CN102378817B - 用于检测和表征产毒性艰难梭菌菌株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测和表征样品中的产毒性艰难梭菌菌株的方法，其中进行下列步骤，(i)提供样品，(ii)在多重PCR测定中，(iii)就细胞毒素tcdB基因的存在或不存在分析样品，(iv)就tcdC基因中的一个或更多个下列缺失的存在或不存在分析样品:(a)SEQ ID NO.1中核苷酸330至核苷酸347的18bp缺失，(b)SEQ ID NO.1中核苷酸（301）至核苷酸（336）的36bp缺失，(c)SEQ ID NO.1中核苷酸（341）至核苷酸（370）的39bp缺失，(d)SEQ ID NO.1中核苷酸（313）至核苷酸（366）的54bp缺失和(e)SEQ ID NO.1的位点117上的单核苷酸的缺失。本发明还涉及各个试剂盒以及引物和探针。

Description

用于检测和表征产毒性艰难梭菌菌株的方法
发明领域
本发明属于生物和化学领域。具体地，本发明属于分子生物学领域。更具体地，本发明属于核酸的检测和实时PCR的领域。最具体地，本发明涉及产毒性艰难梭菌（Clostridium difficile）菌株的检测和表征。
发明背景
艰难梭菌是梭菌属的革兰阳性细菌。梭菌是厌氧芽孢杆菌。艰难梭菌是抗生素相关性腹泻(AAD)的最严重原因并且可导致假膜性结肠炎、严重结肠感染，通常因抗生素对正常肠道菌群的根除引起。天然定居在体内的艰难梭菌变得生长过度：生长过度是有害的，因为细菌释放可引发胃气胀、便秘和腹痛腹泻（diarrhea with abdominal pain）的毒素，所述症状可变得严重。潜伏症状通常模拟某些流感样症状。中断病因的抗生素治疗（causative antibiotic treatment）通常是有疗效的。
艰难梭菌感染的严重性可从无症状变化至严重和威胁生命，特别地是在老年人中。人最常在医院、医护疗养所或公共机构获得感染，虽然社区、门诊发生的艰难梭菌感染日益增加。艰难梭菌获得速率据估计在具有长达2周的住院期的患者中为13%，在具有4周以上的住院期的患者中为50%。艰难梭菌结肠炎的频率和严重度仍然很高并且似乎与增加的死亡率相关。早期干预和侵入性管理是恢复的关键因素。
在2005 (Dial S, Delaney J, Barkun A, Suissa S (2005). "Use of gastric acid-suppressive agents and the risk of community-acquired Clostridium difficile-associated disease". JAMA 294 (23): 2989–95. doi:10.1001/jama.294.23.2989)中报导了据认为在北美引发地理上分散的暴发的抗氟喹诺酮抗生素例如盐酸环丙沙星制剂（Cipro）(环丙沙星)和左氧氟沙星制剂（Levaquin）(左氧氟沙星)的艰难梭菌的新型高毒性菌株的出现。
在2003年6月4日，在加拿大的Montreal, Quebec和Calgary, Alberta报导了该细菌的高毒株的2次暴发。对于2003年中和2004年的前几个月内的约1,400病例，来源使死亡数处于低至36与高至89之间。艰难梭菌感染在2004年后期继续成为Quebec医疗保障体系的问题。截至2005年3月，其已传播至 Toronto, Ontario区域, 使10人住院。
相似的暴发在2003与2005年之间于联合王国的Stoke Mandeville医院发生。
已有人提议加拿大和英国的暴发都与该细菌的似乎更毒的株NAP1/BI/027 相关。该菌株，也称为Quebec菌株，也牵涉在两个荷兰医院(Harderwijk和Amersfoort, 两个都在2005年)暴发的流行病。解释027的增强的毒力的理论是其为毒素A和B的超级生产者（hyperproducer）以及某些抗生素可能实际上刺激细菌过量生产。
当分析具有芽孢（spore）的患者的群体时，无症状的许多患者将该生物传递给免疫受损从而对不断增加的腹泻率和不良结果易感的个体。似乎值得注意的是上述群代表了对试图通过结合信息技术与临床监督来理解疾病如何传播的流行病学家的挑战。
2006年10月1日，根据国家卫生局调查，艰难梭菌据认为在8个月中在Leicester, England的医院杀死至少49人。
2006年10月27日，在Quebec, Canada，该细菌促成9例死亡。
2007年2月27日，在Mississauga, Ontario的Trillium医疗中心鉴定了新的暴发，其中14人被诊断为具有该细菌。该细菌与Quebec的细菌是相同的菌株。官方未能确定艰难梭菌是否是在先前的2个月中造成4个患者死亡的原因。
2007年10月, Maidstone and Tunbridge Wells NHS Trust在其对 2004年4月至2006年9月之间在Kent的医院发生的艰难梭菌大暴发的处理方面受到医疗保健委员会的严厉批评。在其报告中，委员会估计约90个患者"明确地或可能"死于感染(医疗保健委员会新闻稿: Healthcare watchdog finds significant failings in infection control at Maidstone and Tunbridge Wells NHS Trust, 11 October 2007 and Daily Telegraph, Health Secretary intervenes in superbug row, 11 October 2007)。
