DE69936919T2 - Fy7 polymerase - Google Patents
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Classifications
-
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Description
- Bezugnahme auf verwandte Anmeldungen
- Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der US-Provisional-Anmeldung der Serien-Nr. 60/089.556, eingereicht am 17. Juni 1998, deren gesamte Offenbarung hier enthalten ist.
- Hintergrund der Erfindung
- Gebiet der Erfindung
- Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auf thermostabile DNA-Polymerasen, die eine verbesserte Robustheit und Wirksamkeit zeigen.
- Hintergrund
- DNA-Polymerasen sind Enzyme, die nützlich sind in vielen rekombinanten DNA-Techniken, wie Nucleinsäure-Amplifizierung durch die Polymerase-Kettenreaktion („PCR"), Self-Sustained Sequence Replication (3SR''), und Hochtemperatur-DNA-Sequenzierung. Thermostabile Polymerasen sind besonders nützlich. Weil Wärme nicht die Polymeraseaktivität zerstört, gibt es keine Notwendigkeit, eine zusätzliche Polymerase nach jedem Denaturierungsschritt zuzugeben.
- Jedoch wurde gefunden, dass viele thermostabile Polymerasen eine 5'- bis 3'-Exonuclease- oder Struktur-abhängige Einzelstrang-Endonuclease („SDSSE")-Aktivität zeigen, die die Menge des erzeugten Produktes begrenzen oder zum Plateau-Phänomen in der normalen exponentiellen Akkumulation des Produktes beitragen. Eine derartige 5'- bis 3'-Nuclease-Aktivität kann beitragen zu einer beeinträchtigten Fähigkeit, lange PCR-Produkte effizient herzustellen, die größer oder gleich sind als 10 kb, insbesondere für G+C-reiche Ziele. Bei DNA-Sequenzierungs-Anwendungen und Cyclus-Sequenzierungs-Anwendungen kann das Verwenden von 5'- bis 3'-Nuclease-Aktivität zu einer Reduktion in erwünschten Bandintensitäten und/oder der Erzeugung von unechten oder Hintergrundbändern beitragen.
- Zusätzlich sind viele der gegenwärtig verfügbaren Enzyme empfindlich gegenüber Umgebungen mit hohem Salzgehalt und besitzen eine geringe Verarbeitungsfähigkeit, d. h., die Anzahl von Nucleotiden, die pro DNA-Polymerase-Bindungsereignis eingebaut werden. Außerdem führt Zugabe von dITP zur Reaktionsmischung, um Kompressionsproblemen Rechnung zu tragen, üblicherweise zu einer verringerten Aktivität des Enzyms.
- So existiert eine fortdauernde Notwendigkeit für eine verbesserte DNA-Polymerase mit vergrößerter Toleranz gegenüber Bedingungen hohen Salzgehalts, eine effiziente Nutzung von dITP, eine hohe Produktivität und eine verbesserte Leistungsfähigkeit auf GC-reichen Templates.
- Kurze Zusammenfassung der Erfindung
- Die vorliegende Offenbarung lehrt eine gereinigte rekombinante thermostabile DNA-Polymerase, umfassend die Aminosäuresequenz wie in
1 dargelegt, wie auch eine gereinigte rekombinante thermostabile DNA-Polymerase, die mindestens ungefähr 80% Aktivität bei Salzkonzentrationen von 50 mM und größer zeigt. Die vorliegende Offenbarung lehrt weiter eine gereinigte rekombinante thermostabile DNA-Polymerase, die mindestens ungefähr 70% Aktivität bei Salzkonzentrationen von 25 mM und größer zeigt, und eine gereinigte rekombinante thermostabile DNA-Polymerase mit einer Processivity von ungefähr 30 Nukleotiden pro Bindungsereignis. - Die vorliegende Offenbarung lehrt auch eine isolierte Nukleinsäure, die eine thermostabile DNA-Polymerase kodiert, wobei die Nukleinsäure aus der Nukleotidsequenz besteht, die in
1 dargelegt ist, wie auch einen rekombinanten DNA-Vektor, der die Nukleinsäure umfasst, und eine rekombinante Wirtszelle, die mit dem Vektor transformiert ist. - Die vorliegende Offenbarung lehrt auch ein Verfahren zum Sequenzieren von DNA, umfassend den Schritt des Erzeugens von ketten-terminierten Fragmenten aus dem DNA-Template, das mit DNA-Polymerase sequenziert werden soll, bei Vorhandensein mindestens eines ketten-terminierenden Mittels und einer oder mehrerer Nucleotidtriphosphate, und Bestimmen der Sequenz der DNA aus den Größen der Fragmente. Die vorliegende Offenbarung lehrt auch ein Kit zum Sequenzieren von DNA, umfassend die DNA-Polymerase.
