CN111705150B - 用于检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC的方法、引物和试剂盒 - Google Patents

用于检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC的方法、引物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC的方法、引物和试剂盒，它们涉及使用引物激活式恒温核酸扩增方法扩增待测样品DNA，得到扩增产物；其中，所述扩增引物由SEQ ID NO:17‑20表示的组合引物；和分析得到的扩增产物中是否存在艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC序列中第117位单核苷酸缺失。本发明所述的方法、引物和试剂盒能够在等温条件下便捷、高效，并以高特异性以及高灵敏度检测出艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC，从而解决了现有方法中存在的特异性不高、灵敏度较低、交叉污染率高、操作复杂、效率低下、成本高等问题。

Description

用于检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC的方法、引 物和试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，涉及一种用于检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC的方法、引物和试剂盒。
背景技术
艰难梭菌（Clostridium difficile或C. difficile）是一种严格厌氧生长的革兰氏阳性梭状芽孢杆菌，属于条件致病菌，目前是全球范围内公认的引起医院内感染和抗生素相关性腹泻的最为重要的病原微生物。临床上，约15%~25%的抗菌药物相关性腹泻，50%~75%的抗菌药物相关性结肠炎和95%~100%的伪膜性肠炎由CDI（艰难梭菌感染）引起。2013年，艰难梭菌被美国国家卫生部列为抗生素相关耐药菌中的三大病原菌之首，威胁程度指定为“最紧急”。我国也已将艰难梭菌研究纳入“十二五”国家传染病重大科技专项。艰难梭菌感染易出现抗生素耐药性、反复复发性、传染性、高致死性，因此艰难梭菌感染已对全球性公共卫生造成威胁。
在美国和欧洲，CDI已成为相关性腹泻的首要病因，总体发病率高于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染，而在中国，CDI的潜在威胁远高于国际水平，临床需求较明确。2001年后，随着艰难梭菌高毒力菌株核糖体027型（RT027）的出现，艰难梭菌感染的发病率和严重程度在世界各地均呈上升趋势，已经成为令人担忧的健康问题。与其他基因型比较，艰难梭菌RT027更容易导致患者出现严重症状，是目前临床监测的重点。Genbank序列比对结果显示，RT027型毒力调节基因tcdC序列与参考株VPI10463（Genbank收录号：X92982）相比，RT027型菌株tcdC序列出现连续18个核苷酸（nt330-347）的缺失和第117位单核苷酸的缺失。
近几年，检测碱基突变的方法层出不穷，同时经典的方法也在不断地被改进。目前较为常见的方法主要包括传统的PCR-高通量测序技术和PCR-焦磷酸测序技术，以及新兴的ARMS-PCR技术（amplification refractory mutation system）、HRM技术（high-resolution melting analysis）、PNA-探针法以及流式荧光杂交等。然而，上述方法在碱基突变的检测中通常存在分析周期长、灵敏度低、特异性有限、成本高，或者操作繁琐复杂、对操作人员技术要求高、易造成样品污染、仪器平台复杂等问题。
因此，采用能够克服主流碱基突变检测方法的一个、多个或全部缺陷的改进的碱基突变检测方法来对艰难梭菌RT027进行检测，从而辅助艰难梭菌的快速检测，进而进行快速诊断，对于减少目前由于此种艰难梭菌耐药菌感染带来的病人死亡风险和国家及个人的经济损失是有重大意义的。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种用于检测艰难梭菌核糖体027型型毒力调节基因tcdC的方法。本发明提供的方法基于引物激活式恒温核酸扩增方法，通过设计特异性针对RT027型菌株tcdC序列的引物，对艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC进行检测。本发明提供的方法能够在等温条件下便捷、高效，并以高特异性以及高灵敏度检测出艰难梭菌RT027型毒力调节基因tcdC，从而解决了现有方法中存在的特异性不高、灵敏度较低、交叉污染率高、操作复杂、效率低下、成本高等问题。本发明还提供了用于检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC的引物和试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
