ de ADNpEc1 y ADNPTaq son aproximadamente un 38% homólogos (Gelfand, supra).

El dominio nucleasa 5' de la ADNPTaq también comparte aproximadamente un 19% de homología con la

exonucleasa 5’ codificada por el gen 6 del bacteriófago T7 [Dunn et al., J. Mol. Biol. 166:477 (1983)]. Esta nucleasa,

10 que no está unida covalentemente con un dominio de polimerización de ADNp también es capaz de escindir ADN endonucleolíticamente, en un sitio similar o idéntico al sitio que es cortado por las nucleasas 5' descritas anteriormente, sin la adición de cebadores.

C. Transescisión

En el siguiente experimento, se demostró la capacidad de una nucleasa 5' de ser dirigida a la escisión eficaz en

15 cualquier secuencia específica. Se hibridó un oligonucleótido parcialmente complementario denominado “oligonucleótido piloto” con las secuencias en el punto de escisión deseado. La parte de no complementariedad del oligonucleótido piloto proporcionó una estructura análoga al brazo 3’ del molde (véase la Fig. 5), mientras que la región 5’ de la cadena sustrato se convirtió en el brazo 5’. Se proporcionó un cebador mediante el diseño de la región 3’ del piloto tal que se plegara sobre sí misma creando una horquilla corta con un tetra–bucle estabilizante

20 [Antao et al., Nucl. Acids Res. 19:5901 (1991)]. En la Fig. 11A, se muestran dos oligonucleótidos piloto. Los oligonucleótidos 19–12 (SEC ID N.º 18), 30–12 (SEC ID N.º 19) y 30–0 (SEC ID N.º 20) tienen una longitud de 31, 42 ó 30 nucleótidos, respectivamente. Sin embargo, los oligonucleótidos 19–12 (SEC ID N.º 18) y 34–19 (SEC ID N.º 19) sólo tienen 19 y 30 nucleótidos, respectivamente, que son complementarios a secuencias distintas de la cadena sustrato. Los oligonucleótidos piloto se calculan para que fundan sus complementos a aproximadamente 50°C (19–

25 12) y aproximadamente 75°C (30–12). Ambos pilotos ti enen 12 nucleótidos en sus extremos 3’, que actúan como brazos 3’ unidos que tienen unidos cebadores en apareamiento de bases.

Para demostrar que la escisión podría ser dirigida por un oligonucleótido piloto, se incubó un ADN diana monocatenario con ADNPTaq en presencia de dos posibles oligonucleótidos piloto. Las reacciones de transescisión, en las que los ácidos nucleicos diana y piloto no están unidos covalentemente, incluyen 0,01 pmoles de ADN

30 sustrato simple marcado terminalmente, 1 unidad de ADNPTaq y 5 pmoles de oligonucleótido piloto en un volumen de 20 1l de los mismos tampones. Se combinaron estos componentes durante una incubación de un minuto a 95°C, para desnaturalizar el ADN sustrato bicatenario generado por PCR, y entonces se redujeron las temperaturas de las reacciones hasta sus temperaturas de incubación finales. Los oligonucleótidos 30–12 y 19–12 pueden hibridarse a regiones de los ADN sustratos que están a 85 y 27 nucleótidos del extremo 5’ de la cadena diana.

35 La Fig. 19 muestra la secuencia 206–mérica completa (SEC ID N.º 27). El 206–mero fue generado por PCR. Se usaron el cebador (–48) de secuenciación inversa 24–mérico M13/pUC y el cebador (–47) de secuenciación M13/pUC procedentes de New England Biolabs (n.º de catálogos 1233 y 1224, respectivamente) (50 pmoles de cada uno) con vector de plásmido pGEM3z(f+) (Promega Corp.) como molde (10 ng) que contenía las secuencias diana. Las condiciones para la PCR fueron las siguientes: 50 1M de cada dNTP y 2,5 unidades de ADN polimerasa

40 de Taq en 100 1l de Tris–Cl 20mM, pH 8,3; MgCl2 1,5mM; KCl 50mM con Tween–20 al 0,05% y NP–40 al 0,05%. Se sometieron las reacciones a 35 ciclos a través de 95°C durante 45 segundos, 63°C durante 45 segundos, luego 72°C durante 75 segundos. Tras los ciclos, se final izaron las reacciones con una incubación a 72°C dur ante 5 minutos. Se purificó el fragmento resultante mediante electroforesis a través de un gel de poliacrilamida (entrecruzamiento de 29:1) en un tampón de Tris–Borato 45mM, pH 8,3 y EDTA 1,4mM, se visualizó mediante

45 tinción con bromuro de etidio o autorradiografía, se separó del gel, se eluyó mediante difusión pasiva y se concentró mediante precipitación con etanol.

La escisión del ADN sustrato tuvo lugar en presencia del oligonucleótido piloto 19–12 a 50°C (Fig. 11B, vías 1 y 7), pero no a 75°C (vías 4 y 10). En presencia del oligo nucleótido 30–12, se observó la escisión a ambas temperaturas. La escisión no se produjo sin la adición de oligonucleótidos (vías 3, 6 y 12) o a aproximadamente 80°C , aunque a

50 50°C, las estructuras adventicias del sustrato perm itieron la escisión independiente del molde en ausencia de KCl (Fig. 11B, vía 9). Un oligonucleótido inespecífico sin complementariedad con el ADN sustrato no dirigió la escisión a 50°C, ni en ausencia ni en presencia de KCl 50mM (ví as 13 y 14). De este modo, es posible controlar la especificidad de las reacciones de escisión mediante la ampliación de la complementariedad al sustrato y en las condiciones de incubación.

55 D. Escisión de ARN

Se analizó una versión de ARN acortada de la secuencia usada en los experimentos de transescisión descritos anteriormente en cuanto a su capacidad para servir como sustrato de la reacción. Se escinde el ARN en el lugar esperado, en una reacción que es dependiente de la presencia del oligonucleótido piloto. El sustrato de ARN, elaborado mediante ARN polimerasa de T7 en presencia de [a–32P]UTP, corresponde a una versión truncada del sustrato de ADN usado en la Fig. 11B. Las condiciones de reacción fueron similares a aquéllas en las que se usaron los sustratos de ADN descritos anteriormente, con KCl 50mM; la incubación fue durante 40 minutos a 55°C. El oligonucleótido piloto usado se denomina 30–0 (SEC ID N.º 20) y se muestra en la Fig. 12A.

En la Fig. 13B, se muestran los resultados de la reacción de escisión. La reacción fue ejecutada bien en presencia o 5 en ausencia de ADNPTaq u oligonucleótido piloto según lo indicado en la Fig. 12B.

Sorprendentemente, en el caso de la escisión de ARN, no es necesario un brazo 3’ para el oligonucleótido piloto. Es muy poco probable que esta escisión se deba a la RNasaH descrita anteriormente, de la que se esperaría que cortara el ARN en varios lugares a lo largo del dúplex de ARN–ADN largo de 30 pares de bases. La nucleasa 5' de la ADNpTaq es una RnasaH de estructura específica que escinde el ARN en un solo sitio cercano al extremo 5' de la

10 región heteroduplicada.

Es sorprendente que un oligonucleótido que carezca de brazo 3’ sea capaz de actuar como un piloto en la dirección de una escisión eficiente de una diana de ARN, porque tales oligonucleótidos son incapaces de dirigir la escisión eficaz de las dianas de ADN usando ADNp nativas. Sin embargo, algunas nucleasas 5' de la presente invención (por ejemplo, los clones E, F y G de la Fig. 4) pueden escindir el ADN en ausencia de un brazo 3’. En otras palabras, no

15 se requiere una estructura de escisión no prolongable para la escisión específica con algunas nucleasas 5' de la presente invención derivadas de ADN polimerasas termoestables.

Se analizó si la escisión de un molde de ARN realizada por ADNPTaq en presencia de un cebador completamente complementario podría ayudar a explicar por qué la ADNPTaq no puede prolongar un oligonucleótido de ADN sobre un molde de ARN en una reacción semejante a la de la transcriptasa inversa. Otro ADNp termófilo, el ADNpTth, es 20 capad de usar el ARN como molde, pero sólo en presencia de Mn++, de manera que se predijo que esta enzima no escindiría ARN en presencia de este catión. Por consiguiente, se incubó una molécula de ARN con un oligonucleótido piloto apropiado en presencia de ADNPTaq o ADNpTth, en tampón que contenía bien Mg++ o Mn++. Según lo esperado, ambas enzimas escindieron el ARN en presencia de Mg++. Sin embargo, la ADNPTaq, y no la ADNpTth, degradó el ARN en presencia de Mn++. Se concluyó que las actividades nucleasa 5' de muchas ADNp

25 pueden contribuir a su incapacidad de usar ARN como moldes.

Ejemplo 2

Generación de nucleasas 5' a partir de ADN polimerasas termoestables

Se generaron ADN polimerasas termoestables que tienen una actividad sintética reducida, una actividad que es una reacción secundaria indeseable durante la escisión de ADN en el análisis de detección de la invención, aunque han

30 mantenido la actividad nucleasa termoestable. El resultado es una polimerasa termoestable que escinde ADN de ácidos nucleicos con extrema especificidad.

Las ADN polimerasas de tipo A procedentes de eubacterias del género Thermus comparten una amplia identidad secuencial proteínica (90% en el dominio de polimerización, usando el procedimiento de Lipman–Pearson en el programa de análisis de ADN de DNAStar, WI) y se comportan de manera similar tanto en el análisis de 35 polimerización como en el de nucleasas. Por lo tanto, se han usado genes para la ADN polimerasa de Thermus aquaticus (ADNPTaq) y de Thermus flavus (ADNpTfl) como representativos de esta clase. Los genes de polimerasa procedentes de otros organismos eubacterianos, tales como Thermus thermophilus, Thermus sp., Thermotoga maritima, Thermosipho africanus y Bacillus stearothermophilus son igualmente adecuados. Las ADN polimerasas de estos organismos termófilos son capaces de sobrevivir y actuar a temperaturas elevadas, y por tanto se pueden usar

40 en reacciones en las que se use la temperatura como una selección frente a la hibridación inespecífica de cadenas de ácido nucleico.

Los sitios de restricción usados para la mutagénesis de eliminación, descrita más adelante, se seleccionaron por comodidad. En el gen de Thermus thermophilus, hay diferentes sitios situados que suponen una comodidad similar y se pueden usar para hacer construcciones similares con otros genes de polimerasa de tipo A procedentes de

45 organismos relacionados.

A. Creación de construcciones de nucleasa 5'

1. Genes modificados de ADNpTaq

La primera etapa consistió en colocar un gen modificado para la ADN polimerasa de Taq sobre un plásmido bajo el control de un promotor inducible. El gen modificado de polimerasa Taq fue aislado como se explica a continuación: 50 El gen de ADN polimerasa de Taq fue amplificado mediante reacción en cadena de la polimerasa desde ADN genómico de Thermus aquaticus, cepa YT–1 (Lawyer et al., supra), usando como cebadores los oligonucleótidos descritos en las SEC ID N.º 13–14. El fragmento resultante de ADN tiene una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción EcoRI en el extremo 5' de la secuencia codificante y una secuencia para Bglll enel extremo 3'. La escisión con Bglll deja un saliente 5’ o “extremo pegajoso” que es compatible con el extremo 55 generado por BamHI. El ADN amplificado por PCR fue digerido con EcoRI y BamHI. El fragmento de 2.512 pb que contenía la región codificante para el gen de polimerasa fue purificado sobre gel y luego unido a un plásmido que

contiene un promotor inducible.

En una realización de la invención, se usó el vector pTTQ18, que contiene el promotor híbrido trp–lac (tac), [M.J.R. Stara, Gene 5:255 (1987)], y se muestra en la Fig. 13. El promotor tac está bajo el control del represor lac de E. coli. La represión permite la síntesis del producto génico por ser suprimido hasta que se haya alcanzado el nivel deseado

5 de crecimiento bacteriano, en cuyo punto, se elimina la represión mediante la adición de un inductor específico, isopropil– –D–tiogalactopiranósido (IPTG). Tal sistema permite la expresión de proteínas foráneas que pueden retardar o evitar el crecimiento de transformantes.

Los promotores bacterianos, tales como tac, pueden no ser adecuadamente suprimidos cuando están presentes sobre un plásmido de múltiples copias. Si se coloca una proteína muy tóxica bajo el control de tal promotor, la 10 pequeña cantidad de expresión que se introduce puede se dañina para las bacterias. En otra realización de la invención, se usó otra opción para la represión de la síntesis de un producto génico clonado. Se usó el promotor no bacteriano, procedente de bacteriófago T7, encontrado en la serie pET–3 del vector de plásmido para expresar los genes de polimerasa Taq mutantes clonados [Fig. 15; Studier y Moffatt. J. Mol. Biol. 189:113 (1986)]. Este promotor inicia la transcripción sólo mediante ARN polimerasa de T7. En una cepa adecuada, tal como BL21(DE3)pLYS, el

15 gen para esta ARN polimerasa es portado sobre el genoma bacteriano bajo el control del operador lac. Esta disposición tiene la ventaja de que la expresión del gen de múltiples copias (sobre el plásmido) es completamente dependiente de la expresión de la ARN polimerasa de T7, que es fácilmente suprimida porque está presente en una sola copia.

Para la unión en el vector pTTQ18 (Fig. 13), se digirió el ADN producto de la PCR que contenía la región codificante

20 de polimerasa Taq (mutTaq, clon 4B, SEC ID N.º 21) con EcoRI y BgIII, y se unió este fragmento en condiciones de “extremo pegajoso” estándar [Sambrook et al., “Molecular Cloning”. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, pp. 1.63–1.69 (1989)] en los sitios de EcoRI y BamHI del vector de plásmido pTTQ18. La expresión de esta construcción genera un producto de fusión traduccional en el que los dos primeros residuos de la proteína nativa (Met–Arg) están reemplazados por tres del vector (Met–Asn–Ser), pero el resto de la proteína natural no

25 cambiaría. Se transformó la construcción en la cepa JM109 de E. coli y se emplacaron los transformantes en condiciones no completamente represoras que no permiten el crecimiento de bacterias que expresen la proteína nativa. Estas condiciones de emplacamiento permiten el aislamiento de genes que contienen mutaciones pre– existentes, tales como aquéllos que resultan de la infidelidad de la polimerasa Taq durante el procedimiento de amplificación.

30 Mediante el uso de este protocolo de amplificación/selección, se aisló un clon (representado en la Fig. 3B) que contenía un gen de polimerasa Taq mutado (mutTaq, clon 3B). El mutante se detectó primero por su fenotipo, en el que la actividad nucleasa 5' estable a la temperatura en un extracto celular crudo era normal, pero la actividad de polimerización estaba casi ausente (aproximadamente menos del 1% de actividad polimerasa Taq de tipo natural).

El análisis de la secuencia de ADN del gen recombinante mostró que tenía cambios en el dominio polimerasa que

35 resultaron en dos sustituciones de aminoácidos: un cambio de A a G en la posición de nucleótido 1.394 produce un cambio de Glu a Gly en la posición de aminoácido 465 (numerados según las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos naturales, SEC ID N.º 1 y 4) y otro cambio de A a G en la posición de nucleótido 2.260 produce un cambio de Gln a Arg en la posición de aminoácido 754. Como la mutación de Gln a Gly está en una posición no conservada y la mutación de Glu a Arg modifica un aminoácido que está conservado en casi todas las polimerasas de tipo A

40 conocidas, es más probable que esta última mutación sea la responsable de reducir la actividad de síntesis de esta proteína. La secuencia de nucleótidos para la construcción de la Fig. 3B se proporciona en la SEC ID N.º 21. La enzima codificada por esta secuencia se denomina A/G Cleavase®.

Se elaboraron derivados posteriores de las construcciones de ADNpTaq procedentes del gen mutTaq, por lo tanto, todos portaban estas sustituciones de aminoácidos además de sus otras modificaciones, a no ser que estas

45 regiones concretas estuvieran eliminadas. Estos sitios mutados se indican con recuadros en negro en estas localizaciones de los diagramas de la Fig. 3. En la Fig. 3, la denominación de “Exo 3’” se usa para indicar la ubicación de la actividad exonucleasa 3’ asociada con las polimerasas de tipo A que no están presentes en la ADNPTaq. Todos las construcciones a excepción de los genes mostrados en las Fig. 3E, F y G fueron elaborados en el vector pTTQ18.

50 El vector de clonación usado para los genes de las Fig. 3E y F procedía de la serie pET–3 disponible comercialmente, descrita anteriormente. Aunque esta serie de vector sólo tiene un sitio BamHI para clonar secuencia abajo del promotor de T7, la serie contiene variantes que permiten la clonación en cualquiera de los tres marcos de lectura. Para la clonación del producto PCR descrito anteriormente, se usó la variante denominada pET– 3c (Fig. 14). Se digirió el vector con BamHI, desfosforilado con fosfatasa de intestino bovino, y se llenaron los

55 extremos pegajosos usando el fragmento de Klenow de ADNpEc1 y varios dNTP. Se liberó el gen para la ADNp Taq mutante mostrada en la Fig. 3B (mutTaq, clon 3B) de pTTQ18 por digestión con EcoRI y SalI, y se llenaron los “extremos pegajosos” como se hizo con el vector. Se unió el fragmento al vector en condiciones de extremos romos estándar (Sambrook et al, “Molecular Cloning”, supra), se transformó la construcción en la cepa BL21(DE3)pLYS de

E. coli y se rastrearon los aislados para identificar aquéllos que fueron unidos con el gen en el sentido apropiado en 60 relación con el promotor. Esta construcción genera otro producto de fusión traduccional, en el que los dos primeros aminoácidos de ADNpTaq (Met–Arg) estaban reemplazados por 13 del vector más dos del cebador de la PCR (Met– Ala–Ser–Met–Thr–Gly–Gly–Gln–Gln–Met–Gly–Arg–Ile–Asn–Ser) (SEC ID N.º 24).

El objetivo consistía en generar enzimas que carecieran de la capacidad de sintetizar ADN, pero que conservaran la capacidad de escindir ácidos nucleicos con una actividad nucleasa 5’. El acto de la síntesis con molde y cebador del

5 ADN, en realidad, es una serie coordinada de eventos, por lo que es posible deshabilitar la síntesis de ADN interrumpiendo un evento sin afectar al resto. Estas etapas incluyen, pero no se limitan a, reconocimiento y unión de un cebador, unión de dNTP y catálisis del enlace tipo fosfodiéster entre nucleótidos. Algunos de los aminoácidos del dominio de polimerización de ADNpEc1 han estado unidos a estas funciones, pero los mecanismos concretos están poco definidos hasta el momento.

10 Un modo de destruir la capacidad de polimerización de una ADN polimerasa consiste en eliminar todo o parte del segmento génico que codifica ese dominio para la proteína, o de otro modo, hacer que el gen sea incapaz de hacer un dominio de polimerización completo. Las enzimas mutantes individuales pueden diferir entre sí en cuanto a estabilidad y solubilidad tanto dentro como fuera de las células. Por ejemplo, a diferencia del dominio nucleasa 5' de ADNpEc1, que puede ser liberado en una forma activa desde el dominio de polimerización mediante una proteolisis

15 suave [Setlow y Kornberg, J. Biol. Chem. 247:232 (1972)], el dominio nucleasa de Thermus, cuando se trata de una manera similar, se vuelve menos soluble y a menudo se pierde la actividad de escisión.

Usando el gen mutante mostrado en la Fig. 3B como material inicial, se crearon varios construcciones de eliminación. Todas las tecnologías de clonación fueron estándar (Sambrook et al. supra) y se resumen a continuación:

Fig. 3C: la construcción mutTaq fue digerida con PstI, que corta una vez dentro de la región codificante de la

20 polimerasa, como se indica, y corta inmediatamente secuencia abajo del gen en el sitio de clonación múltiple del vector. Tras la liberación del fragmento entre estos dos sitios, se volvió a unir el vector, creando una eliminación de 894 nucleótidos, y llevando al marco un codón de terminación 40 nucleótidos secuencia abajo de la unión. La secuencia de nucleótidos de esta nucleasa 5’ (clon 4C) se proporciona en SEC ID N. 9.

Fig. 3D: la construcción mutTaq fue digerida con Nhel, que corta una vez en el gen de la posición 2.047. Se llenaron

25 los extremos salientes 5’ de cuatro nucleótidos resultantes, según lo descrito anteriormente, y se volvieron a unir los extremos romos. La inserción de cuatro nucleótidos resultante cambia el marco de lectura y provoca la terminación de la traducción diez aminoácidos secuencia abajo de la mutación. La secuencia de nucleótidos de esta nucleasa 5’ (clon 3D) se proporciona en SEC ID N.º 10.

Fig. 3E: se cortó todo el gen mutTaq desde pTTQ18 usando EcoRI y SalI, y se clonó en pET–3c, según lo descrito

30 anteriormente. Se digirió este clon con BstXI y Xcml, en sitios exclusivos que están situados según lo mostrado en la Fig. 3E. Se trató el ADN con el fragmento de Klenow de ADNpEc1 y varios dNTP, lo que resultó en los salientes 3’ de ambos sitios orientados hacia los extremos romos. Se unieron entre sí estos extremos romos, dando como resultado una eliminación fuera de marco de 1.540 nucleótidos. Se produjo un codón de terminación en marco 18 tripletes después del sitio de unión. La secuencia de nucleótidos de esta nucleasa 5’ (clon 3E) se proporciona en

35 SEC ID N.º 11, con la secuencia líder apropiada proporcionada en SEC ID N.º 25. También se denomina BX Cleavase®.

Fig. 3F: se cortó todo el gen mutTaq desde pTTQ18 usando EcoRI y SalI, y se clonó en pET–3c, según lo descrito anteriormente. Se digirió este clon con BstXI y BamHI, en sitios exclusivos que están situados según lo mostrado en el diagrama. Se trató el ADN con el fragmento de Klenow de ADNpEc1 y varios dNTP, lo que resultó en el saliente 3’

40 del sitio BstXI orientado hacia un extremo romo, mientras que el saliente 5’ del sitio BamHI fue relleno para formar un extremo romo. Se unieron entre sí estos extremos, dando como resultado una eliminación en marco de 903 nucleótidos. La secuencia de nucleótidos de esta nucleasa 5’ (clon 3F) se proporciona en SEC ID N.º 12. También se denomina BB Cleavase®.

Fig. 3G: esta polimerasa es una variante de la mostrada en la Fig. 4E. Fue clonada en el vector de plásmido per–21

45 (Novagen). El promotor no bacteriano del bacteriófago T7, encontrado en este vector, sólo inicia la transcripción mediante ARN polimerasa de T7. Véase Studier y Moffatt, supra. En una cepa adecuada, tal como (DES)pLYS, el gen para esta ARN polimerasa es portado sobre el genoma bacteriano bajo el control del operador lac. Esta disposición tiene la ventaja de que la expresión del gen de múltiples copias (sobre el plásmido) es completamente dependiente de la expresión de la ARN polimerasa de T7, que es fácilmente suprimida porque está presente en una

50 sola copia. Como la expresión de estos genes mutantes está bajo este promotor estrechamente controlado, los posibles problemas de toxicidad de las proteínas expresadas a las células huésped son menores.

El vector pET–21 también se presenta como “His*Tag”, un tramo de seis residuos de histidina consecutivos que están añadidos sobre el terminal carboxilo de las proteínas expresadas. Las proteínas resultantes pueden ser entonces purificadas en una sola etapa mediante cromatografía de quelación de metales, usando una columna de

55 resina disponible comercialmente (Novagen) con iones Ni–– inmovilizados. Las columnas de 2,5 ml son reutilizables, y pueden unir hasta 20 mg de proteína diana en condiciones nativas o desnaturalizantes (guanidina*HCl o urea).

Se transforman células (DES)pLYS de E. coli con las construcciones descritas anteriormente usando técnicas de transformación estándar, y se usaron para inocular un medio de crecimiento estándar (p.ej., caldo de Luria–Benani).

La producción de ARN polimerasa de T7 se induce durante el crecimiento en fase logarítmica mediante la adición de IPTG y se incuba durante 12 a 17 horas más. Las alícuotas del cultivo se eliminan tanto antes como después de la inducción, y las proteínas se examinan por electroforesis en gel de poliacrilamida–SDS. La tinción con azul de Coomassie permite la visualización de las proteínas foráneas, si representan aproximadamente 3–5% de la proteína

5 celular y no co–emigran con ninguna de las bandas de la proteína principal. Las proteínas que co–emigran con la proteína huésped principal deben ser expresadas como más del 10% de la proteína total para que se vean en esta etapa del análisis.

Algunas proteínas mutantes son secuestradas por células e introducidas en cuerpos de inclusión. Se trata de gránulos que se forman en el citoplasma cuando se hace que las bacterias expresen niveles elevados de una 10 proteína foránea, y se pueden purificar a partir de un lisado crudo y analizar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida–SDS para determinar su contenido proteínico. Si se encuentra la proteína clonada en los cuerpos de inclusión, debe ser liberada para analizar las actividades de escisión y polimerasa. Hay diferentes procedimientos de solubilización que pueden ser apropiados para diferentes proteínas, y se conoce una variedad de procedimientos. Véase, p.ej., Builder y Ogez, patente estadounidense n.º 4.511.502 (1985); Olson, patente estadounidense 15 n.º 4.518.526 (1985); Olson y Pai, patente estadounidense n.º 4.511.503 (1985), Jones et al., patente estadounidense n.º 4.512.922 (1985), encontrándose todas ellas incorporadas en la presente memoria por referencia.

Entonces se purifica la proteína disuelta sobre la columna de Ni++, según lo descrito anteriormente, siguiendo las instrucciones de los fabricantes (Novagen). Se eluyen las proteínas lavadas desde la columna mediante una combinación de competidor de imidazol (1M) y una sal elevada (NaCl 0,5M), y se someten a diálisis para

20 intercambiar el tampón y permitir que las proteínas desnaturalizadas se vuelvan a plegar. Las recuperaciones comunes dan como resultado aproximadamente 20 1g de proteína específica por cada ml de cultivo inicial. La ADNp mutante se denomina nucleasa BN Cleavase® y la secuencia se proporciona en SEC ID N.º 26 (la secuencia de aminoácidos de la nucleasa BN Cleavase® se obtuvo traduciendo la secuencia de ADN de SEC ID N.º 26).

2. Gen de ADNpTfl modificado

25 El gen de ADN polimerasa de Thermus flavus fue aislado de la cepa AT–62 de “T. flavus” obtenida en la colección americana de tejidos tipo (ATCC 33923). La cepa tiene un mapa de restricción diferente que la cepa de T. flavus usada para generar la secuencia publicada por Akhmetzjanov y Vakhitov, supra. La secuencia publicada figura como SEC ID N.º 2. No se han publicado datos secuenciales para el gen de ADN polimerasa procedente de la cepa AT–62 de T. flavus.

30 El ADN genómico de T. flavus se amplificó usando los mismos cebadores usados para amplificar el gen de ADN polimerasa de T. aquaticus (SEC ID N.º 13–14). El fragmento de la PCR de aproximadamente 2.500 pares de bases fue digerido con EcoRI y BamHI. Se volvieron romos los extremos salientes con el fragmento de Klenow de ADNpEc1 y varios dNTP. El fragmento de aproximadamente 1.800 pares de bases resultante que contiene la región codificante del terminal N fue unido en pET–3c según lo descrito anteriormente. Este constructo, el clon 4B, se

35 representa en la Fig. 4B. El gen para la ADN polimerasa de T. flavus de tipo natural se representa en la Fig. 4A. El clon 4B tiene los mismos aminoácidos líder que los clones de ADNpTaq 4E y F, que fueron clonados en pET–3c; no se sabe con exactitud dónde ocurre la terminación de la traducción, pero el vector tiene una fuerte señal de terminación de la transcripción inmediatamente secuencia abajo del sitio de clonación.

B. Crecimiento e inducción de células transformadas

40 Se transformaron células bacterianas con las construcciones descritas anteriormente usando técnicas de transformación estándar, y se usaron para inocular 2 ml de un medio de crecimiento estándar (p.ej., caldo de Luria– Benani). Se incubaron los cultivos resultantes según lo apropiado para la cepa en particular usada y se indujeron, según lo necesario, para un determinado sistema de expresión. Para todos las construcciones representadas en las Fig. 3 y 4, se cultivaron los cultivos hasta una densidad óptica (a una longitud de onda de 600 nm) de DO = 0,5.

45 Para inducir la expresión de los genes clonados, se llevaron los cultivos hasta una concentración final de IPTG 0,4mM y se continuaron las incubaciones durante 12 a 17 horas. Se retiraron alícuotas de 50 1l de cada cultivo tanto antes como después de la inducción, y se combinaron con 20 1l de un tampón de carga en gel estándar para la electroforesis en gel poliacrilamida–dodecilsulfato de sodio (SDS–PAGE). La posterior tinción con azul de Coomassie (Sambrook et al., supra) permite la visualización de las proteínas foráneas, si representan

50 aproximadamente 3–5% de la proteína celular y no co–emigran con ninguna de las bandas de la proteína de E. coli principal. Las proteínas que co–emigran con la proteína huésped principal deben ser expresadas como más del 10% de la proteína total para que se vean en esta etapa del análisis.

C. Lisis y separación térmica

Se aislaron las proteínas termoestables expresadas, i.e., las nucleasas 5', calentando extractos celulares

55 bacterianos crudos para producir la desnaturalización y la precipitación de las proteínas de E. coli menos estables. Entonces, se eliminaron mediante centrifugación las proteínas de E. coli precipitadas, junto con otros residuos celulares. Se suspendieron 1,7 ml del cultivo mediante microcentrifugación de 12.000 a 14.000 rpm durante 30 a 60 segundos. Tras retirar el sobrenadante, se volvieron a suspender las células en 400 1l de tampón A (Tris–HCl 50mM; pH 7,9; dextrosa 50mM y EDTA 1mM), se volvieron a centrifugar, luego se volvieron a suspender en 80 1l de tampón A con 4 mg/ml de lisozima. Se incubaron las células a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego se combinaron con 80 1l de tampón B (Tris–HCl 10mM; pH 7,9; KCl 50mM; EDTA 1mM; PMSF 1mM; Tween–20 al 0,5%; Nonidet–P40 al 0,5%).

Se incubó esta mezcla a 75°C durante 1 hora para des naturalizar y precipitar las proteínas huésped. Se centrifugó este extracto celular a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4°C, y se transfirió el sobrenadante a un tubo recién preparado. Se usó una alícuota de 0,5 a 1 1l de este sobrenadante directamente en cada reacción de análisis y se determinó el contenido de proteínas del extracto sometiendo 7 1l a análisis electroforético, según lo anterior. La ADN polimerasa de Taq recombinante nativa [Englke, Anal. Biochem 191:396 (1990)] y la proteína de mutación puntual doble mostrada en la Fig. 3B son tanto solubles como activas en este punto.

La proteína foránea puede no ser detectada tras los tratamientos térmicos debido al secuestro de la proteína foráneapor las células y su introducción en cuerpos de inclusión. Éstos son gránulos que se forman en el citoplasma cuando se hace que las bacterias expresen niveles elevados de una proteína foránea, y se pueden purificar a partir de un lisado crudo y analizar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida–SDS para determinar su contenido proteínico. Muchos son los procedimientos descritos en la bibliografía, y a continuación se describe uno de los enfoques.

D. Aislamiento y solubilización de cuerpos de inclusión

Se cultivó un pequeño cultivo y se indujo según lo descrito anteriormente. Se sedimentó una alícuota de 1,7 ml mediante una centrifugación corta, y se volvieron a suspender las células bacterianas en 100 1l de tampón de lisis (Tris–HCl 50mM; pH 8,0; EDTA 1mM; NaCl 100mM). Se añadieron 2,5 1l de PMSF 20mM para una concentración final de 0,5mM, y se añadió lisozima hasta una concentración de 1,0 mg/ml. Se incubaron las células a temperatura ambiente durante 20 minutos, se añadió ácido desoxicólico a 1 mg/ml (1 1l de 100 mg/ml de solución), y se siguió incubando la mezcla a 37°C durante aproximadamente 15 minutos o hasta que se volvió viscosa. Se añadió ADNasa I a 10 1g/ml y se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos o hasta que dejó de ser viscosa.

Se recogieron los cuerpos de inclusión de esta mezcla mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4°C, y se desechó el sobrenadante. Se volvieron a s uspender los sedimentos en 100 1l de tampón de lisis con EDTA 10mM (pH 8,0) y TritonX–100 al 0,5%. Tras 5 minutos a temperatura ambiente, se sedimentaron los cuerpos de inclusión como antes y se reservó el sobrenadante para un análisis posterior. Se volvieron a suspender los cuerpos de inclusión en 50 1l de agua destilada, y se combinaron 5 1l con tampón de carga sobre gel de SDS (que disuelve los cuerpos de inclusión) y se analizaron electroforéticamente, junto con una alícuota del sobrenadante.

Si se encuentra la proteína clonada en los cuerpos de inclusión, puede ser liberada para analizar las actividades de escisión y polimerasa, debiendo ser el procedimiento de solubilización compatible con la actividad en particular. Hay diferentes procedimientos de solubilización que pueden ser apropiados para diferentes proteínas, y se describe una variedad de procedimientos en “Molecular Cloning” (Sambrook et al., supra). Lo siguiente es una adaptación que se ha usado para varios de los aislados.

Se suspendieron 20 1l de suspensión de agua y cuerpos de inclusión mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 4 minutos a temperatura ambiente, y se desechó el sobrenadante. Para seguir lavando los cuerpos de inclusión, se volvieron a suspender los sedimentos en 201l de tampón de lisis con urea 2M y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Entonces se volvieron a suspender los cuerpos de inclusión lavados en 2 1l de tampón de lisis con urea 8M, aclarándose visiblemente la solución al disolverse los cuerpos de inclusión. Se eliminaron los residuos no disueltos mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 4 minutos a temperatura ambiente y se transfirió el sobrenadante extraído a un tubo recién preparado.

Para reducir la concentración de urea, se diluyó el extracto en KH2PO4. Se preparó un nuevo tubo que contenía 180 1l de KH2PO4 50mM, pH 9,5; EDTA 1mM y NaCl 50mM. Se añadió una alícuota de 2 1l del extracto y se sometió a un movimiento vorticial breve para mezclar. Se repitió esta etapa hasta que se hubo añadido todo el extracto para un total de 10 adiciones. Se dejó que la mezcla se asentara a temperatura ambiente durante 15 minutos, tiempo durante el cual se suele formar algún precipitado. Se eliminaron los precipitados mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente y se transfirió el sobrenadante a un tubo recién preparado. A los 200 1l de proteína en la solución de KH2PO4, se añadieron 140–200 1l de (NH4)2SO4 saturado, tal que la mezcla resultante era de (NH4)2SO4 saturado del aproximadamente 41% al 50%. Se enfrió la mezcla sobre hielo durante 30 minutos para permitir la precipitación de la proteína, y luego se recogió la proteína mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 4 minutos a temperatura ambiente. Se desechó el sobrenadante y se disolvieron los sedimentos en 20 1l de tampón C (HEPES 20mM, pH 7,9; EDTA 1mM; PMSF al 0,5%; KCl 25mM, y Tween–20 y Nonidet–P40 al 0,5% cada uno). Se centrifugó la solución de proteína de nuevo durante 4 minutos para sedimentar los materiales insolubles, y se retiró el sobrenadante a un tubo nuevo. Se visualizaron los contenidos de proteínas de los extractos preparados de esta manera resolviendo 1–4 1l mediante electroforesis en gel de poliacrilamida–SDS. Se analizó 0,5 a 1 1l de extracto en los análisis de escisión y polimerización según lo descrito.

E. Análisis de proteínas para la presencia de actividad nucleasa y sintética

Las nucleasas 5' descritas anteriormente y mostradas en las Fig. 3 y 4 se analizaron según los siguientes procedimientos.

1. Análisis de nucleasas de estructura específica

Se analiza una polimerasa modificada candidata en cuanto a la actividad nucleasa 5' examinando su capacidad para catalizar escisiones de estructura específica. El término “estructura de escisión”, como se usa en la presente memoria, pretende significar una estructura de ácido nucleico que es un sustrato para la escisión mediante la actividad nucleasa 5’ de una ADNp.

La polimerasa se expone a complejos de análisis que tienen las estructuras mostradas en la Fig. 15. El análisis de la actividad nucleasa 5' implica tres reacciones: 1) se realiza una escisión dirigida por un cebador (Fig. 15B) porque es relativamente insensible a variaciones en la concentración de sales de la reacción y, por lo tanto, se puede realizar en cualquier condición de soluto que la enzima modificada requiera para su actividad; ésta es generalmente equivalente a las condiciones preferidas por las polimerasas sin modificar; 2) se realiza una escisión dirigida por un cebador similar en un tampón que permita la escisión independiente de un cebador, i.e., un tampón bajo en sales, para demostrar que la enzima es viable en estas condiciones; y 3) se realiza una escisión independiente de un cebador (Fig. 15A) en el mismo tampón bajo en sales.

Se forma el dúplex bifurcado entre una cadena sustrato y una cadena molde según lo mostrado en la Fig. 15. El término “cadena sustrato”, como se usa en la presente memoria, pretende significar esa cadena de ácido nucleico en la que tiene lugar la escisión mediada por la actividad nucleasa 5’. La cadena sustrato siempre se representa como una cadena superior en el complejo bifurcado que sirve como sustrato para la escisión de la nucleasa 5' (Fig. 15). El término “cadena molde”, como se usa en la presente memoria, pretende significar la cadena de ácido nucleico que es al menos parcialmente complementaria a la cadena sustrato y que se aparea a la cadena sustrato para formar la estructura de escisión. La cadena molde se representa siempre como la cadena inferior de la estructura de escisión bifurcada (Fig. 15). Si un cebador (un oligonucleótido corto de 19 a 30 nucleótidos de longitud) se añade al complejo, como cuando se va a analizar una escisión dependiente de un cebador, se diseña para que se aparee con el brazo 3' de la cadena molde (Fig. 15B). Tal cebador se prolongaría a lo largo de la cadena molde si la polimerasa usada en la reacción tuviera actividad sintética.

La estructura de escisión se puede formar como una sola molécula de horquilla, con el extremo 3' de la diana y el extremo 5' del piloto unidos como un bucle según lo mostrado en la Fig. 15E. También es necesario un oligonucleótido cebador complementario al brazo 3' para estos análisis tal que se pueda medir la sensibilidad de la enzima a la presencia de un cebador.

Los ácidos nucleicos por ser usados para formar las estructuras de escisión analíticas se pueden sintetizar químicamente, o se pueden generar mediante técnicas de ADN recombinante estándar. Mediante el último procedimiento, se puede crear la parte de horquilla de la molécula mediante la inserción en un vector de clonación de copias por duplicado de un segmento de ADN corto, adyacentes entre sí, pero en sentido opuesto. El fragmento bicatenario que abarca esta repetición invertida e incluye suficiente secuencia flanqueante para proporcionar brazos 5’ y 3’ cortos (de aproximadamente 20 nucleótidos) desapareados, puede ser entonces liberado del vector mediante digestión con enzimas de restricción, o mediante PCR realizada con una enzima carente de la exonucleasa 5’ (p. ej., el fragmento Stoffel de la ADN polimerasa Amplitaq™, ADN polimerasa Vent™).

El ADN de análisis se puede marcar sobre cualquier extremo, o internamente, bien con un radioisótopo o con una etiqueta no isotópica. Independientemente de si el ADN en horquilla es una cadena simple sintética o una cadena doble clonada, el ADN se calienta antes de su uso para fundir todos los dúplex. Cuando se enfría sobre hielo, la estructura representada en la Fig. 16E se forma y es estable durante un tiempo suficiente para realizar estos análisis.

Para analizar la escisión dirigida por un cebador (Reacción 1), se colocan una cantidad detectable de la molécula de análisis (comúnmente 1–100 fmoles de molécula de horquilla marcada con 32P) y un exceso molar de 10 a 100 veces del cebador en un tampón conocido por su compatibilidad con la enzima de análisis. Para la Reacción 2, en la que se realiza una escisión dirigida por un cebador en condiciones que permiten la escisión independiente del cebador, se colocan las mismas cantidades de moléculas en una solución que es la misma que el tampón usado en la Reacción 1 respecto al pH, los estabilizadores enzimáticos (p. ej., albúmina de suero bovino, detergentes no iónicos, gelatina) y los agentes reductores (p. ej., ditiotreitol, 2–mercaptoetanol), pero reemplazando cualquier sal catiónica monovalente por KCl 20mM; el KCl 20mM es el óptimo demostrado para la escisión independiente del cebador. Los tampones para las enzimas, tales como la ADNpEc1, que habitualmente funcionan en ausencia de sal no son complementados para alcanzar esta concentración. Para el análisis de la escisión independiente de un cebador (Reacción 3), se combinan la misma cantidad de la molécula de análisis, pero sin cebador, en las mismas condiciones de tamponamiento usadas en la Reacción 2.

Las tres reacciones analíticas son entonces expuestas a suficiente enzima tal que la proporción molar de la enzima con respecto al complejo analítico sea de aproximadamente 1:1. Se incuban las reacciones a un intervalo de temperaturas de hasta, pero sin exceder, la temperatura permitida bien por la estabilidad enzimática o por la estabilidad del complejo, la que sea menor, hasta 80°C para enzimas procedentes de termófilos, durante un tiempo suficiente para permitir la escisión (10 a 60 minutos). Los productos de las reacciones 1, 2 y 3 se resuelven mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante, y se visualizan mediante autorradiografía o mediante un procedimiento comparable apropiado para el sistema de marcaje usado. Otros sistemas de marcaje incluyen detección quimioluminiscente, plata u otros tintes, transferencia y sondeo, y similares. La presencia de los productos de escisión se indica por la presencia de moléculas que emigran a un peso molecular inferior de lo que lo hace la estructura de análisis sin escindir. Estos productos de escisión indican que la polimerasa candidata tiene actividad nucleasa 5’ de estructura específica.

Para determinar si una ADN polimerasa modificada tiene sustancialmente la misma actividad nucleasa 5' que la de la ADN polimerasa nativa, se comparan los resultados de los análisis anteriormente descritos con los resultados obtenidos de estos análisis realizados con las ADN polimerasa nativas. “Sustancialmente la misma actividad nucleasa 5'” pretende significar que la polimerasa modificada y la polimerasa nativa ambas escindirán moléculas de análisis de la misma manera. No es necesario que la polimerasa modificada escinda a la misma velocidad que la ADN polimerasa nativa.

Algunas enzimas o preparaciones enzimáticas pueden tener otras actividades asociadas o contaminantes que pueden ser funcionales en condiciones de escisión descritas anteriormente y que pueden interferir en la detección de la nucleasa 5'. Las condiciones de reacción se pueden modificar en consideración a estas otras actividades para evitar la destrucción del sustrato, u a otra que enmascare la escisión de nucleasa 5' y sus productos. Por ejemplo, la ADN polimerasa 1 de E. coli (Pol 1), además de sus actividades polimerasa y nucleasa 5', tiene una exonucleasa 3’ que puede degradar ADN en un sentido de 3’ a 5’. Por consiguiente, cuando se expone la molécula de la Fig. 15E a esta polimerasa en las condiciones descritas anteriormente, la exonucleasa 3’ elimina rápidamente el brazo 3' desapareado, destruyendo la estructura bifurcada necesaria de un sustrato para la escisión de exonucleasa 5’, y no se detecta escisión. La verdadera capacidad de Pol I para escindir la estructura puede ser revelada si la exonucleasa 3' es inhibida por un cambio de condiciones (p. ej., pH), una mutación o mediante la adición de un competidor para la actividad. La adición de 500 pmoles de un oligonucleótido competidor monocatenario, no relacionado con la estructura de la Fig. 15E, a la reacción de escisión con Pol I inhibe eficazmente la digestión del brazo 3' de la estructura de la Fig. 15E sin interferir en la liberación de la exonucleasa 5’ del brazo 5’. La concentración del competidor no es fundamental, pero debería ser lo suficientemente elevada como para ocupar la exonucleasa 3' mientras dura la reacción.