因此，需要用于检测和表征样品中的产毒性艰难梭菌菌株的方法。
发明概述
本发明已发现用于检测和表征样品中的产毒性艰难梭菌菌株的开拓性方法。有利方面是可在一个单一方法中解决多个诊断问题。该方法现在允许指定样品为包含高毒性艰难梭菌菌株。而且，该方法现允许将样品评定为非NAP1/BI/027菌株。同样地，可将样品评定为NAP1/BI/027菌株。其也可被评定为核糖体型078菌株，或被评定为017菌株。因此，在单个测定中，可进行所有上述指定。
本发明涉及用于检测和表征样品中的产毒性艰难梭菌菌株的方法，其中进行下列步骤，(a)提供样品, (b)在多重PCR测定中, (c)就细胞毒素tcdB基因的存在或不存在分析样品，(d)就tcdC基因的下列缺失的一个或更多个的存在或不存在分析样品: (a) SEQ ID NO. 1中核苷酸330至核苷酸347的18 bp缺失，(b) SEQ ID NO. 1中核苷酸301至核苷酸336的36 bp缺失，(c) SEQ ID NO. 1中核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失，(d) SEQ ID NO. 1中核苷酸313至核苷酸366的54 bp缺失和(e) SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失。
本发明还涉及用于进行本发明的方法的试剂盒，其包括用于扩增和/或检测(i)细胞毒素tcdB基因、(ii) tcdA基因的1.8 kb缺失、(iii)tcdC基因的 SEQ ID NO. 1核苷酸330至核苷酸347的18 bp缺失、(iv)tcdC基因的 SEQ ID NO. 1核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失、(v) SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失的引物和/或探针和用于(vi)检测二元毒素cdtA/B基因的引物和/或探针。
"聚合酶链式反应"或''PCR''是指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸体外扩增特定DNA序列的反应。换句话说，PCR是用于产生侧翼连接引物结合位点的靶核酸的多个拷贝或复制物的反应，此类反应包括下列步骤的一个或更多个重复：(i)使靶核酸变性，(ii)使引物与引物结合位点退火，和(iii)在核苷三磷酸存在的情况下利用核酸聚合酶延伸引物。通常，在热循环仪中经历针对各步骤最优化的不同温度使反应循环进行。具体温度、各步骤的持续时间以及步骤之间改变的速率取决于本领域技术人员公知的许多因素，如由参考资料：McPherson等人, editors, PCR: A Practical Approach和PCR2: A Practical Approach (分别地，IRL Press, Oxford, 1991和1995)所示例的因素。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常规PCR中，可在高于90°C的温度下使双链靶核酸变性，在50-75°C范围内的温度下使引物退火，以及在72-78°C范围内的温度下延伸引物。
术语"PCR"包括反应的衍生形式，包括但不限于实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR等。
反应体积在数百纳升例如200 nl至数百微升的范围内。在本文中，优选体积为每反应室10-50微升，更优选约25微升。
"实时PCR"是指用于随着反应进行，监测反应产物即扩增子的量的PCR。存在许多相异主要在于用于监测反应产物的检测化学的实时PCR形式，例如Gelfand等人, 美国专利5,210,015 ("taqman"); Wittwer等人, 美国专利6,174,670和6,569,627 (嵌入染料); Tyagi等人, 美国专利5,925,517 (分子信标)。实时PCR的检测化学综述于Mackay等人, Nucleic Acids Research, 30: 1292-1305 (2002)。在实时PCR中，也可使用两温度阶段反应，在所述反应中聚合温度等于退火温度，即使对于常见的杂交探针如蝎型引物或Pleiades探针也如此。
"多重PCR"是指其中在相同的反应混合物中同时进行多个靶序列（或单个靶序列和一个或更多个参照序列）的PCR，例如Bernard等人, Anal. Biochem., 273: 221-228 (1999) (双色实时PCR)。通常，对于每一个待扩增的序列，使用不同组的引物。通常，多重PCR中的靶序列的数目在2至10，或2至8或更常见地，3至6的范围内。对于本发明，优选数目为2-6。
