KR20120005019A - 독소생성 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출 및 확인 방법 - Google Patents

독소생성 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출 및 확인 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은,
(i) 샘플을 제공하는 단계,
(ii) 멀티플렉스 PCR 검정에서,
(iii) 상기 샘플을 세포독소 tcdB 유전자의 존재 또는 부재에 대해 분석하고,
(iv) 상기 샘플을 상기 tcdC 유전자 내의
a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 330 내지 뉴클레오타이드 347의 18 bp 결실;
b) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 (301) 내지 뉴클레오타이드 (336)의 36 bp 결실;
c) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 (341) 내지 뉴클레오타이드 (370)의 39 bp 결실;
d) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 313 내지 뉴클레오타이드 (366)의 54 bp 결실 및
e) 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실
중 하나 이상의 결실의 존재 또는 부재에 대해 분석하는 단계를 수행하는, 샘플 내의 독소생성 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출 및 확인 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 각각의 키트 및 프라이머 및 프로브에 관한 것이다.

Description

독소생성 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출 및 확인 방법{Method for the detection and characterization of a toxinogenic Clostridium difficile strain}
본 발명은 생물학 및 화학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 핵산의 검출 및 실시간 PCR 분야에 관한 것이다. 가장 특히는, 본 발명은 독소생성 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출 및 확인에 관한 것이다.
클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficile)는 클로스트리디움 속의 그람 양성 세균 종이다. 클로스트리디아(Clostridia)는 혐기성의 포자 형성 간균(바실루스)이다. 씨. 디피실리는 항생제 관련 설사(AAD)의 가장 심각한 원인이고, 가막성 대장염(pseudomembranous colitis), 결장의 심각한 감염을 유도하여 종종 항생제에 의한 정상 장내균총을 제거한다. 체내에 자연적으로 존재하는 씨. 디피실리 세균은 과성장하게 된다: 과성장은 세균이, 복부 통증(심각해질 수 있음)을 갖는 더부룩함, 변비 및 설사를 유발할 수 있는 독소를 방출하기 때문에 유해하다. 잠복 증상은 종종 몇몇 독감 유사 증상처럼 보인다. 원인이 되는 항생제 치료의 중단으로 종종 치유된다.
씨. 디피실리 감염은 무증상으로부터 심각한 및 특히 고령자에서 생명을 위협하는 정도까지 중증도가 다양할 수 있다. 사람들은 대부분 종종 병원, 양로원 또는 보호시설에서 감염되지만, 지역 외래환자 진료시의 씨. 디피실리 감염이 증가하고 있다. 씨. 디피실리 취득 비율은 2주 이하의 병원 입원 환자에서 13% 및 4주 이상의 병원 입원 환자에서 50%인 것으로 평가된다. 씨. 디피실리 대장염의 빈도 및 중증도는 높은 상태이고, 사망률 증가와 관련되는 것 같다. 초기의 개입 및 집중 관리가 회복의 주요 인자이다.
2005년에, 북아메리카에서 지리학적으로 확산된 발병을 유발하는, 시프로(Cipro; 시프로플록사신) 및 레바퀸(Levaquin; 레보플록사신) 등의 플루오로퀴놀론 항생제에 내성이 있는 씨. 디피실리의 새로운 고독성 균주의 출현이 보고되었다[참조: Dials S, Delaney J, Barkun A, Suissa S(2005). "Use of gastric acid-suppressive agents and the risk of community-acquired Clostridium difficile-associated disease". JAMA 294 (23): 2989-95. doi: 10.1001/jama.294.23.2989].
2003년 6월 4일에, 당해 세균의 고병원성 균주의 2회 발병이 캐나다의 몬트리올, 퀘벡 및 캘거리에서 보고되었다. 자료는, 2003년 및 2004년의 초기 몇개월 내에 대략 1400 사례에서 36명과 같이 낮은 사망자수 및 89명과 같이 높은 사망자수를 나타냈다. 씨. 디피실리 감염은 2004년 후반기에 퀘벡 보건 관리 시스템에서 계속 문제가 되었다. 2005년 3월 이래로, 이는 토론토, 온타리오 지역까지 확산하여 10명의 사람을 입원시켰다.
유사한 발병이 2003년과 2005년 사이에 영국의 스토크 맨데빌 병원에서 발생했다.
캐나다 및 영국 발병 둘 다는 세균의 외견상 보다 병독성인 균주 NAP1/BI/027과 관련된 것으로 제안되었다. 퀘벡 균주로서도 알려진 당해 균주는 또한 2개의 네덜란드 병원(Harderwijk 및 Amersfoort, 둘 다 2005년)에서 유행병과 연루되었다. 027의 병독성 증가를 설명하는 이론은 이것이 독소 A 및 B 둘 다의 고생산인자(hyperproducer)이고 특정한 항생제가 실제로 세균이 고생산하도록 자극할 수 있다는 것이다.
당해 포자를 갖는 환자 풀이 분석됨에 따라서, 무증상인 다수는, 면역약화된, 따라서 설사의 증가율 및 불충분한 결과에 감수성인 개체에 유기체를 전달시킬 것이다. 상기 기재한 클러스터는 임상적 감시와 함께 정보 기술의 수렴을 통해 당해 질병이 어떻게 확산하는지를 이해하려고 시도하는 역학자에 대한 도전을 나타낸다.
2006년 10월 1일에, 씨. 디피실리는 국립 건강 서비스 조사에 따라 8개월에 걸쳐 영국 레이세스터의 병원에서 적어도 49명의 사람을 사망시킨 것으로 전해졌다.
2006년 10월 27일에, 9명의 사망자가 캐나다 퀘벡에서 당해 세균에 기인하였다.
2007년 2월 27일에, 새로운 발병이 온타리오 미시사우가의 트릴리움 건강 센터에서 확인되었고, 여기서 14명의 사람은 세균을 갖는 것으로 진단되었다. 당해 세균은 퀘벡에서의 균주와 동일한 균주였다. 공직자들은 씨. 디피실리가 이전 2개월에 걸쳐 4명의 환자의 사망에 관여했는지를 결정할 수 없었다.