一方面，本发明提供了一种用于检测艰难梭菌核糖体027型（RT027）毒力调节基因tcdC的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）使用引物激活式恒温核酸扩增方法扩增待测DNA样品，得到扩增产物；其中，所述扩增引物为SEQ ID NO: 17-20表示的组合引物；和
（2）分析步骤（1）得到的扩增产物中是否存在艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC序列中第117位单核苷酸缺失。
优选地，所述艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC序列及其非转录的调控序列如SEQ ID NO: 21所示，并且其中所述SEQ ID NO: 21所示序列的第1-157位为非转录的调控序列，第274位单核苷酸缺失。
根据本发明所述的方法，在步骤（1）中，所述恒温核酸扩增的反应混合物还可以包括：反应缓冲液、MgSO4、DNA聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷（dNTPs）、荧光染料、甜菜碱和RNase H2酶。优选地，所述恒温核酸扩增的反应混合物还包括：0.8-1.2 x Thermopol反应缓冲液、4-8 M MgSO4、1-1.4 M dNTPs、0.4-2 x SYBR Green I、6-10 U Bst DNA聚合酶、1×10-3-5×10-3 U/μL RNase H2酶、0.6-1.6 μM SEQ ID NO: 17所示的引物、0.6-1.6 μMSEQ ID NO: 18所示的引物、0.1-0.3 μM SEQ ID NO: 19所示的引物、0.1-0.3 μM SEQ IDNO: 20所示的引物、1-1.5 M甜菜碱和无RNase（RNase-free）水。
根据本发明所述的方法，在步骤（1）中，所述恒温核酸扩增的反应总体系可以为25μL或者30 μL；所述恒温核酸扩增的反应温度可以为55~68℃；所述恒温核酸扩增的时间可以为45~90 min；所述待测DNA样品的体积可以为2 μL。
根据本发明所述的方法，在步骤（2）中，所述分析可以为实时荧光分析或实时浊度分析。
另一方面，本发明提供了用于以引物激活式恒温核酸扩增方法检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC的引物，其中所述扩增引物为SEQ ID NO: 17-20的表示的组合引物。
再一方面，本发明提供了一种用于以引物激活式恒温核酸扩增方法检测艰难梭菌核糖体027型（RT027）的试剂盒，所述试剂盒包括：
（1）用于提取待测DNA样品的试剂；和
（2）SEQ ID NO: 17-20的表示的组合引物。
根据本发明所述的试剂盒，所述试剂盒还可以包括以下反应混合物：反应缓冲液、MgSO4、DNA聚合酶、dNTPs、荧光染料、甜菜碱和RNase H2酶。优选地，所述试剂盒还包括以下反应混合物：0.8-1.2 x Thermopol反应缓冲液、4-8 M MgSO4、1-1.4 M dNTPs、0.4-2 xSYBR Green I、6-10 U Bst DNA聚合酶、1×10-3-5×10-3 U/μL RNase H2酶、0.6-1.6 μMSEQ ID NO: 17所示的引物、0.6-1.6 μM SEQ ID NO: 18所示的引物、0.1-0.3 μM SEQ IDNO: 19所示的引物、0.1-0.3 μM SEQ ID NO: 20所示的引物、1-1.5 M甜菜碱和无RNase水。
本发明还提供了上述方法、引物或试剂盒在检测待测样品是否为艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC序列中第117位单核苷酸缺失的基因或其片段，或者待测样品是否包含艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC序列中第117位缺失单核苷酸缺失的用途。
本发明的发明人根据艰难梭菌RT027型特异性基因tcdC设计并筛选了所述的优势组合引物，然后以待测样品的基因组DNA为模板，通过引物激活的方式进行恒温核酸扩增，并且在荧光染料作用下产生荧光信号来快速定性检测待测样品。将本发明提供的反应混合物，包括引物混合物以及待测样品的基因组DNA模板置于反应温度下，如SEQ ID NO: 17所示的引物与基因组DNA在目标碱基位置互补，使得核糖核酸内切酶RNase H2酶能够水解如SEQ ID NO: 17所示的引物中核糖核苷酸上游的磷酸二酯键，去除如SEQ ID NO: 17所示的引物的3’端修饰的核酸聚合酶延伸反应阻断基团，得到3’端可被核酸聚合酶延伸的激活的引物产物；然后所述激活的引物产物能够和所述反应混合物中的SEQ ID NO: 18-20所示的引物分别与所述基因组DNA在目标碱基前后杂交，并进一步在Bst DNA聚合酶作用下进行恒温链置换核酸扩增以得到目标碱基特异性序列扩增产物。