Una destrucción similar de la molécula de análisis puede ser causada por contaminantes en la preparación de la polimerasa candidata. Se pueden realizar varios conjuntos de reacciones con nucleasas de estructura específica para determinar la pureza de la nucleasa candidata y encontrar la ventana de entre por debajo y por encima de la exposición de la molécula de análisis a la preparación de polimerasa que esté siendo investigada.

Las polimerasas modificadas descritas anteriormente fueron analizadas para la actividad nucleasa 5' como se explica a continuación: La Reacción 1 se realizó en un tampón de Tris–Cl 10mM; pH 8,5 a 20°C; MgCl 2 1,5mM y KCl 50mM, y en la Reacción 2, la concentración de KCl se redujo hasta 20mM. En las Reacciones 1 y 2, se combinaron 10 fmoles de la molécula sustrato de análisis mostrada en la Fig. 15E con 1 pmol del cebador indicado y de 0,5 a 1,0 1l de extracto que contenía la polimerasa modificada (preparada según lo descrito anteriormente). Entonces se incubó esta mezcla durante 10 minutos a 55°C. Para t odas las polimerasas mutantes analizadas, estas condiciones eran suficientes para proporcionar una escisión completa. Cuando se marcó la molécula mostrada en la Fig. 15E en el extremo 5', el fragmento 5’ liberado, de una longitud de 25 nucleótidos, fue resuelto convenientemente sobre gel de poliacrilamida al 20% (entrecruzado 19:1) con urea 7M en un tampón que contenía Tris–borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM. Los clones 3C–F y 4B presentaron una escisión de estructura específica comparable a la de la ADN polimerasa sin modificar. Además, los clones 3E, 3F y 3G tienen la capacidad añadida de escindir ADN en ausencia de un brazo 3' según lo tratado anteriormente. En la Fig. 16, se muestran reacciones de escisión representativas.

Para las reacciones mostradas en la Fig. 16, se examinaron los clones de polimerasa mutantes 3E (mutante Taq) y 4B (mutante Tfl) en cuanto a su capacidad para escindir la molécula sustrato de horquilla mostrada en la Fig. 15E. La molécula sustrato fue marcada en el terminal 5’ con 32P. Se mezclaron diez fmoles de ADN sustrato marcado terminalmente desnaturalizado térmicamente y 0,5 unidades de ADNPTaq (vía 1) o 0,5 1l de extracto de 3E o 4B (Fig. 16, vías 2–7, siendo el extracto preparado como se describe anteriormente) en un tampón que contenía Tris–Cl 10mM, pH 8,5; KCl 50mM y MgCl2 1,5mM. El volumen de reacción final fue de 10 1l. Las reacciones mostradas en los carriles 4 y 7 contienen además 50 1M de cada dNTP. Las reacciones mostradas en los carriles 3, 4, 6 y 7 contienen 0,2 1M del oligonucleótido cebador (complementario al extremo 3’ del sustrato y mostrado en la Fig. 15E). Las reacciones se incubaron a 55°C durante 4 minuto s. Se detuvieron las reacciones mediante la adición de 8 1l de formamida al 95% que contenía EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05% para un volumen de reacción de 10 1l. Entonces se aplicaron las muestras a geles de acrilamida desnaturalizantes al 12%. Tras la electroforesis, se autorradiografiaron los geles. La Fig. 16 muestra que los clones 3E y 4B presentan una actividad de escisión similar a la de la ADNPTaq nativa. Obsérvese que alguna escisión tiene lugar en estas reacciones en ausencia del cebador. Cuando se usa una estructura de horquilla larga, tal como la usada aquí (Fig. 15E) en las reacciones de escisión realizadas en tampones que contienen KCl 50mM, se observa un nivel bajo de escisión independiente del cebador. Las concentraciones más elevadas de KCl suprimen, pero no eliminan, esta escisión independiente del cebador en estas condiciones.

2. Análisis para la actividad sintética

La capacidad de la enzima modificada o los fragmentos proteolíticos se analiza añadiendo la enzima modificada a un sistema analítico en el que un cebador se aparea con un molde, siendo la síntesis de ADN catalizada por la enzima añadida. Muchas técnicas de laboratorio estándar emplean tal análisis. Por ejemplo, la traducción de mellas y la secuenciación enzimática implican la prolongación de un cebador a lo largo de un molde de ADN por una molécula de polimerasa.

En un análisis preferido para determinar la actividad sintética de una enzima modificada, se aparea un cebador de oligonucleótido con un molde de ADN monocatenario, p. ej., ADN de bacteriófago M13, y se incuba el dúplex de cebador/molde en presencia de la polimerasa modificada en cuestión, disoxinucleósidos trifosfato (dNTP) y el tampón y las sales conocidos por su idoneidad para la enzima sin modificar o nativa. La detección de bien la prolongación del cebador (mediante electroforesis sobre gel desnaturalizante) o la incorporación de dNTP (mediante precipitación con ácidos o cromatografía) es indicio de una polimerasa activa. Preferiblemente, se incluye un marcador, bien isotópico o no isotópico, bien sobre el cebador o como un dNTP para facilitar la detección de los productos de la polimerización. La actividad sintética se cuantifica como la cantidad de nucleótido libre incorporado a la cadena de ADN en crecimiento y se expresa como la cantidad incorporada por unidad de tiempo en condiciones de reacción específicas.

En la Fig. 17, se muestran resultados representativos de un análisis para la actividad sintética. Se analizó la actividad sintética de los clones 3B–F de ADNPTaq mutantes como se describe a continuación: Se elaboró una mezcla maestra del siguiente tampón: 1,2 x tampón de la PCR (1 x tampón de la PCR contiene KCl 50mM; MgCl2 1,5mM; Tris–Cl 10mM; pH 8,5, y Tween 20 y Nonidet P40 cada uno al 0,05%), dGTP, dATP y dTTP cada uno 50 1M; dCTP 51M y a–32P–dCTP 0,1251M a 600 Ci/mmol. Antes de ajustar esta mezcla hasta su volumen final, se dividió en dos alícuotas iguales. Una recibió agua destilada hasta un volumen de 50 1l para proporcionar las concentraciones anteriores. La otra recibió 5 1g de ADN de M13mp18 monocatenario (concentración final de aproximadamente 2,5 pmoles o 0,051M) y 250 pmoles de cebador de secuenciación M13 (concentración final de 51M) y agua destilada hasta un volumen final de 50 1l. Cada mezcla se calentó hasta 75°C durante 5 minu tos y luego se enfrió hasta la temperatura ambiente. Esto permitió que los cebadores se aparearan con el ADN en las mezclas que contenían ADN.

Para cada análisis, se combinaron 4 1l de mezcla con el ADN con 1 1l de la polimerasa mutante, preparada según lo descrito, o 1 unidad de ADNPTaq (Perkin Elmer) en 1 1l de H2Od. Se hizo un control “sin ADN” en presencia de la ADNPTaq (Fig. 17, vía 1) y un control “sin enzima” usando agua en lugar de la enzima (vía 2). Se mezcló cada reacción, luego se incubó a temperatura ambiente (aprox. 22°C) durante minutos, luego a 55°C durante 2 minutos, luego a 72°C durante 2 minutos. Esta incubación por etapas se realizó para detectar la polimerización en cualquier mutante que pudiera tener temperaturas óptimas inferiores a 72°C. Tras la incubación final, se centrif ugaron los tubos brevemente para recoger cualquier condensación y se colocaron sobe hielo. Se salpicó un 1l de cada reacción en un origen a 1,5 cm del borde inferior de una placa de cromatografía de capa fina de celulosa de polietilenimina (PEI) y se dejó secar. Se ejecutó la placa de cromatografía en NaH2PO4 0,75M, pH 3,5, hasta que el frente del tampón se hubo desplazado aproximadamente 9 cm del origen. Se secó la placa, se envolvió en papel de plástico, se marcó con tinta luminiscente y se expuso a una película de rayos X. La incorporación se detectó como los recuentos que se quedaron pegados donde se salpicaron al principio, mientras que los nucleótidos no incorporados fueron transportados por la solución salina desde el origen.

La comparación de las ubicaciones de los recuentos con las dos vías de control confirmó la falta de actividad de polimerización en las preparaciones de mutantes. Entre los clones de ADNPTaq modificados, sólo el clon 3B conserva cualquier actividad sintética residual según lo mostrado en la Fig. 17.

Ejemplo 3

Las nucleasas 5' derivadas de ADN polimerasas termoestables pueden escindir estructuras de horquilla cortas con especificidad

Se examinó la capacidad de las nucleasas 5' para escindir estructuras de horquilla con el fin de generar una estructura de horquilla escindida adecuada como molécula de detección. En la Fig. 18A (SEC ID N.º 15), se muestra la estructura y la secuencia de la molécula analítica de horquilla. El oligonucleótido (“cebador” marcado en la Fig. 18A, SEC ID N.º 22) se muestra apareado a su secuencia complementaria sobre el brazo 3’ de la molécula analítica de horquilla. La molécula analítica de horquilla fue marcada en un extremo con 32P usando un cebador del promotor de T7 marcado en una reacción en cadena de la polimerasa. El marcador se presenta en el brazo 5’ de la molécula analítica de horquilla y se representa con la estrella en la Fig. 18A.

La reacción de escisión se realizó añadiendo 10 fmoles de molécula analítica de horquilla marcada terminalmente desnaturalizada térmicamente, 0,2 1M del oligonucleótido cebador (complementario al brazo 3' de la horquilla); 50 1M de cada dNTP y 0,5 unidades de ADNPTaq (Perkin Elmer) o 0,5 1l de extracto que contenía una nucleasa 5' (preparada según lo descrito anteriormente) en un volumen total de 10 1l en un tampón que contenía Tris–Cl 10mM, pH 8,5; KCl 50mM y MgCl2 1,5mM. Las reacciones mostradas en los carriles 3, 5 y 7 se ejecutaron en ausencia de dNTP.

Las reacciones se incubaron a 55°C durante 4 minuto s. Se detuvieron las reacciones a 55ºC mediante la adición de 8 µl de formamida al 95% con EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05% para un volumen de reacción de 10 µl. Las muestras no se calentaron antes de cargarlas sobre los geles de poliacrilamida desnaturalizante (poliacrilamida al 10%; entrecruzamiento de 19:1, urea 7M; Tris–borato 89mM; pH 8,3; EDTA 2,8mM). Las muestras no se calentaron para permitir la resolución de las moléculas de horquilla sin escindir reduplicadas y monocatenarias.

La Fig. 18B muestra que las polimerasas modificadas que carecen de cualquier actividad sintética detectable escinden una estructura de horquilla cuando se aparea un oligonucleótido al brazo 3' monocatenario de la horquilla para producir una sola especie de producto escindido (Fig. 18B, vías 3 y 4). Las nucleasas 5', tales como el clon 3D, mostrado en los carriles 3 y 4, generan un solo producto escindido incluso en presencia de dNTP. Las nucleasas 5' que conservan una cantidad residual de actividad sintética (menos del 1% de actividad de tipo natural) generan múltiples productos de escisión cuando la polimerasa puede prolongar el oligonucleótido apareado al brazo 3' de la horquilla, moviendo así el sitio de escisión (clon 3B, vías 5 y 6). La ADNpTaq nativa produce incluso más especies de productos de escisión que las polimerasas mutantes que conservan actividad sintética residual, y además convierte la estructura de horquilla en una forma bicatenaria en presencia de dNTP debido al alto nivel de actividad sintética que hay en la polimerasa nativa (Fig. 18B, vía 8).

Ejemplo 4

Escisión de sustratos de ácido nucleico lineal

A partir de lo anterior, debería estar claro que las ADN polimerasas termoestables nativas (i.e., “de tipo natural”) son capaces de escindir estructuras de horquilla de una manera específica y que este descubrimiento se puede aplicar con éxito a un análisis de detección. En este ejemplo, las ADNp mutantes de la presente invención se analizan frente a tres estructuras de escisión diferentes mostradas en la Fig. 20A. La estructura 1 de la Fig. 20A es simplemente un 206–mero monocatenario (cuya preparación e información secuencial fue descrita en el ejemplo 1C). Las estructuras 2 y 3 son dúplex: la estructura 2 es la misma estructura de horquilla que se muestra en la Fig. 11A (parte inferior), mientras que la estructura 3 tiene una parte de horquilla de la estructura 2 eliminada.

Las reacciones de escisión comprendieron 0,01 pmoles del ADN sustrato resultante y 1 pmol del oligonucleótido piloto en un volumen total de 10 1l de Tris–Cl 10mM; pH 8,3; KCl 100mM; MgCl2 1mM. Se incubaron las reacciones durante 30 minutos a 55ºC y se detuvieron mediante la adición de 8 µl de formamida al 95% con EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05%. Se calentaron las muestras hasta 75°C durante 2 minutos inmediatamente antes de la electroforesis a través de gel de poliacrilamida al 10% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris–Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM.

Los resultados se visualizaron mediante autorradiografía y se muestran en la Fig. 20B con las enzimas indicadas de la siguiente manera: I es ADNpTaq nativa; II es ADNpTfl nativa; III es BX Cleavase® mostrada en la Fig. 3E; IV es BB Cleavase® mostrada en la Fig. 3F; V es la mutante mostrada en la Fig. 4B; y VI es BN Cleavase® mostrada en la Fig. 3G.

Se usó la estructura 2 para “normalizar” la comparación. Por ejemplo, se descubrió que se necesitaron 50 ng de la ADNpTaq y 300 ng de la BN Cleavase® para proporcionar cantidades similares de escisión de la estructura 2 en treinta (30) minutos. En estas condiciones la ADNpTaq nativa es incapaz de escindir la estructura 3 hasta un grado significativo. La ADNpTfl nativa escinde la estructura 3 de una manera que crea múltiples productos.

Por el contrario, todas las mutantes analizadas escinden el dúplex lineal de la estructura 3. Este descubrimiento indica que esta característica de las ADN polimerasas mutantes es constante en las polimerasas termoestables de las especies termófilas.

Ejemplo 5

Escisión exonucleolítica 5’ (“mordisqueado”) realizada por ADNp termoestables

Se ha descubierto que las ADNp termoestables, incluyendo aquéllas de la presente invención, tiene una verdadera exonucleasa 5’ capaz de mordisquear el extremo 5' de una estructura de ácido nucleico dúplex lineal. En este ejemplo, se vuelve a emplear el sustrato dúplex de ADN de 206 pares de bases (véase el ejemplo 1C). En este caso, se produjo mediante el uso de un cebador marcado con 32P y un cebador sin marcar en una reacción en cadena de la polimerasa. Las reacciones de escisión comprendieron 0,01 pmoles de ADN sustrato marcado terminalmente desnaturalizado térmicamente (con la cadena sin marcar también presente), 5 pmoles de oligonucleótido piloto (véanse los oligos piloto de la Fig 11A) y 0,5 unidades de ADNPTaq o 0,5 1l de BB Cleavase® en el extracto de E. coli (véase lo anterior), en un volumen total de 10 1l de Tris–Cl 10mM; pH 8,5; KCl 50mM; MgCI2 1,5mM.

Las reacciones se iniciaron a 65°C mediante la adic ión de enzima precalentada, luego se pasaron a la temperatura de incubación final durante 30 minutos. En la Fig. 21A, se muestran los resultados. Las muestras de los carriles 1–4 son los resultados obtenidos con la ADNpTaq nativa, mientras que los carriles 5–8 muestran los resultados obtenidos con la BB Cleavase®. Las reacciones para los carriles 1, 2, 5 y 6 se realizaron a 65°C y las r eacciones para los carriles 3, 4, 7 y 8 se realizaron a 50°C, y todas se detuvieron a temperatura mediante la adición de 8 1l de formamida al 95% con EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05%. Se calentaron las muestras hasta 75°C durante 2 minutos inmediatamente antes de la electroforesis a través de gel de acrilamida al 10% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris–Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM. El producto esperado en las reacciones 1, 2, 5 y 6 es de una longitud de 85 nucleótidos; en las reacciones 3 y 7, el producto esperado es de una longitud de 27 nucleótidos. Las reacciones 4 y 8 se realizaron sin piloto y deberían permanecer a 206 nucleótidos. La banda tenue observada a 24 nucleótidos es cebador marcado terminalmente residual procedente de la PCR.

El sorprendente resultado es que la BB Cleavase® en estas condiciones hace que aparezca todo el marcador en especies muy pequeñas, lo que sugiere la posibilidad de que la enzima hidrolice completamente el sustrato. Para determinar la composición de la banda que emigra más rápidamente observada en los carriles 5–8 (reacciones llevadas a cabo con el mutante de eliminación), se trataron muestras del dúplex de 206 pares de bases bien con exonucleasa del gen 6 de T7 (USB) o con fosfatasa alcalina de intestino bovino (Promega), según las instrucciones de los fabricantes, para producir bien mononucleótido marcado (vía a de la Fig. 21B) o fosfato inorgánico marcado con 32P (vía b de la Fig. 21B), respectivamente. Estos productos, junto con los productos observados en el carril 7 del panel A se resolvieron mediante una breve electroforesis a través de gel de acrilamida al 20% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris•Borato 45mM; pH 8,3; EDTA 1,4mM. La BB Cleavase® es por tanto capaz de convertir el sustrato en mononucleótidos.

Ejemplo 6

El mordisqueado depende de un dúplex

El mordisqueado de BB Cleavase® depende de un dúplex. En este ejemplo, se produjeron cadenas simples marcadas internamente del 206–mero mediante 15 ciclos de prolongación de un cebador incorporando dCTP marcado con a–32P combinado con los cuatro dNTP sin marcar, usando un fragmento sin marcar de 206 pb como molde. Se resolvieron productos mono y bicatenarios mediante electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 6% no desnaturalizante (entrecruzamiento de 29:1) en un tampón de Tris•Borato 45mM; pH 8,3; EDTA 1,4mM; se visualizaron mediante autorradiografía, se separaron del gel, se eluyeron mediante difusión pasiva y se concentraron mediante precipitación con etanol.

Las reacciones de escisión comprendían 0,04 pmoles de ADN sustrato y 2 1l de BB Cleavase® (en un extracto de E. coli según lo descrito anteriormente) en un volumen total de 40 1l de Tris•Cl 10mM; pH 8,5; KCl 50mM; MgCl2 1,5mM. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de enzima precalentada: se extrajeron alícuotas de 10 1l a los 5, 10, 20 y 30 minutos, y se transfirieron a tubos preparados que contenían 8 1l de formamida al 95% con EDTA 30mM y colorantes marcadores al 0,05%. Se calentaron las muestras hasta 75°C durante 2 minutos inmediat amente antes de la electroforesis a través de gel de acrilamida al 10% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris•Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM. Los resultados fueron visualizados por autorradiografía según lo mostrado en la Fig. 22. Claramente, la escisión realizada por BB Cleavase® depende de una estructura de dúplex; no se detecta escisión de la estructura monocatenaria mientras que la escisión del dúplex 206–mérico es completa.

Ejemplo 7

El mordisqueado puede ser dirigido a una diana

La actividad de mordisqueado de las ADNp de la presente invención se puede emplear con éxito en un análisis de detección. En la Fig. 23, se muestra una realización de tal análisis. En este análisis, se emplea un oligo marcado que es específico de una secuencia diana. El oligo está en exceso de la diana, por lo que la hibridación es rápida. En esta realización, el oligo contiene dos marcadores de fluoresceína cuya proximidad sobre el oligo provoca la detención de su emisión. Cuando se permite a la ADNp mordisquear el oligo, los marcadores se separan y son detectables. El dúplex acortado es desestabilizado y se disocia. Lo importante es que la diana ahora es libre de reaccionar con un oligo marcado intacto. La reacción puede continuar hasta alcanzar el nivel de detección deseado. Se ha descrito un tipo análogo, aunque diferente, de análisis en ciclos empleando la exonucleasa Lambda. Véase C. G, Copley y C. Boot, BioTechniques 13:888 (1992).

El éxito de tal análisis depende de la especificidad. En otras palabras, el oligo debe hibridarse a la diana específica. También se prefiere que el análisis sea sensible; lo ideal es que el oligo sea capaz de detectar pequeñas cantidades de diana. La Fig. 24A muestra un cebador marcado con 32P en el extremo 5’ unido a una secuencia diana de plásmido. En este caso, el plásmido fue pUC19 (comercialmente disponible) que fue desnaturalizado térmicamente hirviéndolo dos (2) minutos y luego enfriándolo rápidamente. El cebador es un 21–mero (SEC ID Nº 28). La enzima empleada fue BX Cleavase® (una dilución equivalente a 5 x 10-3 1l de extracto) en KCl 100mM, Tris–Cl 10mM; pH 8,3; MnCl2 2mM. La reacción se llevó a cabo a 55°C durante di eciséis (16) horas con o sin ADN de fondo genómico (procedente de sangre de pollo). La reacción se detuvo mediante la adición de 8 1l de formamida al 95% con EDTA 20mM y colorantes marcadores.

Los productos de la reacción fueron resueltos mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida (poliacrilamida al 10%; entrecruzamiento de 19:1; 1 x TBE) como se observa en la Fig. 24B. El carril “M” contiene el 21–mero marcado.

Los carriles 1–3 no contienen diana específica, aunque los carriles 2 y 3 contienen 100 ng y 200 ng de ADN genómico, respectivamente. Todas los carriles 4, 5 y 6 contienen diana específica, bien con 0 ng, 100 ng o 200 ng de ADN genómico, respectivamente. Es evidente que la conversión en mononucleótidos tiene lugar en los carriles 4, 5 y 6 independientemente de la presencia o de la cantidad de ADN de fondo. De este modo, el mordisqueado puede ser específico de y dirigido a una diana.

Ejemplo 8

Purificación de la escisión

Como se observa anteriormente, las proteínas termoestables expresadas, i.e., las nucleasas 5', se aislaron mediante extractos celulares bacterianos crudos. Entonces, se eliminaron mediante centrifugación las proteínas de E. coli precipitadas, junto con otros residuos celulares. En este ejemplo, se cultivaron y se recogieron (500 gramos) las células que expresaban el clon BN. Para cada gramo (peso húmedo) de E. coli, se añadieron 3 ml de tampón de lisis (Tris–HCl 50mM; pH 8,0; EDTA 1mM; NaCl 1001M). Se sometieron las células a lisis con 200 1g/ml de lisozima a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después, se añadió ácido desoxicólico hasta llegar a una concentración final del 0,2% y se incubó la mezcla 15 minutos a temperatura ambiente.

Se sometió el lisado a un tratamiento de ultrasonidos durante aproximadamente 6–8 minutos a 0°C. Se reti ró el precipitado mediante centrifugación (39.000 g durante 20 minutos). Se añadió polietilenimina (0,5%) al sobrenadante y se incubó la mezcla sobre hielo durante 15 minutos.

Se centrifugó la mezcla (5.000 g durante 15 minutos) y se conservó el sobrenadante. Se calentó ésta durante 30 minutos a 60°C y luego se centrifugó de nuevo (5.00 0 g durante 15 minutos) y se volvió a conservar el sobrenadante.

Se hizo precipitar el sobrenadante con sulfato de amonio al 35% a 4°C durante 15 minutos. Se centrifugó entonces la mezcla (5.000 g durante 15 minutos) y se retiró el sobrenadante. Entonces se disolvió el precipitado en KCl 0,25M; Tris 20; pH 7,6; Tween al 0,2% y EDTA 0,1) y luego se sometió a diálisis frente a tampón de unión (8 x tampón de unión comprende: imidazol 40mM; NaCI 4M; Tris–HCl 160mM; pH 7,9).

Entonces se purifica la proteína disuelta sobre la columna de Ni--(Novagen). Se permite el drenaje del tampón de unión hasta la parte superior del lecho de la columna y se carga la columna con el extracto preparado. Un caudal de aproximadamente 10 volúmenes de columna a la hora es óptimo para la purificación eficiente. Si el caudal es demasiado rápido, habrá más impurezas que contaminen la fracción eluída.

Se lava la columna con 25 ml (10 volúmenes) de 1 x tampón de unión y luego se lava con 15 ml (6 volúmenes) de 1 x tampón de lavado (8 x tampón de lavado que comprende: imidazol 480mM; NaCI 4M; Tris–HCl 160mM; pH 7,9). La proteína unida fue eluída con 15 ml (6 volúmenes) de 1 x tampón de elución (4 x tampón de elución comprende: imidazol 4mM; NaCI 2M; Tris–HCl 80mM; pH 7,9). Entonces se vuelve a precipitar la proteína con sulfato de amonio al 35% según lo anterior. Luego se disuelve el precipitado y se somete a diálisis frente a: Tris 20mM; KCl 100mM; EDTA 1mM). Se llevó la solución hasta el 0,1% de Tween 20 y NP–40, y se almacenó a 4°C.

Ejemplo 9

El uso de diversos cationes divalentes en la reacción de escisión influye en la naturaleza de los productos de escisión resultantes

Al comparar las nucleasas 5' generadas mediante la modificación y/o la eliminación del dominio de polimerización C–teminal de la ADN polimerasa de Thermus aquaticus (ADNPTaq), como se representa en el diagrama de las Fig. 3B–G, se observaron diferencias significativas en la fuerza de las interacciones de estas proteínas con el extremo 3' de los cebadores localizados secuencia arriba del sitio de escisión (según lo representado en la Fig. 5). Al describir la escisión de estas estructuras por ADN polimerasas de tipo Pol 1 [ejemplo 1 y Lyamichev et al., (1993) Science 260:778], se observó que en ausencia de un cebador, la ubicación de la unión entre la región bicatenaria y los brazos 5’ y 3’ monocatenarios determinó el sitio de escisión, pero que en presencia de un cebador, la ubicación del extremo 3' del cebador se convirtió en el factor determinante para el sitio de escisión. Se postuló que esta afinidad por el extremo 3' estaba de acuerdo con la función sintetizadora de la ADN polimerasa.

La estructura 2, mostrada en la Fig. 20A, se usó para analizar los efectos de un extremo 3' proximal al sitio de escisión en reacciones de escisión que comprendían varias soluciones diferentes [p. ej., soluciones que contenían diferentes sales (KCl o NaCI), diferentes cationes divalentes (Mn2– o Mg2+), etc.], así como el uso de diferentes temperaturas para la reacción de escisión. Cuando las condiciones de reacción fueron tales que la unión de la enzima (p. ej., una ADNp que comprendía una nucleasa 5', una ADNp modificada o una nucleasa 5') con el extremo 3’ (del oligonucleótido piloto) cerca del sitio de escisión fue fuerte, la estructura mostrada fue escindida en el sitio indicado en la Fig. 20A. Esta escisión libera el brazo 5’ desapareado y deja una mella entre la parte restante del ácido nucleico diana y el extremo 3' plegado del oligonucleótido piloto. Por el contrario, cuando las condiciones de reacción fueron tales que la unión de la ADNp (que comprendía una nucleasa 5') con el extremo 3' fue débil, la escisión inicial fue según lo descrito anteriormente, pero tras la liberación del brazo 5’, el dúplex restante fue digerido por la función exonucleasa de la ADNp.

Un modo de debilitar la unión de la ADNp con el extremo 3' consiste en eliminar todo o parte del dominio al que le ha sido atribuida al menos parte de esta función. Algunas de las nucleasas 5' creadas mediante la eliminación del dominio de polimerización de la ADNPTaq tienen una mayor función exonucleasa verdadera, según lo demostrado en el ejemplo 5.

La afinidad de estos tipos de enzimas (i.e., las nucleasas 5' asociadas con o derivadas de las ADNp) por extremos 3’ empotrados también puede verse afectada por la identidad del catión divalente presente en la reacción de escisión. Longley et al., [Nucl. Acids Res. 18:7317 (1990)] demostraron que el uso de MnCl2 en una reacción con ADNPTaq permitió que la polimerasa eliminara nucleótidos desde el extremo 5' de un cebador apareado a un molde, aunque ineficazmente. De manera similar, mediante el examen de los productos de escisión generados usando la estructura 2 de la Fig. 20A, según lo descrito anteriormente, en una reacción que contenía bien ADNPTaq o la nucleasa BB Cleavase®, se observó que la sustitución de MnCl2 por MgCl2 en la reacción de escisión dio como resultado el “mordisqueado” exonucleolítico del dúplex secuencia abajo del sitio de escisión inicial. Aunque sin limitar la invención a un mecanismo en concreto, se cree que la sustitución de MnCl2 por MgCl2 en la reacción de escisión disminuye la afinidad de estas enzimas por los extremos 3’ empotrados.

En todos los casos, el uso de MnCl2 aumenta la función nucleasa 5', y en el caso de la nucleasa BB Cleavase®, se observa una estimulación de 50 a 100 veces mayor de la función nucleasa 5'. De este modo, aunque la actividad exonucleasa de estas enzimas se demostró anteriormente en presencia de MgCl2, los análisis que se describen a continuación muestran una cantidad comparable de actividad exonucleasa usando de 50 a 100 veces menos enzima cuando se usa MnCl2 en lugar de MgCl2. Cuando se usan estas cantidades reducidas de enzima en una mezcla de reacción que contiene MgCl2, el mordisqueado o la actividad exonucleasa es mucho menos evidente que la observada en los ejemplos 5–7.

En la realización del análisis de detección de ácidos nucleicos descrito en los ejemplos 10–39 siguientes, se observan efectos similares cuando se comparan las reacciones llevadas a cabo en presencia de bien MgCl2 o MnCl2. En presencia de cualquier catión divalente, la presencia del oligonucleótido invasor (descrito más adelante) fuerza al sitio de escisión a introducirse en el dúplex sonda, pero en presencia de MnCl2, es posible mordisquear más el dúplex sonda produciendo una escalera de productos que son visibles cuando hay un marcador del extremo 3' presente sobre el oligonucleótido sonda. Cuando se omite el oligonucleótido invasor desde una reacción que contiene Mn2+, la sonda es mordisqueada desde el extremo 5'. Las reacciones basadas en Mg2+ presentan un mordisqueado mínimo del oligonucleótido sonda. En cualquiera de estos casos, la digestión de la sonda depende de la presencia del ácido nucleico diana. En los ejemplos siguientes, se usa la escalera producida mediante la actividad de mordisqueado aumentada observada en presencia de Mn2+ como un indicador positivo de que el oligonucleótido sonda se ha hibridado con la secuencia diana.

Ejemplo 10

Escisión endonucleolítica 5’ invasiva mediante nucleasas 5' termoestables en ausencia de polimerización

Según lo descrito en los ejemplos anteriores, las nucleasas 5' escinden cerca de la unión entre la región monocatenaria y la región con apareamiento de bases de un dúplex bifurcado, habitualmente aproximadamente un par de bases dentro de la región con apareamiento de bases. En este ejemplo, se muestra que las nucleasas 5' termoestables, incluyendo aquéllas de la presente invención (p. ej., nucleasa BN Cleavase®, nucleasa A/G Cleavase®) tienen la capacidad de escindir una mayor distancia dentro de la región con apareamiento de bases cuando se proporcionan con un oligonucleótido secuencia arriba que porta una región 3’ que es homóloga a la región 5’ del dúplex en cuestión, según lo mostrado en la Fig. 26.

La Fig. 26 muestra un oligonucleótido sintético que fue diseñado para plegarse sobre sí mismo, que está constituido por la siguiente secuencia: 5'–GTTCTCTGCTCTCTGGTCGCTG TCTCGCTTGTGAAACAAGCGAGACAGCGTGGTCTCTCG–3' (SEC ID N.º 29). Este oligonucleótido se denomina “horquilla S–60”. La horquilla de 15 pares de bases formada por este oligonucleótido se hace más estable mediante una secuencia de “tri–bucle” en el extremo del bucle (i.e., tres nucleótidos forman la parte del bucle de la horquilla) [Hiraro, I. et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22(4):576]. La Fig. 26 también muestra la secuencia del oligonucleótido P–15 y la ubicación de la región de complementariedad compartida por los oligonucleótidos de horquilla P–15 y S–

60. La secuencia del oligonucleótido P–15 es 5'–CGAGAGACCACGCTG–3’ (SEC ID N.º 30). Como se describe detalladamente más adelante, las puntas de flecha negras mostradas en la Fig. 26 indican los sitios de la escisión de la horquilla S–60 en ausencia de oligonucleótido P–15, y las puntas de flecha sin colorear indican los sitios de escisión en presencia del oligonucleótido P–15. El tamaño de la punta de flecha indica la utilización relativa de un sitio en concreto.

La molécula de horquilla S–60 fue marcada en su extremo 5' con biotina para una detección posterior. Se incubó la horquilla S–60 en presencia de una nucleasa 5' termoestable en presencia o en ausencia del oligonucleótido P–15. La presencia del dúplex completo que se puede formar mediante la horquilla S–60 se demuestra mediante la escisión con la nucleasa 5' BN Cleavase®, de una manera independiente del cebador (i.e., en ausencia del oligonucleótido P–15). La liberación de los fragmentos de 18 y 19 nucleótidos del extremo 5' de la molécula de horquilla S–60 demostró que la escisión tuvo lugar cerca de la unión entre las regiones monocatenaria y bicatenaria cuando no hay nada hibridado al brazo 3' de la horquilla S–60 (Fig. 27, vía 2).

Las reacciones mostradas en la Fig. 27 se realizaron como se explica a continuación: Se combinaron veinte fmoles de ADN de horquilla marcada con biotina en 5’ (SEC ID N.º 29) con 0,1 ng de enzima BN Cleavase® y 1 1l de MOPS 100mM (pH 7,5) que contenía Tween–20 y NP–40 cada uno al 0,5% en un volumen total de 9 1l. En la reacción mostrada en el carril 1, se omitió la enzima y se completó el volumen mediante la adición de agua destilada (ésta sirvió como control sin cortar o sin enzima). La reacción mostrada en el carril 3 de la Fig. 27 también incluía 0,5 pmoles del oligonucleótido P15 (SEC ID N.º 30), que se puede hibridar con el brazo 3' desapareado de la horquilla S–60 (SEC ID N.º 29) según se representa en el diagrama de la Fig. 26.

Se recubrieron las reacciones con una gota de aceite mineral, se calentaron hasta 95°C durante 15 segun dos, luego se enfriaron hasta 37°C y se inició la reacción med iante la adición de 1 1l de MnCl2 10mM a cada tubo. Tras 5 minutos, se detuvieron las reacciones mediante la adición de 6 µl de formamida al 95% que contenía EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05%. Se calentaron las muestras hasta 75°C durante 2 minutos inmediatamente antes de la electroforesis a través de gel de acrilamida al 15% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris–Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM.

Tras la electroforesis, se separaron las placas de gel dejando el gel en reposo sobre una placa. Se extendió sobre el gel expuesto una membrana de nylon cargada positivamente de 0,2 mm de poro (NYRAN, Schleicher y Schuell, Keene, NH), previamente humedecida en H2O. Se eliminaron todas las burbujas de aire. Entonces se colocaron dos piezas de papel de filtro 3MM (Whatman) sobre la membrana, se reemplazó la otra placa de vidrio y se sujetó la estructura en sándwich con clips. Se dejó que continuara la transferencia durante una noche. Tras la transferencia, se retiró cuidadosamente la membrana del gel y se dejó secar al aire. Una vez completado el secado, se lavó la membrana en 1,2 x tampón de bloqueo de Sequenase Images (United States Biochemical) usando 0,3 ml de tampón/cm2 de membrana. El lavado se realizó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadió un conjugado de estreptavidina–fosfatasa alcalina (SAAP, United States Biochemical) a una dilución de 1:4000 directamente a la solución de bloqueo y se agitó durante 15 minutos. Se aclaró la membrana brevemente con H2O y luego se lavó tres veces durante 5 minutos por cada lavado usando 0,5 ml/cm2 de 1 x tampón SAAP (Tris–HCl 100mM; pH 10; NaCI 50mM) con dodecil sulfato de sodio al 0,1% (SDS). Se aclaró brevemente la membrana con H2O entre cada lavado. Entonces se lavó una vez la membrana en 1 x tampón SAAP que contenía MgCl2 1mM sin SDS, se drenó a fondo y se colocó en una bolsa termo–sellable de plástico. Usando una pipeta estéril, se añadieron 5 ml de sustrato quimioluminiscente CDP–Star™ (Tropix, Bedford, MA) para la fosfatasa alcalina a la bolsa y se distribuyó por toda la membrana durante 2–3 minutos. Se expuso la membrana tratada con CDP–Star™ a una película de rayos X XRP (Kodak) durante una exposición inicial de 10 minutos.

En la Fig. 27, se muestra la autorradiografía resultante. En la Fig. 27, el carril marcada con “M” contiene el oligonucleótido P–15 biotinilado que sirvió como marcador. Se indican los tamaños (en nucleótidos) de la horquilla S–60 sin escindir (60 nuc; vía 1), del marcador (15 nuc; vía “M”) y los productos de escisión generados mediante la escisión de la horquilla S–60 en presencia (vía 3) o en ausencia (vía 2) del oligonucleótido P–15.

Como las regiones complementarias de la horquilla S–60 están localizadas sobre la misma molécula, no se requeriría esencialmente ningún tiempo muerto para permitir la hibridación (i.e., para formar la región dúplex de la horquilla). Se esperaría que esta estructura de horquilla se formara mucho antes de que la enzima pudiera localizar y escindir la molécula. Según lo esperado, la escisión en ausencia de oligonucleótido cebador fue en o cerca de la unión entre la región dúplex y la monocatenaria, liberando el brazo 5’ desapareado (Fig. 27; vía 2). Los productos de escisión resultantes tenían una longitud de 18 y 19 nucleótidos.

Se esperaba que la estabilidad de la horquilla S–60 con el tri–bucle evitara que el oligonucleótido P–15 promoviera la escisión de la manera “dirigida por un cebador” descrita en el ejemplo 1 anterior, porque el extremo 3' del “cebador” permanecería desapareado. Sorprendentemente, se descubrió que la enzima parecía mediar una “invasión” mediante el cebador P–15 en la región dúplex de la horquilla S–60, según lo probado por el desplazamiento del sitio de escisión 3 a 4 pares de bases más dentro de la región dúplex, liberando los productos más largos (22 y 21 nuc.) observados en el carril 3 de la Fig. 27.

Los sitios exactos de escisión de la horquilla S–60 se representan sobre la estructura de la Fig. 26, indicando las puntas de flecha negras los sitios de escisión en ausencia del oligonucleótido P–15 e indicando las puntas de flecha sin colorear los sitios de escisión en presencia de P–15.

Estos datos muestran que la presencia sobre el brazo 3' de un oligonucleótido que tiene cierta homología secuencial con las primeras bases varias de la cadena orientada similarmente del dúplex secuencia abajo puede ser un factor dominante en la determinación del sitio de escisión por nucleasas 5'. Como el oligonucleótido que comparte cierta homología secuencial con las primeras bases varias de la cadena similarmente orientada del dúplex secuencia abajo parece invadir la región dúplex de la horquilla, es denominado oligonucleótido “invasor”. Como se muestra en los siguientes ejemplos, un oligonucleótido invasor parece invadir (o reemplazar) una región de ácido nucleico duplicado independientemente de si la región dúplex está presente sobre la misma molécula (i.e., una horquilla) o de si el dúplex está formado entre dos cadenas de ácido nucleico separadas.

Ejemplo 11

El oligonucleótido invasor desplaza el sitio de escisión en un dúplex de sonda/diana preformado

En el ejemplo 10, se demostró que un oligonucleótido invasor podía desplazar el sitio en el que una nucleasa 5' escinde una región dúplex presente sobre una molécula de horquilla. En este ejemplo, se examinó la capacidad de un oligonucleótido invasor de desplazar el sitio de escisión dentro de una región dúplex formada entre dos cadenas separadas de moléculas de ácido nucleico.

Se mezclaron un ADN diana monocatenario que comprendía la molécula M13mp19 circular monocatenaria y un oligonucleótido sonda marcado (fluoresceína) en presencia del tampón de reacción que contenía sal (KCl) y cationes divalentes (Mg2– o Mn2+) para promover la formación de un dúplex. El oligonucleótido sonda se refiere a un oligonucleótido marcado que es complementario a una región a lo largo de la molécula diana (p. ej., M13mp19). Se añadió un segundo oligonucleótido (sin marcar) a la reacción tras permitir el apareamiento de la sonda y la diana. El segundo oligonucleótido se une a una región de la diana que se localiza secuencia abajo de la región a la que se une el oligonucleótido sonda. Este segundo oligonucleótido contiene secuencias que son complementarias a una segunda región de la molécula diana. Si el segundo oligonucleótido contiene una región que es complementaria a una parte de las secuencias a lo largo de la diana a la que también se une el oligonucleótido sonda, este segundo oligonucleótido es denominado oligonucleótido invasor (véase la Fig. 28c).

La Fig. 32 representa el apareamiento de dos oligonucleótidos a regiones situadas a lo largo de la molécula diana M13mp19 (cadena inferior en las tres estructuras mostradas). En la Fig. 28, sólo se muestra una parte de 52 nucleótidos de la molécula M13mp19; esta secuencia de 52 nucleótidos figura en la SEC ID N.º 31. El oligonucleótido sonda contiene un marcador de fluoresceína en el extremo 3'; la secuencia de la sonda es 5'– AGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGG–3’ (SEC ID N.º 32). En la Fig. 28, las secuencias que comprenden el segundo oligonucleótido, incluyendo el oligonucleótido invasor están subrayadas. En la Fig. 28a, el segundo oligonucleótido, que tiene la secuencia 5'–GACGGGGAAAGCCGGCGAACG–3’ (SEC ID N.º 33) es complementario a una región diferente y secuencia abajo de la molécula diana de lo que lo es el oligonucleótido sonda (marcado con fluoresceína o “flúor”): hay un hueco entre el segundo oligonucleótido secuencia arriba y la sonda para la estructura mostrada en la Fig. 28a. En la Fig. 28b, el segundo oligonucleótido secuencia arriba, que tiene la secuencia 5'– GAAAGCCGGCGAACGTGGCG–3’ (SEC ID N.º 34), es complementario a una región diferente de la molécula diana de lo que lo es el oligonucleótido sonda, pero en este caso, el segundo oligonucleótido y el oligonucleótido sonda, que se encuentran contiguos entre sí, (es decir, el extremo 3' del segundo oligonucleótido secuencia arriba es inmediatamente adyacente al extremo 5' de la sonda, tal que no hay ningún hueco entre estos dos oligonucleótidos). En la Fig. 28c, el segundo oligonucleótido secuencia arriba [5'–GGCGAACGTGGCGAGAAAGGA–3’ (SEC ID N.º 35)] y el oligonucleótido soda comparten una región de complementariedad con la molécula diana. De este modo, el oligonucleótido secuencia arriba tiene un brazo 3' que tiene una secuencia idéntica a las primeras bases varias de la sonda secuencia abajo. En este caso, el oligonucleótido secuencia arriba se denomina oligonucleótido “invasor”.

Se examinó el efecto de la presencia de un oligonucleótido invasor sobre el patrón de escisión en un dúplex de sonda/diana formado antes de la adición del invasor. Se añadieron el oligonucleótido invasor y la enzima tras permitir que se apareara la sonda con la diana, y se examinaron la posición y el grado de escisión de la sonda para determinar a) si el invasor fue capaz de desplazar el sitio de escisión hasta una región interna específica de la sonda, y b) si la reacción pudo acumular productos de escisión específicos a lo largo del tiempo, incluso en ausencia de ciclos térmicos, polimerización o eliminación de la exonucleasa de la secuencia sonda.

Las reacciones se llevaron a cabo como se describe a continuación. Se prepararon veinte 1l de dos mezclas enzimáticas que contenían 2 1l de extracto de nucleasa A/G Cleavase® (preparada según lo descrito en el ejemplo 2) con o sin 50 pmoles del oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 35), según lo indicado, por cada 4 1l de mezcla. Para cada una de las ocho reacciones mostradas en la Fig. 29, se combinaron 150 fmoles de ADN monocatenario de M13mp19 (disponible en Life Technologies, Inc.) con 5 pmoles de sonda marcada con fluoresceína (SEC ID N.º 32), para crear la estructura mostrada en la Fig. 28c, pero sin el oligonucleótido invasor presente (la mezcla de sonda/diana). La mitad (4 tubos) de las mezclas de sonda/diana se combinaron con 1 1l de MOPS 100mM; pH 7,5 con Tween–20 y NP–40 cada uno al 0,5%; 0,5 1l de KCl 1M y 0,25 1l de MnCl2 80mM, y agua destilada hasta un volumen de 6 1l. El segundo conjunto de mezclas de sonda/diana se combinó con 1 1l de MOPS 100mM; pH 7,5 con Tween–20 y NP–40 cada uno al 0,5%; 0,5 1l de KCl 1M y 0,25 1l de MgCl2 80mM. El segundo conjunto de mezclas contenía por tanto MgCl2 en lugar del MnCl2 presente en el primer conjunto de mezclas.