2007년 10월에, 메이드스톤 및 턴브릿지 웰스 NHS 트러스트(Maidstone and Tunbridge Wells NHS Trust)는 2004년 4월부터 2006년 9월까지 켄트 병원에서 씨. 디피실리의 주요 발병의 관리에 관한 보건 위원회에 의해 심하게 비판되었다. 이의 보고서에서, 당해 위원회는 약 90명의 환자가 당해 감염의 결과로서 "명백하게 또는 아마도" 사망한 것으로 평가했다[참조: Healthcare Commission press release: Healthcare watchdog finds significant failings in infection control at Maidstone and Tunbridge Wells NHS Trust, 11 October 2007 and Daily Telegraph, Health Secretary intervenes in superbug row, 11 October 2007].
따라서, 샘플에서 독소생성 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출 및 확인하는 방법이 요구되고 있다.
본 발명자들은 샘플에서 독소생성 클로스트리디움 디피실리 균주를 검출 및 확인하는 선구적인 방법을 발견하였다. 당해 이점은 다중 진단 문제가 하나의 단일 방법으로 해소될 수 있다는 것이다. 당해 방법은 이제 고병원성 클로스트리디움 디피실리 균주를 포함하는 것으로 샘플을 지정할 수 있게 한다. 추가로, 이는 비 NAP1/BI/027 균주로서 샘플을 스코어링할 수 있게 한다. 또한, 당해 샘플은 NAP1/BI/027 균주로서 스코어링될 수 있다. 또한, 이는 리보타입 078 균주로 스코어링되거나, 017 균주로서 스코어링될 수 있다. 따라서, 단일 검정에서 모든 상기 지정을 수행할 수 있다.
본 발명자들은
(a) 샘플을 제공하는 단계, (b) 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 검정에서, (c) 샘플을 세포독소 tcdB 유전자의 존재 또는 부재에 대해 분석하고, (d) 샘플을 tcdC 유전자 내의 (a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 330 내지 뉴클레오타이드 347의 18 bp 결실; (b) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 301 내지 뉴클레오타이드 336의 36 bp 결실; (c) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실; (d) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 313 내지 뉴클레오타이드 366의 54 bp 결실 및 (e) 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실 중 하나 이상의 결실의 존재 또는 부재에 대해 분석하는 단계를 수행하는, 샘플 내의 독소생성 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출 및 확인 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, (i) 세포독소 tcdB 유전자, (ii) tcdA 유전자 내의 1.8 kb 결실, (iii) tcdC 유전자의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 330 내지 뉴클레오타이드 347의 18 bp 결실, (iv) tcdC 유전자의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실 및 (v) 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실을 증폭 및/또는 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브 및 이원 독소 cdtA/B 유전자(vi)를 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브를 포함하는, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.
"폴리머라제 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 DNA의 상보성 쇄의 동시 프라이머 연장에 의해 특정 DNA 서열을 시험관내 증폭시키는 반응을 의미한다. 달리 말하면, PCR은 하기 단계: (i) 표적 핵산의 변성, (ii) 프라이머 결합 부위에 대한 프라이머의 어닐링 및 (iii) 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에 핵산 폴리머라제에 의한 프라이머의 연장의 하나 이상의 반복을 포함하는, 프라이머 결합 부위에 의해 플랭킹된 표적 핵산의 다중 복사체 또는 복제물을 생성하는 반응이다. 통상적으로, 당해 반응은 열적 순환 장치에서 각 단계에 대해 최적화된 상이한 온도를 통해 순환된다. 특정 온도, 각 단계에서의 기간 및 단계 사이의 변화율은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 다수의 요인에 따라 달라진다[참조: McPherson et al, editors, PCR: A Practical Approach and PCR2: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991 및 1995, 각각)]. 예를 들면, Taq DNA 폴리머라제를 사용하는 통상의 PCR에서, 이본쇄 표적 핵산은 90℃ 초과의 온도에서 변성될 수 있고, 프라이머는 50 내지 75℃ 범위의 온도에서 어닐링될 수 있으며, 프라이머는 72 내지 78℃ 범위의 온도에서 연장될 수 있다.
용어 "PCR"은 반응의 유도 형태를 포함하며, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 실시간(real-time) PCR, 네스티드(nested) PCR, 정량적(quantitative) PCR, 멀티플렉스(multiplexed) PCR 등이 포함된다.
반응 용적은 수백 nl(예: 200nl) 내지 수백 ㎕ 범위이다. 본원에서, 바람직한 용적은 반응 챔버당 10 내지 50 ㎕, 보다 바람직하게는 약 25 ㎕이다.
"실시간 PCR"은 반응이 진행됨에 따라 반응 생성물(즉, 앰플리콘)의 양을 모니터링하는 PCR을 의미한다. 다양한 형태의 실시간 PCR이 있으며, 이는 주로 반응 생물의 모니터링에 사용된 검출 화학물질이 상이하다[참조: Gelfand et al, U.S. 특허 5,210,015 ("taqman"); Wittwer et al, U.S. 특허 6,174,670 및 6,569,627 (인터컬레이팅 염료(intercalating dyes)); Tyagi et al, U.S. 특허 5,925,517 (분자 비콘(molecular beacons))]. 실시간 PCR을 위한 검출 화학은 문헌[참조: Mackay et al, Nucleic Acids Research, 30: 1292-1305 (2002)]에 검토되어 있다. 실시간 PCR에서, 2개의 온도 단계 반응이 사용될 수 있고, 여기서 중합 온도는 스콜피온(Scorpion) 프라이머 또는 플레이아데스(Pleiades) 프로브 등의 통상의 하이브리드화 프로브의 경우에도 어닐링 온도와 동등하다.
"멀티플렉스 PCR"은 다중 표적 서열(또는 단일 표적 서열 및 하나 이상의 참조 서열)이 동시에 동일한 반응 혼합물에서 수행되는 PCR을 의미한다[참조: Bernard et al, Anal. Biochem., 273: 221-228 (1999)] (2색 실시간 PCR). 통상적으로, 독특한 세트의 프라이머가 각 서열의 증폭에 사용된다. 전형적으로, 멀티플렉스 PCR에서 표적 서열의 수는 2 내지 10개, 또는 2 내지 8개 또는 보다 전형적으로는 3 내지 6개이다. 바람직한 수는 본 발명의 경우에 2 내지 6개이다.