与现有技术相比，本发明提供的方法具有以下优势：
（1）本发明所述的基于引物激活式LAMP的检测方法结合了核糖核酸内切酶对目标碱基互补核糖核苷酸碱基的识别，激活引物序列介导恒温链置换核酸扩增反应，扩增效率高，1小时内可以完成扩增反应，灵敏度高，可以检测到100 aM的目标物。该方法特异性好，有接近10000倍的单碱基错配区分率；
（2）本发明所述的检测方法反应恒温进行，不依赖复杂、精密的温控仪器，同时结果易判读，可直接目测或仅需借助简单的荧光仪或浊度仪观测结果；
（3）本发明所述的检测方法的反应一步完成且为闭管反应，避免了交叉污染，同时反应所需时间短，无需荧光标记，可以直接检测基因组样品，无需放大步骤和其它处理，简化了实验步骤，节省了时间和人力成本。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为根据本发明实施例1所述的方法，采用经设计、筛选和比对后得出的5套引物检测1 pM RT027型毒力艰难梭菌基因组获得的实时荧光曲线，从左至右的S型曲线依次是使用第5套、第4套、第2套、第3套、第1套引物检测突变型靶标（Mutant Target）的出峰结果。其余5条非S型曲线分别为采用此五套引物的阴性对照获得的实时荧光曲线。
图2为根据本发明实施例2所述的方法，采用第1套引物扩增和检测不同浓度RT027型毒力艰难梭菌基因组获得的实时荧光曲线，从左至右的S型曲线对应的浓度依次是10pM、1 pM、100 fM、10 fM和1 fM，其余3条非S型曲线为采用阴性对照获得的实时荧光曲线，浓度分别为100 aM、10 aM和0 aM。
图3为根据本发明实施例2所述的方法，采用第2套引物扩增和检测不同浓度RT027型毒力艰难梭菌基因组获得的实时荧光曲线，从左至右的S型曲线对应的浓度依次是10pM、1 pM、100 fM、10 fM、1 fM和100 aM，其余2条非S型曲线为采用阴性对照获得的实时荧光曲线，浓度分别为10 aM和0 aM。
图4为根据本发明实施例2所述的方法，采用第3套引物扩增和检测不同浓度RT027型毒力艰难梭菌基因组获得的实时荧光曲线，从左至右的S型曲线对应的浓度依次是10pM、1 pM、100 fM、10 fM、1 fM和100 aM，其余2条非S型曲线为采用阴性对照获得的实时荧光曲线，浓度分别为10 aM和0 aM。
图5为根据本发明实施例2所述的方法，采用第4套引物扩增和检测不同浓度RT027型毒力艰难梭菌基因组获得的实时荧光曲线，从左至右的S型曲线对应的浓度依次是10pM、1 pM、100 fM、10 fM、1 fM和100 aM，其余2条非S型曲线为采用阴性对照获得的实时荧光曲线，浓度分别为10 aM和0 aM。
图6为根据本发明实施例2所述的方法，采用第5套引物扩增和检测不同浓度RT027型毒力艰难梭菌基因组获得的实时荧光曲线，从左至右的S型曲线对应的浓度依次是10pM、1 pM、100 fM、10 fM、1 fM、100 aM和10 aM，其余1条非S型曲线为采用阴性对照获得的实时荧光曲线，浓度为0 aM。
图7为根据本发明实施例3所述的方法，采用第1套引物在固定靶标总浓度为10 pM的情况下，将突变型靶标与野生型靶标（Wild Target）混合，从左至右的S型曲线是突变型靶标占有比例依次为100%、10%、1%、0.1%和0.01%的结果，其余1条非S型曲线对应的突变型靶标占有比例为0%。
图8为根据本发明实施例3所述的方法，采用第2套引物在固定靶标总浓度为10 pM的情况下，将突变型靶标与野生型靶标（Wild Target）混合，从左至右的S型曲线是突变型靶标占有比例依次为100%、10%、1%、0.1%、0.01%和0.01%的结果，其余1条非S型曲线对应的突变型靶标占有比例为0%。
图9为根据本发明实施例3所述的方法，采用第3套引物在固定靶标总浓度为10 pM的情况下，将突变型靶标与野生型靶标（Wild Target）混合，从左至右的S型曲线是突变型靶标占有比例依次为100%、10%、1%、0.1%、0.01%和0.01%的结果，其余1条非S型曲线对应的突变型靶标占有比例为0%。
图10为根据本发明实施例3所述的方法，采用第4套引物在固定靶标总浓度为10pM的情况下，将突变型靶标与野生型靶标（Wild Target）混合，从左至右的S型曲线是突变型靶标占有比例依次为100%、10%、1%、0.1%、0.01%和0.01%的结果，其余1条非S型曲线对应的突变型靶标占有比例为0%。
图11为根据本发明实施例3所述的方法，采用第5套引物在固定靶标总浓度为10pM的情况下，将突变型靶标与野生型靶标（Wild Target）混合，从左至右的S型曲线是突变型靶标占有比例依次为100%、10%、1%、0.1%、0.01%和0.01%的结果，其余1条非S型曲线对应的突变型靶标占有比例为0%。
具体实施方式
下面通过实施例及附图对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1 艰难梭菌RT027型tcdC基因的不同引物的反应效率的验证