"定量PCR"是指经设计用以测量样品或样本中的一种或更多种靶序列的丰度的PCR。定量PCR包括此类靶序列的绝对定量和相对定量。使用可以与靶序列分别或一起测定的一个或更多个参照序列进行定量测量。参照序列对于样品或样本来说可以是内源或外源的，在后一种情况下，其可包括一个或更多个竞争者模板。常见的内源参照序列包括下列基因的转录物的区段：pactin、GAPDH、微球蛋白、核糖体RNA等。用于定量PCR的技术对于本领域技术人员来是公知，如下列参考文献所例示的：'Freeman等人, Biotechniques, 26: 112-126 15 (1999); Becker-Andre等人, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9447 (1989); Zimmerman等人, Biotechniques, 21: 268-279 (1996); Diviacco等人, Gene, 122: 3013-3020 (1992); BeckerAndre等人, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9446 (1989);等等。
"引物"是指在与多核苷酸模板形成双链体后能够用作核酸合成的起始点并且沿着模板从其3'末端延伸以便形成延长的双链体的天然或合成的寡核苷酸。通常利用核酸聚合酶例如DNA或RNA聚合酶来进行引物的延伸。延伸过程中添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列决定。通常利用DNA聚合酶延伸引物。引物通常具有在14至40个核苷酸的范围内，或在18至36个核苷酸的范围内的长度。将引物用于多种核酸扩增反应，例如使用单个引物进行的线性扩增反应或利用两个或更多个引物进行的聚合酶链式反应。选择用于特定应用的引物的长度和序列的指导对于本领域技术人员来说是公知的，如由下列参考资料所证明的：Dieffenbach, editor, PCR Primer: A Laboratory Manual, 第2版(Cold Spring Harbor Press, New York, 2003)。
"样品"是指其中寻求靶核酸的检测或测量的来自生物、环境、医疗或患者来源的一些物质。在一个方面其意指包括样本或培养物（例如，微生物培养物）。在另一个方面，其意指包括生物和环境样品。样品可包括合成来源的样本。生物样品可以是动物包括人，液体、固体（例如，粪便）或组织，以及液体和固体食品和饲料产品及成分例如乳制品产品、蔬菜、肉和肉副产品和废料。生物样品可包括采自患者的材料，包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊髓液、胸膜液、精液、针抽吸物（needle aspirate）等。生物样品可从家畜的所有不同家族以及未驯服的动物或野生动物（包括但不限于这样的动物如有蹄类动物、熊、鱼、啮齿类动物等）获得。环境样品包括环境材料例如表面物质、土壤、水和工业样品以及获自食品和乳制品加工仪器、装置、设备、器具、一次性和非一次性产品的样品。这些实例不被解释为限定适用于本发明的样品类型。术语“样品”和“样本”可互换使用。
优选扩增产物描述于下表中：
2 SEQ ID NO. 2是优选tcdB扩增子。
3 SEQ ID NO. 3是更优选tcdB扩增子。
4 SEQ ID NO. 4公开了tcdC nt117缺失。
5 SEQ ID NO. 5公开了 tcdC缺失18bp, 36bp, 39bp和54bp。
6 SEQ ID NO. 6公开了二元毒素。
7 SEQ ID NO. 6公开了tcdA缺失。
8 SEQ ID NO. 8是优选tcdC 18-bp扩增子。
9 SEQ ID NO. 9是优选tcdC 36-bp。
10 SEQ ID NO. 10是优选tcdC 39-bp扩增子。
11 SEQ ID NO. 11是优选tcdC 54-bp 扩增子。
1 SEQ ID NO. 1是全长wt tcdC序列(菌株630登录号AM180355 区域: 804310..805008)
12 SEQ ID NO. 12是全长核糖体型027 tcdC序列(incl nt117和18-bp缺失)登录号DQ861412
13 SEQ ID NO. 13是36-bp缺失变体的全长tcdC 序列(登录号 DQ861424)
14 SEQ ID NO. 14 是39-bp缺失变体的全长tcdC序列(登录号EF470292)
15 SEQ ID NO. 15 是54-bp缺失变体的全长tcdC序列。
附图概述
图1显示根据本发明的优选靶。
图2显示根据本发明的可能筒装置。
实施方案的详述
本发明涉及用于检测和表征样品中的产毒性艰难梭菌株，其中进行下列步骤，(a)提供样品，(b)进行多重PCR测定法，(c)就细胞毒素tcdB基因的存在或不存在分析样品，(d)就tcdC基因的下列缺失的一个或更多个的存在或不存在分析样品: (a) SEQ ID NO. 1中的核苷酸330至347的18 bp缺失, (b) SEQ ID NO. 1中核苷酸301至核苷酸336的36 bp缺失, (c) SEQ ID NO. 1中核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失, (d)SEQ ID NO. 1中核苷酸313至核苷酸366的54 bp缺失和(e) SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失。
任选地，就肠毒素tcdA基因的1.8 kb缺失的存在或不存在额外地分析样品。