Se cubrieron las mezclas (que contenían el dúplex de sonda/diana con tampón, KCl y catión divalente) con una gota de barrera contra la evaporación ChillOut®, y se llevaron hasta 60°C durante 5 minutos para permitir e l apareamiento. Se añadieron cuatro 1l de las mezclas enzimáticas anteriores sin el oligonucleótido invasor a las reacciones cuyos productos se muestran en los carriles 1, 3, 5 y 7 de la Fig. 29. Las reacciones cuyos productos se muestran en los carriles 2, 4, 6 y 8 de la Fig. 29 recibieron la misma cantidad de enzima mezclada con el oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 35). Las reacciones 1, 2, 5 y 6 se incubaron durante 5 minutos a 60°C y las reacciones 3, 4, 7 y 8 se incubaron durante 15 minutos a 60°C.

Todas las reacciones se detuvieron mediante la adición de 8 µl de formamida al 95% con EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05%. Se calentaron las muestras hasta 90°C durante 1 minuto inmediatamente antes de la electroforesis a través de gel de acrilamida al 20% (entrecruzamiento de 19:1), que contenían urea 7M, en un tampón de Tris–Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM. Tras la electroforesis, se visualizaron los productos de reacción mediante el uso de un generador de imágenes fluorescentes FMBIO Hitachi, cuya producción se observa en la Fig.

29. El material fluorescente de muy bajo peso molecular observado en todos los carriles en o cerca del frente salino de la Fig. 29 y otras figuras del generador de imágenes fluorescentes se observan cuando los oligonucleótidos marcados fluorescentemente son sometidos a electroforesis y a un generador de imágenes fluorescentes. Este material no es un producto de la reacción de escisión.

El uso de MnCl2 en estas reacciones (vías 1–4) estimula la verdadera actividad exonucleasa o de “mordisqueado” de las enzimas Cleavase®, según lo descrito en el ejemplo 6, como se observa claramente en los carriles 1 y 3 de la Fig. 29. Este mordisqueado del oligonucleótido sonda (SEC ID N.º 32) en ausencia de oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 35) confirma que el oligonucleótido sonda está formando un dúplex con la secuencia diana. Los productos de tipo escalera producidos por esta reacción de mordisqueado se pueden diferenciar difícilmente de la degradación de la sonda por nucleasas que podrían estar presentes en una muestra clínica. Por el contrario, la introducción del oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 35) provocó un desplazamiento característico en la escisión de la sonda, empujando el sitio de escisión 6 a 7 bases hacia el interior de la sonda, lo que confirma el apareamiento de ambos oligonucleótidos. En presencia de MnCl2, “el mordisqueado” de la exonucleasa puede tener lugar tras la escisión dirigida por un invasor, hasta que el dúplex residual es desestabilizado y se deshace.

En una reacción de escisión basada en magnesio (vías 5–8), el mordisqueado o la verdadera función exonucleasa de la A/G Cleavase® es suprimida enzimáticamente (pero la función endonucleolítica de la enzima permanece esencialmente inalterada), por lo que el oligonucleótido sonda no se degrada en ausencia del invasor (Fig. 29, vías 5 y 7). Cuando se añade el invasor, es evidente que el oligonucleótido invasor puede promover el desplazamiento en el sitio de la escisión endonucleolítica de la sonda apareada. La comparación de los productos de las reacciones de 5 y 15 minutos con invasor (vías 6 y 8 en la Fig. 29) muestra que la sonda adicional se hibrida con la diana y se escinde. La temperatura de fusión calculada (Tm) de la parte de la sonda que no es invadida (i.e., los nucleótidos 9– 26 de la SEC ID N.º 32) es de 56°C, por lo que la ren ovación observada (según lo probado por la acumulación de productos de escisión con el aumento del tiempo de reacción) sugiere que la longitud completa de la molécula de sonda, con una Tm calculada de 76°C, debe estar implicada en los apa reamientos de sonda posteriores en esta reacción a 60°C.

Ejemplo 12

El solapamiento de la secuencia de oligonucleótido invasor 3’ con la región 5’ de la sonda provoca un desplazamiento del sitio de escisión

En el ejemplo 11, se demostró la capacidad de un oligonucleótido invasor de provocar un desplazamiento en el sitio de escisión de una sonda apareada con una molécula diana. En este ejemplo, se llevaron a cabo experimentos para examinar si la presencia de un oligonucleótido secuencia arriba de la sonda era suficiente para provocar un desplazamiento en el o los sitios de escisión a lo largo de la sonda o si era necesaria la presencia de nucleótidos sobre el extremo 3' del oligonucleótido invasor que tenía la misma secuencia que los primeros nucleótidos varios del extremo 5' del oligonucleótido sonda para promover el desplazamiento de la escisión.

Para examinar esta cuestión, se compararon los productos de escisión obtenidos de tres disposiciones diferentes de los oligonucleótidos de diana específica. En la Fig. 28, se muestra el diagrama de estos oligonucleótidos y el modo en el que se hibridan con un ácido nucleico diana, el M13mp19. En la Fig. 28a, el extremo 3' del oligonucleótido de secuencia arriba (SEC ID N.º 33) se localiza secuencia arriba del extremo 5' del oligonucleótido “sonda”de secuencia abajo (SEC ID N.º 32), tal que hay presente una región de la diana M13 que no está apareada a ningún oligonucleótido. En la Fig. 28b, la secuencia del oligonucleótido de secuencia arriba (SEC ID N.º 34) está inmediatamente secuencia arriba de la sonda (SEC ID N.º 32), que no tiene ni un hueco ni un solapamiento entre las secuencias. La Fig. 28c muestra un diagrama de la disposición de los sustratos usados en el análisis de la presente invención, en el que se muestra que el oligonucleótido “invasor” de secuencia arriba (SEC ID N.º 35) tiene la misma secuencia sobre una parte de su región 3’ que ésa presente en la región 5’ de la sonda secuencia abajo (SEC ID N.º 32). Esto significa que estas regiones competirán para hibridarse al mismo segmento del ácido nucleico diana M13.

En estos experimentos, se prepararon cuatro mezclas enzimáticas como se describe a continuación (se planificaron 5 1l por digesto): La mezcla 1 contenía 2,25 1l de extracto de nucleasa A/G Cleavase® (preparado según lo descrito en el ejemplo 2) por cada 5 1l de mezcla, en MOPS 20mM, pH 7,5 con Tween 20 y NP–40 cada uno al 0,1%; MnCl2 4mM y KCl 100mM. La mezcla 2 contenía 11,25 unidades de ADN polimerasa de Taq (Promega) por cada 5 1l de mezcla en MOPS 20mM, pH 7,5 con Tween 20 y NP–40 cada uno al 0,1%; MnCl2 4mM y KCl 100mM. La mezcla 3 contenía 2,25 1l de extracto de nucleasa A/G Cleavase® por cada 5 1l de mezcla en Tris–HCl 20mM, pH 8,5; MgCl2 4mM y KCl 100mM. La mezcla 4 contenía 11,25 unidades de ADN polimerasa de Taq por cada 5 1l de mezcla en Tris–HCl 20mM, pH 8,5; MgCl2 4mM y KCl 100mM.

Para cada reacción, se combinaron 50 fmoles de ADN monocatenario de M13mp19 (la ácido nucleico diana) con 5 pmoles del oligonucleótido sonda (SEC ID N.º 32 que contenía un marcador de fluoresceína en el extremo 3') y 50 pmoles de uno de los tres oligonucleótidos de secuencia arriba representados en la Fig. 28 (i.e., una de las SEC ID N.º 33–35), en un volumen total de 5 1l de agua destilada. Se recubrieron las reacciones con una gota de barrera contra la evaporación ChillOut™ y se calentaron hasta 62°C. Se iniciaron las reacciones de escisión med iante la adición de 5 1l de una mezcla enzimática a cada tubo, y se incubaron las reacciones a 62°C durante 30 min. Las reacciones mostradas en los carriles 1–3 de la Fig. 30 recibieron la mezcla 1; las reacciones 4–6 recibieron la mezcla 2; las reacciones 7–9 recibieron la mezcla 3 y las reacciones 10–12 recibieron la mezcla 4.

Tras 30 minutos a 62°C, se detuvieron las reaccione s mediante la adición de 8 µl de formamida al 95% con EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05%. Se calentaron las muestras hasta 75°C durante 2 minutos inmediat amente antes de la electroforesis a través de gel de acrilamida al 20% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris–Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM.

Tras la electroforesis, se visualizaron los productos de las reacciones mediante el uso de un generador de imágenes fluorescentes FMBIO de Hitachi, cuya producción se observa en la Fig. 30. Los productos de reacción mostrados en los carriles 1, 4, 7 y 10 de la Fig. 30 procedían de las reacciones que contenían la SEC ID N.º 33 como el oligonucleótido de secuencia arriba (véase la Fig. 28a). Los productos de reacción mostrados en los carriles 2, 5, 8 y 11 de la Fig. 30 procedían de las reacciones que contenían la SEC ID N.º 34 como el oligonucleótido de secuencia arriba (véase la Fig. 28b). Los productos de reacción mostrados en los carriles 3, 6, 9 y 12 de la Fig. 30 procedían de las reacciones que contenían la SEC ID N.º 35, el oligonucleótido invasor, como el oligonucleótido de secuencia arriba (véase la Fig. 28c).

El examen de las reacciones basadas en Mn2– usando bien nucleasa A/G Cleavase® o ADNPTaq como el agente de escisión (vías 1 a 3 y 4 a 6, respectivamente) muestra que ambas enzimas tienen la función exonucleasa activa en estas condiciones de tamponamiento. El uso de un marcador 3’ en el oligonucleótido sonda permite que los productos de la actividad de mordisqueado permanezcan marcados y, por tanto, sean visibles en este análisis. Las escaleras observadas en los carriles 1, 2, 4 y 5 confirman que la sonda se hibrida con el ADN diana según lo deseado. Estas vías también muestran que la ubicación de los oligonucleótidos no invasivos tiene poco efecto sobre los productos generados. La escalera uniforme creada por estos digestos sería difícil de distinguir de una escalera producida por una nucleasa contaminante, como la que se podría encontrar en una muestra clínica. Por el contrario, los productos representados en los carriles 3 y 6, en las que se proporcionó un oligonucleótido invasor para dirigir la escisión, muestran un desplazamiento muy característico, tal que el producto de escisión principal es más pequeño que aquéllos observados en la escisión no invasiva. Entonces se somete este producto a más mordisqueado en estas condiciones, según lo indicado por los productos más cortos de estas vías. Estos productos de escisión dirigida por un invasor serían fácilmente distinguidos de un fondo de degradación inespecífica del oligonucleótido sonda.

Cuando se usa Mg2– como catión divalente, los resultados son incluso más característicos. En los carriles 7, 8, 10 y 11 de la Fig. 30, en las que los oligonucleótidos de secuencia arriba no eran invasivos, se observó un mordisqueado mínimo. Los productos de las reacciones con ADNPTaq muestran cierta acumulación de la sonda que ha sido acortada sobre el extremo 5' en uno o dos nucleótidos que coincide con el examen previo de la acción de esta enzima sobre sustratos mellados (Longley et al., supra). Sin embargo, cuando el oligonucleótido de secuencia arriba es invasivo, se observa la aparición de la banda de la sonda desplazada de manera característica. Estos datos indicaron claramente que es la parte 3’ invasiva del oligonucleótido de secuencia arriba la responsable de fijar el sitio de escisión de la sonda de secuencia abajo.

De este modo, los resultados anteriores demuestran que es la presencia de los nucleótidos libres o no apareados inicialmente en el extremo 3' del oligonucleótido invasor lo que media el desplazamiento del sitio de escisión, no sólo la presencia de un oligonucleótido apareado secuencia arriba de la sonda. Los análisis de detección de ácidos nucleicos que emplean el uso de un oligonucleótido invasor se denominan análisis de la “escisión dirigida por un invasor”.

Ejemplo 13

La escisión dirigida por un invasor reconoce moléculas diana mono– y bicatenarias en un fondo de moléculas de ADN no diana

Para que un procedimiento de detección de ácidos nucleicos sea ampliamente útil, debe ser capaz de detectar una diana específica en una muestra que pueda contener grandes cantidades de otro ADN, p. ej., ADN bacteriano o cromosómico humano. Se examinó la capacidad del análisis de la escisión dirigida por un invasor para reconocer y escindir moléculas diana bien mono– o bicatenarias en presencia de grandes cantidades de ADN no diana. En estos experimentos, se combinó un ácido nucleico diana modelo, el M13, bien en forma mono– o bicatenaria (el M13mp18 monocatenario se encuentra disponible en Life Technologies, Inc. y el M13mp19 bicatenario se encuentra disponible en New England Biolabs), con ADN genómico humano (Novagen, Madison, WI) y luego se utilizó en reacciones de escisión dirigida por un invasor. Antes de iniciar la reacción de escisión, se calentaron los ADN hasta 95°C durante 15 minutos para desnaturalizar completamente las muestras, según la práctica analítica estándar, tal como la reacción en cadena de la polimerasa o la secuenciación enzimática de ADN, que implican la hibridación en soluciones de oligonucleótidos con moléculas diana bicatenarias.

Para cada una de las reacciones mostradas en los carriles 2–5 de la Fig. 31, se combinó el ADN diana (25 fmoles del ADNmc o 1 pmol del ADNbc) con 50 pmoles del oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 35); para la reacción mostrada en el carril 1, se omitió el ADN diana. Las reacciones 1, 3 y 5 también contenían 470 ng de ADN genómico humano. Se llevaron estas mezclas hasta un volumen de 10 1l con agua destilada, se recubrieron con una gota de barrera contra la evaporación ChillOut™y se llevaron hasta 95°C durante 15 minutos. Tras este período de incubación, y todavía a 95°C, cada tubo recibió 10 1l de una mezcla que comprendía 2,25 1l de extracto de nucleasa A/G Cleavase® (preparado según lo descrito en el ejemplo 2) y 5 pmoles del oligonucleótido sonda (SEC ID N.º 32) en MOPS 20mM, pH 7,5, con Tween 20 y NP–40 cada uno al 0,1%, MnCl2 4mM y KCl 100mM. Se llevaron estas reacciones hasta 62°C durante 15°C y se detuvieron mediante la adición de 12 µl de formamida al 95% con EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05%. Se calentaron las muestras hasta 75°C durante 2 minutos inmediat amente antes de la electroforesis a través de gel de acrilamida al 20% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris–Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM. Se visualizaron los productos de las reacciones mediante el uso de un generador de imágenes fluorescentes FMBIO de Hitachi. En la Fig. 31, se muestran los resultados.

En la Fig. 31, el carril 1 contiene los productos de la reacción que contiene la sonda (SEC ID N.º 32), el oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 35) y ADN genómico humano. El examen del carril 1 muestra que los oligonucleótidos sonda e invasor son específicos de la secuencia diana, y que la presencia del ADN genómico no provoca ninguna escisión de fondo significativa.

En la Fig. 31, los carriles 2 y 3 contienen productos de reacción procedentes de las reacciones que contienen el ADN diana monocatenario (M13mp18), la sonda (SEC ID N.º 32) y el oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 35) en ausencia o en presencia del ADN genómico humano, respectivamente. El examen de los carriles 2 y 3 demuestra que el análisis de detección por un invasor se puede usar para detectar la presencia de una secuencia específica sobre una molécula diana monocatenaria en presencia o en ausencia de un gran exceso de ADN competidor (ADN genómico humano).

En la Fig. 31, los carriles 4 y 5 contienen productos de reacción procedentes de las reacciones que contienen el ADN diana bicatenario (M13mp19), la sonda (SEC ID N.º 32) y el oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 35) en ausencia o en presencia del ADN genómico humano, respectivamente. El examen de los carriles 4 y 5 muestra que las moléculas diana bicatenarias son eminentemente adecuadas para las reacciones de detección dirigidas por un invasor. El éxito de esta reacción que usa una molécula duplicada corta, la M13mp19, como la diana en un fondo de un gran exceso de ADN genómico es especialmente notable, pues cabría anticipar que se podría esperar que las cadenas de ADN de M13 más cortas y menos complejas encontraran su cadena complementaria más fácilmente de lo que lo harían las cadenas del ADN genómico humano más complejo. Si el ADN de M13 se volviera a aparear antes de que el oligonucleótido sonda y/o invasor se pudiera unir a las secuencias diana a lo largo del ADN de M13, se evitaría la reacción de escisión. Además, como el ADN genómico desnaturalizado posiblemente contendría regiones complementarias al oligonucleótido sonda y/o invasor, sería posible que la presencia del ADN genómico inhibiera la reacción mediante la unión de estos oligonucleótidos evitando así su hibridación con la diana M13. Los resultados anteriores demuestran que estas cuestiones teóricas no suponen un problema en las condiciones de reacción empleadas anteriormente.

Además de demostrar que el análisis de detección por un invasor se puede usar para detectar secuencias presentes en una diana bicatenaria, estos datos también muestran que la presencia de una gran cantidad de ADN no diana (470 ng/20 1l de reacción) no disminuye la especificidad de la escisión. Aunque esta cantidad de ADN muestra cierto impacto sobre la velocidad de acumulación de producto, probablemente, mediante la unión de una parte de la enzima, la naturaleza de la secuencia diana, ácido nucleico bien mono– o bicatenario, no limita la aplicación de este análisis.

Ejemplo 14

Acumulación de señal en el análisis de la escisión dirigida por un invasor como una función de la concentración de diana

Para investigar si el análisis de la escisión dirigida por un invasor se podría usar para indicar la cantidad de ácido nucleico diana presente en una muestra, se realizó el siguiente experimento. Se prepararon reacciones de escisión que contenían un oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 35), una sonda marcada (SEC ID N.º 32) y un ácido nucleico diana, el M13mp19. Se empleó una serie de reacciones, que contenían cantidades cada vez menores de ADN diana de M13, con el fin de examinar si los productos de escisión se acumularían de una manera que reflejara la cantidad de ADN diana presente en la reacción.

Las reacciones se realizaron como se explica a continuación: Se preparó una mezcla maestra que contenía enzima y tampón. Cada 5 1l de mezcla maestra contenía 25 ng de nucleasa BN Cleavase® en MOPS 20mM (pH 7,5) con Tween 20 y NP–40 cada uno al 0,1%; MnCl2 4mM y KCl 100mM. Para cada una de las reacciones de escisión mostradas en los carriles 4–13 de la Fig. 32, se generó una mezcla de ADN que contenía 5 pmoles del oligonucleótido sonda marcado con fluoresceína (SEC ID N.º 32), 50 pmoles del oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 35) y 100, 50, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 ó 0,005 fmoles de M13mp19 monocatenario, respectivamente, por cada 5 1l de mezcla de ADN. Se cubrieron las soluciones de ADN con una gota de barrera contra la evaporación ChillOutTM y se llevaron hasta 61°C. Se iniciaron las reaccione s de escisión mediante la adición de 5 1l de mezcla enzimática a cada uno de los tubos (el volumen de reacción final fue de 10 1l). Tras 30 minutos a 61°C, se detuvieron las reacciones mediante la adición de 8 µl de formamida al 95% con EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05%. Se calentaron las muestras hasta 90°C durante 1 minuto inmediatamente antes de la electroforesis a través de gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (entrecruzamiento de 19:1), que contenían urea 7M, en un tampón de Tris– Borato 45mM (pH 8,3), EDTA 1,4mM. Como referencia (i.e., a modo de patrones), se diluyeron alícuotas de 1,0; 0,1 y 0,01 pmoles del oligonucleótido sonda marcado con fluoresceína (SEC ID N.º 32) con la solución de formamida anterior hasta un volumen final de 18 1l. Se cargaron estos marcadores de referencia en los carriles 1–3, respectivamente, del gel. Se visualizaron los productos de las reacciones de escisión (así como los patrones de referencia) tras la electroforesis mediante el uso de un generador de imágenes fluorescentes FMBIO de Hitachi. En la Fig. 32, se muestran los resultados.

En la Fig. 32, aparecen recuadros alrededor del ácido nucleico que contiene fluoresceína (i.e., las moléculas de sonda escindidas y sin escindir), indicándose la cantidad de fluoresceína contenida en cada recuadro bajo el mismo. La fluorescencia de fondo del gel (véase el recuadro marcado como “fondo”) fue restada mediante el generador de imágenes fluorescentes para generar cada valor representado bajo un recuadro que contenía los productos sonda escindidos y sin escindir (los recuadros están numerados del 1–14 en la parte superior izquierda con una V seguida por un número bajo el recuadro). El carril marcada con una “M” contiene oligonucleótidos fluorescentes que sirven como marcadores.

Los resultados mostrados en la Fig. 32 demuestran que la acumulación de moléculas de sonda escindidas en un período de incubación de una determinada duración refleja la cantidad de ADN diana presente en la reacción. Los resultados también demuestran que los productos de sonda escindidos se acumulan en exceso con respecto al número de copias de la diana. Esto se demuestra claramente mediante la comparación de los resultados mostrados en el carril 3, en la que se muestran 10 fmoles (0,01 pmoles) de sonda sin cortar con los resultados mostrados en 5, donde se muestran los productos que se acumularon como respuesta a la presencia de 10 fmoles de ADN diana. Estos resultados muestran que la reacción puede escindir cientos de moléculas de oligonucleótido sonda por cada molécula diana presente, amplificando de manera espectacular la señal de diana específica generada en la reacción de escisión dirigida por un invasor.

Ejemplo 15

Efecto del extracto de saliva sobre el análisis de la escisión dirigida por un invasor

Para que un procedimiento de detección de ácidos nucleicos sea útil en un entorno médico (i.e., de diagnóstico), no debe ser inhibido por materiales ni contaminantes con probabilidad de ser encontrados en una muestra clínica común. Para analizar la susceptibilidad del análisis de la escisión dirigida por un invasor hacia diversos materiales, incluyendo pero no limitándose a ácidos nucleicos, glicoproteínas e hidratos de carbono, con probabilidad de ser encontrados en una muestra clínica, se preparó una muestra de saliva humana de una manera en concordancia con las prácticas realizadas en el laboratorio clínico, y se añadió el extracto de saliva resultante al análisis de la escisión dirigida por un invasor. Se examinó el efecto del extracto de saliva sobre la inhibición de la escisión y sobre la especificidad de la reacción de escisión.

Se recogió un mililitro y medio de saliva humana, y se extrajo una vez con un volumen igual de una mezcla que contenía fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). Se centrifugó la mezcla resultante en un microcentrifugador para separar las fases acuosa y orgánica. Se transfirió la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Se añadieron volúmenes de una décima parte de NaOAc 3M y se mezclaron los contenidos del tubo. Se añadieron dos volúmenes de alcohol etílico al 100% a la mezcla, y se mezcló y se incubó la muestra a temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir la formación de un precipitado. Se centrifugó la muestra en un microcentrifugador a 13.000 rpm durante 5 minutos, y se retiró y se desechó el sobrenadante. Se volvieron fácilmente visibles unos sedimentos lechosos. Se aclararon una vez los sedimentos con etanol al 70%, se secaron al vacío y se disolvieron en 200 1l de Tris–HCl 10mM, pH 8,0; EDTA 0,1mM (esto constituye el extracto de saliva). Cada 1l de extracto de saliva era equivalente a 7,5 1l de saliva. El análisis de extracto de saliva mediante espectrometría de barrido en el ultravioleta mostró una absorbancia máxima a aproximadamente 260 nm e indicó la presencia de aproximadamente 45 ng de ácido nucleico total por cada 1l de extracto.

Se examinó el efecto de la presencia de extracto de saliva sobre las siguientes enzimas: nucleasa BN Cleavase®, nucleasa A/G Cleavase® y tres lotes diferentes de ADNPTaq: AmpliTaq® (Perkin Elmer: una forma recombinante de ADNPTaq), LD AmpliTaq® (Perkin–Elmer: una preparación de ADNPTaq recombinante que contiene niveles muy bajos de ADN) y ADN polimerasa de Taq (Fischer). Para cada enzima analizada, se elaboró una mezcla de enzima/sonda que comprendía la cantidad seleccionada de enzima con 5 pmoles del oligonucleótido sonda (SEC ID N.º 32) en 10 1l de MOPS 20mM (pH 7,5) que contenían Tween 20 y NP–40 cada uno al 0,1%; MnCl2 4mM; KCl 100mM y 100 1g/ml de ASB. Se usaron las siguientes cantidades de enzima: 25 ng de BN Cleavase® preparada según lo descrito en el ejemplo 8; 2 1l de extracto de nucleasa A/G Cleavase® preparado según lo descrito en el ejemplo 2; 2,25 1l (11,25 unidades de polimerasa) de las siguientes ADN polimerasas: ADN polimerasa AmpliTaq® (Perkin Elmer); LD de ADN polimerasa AmpliTaq® (ADN bajo; de Perkin Elmer); ADN polimerasa de Taq (Fisher Scientific).

Para cada una de las reacciones mostradas en la Fig. 33, a excepción de la mostrada en el carril 1, se combinó el ADN diana (50 fmoles del ADN monocatenario de M13mp19) con 50 pmoles del oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 35) y 5 pmoles del oligonucleótido sonda (SEC ID N.º 32); se omitió el ADN diana en la reacción 1 (vía 1). Las reacciones 1, 3, 5, 7, 9 y 11 incluían 1,5 1l de extracto de saliva. Se llevaron estas mezclas hasta un volumen de 5 µl con agua destilada, se recubrieron con una gota de barrera contra la evaporación ChillOut™y se llevaron hasta 95°C durante 10 minutos. Se iniciaron entonces las reacciones de escisión mediante la adición de 5 1l de la mezcla de enzima/sonda deseada: las reacciones 1, 4 y 5 recibieron nucleasa A/G Cleavase®; las reacciones 2 y 3 recibieron BN Cleavase®; las reacciones 6 y 7 recibieron AmpliTaq®; las reacciones 8 y 9 recibieron LD AmpliTaq®; y las reacciones 10 y 11 recibieron ADN polimerasa de Taq de Fisher Scientific.

Se incubaron las reacciones a 63°C durante 30 minuto s y se detuvieron mediante la adición de 6 µl de formamida al 95% con EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05%. Se calentaron las muestras hasta 75°C durante 2 minu tos inmediatamente antes de la electroforesis a través de gel de acrilamida al 20% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris–Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM. Se visualizaron los productos de las reacciones mediante el uso de un generador de imágenes fluorescentes FMBIO de Hitachi, y los resultados se muestran en la Fig. 33.

Una comparación a pares de los carriles mostrados en la Fig. 33 sin y con el extracto de saliva, tratado con cada una de las enzimas, muestra que el extracto de saliva tiene efectos diferentes sobre cada una de las enzimas. Mientras que la nucleasa BN Cleavase® y la AmpliTaq® son inhibidas significativamente de escindirse en estas posiciones, la nucleasa A/G Cleavase® y la LD AmpliTaq® presentan poca diferencia en la producción de sonda escindida. La preparación de ADN polimerasa de Taq procedente de Fisher Scientific muestra una respuesta intermedia, con una reducción parcial de la producción de producto escindido. Desde el punto de vista de la polimerización, las tres variantes de ADNPTaq deberían ser equivalentes; éstas deberían ser la misma proteína con la misma cantidad de actividad sintética. Es posible que las diferencias observadas se pudieran deber a las variaciones en la cantidad de actividad nucleasa presente en cada preparación provocadas por diferentes manipulaciones durante la purificación o mediante diferentes protocolos de purificación. En cualquier caso, los análisis de control de calidad diseñados para evaluar la actividad de polimerización de preparaciones de ADNp comerciales revelarían con poca probabilidad la variación en la cantidad de actividad nucleasa presente. Si se rastrearan preparaciones de ADNPTaq en cuanto a una actividad nucleasa 5' completa (i.e., si se cuantificara específicamente la actividad nucleasa 5’), es probable que las preparaciones mostraran sensibilidades (al extracto de saliva) más en línea con esa observada usando nucleasa A/G Cleavase®, de la que la ADNPTaq difiere en muy pocos aminoácidos.

Obsérvese que incluso en las reacciones retardadas de la BN Cleavase® y las variantes de ADNPTaq, no hay un aumento notable de la escisión inespecífica del oligonucleótido sonda debido a una hibridación inapropiada o a nucleasas portadas en la saliva.

Ejemplo 16

Comparación de más nucleasas 5' en el análisis de la escisión dirigida por un invasor

Se ha observado un número de ADN polimerasas de tipo A eubacterianas (i.e., ADN polimerasas de tipo Pol I) funcionar como endonucleasas de estructura específica (ejemplo 1 y Lyamichev et al., supra). En este ejemplo, se demostró que también se puede hacer que las enzimas de esta clase catalicen la escisión dirigida por un invasor de la presente invención, aunque no tan eficazmente como las enzimas Cleavase®.

Se analizaron la nucleasa BN Cleavase® y la nucleasa A/G Cleavase® junto a tres ADN polimerasas termoestables diferentes: la ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Promega), y la ADN polimerasa de Thermus thermophilus y la ADN polimerasa de Thermus flavus (Epicentre). Las mezclas enzimáticas usadas en las reacciones mostradas en los carriles 1–11 de la Fig. 34 contenían lo siguiente, cada una en un volumen de 5 1l: Vía 1: MOPS 20mM (pH 7,5) con Tween 20 y NP–40 cada uno al 0,1%; MnCl2 4mM; KCl 100mM; Vía 2: 25 ng de nucleasa BN Cleavase® en la misma solución descrita para el carril 1; Vía 3: 2,25 1l de extracto de nucleasa A/G Cleavase® (preparado según lo descrito en el ejemplo 2), en la misma solución descrita para el carril 1; Vía 4: 2,25 1l de extracto de nucleasa A/G Cleavase® en Tris–Cl 20mM (pH 8,5); MgCl2 4mM y KCl 100mM; Vía 5: 11,25 unidades de polimerasa de ADN polimerasa de Taq en el mismo tampón descrito para el carril 4; Vía 6: 11,25 unidades de polimerasa de ADN polimerasa de Tth en el mismo tampón descrito para el carril 1; Vía 7: 11,25 unidades de polimerasa de ADN polimerasa de Tth en 2 x concentración del tampón suministrado por el fabricante complementado con MnCl2 4mM; Vía 8: 11,25 unidades de polimerasa de ADN polimerasa de Tth en 2 x concentración del tampón suministrado por el fabricante complementado con MnCl2 4mM; Vía 9: 2,25 unidades de polimerasa de ADN polimerasa de Tfl en el mismo tampón descrito para el carril 1; Vía 10: 2,25 unidades de polimerasa de la polimerasa de Tfl en 2 x concentración del tampón suministrado por el fabricante complementado con MnCl2 4mM; Vía 11: 2,25 unidades de polimerasa de la ADN polimerasa de Tfl en 2 x concentración del tampón suministrado por el fabricante complementado con MnCl2 4mM.

Se combinó en una mezcla maestra suficiente ADN diana, sonda e invasor para las 11 reacciones. Esta mezcla contenía 550 fmoles de ADN diana de M13mp19 monocatenario, 550 pmoles del oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 35 ) y 55 pmoles del oligonucleótido sonda (SEC ID N.º 32, cada uno representado en la Fig. 28c, en 55 1l de agua destilada. Se dispensaron cinco 1l de mezcla de ADN en cada uno de los 11 tubos marcados y se recubrieron con una gota de barrera contra la evaporación ChillOut®. Se llevaron las reacciones hasta 63°C y se inició la escisión mediante la adición de 5 1l de la mezcla enzimática apropiada. Entonces se incubaron las mezclas de reacción a una temperatura de 63°C durante 15 minutos. Todas l as reacciones se detuvieron mediante la adición de 8 µl de formamida al 95% con EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05%. Se calentaron las muestras hasta 90°C durante 1 minuto inmediatamente antes de la electroforesis a través de gel de acrilamida al 20% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris–Borato 45mM, (pH 8,3); EDTA 1,4mM. Tras la electroforesis, se visualizaron los productos de las reacciones mediante el uso de un generador de imágenes fluorescentes FMBIO de Hitachi, y los resultados se muestran en la Fig. 34. El examen de los resultados mostrados en la Fig. 34 demuestra que todas las nucleasas 5' analizadas tienen la capacidad de catalizar la escisión dirigida por un invasor en al menos uno de los sistemas de tamponamiento analizados. Aunque no están optimizados aquí, estos agentes de escisión son adecuados para su uso en los procedimientos de la presente invención.

Ejemplo 17

El análisis de la escisión dirigida por un invasor puede detectar diferencias de una sola base en las secuencias de ácidos nucleicos diana

Se examinó la capacidad del análisis de la escisión dirigida por un invasor para detectar mutaciones de apareamiento erróneo de una sola base. Se sintetizaron químicamente y se purificaron mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida dos secuencias de ácido nucleico diana que contenían esqueletos de fosforotioato resistentes a las enzimas Cleavase®. Se usaron dianas que comprendían esqueletos de fosforotioato para evitar el mordisqueado exonucleolítico de la diana cuando formara un dúplex con un oligonucleótido. Un oligonucleótido diana, que proporciona una secuencia diana que es completamente complementaria al oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 35) y el oligonucleótido sonda (SEC ID N.º: 32) contenían la siguiente secuencia:

5'–CCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGC–3’ (SEC ID N.º 36). Se sintetizó una segunda secuencia diana que contenía un cambio de una sola base en comparación con la SEC ID N.º 36: 5’– CCTTTCGCTCTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGC–3’ (SEC ID N.º 37; el cambio de una sola base en comparación con la SEC ID N.º 36 se muestra en negrita y subrayada). El posterior apareamiento erróneo tiene lugar en la región “Z” de la diana según lo representado en la Fig. 25.

Para diferenciar entre dos secuencias diana que difieren en la presencia de un solo apareamiento erróneo, se llevaron a cabo reacciones de escisión dirigida por un invasor usando dos temperaturas de reacción diferentes (55°C y 60°C). Se prepararon mezclas que contenían 200 fmo les de bien la SEC ID N.º 36 o la SEC ID N.º 37; 3 pmoles de oligonucleótido sonda marcado con fluoresceína (SEC ID N.º 32); 7,7 pmoles de oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 35) y 2 1l de extracto de nucleasa A/G Cleavase® (preparado según lo descrito en el ejemplo 2) en 9 1l de MOPS 10mM (pH 7,4) con KCl 50mM, se taparon con una gota de barrera contra la evaporación ChillOut® y se llevaron a la temperatura de reacción apropiada. Se iniciaron las reacciones de escisión mediante la adición de 1 1l de MgCl2 20mM. Tras 30 minutos a bien 55°C o 60°C, se detuvi eron las reacciones mediante la adición de 10 µl de formamida al 95% con EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05%. Entonces se calentaron las mezclas de reacción hasta 90°C durante un minuto antes de cargar 4 1l sobre geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 20%. Se visualizaron los productos de reacción resueltos usando un generador de imágenes fluorescentes FMBIO de Hitachi. En la Fig. 35, se muestra la imagen resultante.

En la Fig. 35, los carriles 1 y 2 muestran los productos de las reacciones llevadas a cabo a 55°C; los carriles 3 y 4 muestran los productos de las reacciones llevadas a cabo a 60°C. Los carriles 1 y 3 contenían producto s de las reacciones que contenían la SEC ID N.º 36 (apareamiento perfecto con la sonda) como diana. Los carriles 2 y 4 contenían productos de las reacciones que contenían la SEC ID N.º 37 (apareamiento de una sola base con la sonda) como diana. La diana que no tiene un apareamiento de hibridación perfecto (i.e., una complementariedad completa) con la sonda no se unirá tan fuertemente, i.e., la Tm de ese dúplex será menor que la Tm de la misma región si está perfectamente apareada. Los resultados presentados aquí muestran que las condiciones de reacción se pueden variar bien para dar cabida al apareamiento erróneo (p. ej., descendiendo la temperatura de la reacción)

o para excluir la unión de la secuencia apareada erróneamente (p. ej., mediante la elevación de la temperatura de la reacción).

Los resultados mostrados en la Fig. 35 demuestran que la escisión específica que tiene lugar en las reacciones de escisión dirigidas por un invasor se puede eliminar por la presencia de un apareamiento erróneo de una sola base entre el oligonucleótido sonda y la secuencia diana. De este modo, se pueden seleccionar las condiciones de reacción para que excluyan la hibridación de las sondas de una escisión dirigida por un invasor apareadas erróneamente, mediante lo que se disminuye e incluso se elimina la escisión de la sonda. En una ampliación de este sistema de análisis, también se pudieron usar múltiples sondas de escisión, poseyendo cada una molécula indicadora separada (i.e., un marcador exclusivo) en una sola reacción de escisión, para sondar simultáneamente dos o más variantes en la misma región diana. Los productos de tal reacción permitirían no sólo la detección de mutaciones que existieran dentro de una molécula diana, sino además permitirían determinar las concentraciones relativas de cada secuencia (i.e., mutante y de tipo natural o múltiples mutantes diferentes) presente en las muestras que contienen una mezcla de secuencias diana. Cuando se proporcionan a partes iguales, pero en un exceso enorme (p. ej., un exceso molar al menos100 veces mayor), se usaría comúnmente al menos 1 pmol de cada oligonucleótido sonda cuando la secuencia diana estuviera presente a aproximadamente 10 fmoles o menos frente a la diana y usada en condiciones optimizadas. Según lo tratado anteriormente, cualquier diferencia en las cantidades relativas de las variantes diana no afectarán a las cinéticas de hibridación, tal que las cantidades de escisión de cada sonda reflejarán las cantidades relativas de cada variante presente en la reacción.

Los resultados mostrados en el ejemplo demuestran claramente que la reacción de escisión dirigida por un invasor se puede usar para detectar diferencias de una sola base entre los ácidos nucleicos diana.

EJEMPLO 18

La reacción de escisión dirigida por un invasor es insensible a los grandes cambios en las condiciones de reacción

Los resultados mostrados anteriormente demostraron que la reacción de escisión dirigida por un invasor se puede usar para la detección de secuencias de ácido nucleico diana y que este análisis se puede usar para detectar una diferencia de una sola base entre los ácidos nucleicos diana. Estos resultados demostraron que las nucleasas 5' (p. ej., la BN Cleavase®, la A/G Cleavase®, la ADNPTaq, la ADNpTth, la ADNpTfl) se podrían usar en combinación con un par de oligonucleótidos solapantes como un modo eficaz de reconocer dianas de ácido nucleico. En los siguientes experimentos, se demuestra que la reacción de escisión invasiva es relativamente insensible a los grandes cambios de las condiciones haciendo así el procedimiento adecuado para la práctica en laboratorios clínicos.

Se examinaron los efectos de la variación de las condiciones de la reacción de escisión en cuanto a su o sus efectos sobre la especificidad de la escisión invasiva y sobre la cantidad de señal acumulada en el transcurso de la reacción. Para comparar las variaciones en la reacción de escisión, primero se definió una reacción de escisión por invasor “estándar”. En cada caso, a no ser que se establezca específicamente lo contrario, se varió el parámetro indicado de la reacción, mientras que los aspectos invariables de un determinado análisis fueron aquéllos de esta reacción estándar. Los resultados de estos análisis se muestran bien en las Fig. 38–40 o son los resultados descritos a continuación.

a) la reacción de escisión dirigida por un invasor estándar

La reacción estándar se definió como aquélla que comprende 1 fmol de ADN diana monocatenario de M13mp18 (New England Biolabs), 5 pmoles del oligonucleótido sonda (SEC ID N.º 38), 10 pmoles del oligonucleótido invasor de secuencia arriba (SEC ID N.º 39) y 2 unidades de A/G Cleavase® en 10 1l de MOPS 10mM, pH 7,5, con KCl 100mM; MnCl2 4mM, y Tween–20 y Nonidet–P40 cada uno al 0,05%. Para cada reacción, se combinaron los tampones, las sales y la enzima en un volumen de 5 1l; los ADN (la diana y los dos oligonucleótidos) se combinaron en 5 1l de H2Od y se recubrieron con una gota de barrera contra la evaporación ChillOut®. Cuando se realizaron múltiples reacciones con los mismos constituyentes de reacción, estas formulaciones se fueron ampliando proporcionalmente.

A no ser que se establezca lo contrario, los tubos de muestra con las mezclas de ADN se calentaron hasta 61°C y las reacciones se iniciaron mediante la adición de 5 1l de la mezcla enzimática. Tras 20 minutos a esta temperatura, se detuvieron las reacciones mediante la adición de 8 µl de formamida al 95% con EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05%. Se calentaron las muestras hasta 75°C durante 2 minutos inmediatamente antes de la electroforesis a través de gel de acrilamida al 20% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris– Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM. Se visualizaron los productos de las reacciones mediante el uso de un generador de imágenes fluorescentes FMBIO de Hitachi. En cada caso, el material de sonda sin cortar se hizo visible como una banda o una mancha negra intensa, habitualmente en la parte superior del panel, mientras que los productos deseados de la escisión de invasor específico se hicieron visibles como una o más bandas negras más estrechas, habitualmente en la parte inferior del panel. Bajo ciertas condiciones de reacción, particularmente aquéllas con concentraciones de sales elevadas, también se hace visible un producto de escisión secundario (generando así un doblete). Las escaleras de bandas grises más claras indican generalmente bien mordisqueado por exonucleasa del oligonucleótido sonda o ruptura de la sonda inespecífica inducida térmicamente.

La Fig. 37 representa el apareamiento del oligonucleótido sonda e invasor a regiones situadas a lo largo de la molécula diana M13mp18 (la cadena inferior). En la Fig. 37, sólo se muestra una parte de 52 nucleótidos de la molécula M13mp18; esta secuencia de 52 nucleótidos figura en la SEC ID N.º 31 (esta secuencia es idéntica tanto a M13mp18 como a M13mp19). El oligonucleótido sonda (cadena superior) contiene un marcador de amidita de Cy3 en el extremo 5': la secuencia de la sonda es 5'–AGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGT–3’ (SEC ID N.º 38). La negrita indica la presencia de una base modificada (2'–O–CH3). La amidita de Cy3 (Pharmacia) es una amidita de colorante de indodicarbocianina que se puede incorporar en cualquier posición durante la síntesis de los oligonucleótidos; el Cy3 es fluorescente en la región amarilla (máximo de excitación y emisión de 554 y 568, respectivamente). El oligonucleótido invasor (cadena media) tiene la siguiente secuencia: 5'– GCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGA–3’ (SEC ID N.º 39).

b) Valoración con KCl

La Fig. 38 muestra los resultados de variar la concentración de KCl en combinación con el uso de MnCl2 2mM, en una reacción estándar diferente. Las reacciones se realizaron por duplicado para confirmar las observaciones; las reacciones mostradas en los carriles 1 y 2 no contenían KCl, los carriles 3 y 4 contenían KCl a 5mM; los carriles 5 y 6 contenían KCl 25mM; los carriles 7 y 8 contenían KCl 50mM; los carriles 9 y 10 contenían KCl 100mM y los carriles 11 y 12 contenían KCl 200mM. Estos resultados muestran que la inclusión de KCl permite la generación de un producto de escisión específico. Aunque la señal más potente se observa a la concentración de KCl de 100mM, la especificidad de la señal en el resto de reacciones con KCl a o por encima de 25mM indica que se pueden seleccionar concentraciones pertenecientes a el intervalo completo (i.e., 25–200mM), si así se desea, para cualquier condición de reacción en particular.