"정량적 PCR"은 샘플 또는 시료에서 하나 이상의 특이적 표적 서열의 풍부함을 측정하도록 설계된 PCR을 의미한다. 정량적 PCR은 이러한 표적 서열의 절대량 및 상대량 둘 다를 포함한다. 정량적 측정은 개별적으로 또는 표적 서열과 함께 검정될 수 있는 하나 이상의 참조 서열을 사용하여 수행된다. 참조 서열은 샘플 또는 시료에 대해 내인성 또는 외인성일 수 있고, 후자의 경우에는 하나 이상의 경쟁인자 주형을 포함할 수 있다. 전형적인 내인성 참조 서열은 하기 유전자의 전사체의 절편을 포함한다: 팩틴, GAPDH, 마이크로글로불린, 리보솜 RNA 등. 정량적 PCR에 대한 기술은, 문헌[참조: 'Freeman et al, Biotechniques, 26: 112-126 15 (1999); Becker-Andre et al, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9447 (1989); Zimmerman et al, Biotechniques, 21 : 268-279 (1996); Diviacco et al, Gene, 122: 3013-3020 (1992); BeckerAndre et al, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9446 (1989) 등]에 예시된 바와 같이, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다.
"프라이머"는, 폴리뉴클레오타이드 주형과 듀플렉스를 형성하는 경우, 핵산 합성의 개시점으로 작용할 수 있고 주형을 따라 3' 말단으로부터 연장하여 연장된 듀플렉스를 형성할 수 있는 천연 또는 합성의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 연장은 통상 DNA 또는 RNA 폴리머라제 등의 핵산 폴리머라제로 수행된다. 연장 과정에서 부가되는 폴리뉴클레오타이드의 서열은 주형 폴리뉴클레오타이드의 서열에 의해 결정된다. 통상적으로, 프라이머는 DNA 폴리머라제에 의해 연장된다. 프라이머는 통상 14 내지 40개 범위의 뉴클레오타이드 길이 또는 18 내지 36개 범위의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 프라이머는 다양한 핵산 증폭 반응, 예를 들면, 단일 프라이머를 사용하는 선형 증폭 반응 또는 2개 이상의 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응에 사용된다. 특정한 용도를 위해 프라이머의 길이 및 서열을 선택하는 지침은 문헌[참조: Dieffenbach, editor, PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Press, New York, 2003)]에서 입증된 바와 같이 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다.
"샘플"은 표적 핵산의 검출 또는 측정이 요구되는 생물학적, 환경적, 의학적 또는 환자 공급원으로부터의 소정량의 물질을 의미한다. 한편, 이는 시료 또는 배양물(예: 미생물 배양물)을 포함하는 것을 의미한다. 한편, 이는 생물학적 및 환경적 샘플을 포함함을 의미한다. 샘플은 합성 기원의 시료를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 동물(사람 포함), 유체, 고체(예: 대변) 또는 조직 뿐만 아니라, 액체 및 고형 식품 및 식이 제품 및 성분, 예를 들면, 낙농 제품, 식물, 육류 및 육류 부산물 및 폐기물일 수 있다. 생물학적 샘플은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 배양물, 혈액, 타액, 뇌척수액, 흉수, 정액, 주사기 흡입물을 포함하는, 환자로부터 채취한 물질을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 다양한 부류의 가축 모두 뿐만 아니라 야생 동물로부터 수득될 수 있고, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 유제동물, 곰, 어류, 설치류 등이 포함된다. 환경적 샘플은 환경적 물질, 예를 들면, 표층 물질, 오일, 물 및 산업적 샘플 뿐만 아니라 식품 및 낙농 가공 장치, 장비, 기구, 휴대용 및 비휴대용 품목으로부터 수득된 샘플을 포함한다. 이들 예는 본 발명에 적용할 수 있는 샘플 종류를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 용어 "샘플" 및 "시료"은 상호 교환적으로 사용된다.
바람직한 증폭 생성물은 다음 표에 제시되어 있다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
도 1은 본 발명에 따르는 바람직한 표적을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따르는 가능한 카트리지 설정을 나타낸다.
본 발명은, (a) 샘플을 제공하는 단계, (b) 멀티플렉스 PCR 검정에서, (c) 샘플을 세포독소 tcdB 유전자의 존재 또는 부재에 대해 분석하고, (d) 샘플을 tcdC 유전자 내의 (a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 330 내지 뉴클레오타이드 347의 18 bp 결실; (b) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 301 내지 뉴클레오타이드 336의 36 bp 결실; (c) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실; (d) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 313 내지 뉴클레오타이드 366의 54 bp 결실 및 (e) 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실 중 하나 이상의 결실의 존재 또는 부재에 대해 분석하는 단계를 수행하는, 샘플 내의 독소생성 클로스트리디움 디피실리 균주의 검출 및 확인 방법에 관한 것이다.
임의로, 샘플은 장독소 tcdA 유전자 1.8 kb 결실의 존재 또는 부재에 대해 추가로 분석된다.
바람직하게는, 샘플은 이원 독소 cdtA 및/또는 cdtB의 존재 또는 부재에 대해 추가로 분석된다.
본 발명에 따르는 방법의 한 가지 양태에서, 샘플은, (i) 하기 결실 모두의 존재 또는 부재: (a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 330 내지 뉴클레오타이드 347의 18 bp 결실, (b) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실, (c) 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실의 존재 또는 부재에 대해 분석되고, (ii) 샘플은 세포독소 tcdB 유전자의 존재 또는 부재에 대해 분석되고, (iii) 샘플은 1.8 kb tcdA 결실의 존재 또는 부재에 대해 분석되고, (iv) 샘플은 cdtA/B 이원 독소 유전자의 존재 또는 부재에 대해 분석된다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 방법에서, (a) tcdB 유전자 서열이 존재하고, tcdA 결실이 부재하고, 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실이 존재하지 않거나 18 bp 결실이 존재하지 않거나 39 bp 결실이 존재하지 않는 경우, 샘플이 독소생성 클로스트리디움 디피실리로서 스코어링되고, (b) tcdB 유전자 서열이 존재하고, tcdA 결실이 부재하고, 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실이 존재하고, 18 bp 결실이 존재하고, cdtA/B 이원 독소 유전자가 존재하는 경우, 샘플이 리보타입 027 클로스트리디움 디피실리 균주로서 스코어링되고, (c) tcdB 유전자 서열이 존재하고, tcdA 결실이 존재하고, 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실이 존재하지 않거나 18 bp 결실이 존재하지 않거나 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실이 존재하지 않고, cdtA/B 이원 독소 유전자가 부재하는 경우, 샘플이 리보타입 017 클로스트리디움 디피실리 균주로서 스코어링되고, (d) tcdB 유전자 서열이 존재하고, tcdA 결실이 부재하고, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실이 존재하고, cdtA/B 이원 독소 유전자가 존재하는 경우, 샘플이 리보타입 078 클로스트리디움 디피실리 균주로서 스코어링된다.