优选，就二元毒素cdtA和/或cdtB的存在或不存在额外地分析样品。
在根据本发明的方法的一个实施方案中，就如下方面分析样品：(i)所有下列缺失的存在或不存在，(a) SEQ ID NO. 1中核苷酸330至核苷酸347的18 bp缺失，(b) SEQ ID NO. 1中核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失和(c) SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失，(ii)就细胞毒素tcdB基因的存在或不存在分析样品，(iii)就1.8 kb tcdA缺失的存在或不存在分析样品和(iv)就cdtA/B二元毒素基因的存在或不存在分析样品。
优选地在根据本发明的方法中，(a)如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失不存在，SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失不存在，所述18 bp缺失也不存在，所述39 bp缺失也不存在，那么所述样品被评定为产毒性艰难梭菌，(b)如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失不存在，SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失存在，所述18 bp缺失存在，所述cdtA/B二元毒素基因存在，那么样品被评定为核糖体型027 艰难梭菌菌株，(c)如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失存在， SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失不存在，所述18 bp缺失也不存在，SEQ ID NO. 1中核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失也不存在，cdtA/B二元毒素基因不存在，那么样品被为评定为核糖体型017艰难梭菌菌株以及(d)如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失不存在， SEQ ID NO. 1中核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失存在，cdtA/B二元毒素基因存在，那么样品被评定为核糖体型078艰难梭菌菌株。
任选地和此外，可分析下列其他靶。这些靶是与高毒力（hypervirulence）相关的靶，例如但不限于tcdC∆36bp、tcdC∆54bp。具有36-bp、39-bp或54-bp缺失的菌株都在tcdC基因的上游具有额外的特定突变，所述突变导致优选作为测定的部分的截断的且无功能的TcdC蛋白。
tcdB基因的3’部分的特定变异据报导与优选用于测定中的非-NAP1/BI/027菌株相关。
优选地，多重PCR测定中的扩增产物大小为60至200 bp。
在一个实施方案中，在荧光指示剂存在于反应混合物中的情况下在封闭系统中进行多重扩增反应，荧光指示剂能够在扩增反应中产生与各扩增子的存在和/或量相关的光学信号和在扩增反应中监测荧光指示剂的光学信号。
在根据本发明的方法中，封闭系统为用户提供光学输出，从而显示上文中概述的评定分配。
所述多重PCR扩增是定量实时PCR。实时PCR（在本文中也称为定量PCR或定量实时PCR (qPCR))是使用聚合酶链式反应(PCR)同时扩增和定量核酸的方法。定量实时逆转录PCR (RT-qPCR)是还包括RNA至DNA例如mRNA至cDNA的逆转录的定量实时PCR法。在qPCR法中，随着扩增核酸积累，对其进行定量。通常，将嵌入双链DNA的荧光染料(例如溴化乙锭或SYBR® Green I)或当与互补核酸（例如，积累的DNA）杂交时发荧光的经修饰的核酸探针(“报告探针”)在基于qPCR的方法中用于扩增。具体地，发荧光的引物、杂交探针(例如 LightCycler探针(Roche))、水解探针(例如TaqMan探针(Roche))或发夹探针例如分子信标、蝎型引物(DxS)、Sunrise引物(Oncor)、LUX引物(Invitrogen)、Amplifluor引物(Intergen)等可用作报告探针。根据本发明，发荧光的引物或探针可以例如是已连接例如共价连接荧光染料的引物或探针。此类荧光染料可以例如是FAM (5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、Oregon绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红、Yakima黄、Alexa Fluor、PET Biosearch Blue™、Marina Blue®、Bothell Blue®、CAL Fluor® Gold、CAL Fluor® Red 610、Quasar™ 670、LightCycler Red640®、Quasar™ 705、LightCycler Red705®等。特定的受体探针可额外地包含荧光猝灭剂。
为了进行本发明的实施方案，可将选择性引物用于定量实时多重PCR。