1.1 设计引物
基因tcdC碱基突变位点第117位单核苷酸缺失的扩增与检测使用含有第117位单核苷酸缺失位点的突变型tcdC质粒DNA突变型靶标和第117位单核苷酸不缺失的野生型tcdC质粒DNA野生型靶标分别作为检测靶标，用于筛选优势引物。其中，突变型tcdC质粒DNA序列如SEQ ID NO: 21所示，并且其中第1-157位为非转录的调控序列，第274位单核苷酸缺失。
SEQ ID NO: 21 (5'-3')
tttcaaaatatattgaatattcttgatttattttgtaaaattatgcttaggggaaatatattttaggaaaatatgaatatataatttttagtcaactagttattttaagtttttaaattttaaaataaaatatatctaataaaagggagattgtattatgttttctaaaaaaaatgagggtaacgaatttagtaatgaaggaaaaggaagctctaagaaaataattaaattctttaagagcacaaagggtattgctctactggcatttattttggcgtgttttttggcaatatatcctcaccagcttgttctgaagaccatgaggaggtcatttctaatcaaacatcagttatagattctcaaaaaacagaaatagaaactttaaatagcaaattgtctgatgctgaaccatggttcaaaatgaaagacgacgaaaagaaagctattgaagctgaaaatcaacgtaaagctgaagaagctaaaaaagctgaagaagctaaaaaggctgaagaacaacgtaaaaaagaagaagaagagaagaaaggatatgatactggtattacttatgaccaattagctagaacacctgatgatta
野生型tcdC质粒DNA的序列如SEQ ID NO: 22所示，并且其中第1-157位为非转录的调控序列。
SEQ ID NO: 22 (5'-3')
tttcaaaatatattgaatattcttgatttattttgtaaaattatgcttaggggaaatatattttaggaaaatatgaatatataatttttagtcaactagttattttaagtttttaaattttaaaataaaatatatctaataaaagggagattgtattatgttttctaaaaaaaatgagggtaacgaatttagtaatgaaggaaaaggaagctctaagaaaataattaaattctttaagagcacaaagggtattgctctactggcatttatttt/a/t/c/g/ggcgtgttttttggcaatatatcctcaccagcttgttctgaagaccatgaggaggtcatttctaatcaaacatcagttatagattctcaaaaaacagaaatagaaactttaaatagcaaattgtctgatgctgaaccatggttcaaaatgaaagacgacgaaaagaaagctattgaagctgaaaatcaacgtaaagctgaagaagctaaaaaagctgaagaagctaaaaaggctgaagaacaacgtaaaaaagaagaagaagagaagaaaggatatgatactggtattacttatgaccaattagctagaacacctgatgatta
根据突变型tcdC质粒第117位单核苷酸缺失设计检测引物，并通过软件分析对比，总共设计并筛选出了5套引物，第1套引物序列如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 4所示，第2套引物序列如SEQ ID NO: 5到SEQ ID NO: 8所示，第3套引物序列如SEQ ID NO: 9到SEQ IDNO: 12所示，第4套引物序列如SEQ ID NO: 13到SEQ ID NO: 16所示，第5套引物序列如SEQID NO: 17到SEQ ID NO: 20所示。其中，每套引物都包括第一类引物DP1、第二类引物P2、第三类引物P3和P4，其中第一类引物DP1中的rG为核糖核苷酸，与tcdC序列中目标突变位点互补，在3’端修饰有C3Spacer，可阻断核酸聚合酶对第一引物DP1的延伸反应。
第1套：
DP1（SEQ ID NO: 1）GTCTTCAGAACAAGCTGGTGATGCTCTACTGGCATTTATTTT/rG/GC-C3Spacer
P2（SEQ ID NO: 2）GGAGGTCATTTCTAACCAAACATCACAGCATCAGACAATTTGCTAT
P3（SEQ ID NO: 3）CGTCGTCTTTCATTTTGAACC
P4（SEQ ID NO: 4）AATTCTTTAAGATCACAAAGGGT
第2套：
DP1（SEQ ID NO: 5）GTCTTCAGAACAAGCTGGTGATGCTCTACTGGCATTTATTTT/rG/GCGC-C3Spacer