Según lo mostrado en la Fig. 38, la reacción de escisión dirigida por un invasor requiere la presencia de sal (p. ej., KCl) para que tenga lugar una escisión eficaz. En otras reacciones, se ha encontrado que el KCl puede inhibir la actividad de ciertas enzimas Cleavase® cuando está presente a concentraciones superiores a aproximadamente 25mM (por ejemplo, en reacciones de escisión en las que se usa el oligonucleótido S–60 mostrado en la Fig. 26 en ausencia de cebador, la enzima BN Cleavase® pierde aproximadamente el 50% de su actividad en KCl 50mM). Por lo tanto, se examinó el uso de sales alternativas en la reacción de escisión dirigida por un invasor. En estos experimentos, se reemplazó el ión de potasio bien con Na o por Li–, o el ión cloruro fue reemplazado con ácido glutámico. El reemplazo del KCl con sales alternativas se describe a continuación en los apartados c–e.

c) Valoración con NaCI

Se usó NaCI en lugar de KCl a 75, 100, 150 ó 200mM, en combinación con el uso de MnCl2 2mM, en una reacción estándar diferente. Estos resultados mostraron que el NaCI se puede usar como sustituto del KCl en la reacción de escisión dirigida por un invasor, aportando una concentración similar resultados similares, (i.e., la presencia de NaCI, como de KCl, aumenta la acumulación de producto).

d) Valoración con LiCl

Se usó LiCl en lugar de KCl en reacciones estándar diferentes. Las concentraciones analizadas fueron LiCl 25, 50, 75, 100, 150 y 200mM. Los resultados demostraron que el LiCl se puede usar como un sustituto adecuado del KCl en la reacción de escisión dirigida por un invasor (i.e., la presencia de LiCl, como de KCl, aumenta la acumulación de producto), en concentraciones de aproximadamente 100mM o superiores.

e) Valoración con KGlu

Se examinaron los resultados de usar una sal de glutamato de potasio (KGlu) en lugar de la sal de cloruro usada más comúnmente (KCl) en reacciones llevadas a cabo en un intervalo de temperaturas. Se ha observado que el KGlu es una fuente salina muy eficaz para algunas reacciones enzimáticas, que muestra un intervalo de concentraciones más amplio que permite un máximo de actividad enzimática [Leirmo et al., (1987) Biochem. 26:2095]. Se comparó la capacidad del KGIu para facilitar el apareamiento de los oligonucleótidos sonda e invasor con el ácido nucleico diana con la del LiCl. En estos experimentos, las reacciones se ejecutaron durante 15 minutos, en lugar de durante los 20 minutos estándar, en reacciones estándar que sustituyeron el KCl por KGIu 200mM, 300mM o 400mM. Las reacciones se ejecutaron a 65°C, 67°C, 69°C o 71°C. Los resultados mostrados demost raron que el KGIu fue muy eficaz como sal en las reacciones de escisión invasiva, con una actividad completa aparente incluso a KGIu 400mM, aunque a la temperatura más baja, la escisión se redujo en aproximadamente el 30% con KGIu 300mM y en aproximadamente el 90% con KGIu 400mM.

f) Valoración con MnCl2 y MgCI2, y capacidad de reemplazar MnCl2 con MgCl2

En algunos casos, puede ser deseable realizar la reacción de escisión invasiva en presencia de Mg2–, bien además de o en lugar de Mn2– como el catión divalente necesario para la actividad de la enzima empleado. Por ejemplo, algunos procedimientos comunes para preparar ADN procedente de cultivos o tejidos bacterianos usan MgCl2 en soluciones que se usan para facilitar la recogida del ADN mediante precipitación. Además, se pueden usar las concentraciones elevadas (i.e., mayores de 5mM) de catión divalente para facilitar la hibridación de los ácidos nucleicos, del mismo modo que las sales monovalentes se usaron anteriormente, aumentando así la reacción de escisión invasiva. En este experimento, se examinó la tolerancia de la reacción de escisión invasiva a 1) para sustitución de MgCl2 por MnCl2 y para la capacidad de generar producto específico en presencia de concentraciones crecientes de MgCl2 y MnCl2.

La Fig. 39 muestra los resultados de bien variar la concentración de MnCl2 de 2mM a 8mM, de reemplazar el MnCl2 con MgCl2 de 2 a 4mM, o de usar estos componentes en combinación en una reacción estándar diferente. Las reacciones analizadas en los carriles 1 y 2 contenían MnCl2 y MgCl2 cada uno a 2mM; los carriles 3 y 4 contenían sólo MnCl2 2mM; los carriles 5 y 6 contenían MnCl2 3mM; los carriles 7 y 8 contenían MnCl2 4mM, y los carriles 9 y 10 contenían MnCl2 8mM. Las reacciones analizadas en los carriles 11 y 12 contenían MgCl2 2mM y los carriles 13 y 14 contenían MgCl2 4mM. Estos resultados muestran que tanto MnCl2 como MgCl2 se pueden usar como el catión divalente necesario para permitir la actividad de escisión de la enzima A/G Cleavase® en estas reacciones y que la reacción de escisión invasiva pueda tolerar un intervalo amplio de concentraciones de estos componentes.

Además de examinar los efectos del medio salino sobre la velocidad de acumulación del producto en la reacción de escisión invasiva, se examinó el uso de los constituyentes de la reacción cuya eficacia en aumentar la hibridación de ácidos nucleicos había sido observada bien en análisis de hibridación estándar (p. ej., hibridación de transferencia) o en reacciones de unión. Estos componentes pueden actuar como eliminadores de volumen, aumentando la concentración eficaz de los ácidos nucleicos de interés y aumentando así la hibridación, o pueden actuar como agentes de protección de la carga para minimizar la repulsión entre los esqueletos muy cargados de las cadenas de los ácidos nucleicos. Los resultados de estos experimentos se describen en los apartados g y h que se presentan a continuación.

g) Efecto de la adición de CTAB

El detergente policatiónico bromuro de cetiltrietilamonio (CTAB) ha mostrado que aumenta de manera espectacular la hibridación de los ácidos nucleicos [Pontius y Berg (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88:8237]. Se examinó el efecto de añadir el detergente CTAB en concentraciones de 100mM a 1mM a reacciones de escisión invasiva en las que se usó LiCl 150mM en lugar del KCl de otras reacciones estándar. Estos resultados mostraron que el CTAB 200mM puede tener un efecto potenciador muy moderado en estas condiciones de reacción, y que la presencia de CTAB en un exceso de aproximadamente 500 1M inhibió la acumulación de producto de escisión específico.

h) Efecto de la adición de PEG

Los inventores examinaron el efecto de añadir polietilenglicol (PEG) a concentraciones del 4,8 ó 12% (p/v) a reacciones estándar diferentes. Se examinaron los efectos de aumentar la temperatura de reacción de las reacciones que contenían PEG realizando las reacciones de valoración con PEG por duplicado a 61°C y 65°C. Los resultados probaron que a todos los porcentajes analizados, y a ambas temperaturas analizadas, la inclusión de PEG eliminó sustancialmente la producción de producto de escisión específico.

Además, se descubrió que la presencia de 1 x solución de Denhardt en la mezcla de reacción no tuvo ningún efecto negativo sobre la reacción de escisión [50 x solución de Denhardt contiene por cada 500 ml: 5 g de Ficoll; 5 g de polivinilpirrolidona; 5 g de ASB]. Además, se examinó la presencia de cada componente de solución de Denhardt individualmente (i.e., Ficoll solo, polivinilpirrolidona sola, ASB sola) en cuanto al efecto sobre la reacción de escisión dirigida por un invasor; no se observó ningún efecto adverso.

i) Efecto de la adición de agentes estabilizantes

Otro enfoque para aumentar la producción de la reacción de escisión invasiva consiste en aumentar la actividad de enzima empleada, bien aumentando su estabilidad en el medio de reacción o aumentando su velocidad de renovación. Sin tener en cuenta el mecanismo exacto mediante el cual diversos agentes funcionan en la reacción de escisión invasiva, se analizó un número de agentes usados comúnmente para estabilizar enzimas durante almacenamientos prolongados en cuanto a la capacidad de aumentar la acumulación de producto de escisión específico en la reacción de escisión invasiva.

Los inventores examinaron los efectos de añadir glicerol al 15% y de añadir los detergentes Tween–20 y Nonidet– P40 al 1,5%, solos o en combinación, en reacciones estándar diferentes. Los resultados demostraron que bajo estas condiciones, estos aductos tenían poco o ningún efecto cobre la acumulación de producto de escisión específico.

Se variaron los efectos de añadir gelatina a las reacciones en la identidad y la concentración de la sal con respecto a la reacción estándar. Los resultados demostraron que en ausencia de sal, la gelatina tenía un efecto moderadamente potenciador sobre la acumulación de producto de escisión específico, pero cuando se añadió cualquier sal (KCl o LiCl) a las reacciones llevadas a cabo en estas condiciones, las cantidades crecientes de gelatina redujeron la acumulación de producto.

j) Efecto de añadir grandes cantidades de ácido nucleico no diana

Al detectar secuencias de ácidos nucleicos específicas en las muestras, es importante determinar si la presencia de más material genético (i.e., ácidos nucleicos no diana) tendrá un efecto negativo sobre la especificidad del análisis. En este experimento, se examinó el efecto de incluir grandes cantidades de ácido nucleico no diana, bien de ADN o ARN, sobre la especificidad de la reacción de escisión invasiva. Se examinaron los datos para bien una modificación del sitio de escisión esperado o para un aumento de la degradación inespecífica del oligonucleótido sonda.

La Fig. 40 muestra los efectos de añadir ácido nucleico no diana (p. ej., ADN genómico o ARNt) a una reacción de escisión invasiva llevada a cabo a 65°C con LiCl 15 0mM en lugar del KCl de la reacción estándar. Las reacciones analizadas en los carriles 1 y 2 contenían 235 y 470 ng de ADN genómico, respectivamente. Las reacciones analizadas en los carriles 3, 4, 5 y 6 contenían 100 ng, 200 ng, 500 ng y 1 1g de ARNt, respectivamente. El carril 7 representa una reacción de control sin ácido nucleico añadido por encima de las cantidades usadas en la reacción estándar. Los resultados mostrados en la Fig. 40 demuestran que la inclusión de ácido nucleico no diana en grandes cantidades podría retardar visiblemente la acumulación de producto de escisión específico (aunque sin limitar la invención a un mecanismo concreto, se cree que el ácido nucleico adicional compite por la unión de la enzima con los componentes de reacción específicos). En otros experimentos, se descubrió que el efecto de añadir grandes cantidades de ácido nucleico no diana se puede compensar con el aumento de enzima en la reacción. Los datos mostrados en la Fig. 40 también demuestran que una característica clave de la reacción de escisión invasiva, la especificidad de la detección, no se vio comprometida por la presencia de grandes cantidades de ácido nucleico no diana.

Además de los datos presentados anteriormente, las reacciones de escisión invasiva se realizaron con tampón de succinato a un pH 5,9 en lugar del tampón de MOPS usado en la reacción “estándar”; no se observaron efectos adversos.

Los datos mostrados en las Fig. 38–40 y descritos anteriormente demuestran que la reacción de escisión invasiva se puede realizar usando una amplia variedad de condiciones de reacción y es, por tanto, adecuada para la práctica en laboratorios clínicos.

Ejemplo 19

Detección de dianas de ARN mediante la escisión dirigida por un invasor

Además de la necesidad clínica de detectar secuencias de ADN específicas para enfermedades infecciosas y genéticas, existe la necesidad de tecnologías que puedan detectar cuantitativamente los ácidos nucleicos diana que están compuestos por ARN. Por ejemplo, un número de agentes víricos, tales como el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tienen material genómico de ARN, cuya detección cuantitativa se puede usar como una medida de la carga vírica en una muestra de un paciente. Tal información puede ser un valor de diagnóstico y pronóstico fundamental.

La infección por el virus de la hepatitis C (VHC) es la causa predominante de la hepatitis no A, no B posterior a una transfusión (NANB) en todo el mundo. Además, el VHC es el principal agente etiológico del carcinoma hepatocelular (CHC) y la enfermedad crónica del hígado en todo el mundo. El genoma del VHC es una molécula de ARN pequeña (9,4 kb). En estudios de transmisión del VHC mediante transfusión sanguínea, se ha descubierto que la presencia de anticuerpo del VHC, medido en análisis inmunológicos estándar, no siempre está correlacionada con la infectividad de la muestra, mientras que la presencia de ARN del VHC en una muestra de sangre está fuertemente correlacionada con la infectividad. Por el contrario, los análisis serológicos pueden permanecer negativos en individuos infectados inmunosuprimidos, mientras que el ARN del VHC puede ser detectado fácilmente [J. A. Cuthbert (1994) Clin. Microbiol. Rev. 7:505].

La necesidad por y el valor del desarrollo de un análisis basado en sondas para la detección del ARN del VHC es evidente. Se ha usado la reacción en cadena de la polimerasa para detectar el VHC en muestras clínicas, pero los problemas asociados con la contaminación de transferencia de las muestras ha sido motivo de preocupación. La detección directa del ARN vírico sin la necesidad de realizar bien transcripción inversa o amplificación permitiría la eliminación de varios de los puntos en los que los análisis existentes pueden fallar.

El genoma del virus de la hepatitis C de ARN catenario positivo comprende varias regiones que incluyen regiones no codificantes 3’ y 5’ (i.e., regiones sin traducir 5’ y 3’) y una región codificante de poliproteínas que codifica la proteína del núcleo (C), dos glicoproteínas de la cubierta (E1 y E2/NS1) y seis glicoproteínas no estructurales (NS2–NS5b). El análisis biológico molecular del genoma del VHC ha mostrado que algunas regiones del genoma están muy altamente conservadas entre aislados, mientras que otras regiones varían con bastante rapidez. La región no codificante 5’ (RNC) es la región más altamente conservada del VHC. Estos análisis han permitido la división de estos virus en seis grupos genotípicos básicos y su posterior clasificación en más de una docena de subtipos [la nomenclatura y la división de los genotipos del VHC está evolucionando; véase Altamirano et al, J. Infect. Dis. 171:1034 (1995) para consultar un esquema de clasificación reciente].

Para desarrollar un procedimiento rápido y exacto de detección del VHC presente en individuos infectados, se examinó la capacidad de la reacción de escisión dirigida por un invasor para detectar el ARN del VHC. Se usaron plásmidos que contenían ADN derivado de la región sin traducir 5’ conservada de seis aislados de ARN del VHC diferentes con el fin de generar moldes para una transcripción in vitro. Las secuencias de VHC contenidas en estos seis plásmidos representan los genotipos 1 (cuatro subtipos representados: 1a, 1b, 1c y L1c), 2 y 3. La nomenclatura de los genotipos del VHC usada en la presente memoria es la de Simmonds et al., [según lo descrito en Altamirano et al., supra]. Se usó el subtipo L1c en la reacción de detección modelo descrita a continuación.

a) Generación de plásmidos que contienen secuencias del VHC

Se generaron seis fragmentos de ADN derivados del VHC mediante RT–PCR usando ARN extraído de muestras de suero de donantes de sangre; estos fragmentos de la PCR fueron cedidos por el Dr. M. Altamirano (University of British Columbia, Vancouver). Estos fragmentos de la PCR representan las secuencias de VHC derivadas de los genotipos del VHC 1a, 1b, 1c, L1c, 2c y 3a.

La extracción del ARN, la transcripción inversa y la PCR se realizaron usando técnicas estándar (Altamirano et al, supra). En síntesis, se extrajo ARN de 100 1l de suero usando isotiocianato de guanidina, laurel sarcosato de sodio y fenol–cloroformo [Inchauspe et al, Hepatology 14:595 (1991)]. La transcripción inversa se realizó según las instrucciones del fabricante usando un equipo de la PCR para ARN de transcriptasa inversa de rTh GeneAmp (Perkin–Elmer) en presencia de un cebador externo antisentido, HCV342. La secuencia del cebador HCV342 es 5’– GGTTTTTCTTTGAGGTTTAG–3’ (SEC ID N.º 40). Tras la terminación de la reacción a TA, se añadieron el cebador sentido HCV7 [5'–GCGACACTCCACCATAGAT–3’] (SEC ID N.º 41)] y magnesio, y se realizó una primera PCR. Se usaron alícuotas de los primeros productos de la PCR en una segunda PCR (anidada) en presencia de los cebadores HCV46 [5'–CTGTCTTCACGCAGAAAGC–3’ (SEC ID N.º 42)] y HCV308 [5'–GCACGGT CTACGAGACCTC–3’ (SEC ID N.º 43)]. Las PCR produjeron un producto de 281 pb que se corresponde con una región no codificante 5’ conservada (RNC) del VHC entre las posiciones –284 y –4 del genoma del VHC (Altamirano et al, supra).

Los seis fragmentos de la PCR de 281 pb se usaron directamente para la clonación o se sometieron a una etapa de amplificación más usando una PCR de 50 1l que comprendía aproximadamente 100 fmoles de ADN, los cebadores HCV46 y HCV308 a 0,1 1M, 100 1M de los cuatro dNTP y 2,5 unidades de ADN polimerasa de Taq en un tampón que contenía Tris–HCl 10mM, pH 8,3; KCl 50mM; MgCl2 1,5mM y Tween 20 al 0,1%. Se realizaron 25 ciclos de la PCR a 96°C durante 45 s, a 55°C durante 45 s y a 72° C durante 1 min. Se usaron dos microlitros de bien las muestras de ADN originales o de los productos de la PCR reamplificados para la clonación en el vector de T pT7Blue lineal (Novagen) según el protocolo del fabricante. Tras unir los productos de la PCR al vector de T pT7Blue, se usó la mezcla de reacción de unión para transformar células JM109 competentes (Promega). Se seleccionaron clones que contenían el vector de T pT7Blue con un inserto por la presencia de colonias que tenían un color blanco sobre placas de LB que contenían 40 1g/ml de X–Gal, 40 1g/ml de IPTG y 50 1g/ml de ampicilina. Se recogieron cuatro colonias para cada muestra de la PCR y se cultivaron durante una noche en 2 ml de medio de LB que contenía 50 1g/ml de carbenicilina. Se aisló ADN de plásmido usando el siguiente protocolo de minipreparación alcalina. Se recogieron células de 1,5 ml del cultivo de una noche mediante centrifugación durante 2 min en un microcentrifugador (14K rpm), se desechó el sobrenadante y se volvieron a suspender los sedimentos celulares en 50 1l de tampón de TE con 10 1g/ml de RNasa A (Pharmacia). Se añadieron cien microlitros de una solución que contenía NaOH 0,2N, SDS al 1% y se lisaron las células durante 2 min. Se mezcló suavemente el lisado con 100 1l de acetato de potasio 1,32M, pH 4,8, y se centrifugó la mezcla durante 4 min en un microcentrifugador (14K rpm), desechándose los sedimentos que comprendían residuos celulares. Se precipitó ADN de plásmido procedente del sobrenadante con 200 1l de etanol y se sedimentó mediante centrifugación en un microcentrifugador (14K rpm). Se secaron al aire los sedimentos de ADN durante 15 min y luego se volvieron a disolver en 50 1l de tampón de TE (Tris–HCl 10mM, pH 7,8, EDTA 1mM).

b) Reamplificación de clones del VHC para añadir el promotor de fago T7 para la posterior transcripción in vitro

Para garantizar que el producto de transcripción de ARN tuviera un extremo 3' diferenciado, fue necesario crear moldes de transcripción lineales que se detuvieran al final de la secuencia del VHC. Estos fragmentos fueron producidos convenientemente usando la PCR para reamplificar el segmento del plásmido que contenía la secuencia del promotor de fago y el inserto de VHC. Para estos estudios, se reamplificó el clon del tipo de VHC L1c usando un cebador que se hibridara con la secuencia del promotor de T7: 5'–TAATACGACTCACTATAGGG–3' (SEC ID N.º 44; “el cebador del promotor de T7” (Novagen) en combinación con el cebador específico del VHC del terminal 3’ HCV308 (SEC ID N.º 43). Para estas reacciones, se reamplificó 1 1l de ADN de plásmido (aproximadamente 10 a 100 ng) en una PCR de 200 1l usando cebadores de T7 y HCV308 según lo descrito anteriormente con la excepción de que se emplearon 30 ciclos de amplificación. El amplicón resultante tenía una longitud de 354 pb. Tras la amplificación, se transfirió la mezcla de la PCR a un nuevo tubo de microcentrifugación de 1,5 ml, se llevó la mezcla hasta una concentración final de NH4OAc 2M y se precipitaron los productos mediante la adición de un volumen de isopropanol al 100%. Tras una incubación de 10 min a temperatura ambiente, se recogieron los precipitados por centrifugación, se lavaron una vez con etanol al 80% y se secaron al vacío. Se disolvió el material recogido en 100 1l de agua destilada libre de nucleasa (Promega).

Los segmentos de ARN se produjeron desde este amplicón mediante transcripción in vitro usando el sistema de producción de ARN a gran escala RiboMAX™(Promega) según las instrucciones del fabricante, usando 5,3 1g del amplicón descrito anteriormente en una reacción de 100 1l. La reacción de transcripción se incubó durante 3,75 horas, tras lo que se destruyó el molde de ADN mediante la adición de 5–6 1l ADNasa libre de RNasa RQ1 (1 unidad/1l) según las instrucciones del equipo RiboMAXTM. Se extrajo la reacción dos veces con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (50:48:2) y se transfirió la fase acuosa a un nuevo tubo de microcentrifugación. Entonces se recogió el ARN mediante la adición de 10 1l de NH4OAc 3M, pH 5,2 y 110 1l de isopropanol al 100%. Tras una incubación de 5 min a 4°C, se recogió el p recipitado por centrifugación, se lavó una vez con etanol al 80% y se secó al vacío. La secuencia del transcripto de ARN resultante (transcripto VHC1.1) figura en la SEC ID N.º 45.

c) Detección del transcripto VHC1.1 en el análisis de la escisión dirigida por un invasor

Se analizó la detección del transcripto VHC1.1 en el análisis de la escisión dirigida por un invasor usando un oligonucleótido sonda específico del VHC [5'–CCGGTCGTCCTGGCAATXCC–3’ (SEC ID N.º 46): la X indica la presencia de un colorante de fluoresceína sobre un ligador abásico) y un oligonucleótido invasor específico del VHC [5'–GTTTATCCAAGAAAGGACCCGGTC–3’ (SEC ID N.º 47)] que provoca la escisión invasiva del nucleótido 6 de la sonda.

Cada 10 1l de mezcla de reacción comprendía 5 pmoles del oligonucleótido sonda (SEC ID N.º 46) y 10 pmoles del oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 47) en un tampón de MOPS 10mM, pH 7,5 con KCl 50mM; MnCl2 4mM; Tween– 20 y Nonidet–P40 cada uno al 0,05% y 7,8 unidades de inhibidor de la ribonucleasa RNasin® (Promega). Los agentes de escisión empleados fueron A/G Cleavase® (usada a 5,3 ng/10 1l de reacción) o ADNpTth (usada a 5 unidades de polimerasa/10 1l de reacción). Se varió la cantidad de diana de ARN según lo indicado a continuación. Cuando está indicado el tratamiento con RNasa, se pre–trataron los ARN diana con 10 1g de RNasa A (Sigma) a 37°C durante 30 minutos, para demostrar que la dete cción era específica del ARN de la reacción y no se debía a la presencia de ningún molde de ADN residual procedente de la reacción de transcripción. Las alícuotas tratadas con RNasa del ARN del VHC fueron usadas directamente sin una purificación.

Para cada reacción, se suspendieron los ARN diana en las soluciones de reacción según lo descrito anteriormente, pero sin el agente de escisión y el MnCl2 para un volumen final de 10 1l, con el invasor y la sonda a las concentraciones que figuran anteriormente. Se calentaron las reacciones hasta 46°C y las reacciones se iniciaron mediante la adición de una mezcla de la enzima apropiada con MnCl2. Tras la incubación durante 30 min a 46°C, se detuvieron las reacciones mediante la adición de 8 1l de formamida al 95%; EDTA 10mM y violeta de metilo al 0,02% (tampón de carga de violeta de metilo). Entonces se resolvieron las muestras mediante electroforesis a través de gel de poliacrilamida desnaturalizante al 15% (entrecruzamiento de 19:1) que contenía urea 7M, en un tampón de Tris–Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM. Tras la electroforesis, se visualizaron los productos de reacción marcados usando un analizador de imágenes FMBIO–100 (Hitachi), mostrándose el barrido del generador de imágenes resultante en la Fig. 41.

En la Fig. 41, las muestras analizadas en los carriles 1–4 contenían 1 pmol de diana de ARN, las reacciones mostradas en los carriles 5–8 contenían 100 fmoles de la diana de ARN y las reacciones mostradas en los carriles 9–12 contenían 10 fmoles de la diana de ARN. Todas los carriles con número impar representan las reacciones llevadas a cabo usando la enzima A/G Cleavase® y todas los carriles con número par representan las reacciones llevadas a cabo usando ADNpTth. Las reacciones analizadas en los carriles 1, 2, 5, 6, 9 y 10 contenían ARN que había sido digerido previamente con RNasa A. Estos datos demuestran que la reacción de escisión invasiva detecta eficazmente las dianas de ARN y además, la ausencia de cualquier señal de escisión específica en las muestras tratadas con RNasa confirma que el producto de escisión específico observado en el resto de vías es dependiente de la presencia de ARN de entrada.

Ejemplo 20

El destino del ARN diana en la reacción de escisión dirigida por un invasor

En este ejemplo, se examinó el destino de la diana de ARN en la reacción de escisión dirigida por un invasor. Como se muestra anteriormente en el ejemplo 1D, cuando los ARN se hibridan con oligonucleótidos de ADN, las nucleasas 5' asociadas con ADN polimerasas se pueden usar para escindir los ARN, pudiéndose suprimir tal escisión cuando el brazo 5’ es largo o cuando está muy estructurado [Lyamichev et al., (1993) Science 260:778 y la patente estadounidense n.º 5.422.253, cuya revelación se incorpora en la presente memoria por referencia]. En este experimento, se examinó el grado hasta el que la diana de ARN sería escindida por los agentes de escisión cuando estuviera hibridada a los oligonucleótidos de detección (i.e., el oligonucleótido sonda e invasor) usando reacciones similares a aquéllas descritas en el ejemplo 20, realizadas usando ARN marcado con fluoresceína como diana.

Las reacciones de transcripción se llevaron a cabo según lo descrito en el ejemplo 19 con la excepción de que el 2% de UTP de la reacción fue reemplazado con fluoresceína–12–UTP(Boehringer Mannheim) y que se usaron 5,3 1g del amplicón en una reacción de 100 1l. La reacción de transcripción se incubó durante 2,5 horas, tras lo que se destruyó el molde de ADN mediante la adición de 5–6 µl ADNasa libre de RNasa RQ1 (1 unidad/µl) según las instrucciones del equipo RiboMAX™. Se omitió la extracción orgánica y se recogió el ARN mediante la adición de 10 1l de NaOAc 3M, pH 5,2 y 110 1l de isopropanol al 100%. Tras una incubación de 5 min a 4°C, se recogió el precipitado por centrifugación, se lavó una vez con etanol al 80% y se secó al vacío. Se disolvió el ARN resultante en 100 1l de agua libre de nucleasas. Se purificó el 50% de la muestra mediante electroforesis a través de gel de poliacrilamida desnaturalizante al 8% (entrecruzamiento de 19:1) que contenía urea 7M, en un tampón de Tris– Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM. Se separó una porción de gel que contenía el material de longitud completa y se eluyó el ARN empapando la porción durante una noche a 4°C en 200 1l de Tris–Cl 10mM, pH 8,0; EDTA 0,1mM y NaOAc 0,3M. Entonces se precipitó el ARN mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Tras una incubación a –20°C durante 30 min, se recogieron lo s precipitados por centrifugación, se lavaron una vez con etanol al 80% y se secaron al vacío. Se disolvió el ARN en 25 1l de agua libre de nucleasas y luego se cuantificó mediante absorbancia UV a 260 nm.

Se incubaron las muestras de diana de ARN purificado durante 5 ó 30 min en reacciones que duplicaban las reacciones con invasor de A/G Cleavase® y ADNpTth descritas en el ejemplo 20 a excepción de que las reacciones carecían de oligonucleótidos sonda e invasor. Los análisis posteriores de los productos mostraron que el ARN era muy estable, apareciendo un fondo muy claro de degradación inespecífica como un fondo gris en el carril de gel. El fondo no dependía de la presencia de la enzima en la reacción.

Las reacciones de detección de invasor en las que se usó la diana de ARN purificado se realizaron usando el par de sonda/invasor descrito en el ejemplo 19 (SEC ID N.º 46 y 47). Cada reacción incluía 500 fmoles del ARN diana, 5 pmoles de la sonda marcada con fluoresceína y 10 pmoles del oligonucleótido invasor en un tampón de MOPS 10mM, pH 7,5 con LiCl 150mM; MnCl2 4mM; Tween–20 y Nonidet–P40 cada uno al 0,05% y 39 unidades de RNAsin® (Promega). Se combinaron estos componentes y se calentaron hasta 50°C y se iniciaron las reaccio nes mediante la adición de bien 53 ng de A/G Cleavase® o de 5 unidades de polimerasa de ADNpTth. El volumen final fue de 10 1l. Tras 5 min a 50°C, se retiraron alícuotas de 5 1l de cada reacción a tubos que contenían 4 1l de formamida al 95%, EDTA 10mM y violeta de metilo al 0,02%. La alícuota restante recibió una gota de barrera contra la evaporación ChillOut® y se incubó durante 25 min más. Entonces se detuvieron estas reacciones mediante la adición de 4 1l de la solución de formamida anterior. Se resolvieron los productos de estas reacciones mediante electroforesis a través de gel de poliacrilamida desnaturalizante al 20% (entrecruzamiento de 19:1) que contenía urea 7M, en un tampón de Tris–Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM. Tras la electroforesis, se visualizaron los productos de reacción marcados usando un analizador de imágenes FMBIO–100 (Hitachi), mostrándose el barrido del generador de imágenes resultante en la Fig. 42A (reacciones de 5 min) y 42B (reacciones de 30 min).

En la Fig. 53, el ARN diana se observa muy cerca de la parte superior de cada vía, mientras que la sonda marcada y sus productos de escisión se observan justo debajo de la mitad de cada panel. Se usó el analizador de imágenes FMBIO–100 para cuantificar la señal de fluorescencia en las bandas de sonda. En cada panel, el carril 1 contiene productos de las reacciones llevadas a cabo en ausencia de un agente de escisión, el carril 2 contiene productos procedentes de las reacciones llevadas a cabo usando A/G Cleavase® y el carril 3 contiene los productos procedentes de las reacciones llevadas a cabo usando ADNpTth.

La cuantificación de la señal de fluorescencia en las bandas de sonda reveló que, tras una incubación de 5 min, el 12% o 300 fmoles de la sonda fueron escindidos por la A/G Cleavase® y el 29% o 700 fmoles fueron escindidos por la ADNpTth. Tras una incubación de 30 min, la A/G Cleavase® había escindido el 32% de las moléculas de sonda y la ADNpTth había escindido el 70% de las moléculas de sonda. (Las imágenes mostradas en las Fig. 42A y 42B fueron impresas con un ajuste de la intensidad para mostrar la pequeña cantidad de fondo procedente de la degradación del ARN, por lo que las bandas que contienen señales potentes están saturadas y por tanto estas imágenes no reflejan exactamente las diferencias en la medida de fluorescencia).

Los datos mostrados en la Fig 42 muestran claramente que, en condiciones de escisión invasiva, las moléculas de ARN son suficientemente estables para ser detectadas como una diana y que cada molécula de ARN puede soportar muchas series de escisión de sonda.

Ejemplo 21

Valoración del ARN diana en el análisis de la escisión dirigida por un invasor

Uno de los principales beneficios del análisis de la escisión dirigida por un invasor como medio de detección de la presencia de ácidos nucleicos diana específicos es la correlación entre la cantidad de producto de escisión generado en una determinada cantidad de tiempo y la cantidad del ácido nucleido de interés presente en la reacción. Los beneficios de la detección cuantitativa de las secuencias de ARN se trataron en el ejemplo 19. En este ejemplo, se demostró la naturaleza cuantitativa del análisis de detección a través del uso de diversas cantidades de material inicial diana. Además de demostrar la correlación entre las cantidades de diana de entrada y el producto de escisión de salida, estos datos muestran gráficamente el grado hasta el que se puede reciclar la diana de ARN en este análisis.

La diana de ARN usada en estas reacciones era el material marcado con fluoresceína descrito en el ejemplo 20 (i.e., SEC ID N.º 45). Como no se conocía la eficacia de la incorporación del fluoresceína–12–UTP mediante la ARN polimerasa de T7, se determinó la concentración del ARN midiendo la absorbancia a 260 nm, no mediante la intensidad de la fluorescencia. Cada reacción comprendía 5 pmoles del sonda marcada con fluoresceína (SEC ID N.º 46) y 10 pmoles del oligonucleótido invasor (SEC ID N.º 47) en un tampón de MOPS 10mM, pH 7,5 con LiCl 150mM; MnCl2 4mM; Tween–20 y Nonidet–P40 cada uno al 0,05% y 39 unidades de RNasin® (Promega). Se varió la cantidad de ARN diana de 1 a 100 fmoles, según lo indicado a continuación. Se combinaron estos componentes, se recubrieron con barrera contra la evaporación ChillOut® y se calentaron hasta 50°C; las reacciones se iniciaron mediante la adición de bien 53 ng de la A/G Cleavase® o 5 unidades de polimerasa de ADNpTth hasta un volumen de reacción final de 10 1l. Tras 30 minutos a 50°C, se detuvieron las reacci ones mediante la adición de 8 1l de formamida al 95%, EDTA 10mM y violeta de metilo al 0,02%. Los marcadores sin reaccionar de los carriles 1 y 2 se diluyeron en el mismo volumen total (18 1l). Se calentaron las muestras hasta 90°C durante 1 minuto y se resolvieron 2,5 1l de cada una de estas reacciones mediante electroforesis a través de gel de poliacrilamida desnaturalizante al 20% (entrecruzamiento de 19:1) con urea 7M y un tampón de Tris–Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM, y se visualizaron los productos de reacción macados usando un analizador de imágenes FMBIO–100 (Hitachi), mostrándose el barrido del generador de imágenes resultante en la Fig. 43.

En la Fig. 43, los carriles 1 y 2 muestran 5 pmoles de sonda sin cortar y 500 fmoles de ARN sin tratar, respectivamente. La sonda es la señal muy oscura que se observa cerca de la mitad del panel, mientras que el ARN es la línea fina observada cerca de la parte superior del panel. Se transcribieron estos ARN con una sustitución del 2% de fluoresceína–12–UTP para el UTP natural en la reacción de transcripción. El transcripto resultante contiene 74 residuos de U, que aportarían una media de 1,5 marcadores de fluoresceína por cada molécula. Con un décimo de la cantidad molar del ARN marcado en el carril 2, la señal del carril 2 debería ser de aproximadamente un séptimo (x 0,15) de la intensidad de la fluorescencia de la sonda del carril 1. Las medidas indicaron que la intensidad era más cercana a una cuadragésima parte, lo que indica una eficacia de la incorporación del marcador del aproximadamente 17%. Como la concentración de ARN fue verificada mediante la medida de A260, ésta no altera las siguientes observaciones experimentales, pero debería señalarse que la señal procedente del ARN y de las sondas no refleja con exactitud las cantidades relativas de las reacciones.

Las reacciones analizadas de los carriles 3 a 7 contenían 1, 5, 10, 50 y 100 fmoles de diana, respectivamente, realizándose la escisión de la sonda con A/G Cleavase®. Las reacciones analizadas en los carriles 8 a 12 repitieron la misma serie de cantidades de diana, estando la escisión de la sonda realizada por ADNpTth. Los recuadros que rodean las bandas de producto muestran la superficie del barrido en la que se midió la fluorescencia para cada reacción. El número de unidades de fluorescencia detectado en cada recuadro se indica bajo cada uno; también se midió la fluorescencia de fondo.

Se puede observar mediante la comparación de la fluorescencia detectada en cada vía que la cantidad de producto formado en estas reacciones de 30 minutos puede guardar correlación con la cantidad de material diana. La acumulación de producto en estas condiciones es aumentada ligeramente cuando se usa ADNpTth como agente de escisión, pero la correlación con la cantidad de diana presente permanece constante. Esto demuestra que el análisis con invasor se puede usar como un medio de medición de la cantidad de ARN diana de una muestra.

La comparación de la intensidad de la fluorescencia del ARN de entrada con la del producto escindido muestra que el análisis de la escisión dirigida por un invasor crea señal en exceso con respecto a la cantidad de diana, tal que la señal visible como sonda escindida es mucho más intensa que la que representa el ARN diana. Esto confirma además los resultados descritos en el ejemplo 20, en el que se demostró la posibilidad de usar cada molécula de ARN muchas veces.

Ejemplo 22

Detección de ADN mediante inversión de la carga

La detección de dianas específicas se consigue en el análisis de la escisión dirigida por un invasor mediante la escisión del oligonucleótido sonda. Además de los procedimientos descritos en los ejemplos anteriores, es posible separar la sonda escindida de la sonda sin escindir usando la técnica de inversión de la carga que se describe a continuación. Esta nueva técnica de separación se refiere a la observación de que los aductos cargados positivamente pueden afectar al comportamiento electroforético de oligonucleótidos pequeños, porque la carga del aducto es significativa en relación con la carga del complejo total. En la bibliografía se han publicado observaciones de la movilidad anómala debida a los aductos cargados, pero en todos los casos descubiertos, las aplicaciones buscadas por otros científicos han implicado alargar los oligonucleótidos mediante prolongación enzimática. A medida que se van añadiendo los nucleótidos cargados negativamente, se va reduciendo la influencia positiva del aducto hasta que se vuelve irrelevante. Como resultado de ello, los aductos cargados positivamente han sido descartados, pasando a recibir una atención mínima en la bibliografía existente.

Este efecto observado es de particular utilidad en los análisis basados en la escisión de moléculas de ADN. Cuando se acorta un oligonucleótido mediante la acción de una enzima Cleavase® u otro agente de escisión, se puede formar la carga positiva no sólo hasta reducir significativamente la carga negativa neta, sino hasta, en realidad, anularla, “dando la vuelta” eficazmente a la carga neta de la entidad marcada. Esta inversión de la carga permite la separación de los productos de escisión de diana específica de la sonda sin escindir mediante procedimientos extremadamente sencillos. Por ejemplo, se puede hacer que los productos de escisión emigren hacia un electrodo negativo colocado en cualquier punto de una cuba de reacción, para una detección focalizada sin electroforesis basada en gel. Cuando se usa una lámina de gel, los pocillos de muestras se pueden colocar en el centro del gel, tal que sea posible observar la emigración de las sondas escindidas y sin escindir en sentidos opuestos. Alternativamente, se puede usar un gel vertical tradicional, pero con los electrodos invertidos con respecto a los geles de ADN habituales (i.e., el electrodo positivo en la parte superior y el electrodo negativo en la inferior) tal que las moléculas escindidas entren en el gel, mientras que las no escindidas se dispersen en el depósito superior del tampón de electroforesis.

Otro beneficio de este tipo de lectura es que la naturaleza absoluta de la separación de los productos se los sustratos significa que es posible suministrar una abundancia de sonda sin escindir para conducir la etapa de hibridación del análisis basado en una sonda, aunque se puede restar la sonda no consumida del resultado para reducir el fondo.

Mediante el uso de múltiples aductos cargados positivamente, se pueden construir las moléculas sintéticas con una modificación suficiente como para que la cadena cargada negativamente normalmente se vuelva casi neutra. Cuando se construye así, la presencia o la ausencia de un solo grupo fosfato puede significar la diferencia entre una carga negativa neta o una carga positiva neta. Esta observación tiene una utilidad particular cuando uno de los objetivos es diferenciar entre los fragmentos de ADN generados enzimáticamente, que carecen de un fosfato 3’, y los productos de degradación térmica, que conservan un fosfato 3’ (y así dos cargas negativas más).

a) Caracterización de los productos de la ruptura térmica de los oligonucleótidos de ADN

La degradación térmica de las sondas de ADN da como resultado un fondo elevado que puede oscurecer las señales generadas por la escisión enzimática específica, disminuyendo la proporción de señal con respecto al ruido. Para comprender mejor la naturaleza de los productos de la degradación térmica del ADN, se incubaron los oligonucleótidos marcados con tetracloro–fluoresceína (TET) en 5’ 78 (SEC ID N.º 48) y 79 (SEC ID N.º 49) (100 pmoles de cada uno) en 50 1l de NaCO3 10mM (pH 10,6), NaCI 50mM a 90°C durante 4 horas. Para evitar la evaporación de las muestras, se cubrió la mezcla de reacción con 50 1l de cera líquida ChillOut®. Se dividieron las reacciones en dos alícuotas iguales (A y B). Se mezcló la alícuota A con 25 1l de tampón de carga de violeta de metilo y se desfosforiló la alícuota B mediante la adición de 2,5 1l de MgCl2 100mM y 1 1l de 1 unidad/1l de fosfatasa alcalina intestinal bovina (CIAP) (Promega), con la incubación a 37°C durante 30 min, tras lo que se aña dieron 25 1l de tampón de carga de violeta de metilo. Se resolvió un microlitro de cada muestra mediante electroforesis a través de gel desnaturalizante de poliacrilamida al 12% y se generaron imágenes según lo descrito en el ejemplo 21; se usó un filtro de 585 nm con el analizador de imágenes de FMBIO. En la Fig. 44, se muestra el barrido del generador de imágenes resultante.

En la Fig. 44, los carriles 1–3 contienen el oligonucleótido marcado con TET 78 y los carriles 4–6 contienen el oligonucleótido marcado con TET 79. Los carriles 1 y 4 contienen los productos de reacciones que no fueron tratados térmicamente. Los carriles 2 y 5 contienen productos de reacciones que fueron tratados térmicamente y los carriles 3 y 6 contienen productos de las reacciones que fueron tratados térmicamente y sometidos a un tratamiento con fosfatasa.

Según lo mostrado en la Fig. 44, el tratamiento térmico provoca una ruptura significativa del ADN marcado con TET en 5’, generando una escalera de productos de degradación (Fig. 44, vías 2, 3, 5 y 6). Las intensidades de banda guardan correlación con el posicionamiento de las bases de purina y pirimidina en las secuencias de oligonucleótidos, lo que indica que se puede producir la hidrólisis del esqueleto mediante la formación de productos intermedios abásicos que tengan velocidades mayores para las purinas que para las pirimidinas [Lindahl and Karlström (1973) Biochem. 12:5151].

La desfosforilación disminuye la movilidad de todos los productos generados mediante el procedimiento de degradación térmica, observándose el efecto más pronunciado para los productos más cortos (Fig. 44, vías 3 y 6). Esto demuestra que los productos degradados térmicamente poseen un grupo fosforilo terminal en el extremo 3' que se puede retirar mediante la desfosforilación con CIAP. La eliminación del grupo fosforilo disminuye la carga negativa total entre 2. Por lo tanto, los productos más cortos que tienen un número pequeño de cargas negativas son influidos en mayor grado tras la eliminación de dos cargas. Esto conduce a un mayor desplazamiento de la movilidad en los productos más cortos que el observado para las especies de mayor tamaño.