本文中的“引物”是指包含与待转录的核酸（“模板”）杂交的序列的寡核苷酸。在复制过程中，聚合酶将核苷酸连接至与模板的各核苷酸互补的引物的3’末端。
在本发明的具体实施方案中，用于定量实时PCR的聚合酶是来自嗜热生物的聚合酶或热稳定的聚合酶或选自嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）(Tth) DNA聚合酶、水生栖热菌（Thermus acquaticus）(Taq) DNA聚合酶、海栖热袍菌（Thermotoga maritima）(Tma) DNA聚合酶、Thermococcus litoralis (Tli) DNA聚合酶、强烈炽热球菌（Pyrococcus furiosus）(Pfu) DNA聚合酶、沃氏热球菌（Pyrococcus woesei）(Pwo) DNA聚合酶、Pyrococcus kodakaraensis KOD DNA聚合酶、丝状栖热菌（Thermus filiformis）(Tfi) DNA聚合酶、硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）Dpo4 DNA聚合酶、Thermus pacificus (Tpac) DNA聚合酶、Thermus eggertssonii (Teg) DNA聚合酶、布氏栖热菌（Thermus brockianus）(Tbr)和黄色栖热菌(Thermus flavus ) (Tfl) DNA聚合酶。
具体地，利用选自FAM、VIC、NED、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、Oregon绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红、Yakima黄、Alexa Fluor 和PET的染料标记荧光标记的探针。
具体地，杂交探针是LightCycler探针(Roche)或杂交探针是TaqMan探针(Roche)。在其他实施方案中，发夹探针选自分子信标、蝎型引物、Sunrise引物、LUX引物和Amplifluor引物。TaqMan探针是优选的。
本发明涉及包含一个或更多个通道或小室的封闭系统扩增筒(cartridge)，所述通道或小室包含用于扩增和/或检测(i)细胞毒素tcdB基因、(ii) tcdA基因的1.8 kb缺失、(iii)tcdC基因的SEQ ID NO. 1核苷酸330至核苷酸347的18 bp缺失、(iv)tcdC基因的SEQ ID NO. 1核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失、(v)SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失的引物和/或探针和用于检测二元毒素cdtA/B基因的引物和/或探针。
本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包括用于扩增和/或检测(i)细胞毒素tcdB基因、(ii) tcdA基因的1.8 kb缺失、(iii)tcdC基因的SEQ ID NO. 1核苷酸330至核苷酸347的18 bp缺失、(iv)tcdC基因的SEQ ID NO. 1核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失、(v)SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失的引物和/或探针和用于(vi)检测二元毒素cdtA/B基因的引物和/或探针。
在本发明的优选实施方案中，试剂盒额外地包含酶例如聚合酶、缓冲液和其他成分。
在一个实施方案中，所述方法可在经设计用于进行样品制备和实时多重PCR的筒中进行。此类筒是用于封闭多阶段核酸扩增反应的系统、方法和仪器，其中一部分前期阶段反应混合物用作用于下一阶段反应的样品。本发明提供了上文中概述的用于控制扩增的方法，其包括步骤：(i)在荧光指示剂存在于反应混合物中的情况下扩增所述多重反应物，荧光指示剂能够在扩增反应中产生与扩增子的量相关的光学信号; (ii)在扩增反应中监测荧光指示剂的光学信号。
本发明还涉及包含一个或更多个通道或小室的封闭系统扩增筒，所述通道或小室包含用于扩增和/或检测(i)细胞毒素tcdB基因、(ii) tcdC基因、(iii)SEQ ID NO. 1中核苷酸330至核苷酸347的18 bp缺失、(iv) SEQ ID NO. 1中核苷酸301至核苷酸336的36 bp缺失、(v)SEQ ID NO. 1中核苷酸341至核苷酸370的39 bp缺失、(vi) SEQ ID NO. 1中核苷酸313至核苷酸366的54 bp缺失、(vii)SEQ ID NO. 1的位点117上的单核苷酸缺失的引物和/或探针。这样的封闭系统公开于例如WO 2006/047777中。筒可额外地包含用于样品制备例如细胞裂解和/或核酸提取的一个或更多个小室。优选PCR室包括任选地透明表面，例如玻璃、晶体或塑料，其允许扩增产物的在线检测。