P2（SEQ ID NO: 6）GGAGGTCATTTCTAACCAAACATCACAGCATCAGACAATTTGCTAT
P3（SEQ ID NO: 7）CGTCGTCTTTCATTTTGAACC
P4（SEQ ID NO: 8）AATTCTTTAAGATCACAAAGGGT
第3套：
DP1（SEQ ID NO: 9）TGTTTGATTAGAAATGACCTCCTCAGCTCTACTGGCATTTATTTT/rG/GC-C3Spacer
P2（SEQ ID NO: 10）ATAGCAAATTGTCTGATGCTGAACCTTCAATAGCTTTCTTTTCGTCG
P3（SEQ ID NO: 11）CTTCTTCAGCTTTACGTTGAT
P4（SEQ ID NO: 12）TAAGAGCACAAAGGGTA
第4套：
DP1（SEQ ID NO: 13）TGTTTGATTAGAAATGACCTCCTCAGCTCTACTGGCATTTATTTT/rG/GCG-C3Spacer
P2（SEQ ID NO: 14）ATAGCAAATTGTCTGATGCTGAACCTTCAATAGCTTTCTTTTCGTCG
P3（SEQ ID NO: 15）CTTCTTCAGCTTTACGTTGAT
P4（SEQ ID NO: 16）TAAGAGCACAAAGGGTA
第5套：
DP1（SEQ ID NO: 17）TGTTTGATTAGAAATGACCTCCTCAGCTCTACTGGCATTTATTTT/rG/GCGC-C3Spacer
P2（SEQ ID NO: 18）ATAGCAAATTGTCTGATGCTGAACCTTCAATAGCTTTCTTTTCGTCG
P3（SEQ ID NO: 19）CTTCTTCAGCTTTACGTTGAT
P4（SEQ ID NO: 20）TAAGAGCACAAAGGGTA
1.2 配置基于引物激活的碱基突变序列扩增和检测的混合液
以反应温度为63℃，时间为60min为反应条件进行突变型序列的扩增。反应过程中，第一引物DP1与DNA在目标单碱基处互补杂交，当DNA中目标碱基为突变型靶标时，核糖核酸酶RNaseH2酶识别并剪切第一引物DP1中与目标单碱基突变位点互补的核糖核苷酸rG上游的磷酸二酯键，迫使DP1带有阻断基团的C3Spacer的3’端从RNaseH2酶剪切处掉落，同时在3’端留下可被BstDNA聚合酶延伸的OH，得到激活的第一引物，并在核酸聚合酶作用下延伸，此延伸产物可被第三引物P4的延伸产物置换得到单链DNA，单链DNA的5’端进一步折叠形成一个发夹结构；同时，第二引物P2和第三引物P3可与该单链DNA在近3’端不同区域结合而被聚合酶延伸，且第二引物P2的延长产物可被第三引物P3的延长产物置换而变成单链，从而得到两端都具有发夹结构的扩增模板。在模板上，第一引物DP1被反复验证并激活，并与第二引物P2共同作用，使得模板不断被延伸并产生新的扩增模板，实现与目标碱基相关的高特异性和高灵敏的DNA扩增，有助于目标碱基的准确检测。
1.3 不同引物的反应效率验证
配置基于引物激活的碱基突变序列的扩增检测混合液，其反应体系由如下组成：反应体系的体积为25μL，其中包含1×Thermopol反应缓冲液（采购于NEB公司）、4M MgSO4、1M dNTP、1×SYBRGreenI（采购于北京索莱宝科技有限公司）、8U BstDNA聚合酶（采购于NEB公司）、3×10-3 U/μL RNase H2酶（RNase H2酶采购于IDT公司）、1M甜菜碱，以及无RNase水，0.8μM的第一引物DP1和第二引物P2，0.2μM的第三引物P3和第三引物P4，其中1×反应缓冲液包含20mM Tris-HCl，10mM (NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1% TritonX-100，pH为8.8；使用经设计、筛选以及比对后得出的5套不同引物配置的引物混合物，使用浓度为1 pM含有第117位单核苷酸缺失位点的突变型tcdC质粒DNA突变型靶标作为检测靶标，以无RNase水作为阴性对照，以反应温度为63℃，时间为90min为反应条件进行核酸扩增反应，用实时荧光定量PCR仪进行检测，每间隔30s读取一次荧光值，结果记录为实时荧光曲线图，具体结果即实时荧光曲线图请参见图1。实时荧光曲线图显示：对于突变型DNA突变型靶标，反应效率最高的为第5套引物。
实施例2 艰难梭菌RT027型tcdC基因的不同引物的灵敏度验证
采用分别基于第1-5套引物配制的引物激活的碱基突变序列扩增检测混合液在63℃、90min条件下进行突变型序列的扩增，实时荧光检测不同浓度的突变型tcdC质粒DNA突变型靶标的实时荧光曲线，各浓度依次是10pM、1pM、100fM、10fM、1fM、100aM、10aM和0aM。用实时荧光定量PCR仪进行检测，每间隔30s读取一次荧光值，具体结果实时荧光曲线图请参见图2-6。实时荧光曲线图显示：本实施例中对于突变型DNA突变型靶标的检测，对比第1-4套引物，第5套引物更优，采用第5套引物可被检测到的浓度可低至100aM，表明本发明方法具有高灵敏度和极低的检测下限，灵敏度最优引物为第5套引物。