- Kurze Beschreibung mehrerer Ansichten der Zeichnungen
-
1 stellt die Aminosäuresequenz (und DNA-Sequenz, die dafür kodiert) für die FY7-Polymerase dar. -
2 stellt die DNA-Sequenz der M13mp18 DNA dar, die unter Verwenden der FY7-Polymerase sequenziert ist, die unter Mg-Bedingungen formuliert wurde, wie gezeigt durch einen Ausdruck aus einem automatisierten ABI-Model-377-Fluoreszenz-DNA-Sequenziergerät. -
3 stellt die DNA-Sequenz der N13mp18 DNA dar, die sequenziert ist unter Verwenden der FY7-Polymerase, die in Mg-Bedingungen formuliert ist, wie gezeigt durch einen Ausdruck aus einem automatisierten ABI-Model-377-Fluoreszenz-DNA-Sequenziergerät. -
4 stellt den Prozentsatz der maximalen Polymeraseaktivität für die Thermo-SequenaseTM-Enzym-DNA-Polymerase versus FY7-DNA-Polymerase unter variierenden KCl-Konzentrationen dar. -
5 stellt den Effekt hoher Salzkonzentrationen auf die DNA-Sequenzierfähigkeit in Sequenzierreaktionen von radioaktiv markierter DNA unter Verwenden der Thermo-SequenaseTM-Enzym-DNA-Polymerase versus FY7-DNA-Polymerase dar. -
6 -10 stellen den Effekt ansteigender Salzkonzentration auf die Leistungsfähigkeit der Thermo-Sequenase dar. Bei Konzentrationen so niedrig wie 25 mM wird die Datenqualität beeinflusst, wobei die Leselänge von mindestens 600 Basen auf ungefähr auf 450 Basen verringert wird. Bei 50 mM Salz wird die Leselänge weiter verringert auf ungefähr 350 Basen. 75 mM bis ungefähr 250 Basen und bei 100 mM ist die Leselänge vernachlässigbar. -
11 -15 stellen den Effekt ansteigender Salzkonzentration auf die Leistungsfähigkeit der FY7-DNA-Polymerase dar. Es gibt keinen schädlichen Effekt auf die Leistungsfähigkeit bis mindestens 75 mM KCl und nur eine leichte Abnahme in der Datenqualität bei 100 mM KCl. -
16 stellt die Processivity dar, die für eine Thermo-Sequenase-DNA-Polymerase gemessen ist. AmpliTaq-FS-DNA-Polymerase, verglichen mit der Processivity gemessen für FY7-DNA-Polymerase. -
17 stellt die verbesserte Leselänge dar, die erhalten wird, wenn die FY7-Polymerase verwendet wird, versus die Thermo-Sequenase-DNA-Polymerase in radioaktiv markierten Sequenzierreaktionen, die das dGTP (Guanosintriphosphat)-Analogon dITP (Inosintriphosphat) bei 72°C einbauen. -
18 -22 zeigen den Effekt einer steigenden Extensionsschrittzeit auf die Leselänge und Datenqualität, die von Thermo-Sequenase-DNA-Polymerase erzeugt wird, in fluoreszierend markierten Terminator-DNA-Sequenzierreaktionen. -
23 -27 zeigen den Effekt einer ansteigenden Extensionsschrittzeit auf die Leselänge und Datenqualität, die von FY7-DNA-Polymerase erzeugt wird in fluoreszierend markierten Terminator-DNA-Sequenzierreaktionen. - Detaillierte Beschreibung der Erfindung
- Eine Reihe von Polymerasemutanten wurden konstruiert mit dem Ziel des Erhaltens einer verbesserten Polymerase für das DNA-Sequenzieren durch Verringern der Exonucleaseaktivität, die in den DNA-Polymerase-I-Enzymen Thermus thermophilus und Thermus aquaticus voller Länge gefunden wird. Sechs konservierte Motive (Gutman and Minton (1993) Nucleic Acids Research 21, 4406-4407) können identifiziert werden in der amino-terminalen Domäne von Pol-I-Typ-Polymerasen, für die gezeigt wurde, dass in ihnen die 5'- bis 3'-Exonuclaseaktivität sitzt. Weiter wurde gezeigt, dass sechs Carboxylat-Reste in diesen konservierten Bereichen in einer Kristallstruktur an der aktiven Stelle der Exonucleasedomäne von Thermus aquaticus DNA polI (Kim et al., (1995) Nature 376. 612-616) lokalisiert sind. Punktmutationen wurden erzeugt durch Stellen-gerichtete Mutagenese zu Carboxylaten und anderen Resten in drei von sechs konservierten Motiven in Tth- und Taq-Polymerasen, wie folgt:
TaqD18A. TaqT140V. TaqD142N/D144N, alle von diesen besitzen die Mutation F677Y außerhalb der Exonucleasedomäne. - TthD18A. Tth141V. TthD143N/D145N, alle von diesen besitzen die Mutatuion F669Y außerhalb der Exonucleasedomäne. Alle Polymerasen wurden bewertet auf Exonucleaseakticität, Processivity, Strang-Verdrängung, Salztoleranz, Thermostabilität und Sequenzierqualität. Eine FY7-Polymerase. TthD18A. F669Y wird detaillierter unten beschrieben.