El hecho de que la mayoría de los productos de ADN degradados térmicamente contengan grupos fosfato en el extremo 3' y productos generados por enzimas Cleavase® no permitió el desarrollo de procedimientos de aislamiento sencillos para los productos generados en el análisis de la escisión dirigida por un invasor. Las dos cargas extra encontradas en los productos de ruptura térmica no existen en los productos de escisión específica. Por lo tanto, si se diseñan análisis que generan productos específicos que contienen una carga positiva neta de uno o dos, entonces los productos de ruptura térmica similares serán bien negativos o neutros. Se puede usar la diferencia para aislar productos específicos mediante procedimientos de inversión de la carga según lo mostrado a continuación.

b) La desfosforilación de oligonucleótidos amino–modificados cortos puede invertir la carga neta del producto marcado

Para demostrar cómo se pueden transformar oligonucleótidos de compuestos de carga negativa neta a compuestos de carga positiva neta, se sintetizaron los cuatro oligonucleótidos amino–modificados cortos marcados como 70, 74, 75 y 76 y mostrados en las Fig. 45–47 (la Fig. 45 muestra ambos oligonucleótidos 70 y 74). Los cuatro oligonucleótidos modificados poseen colorantes de Cy–3 colocados en el extremo 5’ que están individualmente cargados positivamente en las condiciones de reacción y aislamiento descritas en este ejemplo. Los compuestos 70 y 74 contienen dos timidinas amino–modificadas que, en condiciones de reacción, presentan grupos R–NH3+ cargados positivamente unidos en la posición del carbono 5 a través de un ligador del carbono de 10 ó 6 átomos, respectivamente. Como los compuestos 70 y 74 están fosforilados en el extremo 3’, constan de cuatro cargas negativas y tres cargas positivas. El compuesto 75 difiere del 74 en que el fosfato de timidina amino–modificado del carbono 6 interno de 74 está reemplazado por un metilfosfonato de timidina. El esqueleto del fosfonato no tiene carga, por lo que hay un total de tres cargas negativas en el compuesto 75. Esto proporciona al compuesto 75 una carga neta negativa de uno. El compuesto 76 difiere del 70 en que la timidina amino–modificada interna está reemplazada por un fosfonato de citosina interno. La pKa del nitrógeno N3 de la citosina puede ser de 4 a 7. De este modo, las cargas netas de este compuesto pueden ser desde –1 a 0 en función del pH de la solución. Para simplificar el análisis, se asigna a cada grupo un número entero de cargas, aunque se sabe que, en función de la pKa de cada grupo químico y del pH ambiental, la carga real puede diferir del número entero asignado. Se supone que esta diferencia no es significativa en el intervalo de pH usado en las reacciones enzimáticas estudiadas aquí.

La desfosforilación de estos compuestos, o la eliminación del grupo fosforilo terminal del extremo 3', dan como resultado la eliminación de dos cargas negativas y genera productos que tienen una carga positiva neta de uno. En este experimento, se usó el procedimiento de isoelectroenfoque (IEF) para demostrar un cambio de la carga neta negativa de uno a la neta positiva de uno para los sustratos descritos durante la desfosforilación.

Se sintetizaron los sustratos 70, 74, 75 y 76 mediante químicas de fosforamiditas estándar y se desprotegieron durante 24 horas a 22°C en solución de hidróxido de amonio acuoso 14M, tras lo que se eliminó el disolvente al vacío. Se volvieron a suspender los polvos secos en 200 1l de H2O y se filtraron a través de filtros de 0,2 1m. Se estimó la concentración de las soluciones madre mediante absorbancia en UV a 261 nm de las muestras diluidas 200 veces en H2O usando un espectrofotómetro (Spectronic Genesys 2, Milton Roy, Rochester, NY).

La desfosforilación de los compuestos 70 y 74, 75 y 76 se realizó tratando 10 1l de las soluciones madre crudas (variando en concentración de aproximadamente 0,5 a 2mM) con 2 unidades de CIAP en 100 1l de tampón de CIAP (Promega) a 37°C durante 1 hora. Entonces se calenta ron las reacciones hasta 75°C durante 15 min para d esactivar el CIAP. Para mayor claridad, los compuestos desfosforilados se denominan “dp”. Por ejemplo, tras la desfosforilación, el sustrato 70 se convierte en 70dp.

Para preparar muestras para los experimentos de IEF, se ajustó la concentración de las soluciones madre de sustrato y producto desfosforilado hasta una absorbancia uniforme de 8,5 x 10–3 a 532 nm mediante dilución con agua. Se analizaron dos microlitros de cada muestra mediante IEF usando una unidad de electroforesis PhastSystem (Pharmacia) y medio 3–9 para IEF PhastGel (Pharmacia) según el protocolo del fabricante. La separación se realizó a 15°C con el siguiente progr ama: pre–serie: 2.000 V; 2,5 mA; 3,5 W, 75 Vh; carga; 200 V; 2,5 mA; 3,5 W; 15 Vh; serie: 2.000 V: 2,5 mA; 3,5 W; 130 Vh. Tras la separación, se visualizaron las muestras usando el analizador de imágenes de FMBIO (Hitachi) equipado con un filtro de 585 nm. En la Fig. 48, se muestra el barrido del generador de imágenes resultante.

La Fig. 48 muestra los resultados de la separación por IEF de los sustratos 70, 74, 75 y 76, y sus productos desfosforilados. La flecha marcada con “posición de carga de la muestra” indica una línea de carga; el signo “+” muestra la posición del electrodo positivo y el signo “–“indica la posición del electrodo negativo.

Los resultados mostrados en la Fig. 48 demuestran que los sustratos 70, 74, 75 y 76 emigraron hacia el electrodo positivo, mientras que los productos desfosforilados 70dp, 74dp, 75dp y 76dp emigraron hacia el electrodo negativo. Las diferencias observadas en cuanto al sentido de la movilidad coincidieron con la carga neta predicha de los sustratos (menos uno) y los productos (más uno). Las pequeñas perturbaciones en las movilidades de los compuestos fosforilados indican la variación de los pl totales. Esto también se cumplió para los compuestos desfosforilados. La presencia de la citosina en el 76dp, por ejemplo, movió este compuesto más hacia el electrodo negativo, lo que indicó un mayor pl total en relación con el resto de compuestos desfosforilados. Es importante observar que se pueden obtener más cargas positivas usando una combinación de las bases amino–modificadas naturales (70dp y 74dp) junto con puentes de metilfosfonato sin carga (productos 75dp y 76dp).

Los resultados mostrados anteriormente demuestran que la eliminación de un solo grupo fosfato puede dar la vuelta a la carga neta de un oligonucleótido para provocar una inversión en un campo eléctrico, facilitando la separación de productos, y que la composición exacta de las bases de los oligonucleótidos afecta a la movilidad absoluta, pero no al efecto de inversión de la carga.

Ejemplo 23

Detección de productos de escisión específicos en la reacción de la escisión dirigida por un invasor mediante la inversión de la carga

En este ejemplo, se demostró la capacidad de aislar productos generados en el análisis de la escisión dirigida por un invasor del resto de ácidos nucleicos presentes en una mezcla de reacción usando una inversión de la carga. Este experimento utilizó el siguiente oligonucleótido marcado con Cy3: 5'–Cy3–AminoT–AminoT– CTTTTCACCAGCGAGACGGG–3' (SEC ID N.º 50; denominado "oligo 61"). El oligo 61 fue diseñado para liberar tras la escisión un producto marcado con carga positiva neta. Para analizar si sería reconocido o no un producto marcado en el extremo 5’ con carga positiva neta por las enzimas Cleavase® en el formato del análisis de la escisión dirigida por un invasor, se sintetizaron químicamente el oligo sonda 61 (SEC ID N.º 50) y el oligonucleótido invasor 67 (SEC ID N.º 51) sobre un sintetizador de ADN (ABI 391) usando químicas de fosforamidita estándar y reactivos obtenidos en Glen Research (Sterling, VA).

Cada reacción analítica comprendía 100 fmoles de ADN monocatenario de M13mp18, 10 pmoles del oligonucleótido sonda (SEC ID N.º 50) y del InvaderTM (SEC ID N.º 51) y 20 unidades de A/G Cleavase® en una solución de 10 1l de MOPS 10mM, pH 7,4 con KCl 100mM. Se cubrieron las muestras con aceite mineral para evitar la evaporación. Se llevaron las muestras hasta bien 50°C, 55°C, 60°C o 65°C y se inició la escisión mediante la adición d e 1 1l de MnCl2 40mM. Se dejaron continuar las reacciones durante 25 minutos y luego se terminaron mediante la adición de 10 1l de formamida al 95% que contenía EDTA 20mM y violeta de metilo al 0,02%. El experimento de control negativo carecía de M13mp18 diana y fue ejecutado a 60°C. Se cargaron cinco microlitros de cada reacción en pocillos separados de un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 20% (entrecruzamiento de 29:1) con urea 8M en un tampón que contenía Tris–Borato 45mM (pH 8,3) y EDTA 1,4mM. Se aplicó un campo eléctrico de 20 vatios durante 30 minutos, con los electrodos orientados según lo indicado en la Fig. 49B (i.e., en sentido inverso). Se visualizaron los productos de estas reacciones usando un generador de imágenes fluorescentes FMBIO, mostrándose el barrido del generador de imágenes resultante en la Fig. 49B.

La Fig. 49A proporciona una ilustración esquemática que muestra un alineamiento del invasor (SEC ID N.º 50) y la sonda (SEC ID N.º 51) a lo largo del ADN de M13mp18 diana; sólo se muestran 53 bases de la secuencia de M13mp18 (SEC ID N.º 52). La secuencia del oligonucleótido invasor se muestra bajo la diana de M13mp18 y se usa una flecha sobre la secuencia de M13mp18 para indicar la posición del invasor en comparación con la sonda y la diana. Como se observa en la Fig. 49A, los oligonucleótidos invasor y sonda comparten una región de solapamiento de 2 bases.

En la Fig. 49B, los carriles 1–6 contienen reacciones llevadas a cabo a 50°C, 55°C, 60°C y 65°C, respect ivamente; el carril 5 contenía la reacción de control (sin diana). En la Fig. 49B, los productos de escisión se observan como bandas oscuras en la mitad superior del panel; la banda inferior apenas visible aparece en proporción a la cantidad de producto principal producido y, sin limitar la invención a un mecanismo en concreto, puede representar la escisión de un nucleótido en el dúplex. La sonda sin escindir no entra en el gel, por lo que no es visible. El carril de control no mostró señal detectable sobre el fondo (vía 5). Como se espera en una reacción de escisión invasiva, la velocidad de acumulación de producto de escisión específico fue dependiente de la temperatura. Mediante el uso de estos oligonucleótidos y esta diana en particular, la velocidad mayor de acumulación de producto fue observada a 55°C (vía 2), observándose muy poco producto a 65°C (vía 4).

Cuando se incuban durante períodos prolongados a una temperatura elevada, las sondas de ADN se pueden romper inespecíficamente (i.e., sufrir una degradación térmica), contribuyendo los fragmentos resultantes a un fondo de interferencia con el análisis. Los productos de tal ruptura térmica se distribuyen desde nucleótidos simples hasta la sonda de longitud completa. En este experimento, se examinó si la capacidad de separar en base a la carga de los productos de escisión (i.e., inversión de la carga) permitiría la separación sensible de los productos específicos de la escisión dependiente de la diana de los fragmentos de sonda generados mediante degradación térmica.

Para analizar el límite de sensibilidad de este procedimiento de detección, se diluyó en serie el ADN de M13mp18 diana diez veces en un intervalo de 1 fmol a 1 amol. Los oligonucleótidos invasor y sonda fueron aquéllos descritos anteriormente (i.e., SEC ID N.º 50 y 51). Las reacciones invasivas de escisión fueron ejecutadas según lo descrito anteriormente con las siguientes modificaciones: las reacciones se realizaron a 55°C. Se usó KGIu 250mM o 100mM en lugar del KCl 100mM, y sólo se añadió 1 pmol de oligonucleótido invasor. Las reacciones se iniciaron según lo descrito anteriormente y se dejaron proseguir durante 12,5 horas. También se ejecutó una reacción de control negativo que carecía de ADN diana de M13m18. Se terminaron las reacciones mediante la adición de 10 1l de la formamida al 95% que contenía EDTA 20mM y violeta de metilo al 0,02%, y se sometieron a electroforesis y se visualizaron según lo descrito anteriormente 5 1l de estas mezclas. En la Fig. 50, se muestra el barrido del generador de imágenes resultante.

En la Fig. 50, el carril 1 contiene el control negativo; los carriles 2–5 contienen reacciones llevadas a cabo usando KGIu 100mM; los carriles 6–9 contienen reacciones llevadas a cabo usando KGIu 250mM. Las reacciones resueltas en los carriles 2 y 6 contenían 1 fmol de ADN diana; aquéllas resueltas en los carriles 3 y 7 contenían 100 amoles de diana; aquéllas resueltas en los carriles 4 y 8 contenían 10 amoles de diana y aquéllas resueltas en las líneas 5 y 9 contenían 1 amole de diana. Los resultados mostrados en la Fig. 50 demuestran que el límite de detección usando la inversión de cargas para detectar la producción de productos de escisión específicos en una reacción de escisión invasiva está en o por debajo de 1 attomol o en aproximadamente 6,02 x 105 moléculas de diana. No se observó señal detectable en el carril de control, lo que indica que los productos sometidos a hidrólisis inespecífica o a otra ruptura no emigran en el mismo sentido que los productos de escisión de enzima específica. Los máximos de excitación y emisión para el Cy3 son 554 y 568, respectivamente, mientras que el analizador de imágenes FMBIO se excita a 532 y detecta a 585. Por lo tanto, es posible mejorar el límite de detección de los productos de escisión específicos mediante el uso de filtros de detección y de fuente de excitación apareados más estrechamente.

Ejemplo 24

Dispositivos y procedimientos para la separación y la detección de productos de reacción cargados

Este ejemplo se dirige a procedimientos y a dispositivos para aislar y concentrar productos de reacción específicos producidos mediante reacciones enzimáticas llevadas a cabo en una solución mediante la cual las reacciones generan productos cargados a partir de bien un sustrato de carga neutra o un sustrato que porta la carga opuesta a la portada por el producto de reacción específico. Los procedimientos y los dispositivos de este ejemplo permiten el aislamiento de, por ejemplo, los productos generados mediante el análisis de la escisión dirigida por un invasor de la presente invención.

Los procedimientos y los dispositivos de este ejemplo se basan en el principio de que cuando se aplica un campo eléctrico a una solución de moléculas cargadas, se produce rápidamente la emigración de las moléculas hacia el electrodo de la carga opuesta. Si se introduce una matriz u otro material inhibidor entre las moléculas cargadas y el electrodo de carga opuesta tal que se ralentiza de manera espectacular esta emigración rápida, las primeras moléculas en alcanzar la matriz serán casi detenidas, permitiendo así que sean alcanzadas por las moléculas rezagadas. De este modo, es posible concentrar una población dispersa de moléculas cargadas en disolución eficazmente en un volumen más pequeño. Mediante el marcaje de las moléculas con un resto detectable (p. ej., un colorante fluorescente) se facilita la detección tanto por la concentración como por la localización de los analitos. Este ejemplo ilustra dos realizaciones de los dispositivos contemplados por la presente invención; por supuesto, las variaciones de estos dispositivos serán evidentes para los expertos en la técnica y pertenecen al espíritu y el ámbito de la presente invención.

La Fig. 51 representa una realización de un dispositivo para concentrar los productos cargados positivamente generados usando los procedimientos de la presente invención. Según lo mostrado en la Fig. 51, el dispositivo comprende un tubo de reacción (10) que contiene la solución de reacción (11). Se sumerge un extremo de cada uno de los dos capilares finos (u otros tubos huecos) (13A y 13B) en la solución de reacción (11). Los capilares (13A y 13B) se pueden suspender en la solución de reacción (11) tal que no estén en contacto con el propio tubo de reacción; un procedimiento apropiado para suspender los capilares consiste en sujetarlos con pinzas (no se muestra). Alternativamente, se pueden suspender los capilares en la solución de reacción (11) tal que estén en contacto con el propio tubo de reacción. Los capilares adecuados incluyen tubos capilares de vidrio comúnmente disponibles en compañías de abastecimiento de material científico (p.ej., Fisher Scientific o VWR Scientific) o en casas de abastecimiento de material médico que llevan materiales para la extracción y el análisis de sangre. Aunque la presente invención no se limita a capilares de un diámetro interior en particular, se prefieren particularmente los tubos con diámetros interiores de hasta aproximadamente 1/8 pulgada (aproximadamente 3 mm) para su uso en la presente invención; por ejemplo, los tubos n.º 73811–99 de Kimble (VWR Scientific) tienen un diámetro interior de 1,1 mm y son de un tipo adecuado de tubo capilar. Aunque los capilares del dispositivo están comúnmente compuestos de vidrio, cualquier material tubular no conductor, bien rígido o flexible, que pueda contener bien un material conductor o un material de captura es adecuado para su uso en la presente invención. Un ejemplo de tubo flexible adecuado es el tubo de plástico claro Tygon® (N.º de pieza R3603; diámetro interior = aprox. 1,5 mm; diámetro exterior = aprox. 3 mm).

Según lo ilustrado en la Fig. 51, se conecta un capilar 13A al electrodo positivo de una fuente de alimentación (20) (p. ej., una fuente de alimentación controlable disponible a través de los proveedores de laboratorio que figuran anteriormente o a través de casas de suministro electrónico como Radio Shack) y se conecta el capilar 13B al electrodo negativo de la fuente de alimentación (20). Se llena el capilar 13B con un material de captura (14) capaz de atrapar los productos de reacción cargados positivamente permitiendo la emigración mínima de los productos que han entrado en el material de captura (14). Los materiales de captura adecuados incluyen, pero no se limitan a, acrilamida a un porcentaje elevado (p. ej., al aproximadamente 20%) polimerizada en un tampón de alto contenido en sales (acetato de sodio o una sal similar 0,5M o mayor); una matriz de poliacrilamida a un porcentaje tan elevado ralentiza de manera espectacular la emigración de los productos de reacción cargados positivamente. Alternativamente, el material de captura puede comprender una matriz sólida cargada negativamente, tal como perlas de látex cargadas negativamente, que puede unir los productos cargados positivamente entrantes. Obsérvese que es posible usar cualquier cantidad de material de captura (14) capaz de inhibir cualquiera que concentre los productos de reacción cargados positivamente. De este modo, aunque el capilar 13B de la Fig. 51 sólo contiene material de captura en la parte sumergida inferior del tubo, el material de captura (14) puede estar presente en todo el capilar (13B); de manera similar, puede haber presente menos material de captura (14) que el observado en la Fig. 51, porque los productos de reacción cargados positivamente se acumulan generalmente en una parte muy pequeña del fondo del capilar (13B). La cantidad de material de captura sólo necesita ser suficiente para entrar en contacto con la solución de reacción (11) y tener la capacidad de recoger los productos de la reacción. Cuando el capilar 13B no está completamente lleno de material de captura, se llena el espacio restante con cualquier material conductor (15); los materiales conductores adecuados se describen más adelante.

Por comparación, se puede llenar el capilar (13A) conectado al electrodo positivo de la fuente de alimentación 20 con cualquier material conductor (15) (indicado por las líneas sombreadas de la Fig. 51). Este puede ser el tampón de reacción de la muestra (p. ej., MOPS 10mM, pH 7,5 con LiCl 150mM; MnCl2 4mM), un tampón de electroforesis estándar (p. ej., Tris–Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM) o la propia solución de reacción (11). El material conductor (15) frecuentemente es un líquido, pero puede ser más fácil de usar un material semisólido (p. ej., un gel) u otro material adecuado, y pertenecen al ámbito de la presente invención. Además, también se puede usar el material de captura usado en el otro capilar (i.e., el capilar 13B) como material conductor. Por el contrario, debería observarse que también es posible usar el mismo material conductor usado en el capilar (13A) unido al electrodo positivo en el capilar 13B para llenar el espacio por encima de la región que contiene el material de captura (14) (véase la Fig. 51).

El extremo superior de cada uno de los capilares (13A y 13B) está conectado al electrodo apropiado de la fuente de alimentación (20) mediante cable de electrodo (18) u otro material adecuado. El cable de platino fino (p. ej., de 0,1 a 0,4 mm, Aesar Johnson Matthey. Ward Hill. MA) se usa comúnmente como cable conductor, porque no se corroe en condiciones de electroforesis. Se puede unir el cable de electrodo (18) a los capilares (13A y 13B) con adhesivo no conductor (no mostrado), tal como los adhesivos de silicona que se comercializan comúnmente en establecimientos de hardware para sellar fijaciones de tuberías. Si se construyen los capilares de un material flexible, se puede fijar el cable de electrodo (18) con una pequeña abrazadera de sujeción de tubos flexibles o un cable de estrangulamiento (no mostrado) para comprimir la abertura de los capilares alrededor del cable de electrodo. Si el material conductor

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es un gel, se puede insertar un cable de electrodo (18) directamente en el gel del capilar.

La reacción de escisión se prepara en un tubo de reacción (10) y se deja que continúe en el mismo según lo descrito en los ejemplos anteriores (p. ej., los ejemplos 22–23). Aunque sin limitarse a un volumen de solución de reacción

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en particular, un volumen preferido es menor de 10 ml y, más preferiblemente, menor de 0,1 ml. El volumen sólo necesita ser suficiente para permitir el contacto con ambos capilares. Una vez completada la reacción de escisión, se aplica un campo eléctrico a los capilares encendiendo la fuente de alimentación (20). Como resultado, los productos cargados positivamente generados durante la reacción de escisión dirigida por un invasor que emplea un oligonucleótido que, cuando se escinde, genera un fragmento cargado positivamente (descrito en el Ej. 23) pero que cuando está sin escindir porta una carga negativa neta, emigran al capilar negativo en el que se retarda o se detiene su emigración mediante el material de captura (14), y las moléculas de sonda degradadas térmicamente y sin cortar cargadas negativamente emigran hacia el electrodo positivo. Mediante el uso de este dispositivo o uno similar, los productos cargados positivamente de la reacción de escisión invasiva son separados del otro material (i.e., la sonda sin cortar y degradada térmicamente) y se concentran desde un gran volumen. La concentración del producto en una cantidad pequeña de material de captura (14) simplifica la detección con una proporción de señal con respecto al ruido mucho mayor que la que es posible con la detección en el volumen de reacción original. Como el producto concentrado está marcado con un resto detectable como un colorante fluorescente, se puede usar un lector de placas fluorescentes disponible comercialmente (no mostrado) para determinar la cantidad de producto. Los lectores de placas adecuados incluyen lectores láser tanto superiores como inferiores. Se puede colocar el capilar 13B con el tubo de reacción (10) en cualquier posición deseada para posibilitar su uso con un dispositivo de lectura de placas bien superior o inferior.

En la realización alternativa de la presente invención representada en la Fig. 52, el procedimiento descrito anteriormente se realiza utilizando un solo capilar (13B). El capilar (13B) contiene el material de captura (14) descrito anteriormente y está conectado a un cable de electrodo (18), que a su vez está unido al electrodo negativo de una fuente de alimentación (20). El tubo de reacción (10) tiene un electrodo (25) introducido en su superficie tal que una superficie del electrodo está expuesta hacia el interior del tubo de reacción (10) y otra superficie está expuesta hacia el exterior del tubo de reacción. La superficie del electrodo (25) situada sobre el exterior del tubo de reacción está en contacto con una superficie conductora (26) conectada al electrodo positivo de la fuente de alimentación (20) a través de un cable de electrodo (18). La presente invención también contempla variaciones de la disposición representada en la Fig. 52. Por ejemplo, el electrodo (25) puede estar en contacto con la solución de reacción (11) mediante el uso de un pequeño orificio en el tubo de reacción (10); además, el cable de electrodo (18) puede estar unido directamente al cable de electrodo (18), eliminando así la superficie conductora (26).

Según lo indicado en la Fig. 52, el electrodo (25) está introducido en el fondo de un tubo de reacción (10) tal que se puedan fijar uno o más tubos de reacción sobre la superficie conductora (26). Esta superficie conductora podría servir como electrodo negativo para múltiples tubos de reacción; tal superficie con los contactos apropiados podría ser de aplicación mediante el uso de láminas de metal (p. ej., de cobre o de platino, Aesar Johnson Matthey, Ward Hill, MA) en gran parte del mismo modo que los contactos se aplican a placas de circuitos. Como tal contacto de la superficie no se expondría a la muestra de reacción directamente, se podrían usar metales menos costosos, tales como el cobre, para fabricar las conexiones eléctricas.

Los anteriores dispositivos y procedimientos no se limitan a la separación y la concentración de los oligonucleótidos cargados positivamente. Como resultará evidente para los expertos en la técnica, se pueden separar los productos de reacción cargados negativamente de los reactivos neutros o cargados positivamente usando el dispositivo y los procedimientos anteriores con la excepción de que el capilar 13B esté unido al electrodo positivo de la fuente de alimentación (20) y el capilar 13A, o alternativamente, el electrodo 25, esté unido al electrodo negativo de la fuente de alimentación (20).

Ejemplo 25

La escisión dirigida por un cebador y la independiente de un cebador tienen lugar en el mismo sitio cuando el cebador se prolonga hasta el lado 3’ de una “burbuja” apareada erróneamente del dúplex de secuencia abajo

Según lo tratado anteriormente en el ejemplo 1, la presencia de un cebador secuencia arriba de un dúplex bifurcado puede influir en el sitio de escisión, y la existencia de un hueco entre el extremo 3' del cebador y la base del dúplex puede provocar un desplazamiento del sitio de escisión hasta el brazo 5’ desapareado de la estructura (véase también Lyamichev et al., supra y la patente estadounidense n.º 5.422.253). El desplazamiento no invasivo resultante del sitio de escisión como respuesta a un cebador se demuestra en las Fig. 8, 9 y 10, en las que el cebador usado dejó un hueco de 4 nucleótidos (en relación con la base del dúplex). En las Fig. 8–10, todas las reacciones de escisión “dirigida por un cebador” generaron un producto de 21 nucleótidos, mientras que las reacciones de escisión independiente de un cebador generaron un producto de 25 nucleótidos. Se examinó el sitio de escisión obtenido cuando se prolongó el cebador hasta la base del dúplex sin dejar huecos. Los resultados se muestran en la Fig. 53 (la Fig. 53 es una reproducción de la Fig. 2C de Lyamichev et al.). Estos datos fueron derivados de la escisión de la estructura mostrada en la Fig. 5, según lo descrito en el ejemplo 1. A no ser que se especifique lo contrario, las reacciones de escisión comprendieron 0,01 pmoles de ADN en forma de horquilla marcado terminalmente desnaturalizado térmicamente (con la cadena complementaria sin marcar también presente), 1 pmol de cebador (complementario al brazo 3’ mostrado en la Fig. 5 y que tiene la secuencia 5'– GAATTCGATTTAGGTGACAC TATAGAATACA (SEC ID N.º 53)]) y 0,5 unidades de ADNpTaq (estimadas como 0,026 pmoles) en un volumen total de 10 µl de Tris–Cl 10mM, pH 8,5; MgCl2 1,5mM y KCl 50mM. Se omitió el cebador de la reacción mostrada en la primera vía de la Fig. 53 y se incluyó en el carril 2. Estas reacciones se incubaron a 55°C durante 10 minutos. Las reacciones se iniciaron a la temperatura de reacción final mediante la adición de bien MgCl2 o enzima. Las reacciones se detuvieron a sus temperaturas de incubación mediante la adición de 8 µl de formamida al 95% con EDTA 20mM y colorantes marcadores al 0,05%.

La Fig. 53 es un autorradiograma que indica los efectos sobre el sitio de escisión de una estructura de dúplex bifurcado en presencia de un cebador que se prolonga hasta la base del dúplex de horquilla. El tamaño del producto de escisión liberado se muestra a la izquierda (i.e., 25 nucleótidos). A la derecha, se muestra una escalera de secuenciación de didesoxinucleótidos del sustrato de escisión como un marcador (vías 3–6).

Estos datos muestran que la presencia de un cebador que es adyacente a un dúplex de secuencia abajo (vía 2) produce la escisión en el mismo sitio que el observado en las reacciones llevadas a cabo en ausencia del cebador (vía 1). (Véase las Fig. 8A y B, 9B y 10A para más comparaciones). Cuando los nucleótidos del terminal 3’ del oligonucleótido de secuencia arriba se pueden aparear a la cadena molde, pero no son homólogos a la cadena reemplazada en la región inmediatamente secuencia arriba del sitio de escisión (i.e., cuando el oligonucleótido de secuencia arriba está abriendo una “burbuja” en el dúplex), el sitio al que se desplaza aparentemente la escisión no es completamente dependiente de la presencia de un oligonucleótido de secuencia arriba.

Según lo tratado anteriormente en el apartado de antecedentes y en la tabla 1, el requisito de que dos secuencias independientes sean reconocidas en un análisis proporciona un nivel muy deseable de especificidad. En las reacciones de escisión invasiva de la presente invención, los oligonucleótidos invasor y sonda deben hibridarse al ácido nucleico diana en el sentido y espaciado correctos para permitir la producción del producto de escisión correcto. Cuando el patrón característico de escisión no depende de alineamiento correcto de ambos oligonucleótidos en el sistema de detección, se pierden estas ventajas de reconocimiento independiente.

Ejemplo 26

Escisión invasiva y escisión dirigida por un cebador cuando sólo hay homología parcial en la región de solapamiento “X”

Aunque sin limitar la presente invención a un mecanismo en particular, la escisión invasiva tiene lugar cuando el sitio de escisión es desplazado a un sitio dentro del dúplex formado entre la sonda y el ácido nucleico diana de una manera que es dependiente de la presencia de un oligonucleótido secuencia arriba que comparta una región de solapamiento con el oligonucleótido sonda de secuencia abajo. En algunos casos, la región 5’ del oligonucleótido de secuencia abajo puede no ser completamente complementaria al ácido nucleico diana. En estos casos, la escisión de la sonda puede producirse en un sitio interno de la sonda, incluso en ausencia de un oligonucleótido secuencia arriba (a diferencia del mordisqueado de base por base observado cuando se usa una sonda completamente apareada sin un invasor). La escisión invasiva se caracteriza por un aparente desplazamiento de la escisión a un sitio dentro de un dúplex de secuencia abajo que es dependiente de la presencia del oligonucleótido invasor.

Es posible ilustrar una comparación entre la escisión invasiva y la escisión dirigida por un cebador comparando los sitios de escisión esperados de un conjunto de de oligonucleótidos sonda que tienen grados decrecientes de complementariedad con la cadena diana de la región 5’ de la sonda (i.e., la región que se solapa con el invasor). Se puede realizar un simple análisis, similar al realizado sobre el sustrato de horquilla anterior (Ej. 25), para comparar la escisión invasiva con la escisión dirigida por un cebador no invasiva descrita anteriormente. Tal conjunto de oligonucleótidos de análisis se representan en la Fig. 54. Las estructuras mostradas en la Fig. 54 se agrupan en pares marcados con “a”, “b”, “c” y “d”. Cada par tiene la misma secuencia de sonda apareada a la cadena diana (SEC ID N.º 54), pero la estructura superior de cada par se representa sin un oligonucleótido de secuencia arriba, mientras que la estructura inferior incluye este oligonucleótido (SEC ID N.º 55). Las secuencias de las sondas mostradas en las Fig. 54a–54d figuran en las SEC ID Nº. 32, 56, 57 y 58, respectivamente. Los sitios probables de escisión se indican con puntas de flecha negras. (Obsérvese que el sitio de escisión exacto sobre cada una de estas estructuras puede variar en función de la elección del agente de escisión y de otras variables experimentales. Estos sitios concretos sólo se proporcionan a modo ilustrativo).

Para realizar este análisis, se determina el sitio de escisión de cada sonda tanto en presencia como en ausencia del oligonucleótido de secuencia arriba, con condiciones de reacción tales como aquéllas descritas en el ejemplo 18. Entonces se comparan los productos de cada par de reacciones para determinar si el fragmento liberado del extremo 5' de la sonda aumenta en tamaño cuando se incluye el oligonucleótido de secuencia arriba en la reacción.

La disposición mostrada en la Fig. 54a, en la que la molécula de sonda es completamente complementaria a la cadena diana, es similar a aquélla mostrada en la Fig. 28. El tratamiento de la estructura superior con la nucleasa 5' de una ADN polimerasa provocaría el mordisqueado exonucleolítico de la sonda (i.e., en ausencia del oligonucleótido de secuencia arriba). Por el contrario, la inclusión del oligonucleótido invasor provocaría un desplazamiento característico de la escisión similar a aquéllos observados en la Fig. 29.

Las disposiciones mostradas en las Fig 54b y 54c tienen la misma cantidad de secuencia desapareada en el terminal 5’ de la sonda (3 y 5 bases, respectivamente). Estos pequeños brazos 5’ constituyen un sustrato de escisión adecuado para las nucleasas 5' y serían escindidos en dos nucleótidos de la unión entre la región monocatenaria y el dúplex. En estas disposiciones, el extremo 3' del oligonucleótido de secuencia arriba comparte identidad con una parte de la región 5’ de la sonda que es complementaria a la secuencia diana (es decir, el extremo 3' del invasor tiene que competir por la unión a la diana con una parte del extremo 5' de la sonda). Por lo tanto, cuando se incluye el oligonucleótido de secuencia arriba, se cree que media un desplazamiento en el sitio de escisión dentro del dúplex de secuencia abajo (aunque la presente invención no se limita a un mecanismo de acción en particular), constituyendo, por tanto, esto una escisión invasiva. Si los nucleótidos del extremo 5’ de la región desapareada de la sonda fueran capaces de hibridarse con la cadena diana, el sitio de escisión en ausencia del invasor podría cambiar, pero la adición del oligonucleótido invasor seguiría desplazando el sitio de escisión a la posición apropiada.

Finalmente, en la disposición mostrada en la Fig. 54d, la sonda y el oligonucleótido de secuencia arriba no comparten regiones significativas de homología, y en presencia del oligonucleótido de secuencia arriba no competiría por la unión a la diana con la sonda. La escisión de las estructuras mostradas en la Fig 54d tendría lugar en el mismo sitio con o sin oligonucleótido de secuencia arriba, y esto no constituiría una escisión invasiva.

Al examinar cualquier par de oligonucleótido de secuencia arriba/sonda de este modo, se puede determinar fácilmente si la escisión resultante es invasiva o simplemente está dirigida por un cebador. Tal análisis es particularmente útil cuando la sonda no es completamente complementaria al ácido nucleico diana, tal que el resultado esperado puede no ser tan claro mediante la simple inspección de las secuencias.

Ejemplo 27

Enzimas Cleavase® modificadas

Para desarrollar nucleasas que tengan actividades útiles para la escisión de ácidos nucleicos, se produjeron las siguientes nucleasas modificadas.

a) Nucleasa trombina/BN Cleavase®

i) Clonación y expresión de la Nucleasa trombina/BN Cleavase®

Se usó una mutagénesis de sitio dirigida para introducir una secuencia proteínica reconocida por la proteasa trombina en la región de la nucleasa BN Cleavase® de quien se cree que forma el arco helicoidal de la proteína a través del cual se supone que pasa el ADN monocatenario que es escindido. La mutagénesis se llevó a cabo usando el equipo de mutagénesis Transformer™ (Clonetech, Palo Alto, CA) según el protocolo del fabricante usando el oligonucleótido mutagénico 5'–GGGAAAGTCCTCGCAGCCGCGCGGGACGAGCGTGGGGGCCCG (SEC ID N.º 59). Tras la mutagénesis, se secuenció el ADN para verificar la inserción del sitio de escisión de la trombina. La secuencia de ADN codificante de la nucleasa trombina/BN Cleavase® se proporciona en la SEC ID N.º 60; la secuencia de aminoácidos de la nucleasa trombina/BN Cleavase® se proporciona en la SEC ID N.º 61.

Se hizo una preparación a gran escala del mutante de trombina (i.e., trombina/BN Cleavase®) usando células de E. coli que sobre–expresaban la nucleasa trombina/BN Cleavase® según lo descrito en el ejemplo 28.

ii) Escisión con trombina de la trombina/BN Cleavase®

Se digirieron seis coma cuatro (6,4) mg de la nucleasa trombina/BN Cleavase® con 0,4 U de trombina (Novagen) durante 4 horas a 23°C o 37°C. La digestión complet a se verificó mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida–SDS al 15% tiñendo con azul brillante de Coomassie R. También se digirió la nucleasa BN Cleavase® de tipo natural con trombina como control. En la Fig. 61, se muestra el gel resultante.

En la Fig. 61, el carril 1 contiene marcadores del peso molecular (marcadores del peso molecular de proteínas de rango bajo: Promega); el carril 2 contiene nucleasa trombina/BN Cleavase®; los carriles 3 y 4 contienen nucleasa trombina/BN Cleavase® digerida con trombina a 23°C d urante 2 y 4 horas, respectivamente; y los carriles 5 y 6 contienen nucleasa trombina/BN Cleavase® digerida con trombina a 37°C durante 2 y 4 horas, respectivame nte. Estos resultados muestran que la nucleasa trombina/BN Cleavase® tiene un peso molecular aparente de 36,5 kilodaltons y demuestran que la nucleasa trombina/BN Cleavase® es escindida eficazmente por la trombina. Además, los productos de la escisión de la trombina tienen pesos moleculares aproximados de 27 kilodaltons y 9 kilodaltons, basándose el tamaño esperado en la posición del sitio de trombina insertado en la nucleasa trombina/BN Cleavase®.

Para determinar el nivel de actividad de escisión de la horquilla en la nucleasa trombina/BN Cleavase® digerida y sin digerir, se prepararon diluciones y se usaron para escindir una horquilla de análisis que contenía un marcador de fluoresceína en 5’. Se incubaron cantidades variables de nucleasa trombina/BN Cleavase® digerida y sin digerir con horquilla de oligonucleótido S–60 51M (SEC ID N.º 29; véase la Fig. 26) en MOPS 10mM (pH 7,5); Tween–20 al 0,05%; NP–40 al 0,05% y MnCl2 1mM durante 5 minutos a 60°C. Se sometió a electrof oresis la mezcla digerida sobre un gel de acrilamida al 20% y se visualizaron sobre un generador de imágenes FMBIO 100 de Hitachi. En la Fig. 62, se muestra la imagen resultante.

En la Fig. 62, el carril 1 contiene el control sin enzima; el carril 2 contiene los productos de reacción generados usando 0,01 ng de nucleasa BN Cleavase®; los carriles 3, 4 y 5 contienen los productos de reacción generados usando 0,01 ng, 0,04 ng y 4 ng de nucleasa trombina/BN Cleavase® sin digerir, respectivamente; y las líneas 6, 7 y 8 contienen los productos de reacción generados usando 0,01 ng, 0,04 ng y 4 ng de nucleasa trombina/BN Cleavase® digerida con trombina, respectivamente. Los resultados mostrados en la Fig. 62 demostraron que la inserción del sitio de escisión de la trombina redujo la actividad de escisión en aproximadamente 200 veces (en relación con la actividad de la nucleasa BN Cleavase®), pero que la digestión con trombina no redujo la actividad significativamente.

Se usó ADN monocatenario de M13 como sustrato para la escisión por parte de la nucleasa BN Cleavase® y la nucleasa trombina/BN Cleavase® digerida y sin digerir. Se incubaron setenta nanogramos de ADN de M13 monocatenario (New England Biolabs, Beverly, MA) en MOPS 10mM, pH 7,5; Tween–20 al 0,05%; NP–40 al 0,05%; MgCl2 1mM o MnCl2 1mM, con 8 ng de nucleasa BN Cleavase®, nucleasa trombina/BN Cleavase® sin digerir o nucleasa trombina/BN Cleavase® digerida durante 10 minutos a 50°C. Se sometieron a electroforesis las me zclas de reacción sobre un gel de agarosa al 0,8% y luego se tiñeron con una solución que contenía 0,5 1g/ml de bromuro de etidio (EtBr) para visualizar las bandas de ADN. En la Fig. 63, se muestra una imagen negativa del gel teñido con EtBr.

En la Fig. 63, el carril 1 contiene el control sin enzima; el carril 2 contiene los productos de reacción generados usando nucleasa BN Cleavase® y MgCl2 1mM; el carril 3 contiene los productos de reacción generados usando nucleasa BN Cleavase® y MnCl2 1mM; el carril 4 contiene los productos de reacción generados usando nucleasa trombina/BN Cleavase® sin digerir y MgCl2 1mM; el carril 5 contiene los productos de reacción generados usando nucleasa trombina/BN Cleavase® sin digerir y MnCl2 1mM; el carril 6 contiene los productos de reacción generados usando la nucleasa trombina/BN Cleavase® digerida con trombina y MgCl2 1mM; y el carril 7 contiene los productos de reacción generados usando nucleasa trombina/BN Cleavase® digerida con trombina y MnCl2 1mM. Los resultados mostrados en la Fig. 63 demostraron que la nucleasa trombina/BN Cleavase® tenía una mayor capacidad de escindir el ADN circular (y por tanto una menor necesidad por la presencia de un extremo 5' libre) en comparación con la nucleasa BN Cleavase®.

A partir de estos datos, se puede observar que el arco helicoidal de estas proteínas puede ser abierto sin destruir la enzima o su capacidad de reconocer específicamente las estructuras de escisión. El mutante trombina/BN Cleavase® tiene una mayor capacidad para escindir sin referencia al extremo 5', según lo tratado anteriormente. La capacidad de escindir tales estructuras permitirá la escisión de moléculas largas, tales como el ADN genómico que, aunque habitualmente no son circulares, pueden presentar muchos sitios de escisión deseables que son escindidos de cualquier extremo 5' disponible. Las estructuras de escisión se pueden formar en tales sitios bien mediante plegamiento de las cadenas (i. e., escisión CFLP®) o mediante la introducción de oligonucleótidos que formen estructuras (patente estadounidense n.º 5.422.253). Los extremos 5’ de los ácidos nucleicos también se pueden volver no disponibles debido a la unión de una sustancia demasiado larga para pasar por el arco helicoidal. Tales restos de unión pueden incluir proteínas tales como estreptavidina o anticuerpos, o soportes sólidos tales como perlas o las paredes de una cuba de reacción. Una enzima de escisión con una abertura en el bucle del arco helicoidal será capaz de escindir ADN que estén configurados de este modo, aumentando el número de modos en los que se pueden formar las reacciones que usan tales enzimas.

b) Nucleasa DN Cleavase®

i) Construcción y expresión de la Nucleasa DN Cleavase®

Se construyó un mutante deficiente en polimerización de la ADN polimerasa de Taq denominado nucleasa DN Cleavase®. La nucleasa DN Cleavase® contiene un residuo de asparagina en lugar del residuo de ácido aspártico de tipo natural de la posición 785 (D785N).

El ADN codificante de la nucleasa DN Cleavase® se construyó a partir del gen codificante de la A/G Cleavase® (mutTaq, Ej. 2) en dos series de mutagénesis de sitio dirigida. En primer lugar, la G de la posición 1397 y la G de la posición 2264 del gen de A/G Cleavase® (SEC ID N.º 21) fueron cambiadas por A en cada posición para recrear un gen de ADNPTaq de tipo natural. Como segunda serie de mutagénesis, se convirtió el gen de ADNPTaq de tipo natural en el gen de DN Cleavase® cambiando la G de la posición 2356 por A. Estas manipulaciones se realizaron como se describe a continuación.

Se volvió a clonar el ADN codificante de la nucleasa A/G Cleavase® desde el plásmido pTTQ18 (Ej. 2) en el plásmido pTrc99A (Pharmacia) en un procedimiento de dos etapas. En primer lugar, se modificó el vector pTrc99A eliminando la G de la posición 270 del mapa de pTrc99A, creando un vector de clonación pTrc99G. Con este fin, se cortó el ADN del plásmido pTrc99A con NcoI y se rellenaron los extremos 3’ recesivos usando el fragmento de Klenow de la polimerasa I de E. coli en presencia de los cuatro dNTP a 37°C durante 15 m in. Tras la desactivación del fragmento de Klenow mediante incubación a 65°C d urante 10 min, se cortó el ADN del plásmido con EcoRI, se volvieron a rellenar los extremos usando el fragmento de Klenow en presencia de los cuatro dNTP a 37°C durante 15 min. Entonces se desactivó el fragmento de Klenow incubando a 65ºC durante 10 min. Se precipitó con etanol el ADN plasmídico, se recircularizó mediante unión y se usó para transformar células JM109 de E. coli (Promega). Se aisló el ADN plasmídico a partir de colonias simples y se confirmó la eliminación de la G de la posición 270 del mapa pTrc99A mediante secuenciación de ADN.

Como segunda etapa, se retiró el ADN codificante de la nucleasa A/G Cleavase® del plásmido pTTQ18 usando EcoRI y Sall, y se separó el fragmento de ADN que portaba el gen de nucleasa A/G Cleavase® sobre un gel de agarosa al 1% y se aisló con el equipo Geneclean II (Bio 101, Vista, CA). Se unió el fragmento purificado en el vector pTrc99G que había sido cortado con EcoRI y Sall. Se usó la mezcla de unión para transformar células JM109 de E. coli competentes (Promega). Se aisló el ADN plasmídico de las colonias simples y se confirmó la inserción del gen de nucleasa A/G Cleavase® mediante el análisis de restricción usando EcoRI y Sall.