임의로 및 추가로, 하기 추가의 표적이 분석될 수 있다. 이들은 고병원성과 관련된 표적, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, tcdC△36bp, tcdC△54bp이다. 36-bp, 39-bp 또는 54-bp 결실을 포함하는 균주는 모두 tcdC 유전자의 상류에 추가 특이적 돌연변이를 갖고, 이는 바람직하게는 검정의 일부분인 절두된 및 비-기능성 TcdC 단백질을 생성한다.
tcdB 유전자의 3' 부분에서 특정 돌연변이는 바람직하게는 검정시에 존재하는 비-NAP1/BI/027 균주에 대해 보고되었다.
바람직하게는, 멀티플렉스 PCR 검정에서 증폭 생성물은 60 내지 200 bp 크기이다.
한가지 양태에서, 멀티플렉스 증폭 반응은 반응 혼합물(들) 중의 형광 지시약의 존재하에 밀폐식 시스템에서 수행되고, 이때 형광 지시약은 증폭 반응물 중의 각 앰플리콘의 존재 및/또는 양과 관련된 광학 시그날을 생성할 수 있고 증폭 반응물 중의 형광 지시약의 광학 시그날을 모니터링할 수 있다.
본 발명에 따르는 방법에서, 밀폐식 시스템은 사용자를 위한 광학 결과를 제공하여 상술한 스코어링 배정을 지시한다.
바람직하게는, 멀티플렉스 PCR 증폭은 정량적 실시간(quantitative real-time) PCR이다. 실시간 PCR(또한 정량적 PCR 또는 정량적 실시간 PCR(qPCR)로서 지칭됨)은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 핵산을 동시에 증폭 및 정량화하는 방법이다. 정량적 실시간 역전사 PCR(RT-qPCR)은 RNA의 DNA로의 역전사, 예를 들면, mRNA의 cDNA로의 역전사를 추가로 포함하는 정량적 실시간 PCR 방법이다. qPCR 방법에서, 증폭된 핵산은 축적됨에 따라 정량화된다. 통상적으로, 이본쇄 DNA에 삽입되는 형광 염료(예: 에티디움브로마이드 또는 SYBRR Green I) 또는, 상보성 핵산(예: 축적 DNA)과 하이브리드화되는 경우에 형광을 내는 변형된 핵산 프로브("리포터 프로브")가 qPCR 기반 방법에서 정량화에 사용된다. 특히, 형광 프라이머, 하이브리드화 프로브(예: LightCycler 프로브(Roche)), 가수분해 프로브(예: TaqMan 프로브(Roche)) 또는 헤어핀 프로브, 예를 들면, 분자 비콘, 스콜피온 프라이머(DxS), 썬라이즈 프라이머(Oncor), LUX 프라이머(Invitrongen), 앰플리플루오르(Amplifluor) 프라이머(Intergen) 등이 리보터 프로브로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따라서, 형광 프라이머 또는 프로브는, 예를 들면, 형광 염료가 부착되는, 예를 들면, 공유 결합되는 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 이러한 형광 염료는, 예를 들면, FAM (5- 또는 6-카복시플루오레세인), VIC, NED, 플루오레세인, FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, 오레곤 그린(Oregon Green), 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 텍사스 레드(Texas Red), 야키마 옐로우(Yakima Yellow), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), PET 바이오써치 블루(Biosearch BlueTM), 마리나 블루(Marina BlueR), 보텔 블루(Bothell BlueR), CAL 플루오르 골드(FluorR Gold), CAL 플루오르 레드(FluorR Red) 610, 쿠아사르(QuasarTM) 670, 라이트사이클러 레드(LightCycler Red)640R, 쿠아사르(QuasarTM) 705, 라이트사이클러 레드(LightCycler Red)705R 등일 수 있다. 특정 리포터 프로브는 추가로 형광 퀀쳐를 포함할 수 있다.
본 발명의 양태를 위해, 선택적 프라이머가 정량적 실시간 멀티플렉스 PCR에 사용될 수 있다.
본원에서 "프라이머"는 전사될 핵산("주형")에 상보성인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 복제 동안, 폴리머라제는 뉴클레오타이드를 주형의 각 뉴클레오타이드에 상보성인 프라이머의 3' 말단에 부착시킨다.
본 발명의 특정한 양태에서, 정량적 실시간 PCR에 사용된 폴리머라제는 호열성 유기체 또는 열안정성 폴리머라제로부터의 폴리머라제이거나, 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus)(Tth) DNA 폴리머라제, 테르무스 액퀴아티쿠스(Thermus acquaticus) (Taq) DNA 폴리머라제, 테르모토가 마리티마(Thermotoga maritima) (Tma) DNA 폴리머라제, 테르모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) (Tli) DNA 폴리머라제, 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) (Pfu) DNA 폴리머라제, 피로코쿠스 보에세이(Pyrococcus woesei) (Pwo) DNA 폴리머라제, 피로코쿠스 코다카라엔시스(Pyrococcus kodakaraensis) KOD DNA 폴리머라제, 테르무스 필리포르미스(Thermus filiformis) (Tfi) DNA 폴리머라제, 설포로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) Dpo4 DNA 폴리머라제, 테르무스 파시피쿠스(Thermus pacificus) (Tpac) DNA 폴리머라제, 테르무스 에게르트쏘니(Thermus eggertssonii) (Teg) DNA 폴리머라제, 테르무스 브록키아누스(Thermus brockianus) (Tbr) 및 테르무스 플라부스(Thermus flavus) (Tfl) DNA 폴리머라제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특히, 형광 표지된 프로브는 FAM, VIC, NED, 플루오레세인(Fluorescein), FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, 오레곤 그린(Oregon Green), 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 텍사스 레드(Texas Red), 야키마 옐로우(Yakima Yellow), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 및 PET로 이루어진 그룹으로부터 선택된 염료로 표지된다.
특히, 하이브리드화 프로브는 라이트사이클러 프로브(Roche)이거나, 가수분해 프로브는 TaqMan 프로브(Roche)이다. 다른 양태에서, 헤어핀 프로브는 분자 비콘, 스콜피온 프라이머, 선라이즈 프라이머, LUX 프라이머 및 앰플리플루오르(Amplifluor) 프라이머로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. TaqMan 프로브가 바람직하다.