实施例3 艰难梭菌RT027型tcdC基因的不同引物的特异性验证
在固定靶标总浓度为10 pM的情况下，将突变型靶标与野生型靶标混合，使得突变型靶标占有比例依次为100%、10%、1%、0.1%、0.01%和0%，并使用本发明试剂盒中基于第5套引物配制的引物激活的碱基突变序列扩增检测混合液在63℃、90min条件下进行突变型序列的扩增和实时荧光检测，所得的实时荧光曲线请参见图7-11。实时荧光曲线显示：采用第5套引物时，当突变型靶标比例低至0.01%时，本发明试剂盒依然能从比例高达99.99%的野生型靶标中区分0.01%的突变型靶标，所得的实时荧光曲线POI值低于100%野生型靶标的信号（突变型靶标比例为0%），对突变型靶标和野生型靶标的区分度约为10000倍，表明本发明试剂盒具有优越的单碱基识别特异性。对比第1-4套引物，第5套引物对于突变型靶标和野生型靶标的区分度最高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式说明本发明，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变获得的技术方案都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中南大学湘雅医院
<120> 用于检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC的方法、引物和试剂盒
<130> DIC19110059
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> g为核糖核苷酸
<220>
<221> modified_base
<222> (45)..(45)
<223> c被C3Spacer修饰
<400> 1
gtcttcagaa caagctggtg atgctctact ggcatttatt ttggc 45
<210> 2
<211> 46
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggaggtcatt tctaaccaaa catcacagca tcagacaatt tgctat 46
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cgtcgtcttt cattttgaac c 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aattctttaa gatcacaaag ggt 23
<210> 5
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> g为核糖核苷酸
<220>
<221> modified_base
<222> (47)..(47)
<223> c被C3Spacer修饰
<400> 5
gtcttcagaa caagctggtg atgctctact ggcatttatt ttggcgc 47
<210> 6
<211> 46
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggaggtcatt tctaaccaaa catcacagca tcagacaatt tgctat 46
<210> 7
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cgtcgtcttt cattttgaac c 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
aattctttaa gatcacaaag ggt 23
<210> 9
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)..(46)
<223> g为核糖核苷酸
<220>
<221> modified_base
<222> (48)..(48)
<223> c被C3Spacer修饰
<400> 9
tgtttgatta gaaatgacct cctcagctct actggcattt attttggc 48
<210> 10
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
atagcaaatt gtctgatgct gaaccttcaa tagctttctt ttcgtcg 47
<210> 11
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cttcttcagc tttacgttga t 21
<210> 12
<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
taagagcaca aagggta 17