Se purificó el pTrcAG de ADN plasmídico que portaba el gen de nucleasa A/G Cleavase® clonado en el vector pTrc99A a partir de 200 ml de cultivo de JM109 de una noche usando el equipo Plasmid Maxi de QIAGEN (QIAGEN, Chatsworth, CA) según el protocolo del fabricante. Se sometió a mutagénesis el ADN de plásmido pTrcAG usando dos cebadores mutagénicos, E465 (SEC ID N.º 62) (Integrated DNA Technologies, Iowa) y R754Q (SEC ID N.º 63) (Integrated DNA Technologies), y el cebador de selección Trans Oligo AlwNI/Spel (Clontech, Palo Alto, CA, n.º de catálogo 6488–1) según el protocolo del equipo de mutagénesis de sitio dirigida Transformer™(Clontech) para producir un gen de ADNPTaq de tipo natural restaurado (pTrcWT).

Se purificó el ADN de plásmido pTrcWT que portaba el gen de la ADNPTaq de tipo natural clonado en el vector pTrc99A a partir de 200 ml de cultivo de JM109 de una noche usando el equipo Plasmid Maxi de QIAGEN (QIAGEN, Chatsworth, CA) según el protocolo del fabricante. Entonces se sometió el pTrcWT a mutagénesis usando el cebador mutagénico D785N (SEC ID N.º 64) (Integrated DNA Technologies) y el cebador de selección Switch Oligo Spel/AlwNI (Clontech, n.º de catálogo 6373–1) según el protocolo del equipo de mutagénesis de sitio dirigida Transformer™(Clontech) para crear un plásmido que contuviera ADN codificante de de la nucleasa DN Cleavase®. La secuencia de ADN codificante de la nucleasa DN Cleavase® se proporciona en la SEC ID N.º 65; la secuencia de aminoácidos de la nucleasa DN Cleavase® se proporciona en la SEC ID N.º 66.

Se hizo una preparación a gran escala de la nucleasa DN Cleavase® usando células de E. coli que sobre– expresaban la nucleasa DN Cleavase® según lo descrito en el ejemplo 28.

c) Nucleasa DA Cleavase® y nucleasa DV Cleavase®

Se construyeron dos mutantes deficientes en polimerización de la ADN polimerasa de Taq denominados nucleasa DA Cleavase® y nucleasa DV Cleavase®. La nucleasa DA Cleavase® contiene un residuo de alanina en lugar del residuo de ácido aspártico de tipo natural de la posición 610 (D785A). La nucleasa DV Cleavase® contiene un residuo de valina en lugar del residuo de ácido aspártico de tipo natural de la posición 610 (D610V).

i) Construcción y expresión de la Nucleasa DA Cleavase® y la nucleasa DV Cleavase®

Para construir vectores codificantes de las nucleasas DA y DV Cleavase®, se sometió a mutagénesis el gen de nucleasa A/G Cleavase® contenido en pTrcAG con dos cebadores mutagénicos, R754Q (SEC ID N.º 63) y D610AV (SEC ID N.º 67) y el cebador de selección Trans Oligo AlwNI/Spel (Clontech, n.º de catálogo 6488–1) según el protocolo de equipo de mutagénesis de sitio dirigida Transformer™(Clontech), para crear un plásmido que contuviera ADN codificante de la nucleasa DA Cleavase® o la nucleasa DV Cleavase®. El oligonucleótido D610AV fue sintetizado para que tuviera una purina, A o G, en la posición 10 del extremo 5' del oligonucleótido. Tras la mutagénesis, se aisló el ADN plasmídico a partir de colonias simples, y se determinó el tipo de mutación presente, DA o DV, mediante secuenciación de ADN. La secuencia de ADN codificante de la nucleasa DA Cleavase® se proporciona en la SEC ID N.º 68; la secuencia de aminoácidos de la nucleasa DA Cleavase® se proporciona en la SEC ID N.º 69. La secuencia de ADN codificante de la nucleasa DV Cleavase® se proporciona en la SEC ID N.º 70; la secuencia de aminoácidos de la nucleasa DV Cleavase® se proporciona en la SEC ID N.º 71.

Se hizo una preparación a gran escala de la nucleasa DA Cleavase® y la nucleasa DV Cleavase® usando células de E. coli que sobre–expresaban la nucleasa DA Cleavase® o la nucleasa DV Cleavase® según lo descrito en el ejemplo 28.

Ejemplo 28

Clonación y expresión de endonucleasas FEN–1 termoestables

Se clonaron secuencias codificantes de proteínas FEN–1 termoestables derivadas de tres especies arqueabacterianas y se sobre–expresaron en E. coli. Este ejemplo implicó a) clonación y expresión de una endonucleasa FEN–1 procedente de Methanococcus jannaschii; b) clonación y expresión de una endonucleasa FEN–1 procedente de Pyrococcus furiosus; b) clonación y expresión de una endonucleasa FEN–1 procedente de Pyrococcus woesei; d) preparación a gran escala de proteínas FEN–1 termoestable recombinantes y e) análisis de la actividad usando endonucleasas FEN–1.

a) Clonación y expresión de una endonucleasa FEN–1 procedente de Methanococcus jannaschii

El ADN codificante de la endonucleasa FEN–1 procedente de Methanococcus jannaschii (M. jannaschii) fue aislado de células de M. jannaschii e insertado en un plásmido bajo el control transcripcional de un promotor inducible según la siguiente descripción. Se preparó el ADN genómico desde 1 vial de bacterias de M. jannaschii vivas (DSMZ. Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Alemania n.º 2661) con un equipo XTRAX de ADN (Gull Laboratories. Salt Lake City, UT) según el protocolo del fabricante. Se volvieron a suspender los sedimentos de ADN finales en 100 1l de TE (Tris HCl 10mM, pH 8,0; EDTA 1mM) Se empleó un microlitro de solución de ADN en una PCR usando el equipo de PCR de ADNc Advantage™(Clonetech); la PCR se llevó a cabo según las recomendaciones del fabricante. El cebador del extremo 5' (SEC ID N.º 72) es complementario al extremo 5' del marco de lectura abierto de la FEN–1 de Mja con una sustitución de una base para crear un sitio de restricción de Ncol [un fragmento del genoma de M. jannaschii que contiene el gen codificante de la FEN–1 de M. jannaschii (Mja) se encuentra disponible en el banco de genes con n.º de acceso U67585]. El cebador del extremo 3’ (SEC ID N.º 73) es complementario a la secuencia de aproximadamente 15 pares de bases secuencia abajo del extremo 3’ del marco de lectura abierto de la FEN–1 de Mja con sustituciones de dos bases para crear un sitio de la enzima de restricción Sall. Las secuencias de los cebadores del extremo 5’ y del extremo 3’ son: 5'–GGGATACCA TGGGAGTGCAGTTTGG–3’ (SEC ID N.º 72) y 5'–GGTAAATTTTTCTCGTCGA CATCCCAC–3’ (SEC ID N.º 73), respectivamente. La reacción PCR dio como resultado la amplificación (i.e., la producción) de una sola banda principal de una longitud de aproximadamente 1 kilobase. El marco de lectura abierto (ORF) codificante de la endonucleasa FEN–1 de Mja se proporciona en la SEC ID N.º 74; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID N.º 75.

Tras la amplificación por PCR, se sometió toda la reacción a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,0% y se excitó la banda principal desde el gel y se purificó usando el equipo Geneclean II (Bio101, Vista, CA) según las instrucciones del fabricante. Se digirió con NcoI y Sall aproximadamente 1 1g del producto de PCR de la FEN–1 de Mja purificado sobre gel. Tras la digestión, se purificó el ADN usando el equipo Geneclean II según las instrucciones del fabricante. Se digirió un microgramo del vector pTrc99a (Pharmacia, Piscataway, NJ) con NcoI y SaII en preparación para la unión con el producto de la PCR digerido. Se combinaron cien nanogramos del vector pTrc99a digerido y 250 ng del producto de la PCR FEN–1 de Mja y se unieron para crear pTrc99–MJFEN1. El pTrc99– MJFEN1 se usó para transformar células JM109 de E. coli competentes (Promega), usando técnicas estándar.

b) Clonación y expresión de una endonucleasa FEN–1 procedente de Pyrococcus furiosus

Se obtuvo ADN codificante de la endonucleasa FEN–1 de Pyrococcus furiosus (P. furiosus) mediante amplificación por PCR usando un plásmido que contenía ADN codificante de la endonucleasa FEN–1 de P. furiosus (Pfu) (proporcionada por el Dr. Frank Robb. Center of Marine Biotechnology, Baltimore, MD). Las secuencias de ADN codificantes de una parte de la endonucleasa FEN–1 de Pfu se pueden obtener del banco de genes con los n.º de acceso AA113505 y W36094. Se insertó el gen de FEN–1 de Pfu amplificado en el vector de expresión pTrc99a (Pharmacia) para colocar el gen de FEN–1 de Pfu bajo el control transcripcional del promotor trc inducible. La amplificación por PCR se realizó como se explica a continuación. Las reacciones de cien microlitros contenían Tris HCl 50mM, pH 9,0; (NH4)2SO4 20mM; MgCl2 2mM; varios dNTP 501M; 50 pmoles de cada cebador, 1 U de polimerasa de Tfl (Epicentre Technologies, Madison, WI) y 1 ng de ADN de plásmido que contenía gen de FEN–1. El cebador del extremo 5' (SEC ID N.º 76) es complementario al extremo 5' del marco de lectura abierto de la FEN–1 de Pfu, pero con dos sustituciones para crear un sitio de Ncol, y el cebador del extremo 3’ (SEC ID N.º 77) es complementario a la secuencia localizada aproximadamente 30 pares de bases secuencia abajo del marco de lectura abierto de FEN–1 con dos sustituciones para crear un sitio de Pstl. Las secuencias de los cebadores del extremo 5’ y del extremo 3’ son: 5'–GAGGTGATACCATGGGTGTCC–3' (SEC ID N.º 76) y 5'– GAAACTCTGCAGCGCGTCAG–3' (SEC ID N.º 77), respectivamente. La reacción PCR dio como resultado la amplificación de una sola banda principal de una longitud de aproximadamente 1 kilobase. El marco de lectura abierto (ORF) codificante de la endonucleasa FEN–1 de Pfu se proporciona en la SEC ID N.º 78; la secuencia de aminoácidos codificada por este ORF se proporciona en la SEC ID N.º 79.

Tras la amplificación por PCR, se sometió toda la reacción a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,0% y se excitó la banda principal desde el gel y se purificó usando el equipo Geneclean II (Bio101) según las instrucciones del fabricante. Se digirió con NcoI y Pstl aproximadamente 1 µg del producto de la PCR de la FEN–1 de Pfu purificado sobre gel. Tras la digestión, se purificó el ADN usando el equipo Geneclean II según las instrucciones del fabricante. Se digirió un microgramo del vector pTrc99a con NcoI y Pstl antes de la unión con el producto de la PCR digerido. Se combinaron cien nanogramos del vector pTrc99a digerido y 250 ng del producto de la PCR de la FEN–1 de Pfu y se unieron para crear pTrc99–PFFEN1. El pTrc99–PFFEN1 se usó para transformar células JM109 de E. coli competentes (Promega), usando técnicas estándar.

c) Clonación y expresión de una endonucleasa FEN–1 procedente de Pyrococcus woesei

Para la clonación del ADN codificante de la endonucleasa FEN–1 de Pyrococcus woesei (Pwo), se preparó ADN de bacterias P. woesei liofilizadas (DSMZ n.º 3773) según lo descrito [Z wicki et al., (1990) J. Bact. 172:4329] con varios cambios. En síntesis, se rehidrató un vial de bacterias P. woesei y se volvió a suspender en 0,5 ml de LB (caldo de Luria). Se centrifugaron las células a 14.000 xg durante 1 min y se volvieron a suspender los sedimentos celulares en 0,45 ml de TE. Se añadieron cincuenta microlitros de SDS al 10% y se incubó la mezcla a TA durante 5 min. Entonces se extrajo el lisado celular tres veces con fenol:cloroformo (1:1) y tres veces con cloroformo. Se añadieron quinientos microlitros de isopropanol al lisado extraído y se sedimentó el ADN mediante centrifugación a 14.000 xg durante 10 min. Se lavaron los sedimentos de ADN en 0,5 ml de etanol al 70% y se volvió a sedimentar el ADN mediante centrifugación a 14.000 xg durante 5 min. Se secaron los sedimentos de ADN y se volvieron a suspender en 100 1l de TE, y se usaron para reacciones PCR sin mayor purificación.

Para generar un fragmento génico de la FEN–1 de P. woesei para su clonación en un vector de expresión, se intentó realizar una PCR en condiciones poco restrictivas con cebadores complementarios a los extremos del marco de lectura abierto del gen de la FEN–1 de P. furiosus. Las secuencias de los cebadores del extremo 5’ y del extremo 3’ son: 5'–GATACCATGGGTGTCCCAATTGGTG–3' (SEC ID N.º 80) y 5'– TCGACGTCGACTTATCTCTTGAACCAACTTTCAAGGG–3' (SEC ID N.º 81), respectivamente. El elevado nivel de similitud secuencial de los homólogos de proteína (i.e., proteínas distintas a las proteínas FEN–1) de P. furiosus y P. woesei sugirió que había una elevada probabilidad de que el gen de la FEN–1 de P. woesei pudiera ser amplificado usando cebadores que contuvieran las secuencias complementarias al gen de la FEN–1 de P. furiosus. Sin embargo, este enfoque no tuvo éxito bajo varias condiciones diferentes de la PCR.

Se alinearon la secuencia de ADN de los genes de FEN–1 procedentes de P. furiosus y M. jannaschii, y se identificaron bloques de identidad secuencial entre los dos genes. Estos bloques fueron usados para diseñar cebadores internos (i.e., complementarios a las secuencias localizadas internamente a los extremos 5’ y 3’ del ORF) para el gen de FEN–1 que son complementarios al gen de la FEN–1 de P. furiosus en aquellas regiones conservadas. Las secuencias de los cebadores internos al extremo 5’ y extremo 3’ son: 5'– AGCGAGGGAGAGGCCCAAGC–3' (SEC ID N.º 82) y 5'–GCCTATGCCCTTTATTCCTCC–3' (SEC ID N.º 83), respectivamente. Se llevó a cabo una PCR empleando estos cebadores internos mediante el uso del equipo de PCR Advantage™y dio como resultado la producción de una banda principal de ~300 pb.

Como la PCR con los cebadores internos tuvo éxito, se intentaron llevar a cabo reacciones que contuvieran mezclas de los cebadores internos (SEC ID N.º 82 y 83) y externos (SEC ID N.º 80 y 81). Una reacción que contenía el cebador externo al extremo 5’ (SEC ID N.º 80) y el cebador interno al extremo 3’ (SEC ID N.º 83) dio como resultado la producción de una banda de 600 pb, y una reacción que contenía el cebador interno al extremo 5’ (SEC ID N.º 82) y el cebador externo al extremo 3’ (SEC ID N.º 81) dio como resultado la producción de una banda de 750 pb. Se purificaron sobre gel estos fragmentos de ADN solapantes y se combinaron con los cebadores externos (SEC ID N.º 80 y 81) en una reacción PCR. Esta reacción generó un fragmento de ADN de 1 kb que contenía el marco de lectura abierto entero del gen de la FEN–1 de Pwo. Se purificó sobre gel el producto de la PCR resultante, se digirió y se unió exactamente según lo descrito anteriormente para el producto de la PCR del gen de la FEN–1 de Mja. El plásmido resultante se denominó pTrc99–PWFEN1. El pTrc99–PWFEN1 se usó para transformar células JM109 de

E. coli competentes (Promega), usando técnicas estándar.

d) Preparación a gran escala de proteínas FEN–1 termoestables recombinantes

Se purificaron las proteínas FEN–1 de Mja, Pwo y Pfu mediante la siguiente técnica que deriva de un protocolo de preparación de ADN polimerasa de Taq [Engelke et al., (1990) Anal. Biochem, 191:396] como se describe a continuación. Se inocularon células de E. coli (cepa JM109) que contenían bien pTrc99–PFFEN1, pTrc99–PWFEN1

o pTrc99–MJFEN1 en 3 ml de LB (caldo de Luria) que contenía 100 1g/ml de ampicilina, y se cultivaron durante 16 h a 37°C. Se inoculó todo el cultivo de una noche en 200 ml o 350 ml de LB que contenía 1001g/ml de ampicilina, y se cultivó a 37°C con una agitación vigorosa a una A 600 de 0,8. Se añadió IPTG (solución madre 1M) hasta una concentración final de 1mM y se continuó el crecimiento durante 16 h a 37°C.

Se sedimentaron las células inducidas, y se pesaron los sedimentos celulares. Se añadió un volumen igual de 2 x tampón de DG (Tris–HCl 100mM, pH 7,6; EDTA 0,1mM) y se volvieron a suspender los sedimentos mediante agitación. Se añadieron cincuenta mg/ml de lisozima (Sigma, St. Louis, MO) hasta 1 mg/ml de concentración final, y se incubaron las células a temperatura ambiente durante 15 min. Se añadió ácido desoxicólico (solución al 10%) en gotas hasta una concentración final del 0,2% mientras se generaban movimientos vorticiales. Se añadieron un volumen de H2O y 1 volumen de 2 x tampón de DG, y se sometió la mezcla resultante a ultrasonidos durante 2 minutos sobre hielo para reducir la viscosidad de la mezcla. Tras el tratamiento de ultrasonidos, se añadió (NH4)2SO4 3M hasta una concentración final de 0,2M, y se centrifugó el lisado a 14.000 xg durante 20 min a 4°C. Se retiró el sobrenadante y se incubó a 70°C durante 6 0 min, momento en el que se añadió polietilimina al 10% (PEI) al 0,25%. Tras la incubación sobre hielo durante 30 min, se centrifugó la mezcla a 14.000 xg durante 20 minutos a 4°C. En este momento, se retiró el sobrenadante y se precipitaron las proteínas FEN–1 mediante la adición de (NH4)2SO4 como se explica a continuación.

Para las preparaciones de FEN–1 de Pwo y Pfu, se precipitó la proteína FEN–1 mediante la adición de 2 volúmenes de (NH4)2SO4 3M. Se incubó la mezcla por la noche a temperatura ambiente durante 16 h y se centrifugó la proteína a 14.000 xg durante 20 minutos a 4°C. Se volvieron a suspender los sedimentos de proteína en 0,5 ml de tampón de Q (Tris–HCl 50mM, pH 8,0; EDTA 0,1mM; Tween 20 al 0,1%). Para la preparación de la FEN–1 de Mja, se añadió (NH4)2SO4 sólido hasta una concentración final de 3M (–75% saturada), se incubó la mezcla sobre hielo durante 30 min y se sometió la proteína a una centrifugación descendente para volverla a suspender según lo descrito anteriormente.

Se cuantificaron las preparaciones de proteína resuspendidas mediante la determinación de la A279, y se sometieron a electroforesis alícuotas que contenían 2–4 1g de la proteína total sobre un gel de poliacrilamida–SDS al 10% (acrilamida: bis–acrilamida (29:1)) en tampón de Laemmli estándar [Laemmli (1970) Nature 277:680] y se tiñeron con azul brillante de Coomassie R; en la Fig. 64, se muestran los resultados.

En la Fig. 64, el carril 1 contiene marcadores del peso molecular (marcadores del peso molecular de proteínas de rango medio; Promega); indicándose el tamaño de las proteínas marcadoras a la izquierda del gel. El carril 2 contiene nucleasa BN Cleavase® purificada; los carriles 3–5 contienen extractos preparados a partir de E. coli que expresan las nucleasas FEN–1 de Pfu, Pwo y Mja, respectivamente. El peso molecular calculado (i.e., usando una traducción de la secuencia de ADN codificante de la nucleasa) de la nucleasa FEN–1 de Pfu es de 38.714 daltons y el peso molecular calculado para la nucleasa FEN–1 de Mja es de 37.503 daltons. Las proteínas FEN–1 de Pwo y Pfu co–emigraron sobre el gel de poliacrilamida–SDS y, por lo tanto, el peso molecular de la nucleasa FEN–1 de Pwo fue estimado en 38.7 kDa.

e) Análisis de la actividad usando endonucleasas FEN–1

i) Análisis mixto de horquillas

La nucleasa BN Cleavase® tiene una afinidad aproximadamente 60 veces mayor por una estructura de bucle del tallo de 12 pares de bases que por una estructura de ADN de bucle del tallo de 8 pares de bases. Como un análisis de la actividad diferencia entre la nucleasa BN Cleavase® y las nucleasas FEN–1, se incubó una mezcla de oligonucleótidos que tenían un bucle de tallo de bien 8 ó 12 pb (véase la Fig. 60 que representa los oligonucleótidos S–33 y 11–8–0) con un extracto preparado de células de E. coli que sobre–expresaban la nucleasa FEN–1 de Mja (preparadas según lo descrito anteriormente). Las reacciones contenían 0,05 1M de los oligonucleótidos S–33 (SEC ID N.º 84) y 11–8–0 (SEC ID N.º 85) (conteniendo ambos oligonucleótidos marcadores de fluoresceína en 5’), MOPS 10mM, pH 7,5; Tween–20 al 0,05%; NP–40 al 0,05%; MnCl2 1mM. Se calentaron las reacciones hasta 90°C durant e 10 segundos, se enfriaron hasta 55°C, luego se añad ió 1 1l del extracto crudo (FEN–1 de Mja) o de enzima purificada (nucleasa BN Cleavase®), y se incubaron las mezclas a 55°C durante 10 minutos; también se ej ecutó un control sin enzima. Se detuvieron las reacciones mediante la adición de formamida/EDTA, se sometieron a electroforesis sobre un gel de acrilamida al 20% desnaturalizante y se visualizaron sobre un generador de imágenes FMBIO 100 de Hitachi. En la Fig. 65, se muestra la imagen resultante.

En la Fig. 65, el carril 1 contiene los productos de reacción generados por la nucleasa BN Cleavase®; el carril 2 contiene los productos de reacción generados a partir de la reacción control sin enzima; y el carril 3 contiene los productos de reacción generados por la nucleasa FEN–1 de Mja. Los datos mostrados en la Fig. 76 demuestran que la nucleasa BN Cleavase® prefiere enormemente la estructura S33 (bucle de tallo de 12 pb), mientras que la nucleasa FEN–1 de Mja escinde las estructuras que tienen un bucle de tallo de bien 8 ó 12 pb con aproximadamente la misma eficacia. Esto muestra que la nucleasa FEN–1 de Mja tiene una especificidad de sustrato diferente que la nucleasa BN Cleavase®, característica útil para los análisis con InvaderTM o los análisis con CFLP® según lo tratado en el apartado de “Descripción de la invención”.

Ejemplo 29

La desoxinucleotidil transferasa terminal prolonga selectivamente los productos de la escisión dirigida por InvaderTM

La mayoría de los productos de degradación térmica de las sondas de ADN tendrá un fosfato en el extremo 3’. Para investigar si la ADN polimerasa independiente del molde desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) puede prolongar o polimerizar los fosfatos del extremo 3' anteriormente mencionados (i.e., añadir nucleótidos trifosfato al extremo 3’), se realizó el siguiente experimento.

Para crear una muestra que contuviera un gran porcentaje de productos de degradación térmica, se incubó el oligonucleótido marcado con fluoresceína en 5’ 34–078–01 (SEC ID N.º 86) (200 pmoles) en 100 1l de NaCO3 10mM (pH 10,6); NaCI 50mM a 95°C durante 13 horas. Para e vitar la evaporación, se cubrió la mezcla de reacción con 60 µl de cera líquida 14 ChillOut®. Se dividió la mezcla de reacción en dos alícuotas iguales (A y B). Se mezcló la alícuota A con un décimo de volumen de NaOAc 3M seguido por tres volúmenes de etanol, y se almacenó a –20°C. Se desfosforiló la alícuota B mediante la adición de 0,5 µl de MgCl2 1M y 1 µl de 1 unidad/µl de fosfatasa alcalina intestinal bovina (CIAP) (Promega), con la incubación a 37°C durante 30 min. Se añadió a la muestra un vol umen igual de fenol:cloroformo:alcohol isomaílico (24:24:1) seguido de movimientos vorticiales durante un minuto y luego una centrifugación de 5 minutos a la velocidad máxima en un microcentrifugador para separar las fases. Se retiró la fase acuosa a un nuevo tubo al que se añadió un décimo de volumen de NaOAc 3M y tres volúmenes de etanol, seguido por el almacenamiento a –20°C durante 30 mi nutos. Se centrifugaron ambas alícuotas (A y B) durante 10 minutos a velocidad máxima en un microcentrifugador para sedimentar el ADN. Entonces se lavaron los sedimentos dos veces cada vez con etanol al 80% y luego se disecaron hasta la sequedad. Entonces se disolvieron los sedimentos secos en 70 1l de H2Odd cada uno.

Las reacciones con TdT se realizaron como se explica a continuación. Se prepararon seis mezclas, conteniendo todas ellas TrisOAc 10mM (pH 7,5); MgOAc 10mM; KCl 50mM y dATP 2mM. Las mezclas 1 y 2 contenían un pmol de 34–078–01 sin tratar (SEC ID N.º 86), las mezclas 3 y 4 contenían 2 1l de alícuota A (anterior), las mezclas 5 y 6 contenían 2 1l de la alícuota B (anterior). Se añadió 1 1l de H2Odd a cada 9 1l de las mezclas 1, 3 y 5, y a cada 9 1l de las mezclas 2, 4 y 6, se añadió 1 1l de 20 unidades/1l de TdT (Promega). Se incubaron las reacciones a 37°C durante 1 hora, y luego se detuvo la reacción mediante la adición de 5 µl de formamida al 95% con EDTA 10mM y colorantes marcadores al 0,05%. Se resolvieron mediante electroforesis a través de gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (entrecruzamiento de 19:1) cinco microlitros de cada mezcla con urea 7M en un tampón que contenían que contenía Tris–Borato 45mM (pH 8,3) y EDTA 1,4mM, y se generaron imágenes usando el analizador de imágenes FMBIO con un filtro de 505 nm. En la Fig. 66, se muestra el barrido del generador de imágenes resultante.

En la Fig. 66, los carriles 1, 3 y 5 contienen 34–078–01 sin tratar (SEC ID N.º 86), 34–078–01 degradado térmicamente y 34–078–01 desfosforilado degradado térmicamente, respectivamente, incubados en ausencia de TdT. Los carriles 2, 4 y 6 contienen 34–078–01 sin tratar, 34–078–01 degradado térmicamente y 34–078–01 desfosforilado degradado térmicamente, respectivamente, incubados en presencia de TdT.

Como se muestra en la Fig. 66, vía 4, la TdT fue incapaz de prolongar los productos de degradación térmica que contenían un grupo fosfato en el extremo 3’, prolongando selectivamente moléculas que tenían un grupo hidroxilo en el extremo 3’.

Ejemplo 30

Prolongación de TdT específica de los productos de la escisión dirigida por InvaderTM con la posterior captura y detección sobre soportes de nitrocelulosa.

Cuando se usa TdT para prolongar los productos específicos de una escisión, un procedimiento para detectar los productos prolongados es la captura selectiva de los productos de la prolongación sobre un soporte sólido antes de la visualización. Este ejemplo demuestra que los productos de la escisión se pueden prolongar selectivamente mediante el uso de TdT y desoxinucleótidos trifosfato, y que los productos prolongados se pueden visualizar mediante captura usando un oligonucleótido complementario unido a un soporte de nitrocelulosa.

Para prolongar el producto de escisión generado en una reacción de escisión dirigida por InvaderTM, se realizó el siguiente experimento. Se prepararon tres mezclas de reacción, cada una en un tampón de MES 10mM (pH 6,5); Tween–20 al 0,5%; NP–40 al 0,5%. La primera mezcla contenía 5 fmoles de ADN diana de M13mp18; 10 pmoles del oligo sonda 32–161–2 (SEC ID N.º 87; este oligonucleótido sonda contiene ddC en 3’ y un grupo de amidita de Cy3 cerca del extremo 3'), y 5 pmoles de oligonucleótido InvaderTM 32 161–1 (SEC ID N.º 88; este oligo contiene un ddC en 3’). La segunda mezcla contenía los oligonucleótidos sonda e InvaderTM sin el ADN diana. La tercera mezcla era igual que la primera mezcla y contenía la misma secuencia sonda, pero con un marcador de fluoresceína en 5’ [oligo 32–161–4 (SEC ID N.º 89; este oligo contiene un ddC en 3’, un marcador de fluoresceína en 5’ y un grupo de colorante Cy3 cerca del extremo 3')], tal que los productos de la escisión dirigida por InvaderTM pudieran ser detectados antes y después de la escisión mediante generación de imágenes fluorescentes. La muestra control de sólo sonda contenía 10 pmoles del oligo 32–161–2 (SEC ID N.º 87). Cada 3 µl de mezcla enzimática contenía 5 ng de nucleasa DN Cleavase® en MgCl2 7,5mM. La mezcla de TdT (por cada 4 1l) contenía: 10 U de TdT (Promega), CoCl2 1mM; KCl 50mM, y 100 1M de dTTP. Se prepararon las mezclas de reacción de escisión con InvaderTM descritas anteriormente en tubos de pared fina, y se iniciaron las reacciones mediante la adición de 3 1l de la mezcla de enzima DN Cleavase®. Estas reacciones se incubaron a 65°C durante 20 minutos. Tras enfriar hasta 37° C, se añadieron 4 1l de la mezcla de TdT y se incubaron las muestras durante 4 min a 37°C. Entonces se añadió biotina– 16–dUTP a 100 1M y se incubaron las muestras durante 50 min a 37°C . Se finalizaron las reacciones mediante la adición de 1 µl de EDTA 0,5M.

Para analizar la eficacia de prolongación, se prepararon los productos sobre un gel de acrilamida. Se mezclaron cuatro microlitros de cada mezcla de reacción con 2,6 1l de formamida al 95%, EDTA 10mM y violeta de metilo al 0,05%, se calentó hasta 90°C durante 1 min, y se ca rgaron 3 1l sobre un gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (entrecruzamiento de 19:1) con urea 7M, en tampón que contenía Tris–Borato 45mM (pH 8,3) y EDTA 1,4mM. También se cargó un marcador [cX174–Hinfl (marcado con fluoresceína)]. Tras la electroforesis, se analizó el gel usando un analizador de imágenes de FMBIO–100 (Hitachi) equipado con un filtro de 505 nm. En la Fig. 67, se muestra el barrido resultante.

En la Fig. 67, el carril 1 sólo contenía la sonda 32–161–2, sin ningún tratamiento. Los carriles 2 y 3 contenían los productos de las reacciones ejecutadas sin ADN diana, sin o con la posterior prolongación con TdT, respectivamente. Los carriles 4 y 5 contenían los productos de las reacciones ejecutadas con ADN diana, el oligo sonda 32–161–2 (SEC ID N.º 87) y el oligo Invader™ 32–161–1 (SEC ID N.º 88), sin o con la posterior prolongación con TdT, respectivamente. Los carriles 6 y 7 muestran los productos de las reacciones que contienen ADN diana, el oligo sonda 32–161–4 (SEC ID N.º 89) y el oligo Invader™ 32–161–1 (SEC ID N.º 88), sin o con la posterior prolongación con TdT, respectivamente. El carril M contiene el marcador cX174–Hinfl.

Los productos de reacción de los carriles 4 y 5 son los mismos que aquéllos observados en los carriles 6 y 7, a excepción de que la ausencia de una fluoresceína en 5’ sobre la sonda evita la detección del producto 5’ liberado (indicado como “A” cerca de la parte inferior del gel) o el producto 5’ prolongado con TdT (indicado como “B”, cerca de la parte superior del gel). La parte 3’ marcada con Cy3 de la sonda escindida es visible en la totalidad de estas reacciones (indicada como “C”, justo debajo del centro del gel).

Para demostrar la detección de los productos de la escisión dirigida por InvaderTM dependientes de una diana sobre un soporte sólido, se analizaron las reacciones de los carriles 3 y 5 sobre el Genecomb® universal (Bio–Rad), que es una matriz de nitrocelulosa estándar sobre un refuerzo de nylon rígido diseñado en forma de peine, según lo representado en la Fig. 68. Siguiendo el protocolo del fabricante, con una modificación: se usaron 10 1l de las reacciones de la escisión dirigida por InvaderTM en lugar del 10% de una PCR recomendado. Para capturar los productos de escisión, se salpicaron 2,5 pmoles del oligo de captura 59–28–1 (SEC ID N.º 90) sobre cada diente. Las etapas de captura y de visualización se realizaron según las indicaciones del fabricante. En la Fig. 68, se muestran los resultados.

En la Fig 68, los dientes numerados como 6 y 7 muestran los resultados de la captura de las reacciones llevadas a cabo sin y con ADN presente. El diente 8 muestra el control positivo del equipo.

La oscuridad de la mancha observada sobre el diente 7, en comparación con el diente 6, indica claramente que los productos de los análisis de escisión dirigida por Invader™ se pueden detectar específicamente sobre soportes sólidos. Aunque se usó el Genecomb® universal para demostrar la captura sobre soporte sólido en este caso, hay otros procedimientos de captura sobre soportes conocidos por los expertos en la técnica que serían igualmente adecuados. Por ejemplo, se pueden revestir con facilidad perlas o las superficies de las cubas de reacción con oligonucleótidos de captura para que puedan ser usadas en esta etapa. Alternativamente, se pueden revestir soportes sólidos similares fácilmente con estreptavidina o anticuerpos para la captura de los productos de la reacción de escisión/prolongación marcados con biotina o hapteno. En cualquiera de estas realizaciones, es posible visualizar apropiadamente los productos mediante la detección de la fluorescencia, quimioluminiscencia, cambios colorimétricos, emisiones radiactivas, cambios en la densidad óptica o cualquier otra característica distinguible resultante del producto.

Ejemplo 31

Comparación de los efectos de la longitud de la invasión y del marcador de 5’ de la sonda sobre la escisión dirigida por Invader™realizada por las nucleasas A/G Cleavase® y FEN–1 de Pfu

Para investigar el efecto de la longitud de la invasión, así como el efecto del tipo de colorante sobre la capacidad de la nucleasa FEN–1 de Pfu y la nucleasa A/G Cleavase® para escindir brazos 5’, se realizó el siguiente experimento. Se prepararon tres sondas de secuencias similares marcadas bien con fluoresceína, TET o Cy3 en reacciones con tres oligonucleótidos Invader™ que crearon regiones de hibridación con la diana solapantes de ocho, cinco y tres bases a lo largo del ácido nucleico diana M13mp18.

Las reacciones se ejecutaron como se explica a continuación: Todas las condiciones se realizaron por duplicado. Se prepararon mezclas enzimáticas para la nucleasa FEN–1 de Pfu y la nucleasa A/G Cleavase®. Cada 2 µl de la mezcla de FEN–1 de Pfu contenían 100 ng de FEN–1 de Pfu (preparados según lo descrito en el Ej. 28) y MgCl2 7,5mM. Cada 2 µl de mezcla de A/G Cleavase® contenían 5,3 ng de nucleasa A/G Cleavase® y MnCl2 4,0mM. Se prepararon seis mezclas maestras que contenían tampón, M13mp18 y oligonucleótidos Invader™. Cada 7 1l de las mezclas 1–3 contenían 1 fmol de M13mp18, 10 pmoles de oligonucleótido Invader™[34–078–4 (SEC ID N.º 39), 24– 181–2 (SEC ID N.º 91) o 24–181–1( SEC ID N.º 92) en MOPS 10mM (pH 7,5), LiCl 150mM. Cada 7 µl de las mezclas 4–6 contenían 1 fmol de M13mp18, 10 pmoles de oligonucleótido Invader™[34–078–4 (SEC ID N.º 39), 24– 181–2 (SEC ID N.º 91) o 24–181–1( SEC ID N.º 92) en Tris 10mM (pH 8,0) . Entonces se dividieron las mezclas 1–6 en tres mezclas a cada una de las cuales se añadió bien la sonda marcada con fluoresceína (oligo 34–078–01; SEC ID N.º 86), la sonda marcada con Cy3 (oligo 43–20; SEC ID N.º 93) o la sonda marcada con TET (oligo 90: SEC ID N.º 32 que contenía un marcador de TET en 5’). Cada 7 1l de todas las mezclas contenían 10 pmoles de la correspondiente sonda. Se cubrieron las soluciones de ADN descritas anteriormente con 10 1l de barrera contra la evaporación ChillOutTM y se llevaron hasta 68°C.

Las reacciones generadas a partir de las mezclas 1–3 fueron iniciadas con 2 1l de la mezcla de nucleasa A/G Cleavase® y las reacciones generadas a partir de las mezclas 4–6 fueron iniciadas con 2 1l de la mezcla de FEN–1 de Pfu. Tras 30 minutos a 68°C, se detuvieron las reaccio nes mediante la adición de 8 µl de formamida al 95% con EDTA 10mM y colorantes marcadores al 0,05%. Se calentaron las muestras hasta 90°C durante 1 minuto inmediatamente antes de la electroforesis a través de gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón que contenía Tris–Borato 45mM, (pH 8,3); EDTA 1,4mM. Se visualizaron los productos de las reacciones de escisión tras la electroforesis mediante el uso de un generador de imágenes fluorescentes FMBIO de Hitachi. Los resultados de la sonda marcada con fluoresceína se muestran en la Fig. 69, los resultados de la sonda marcada con Cy3, en la Fig. 70, y los resultados de la sonda marcada con TET, en la Fig. 71. Cada una de estas figuras de productos de la escisión realizada por A/G Cleavase® se muestran en los carriles 1–6, y los productos de la escisión realizada por la FEN–1 de Pfu se muestran en los carriles 7–12. En cada caso, el material sin cortar aparece como una banda muy oscura cerca de la parte superior del gel, indicado por una “U” a la izquierda. Los productos de la escisión dirigida por oligonucleótidos invasores con 8, 5 ó 3 bases de solapamiento (i.e., la región “X” era de una longitud de 8, 5 ó 3 nt) se muestran en el primer, segundo y tercer par de vías en cada conjunto, respectivamente, estando los extremos 5’ marcados liberados de estas reacciones indicados con los números 8, 5 y 3 a la izquierda. Obsérvese que en las reacciones de escisión mostradas en la Fig. 70, la presencia de colorante Cy3 cargado positivamente hace que los productos más cortos emigren más lentamente que los productos más largos. Estos productos no contienen ninguna carga positiva adicional, p.ej., modificaciones amino como las usadas en el ejemplo 23, y por tanto, todavía portan una carga negativa neta y emigran hacia el electrodo positivo en una serie de electroforesis estándar.

Se puede observar a partir de estos datos que las nucleasas de estructura específica A/G Cleavase® y FEN–1 de Pfu responden de manera diferente tanto a la identidad del colorante como al tamaño del trozo por ser escindido desde la sonda. La nucleasa FEN–1 de Pfu mostró mucha menor variabilidad como respuesta a la identidad del colorante de lo que lo hizo la nucleasa A/G Cleavase®, demostrando que cualquier colorante sería adecuado para el uso con esta enzima. Por el contrario, la cantidad de escisión catalizada por la nucleasa A/G Cleavase® varió sustancialmente con la identidad del colorante. El uso del colorante de fluoresceína ofreció resultados muy próximos a aquéllos observados con la nucleasa FEN–1 de Pfu, mientras que el uso de bien Cy3 o TET ofreció una señal reducida de manera espectacular en comparación con las reacciones con la FEN–1 de Pfu. La excepción a esto estuvo en la escisión del producto de 3 nt que portaba un colorante de TET (vías 5 y 6, Fig. 71), en el que la nucleasa A/G Cleavase® proporcionó la escisión a la misma velocidad que la nucleasa FEN–1 de Pfu. Estos datos indican que, aunque es posible usar la A/G Cleavase® para escindir sondas marcadas con estos otros colorantes, la nucleasa FEN–1 de Pfu es una nucleasa preferida para la escisión de sondas marcadas con Cy3 y con TET.

Ejemplo 32

Examen de los efectos de una carga positiva en 5’ sobre la velocidad de la escisión invasiva usando las nucleasas A/G Cleavase® o FEN–1 de Pfu

Para investigar si las cargas positivas colocadas sobre el extremo 5' de los oligonucleótidos sonda que contienen uno o varios aductos cargados positivamente (i.e., sondas de tecnologías de inversión de la carga o CTR según lo descrito en el Ej. 23 y 24) tienen un efecto sobre la capacidad de la nucleasa A/G Cleavase® o la nucleasa FEN–1 de Pfu para escindir el brazo 5’ de la sonda, se realizó el siguiente experimento.

Se utilizaron dos oligonucleótidos sonda con las siguientes secuencias en las reacciones con Invader™: Sonda 34– 180–1: (N–Cy3)TNH2TNH2CCAGAGCCTAATTTGCC AGT(N–fluoresceína)A, en la que N representa un espaciador que contiene bien el grupo Cy3 o el grupo fluoresceína (SEC ID N.º 94) y la sonda 34–180–2: 5’–(N– TET)TTCCAGAGCC TAATTTGCCAGT–(N–fluoresceína)A, en la que N representa un espaciador que contiene bien el grupo TET o el grupo fluoresceína (SEC ID N.º 95). La sonda 34–180–1 tiene amino–modificadores sobre los dos residuos T del extremo 5' y un marcador de Cy3 sobre el extremo 5', creando cargas positivas extra sobre el extremo 5'. La sonda 34–180–2 un marcador de TET sobre el extremo 5', sin cargas positivas extra. El marcador de fluoresceína sobre el extremo 3' de la sonda 34–180–1 permite la visualización de los productos escindidos en 3’ y las sondas sin escindir juntos sobre un gel de acrilamida ejecutada en el sentido estándar (i.e., con la emigración del ADN hacia el electrodo positivo). El producto escindido en 5’ de la sonda 34–180–1 tiene una carga positiva neta y no emigrará en el mismo sentido que la sonda sin escindir, siendo por tanto visualizado mediante la resolución sobre un gel en el sentido opuesto (i.e., con este ADN emigrando hacia el electrodo negativo).

Las reacciones de escisión se realizaron como se explica a continuación: Todas las condiciones se realizaron por duplicado. Se prepararon las mezclas enzimáticas para la nucleasa FEN–1 de Pfu y la nucleasa A/G Cleavase®. Cada 2 µl de la mezcla de FEN–1 de Pfu contenían 100 ng de la FEN–1 de Pfu (preparados según lo descrito en el Ej. 28) y MgCl2 7,5mM. Cada 2 µl de mezcla de A/G Cleavase® contenían 26,5 ng de nucleasa A/G Cleavase® y MnCl2 4,0mM. Se prepararon cuatro mezclas maestras que contenían tampón, M13mp18 y oligonucleótidos Invader™. Cada 7 µl de la mezcla 1 contenían 5 fmol de M13mp18, 10 pmoles de oligonucleótido Invader™ 123 (SEC ID N.º 96) en HEPES 10mM (pH 7,2). Cada 7 µl de la mezcla 2 contenían 1 fmol de M13mp18, 10 pmoles de oligonucleótido Invader™ 123 en HEPES 10mM (pH 7,2). Cada 7 µl de la mezcla 3 contenían 5 fmol de M13mp18, 10 pmoles de oligonucleótido Invader™ 123 en HEPES 10mM (pH 7,2), KGIu 250mM. Cada 7 µl de la mezcla 4 contenían 1 fmol de M13mp18, 10 pmoles de oligonucleótido Invader™ 123 en HEPES 10mM (pH 7,2), KGIu 250mM. Para cada 7 1l de cada mezcla, se añadieron 10 pmoles de bien sonda 34–180–1 (SEC ID N.º 94) o sonda 34–180–2 (SEC ID N.º 95). Se cubrieron las soluciones de ADN descritas anteriormente con 10 µl de barrera contra la evaporación ChillOutTM y se llevaron hasta 65°C. Las reacciones generadas a partir de las mezclas 1–2 fueron iniciadas mediante la adición de 2 µl de la mezcla de la FEN–1 de Pfu, y las reacciones generadas a partir de las mezclas 3–4 fueron iniciadas mediante la adición de 2 µl de la mezcla de nucleasa A/G Cleavase®. Tras 30 minutos a 65°C, se detuvieron las reacciones mediante la ad ición de 8 µl de formamida al 95% que contenía EDTA 10mM. Se calentaron las muestras hasta 90°C durante 1 minu to inmediatamente antes de la electroforesis a través de gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón que contenía Tris– Borato 45mM, (pH 8,3); EDTA 1,4mM y un gel de acrilamida nativo al 20% (entrecruzamiento de 29:1) en un tampón que contenía Tris–Borato 45mM, (pH 8,3); EDTA 1,4mM.