본 발명은, (i) 세포독소 tcdB 유전자, (ii) tcdA 유전자 내의 1.8 kb 결실, (iii) tcdC 유전자의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 330 내지 뉴클레오타이드 347의 18 bp 결실, (iv) tcdC 유전자의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실 및 (v) 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실을 증폭 및/또는 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브 및 이원 독소 cdtA/B 유전자를 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브를 포함하는 하나 이상의 채널 또는 챔버를 포함하는 밀폐식 시스템 증폭 카트리지에 관한 것이다.
본 발명은 또한, (i) 세포독소 tcdB 유전자, (ii) tcdA 유전자 내의 1.8 kb 결실, (iii) tcdC 유전자의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 330 내지 뉴클레오타이드 347의 18 bp 결실, (iv) tcdC 유전자의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실 및 (v) 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실을 증폭 및/또는 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브 및 이원 독소 cdtA/B 유전자(vi)를 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브를 포함하는, 본 발명에 따르는 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 키트는 폴리머라제 등의 효소, 완충제 및 기타 성분을 추가로 포함한다.
한 가지 양태에서, 본 발명의 방법은 샘플 제조 및 실시간 멀티플렉스 PCR을 수행하도록 지정된 카트리지에서 수행할 수 있다. 이들은 선행 단계 반응 혼합물의 일부분이 후속 단계 반응을 위한 샘플로서 사용되는 밀폐식 다단계 핵산 증폭 반응을 위한 시스템, 방법 및 장치이다. 본 발명은 (i) 반응 혼합물 중의 형광 지시약의 존재하에 멀티플렉스 반응을 증폭시키는 단계(여기서, 형광 지시약은 증폭 반응물 중의 앰플리콘의 양과 관련된 광학 시그날을 생성할 수 있다) 및 (ii) 증폭 반응물 중의 형광 지시약의 광학 시그날을 모니터링하는 단계를 포함하는, 증폭을 조절하기 위한 상기 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 세포독소 tcdB 유전자, (ii) tcdC 유전자, (iii) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 330 내지 뉴클레오타이드 347의 18 bp 결실, (iv) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 301 내지 뉴클레오타이드 336의 36 bp 결실, (v) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실, (vi) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 313 내지 뉴클레오타이드 366의 54 bp 결실, (vii) 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실을 증폭 및/또는 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브를 포함하는 하나 이상의 채널 또는 챔버를 포함하는 밀폐식 시스템 증폭 카트리지에 관한 것이다. 이러한 밀폐식 시스템은, 예를 들면, 국제공개공보 제WO 2006/047777호에 기재되어 있다. 당해 카트리지는 샘플 제조, 예를 들면, 세포 용해 및/또는 핵산 추출을 위한 하나 이상의 챔버를 추가로 포함한다. 바람직하게는, PCR 챔버는 증폭 생성물의 온라인 검출을 가능하게 하는 광학적으로 투명한 표면(예: 유리, 결정 또는 플라스틱)을 포함한다.
DNA가 카트리지에서 분리되는 경우, 이는 마스터믹스에 재용해시키고, 카트리지 내부에 동결된 형태로 저장된다. 이어서, 마스터믹스 용액 중의 용출물의 균질화를 수행한다. 어떠한 공기도 챔버 내에 포획되지 않도록, 적어도 3 내지 5개의 PCR 챔버(또는 이러한 적용이 필요한 경우의 서브세트)의 충전을 카트리지에서 수행한다. 5개 미만의 챔버가 증폭에 요구될 수 있으며, 여기서 카트리지 변형태가 사용될 수 있다. 요구되는 용출 용적은 검정 프로토콜에 의해 적용될 수 있다. 어떠한 앰플리콘도 환경으로 이탈하지 않고 어떠한 공기도 챔버 내로 유입되지 않도록 증폭 동안 챔버의 밀폐를 수행한다. 챔버의 온도-순환을 수행한다. 사이클링은 개개의 온도 설정점에서 모든 챔버 사이에 동기화된다. 이어서, 6개 이하의 파장에서 형광 검출을 수행한다. 검출은 사이클 중의 임의의 순간에 수행할 수 있다. 측정 데이터 및 가능하게는 추가의 보정 데이터로부터 Ct 값, 초기 농도 및 최종 시험 결과의 계산을 수행한다. 시험 결과는 본 발명의 표적을 위한 Ct 값에 기반하여 생성된다.
카트리지는 장치 내에서 PCR을 수행한다. 시료 용기 또는 본원의 카트리지는 콘솔에 도달하고, 사용자는 명령과 관련된 식별자(예: 바코드, 종이 명령 형태 상의 식별자 등)를 입력한다. 콘솔은 관련 명령을 국지 콘솔 데이터베이스로부터 검색한다. 이어서, 사용자는 카트리지의 RFID 태그를 스캐닝한다. 카트리지를 이의 유효성에 대해 검사한다(예: 카트리지 타입은 시험 형태, 만료일 등에 상응한다). 카트리지가 유효한 경우, 이는 콘솔 데이터베이스에서 명령과 관련된다. 콘솔 주요 서비스는 장치의 이용가능한 슬롯을 요청한다. 장치 조절 서브시스템은 적재 평형 적용 후에 이용가능한 슬롯을 반송한다. 사용자에게 카트리지의 삽입을 통보한 후, 사용자는 카트리지를 제안된 슬롯에 삽입한다. 당해 장치 조절 서브시스템은 카트리지가 삽입되었고 콘솔 주요 서비스가 당해 카트리지가 명령과 관련되는지를 검사함을 알려준다. 카트리지가 명령과 관련되는 경우, 처리 데이터베이스에 접근하여 명령에서 시험 형태에 부합하는 처리를 검색한다. 처리를 검색한 후, 당해 장치 조절 서브시스템을 정렬하여 처리를 업로드하고 카트리지가 삽입된 슬롯에 대해 시험을 개시한다. 시험 완료 후, 시험 결과는 장치 조절 서브시스템에 의해 접수되고, 하기 단계를 수행할 수 있다:
시험 결과는 시험 결과 엔진에 통과될 것이다. 시험 결과 엔진은 콘솔 데이터베이스에 결과를 저장할 수 있다. 이어서, 당해 결과는 외부 IS 데이터 교환 서브시스템을 통해 외부 IS로 전송될 것이다. 사용자는 시험이 완료되는 정보를 얻는다. 사용자는 스코어에 관한 광학 및/또는 청각적 결과를 얻는다.