一旦在筒中分离了DNA，就将其重新溶解在以冻干形式贮存在筒内的主混合物（mastermix）中。随后在主混合物溶液中均质化洗脱物。在筒中充满至少3至5个PCR小室（或亚组，如果应用这样要求的话），以便无空气被捕获小室中。扩增可能需要少于5个小室，此处可使用筒变型。可通过测定方案改变所需洗脱体积。在扩增过程中关闭小室，以便无扩增子可逸入环境，并且不让空气进入小室。使小室进行温度循环。在所有小室之间使循环同步，具有单个温度设定点。随后在多达6个波长上进行荧光检测。可在循环的任何时刻触发检测。可从测量数据和可能地另外的校准数据计算Ct值、初始浓度和终测试结果。基于本发明的靶的Ct值产生测试结果。
筒在装置中进行PCR。样本容器或还有本文中的筒到达控制台，用户输入与命令相关的标识符(例如以纸命令形式存在的条形码、标识符等)。控制台从局部控制台数据库检索(retrieve)相关命令。然后用户 扫描筒的RFID标签。检查筒的有效性(例如，筒类型对应于测试类型、有效期等)。如果筒是有效的，那么其与控制台数据库中的命令相关。控制台主服务需要仪器的可用槽（available slot）。仪器控制子系统在应用负载均衡后返回可用槽。在通知用户插入筒后，用户将筒插入提示的槽。仪器控制子系统被告知已插入筒并且控制台主服务检查筒是否与命令相关。如果筒与命令相关，那么访问配方数据库（recipe database）以检索匹配命令中测试类型的配方。在检索配方后，命令仪器控制子系统上载配方并且起始其中已插入筒的槽的测试。在测试完成后，由仪器控制子系统接受测试结果并且进行下列步骤：
将测试结果传递给测试结果引擎。测试结果引擎将所述结果存储在控制台数据库中。然后通过外部IS数据交换子系统将结果发送至外部IS。并且用户被告知测试完成。用户获得关于评定的光学和/或声学输出。
如图2中所绘制的，筒被分成6个模块。在下列段落中详细地解释模块。就其功能性定义筒内的模块。尽可能多地整合筒的所有功能性并且利用最少数量的部分实现所述功能性。总流程如下：操作者手工将样品充满裂解室并且关闭输入盖。将筒置于槽的托盘中，将托盘载入槽中。当加载至槽中时，过程始于液化和裂解样品。这都在裂解室中借助于 HiFU能进行。之后向样品中各自加入不同试剂，以便可使最终结果涌过提取膜（extraction membrane）。所有此类步骤在一个小室中进行以能够也处理高粘性样品如大便(粪便)。同样地，对于所有过程只需要一个接口和HiFU源。试剂至小室的运输通过液体运输模块来进行。在该模块内，试剂被贮存持续达保存期限，将试剂从储存器取出并运输至裂解室。该模块也将处理的样品从裂解室通过提取膜运输至废料。以相同的方式操作清洗裂解模块、流体运输模块、提取模块、废料处理模块、PCR模块、手工样品输入、覆盖试剂，从储存器取出试剂，将其通过膜运输至废料。通过集中流体驱动和处理，使用于该支持功能的筒内的接口数和组分数减少至最少。之前提及的提取膜包含在提取模块内。该模块确保通过膜的良好流动和至膜的良好热传递。该加热是DNA的乙醇去除和洗脱所必需的。废料处理模块用于将所有流体（除了洗脱物外）导向废料室，这利用与流体处理模块中所使用的相同类型的阀门来进行。进行这以使筒内使用的用于相同功能性的不同技术减少至最少。该模块的第二功能是吸取洗脱缓冲液通过提取膜。利用该模块进行驱动使洗脱物的污染的风险降至最低。当流体运输模块也用于该功能时，该风险更高。在将洗脱物运输至PCR室时，首先必须加入主混合物，并且必须使整个体积中的DNA内容物均质化。这也在该模块中进行。最后，将流体运输至PCR室。利用与早期用于将洗脱物运输通过提取膜的驱动器相同的驱动器进行驱动。也选择压力驱动的流体运输来进行该运输功能。之后压力驱动的流体运输的功能性已存在在筒中。必须将置于PCR模块中的PCR室充满而不留空气。为了确保该目的，将脱气膜置于供给通道内以除去将进入PCR室的混合气泡。制造PCR室以使小室的几何形状限制体积。这确保小室充满相同体积，即使当从一个供给通道充满小室时亦如此。将小室平行地置于流体性结构内以防止为每小室特异性的引物/或探针的任何串扰。还存在充填后脱气过滤器。
含有靶多核苷酸（艰难梭菌）的样品或样本可来自与本发明一起使用的许多种来源，包括细胞培养物、动物或人组织、患者生物活检组织、环境样品等。使用通常依赖于样品或样本所采自的来源的常规技术制备用于本发明的测定法的样品。收集样品或样本以使样品或样本被外来成分污染，或环境被样品或样本（如果其包含有害成分）污染的机会降至最低。通常，这通过将用于分析的样品例如组织、血液、唾液等直接引入流体封闭系统内的样品收集室来进行。常见地，可通过将样品经任选地可密封的开口例如注射阀或隔膜直接注射入样品收集室来防止样品的交叉污染。通常，优先采用可密封阀来在样品注射过程中或之后减少渗漏的任何潜在威胁。除了上文所述之外，装置/筒的样品收集部分还可包含用于中和传染剂、稳定样本或样品、pH调整等的试剂和/或处理。稳定和pH调整处理可包括例如引入肝素来防止血液样品的凝固、缓冲剂的添加、蛋白酶、防腐剂等的添加。通常可将此类试剂贮存在装置/筒的样品收集室内或可将其贮存在分别可及的小室中，其中可添加试剂或在将样品引入装置后将试剂与样品混合。取决于所使用的特定试剂的性质和稳定性，可将此类试剂以液体或冻干形式整合在装置内。
在本文中，优选样品是人或动物粪便。
在对样品进行扩增反应之前，通常需要对样品进行一个或更多个样品制备操作。常见地，这些样品制备操作可包括这样的操作，如从完整样品提取细胞内物质例如核酸等。可容易地将此类不同操作的一个或更多个操作整合入本发明包括的流体封闭系统。