<210> 13
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)..(46)
<223> g为核糖核苷酸
<220>
<221> modified_base
<222> (49)..(49)
<223> c被C3Spacer修饰
<400> 13
tgtttgatta gaaatgacct cctcagctct actggcattt attttggcg 49
<210> 14
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
atagcaaatt gtctgatgct gaaccttcaa tagctttctt ttcgtcg 47
<210> 15
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
cttcttcagc tttacgttga t 21
<210> 16
<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
taagagcaca aagggta 17
<210> 17
<211> 50
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)..(46)
<223> g为核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(50)
<223> c被C3Spacer修饰
<400> 17
tgtttgatta gaaatgacct cctcagctct actggcattt attttggcgc 50
<210> 18
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
atagcaaatt gtctgatgct gaaccttcaa tagctttctt ttcgtcg 47
<210> 19
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
cttcttcagc tttacgttga t 21
<210> 20
<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
taagagcaca aagggta 17
<210> 21
<211> 596
<212> DNA
<213> 突变型艰难梭菌()
<400> 21
tttcaaaata tattgaatat tcttgattta ttttgtaaaa ttatgcttag gggaaatata 60
ttttaggaaa atatgaatat ataattttta gtcaactagt tattttaagt ttttaaattt 120
taaaataaaa tatatctaat aaaagggaga ttgtattatg ttttctaaaa aaaatgaggg 180
taacgaattt agtaatgaag gaaaaggaag ctctaagaaa ataattaaat tctttaagag 240
cacaaagggt attgctctac tggcatttat tttggcgtgt tttttggcaa tatatcctca 300
ccagcttgtt ctgaagacca tgaggaggtc atttctaatc aaacatcagt tatagattct 360
caaaaaacag aaatagaaac tttaaatagc aaattgtctg atgctgaacc atggttcaaa 420
atgaaagacg acgaaaagaa agctattgaa gctgaaaatc aacgtaaagc tgaagaagct 480
aaaaaagctg aagaagctaa aaaggctgaa gaacaacgta aaaaagaaga agaagagaag 540
aaaggatatg atactggtat tacttatgac caattagcta gaacacctga tgatta 596
<210> 22
<211> 597
<212> DNA
<213> 野生型艰难梭菌()
<220>
<221> misc_feature
<222> (274)..(274)
<223> n为a或t或g或c
<400> 22
tttcaaaata tattgaatat tcttgattta ttttgtaaaa ttatgcttag gggaaatata 60
ttttaggaaa atatgaatat ataattttta gtcaactagt tattttaagt ttttaaattt 120
taaaataaaa tatatctaat aaaagggaga ttgtattatg ttttctaaaa aaaatgaggg 180
taacgaattt agtaatgaag gaaaaggaag ctctaagaaa ataattaaat tctttaagag 240