도 2에 도시된 바와 같이, 카트리지는 6개 모듈로 나뉜다. 당해 모듈은 하기 문단에서 상세히 설명된다. 카트리지 내의 모듈은 이의 기능에 대해 규정된다. 카트리지의 모든 기능은 가능한 많이 통합되고, 최소 부품 수로 실현된다. 전체 공정 흐름은 다음과 같다: 운전자는 용해 챔버를 수동으로 샘플로 충전시키고, 유입 리드를 밀폐한다. 카트리지를 슬롯 상에 적재된 트레이와 함께 슬롯 트레이 위에 놓는다. 슬롯에 적재되는 경우, 당해 공정은 샘플의 액화 및 용해를 개시한다. 이는, 예를 들면, 용해 챔버에서 HiFU 에너지를 이용하여 모두 수행한다. 이어서, 샘플에 상이한 시약을 첨가하여 최종 결과가 추출 막을 통해 분출될 수 있도록 한다. 이러한 모든 단계는 스툴(대변)과 같은 높은 비스코스 샘플을 취급하도록 하나의 챔버에서 수행된다. 또한, 하나의 인터페이스 및 HiFU 공급원만이 모든 공정에 요구된다. 시약의 챔버로의 수송은 유체 수송 모듈에 의해 수행된다. 당해 모듈 내에서, 시약은 보관수명 동안 저장되고, 저장소 외부로 배출되고, 용해 챔버로 수송된다. 또한, 모듈은 처리된 샘플을 추출 막을 통해 용해 챔버로부터 폐기물로 수송한다. 동일한 방식으로, 세척 용해 모듈, 유체 수송 모듈, 추출 모듈, 폐기물 처리 모듈, PCR 모듈, 매뉴얼 샘플 입력, 커버링 시약이 처리되고, 저장기로부터 배출되고, 막을 통해 폐기물로 수송된다. 유체 작동 및 처리를 수집함으로써, 이러한 지지 기능을 위한 카트리지 내의 인터페이스 수 및 부품 수가 최소화된다. 상기 언급된 추출 막은 추출 모듈 내에 매립된다. 이러한 모듈은 막을 통한 양호한 유동 및 막으로의 우수한 열 전달을 보장한다. 이러한 열은 DNA의 에탄올 제거 및 용출에 요구된다. 폐기물 처리 모듈은 용출물을 제외한 모든 유체를 폐기물로 유도하기 위해 사용되고, 이는 유체 처리 모듈에 사용된 것과 동일한 형태의 밸브로 수행한다. 이는 동일한 기능을 위해 카트리지 내에 사용된 상이한 기술을 최소화하기 위해 수행된다. 이러한 모듈의 두번째 기능은 추출 막을 통해 용출 완충제를 흡인하는 것이다. 작동은 용출물의 오염 위험을 최소화하기 위해 이러한 모듈에 의해 수행된다. 이러한 위험은 유체 수송 모듈이 또한 이러한 기능에 사용되는 경우에 보다 높을 수 있다. 용출물이 PCR 챔버로 수송되기 전에, 먼저 마스터믹스가 첨가되어야 하고, DNA 함량은 전체 용적에 대해 균질화되어야 한다. 이는 또한 당해 모듈 내에서 수행된다. 마지막으로, 유체를 PCR 챔버로 수송한다. 작동은 추출 막을 통해 용출물 수송을 위해 앞서 사용된 것과 동일한 작동기로 수행한다. 압력 유도 유체 수송이 또한 당해 수송 기능을 위해 선택된다. 이어서, 압력 유도 유체 수송을 위한 기능이 카트리지 내에 이미 존재한다. PCR 모듈 내에 위치된 PCR 챔버는 공기 부재하에 충전되어야 한다. 이를 보장하기 위해, 탈기 막을 공급 채널 내에 위치시켜, PCR 챔버로 가는 혼합 버블을 제거한다. PCR 챔버는 당해 챔버의 외형이 용적을 제한하도록 제조된다. 이는, 챔버를 하나의 공급 채널로부터 충전하는 경우에도, 당해 챔버가 동일한 용적으로 충전되도록 한다. 챔버는 챔버마다 특정한 프라이머 및/또는 프로브의 임의의 교차를 방지하기 위해 유체 구조물 내에 평행하게 위치된다. 또한, 충전후 탈기 필터가 존재한다.
표적 폴리뉴클레오타이드(클로스트리디움 디피실리)를 함유하는 샘플 또는 시료는 본 발명에 따라 사용하기 위한 다양한 공급원으로부터 기원할 수 있고, 세포 배양물, 동물 또는 사람 조직, 환자 생검, 환경 샘플 등을 포함한다. 샘플은 통상의 기술을 사용하여 본 발명의 검정을 위해 제조되고, 이는 통상 샘플 또는 시료가 채취되는 공급원에 따라 달라진다. 샘플 또는 시료는 외부 요소에 의한 샘플 또는 시료의 오염 기회, 또는 유해한 성분을 함유하는 경우에는 샘플 또는 시료에 의한 환경 오염을 최소화하도록 수집된다. 일반적으로, 이는 분석용 샘플(예: 조직, 혈액, 타액 등)을 유체 밀폐식 시스템 내의 샘플 수집 챔버 내로 직접 도입함으로써 수행된다. 전형적으로, 샘플의 교차 오염의 방지는 샘플을 임의의 밀봉가능한 개구, 예를 들면, 주사 밸브 또는 격벽을 통해 샘플 수집 챔버 내로 직접 주입함으로써 달성할 수 있다. 일반적으로, 밀봉가능한 밸브는 샘플 주사 동안 또는 주사 후에 잠재적인 누출 위험을 감소시키는 것이 바람직하다. 상기 이외에, 장치/카트리지의 샘플 수집 부분은 또한 감염성 제제를 중화시키고 시료 또는 샘플을 안정화시키기 위한 시약 및/또는 처리제, pH 조절제 등을 포함할 수 있다. 안정화 및 pH 조절 처리는, 예를 들면, 혈액 샘플의 응고를 방지하기 위한 헤파린의 도입, 완충제의 첨가, 프로테아제, 방부제 등의 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 시약은 일반적으로 장치/카트리지의 샘플 수집 챔버 내에 저장될 수 있거나, 별도로 접근가능한 챔버 내에 저장될 수 있고, 여기서 시약은 샘플을 장치 내로 도입할 때에 샘플에 첨가되거나 샘플과 혼합될 수 있다. 이들 시약은 사용된 특정 시약의 성질 및 안정성에 따라 액체 또는 동결건조 형태로 장치 내로 도입될 수 있다.