对于其中将分析完整细胞或其他组织样品的那些实施方案，通常在继续不同样品制备操作之前必需从细胞、粪便、血液或其他体液提取核酸。因此，在样品收集后，可将核酸从收集的细胞释放至粗提物中，然后进行额外处理以制备用于随后操作例如污染性（DNA结合）蛋白质的变性、纯化、过滤、脱盐等的样品。通常可通过化学、物理或电解质裂解法来从样品细胞释放核酸以及使DNA结合蛋白变性。例如，化学法通常利用裂解剂破裂细胞，从细胞提取核酸，然后利用离液盐例如异硫氰酸胍或尿素处理提取物来使任何污染性和潜在干扰性蛋白质变性。通常，当使用化学提取和/或变性法时，可将适当的试剂整合在样品制备室、分离的可及的小室内，或可从外部引入所述试剂。
可用物理方法提取核酸和使DNA结合蛋白变性。美国专利No. 5,304,481论述了物理突出物（physical protrusion）在微通道内或锐边颗粒在小室或通道内刺穿细胞膜并且提取它们的内容物的用途。此类结构与用于搅拌的压电元件的组合可提供适当的剪切力来进行裂解。关于核酸片段化在下文中更详细地描述此类元件。还可使用更常规的细胞提取方法，例如应用具有引起细胞裂解的有限横断面尺寸的通道。可选地，可通过对样品施加交变电流来进行细胞提取和污染性蛋白质的变性。更具体地，将细胞的样品流过微导管阵列同时施加跨液流的交变电流。可将多种其它方法用于本发明的装置内以进行细胞裂解/提取，包括例如将细胞经历超声搅拌或迫使细胞通过小孔，从而使细胞经历高剪切力，从而导致破碎。
在提取后，通常需要将核酸与粗提物的其他成分例如变性的蛋白质、细胞膜颗粒、盐等分离。一般通过过滤、絮凝等除去颗粒物质。可将多种过滤器类型容易地整合在装置中。此外，当使用化学变性法时，可能需要在进行下一步骤之前使样品脱盐。通常在单个步骤中进行样品的脱盐和核酸的分离，例如通过将核酸结合至固相并且洗去污染性盐或对样品进行凝胶过滤层析，使盐通过透析膜等来进行。用于核酸结合的适当的固体载体包括例如硅藻土、硅石(即，玻璃棉)等。本领域内也公知的适当的凝胶排阻介质也可被容易地整合在本发明的装置/筒中，并且可从例如Pharmacia和Sigma Chemical商购获得。
可在另外的小室中进行分离和/或过滤/脱盐，或可选地，可将特定的层析介质整合在通往随后的反应室的通道或液道中。可选地，一个或更多个液道或小室的内表面本身可被衍生以提供适合于所需纯化的官能团，例如带电荷的基团和亲和结合基团等。可选地，脱盐方法通常可利用DNA的高电泳迁移率和负电荷（与其他成分相比较的）。电泳法还可用于从其他细胞污染物和碎片纯化核酸。在一个实例中，装置的分离通道或小室与两个分离的其中置有电极例如铂电极的“场”通道或小室流体连接。使用适当的屏障或“捕获膜”将两个场通道与分离通道分开，所述屏障或捕获膜允许液流通过而不允许核酸或其他大分子通过。屏障通常发挥两个基本功能：首先，屏障用于阻留向分离小室内的正电极迁移的核酸；其次，屏障防止与电极上的电解相关的有害作用进入反应室(例如，用作盐连接（ salt junction）)。此类屏障可包括透析膜、浓稠凝胶、PEI过滤器或其他适当的材料。当施加适当的电场时，存在于样品中的核酸将向正电极迁移并且被捕获在捕获膜上。随后通过施用适当的液流从小室洗去未与膜结合的样品杂质。当反转电压时，核酸以显著更纯的形式从膜释放。可将场通道置于分离小室或通道的相同或相对的侧或末端上，并且可将其与本文中描述的混合成分联合使用以确保操作的最大效率。此外，还可将粗滤器覆盖在屏障上以避免颗粒物、蛋白质或核酸对屏障的任何污染，从而允许重复使用。在相似的方面中，通过利用短柱的凝胶或可减缓或迟滞其他污染物的流动同时允许核酸更快通过的其他适当的基质或凝胶把核酸（具有负电荷）的高电泳迁移率用于使核酸与污染物分离。
在优选实施方案中，将探针和/或引物如下分配在通道或小室中：将引物和探针的特定混合物作为干燥的材料稳定地贮存在各个单个PCR小室中。通过用预混合的模板/PCR反应混合物充满PCR小室，贮存的引物/探针以对于它们的指定的反应为最优的浓度形成均质溶液。
序列表
<110> Philips IP & S
<120> 用于检测和表征产毒性艰难梭菌菌株的方法
<130> P3274 EP BLN
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 699
<212> DNA
<213> 艰难梭菌
<400> 1
atgttttcta aaaaaaatga tggtaacgaa tttagtaatg aaggaaaagg aagctctaag 60
aaaataatta aattctttaa gagcacaaag ggtattgctc tactggcatt tattttaggc 120
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<212> DNA
<213> 艰难梭菌
<400> 2
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<212> DNA
<213> 艰难梭菌
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<212> DNA
<213> 艰难梭菌
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 艰难梭菌
<400> 11
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<212> DNA