cacaaagggt attgctctac tggcatttat tttnggcgtg ttttttggca atatatcctc 300
accagcttgt tctgaagacc atgaggaggt catttctaat caaacatcag ttatagattc 360
tcaaaaaaca gaaatagaaa ctttaaatag caaattgtct gatgctgaac catggttcaa 420
aatgaaagac gacgaaaaga aagctattga agctgaaaat caacgtaaag ctgaagaagc 480
taaaaaagct gaagaagcta aaaaggctga agaacaacgt aaaaaagaag aagaagagaa 540
gaaaggatat gatactggta ttacttatga ccaattagct agaacacctg atgatta 597

Claims (10)

1.一种用于检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）使用引物激活式恒温核酸扩增方法扩增待测DNA样品，得到扩增产物；
其中，所述扩增引物为SEQ ID NO: 17-20表示的组合引物；
所述扩增的反应温度为63℃；反应时间为90min；
（2）分析步骤（1）得到的扩增产物中是否存在艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC序列中第117位单核苷酸缺失；
其中，所述方法为非诊断目的的检测方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（1）中，所述恒温核酸扩增的反应混合物还包括：反应缓冲液、MgSO4、DNA聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷、荧光染料、甜菜碱和RNase H2酶。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（1）中，所述恒温核酸扩增的反应混合物包括：0.8-1.2 x Thermopol反应缓冲液、4-8M MgSO4、1-1.4 M三磷酸脱氧核糖核苷、0.4-2x SYBR Green I、6-10 U Bst DNA聚合酶、1×10-3-5×10-3 U/μL RNase H2酶、0.6-1.6 μMSEQ ID NO: 17所示的引物、0.6-1.6 μM SEQ ID NO: 18所示的引物、0.1-0.3 μM SEQ IDNO: 19所示的引物、0.1-0.3 μM SEQ ID NO: 20所示的引物、1-1.5M甜菜碱和无RNase水。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（1）中，所述恒温核酸扩增的反应总体系为25 μL或者30 μL。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述待测DNA样品为2 μL。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（2）中，所述分析为实时荧光分析或实时浊度分析。
7. 用于以引物激活式恒温扩增方法检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC的引物，其特征在于，所述扩增引物为SEQ ID NO: 17-20表示的组合引物。
8. 一种用于以引物激活式恒温核酸扩增方法检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:
（1）用于提取待测DNA样品的试剂；和
（2）SEQ ID NO: 17-20表示的组合引物。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括以下反应混合物：反应缓冲液、MgSO4、DNA聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷、荧光染料、甜菜碱和RNase H2酶。
10. 根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括以下反应混合物：0.8-1.2 xThermopol反应缓冲液、4-8 M MgSO4、1-1.4 M三磷酸脱氧核糖核苷、0.4-2 x SYBR GreenI、6-10 U Bst DNA聚合酶、1×10-3-5×10-3 U/μL RNase H2酶、0.6-1.6 μM SEQ ID NO: 17所示的引物、0.6-1.6 μM SEQ ID NO: 18所示的引物、0.1-0.3 μM SEQ ID NO: 19所示的引物、0.1-0.3 μM SEQ ID NO: 20所示的引物、1-1.5 M甜菜碱和无RNase水。
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