본원에서 바람직한 샘플은 사람 또는 동물 대변이다.
샘플에 대한 증폭 반응을 수행하기 전에, 샘플에 대해 하나 이상의 샘플 예비 작업을 수행하는 것이 종종 바람직할 수 있다. 전형적으로, 이들 샘플 예비 작업은 전체 샘플 등으로부터 세포내 물질(예: 핵산)의 추출과 같은 조작을 포함할 것이다. 하나 이상의 상이한 이들 작업은 본 발명에 의해 고려되는 유체 밀폐식 시스템 내로 용이하게 도입될 수 있다.
전체 세포 또는 기타 조직 샘플이 분석되는 이들 양태의 경우, 다양한 샘플 예비 작업을 계속하기 전에 세포, 대변, 혈액 또는 기타 체내 유체로부터 통상 핵산을 추출할 필요가 있다. 따라서, 샘플 수집 후, 핵산은 수집된 세포로부터 조 추출물내로 유리된 다음, 추가 처리하여 후속 작업, 예를 들면, 오염 (DNA 결합) 단백질의 변성, 정제, 여과, 탈염 등을 위해 샘플을 제조할 수 있다. 샘플 세포로부터 핵산의 유리 및 DNA 결합 단백질의 변성은 일반적으로 화학적, 물리적 또는 전해질 용해 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 화학적 방법은 일반적으로 세포를 파쇄하고 세포로부터 핵산을 추출하기 위해 용해제를 사용하고, 이어서 추출물을 구아니디니움 이소티오시아네이트 또는 우레아 등의 카오트로픽 염으로 처리하여 임의의 오염 및 잠재적 간섭 단백질을 변성시킬 수 있다. 일반적으로, 화학적 추출 및/또는 변성 방법이 사용되는 경우, 적절한 시약을 샘플 예비 챔버, 별도의 접근가능한 챔버 내로 도입하거나, 외부적으로 도입할 수 있다.
물리적 방법을 사용하여 핵산을 추출하고 DNA 결합 단백질을 변성시킬 수 있다. 미국 특허 제5,304,481호는 세포 막을 관통하고 이들의 내용물을 추출하기 위해 마이크로채널 내의 물리적 돌출물 또는 챔버 또는 채널 내의 예리한 엣지 입자의 사용을 개시한다. 진탕을 위한 압전 소자와 이러한 구조물의 배합은 용해에 적합한 전단력을 제공할 수 있다. 이러한 소자는 하기에 핵산 단편화와 관련하여 보다 상세히 기재되어 있다. 세포 추출을 위한 보다 전통적인 방법을 사용할 수 있고, 예를 들면, 세포 용해를 유발하는 제한된 절단면 치수를 갖는 채널을 사용할 수 있다. 또는, 세포 추출 및 오염 단백질의 변성은 샘플에 교류 전류를 인가하여 수행할 수 있다. 보다 구체적으로, 세포 샘플을 미세소관 어레이를 통해 유동시키고, 이때 교류 전류를 유체 유동을 통해 인가한다. 다양한 다른 방법을 본 발명의 장치에 사용하여 세포 용해/추출을 수행할 수 있고, 예를 들면, 세포를 초음파 진탕으로 처리하거나 세포를 작은 구멍을 통해 강제하여 세포를 고전단력으로 처리함으로써 파괴시킬 수 있다.
추출 후, 조 추출물의 다른 요소(예: 변형 단백질, 세포 막 입자, 염 등)으로부터 핵산을 분리하는 것이 종종 필요할 수 있다. 미립자 물질의 제거는 일반적으로 여과, 응집 등에 의해 달성된다. 다양한 필터 형태를 당해 장치 내로 용이하게 도입할 수 있다. 추가로, 화학적 변성 방법이 사용되는 경우, 후속 단계를 진행시키기 전에 샘플을 탈염시키는 것이 바람직할 수 있다. 샘플의 탈염 및 핵산의 분리는 일반적으로 단일 단계, 예를 들면, 핵산을 고체 상에 결합시키고 오염 염을 세척하거나 샘플에 대해 겔 여과 크로마토그래피를 수행하고, 염을 투석 막 등을 통해 통과시킴으로써 실시할 수 있다. 핵산 결합에 적합한 고체 지지체는, 예를 들면, 규조토, 실리카(즉, 유리 울) 등을 포함한다. 당해 기술분야에 공지된 적합한 겔 배제 매질을 또한 본 발명의 장치/카트리지에 도입할 수 있고, 예를 들면, 파마시아(Pharmacia) 및 시그마 케미칼(Sigma Chemical)로부터 상업적으로 시판되고 있다.
분리 및/또는 겔 여과/탈염은 추가의 챔버에서 수행할 수 있거나, 달리는 특정 크로마토그래피 매질을 채널 또는 유체 통로에 도입하여 후속 반응 챔버를 유도할 수 있다. 또는, 하나 이상의 유체 통로 또는 챔버의 내부 표면을 자체로 유도체화하여 목적하는 정제에 적합한 관능성 그룹, 예를 들면, 하전 그룹, 친화성 결합 그룹 등을 제공할 수 있다. 또는, 탈염 방법은 일반적으로 기타 요소와 비교하여 높은 전기 영동 및 DNA의 음하전의 이점을 취할 수 있다. 전기영동 방법은 또한 다른 세포 오염물 및 파편으로부터 핵산의 정제에 활용될 수 있다. 한 가지 예에서, 당해 장치의 분리 채널 또는 챔버는 내부에 배치된 전극(예: 백금 전극)을 갖는 2개의 개별 "필드" 채널 또는 챔버에 유체 연결될 수 있다. 2개 필드 채널은 적절한 차단막 또는 "포획 막"을 사용하여 분리 채널로부터 분리되고, 포획 막은 핵산 또는 기타 거대 분자를 통과시키지 않고서 전류를 통과시킨다. 차단막은 일반적으로 2가지 기본 기능을 수행하는데, 먼저 차단막은 분리 챔버 내의 포지티브 전극을 향해 이동하는 핵산을 보유하도록 작용하고, 둘째 차단막은 반응 챔버내로 유입되는 것으로부터 전극에서 전기분해와 관련된 역효과를 방지한다(예: 염 접합으로서 작용). 이러한 차단막은 투석 막, 밀집 겔, PEI 필터 및 기타 적합한 물질을 포함할 수 있다. 적절한 전기장의 적용시, 샘플에 존재하는 핵산은 포지티브 전극을 향해 이동할 것이고, 포획 막 상에 포획된다. 이어서, 막에 잔류하는 샘플 불순물은 적절한 유체 유동을 적용하여 챔버로부터 세척한다. 전압의 역전시, 핵산은 막으로부터 실질적으로 보다 순수한 형태로 방출된다. 필드 채널은 분리 챔버 또는 채널의 동일한 또는 반대의 측면 또는 말단에 배치될 수 있고, 본원에 기재된 혼합 부재와 결합 사용되어 최대 작동 효율을 보장한다. 추가로, 조 필터를 차단막 위에 적층하여 미립자 물질, 단백질 또는 핵산에 의한 차단막의 임의의 오염을 방지함으로써 반복 사용을 가능하게 한다. 유사한 양태에서, 음전하를 갖는 핵산의 고도의 전기영동 이동성을 사용하여, 겔 또는 기타 적절한 매트릭스, 또는 핵산을 보다 빠르게 통과시키면서 기타 오염물의 유동을 느리게 하거나 지연시키는 겔의 짧은 컬럼을 사용함으로써 오염물로부터 핵산을 분리할 수 있다.