Se visualizaron los productos de las reacciones de escisión tras la electroforesis mediante el uso de un generador de imágenes fluorescentes FMBIO de Hitachi. En la Fig. 72, se muestran las imágenes resultantes. La Fig. 72A muestra el gel desnaturalizante que fue ejecutado en el sentido de la electroforesis estándar y la Fig. 72B muestra el gel nativo que fue ejecutado en el sentido inverso. Los productos de reacción generados por las nucleasas FEN–1 de Pfu y A/G Cleavase® se muestran en los carriles 1–8 y 9–16, respectivamente. Los productos de las reacciones de 5 fmoles de M13mp18 y de 1 fmol de M13mp18 se muestran en los carriles 1–4, 9–12 (5 fmoles) y 5–8, 13–16 (1 fmol). La sonda 34–180–1 está en los carriles 1–2, 5–6, 9–10, 13–14, y la sonda 34–180–2 está en los carriles 3–4, 7–8, 11–12, 15–16.

En la Fig.72A, se muestran los fragmentos del extremo 3' marcados con fluoresceína procedentes de todas las reacciones de escisión. Los productos marcados con TET en 5’ de 3 nt no son visibles en esta figura, mientras que los productos marcados con Cy3 en 5’ se muestran en la Fig. 72B.

Las bandas del extremo 3’ de la Fig. 72A se pueden usar para comparar las velocidades de escisión de las diferentes enzimas en presencia de los diferentes marcadores del extremo 5'. A partir de esta banda se puede observar que, independientemente de la cantidad de ácido nucleico diana presente, tanto la nucleasa FEN–1 de Pfu como la nucleasa A/G Cleavase® muestran más producto procedente de la sonda marcada con TET en 5’. Con la nucleasa FEN–1 de Pfu, esta preferencia es modesta, con un aumento de la señal de sólo aproximadamente el 25 al 40%. Sin embargo, en el caso de la nucleasa A/G Cleavase®, hay una fuerte preferencia por el marcador de TET de 5’. Por lo tanto, aunque cuando se usa el procedimiento de inversión de la carga para resolver los productos, se observa una cantidad sustancial de producto procedente de las reacciones catalizadas por la nucleasa A/G Cleavase®, la nucleasa FEN–1 de Pfu es una enzima preferida para la escisión de las sondas marcadas con Cy3.

Ejemplo 33

El uso de bases universales en la detección de apareamientos erróneos mediante la escisión dirigida por Invader™

El término “base degenerada” se refiere a una base situada sobre un nucleótido que no forma un enlace de hidrógeno de la manera de "Watson–Crick" estándar con un complemento de base específico, i.e., A con T y G con

C. Por ejemplo, se puede hacer que la base de inosina se aparee mediante uno o dos enlaces de hidrógeno con todas las bases naturales (el efecto del “titubeo”) y por eso se denomina degenerada. Alternativamente, una base degenerada puede no aparearse en absoluto; este tipo de base ha sido denominada base “universal”, porque puede estar colocada frente a cualquier nucleótido de un dúplex y, aunque no contribuya a la estabilidad mediante el apareamiento con una base, no desestabiliza activamente abarrotando la base opuesta. Los dúplex que usan estas bases universales son estabilizados sólo apilando interacciones. En las Fig. 73, se muestran dos ejemplos de bases universales, 3–nitropirrol y 5–nitroindol. En la hibridación, la colocación de un 3–nitropirrol tres bases a partir de una posición de apareamiento erróneo aumenta el reconocimiento diferencial de los apareamientos erróneos de una base. El aumento de la diferenciación parece proceder del efecto desestabilizante de la base no natural (i.e., una Tm modificada en las proximidades cercanas al apareamiento erróneo). Para analizar este mismo principio como modo de detectar sensiblemente los apareamientos erróneos usando un análisis de escisión dirigida por Invader™, se diseñaron oligonucleótidos Invader™ usando las bases universales mostradas en la Fig. 73, en presencia o en ausencia de un apareamiento erróneo natural. En estos experimentos, se examinó el uso de bases de nitropirrol sin aparear o de pares de bases de nitroindol flanqueando el sitio del apareamiento erróneo.

En la Fig. 74, se muestran los oligonucleótidos diana, sonda e Invader™ usados en estos análisis. Como diana, se usó un oligonucleótido de 43 nucleótidos (oligo 109; SEC ID N.º 97). El oligonucleótido sonda (oligo 61; SEC ID N.º 50) libera un producto marcado con carga positiva neta tras la escisión. En la Fig. 74, se muestra esquemáticamente el oligonucleótido Invader™ sobre el oligonucleótido diana como una flecha; la punta de flecha indica la ubicación del apareamiento erróneo entre los oligos Invader™ y la diana. Debajo del oligonucleótido diana, se muestran el oligo Invader™ completamente complementario, todo natural (i.e., sin bases universales) (oligo 67; SEC ID N.º 51) y un compuesto de oligos Invader™ que contiene bases universales (“X”) a cada lado del apareamiento erróneo (“M”). Se emplearon los siguientes oligos Invader™: el oligo 114 (SEC ID N.º 98) que contiene un apareamiento erróneo de un solo nt; el oligo 115 (SEC ID N.º 99) que contiene dos bases de 5–nitroindol y ningún apareamiento erróneo; el oligo 116 (SEC ID N.º 100) que contiene dos bases de 5–nitroindol y un apareamiento erróneo de un solo nt; el oligo 112 (SEC ID N.º 101) que contiene una base de 3–nitropirrol y ningún apareamiento erróneo; el oligo 113 (SEC ID N.º 102) que contiene una base de 5–nitropirrol y un apareamiento erróneo de un solo nt; y un oligo 67 (SEC ID N.º 51), que es completamente complementario a la diana.

Las reacciones de la escisión dirigida por Invader™ se llevaron a cabo en 10 1l de MOPS 10mM (pH 7,2); KCl 100mM que contenía 1 1M del oligonucleótido invasor apropiado (oligos 67, 112–116); diana 109 sintética 10nM, sonda 61 marcada con Cy–3 11M y 2 unidades de DV Cleavase® (preparada según lo descrito en el Ej. 27). Se taparon las reacciones con cera líquida Chill–Out®, se llevaron hasta la temperatura de reacción apropiada, 52°C, 55°C o 58°C, y se iniciaron mediante la adición de 1 1l de MnCl2 40mM. Se dejaron proseguir las reacciones durante 1 hora y se detuvieron mediante la adición de 10 µl de formamida. Se cargó un cuarto del volumen total de cada reacción sobre geles de poliacrilamida no desnaturalizantes al 20% que fueron sometidos a electroforesis en el sentido inverso. Se visualizaron los productos usando un generador de imágenes fluorescentes FMBIO–100 de Hitachi, usando un filtro de 585 nm. En la Fig. 75A–C, se muestran las imágenes resultantes. En cada panel, los carriles 1–6 contienen los productos de reacción de las reacciones en las que se usan los oligos Invader™ 67, 114, 115, 116, 112 y 113, respectivamente. Las reacciones ejecutadas a 52°C, 55°C y 58°C se muestran en los paneles A, B y C, respectivamente.

Estos datos muestran que dos 5–nitroindoles flanqueantes presentan una diferenciación significativamente mayor que la presentada por un sistema de 3–nitropirrol, o la hibridación de todas las bases naturales, y este aumento de sensibilidad no depende de la temperatura. Esto demuestra que el uso de bases universales es un procedimiento útil para detectar sensiblemente los apareamientos erróneos de una sola base entre el ácido nucleico diana y el complejo de oligonucleótidos de detección de la presente invención.

Ejemplo 34

Detección de mutaciones puntuales en el oncogén Ras humano mediante el uso de una minisonda

En la presente memoria, se demuestra que las sondas muy cortas se pueden usar para la detección sensible de secuencias de ácido nucleico diana (Ej. 37). En este ejemplo, se demuestra que las sondas cortas escasamente funcionan cuando están apareadas erróneamente con la diana, y por consiguiente, que es posible usarlas para distinguir una determinada secuencia de ácido nucleico de otra estrechamente relacionada que tenga sólo una diferencia de una sola base. Para analizar este sistema, se crearon secuencias diana del oncogén ras humano sintético que variaban entre sí en una posición. El oligonucleótido 166 (SEC ID N.º 103) proporcionó la secuencia diana de ras de tipo natural. El oligonucleótido 165 (SEC ID N.º 104) proporcionó la secuencia diana de ras mutante. En la Fig. 76, se muestra la secuencia de estos oligonucleótidos, y se indica el sitio de la variación secuencial en el sitio correspondiente al codón 13 del gen ras. El oligonucleótido Invader™ (oligo 162) tiene la secuencia:

5'–GsCsTsCsAsAsGsGsCsACTCTTGCCTACGA–3’ (SEC ID N.º 105), en la que la “S” indica los enlaces de tiol [i.e., éstos son 2'–desoxinucleótido–5'–O–(1–tiomonofatos)]. La minisonda (oligo 161) tiene la secuencia: 5'–(N– Cy3)TNH2TNH2C ACCAG–3’ (SEC ID N.º106) y está diseñada para detectar la secuencia diana de ras mutante (i.e., es completamente complementaria al oligo 165). El oligonucleótido apilador (oligo 164) tiene la secuencia: 5'– CsTsCsCsAsAsCs TsAsCCACAAGTTTATATTCAG–3' (SEC ID N.º 107). En la Fig. 76, se representa un esquema que muestra el ensamblaje de estos oligonucleótidos en una estructura de escisión.

Cada reacción de escisión contenía 100 nM de oligonucleótido tanto invasor (oligo 162) como apilador (oligo 164), sonda marcada con Cy3 101M (oligo 161) y 100 pM de bien oligo 165 u oligo 166 (ADN diana) en 10 1l de HEPES 10mM (pH 7,2); KGIu 250mM; MnCl2 4mM. Se cubrieron las mezclas de ADN con aceite mineral, se calentaron hasta 90°C durante 15 s, luego se llevaron hasta un a temperatura de reacción de 47ºC, 50ºC, 53ºC o 56ºC. Se iniciaron las reacciones mediante la adición de 1 µl de 100 ng/µl de FEN–1 de Pfu. Se dejaron proseguir las reacciones durante 3 horas y se detuvieron mediante la adición de 10 µl de formamida. Se cargó un cuarto del volumen total de cada reacción sobre geles de poliacrilamida no desnaturalizantes al 20% que fueron sometidos a electroforesis en el sentido inverso. Se exploró el gel usando un escáner fluorescente FMBIO–100 de Hitachi equipado con un filtro de 585 nm, mostrándose la imagen resultante en la Fig. 77.

En la Fig. 77, se muestran, para cada temperatura de reacción analizada, los productos de las reacciones que contienen bien la secuencia diana de ras mutante (oligo 165) o la de tipo natural (oligo 166).

Estos datos demuestran que es posible usar la minisonda para diferenciar sensiblemente entre las secuencias que difieren en un solo nucleótido. La minisonda fue escindida para producir una señal potente en presencia de la secuencia diana mutante, pero poca o nada de minisonda se escindió en presencia de la secuencia diana de tipo natural. Además, la distinción entre las dianas estrechamente relacionadas es eficaz en un intervalo de temperaturas de al menos 10°C, que es un intervalo mucho más amp lio de temperaturas que el habitualmente tolerable cuando la selección sólo se basa en la hibridación (p. ej., la hibridación con ASO). Esto sugiere que la enzima puede ser un factor en la diferenciación, siendo la minisonda perfectamente apareada el sustrato preferido en comparación con la minisonda apareada erróneamente. De este modo, este sistema proporciona una detección sensible y específica de las secuencias de ácido nucleico diana.

Ejemplo 35

Efectos de la identidad del extremo 3' sobre el sitio de escisión de una estructura de oligonucleótido modelo

Según lo descrito en los ejemplos anteriores, las nucleasas de estructura específica escinden cerca de la unión entre la región monocatenaria y la región con apareamiento de bases de un dúplex bifurcado, habitualmente aproximadamente un par de bases dentro de la región con apareamiento de bases. En el ejemplo 10, se mostró que las nucleasas 5' termoestables, incluyendo aquéllas de la presente invención (p. ej., nucleasa BN Cleavase®, nucleasa A/G Cleavase®) tienen la capacidad de escindir una mayor distancia dentro de la región con apareamiento de bases cuando se proporcionan con un oligonucleótido secuencia arriba que porta una región 3’ que es homóloga a la región 5’ del dúplex en cuestión, según lo mostrado en la Fig. 26. También se ha determinado que el nucleótido del terminal 3’ del oligonucleótido invasor puede estar desapareado del ácido nucleico diana y seguir desplazando la escisión la misma distancia dentro del dúplex de secuencia abajo que como cuando está apareado. En este ejemplo se muestra que es el componente de base del nucleótido, no el azúcar ni el fosfato, el que se necesita para desplazar la escisión.

La Fig. 78A y B muestran un oligonucleótido sintético que fue diseñado para plegarse sobre sí mismo, que está constituido por la siguiente secuencia: 5'–GTTCTCTGCTCTCTGGTC GCTGTCTCGCTTGTGAAACAAGCGAGACAGCGTGGTCTCTCG–3' (SEC ID N.º 29). Este oligonucleótido se denomina “horquilla S–60”. La horquilla de 15 pares de bases formada por este oligonucleótido se hace más estable mediante una secuencia de “tri–bucle” en el extremo del bucle (i.e., tres nucleótidos forman la parte del bucle de la horquilla) [Hiraro, I. et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22(4):576]. La Fig. 78B muestra la secuencia del oligonucleótido P–15 (SEC ID N.º 30) y la ubicación de la región de complementariedad compartida por los oligonucleótidos de horquilla P–15 y S–60. Además del oligonucleótido P–15 mostrado, también se analizó la escisión en presencia del oligonucleótido P–14 (SEC ID N.º 108) (P–14 es una base más corto en el extremo 3' en comparación con P–15), el P–14 con un azúcar abásico (P–14d; SEC ID N.º 109) y el P14 con un azúcar abásico con un fosfato 3’ (P–14dp; SEC ID N.º 110). También se examinó el oligo P–15 con un fosfato 3’, P–15p (SEC ID N.º 111). Las puntas de flecha negras mostradas en la Fig. 78 indican los sitios de la escisión de la horquilla S–60 en ausencia (estructura superior; A) o en presencia (estructura inferior; B) del oligonucleótido P–15.

La molécula de horquilla S–60 fue marcada en su extremo 5' con fluoresceína para su posterior detección. Se incubó la horquilla S–60 en presencia de una nucleasa 5' termoestable en presencia o en ausencia del oligonucleótido P–15. La presencia del dúplex completo que se puede formar mediante la horquilla S–60 se demuestra mediante la escisión con la nucleasa 5' BN Cleavase® de una manera independiente del cebador (i.e., en ausencia del oligonucleótido P–15). La liberación de los fragmentos de 18 y 19 nucleótidos del extremo 5' de la molécula de horquilla S–60 demostró que la escisión tuvo lugar cerca de la unión entre las regiones monocatenaria y bicatenaria cuando no había nada hibridado al brazo 3' de la horquilla S–60 (Fig. 27, vía 2).

Las reacciones mostradas en la Fig. 78C se realizaron en 10 1l de 1 x tampón CFLP con MnCl2 1mM y glutamato de potasio 50mM en presencia de S–60 0,021M; oligonucleótido Invader™0,51M y 0,01 ng por 1l de nucleasa BN Cleavase®. Se incubaron las reacciones a 40°C durant e 5 minutos y se detuvieron mediante la adición de 8 µl de tampón de detención (formamida al 95%, EDTA 20mM y violeta de metilo al 0,02%). Se calentaron las muestras hasta 75°C durante 2 minutos inmediatamente antes d e la electroforesis a través de gel de acrilamida al 15% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón de Tris–Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM. Entonces se analizaron los geles con un analizador de imágenes de FMBIO–100 (Hitachi) equipado con un filtro de 505 nm. En la Fig. 78C, se muestra la imagen resultante.

En la Fig. 78C, el carril 1 contiene productos procedentes del control sin enzima; el carril 2 contiene productos de una reacción llevada a cabo en ausencia de un oligo Invader™; los carriles 3–6 contienen productos de reacciones llevadas a cabo en presencia de los oligos Invader™P–14d, P–14dp, P–15 y P–15p, respectivamente.

De los datos mostrados en la Fig. 78C, se puede observar que el uso del oligonucleótido Invader™ P–15 produce un desplazamiento del sitio de escisión, mientras que el oligonucleótido Invader™P14 bien con una ribosa (P14d) o una ribosa fosforilada (P14dp) no lo hizo. Esto indica que el residuo 15 del oligonucleótido Invader™debe tener el grupo de bases unido para promover el desplazamiento de la escisión. Lo interesante es que la adición de fosfato en el extremo 3’ del oligonucleótido P15 aparentemente invirtió el desplazamiento del sitio de escisión. La escisión en esta vía puede ser de hecho la escisión en ausencia de un oligonucleótido Invader™, como se observa en el carril 2. En experimentos con oligonucleótidos invaderTM marcados con colorante en 5’ que tienen grupos fosfato 3’, la emigración de estos oligonucleótidos en el gel se ha visto gravemente retardada, lo que sugiere que bien la enzima u otro constituyente de la reacción (p. ej., ASB) es capaz de unirse al fosfato 3’ independientemente del resto de la estructura de escisión. Si los oligonucleótidos Invader™ están de hecho siendo secuestrados lejos de la estructura de escisión, la escisión resultante de la horquilla S–60 tendría lugar de un modo independiente del cebador y no sería, por tanto, desplazada.

Además del estudio citado anteriormente, se investigaron los efectos de otros sustituyentes sobre los extremos 3’ de los oligonucleótidos Invader™ en presencia de varias enzimas diferentes y en presencia de bien Mn++ o Mg++. Los efectos de estas modificaciones del extremo 3' sobre la generación del producto escindido se resumen en la siguiente tabla. Todas las modificaciones fueron realizadas durante la síntesis de oligonucleótidos estándar mediante el uso de columnas de síntesis de vidrio de poro controlado (CPG) con los restos químicos enumerados proporcionados sobre el soporte como el residuo inicial de la síntesis. Todos estos materiales de CPG fueron adquiridos en Glen Research Corp. (Sterling, VA).

La Fig. 79 proporciona las estructuras para los sustituyentes del extremo 3’ usados en estos experimentos.

TABLA 3

Estudios de modificación del extremo 3’ de oligos invasores

Modificación del extremo 3’

Prolongación mediante transferasa terminal Efecto sobre la rxn con el invasor (como invasor) Enzima: condición – Efecto

Parte Glen n.º 20–2900–43 del fosfato 3’

no A:5 – inhibe la reacción, actividad no detectable

Parte Glen n.º 20–2973–42 de la acridina 3’

Sí, un poco A:5 – descenso en actividad, <10% B:5 – descenso en actividad, <10% B:4 – descenso en actividad, <10% C:1 – descenso en actividad, <10% C:2 – descenso en actividad, -20% C:4 – descenso en actividad, -50% C:3 – descenso en actividad, <5%

Parte Glen n.º 20–4090–42 del carboxilato 3’

No A:1 – descenso en actividad, ~50% Desplazamiento de la actividad en el sitio de escisión C:3 – reduce la velocidad, <10% de actividad

Parte Glen n.º 20–2143–42 del nitropirrol 3’

Sí A:5 – aumento en actividad, ~x 2

Parte Glen n.º 20–2144–42 del nitroindol 3’

Sí A:5 – aumento en actividad, ~33% de actividad

Parte Glen n.º 104010–90 de la arabinosa 3’

Sí A:5 – descenso en actividad, ~50% de actividad

3’didesoxiUTP–fluoresceína

No A:4 – descenso en actividad, ~40% de actividad

Parte Glen n.º 20–0002–01 del

No A:1– desplazamiento de la

enlace 3’–3’

actividad de escisión equivalente C:3 – descenso en actividad, ~25% de actividad

Parte Glen n.º 20–2902–42 del

Sí, muy poca C:3 – descenso en actividad,

glicerilo 3’

~30% de pérdida de actividad de especificidad de la escisión (2 sitios)

Parte Glen n.º 20–2957–42 del

Sí C:3 – descenso en actividad,

amino modificador 3’ C7

~30% de pérdida actividad de especificidad, múltiples sitios

(Continuación)

Estudios de modificación del extremo 3’ de oligos invasores

Modificación del extremo 3’

Prolongación mediante transferasa terminal Efecto sobre la rxn con el invasor (como invasor) Enzima: condición – Efecto

Parte Glen n.º 20–2104–42 de 3’desoxi, 2’OH

Sí, muy poca A:5 – descenso en actividad, <20% de actividad B:5 – descenso en actividad, <20% de actividad B:3 – descenso en actividad, <20% de actividad C:1 – actividad equivalente C:2 – actividad equivalente C:4 – ¿? aumento en actividad C:3 – descenso en actividad, ~40% de actividad

Enzimas: A) Nucleasa DV Cleavase® B) Nucleasa BN Cleavase® C) FEN–1 de Pfu Condición: 1) MnCl2 4mM; LiCl 150mM 2) MnCl2 4mM; KCl 50mM 3) MgCl2 7,5mM; no monovalente 4) MgCl2 4mM; KCl 50mM 5) MgOAc 10mM; KCl 50mM

A partir de estos datos, se puede observar que es posible usar muchas modificaciones diferentes sobre el extremo 3' del oligonucleótido Invader™ sin ningún perjuicio. En diversas realizaciones de la presente invención, tales 5 modificaciones del extremo 3' se pueden usar para bloquear, facilitar o modificar de otro modo las características de hibridación del oligonucleótido Invader™ (p. ej., para aumentar la diferenciación frente a los apareamientos erróneos

o para aumentar la tolerancia de los apareamientos erróneos, o para reforzar la asociación entre el oligonucleótido Invader™ y el ácido nucleico diana). Se pueden usar algunos sustituyentes para modificar el comportamiento de la enzima en el reconocimiento y la escisión dentro del complejo ensamblado.

10 Los extremos 3’ modificados también se pueden usar para evitar la prolongación del oligonucleótido Invader™ mediante polimerasas de ácido nucleico bien dependientes del molde o independientes del molde. El uso de didesoxinucleótidos sin modificar de otro tipo (i.e., sin colorantes u otros restos unidos) es un procedimiento particularmente preferido de bloqueo de la prolongación de los oligonucleótidos Invader™, porque no disminuyen la actividad de escisión y no se pueden prolongar en absoluto.

15 Ejemplo 36

Efecto de la concentración de sonda, la temperatura y un oligonucleótido apilador sobre la escisión de minisondas mediante la escisión dirigida por Invader™

Los oligonucleótidos apiladores empleados para formar las estructuras de escisión pueden cumplir dos objetivos en la detección de una diana de ácido nucleico mediante el uso de una minisonda. El oligonucleótido apilador puede 20 ayudar a estabilizar la interacción de la minisonda con el ácido nucleico diana, conduciendo a una mayor acumulación de sonda escindida. Además, la presencia de este oligo en el complejo alarga al dúplex secuencia abajo del sitio de escisión, lo que puede aumentar la actividad de escisión de algunas de las enzimas de la presente invención. Un ejemplo de diferentes preferencias por la longitud de este dúplex por diferentes nucleasas de estructura específica se observa en la comparación de la nucleasa BN Cleavase® y la nucleasa FEN–1 de Mja de

25 las regiones del dúplex de 8 pb y 12 pb de la Fig. 65. El aumento de afinidad de la enzima por la estructura de escisión también da como resultado un aumento de la acumulación de la sonda escindida durante las reacciones ejecutadas durante una determinada cantidad de tiempo.

La cantidad de minisonda que se une a la diana también es afectada por la concentración de la minisonda de la mezcla de reacción. Incluso cuando una minisonda sólo tiene una ligera probabilidad de hibridarse (p. ej., cuando la reacción se realiza a temperaturas en exceso con respecto a la temperatura de fusión esperada del dúplex de sonda/diana), la cantidad de sonda de la diana en cualquier momento dado se puede aumentar mediante el uso de concentraciones elevadas de la minisonda.

Se examinó la necesidad de un oligonucleótido apilador por aumentar la escisión de la minisonda tanto a concentraciones de sonda bajas como elevadas. Las reacciones se llevaron a cabo en 10 1l de HEPES 10mM (pH 7,2); KGIu 250mM; MnCl2 4mM, que contenía 100nM de tanto el oligonucleótido invasor (oligo 135; SEC ID N.º 112) como el apilador (oligo 147; SEC ID N.º 113) y ADNmc de M13 100pM. Se cubrieron las reacciones con aceite mineral, se calentaron hasta 90°C durante 15 s, y l uego se llevaron hasta la temperatura de reacción. Las reacciones se llevaron a cabo a 35ºC, 40ºC, 45ºC, 50ºC, 55ºC, 60ºC y 65ºC. Se iniciaron las reacciones de escisión mediante la adición de 1 µl de 100 ng/µl de FEN–1 de Pfu y 1 µl de concentraciones variables de oligonucleótido minisonda 142 marcado con Cy–3 (SEC ID N.º 114). Se dejaron proseguir las reacciones durante 1 hora y se detuvieron mediante la adición de 10 µl de formamida. Se cargó un cuarto del volumen total de cada reacción sobre geles de poliacrilamida no desnaturalizantes al 20% que fueron sometidos a electroforesis en el sentido inverso. Se visualizaron los geles usando un escáner fluorescente FMBIO–100 de Hitachi, usando un filtro de 585 nm. Se midió la fluorescencia de cada banda de producto, creándose el gráfico mostrado en la Fig. 80 usando una hoja de cálculo de Microsoft Excel.

Los datos resumidos en la Fig. 80 mostraron que la concentración de la minisonda tuvo un efecto significativo sobre la medida final del producto, mostrando aumentos espectaculares a medida que se iba aumentando la concentración. Los aumentos en la concentración de la minisonda también desplazaron la temperatura de reacción óptima en sentido ascendente. Se sabe en la técnica que la concentración de las cadenas complementarias en una hibridación afectará a la Tm aparente del dúplex formado entre ellas. Más significativo para los procedimientos y las composiciones de la presente invención es el hecho de que la presencia del oligonucleótido apilador tiene una profunda influencia sobre la velocidad de escisión de la minisonda a todas las concentraciones de sonda. A cada una de las concentraciones de sonda, la presencia del apilador llegó a tanto como duplicar la señal procedente del producto de escisión. Esto demostró la utilidad de usar el oligonucleótido apilador en combinación con las minisondas descritas en la presente memoria.

Ejemplo 37

La presencia de un apareamiento erróneo en el oligonucleótido Invader™ disminuye la actividad de escisión de la nucleasa A/G Cleavase®

En cualquier análisis de detección de ácidos nucleicos, el hecho de que el análisis pueda realizarse para que detecte sensiblemente diferencias menores entre los ácidos nucleicos supone una ventaja adicional. En el siguiente experimento, se usaron sustratos de escisión modelo que eran idénticos a excepción de la presencia o la ausencia de un apareamiento erróneo cerca del extremo 3' del oligonucleótido Invader™ hibridado al ácido nucleico diana modelo. Entonces se analizó el efecto de un apareamiento erróneo en esta región sobre la acumulación de la sonda escindida.

Para demostrar el efecto de la presencia de un apareamiento erróneo en el oligonucleótido Invader™ sobre la capacidad de la nucleasa A/G Cleavase® de escindir el oligonucleótido sonda en un análisis con Invader™, se realizó el siguiente experimento. Escisión del oligonucleótido de análisis IT–2 (SEC ID N.º 115) en presencia de los oligonucleótidos Invader™ IT–1 (SEC ID N.º 116) e IT–1A4 (SEC ID N.º 117). El oligonucleótido IT–1 es completamente complementario al brazo 3' de IT–2, mientras que el oligonucleótido IT–1A4 tiene una sustitución de T–>A en la posición 4 desde el extremo 3' que resulta en un apareamiento erróneo de A/A en el dúplex de Invader™–diana. Se esperaría que tanto el oligonucleótido Invader™ apareado como el apareado erróneamente se hibridaran a la temperatura a la que se realizó la siguiente reacción. La Fig. 81 proporciona un esquema que muestra el IT–1 apareado a la estructura de IT–2 plegada, y muestra el IT–1A4 apareado a la estructura de IT–2 plegada.

Las reacciones se ejecutaron como se explica a continuación. Se incubó el oligonucleótido de análisis IT–2 (0,11M), marcado en el extremo 5' con fluoresceína ((Integrated DNA Technologies) con 0,26 ng/1l de AG Cleavase® en 10 1l de tampón CFLP® con MgCl2 4mM, en presencia de IT–1 o IT–1A4 11M a 40°C durante 10 min; también se ejecutó un control sin enzima. Se cubrieron las muestras con 15 1l de cera líquida Chill–Out® para evitar la evaporación. Se detuvieron las reacciones mediante la adición de 4 µl de tampón de detención (formamida al 95%, EDTA 20mM y violeta de metilo al 0,02%). Se separaron los productos de escisión sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante al 20% y se analizaron con un analizador de imágenes FMBIO–100 (Hitachi) equipado con un filtro de 505 nm. En la Fig. 82, se muestra la imagen resultante.

En la Fig. 82, el carril 1 contiene productos de reacción del control sin enzima y muestra la emigración del oligo IT–2 sin cortar; los carriles 2–4 contienen los productos de las reacciones que no contienen oligo Invader™, el oligo IT–1 Invader™ y el IT–1A4 Invader™, respectivamente.

Estos datos muestran que la escisión se reduce notablemente por la presencia del apareamiento erróneo, incluso en condiciones en las que no se esperaría que el apareamiento erróneo interrumpiera la hibridación. Esto demuestra que la región de unión del oligonucleótido invasor es una de las regiones del complejo que se puede usar para la detección de apareamientos erróneos, según lo revelado por una caída de la velocidad de escisión.

Ejemplo 38

Comparación de la actividad de las nucleasas FEN–1 de Pfu y FEN–1 de Mja en la reacción con Invader™

Para comparar la actividad de la nucleasa FEN–1 de Pfu y la nucleasa FEN–1 de Mja en la reacción con Invader™, se realizó el siguiente experimento. Se emplearon un oligonucleótido de análisis IT3 (SEC ID N.º 118) que forma una estructura de horquilla de invasor–diana y el oligonucleótido sonda PR1 (SEC ID N.º: 119) marcado en el extremo 5' con fluoresceína (Integrated DNA Technologies) en los análisis con Invader™ usando las nucleasas bien FEN–1 de Pfu o la FEN–1 de Mja.

Los análisis se realizaron como se explica a continuación: se incubaron FEN–1 de Pfu (13 ng/1l) y FEN–1 de Mja (10 ng/1l) (preparadas según lo descrito en el Ej. 28) con los oligonucleótidos IT3 (0,1nM) y PR1 (2 y 51M) en 10 1l de tampón CFLP®, MgCl2 4mM y 20 mg/ml de ARNt a 55°C durante 41 min. Se cub rieron las muestras con 15 µl de barrera contra la evaporación Chill–Out® para evitar la evaporación. Se detuvieron las reacciones mediante la adición de 70 µl de tampón de detención (formamida al 95%, EDTA 20mM y violeta de metilo al 0,02%). Se separaron los productos de reacción (1 1l) sobre un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 20%, se visualizaron usando un generador de imágenes fluorescentes y se cuantificaron las bandas correspondientes a la sonda y al producto. En la Fig. 83, se muestra la imagen resultante. En la Fig. 83, se muestra la tasa de renovación por diana por minuto bajo la imagen de cada nucleasa a cada concentración de sonda y diana analizada.

Se demostró en el ejemplo 32 que el uso de la nucleasa de estructura específica FEN–1 de Pfu en la reacción de escisión dirigida por Invader™ dio como resultado una velocidad mayor de acumulación de producto que la que se produjo con el uso de la A/G Cleavase®. Los datos presentados aquí demuestran que el uso de la nucleasa FEN–1 de Mja con la sonda marcada con fluoresceína aumenta más la cantidad de producto generado en una media del aproximadamente 50%, demostrando que, además de la nucleasa FEN–1 de Pfu, la nucleasa FEN–1 de Mja es una nucleasa de estructura específica preferida para la detección de dianas de ácido nucleico mediante el procedimiento de la presente invención.

Ejemplo 39

Detección de ácidos nucleicos Diana de ARN usando oligonucleótidos minisonda y apilador

Además de la detección del material diana de ADN de M13 descrito anteriormente, se diseñó un sistema de minisonda/apilador para detectar las secuencias de ARN derivadas del VHC descritas en el ejemplo 19. También se analizó una sonda de una longitud intermedia, bien una larga de rango medio o una corta estándar. La minisonda usada (oligo 42–168–1) tiene la secuencia: 5'–TET–CCGGTCGTCCTGG–3 (SEC ID N.º 120), el oligonucleótido apilador usado (oligo 32–085) con esta minisonda tiene la secuencia: 5'–CAATTCCGGTGTACTACCGGTTCC–3' (SEC ID N.º 121). La sonda ligeramente más larga, usada sin un apilador (oligo 42–088) tiene la secuencia: 5'–TET– CCGGTCGTCCTGGCAA–3’ (SEC ID N.º 122). El oligonucleótido Invader™ usado con ambas sondas tiene la secuencia: 5'–GTTTATCCAAGAAAGGACCCGGTC–3' (SEC ID N.º 47). Las reacciones incluían 50 fmoles de ARN diana, 10 pmoles del oligonucleótido Invader™ y 5 pmoles del oligonucleótido minisonda en 10 1l de tampón que contenía MES 10mM, pH 6,5 con LiCl 150mM, MnCl2 4mM, Tween–20 y NP–40 cada uno al 0,05%, y 39 unidades de ARNsin (Promega). En los casos en los que se usó, se añadieron 10 pmoles del oligonucleótido apilador. Se combinaron estos componentes, se recubrieron con barrera contra la evaporación ChillOut® y se calentaron hasta 50°C; las reacciones se iniciaron mediante la adici ón de 5 unidades de polimerasa de ADNpTth hasta un volumen de reacción final de 10 µl. Tras 30 minutos a 50°C, se detuvieron las reacciones mediante la adición de 8 µl de formamida al 95%, EDTA 10mM y violeta de metilo al 0,02%. Se calentaron las muestras hasta 90°C durante 1 minuto y se resolvieron 2,5 µl de cada una de estas reacciones mediante electroforesis a través de gel de poliacrilamida desnaturalizante al 20% (entrecruzamiento de 19:1) con urea 7M en un tampón de Tris–Borato 45mM, pH 8,3; EDTA 1,4mM, y se visualizaron los productos de reacción marcados usando el analizador de imágenes FMBIO–100 (Hitachi). En la Fig. 84, se muestra la imagen resultante.

En la Fig. 84, los carriles 1 y 2 muestran los productos de las reacciones que contienen el oligonucleótido Invader™ del VHC y la sonda más larga (oligo 42–088), sin y con el ARN diana presente, respectivamente. Los carriles 3, 4 y 5 muestran los productos de las reacciones que contienen el oligonucleótido Invader™ y la sonda más corta (oligo 42– 168–1). El carril 3 es una reacción de control sin el ARN diana presente, mientras que los carriles 4 y 5 tienen la diana, pero están sin o con el oligonucleótido apilador, respectivamente.

Bajo estas condiciones, se escindió el oligonucleótido sonda ligeramente más largo (16 nt) con bastante facilidad sin la ayuda de un oligonucleótido apilador. Por el contrario, la sonda más corta (13 nt) necesitó la presencia del oligonucleótido apilador para producir niveles detectables de escisión. Estos datos muestran que el sistema de minisonda de detección de dianas mediante la escisión dirigida por Invader™ es igualmente aplicable a la detección de dianas de ARN y ADN. Además, la comparación del rendimiento de la escisión de las sondas más largas y las más cortas en ausencia de un oligonucleótido apilador proporciona un ejemplo de la distinción entre el rendimiento del sistema de minisonda/apilador y el rendimiento de las sondas de rango medio y largas en la detección de dianas de ácido nucleico.

Ejemplo 40

Efecto de una cola 3’ desapareada sobre la transcripción desde un promotor completo (no mellado)

Al diseñar el procedimiento de visualización basado en la transcripción de los productos de la escisión dirigida por Invader™, primero fue necesario evaluar el efecto de una cola 3’ sobre la eficacia de la transcripción desde un promotor de longitud completa. Los dúplex analizados en este ejemplo se muestran en la parte inferior de la Fig. 93 y se presentan esquemáticamente en las Fig. 85A–C.

Las reacciones de transcripción se realizaron usando el sistema MEGAshortscript™de Ambion, Inc. (Austin, TX), según las instrucciones del fabricante a excepción de la adición de un ribonucleótido marcado con fluoresceína. Se preparó cada muestra de ADN en 4 1l de H2Od libre de RNasa. Las reacciones 1–3 contenían cada una 10 pmoles del oligo molde de copia 150 (SEC ID N.º 123); la reacción 2 contenía 10 pmoles del oligo promotor 151 (SEC ID N.º 124); la muestra 3 contenía 10 pmoles del oligo promotor prolongado en 3’ 073–065 (SEC ID N.º 125); la muestra 4 no tenía ADN añadido. Se añadieron a cada muestra 6 1l de una solución que contenía 1 1l de 10 x tampón de transcripción, 7,5mM de cada rNTP; fluoresceína–12–UTP 0,125mM (Boehringer) y 1 1l de mezcla enzimática MEGAshortscript™de T7. Se incubaron las muestras a una temperatura de 37°C durante 1 hora. Se añadió un microlitro de ADNasa 1 libre de RNasa (2U/1l) a cada muestra y se incubaron las muestras durante 15 minutos más a 37°C. Se detuvieron las reacciones mediante la adi ción de 10 µl de una solución de formamida al 95%, Na2EDTA 5mM con colorantes de carga. Se calentaron todas las muestras hasta 95°C durante 2 minutos y se resolvi eron 4 1l de cada muestra mediante electroforesis a través de gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón que contenía Tris–Borato 7M (pH 8,3) y EDTA 1,4mM. Se analizó el gel usando un analizador de imágenes fluorescentes FMBIO II, mostrándose la imagen resultante en la Fig. 93. El ARN producido mediante una transcripción correcta aparece cerca de la mitad del panel, según lo indicado (“ARN”).

El examen de los productos de transcripción mostrados en los carriles 2 y 3 muestra que la presencia de la cola 3’ sobre el promotor de longitud completa tiene un efecto negativo sobre la eficacia de la transcripción, pero que no la desactiva por completo. Como el objetivo de los análisis de visualización basados en la transcripción de la presente invención consiste en diferenciar entre la sonda sin escindir y los productos más cortos del análisis de escisión invasiva (sonda cortada), estos datos indican que la producción de un promotor de longitud completa en la reacción de escisión sería difícil de resolver desde el fondo creado mediante la transcripción desde los promotores que contienen la sonda sin escindir si no se incluyeran otros oligonucleótidos en el análisis. Los procedimientos para suprimir la transcripción desde tal promotor ramificado se tratan en el apartado de “Descripción de la invención” y en el Ej. 43 que figura más adelante.

Ejemplo 41

Examen de la influencia de la posición de la mella sobre la eficacia de transcripción desde promotores de bacteriófago T7 compuestos parciales y completos

En el apartado de “Descripción de la invención”, se describe el procedimiento para analizar posibles trozos de promotor para su idoneidad en un análisis relacionado con la escisión invasiva. Un aspecto del análisis consiste en examinar el efecto que tiene un determinado sitio de mella sobre la eficacia de la transcripción desde el promotor compuesto final. Además, se analizan los trozos individuales del promotor mellado en cuanto a la actividad de transcripción en presencia de la cadena sin mellar de longitud completa. En este experimento, se hace una comparación sobre estos puntos entre un promotor compuesto que tiene una mella en la cadena no molde entre los nucleótidos –11 y –10 con respecto al sitio de iniciación (+1), y un promotor que tiene una mella sobre la misma cadena, pero colocada entre los nucleótidos –8 y –7. Los números de figura para las representaciones esquemáticas de los contenidos de cada reacción se indican bajo cada carril (p. ej., 85A = Fig. 85A). El sitio en el que estaría la mella en un promotor compuesto completamente ensamblado usando los oligonucleótidos de la reacción también se indica bajo cada carril (“–11/–10” y “–8/–7”).

Las reacciones de transcripción se realizaron usando el sistema MEGAshortscript™, según las instrucciones del fabricante, a excepción de la adición de un ribonucleótido marcado con fluoresceína. Se preparó cada muestra de ADN en 4 µl de H2Od libre de RNasa. La reacción 1 no tenía ADN añadido. Las reacciones 2–9 contenían cada una 10 pmoles del oligo molde de copia 150 (SEC ID N.º 123). Las reacciones 3 y 4 contenían 10 pmoles del oligo sonda “cortada” –11 073–061–01 (SEC ID N.º 127) o 20 pmoles del oligo promotor parcial –10 073–061–02 (SEC ID N.º 130), respectivamente; y la reacción 5 contenía ambos. Las reacciones 6 y 7 contenían bien los 10 pmoles del oligo sonda “cortada” –8 073–062–01 (SEC ID N.º 126 ) o 20 pmoles del oligo promotor parcial –7 073–062–02 (SEC ID N.º 129 ), respectivamente; y la reacción 8 contenía ambos. La reacción 9 contenía 10 pmoles del oligo promotor intacto 151 (SEC ID N.º 124).

Se iniciaron las reacciones de transcripción, se incubaron y se finalizaron, resolviéndose los productos de reacción y creándose imágenes según lo descrito en el Ej. 40. En la Fig. 92, se muestra la imagen resultante. Los números de reacción corresponden a los números de carril sobre la imagen. El ARN creado mediante la transcripción correcta aparece en el tercio superior de la imagen. La comparación con la reacción control positiva (rxn. 9) muestra que el ARN de longitud completa producido por cada uno de los promotores compuestos es del mismo tamaño que el producido en la reacción de control, indicando que la transcripción se inició en el mismo sitio en cada reacción.

En la Fig. 92, carriles 3, 4 y 5 comparan la transcripción procedente de las dos especies de promotores ensamblados parcialmente (véanse los esquemas de las Fig. 86A y B) y el promotor compuesto completamente ensamblado (Fig. 88B) que tiene una mella entre los nucleótidos –11 y –10 con respecto al inicio de la transcripción. Se puede observar a partir de estos datos que ningún promotor parcial (carriles 3 y 4) es capaz de mantener la transcripción del molde de copia, pero que el promotor compuesto (carril 5) con este sitio de mella es potentemente transcrito. Lo sorprendente es que la comparación con la reacción de control (carril 9) muestra que la presencia de una mella en este sitio (–11/–10) aumenta realmente la transcripción. Aunque sin limitar la presente invención a un mecanismo en particular, se cree que el aumento de la transcripción es un resultado de tanto la supresión de la formación de los transcriptos abortivos más cortos como de permitir una mayor acumulación del producto de longitud completa. Este resultado es altamente reproducible.

En la Fig. 92, los carriles 6, 7 y 8 comparan la transcripción de un conjunto similar de promotores parciales y completos en los que la mella está desplazada 3 residuos más cerca del sitio de iniciación de la transcripción. El examen del carril 6 muestra que la presencia de 3 bases más sobre las sonda “cortada” –8 (en comparación con la sonda “cortada” –11 del carril 3) permite a este promotor parcial iniciar la transcripción. Esto indica que el sitio –8/–7 sería una mala elección para su uso en esta realización de la presente invención.