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atcaaacatc agttatagat tctcaaaaaa cagaaataga aactttaaat agcaaattgt 240
ctgatgctga accatggttc aaaatgaaag acgacgaaaa gaaagctatt gaagctgaaa 300
atcaacgtaa agctgaagaa gctaaaaagg ctgaagaaca acgtaaaaaa gaagaagaag 360
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gataaggttg tactatgtag ttataaaaaa tcaataactc cttcaagagt attagaggat 540
gattacataa ctataagagg tataagtgct ggaactataa cttatgaatc aactatgggt 600
ggaaatataa ctataccagg gatagctgta gagaaaatta attaa 645

Claims (9)

1.用于扩增和/或检测细胞毒素tcdB基因、SEQ ID NO.1中核苷酸330至核苷酸347的18bp缺失、SEQ ID NO.1中核苷酸301至核苷酸336的36bp缺失、SEQ ID NO.1中核苷酸341至核苷酸370的39bp缺失、SEQ ID NO.1中核苷酸313至核苷酸366的54bp缺失和SEQ ID NO.1中位点117上的单核苷酸缺失的引物和/或探针共同在制备用于检测和表征样品中的产毒性艰难梭菌菌株的方法的封闭系统扩增筒或试剂盒中的用途，其中所述方法进行下列步骤，
a.提供样品；
b.在多重PCR测定中，
i就细胞毒素tcdB基因的存在或不存在分析所述样品；
ii就tcdC基因中的一个或更多个下列缺失的存在或不存在分析所述样品，
a)SEQ ID NO.1中核苷酸330至核苷酸347的18bp缺失；
b)SEQ ID NO.1中核苷酸301至核苷酸336的36bp缺失；
c)SEQ ID NO.1中核苷酸341至核苷酸370的39bp缺失；
d)SEQ ID NO.1中核苷酸313至核苷酸366的54bp缺失；
e)SEQ ID NO.1中位点117上的单核苷酸缺失，
其中所述多重PCR扩增是定量实时PCR。
2.权利要求1的用途，其中所述封闭系统扩增筒或试剂盒进一步包含用于扩增和/或检测肠毒素tcdA基因1.8kb缺失的引物和/或探针，并且就肠毒素tcdA基因1.8kb缺失的存在或不存在额外地分析样品。
3.权利要求1或2的用途，其中所述封闭系统扩增筒或试剂盒进一步包含用于扩增和/或检测二元毒素cdtA和/或cdtB的引物和/或探针，并且就二元毒素cdtA和/或cdtB的存在或不存在额外地分析样品。
4.权利要求1至3的用途，其中就如下方面分析所述样品，
a.所有下列缺失的存在或不存在：
b.SEQ ID NO.1中核苷酸330至核苷酸347的18bp缺失、SEQ ID NO.1中核苷酸341至核苷酸370的39bp缺失，
c.SEQ ID NO.1的位点117上单个核苷酸的缺失，
d.细胞毒素tcdB基因的存在或不存在，
e.1.8kb tcdA缺失的存在或不存在，和
f.cdtA/B二元毒素基因的存在或不存在。
5.上述权利要求的任一项的用途，其中
a.如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失不存在，SEQ ID NO.1的位点117上的单核苷酸缺失不存在，所述18bp缺失也不存在，所述39bp缺失也不存在，那么所述样品被评定为产毒性艰难梭菌，
b.如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失不存在，SEQ ID NO.1的位点117上的单核苷酸缺失存在，所述18bp缺失存在，所述cdtA/B二元毒素基因存在，那么样品被评定为核糖体型027艰难梭菌菌株，
c.如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失存在，SEQ ID NO.1的位点117上的单核苷酸缺失不存在，所述18bp缺失也不存在，SEQ ID NO.1中核苷酸341至核苷酸370的39bp缺失也不存在，并且cdtA/B二元毒素基因不存在，那么样品被为评定为核糖体型017艰难梭菌菌株，和
d.如果tcdB基因序列存在，tcdA缺失不存在，SEQ ID NO.1中核苷酸341至核苷酸370的39bp缺失存在，并且cdtA/B二元毒素基因存在，那么样品被评定为核糖体型078艰难梭菌菌株。
6.上述权利要求的任一项的用途，其中在反应混合物中存在荧光指示剂的情况下在封闭系统中进行所述多重扩增反应，荧光指示剂能够在扩增反应中产生与各扩增子的存在和/或量相关的光学信号和在扩增反应中监测荧光指示剂的光学信号。
7.权利要求6的用途，其中所述封闭系统为用户提供光学输出，指示权利要求5的评定分配。
8.权利要求1至6的用途，其中多重PCR测定中的所述扩增产物大小为60至200bp。
9.权利要求1至8的用途，其中所述样品是人或动物粪便。
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