바람직한 양태에서, 프로브 및/또는 프라이머는 다음과 같이 채널 또는 챔버에 분포된다: 프라이머 및 프로브의 특정한 혼합물은 각각의 개개 PCR 챔버 내에 건조 물질로서 안정하게 저장된다. PCR 챔버를 예비혼합된 주형/PCR 반응 혼합물로 충전시키면, 저장된 프라이머/프로브는 지정된 반응을 위해 최적화된 농도를 갖는 균질한 용액을 형성한다.
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Claims (12)

  1. 샘플 내의 독소생성 클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficile) 균주의 검출 및 확인 방법으로서,
    a. 샘플을 제공하는 단계,
    b. 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 검정에서,
    (i) 상기 샘플을 세포독소 tcdB 유전자의 존재 또는 부재에 대해 분석하고,
    (ii) 상기 샘플을 tcdC 유전자 내의
    a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 330 내지 뉴클레오타이드 347의 18 bp 결실;
    b) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 301 내지 뉴클레오타이드 336의 36 bp 결실;
    c) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실;
    d) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 313 내지 뉴클레오타이드 366의 54 bp 결실 및
    e) 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실
    중 하나 이상의 결실의 존재 또는 부재에 대해 분석하는 단계
    를 수행하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 샘플을 장독소 tcdA 유전자 1.8 kb 결실의 존재 또는 부재에 대해 추가로 분석하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 샘플을 이원 독소 cdtA 및/또는 cdtB의 존재 또는 부재에 대해 추가로 분석하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플을
    a. 하기 결실 모두의 존재 또는 부재:
    b. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 330 내지 뉴클레오타이드 347의 18 bp 결실, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실,
    c. 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실,
    d. 상기 세포독소 tcdB 유전자의 존재 또는 부재,
    e. 상기 1.8 kb tcdA 결실의 존재 또는 부재 및
    f. 상기 cdtA/B 이원 독소 유전자의 존재 또는 부재
    에 대해 분석하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    a. 상기 tcdB 유전자 서열이 존재하고, 상기 tcdA 결실이 부재하고, 상기 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실이 존재하지 않거나 상기 18 bp 결실이 존재하지 않거나 상기 39 bp 결실이 존재하지 않는 경우, 상기 샘플이 독소생성 클로스트리디움 디피실리로서 스코어링되고,
    b. 상기 tcdB 유전자 서열이 존재하고, 상기 tcdA 결실이 부재하고, 상기 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실이 존재하고, 상기 18 bp 결실이 존재하고, 상기 cdtA/B 이원 독소 유전자가 존재하는 경우, 상기 샘플이 리보타입 027 클로스트리디움 디피실리 균주로서 스코어링되고,
    c. 상기 tcdB 유전자 서열이 존재하고, 상기 tcdA 결실이 존재하고, 상기 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실이 존재하지 않거나 상기 18 bp 결실이 존재하지 않거나 상기 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실이 존재하지 않고, 상기 cdtA/B 이원 독소 유전자가 부재하는 경우, 상기 샘플이 리보타입 017 클로스트리디움 디피실리 균주로서 스코어링되고,
    d. 상기 tcdB 유전자 서열이 존재하고, 상기 tcdA 결실이 부재하고, 상기 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실이 존재하고, 상기 cdtA/B 이원 독소 유전자가 존재하는 경우, 상기 샘플이 리보타입 078 클로스트리디움 디피실리 균주로서 스코어링되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 멀티플렉스 증폭 반응을 반응 혼합물(들) 중의 형광 지시약의 존재하에 밀폐식 시스템에서 수행하고, 상기 형광 지시약은 상기 증폭 반응물 중의 각 앰플리콘의 존재 및/또는 양과 관련된 광학 시그날을 생성할 수 있으며 상기 증폭 반응물 중의 상기 형광 지시약의 광학 시그날을 모니터링할 수 있는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 밀폐식 시스템이 사용자를 위한 광학 결과를 제공하여 제5항의 스코어링 배정을 지시하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR 검정에서 증폭 산물이 60 내지 200 bp 크기인, 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭이 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 사람 또는 동물 대변인, 방법.
  11. (i) 세포독소 tcdB 유전자, (ii) tcdA 유전자 내의 1.8 kb 결실, (iii) tcdC 유전자의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 330 내지 뉴클레오타이드 347의 18 bp 결실, (iv) tcdC 유전자의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실 및 (v) 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실을 증폭 및/또는 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브 및
    이원 독소 cdtA/B 유전자를 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브
    를 포함하는 하나 이상의 채널 또는 챔버를 포함하는 밀폐식 시스템 증폭 카트리지.
  12. (i) 세포독소 tcdB 유전자, (ii) tcdA 유전자 내의 1.8 kb 결실, (iii) tcdC 유전자의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 330 내지 뉴클레오타이드 347의 18 bp 결실, (iv) tcdC 유전자의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 341 내지 뉴클레오타이드 370의 39 bp 결실 및 (v) 서열번호 1의 위치 117의 단일 뉴클레오타이드 결실을 증폭 및/또는 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브 및
    이원 독소 cdtA/B 유전자(vi)를 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브를 포함하는,
    제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따르는 방법을 수행하기 위한 키트.
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