Este experimento demuestra el procedimiento para determinar la colocación adecuada de una mella dentro de un ensamblaje de promotores para alcanzar el resultado deseado. Se pueden diseñar fácilmente análisis similares para analizar otras mellas del promotor del bacteriófago T7 analizado en este ejemplo, o para analizar la colocación adecuada de la mella en cualquier promotor de fago, procariota o eucariota deseado.

Ejemplo 42

Detección de los productos de la escisión dirigida por Invader™ a través de la transcripción desde un promotor compuesto

Los ejemplos anteriormente descritos indican que es posible usar un oligonucleótido pequeño para completar el ensamblaje de un promotor de T7 compuesto, permitiendo así la transcripción desde ese promotor. Los ejemplos anteriores demuestran que la reacción de escisión invasiva se puede usar para liberar productos de oligonucleótido pequeños específicos desde oligonucleótidos sonda más largos. En este ejemplo, se demuestra que estas dos observaciones se pueden combinar, y que los productos de la reacción de escisión invasiva se pueden usar para completar un promotor y permitir la posterior transcripción. En la Fig. 88, se muestran las representaciones esquemáticas de los promotores compuestos analizados en este ejemplo.

Se prepararon dos reacciones de escisión invasiva, una sin (rxn 1) y otra con (rxn. 2) ADN diana de entrada. Las reacciones (1 y 2) comprendían MOPS 10mM (pH 7,5), Tween–20 al 0,05%, NP–40 al 0,05%, y 20 pmoles de oligo sonda 073–067–01 (SEC ID N.º 132) y 10 pmoles de oligo Invader™ 073–073–02 (SEC ID N.º 134) en un volumen de 14 1l. La reacción 2 también incluía 100 fmoles de ADNmc de M13mp18. Se colocaron las muestras a 60°C y se añadieron 6 1l de una solución que contenía 20 ng de la FEN–1 de Mja y Mg2Cl 40mM a cada muestra para iniciar las reacciones. Se incubaron las muestras a 60°C dur ante 30 minutos y se detuvieron mediante la adición de 3 µl NaOAc 2,5M y Na2EDTA 83mM (pH 8,0). Se transfirió cada muestra a un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml y luego se precipitaron los ADN mediante la adición de 60 1l de etanol enfriado al 100%, y se almacenaron a –20°C durante 20 minutos. Se recogieron los sedimentos mediante microcentrifugación, se lavaron una vez con etanol al 80% para eliminar el exceso de sal y luego se secaron al vacío. El producto de esta reacción de escisión invasiva es un oligonucleótido de 12 nt que tiene la secuencia: 5'–CGAAATTAATAC–3’ (SEC ID N.º 128) denominado sonda cortada –12 (la misma secuencia que el oligo 073–073–03).

Para la transcripción, se disolvió cada una de las muestras secas en 4 1l de una solución que contenía 1 pmol del oligo molde de copia 150 y 2 pmoles del oligo promotor parcial –11 073–073–012 (SEC ID N.º 131). Las muestras control 3 y 4 contenían cada una 1 pmol del oligo molde de copia 150; la muestra 3 contenía 1 pmol del oligo sonda 073–067–01 (SEC ID N.º 132) y 2 pmoles del oligo promotor parcial –11 073–073–012 (véase la estructura 88A); la muestra 4 contenía 1 pmol del oligo sonda “cortada” –12 073–073–03 (SEC ID N.º 128) y 2 pmoles del oligo promotor parcial –11 073–073–012 (véase la estructura 88B). Estas son las estructuras que se esperaría que existieran en las reacciones de transcripción procedentes de las dos reacciones de escisión invasiva descritas anteriormente.

Se iniciaron las reacciones de transcripción, se incubaron, y se finalizaron, resolviéndose los productos y creándose imágenes según lo descrito en el Ej. 40. La imagen resultante se muestra en la mitad derecha de la Fig. 89 (carriles 6–9). Las muestras 3 y 4 aparecen en los carriles 6 y 7, respectivamente, y las reacciones 1 y 2 procedentes de los productos de reacción de escisión invasiva (indicados mediante el uso de la “i” minúscula) aparecen en los carriles 8 y 9, respectivamente. El número de Fig. que muestra la representación esquemática de la estructura esperada de promotor en cada reacción se indica sobre cada carril, indicándose también la colocación de la mella. Las letras mayúsculas indican qué estructura de la figura en particular examinar para cada reacción. La “i” minúscula sobre los carriles 8 y 9 indica que estas transcripciones fueron derivadas de las verdaderas reacciones de escisión invasiva . Se comparan estos productos con el ARN producido en la reacción de control en el carril 5, cuyo procedimiento se describe en el Ej. 44. El ARN creado mediante la transcripción correcta aparece en el tercio superior de la imagen (indicado como “ARN”).

La reacción mostrada en el carril 6 no muestra transcripción. Esto demuestra que una mella entre los nucleótidos – 12 y –11 de la cadena no molde del promotor de T7 elimina la transcripción si el promotor está ensamblado desde la sonda sin cortar tal que el extremo 3' de la sonda forme una ramificación dentro de la secuencia promotora. Esto es opuesto a los resultados observados con la mella –11/–10 examinada más adelante. Además, el transcripto aparente del carril 7 muestra que un promotor no ramificado con una mella en el mismo sitio (–12/–11) produce el ARN correcto con pocos productos de iniciación abortivos (véanse los carriles 2 y 5 de la Fig. 89, descritos en el Ej. 44). Las reacciones de los carriles 8 y 9 demuestran que se observa el mismo efecto cuando la reacción de escisión invasiva es el único origen del trozo de secuencia arriba (sonda cortada –12) del promotor de T7. Cabe señalar que el promotor que está transcrito en el carril 8 se completa mediante la presencia de 1 pmol de un oligo sonda “cortada” sintético, sin ninguna sonda sin cortar en la mezcla, mientras que el promotor que está transcrito en el carril 9 se completa mediante el producto de una reacción de escisión invasiva que sólo tiene 100 fmoles de ADN diana en el mismo. Esta reacción también incluyó la sonda sin cortar residual (de hasta aprox. 10 pmoles) que puede competir por la unión en el mismo sitio. No obstante, la eficacia de las transcripciones procedentes de los productos de la reacción de escisión invasiva sólo es reducida ligeramente, estando las transcripciones justo tan libres de fondo como la muestra “sin diana” (carril 8). Este ejemplo demuestra claramente que los productos de escisión procedentes de la reacción de escisión invasiva se pueden usar en combinación con un oligo promotor parcial para promover la producción de ARN, sin la transcripción de fondo generada por la presencia de la sonda sin cortar. Este producto de ARN depende claramente de la presencia del material diana en la reacción de escisión invasiva.

Ejemplo 43

Desactivación de la transcripción desde un promotor compuesto de T7 ramificado “agujereado” mediante el uso de un oligonucleótido promotor parcial secuencia abajo que tiene una cola de 5’

El ejemplo anterior demostraba que la colocación de una mella en la cadena no molde de un promotor de bacteriófago T7 entre los nucleótidos –12 y –11 con respecto al sitio de iniciación de la transcripción evita la transcripción del promotor ramificado, mientras que cuando el promotor compuesto se ensambla usando la sonda cortada se permite la transcripción. Cuando la mella está colocada en otras zonas del promotor de T7, es posible iniciar la transcripción desde cualquier promotor, aunque habitualmente es menos eficaz hacerlo desde el promotor ramificado. Este ejemplo demuestra que la adición de una cola 5' que se puede aparear a la sonda sin cortar (Fig. 90A) al trozo de promotor parcial de secuencia abajo bloquea eficazmente la transcripción desde ese promotor, pero no evita la transcripción cuando hay una sonda cortada completando el promotor (Fig. 90B).

Se realizaron dos reacciones de escisión invasiva, una sin (rxn 7) y otra con (rxn. 8) ADN diana de entrada. Las reacciones (7 y 8) comprendían MOPS 10mM (pH 7,5), Tween–20 al 0,05%, NP–40 al 0,05%, y 20 pmoles de oligo sonda 073–067–01 (SEC ID N.º 132) y 10 pmoles de oligo Invader™ 073–067–02 (SEC ID N.º 133) en un volumen de 14 µl. La reacción 8 también incluía 100 fmoles de ADNmc de M13mp18. Se colocaron las muestras a 60°C y se añadieron 6 µl de una solución que contenía 20 ng de la FEN–1 de Mja y Mg2Cl 40mM a cada muestra para iniciar las reacciones. Se incubaron las muestras a 60°C dur ante 30 minutos y luego se detuvieron mediante la adición de 3 µl NaOAc 2,5M y Na2EDTA 83mM (pH 8,0). Se transfirió cada muestra a un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml y luego se precipitaron los ADN, se lavaron y se secaron según lo descrito en el Ej. 42. El producto de esta reacción de escisión invasiva es la secuencia de oligonucleótido de 13 nt 5'–CGAAATTAATACG–3' (SEC ID N.º 127) denominada sonda cortada –11 (la misma secuencia que el oligo 073–061–01, que se denomina sonda “cortada” – 11 para indicar que no fue generada en una reacción de escisión invasiva).

En las reacciones de transcripción, todos los ADN se disolvieron en 4 1l de H2Od libre de RNasa. La muestra 1 no tenía ADN añadido; las muestras 2–8 contenían 1 pmol del oligo molde de copia 150 (SEC ID N.º 123). Además, la muestra 3 contenía 1 pmol del oligo sonda “cortada” –11 073–061–01 (SEC ID N.º 127) y 2 pmoles del oligo promotor parcial –10 073–061–02 (SEC ID N.º 130); la muestra 4 contenía 1 pmol del oligo sonda 073–067–01 y 2 pmoles del oligo promotor parcial –10 073–061–02. La muestra control 5 contenía 1 pmol del oligo sonda 073–067– 01 y 2 pmoles del oligo promotor parcial con cola 5’ 073–074 (5’– TACTGACTCACTATAGGGTCTTCTATGGAGGTC–3’; SEC ID N.º 146) (véase la estructura de la Fig. 90A) y la muestra 6 contenía 1 pmol del oligo sonda “cortada” –11 073–061–01 y 2 pmoles del oligo promotor parcial con cola 5’ 073–074 (véase la estructura de la Fig. 90B). Estas son las estructuras (i.e., 90A y 90B) que se esperaría que existieran en las reacciones de transcripción procedentes de las dos reacciones de escisión invasiva descritas anteriormente.

Se disolvieron cada una de las muestras secas 7 y 8 procedentes de la escisión invasiva (anterior) en 4 µl de H2Od que contenía 1 pmol del oligo molde de copia 150 y 2 pmoles del oligo promotor parcial con cola 5’ 073–074. Se iniciaron las reacciones de transcripción, se incubaron, y se finalizaron, resolviéndose los productos de reacción y creándose imágenes según lo descrito en el Ej. 40. En la Fig. 91, se muestra la imagen resultante.

En la Fig. 91, los números de carril corresponden a los números de muestra; el número de la figura que muestra la representación esquemática de la estructura esperada de promotor en cada reacción se indica sobre cada carril (“88” y “90”), indicándose también la colocación de la mella (“–11/–10”). Las letras mayúsculas indican qué estructura de la figura en particular examinar para cada reacción. La “i” minúscula sobre los carriles 7 y 8 indica que estas transcripciones fueron derivadas de las verdaderas reacciones de escisión invasiva. El ARN creado mediante la transcripción correcta aparece en el tercio superior del panel, según lo indicado (“ARN”).

Las reacciones control de los carriles 1 y 2, bien sin ADN o sólo con el molde de copia, no produjeron ARN según lo esperado. El producto del carril 4 demuestra que el promotor de T7 ramificado con una mella en la cadena no molde entre los nucleótidos –11 y –10 puede mantener la transcripción, aunque no tan eficazmente como el promotor no ramificado con la mella en el mismo sitio (carril 3). El examen del carril 5 muestra que el uso de un oligonucleótido promotor parcial con una cola 5' corta que se puede aparear a la sonda sin cortar según lo representado en la Fig. 90A suprime eficazmente esta transcripción, pero permite la transcripción cuando la sonda no tiene una cola 3’ (carril

6: Fig. 90B esquemática). Las reacciones de los carriles 7 y 8 demuestran que se observa el mismo efecto cuando la reacción de escisión invasiva es el único origen del trozo de secuencia arriba (sonda cortada –11; SEC ID N.º 127) del promotor de T7. Cabe señalar que el promotor que está transcrito en la muestra 6 se completa mediante la presencia de 1 pmol de una “sonda cortada” sintética sin ninguna sonda sin cortar en la mezcla, mientras que el promotor que está transcrito en la muestra 8 se completa mediante el producto de una reacción de escisión invasiva que sólo tenía 100 fmoles del ADN diana en el mismo. Esta reacción también incluyó la sonda sin cortar residual (de hasta aprox. 19 pmoles) que puede competir por la unión en el mismo sitio. No obstante, las transcripciones procedentes de los productos de la reacción de escisión invasiva son justo tan potentes y están justo tan libres de fondo en las muestras “no diana”.

Este ejemplo demuestra claramente que los productos de escisión procedentes de la reacción de escisión invasiva se pueden usar en combinación con un oligo promotor parcial que tenga una cola 5’ para promover la producción de ARN sin la transcripción de fondo generada por la sonda sin cortar. Este producto de ARN depende claramente de la presencia del material diana en la reacción de escisión invasiva.

Ejemplo 44

Creación de un promotor de bacteriófago T7 completo mediante la prolongación mediada por una ADN polimerasa de una sonda cortada que comprende un promotor de T7 parcial

Como se demuestra en los ejemplos anteriores, la transcripción no puede tener lugar desde el promotor de T7 a no ser que esté presente un promotor completo. En los ejemplos anteriores, se creó un promotor completo que contenía una mella en una cadena mediante al apareamiento de una sonda cortada generada en una reacción de escisión invasiva con un molde de copia que estaba apareado a un oligo promotor parcial. Un procedimiento alternativo para crear un promotor completo de una manera dependiente de la detección de una secuencia diana en una reacción de escisión invasiva consiste en aparear la sonda cortada a un molde de copia carente de un oligo promotor parcial. El OH de 3’ presente en el extremo de la sonda cortada apareada es entonces prolongado mediante una ADN polimerasa para crear un promotor completo y sin mellar que sea competente en la transcripción.

En este ejemplo, el promotor se completó a través del uso de una prolongación del cebador, en lugar de hacerlo mediante la co–hibridación de otro oligonucleótido. En la figura 87, se representan esquemáticamente las etapas de reacción. Se prepararon dos reacciones de escisión invasiva, una sin (rxn 1) y otra con (rxn. 2) ADN diana de entrada. Las reacciones (1 y 2) comprendían MOPS 10mM (pH 7,5), Tween–20 al 0,05%, NP–40 al 0,05%, y 20 pmoles de oligo sonda 073–067–01 (SEC ID N.º 132) y 10 pmoles de oligo Invader™ 073–073–02 (SEC ID N.º 134) en un volumen de 14 µl. La reacción 2 también incluía 100 fmoles de ADNmc de M13mp18. Se colocaron las muestras a 60°C y se añadieron 6 µl de una solución que contenía 20ng ng de la FEN–1 de Mja y Mg2Cl 40mM a cada muestra para iniciar las reacciones. Se incubaron las muestras a 60°C durante 30 minutos y se det uvieron mediante la adición de 3 µl NaOAc 2,5M y Na2EDTA 83mM (pH 8,0). Se transfirió cada muestra a un tubo de microcentrifugación de 1,5 m, y luego se precipitaron los ADN, se lavaron y se secaron según lo descrito en el Ej. 42. El producto de esta reacción de escisión invasiva es la secuencia de oligonucleótido de 12 nt 5'–CGAAATTAATAC– 3’ (SEC ID N.º 128), denominada sonda cortada –12 (la misma secuencia que el oligo 073–073–03, que se denomina sonda “cortada” –12 para indicar que no fue generada en una reacción de escisión invasiva).

Para permitir la prolongación de estos productos usando una ADN polimerasa dependiente del molde, se añadió a cada una de las muestras de escisión secas una solución de 20 1l que contenía Tris–HCl 20mM (pH 8,5), Mg2Cl 1,5mM, KCl 50mM, Tween–20 al 0,05%, NP–40 al 0,05%, 251M de cada dNTP, 0,25 unidades de ADN polimerasa de Taq (Boehringer) y oligo molde de copia 150 21M (SEC ID N.º 123). Se incubaron las muestras a 30°C d urante 1 hora. Se detuvieron todas las reacciones de prolongación del cebador mediante la adición de 3 µl de NaOAc 2,5M con Na2EDTA 83mM (pH 8,0)/muestra. Se transfirió cada muestra a un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml y luego se precipitaron los ADN, se lavaron y se secaron según lo descrito en el Ej. 42.

Las muestras 1 y 2 se disolvieron en 4 µl de H2Od libre de RNasa. Las muestras 3, 4 y 5 son reacciones de control; la muestra 3 era 4 1l de H2Od libre de RNasa sin ADN añadido; la muestra 4 contenía 1 pmol del oligo molde de copia 150 (SEC ID N.º 123) en 4 1l de H2Od libre de RNasa, y la muestra 5 contenía 1 pmol del mismo molde de copia y 1 pmol del oligo promotor completo 151 (SEC ID N.º 124) en H2Od libre de RNasa.

Las reacciones de transcripción se realizaron usando el sistema MEGAshortscript™, según las instrucciones del fabricante, pero con la adición de un ribonucleótido marcado con fluoresceína. Se añadieron a cada muestra 6 µl de una solución que contenía 1 µl de 10 x tampón de transcripción, 7,5mM de cada rNTP; fluoresceína–12–UTP 0,125mM (Boehringer) y 1 µl de mezcla enzimática MEGAshortscript™de T7. Se incubaron las muestras a 37°C durante 1 hora. Se añadió un 1l de ADNasa 1 libre de RNasa (2U/µl) a cada muestra y se incubaron durante 15 minutos más a 37°C. Se detuvieron las reacciones me diante la adición de 10 µl de una solución de formamida al 95% y NaEDTA 5mM con colorantes de carga. Se calentaron todas las muestras hasta 95°C durante 2 minutos y se resolvieron cuatro µl de cada muestra mediante electroforesis a través de gel de acrilamida desnaturalizante al 20% (entrecruzamiento de 19:1), con urea 7M, en un tampón que contenía Tris–Borato 45mM (pH 8,3) y EDTA 1,4mM. Se generaron imágenes de los resultados usando el generador de imágenes fluorescentes 595 de Molecular Dynamics, con la excitación a 488 nm y la emisión detectada a 530 nm.

La imagen resultante se muestra en los carriles 1 a 5 de la Fig. 89; los números de carril corresponden a los números de muestra. Los números de figura corresponden a las representaciones esquemáticas de los promotores transcritos en cada reacción como se indican sobre los carriles. El producto de ARN procedente de la transcripción correcta aparece en el tercio superior del panel, según lo indicado (“ARN”). El nucleótido marcado no incorporado aparece como una señal densa cerca de la parte inferior (“NTP”). Los productos de transcripción cortos generados por iniciaciones abortadas [Milligan y Uhlenbeck (1989) Methods Enzymol. 180:51] aparecen como bandas justo encima del nucleótido libre en los carriles que muestran una transcripción activa (i.e., los carriles 2 y 5).

Se puede observar claramente a partir de los datos de los carriles 1 y 2 que la transcripción depende de la presencia del material diana en la reacción de escisión invasiva. En otro sitio se muestra (véase el carril 3, Fig. 92) que el producto de la reacción de escisión no es suficiente por sí mismo para permitir la transcripción desde el molde de copia. De este modo, la acción de la ADN polimerasa prolongando la sonda cortada hibridada a través del promotor es una etapa necesaria para permitir la transcripción en esta realización. Estos datos demuestran claramente que tanto la prolongación dependiente del molde realizada por una ADN polimerasa como la prolongación seguida por la transcripción son procedimientos adecuados de visualización de los productos del análisis de escisión invasiva. Según lo tratado en el apartado de “Descripción de la invención”, los productos de la ruptura térmica que poseen fosfatos en el terminal 3’ no se prolongarían, no pudiendo así contribuir a la transcripción de fondo.

De lo anterior se desprende que es obvio que la invención proporciona reactivos y procedimientos para permitir la detección y la caracterización de secuencias de ácidos nucleicos y variaciones en las secuencias de ácidos nucleicos. La reacción de escisión dirigida por Invader™ de la presente invención proporciona un procedimiento de detección directa ideal que combina las ventajas de los análisis de detección directa (p. ej., una fácil cuantificación y un riesgo mínimo de contaminación remanente) con la especificidad proporcionada por un análisis de hibridación de dos o tres oligonucleótidos.

LISTADO DE SECUENCIAS

(1)

INFORMACIÓN GENERAL:

(i) SOLICITANTE: Hall, Jeff G. Lyamichev, Victor I. Prudent, James R. Brow, Mary Ann D. Kaiser, Michael

W.

Lyamichev, Natasha Olive, David M. Dahlberg, James E.

(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Escisión invasiva de ácidos nucleicos

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 146

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

(A)

DESTINATARIO: Medlen & Carroll, LLP

(B)

CALLE: 220 Montgomery Street, Suite 2200

(C)

CIUDAD: San Francisco

(D)

ESTADO: California

(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

(F)

CÓDIGO POSTAL: 94104

(v)

FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC–DOS/MS–DOS

(D)

PROGRAMA: Patentln Release nº 1.0, Versión nº 1.30

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

(C)

CLASIFICACIÓN:

(vii)

DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/759.038

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 02–DIC–1996

(vii)

DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/758.314

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 02–DIC–1996

(vii)

DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/756.386

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 29–NOV–1996

(vii)

DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/682.853

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 12–JUL–1996

(vii)

DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/599.491

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 24–ENERO–1996

(viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

(A)

NOMBRE: Ingolia, Diane E.

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 40.027

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: FORS–02616 5 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

(A)

TELÉFONO: (415) 705–8410

(B)

TELEFAX: (415) 397–8338

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 1:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 10 (A) LONGITUD: 2.506 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico:

(C)

ENCADENAMIENTO: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 1:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 2: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 2.496 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico:

(C)

ENCADENAMIENTO: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 2:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 3:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 2.504 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico:

(C)

ENCADENAMIENTO: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 3:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 832 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: irrelevante

(D)

TOPOLOGÍA: irrelevante

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 4: 10

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 5:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 831 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 5:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 6:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 834 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 6:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 7:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 2.502 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 7:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 8:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 833 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 8:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 9:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1.647 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 9:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 10:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 2.088 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 10:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 11:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 962 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 11:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 12:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1.600 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 12:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 13:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 13: CACGAATTCG GGGATGCTGC CCCTCTTTGA GCCCAA 36

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 14:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 14: GTGAGATCTA TCACTCCTTG GCGGAGAGCC AGTC 34

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 15:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 91 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 15:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 16:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 16: TAATACGACT CACTATAGGG 20

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 17:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 17: GAATTCGATT TAGGTGACAC TATAGAA 27

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 18:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 18: GTAATCATGG TCATAGCTGG TAGCTTGCTA C 31

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 19:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 19: GGATCCTCTA GAGTCGACCT GCAGGCATGC CTACCTTGGT AG 42

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 20:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 20: GGATCCTCTA GAGTCGACCT GCAGGCATGC 30

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 21:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 2.502 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 21:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 22:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 22: GATTTAGGTG ACACTATAG 19

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 23:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 50 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 23: ACACAGGTAC CACATGGTAC AAGAGGCAAG AGAGACGACA CAGCAGAAAC 50

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 24:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 24:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 25:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 969 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 25:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 26: 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 948 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 15 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 26:

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 27:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 206 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 27:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 28:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 28: AACAGCTATG ACCATGATTA C 21

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 29:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 29: GTTCTCTGCT CTCTGGTCGC TGTCTCGCTT GTGAAACAAG CGAGACAGCG TGGTCTCTCG

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 30:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 30: CGAGAGACCA CGCTG 15

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 31:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 52 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 31: CCTTTCGCTT TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG TC

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 32:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 32: AGAAAGGAAG GGAAGAAAGC GAAAGG

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 33:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 33: GACGGGGAAA GCCGGCGAAC G 21

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 34:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 34: GAAAGCCGGC GAACGTGGCG 20

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 35:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 35: GGCGAACGTG GCGAGAAAGG A 21

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 36:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 40:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 40: GGTTTTTCTT TGAGGTTTAG 20

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 41:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 41: GCGACACTCC ACCATAGAT 19

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 42:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 42: CTGTCTTCAC GCAGAAAGC 19

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 43:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 43: GCACGGTCTA CGAGACCTC 19

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 44:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple 5 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 44: TAATACGACT CACTATAGGG 20

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 45: 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 337 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: irrelevante

(D)

TOPOLOGÍA: irrelevante 15 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 45:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 46: 20 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 25 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc feature.

(B)

UBICACIÓN: 18

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /pruebas= EXPERIMENTALES /nota= “La N de esta posición indica la presencia de un colorante de fluoresceína en un ligador abásico”.

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 46: CCGGTCGTCC TGGCAATNCC 20

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 47:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 47: GTTTATCCAA GAAAGGACCC GGTC 24

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 48:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 48: CAGGGTGAAG GGAAGAAGAA AGCGAAAGGT 30

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 49:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 49: CAGGGGGAAG GGAAGAAGAA AGCGAAAGGT 30

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 50:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

(B)

UBICACIÓN: 1..2

(C)

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /pruebas= EXPERIMENTALES/base_mod= OTRA /nota: “Los residuos T de las posiciones 1 y 2 son residuos T amino–modificados”.

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 50: TTCTTTTCAC CAGCGAGACG GG 22

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 51:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 51: ATTGGGCGCC AGGGTGGTTT TT 22

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 52:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 53 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 52: CCCGTCTCGC TGGTGAAAAG AAAAACCACC CTGGCGCCCA ATACGCAAAC CGC

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 53:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 53:

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 36:

CCTTTCGCTT TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GC

42

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 37:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 42 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) ENCADENAMIENTO: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 37:

CCTTTCGCTC TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GC

42

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 38:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 27 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) ENCADENAMIENTO: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: modified_base

(B) UBICACIÓN: 8

(C) PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

(D) OTRA INFORMACIÓN: /pruebas= EXPERIMENTALES

/base_mod= OTRA

/nota: "El residuo A de esta posición es 2'–O–metiladenosina."

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 38:

AGAAAGGAAG GGAAGAAAGC GAAAGGT 27

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 39:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) ENCADENAMIENTO: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 39:

GCCGGCGAAC GTGGCGAGAA AGGA 24

GAATTCGATT TAGGTGACAC TATAGAATAC A 31

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 54:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 54: CCTTTCGCTT TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GC 42

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 55:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 55: GCCGGCGAAC GTGGCGAGAA AGGA 24

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 56:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 56: CAGAAGGAAG GGAAGAAAGC GAAAGG 26

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 57:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 57: CAGGGGGAAG GGAAGAAAGC GAAAGG 26

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 58:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 58: CAGGGTACAG GGAAGAAAGC GAAAGG 26

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 59:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 59: GGGAAAGTCC TCGGAGCCGC GCGGGACGAG CGTGGGGGCC CG 42

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 60:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 963 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

UBICACIÓN: 1..960

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 60:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 61:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 320 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 61:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 62:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 62: CGATCTCCTC GGCCACCTCC 20

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 63:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 63: GGCGGTGCCC TGGACGGGCA 20

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 64:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 64:

CCAGCTCGTT GTGGACCTGA 20

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 65:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 2.505 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(ix)

CARACTERÍSTICA:10 (A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

UBICACIÓN: 1..2499

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 65:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 66:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 833 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 66:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 67:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 162

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 67:

TGGCTATAGR CCAGGGCCAC 20 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 68:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 2.505 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: doble 10 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS15 (B) UBICACIÓN: 1..2499

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 68:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 69:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 833 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 69:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 70:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 2.505 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN” 10 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

UBICACIÓN: 1..2499

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 70:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 71:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 833 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 71:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 72:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 72: GGGATACCAT GGGAGTGCAG TTTGG 25

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 73:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 73: GGTAAATTTT TCTCGTCGAC ATCCCAC 27

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 74:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 981 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

UBICACIÓN: 1..978

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 74:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 75:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 326 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 75:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 76:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 76: GAGGTGATAC CATGGGTGTC C 21

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 77:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 77: GAAACTCTGC AGCGCGTCAG 20

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 78:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1.023 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

UBICACIÓN: 1..1020

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 78:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 79:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 340 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 79:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 80:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 80: GATACCATGG GTGTCCCAAT TGGTG 25

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 81:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 81: TCGACGTCGA CTTATCTCTT GAACCAACTT TCAAGGG 37

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 82:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 82: AGCGAGGGAG AGGCCCAAGC 20

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 83:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 83: GCCTATGCCC TTTATTCCTC C 21

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 84:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 84: TGGTCGCTGT CTCGCTGAAA GCGAGACAGC GTG

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 85:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 85: TGCTCTCTGG TCGCTGTCTG AAAGACAGCG 30

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 86:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (1, “”)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un espaciador que contiene un marcador de fluoresceína”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 86: NAGAAAGGAA GGGAAGAAAG CGAAAGG 27

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 87:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (27, " ")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un espaciador que porta un colorante de Cy3”

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

(B)

UBICACIÓN: 28

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA/nota = “El residuo de esta posición es una didesoxicitidina”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 87: AGAAAGGAAG GGAAGAAAGC GAAAGGNC 28

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 88:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

(B)

UBICACIÓN: 24

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA/nota = “El residuo de esta posición es una didesoxicitidina”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 88: GCCGGCGAAC GTGGCGAGAA AGGC 24

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 89:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (1, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un espaciador que contiene un marcador de fluoresceína”

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (28, “")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un espaciador que porta un colorante de Cy3”

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

(B)

UBICACIÓN: 29

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = “El residuo de esta posición es una didesoxicitidina”.

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 89: NAGAAAGGAA GGGAAGAAAG CGAAAGGNC 29

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 90:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 90: AAAATTCCTT TCTCTTTGCC CTTTGCTTCC

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 91:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 91: GGAAAGCCGG CGAACGTGGC GAGAAA 26

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 92:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 92: GGAAAGCCGG CGAACGTGGC GAGA 24

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 93:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazada (1, “")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un espaciador que porta un colorante de Cy3”

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (28, “")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un espaciador que porta un grupo de biotina”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 93: NAGAAAGGAA GGGAAGAAAG CGAAAGGNT 29

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 94:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (1, “")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un espaciador que porta un colorante de Cy3”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

(B)

UBICACIÓN: 2..3

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = “Los residuos de estas posiciones tienen un grupo amino añadido”. "

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (24, “ ")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un espaciador que contiene un marcador de fluoresceína”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 94: NTTCCAGAGC CTAATTTGCC AGTNA 25

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 95:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

(B)

UBICACIÓN: 1

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = “El residuo de esta posición tiene un marcador de TET 5’”.

(ix) CARACTERÍSTICA

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (23, “")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un espaciador que contiene un marcador de fluoresceína”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 95: TTCCAGAGCC TAATTTGCCA GTNA 24

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 96:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 96: CTTACCAACG CTAACGAGCG TCTTG 25

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 97:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico:

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 97: CCCGTCTCGC TGGTGAAAAG AAAAACCACC CTGGCGCCCA ATA 43

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 98:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico:

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 98: TATTGGGCGC CATGGTGGTT TTT 23

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 99:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (10, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 5–nitroindol”. "

(ix)

CARACTERÍSTICA

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (16, “ ")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 5–nitroindol”.

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 99: TATTGGGCGN CAGGGNGGTT TTT 23

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 100:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (10, “")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 5–nitroindol”.

(ix)

CARACTERÍSTICA

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (16, “")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 5–nitroindol”.

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 100: TATTGGGCGN CATGGNGGTT TTT 23

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 101:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (16, “")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 3–nitropirrol”.

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 101: TATTGGGCGC CAGGGNGGTT TTT 23

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 102:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(i)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"

(ix)

CARACTERÍSTICA

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (16, “")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 3–nitropirrol”.

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 102: TATTGGGCGC CATGGNGGTT TTT 23

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 103:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 56 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (1, ")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxicitosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (2, “")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxitimidin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (3, “")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxiguanosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (4..5, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “Los residuos de estas posiciones son un 2’desoxiadenosin–5’– O–(1–tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: sustituir (6, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxitimidin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”. "

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (7, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxiadenosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (8, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxitimidin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”. "

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (9..10, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = Los residuos de estas posiciones son un 2’desoxiadenosin–5’– O–(1–tiomonofosfato)”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 103: CTGAATATAA ACTTGTGGTA GTTGGAGCTG GTGCCGTAGG CAAGAGTGCC TTGACG 56

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 104:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 56 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazada (1, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxicitosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (2, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxitimidin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (3, “ “)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxiguanosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (4..5, “")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “Los residuos de estas posiciones son un 2’desoxiadenosin–5’– O–(1–tiomonofosfato)”

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: sustituir (6, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxitimidin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (7, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxiadenosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (8, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxitimidin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (9..10, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = Los residuos de estas posiciones son un 2’desoxiadenosin–5’– O–(1–tiomonofosfato)”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 104: CTGAATATAA ACTTGTGGTA GTTGGAGCTG GTGACGTAGG CAAGAGTGCC TTGACG 56

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 105:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (1, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxiguanosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (2, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxicitosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar(2, “ “)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxitimidin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (4, “”)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxicitosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (5..6, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “Los residuos de estas posiciones son un 2’desoxiadenosin– 5’’–O–(1–tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (7..8, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “Los residuos de estas posiciones son un 2’desoxiguanonsin– 5’–O–(1–tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (9, “ “)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxicitosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 105: GCTCAAGGCA CTCTTGCCTA CGA 23

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 106:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 9 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: remplazar (1, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un espaciador que porta un

marcador de amidita Cy3”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

(B)

UBICACIÓN: 2..3

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = “Los residuos de estas posiciones tienen un grupo amino añadido”.

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 106: NTTCACCAG 9

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 107:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: remplazar, (1, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxicitosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (2, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxitimidin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (3..4, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “Los residuos de estas posiciones son un 2’desoxicitosin–5’– O–(1–tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (5..6, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “Los residuos de estas posiciones son un 2’desoxiadenosin–5’– O–(1–tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (7, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxicitosin–5’–O–(1–

tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (8, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxitimidin–5’–O–(1–

tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (9, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxiadenosin–5’–O–(1–

tiomonofosfato)”.

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 107: CTCCAACTAC CACAAGTTTA TATTCAG 27

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 108:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 108: CGAGAGACCA CGCT 14

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 109:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (14, “ ")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición contiene una ribosa abásica”.

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 109:

CGAGAGACCA CGCT 14

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 110:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (14, “ ")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición contiene una ribosa abásica con un

grupo fosfato 3’”.

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 110: CGAGAGACCA CGCT 14

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 111:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (15, “ ")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición contiene un grupo fosfato 3’”.

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 111: CGAGAGACCA CGCTG 15

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 112:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: remplazar (1, “ “)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxiguanosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (2, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxitimidin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (3..4, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “Los residuos de estas posiciones son un 2’desoxiadenosin–5’– O–(1–tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (5, “ “)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxitimidin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (6, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxicitosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (7..8, “ “)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “Los residuos de estas posiciones son un 2’desoxitimidin–5’– O–(1–tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (9, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxiadenosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (10, “ ")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxicitosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 112: GTAATCTTAC CAACGCTAAC GAGCGTCTTG 30

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 113:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (1..2, “")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “Los residuos de estas posiciones son un 2’desoxicitosin–5’– O–(1–tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (3, “ “)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxitimidin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: remplazar (4..5, “ ")

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “Los residuos de estas posiciones son un 2’desoxiadenosin–5’– O–(1–tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (6..8, “ “)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “Los residuos de estas posiciones son un 2’desoxitimidin–5’– O–(1–tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (9, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxiguanosin–5’–O–(1– tiomonofosfato)”.

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (10, “ “)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un 2’desoxicitosin–5’–O–(1–

tiomonofosfato)”.

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 113: CCTAATTTGC CAGTTACAAA ATAAACAGCC C 31

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 114:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 9 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: remplazar, (1, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición es un espaciador que porta un colorante de

Cy3”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: modified_base

(B)

UBICACIÓN: 2..3

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /base_mod= OTRA /nota = “Los residuos de estas posiciones tienen un grupo amino añadido”.

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 114: NTTCCAGAG 9

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 115:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 115: TTTTCCAGAG CCTAATGAAA TTAGGCTCTG GAAAGACGCT CGTG 44

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 116:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 116: AACGAGCGTC TTTG 14

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 117:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 117: AACGAGCGTC ATTG 14

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 118:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 50 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 118: TTTTTTTTTA ATTAGGCTCT GGAAAGACGC TCGTGAAACG AGCGTCTTTG

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 119:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 119:

TTTTCCAGAG CCTAATG 17

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 120:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 13 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: reemplazar (1, “”)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición tiene un marcador de TET”.

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 120: CCGGTCGTCC TGG 13

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 121:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 121: CAATTCCGGT GTACTCACCG GTTCC 25

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 122:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_difference

(B)

UBICACIÓN: remplazar (1, ““)

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = “El residuo de esta posición tiene un marcador de TET”.

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 122: CCGGTCGTCC TGGCAA 16

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 123:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 47 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 123: TGTTTTGACC TCCATAGAAG ACCCTATAGT GAGTCGTATT AATTTCG

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 124:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 124: CGAAATTAAT ACGACTCACT ATA 23

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 125:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 125: CGAAATTAAT ACGACTCACT ATACCCAGAA 30

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 126:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 126: CGAAATTAAT ACGACT 16

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 127:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 13 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 127: CGAAATTAAT ACG 13

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 128:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 128: CGAAATTAAT AC 12

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 129:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 129: CACTATAGGG TCTTCTATGG AGGTC 25

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 130:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 130: ACTCACTATA GGGTCTTCTA TGGAGGTC

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 131:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico:

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 131: GACTCACTAT AGGGTCTTCT ATGGAGGTC 29

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 132:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 132: CGAAATTAAT ACGCAGTATG TTAGCAAACG 30

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 133:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 133:

GAACTGGCAT GATTAAGACT CCTTATTACC 30

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 134:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 29 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

ENCADENAMIENTO: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN"

10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 134: GAACTGGCAT GATTAAGACT CCTTATTAA 29

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 135:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 326 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: irrelevante

(D)

TOPOLOGÍA: irrelevante

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 135:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 136:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 340 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: irrelevante

(D)

TOPOLOGÍA: irrelevante

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 136:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 137:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 380 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: irrelevante

(D)

TOPOLOGÍA: irrelevante

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 137:

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 138:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 378 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: irrelevante

(D)

TOPOLOGÍA: irrelevante

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 138:

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 139:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 382 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: irrelevante

(D)

TOPOLOGÍA: irrelevante

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 139: 10

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 140:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 387 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: irrelevante

(D)

TOPOLOGÍA: irrelevante

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 140: 10

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 141:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 488 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: irrelevante

(D)

TOPOLOGÍA: irrelevante

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 141:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 142:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 550 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: irrelevante

(D)

TOPOLOGÍA: irrelevante

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 142:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 143: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 543 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: irrelevante

(D)

TOPOLOGÍA: irrelevante

10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 143:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 144:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 527 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: irrelevante

(D)

TOPOLOGÍA: irrelevante

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 144:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 145:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 434 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

ENCADENAMIENTO: irrelevante

(D)

TOPOLOGÍA: irrelevante

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 145:

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 146:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 33 pares de bases

5

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) ENCADENAMIENTO: simple

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “ADN”

10

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 146:

TACTGACTCA CTATAGGGTC TTCTATGGAG GTC

33

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un conjunto de reactivos para detectar una molécula de ácido nucleico diana que comprende:

   a) un oligonucleótido sonda, en el que al menos una parte de dicho oligonucleótido sonda es complementario a dicho ácido nucleico diana; y

   b) una endonucleasa -1 Flap (FEN-1) termoestable purificada.
2. 2. Un conjunto de reactivos para formar una estructura de escisión con un ácido nucleico diana, teniendo dicho ácido nucleico diana una primera región, una segunda región, una tercera región y una cuarta región, en el que dicha primera región está localizada adyacente a y hacia abajo de dicha segunda región, dicha segunda región está localizada adyacente a y hacia abajo de dicha tercera región y dicha tercera región está localizada adyacente a y hacia abajo de dicha cuarta región, comprendiendo:

   a) un oligonucleótido sonda, teniendo dicho oligonucleótido sonda una parte 5’ y una parte 3’ en el que dicha parte 3’ de dicho oligonucleótido sonda contiene una secuencia de uno o más nucleótidos que es completamente complementaria a dicha tercera región de dicho ácido nucleico diana y en la que dicha parte 5’ de dicho oligonucleótido sonda contiene una secuencia de uno o más nucleótidos adyacente a dicha parte 3’ de dicho oligonucleótido sonda que es completamente complementaria a dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana;

   b) un segundo oligonucleótido que tiene una parte 5’ y una parte 3’ en el que dicha parte 5’ de dicho segundo oligonucleótido contiene una secuencia o uno o más nucleótidos que son completamente complementarios a dicha primera región de dicho ácido nucleico diana y en el que dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido es complementaria a dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana o comprende o consiste en al menos un solo nucleótido que está apareado erróneamente a dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana; y

   c) una enzima termoestable que tiene actividad nucleasa 5’ y sustancialmente carece de actividad polimerasa de ácido nucleico.

3. 3.

   El conjunto de reactivos de la Reivindicación 2, que comprende además un tercer oligonucleótido complementario a dicha cuarta región de dicho ácido nucleico diana.

4. 4.

   El conjunto de reactivos de la Reivindicación 2, en el que un nucleótido terminal 3’ de dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido comprende un nucleótido que está apareado erróneamente al nucleótido en la posición correspondiente de dicho ácido nucleico diana.

5. 5.

   El conjunto de reactivos de la Reivindicación 2, en el que dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido consiste en un solo nucleótido, dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana consiste en un solo nucleótido, y en el que dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido está apareada erróneamente con dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana, o en el que dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido consiste en un solo nucleótido, dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana consiste en un solo nucleótido, y en el que dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido es complementaria a dicha segunda región de dicho ácido nucleico diana.

6. 6.

   El conjunto de reactivos de la Reivindicación 2, en el que dicho terminal 3’ de dicha parte 3’ de dicho segundo oligonucleótido comprende una estructura de anillo aromático que no es una base.

7. 7.

   El conjunto de reactivos de la Reivindicación 1 o Reivindicación 2, en el que dicha composición comprende además un soporte sólido, y en el que dicho oligonucleótido sonda preferiblemente está unido a dicho soporte sólido.

8. 8.

   El conjunto de reactivos de la Reivindicación 2, en el que dicho segundo oligonucleótido está unido a dicho soporte sólido.

9. 9.

   El conjunto de reactivos de la Reivindicación 2, en el que dicha enzima termoestable comprende una secuencia de aminoácidos, en el que en una parte de la secuencia de aminoácidos de dicha enzima termoestable es homóloga a una parte de una secuencia de aminoácidos de una ADN polimerasa termoestable derivada de una especie de Thermus.

10. 10.

    El conjunto de reactivos de la Reivindicación 9, en el que dicha enzima termoestable tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID N.º 61, 66, 69 y 71.

11. 11.

    El conjunto de reactivos de la Reivindicación 2, en el que dicha enzima termoestable comprende una endonucleasa-1 Flap (FEN-1), y en el que dicha endonucleasa-1 Flap (FEN-1) preferiblemente procede de una arqueabacteria.

12. 12.

    El conjunto de reactivos de la Reivindicación 11, en el que dicha arqueabacteria está seleccionada del grupo que cosiste en Methanococcus jannaschii, Pyrococcus woesei y Pyrococcus furiosus.

13. 13.

    El conjunto de reactivos de la Reivindicación 11, en el que dicha endonucleasa-1 Flap (FEN-1) comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID N.º 75, o en el que dicha nucleasa FEN-1 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 79.

14. 14.

    El conjunto de reactivos de la Reivindicación 1 o Reivindicación 2, en el que dicho oligonucleótido sonda

    5 comprende además una parte terminal 5’ que no es complementaria a dicho ácido nucleico diana, y preferiblemente comprende además una solución tampón, y preferiblemente comprende además cebadores de amplificación capaces de amplificar dicho ácido nucleico diana.