- Beispiele
- Verfahren
- In-vitro-Mutagenese
- PCR wurde eingesetzt, um eine Asparaginsäure in eine Alanin-Aminosäureänderung beim Codon 18(D18A) eines klonierten F669Y-Tth(plasmid-pMR10) voller Länge einzuführen. Mutagener Primer I (CTGTTCGAACCCAAAGGCCGTGTCCTCCTGGTGGCCGGCCACCAC) umfasst Nukleotide 19-60 des pMR10 einschließlich Codon 18 und eine BstBI-Restrictionsstelle. Der Oligonukleotid-Primer 2 (GAGGCTGCCGAATTCCAGCCTCTC) umfasst eine EcoRI-Stelle von pMR10. pMR10 wurde verwendet als Template-DNA. Das PCR-Produkt wurde verdaut mit BstBI und EcoRI und ligiert zu zwei Fragmenten von pMR10: ein 5000 bp KpnI/BstBI und ein 2057 bp EcoRI/KpnI. – erzeugendes Plasmid pMr12. Zellen des E. coil-Stammes DH1λ+ wurden verwendet für die primäre Transformation und ein Stamm M5248 (λ cI857) wurde verwendet für die Proteinexpression, obwohl ein beliebiges vergleichbares Paar von E. coli-Stämmen, die die cI+- und cI857-Allele tragen, genutzt werden könnte. Alternativ könnte ein beliebiger rec+cI+-Stamm eingeführt werden durch chemische Mittel, wie Nalidixinsäure, um die Polymerase zu erzeugen.
- Reinigung der Polymerase
- M5248, enthaltend das Plasmid pMR12, wurde gezogen in einem Liter LB-Medium (1% Trypton. 0,5% Hefeextrakt. 1% NaCl), bevorzugt 2 × LB-Medium, enthaltend 100 mg/ml Ampicilin bei 30°C. Wenn die OD600 1,0 erreichte, wurde die Kultur bei 42°C für 1,5 Stunden induziert. Die Kulturen wurden dann gekühlt auf < 20°C und die Zellen durch Zentrifugation in einer Sorvall-RC-3B-Zentrifuge bei 5000 Upm bei 4°C für 15 bis 30 Minuten geerntet. Geerntete Zellen wurden gelagert bei –80°C.
- Das Zell-Pellet wurde resuspendiert in 25 ml vorgewärmtem Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MeCl2, 16 mM (NH4)2SO4, 1 mM EDTA. 0,1%, bevorzugt 0,2% Tween 20, 0,1%, bevorzugt 0,2% NP40). Bevorzugt enthält der Lysepuffer 300 mM NaCl. Resuspendierte Zellen wurden inkubiert bei 75-85°C für 10-20 Minuten, beschallt für eine Minute und gereinigt durch Zentrifugation. Das gereinigte Lysat ließ man durchlaufen durch eine 300 ml-Säule aus Diethylaminoethylzellulose (Whatman DE 52), ins Gleichgewicht gebracht in Puffer A (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 0,1% Tween 20. 0,1% NP40), enthaltend 100 mM, bevorzugt 300 mM NaCl. Fraktionen wurden einem Assay unterzogen auf eine Polymeraseaktivität, und jene, die eine Spitzenpolymeraseaktivität zeigen, wurden gesammelt, verdünnt auf 50 mM NaCl mit Puffer A, und geladen auf eine Heparin-Sepharose-Säule (20 ml), ins Gleichgewicht gebracht mit 50 mM NaCl im Puffer A. Die Polymerase wurde eluiert aus der Säule mit einem linearen Salzgradienten von 50 mM bis 700 mM NaCl im Puffer A. Fraktionen wurden einem Assay unterzogen auf Polymeraseaktivität, und jene, die eine Spitzenaktivität zeigten, wurden gesammelt und dialysiert gegen Endpuffer (20 mM Tris-HCl pH 8.5, 50% (v/v) Glycerin. 0,1 mM EDTA, 0,5% Tween 20, 0,5% NP40, 1 mM DTTm 100 mM KCl). Das gereinigte Protein wird bezeichnet FY7. Die Aminosäuresequenz (und die DNA-Sequenz, die dafür kodiert) sind in
1 präsentiert. - Bakterielle Stämme
-
- E. coli-Stämme: DHIλ+ [gyrA96. recAI. relAI. endAI. thi-I, hsdR17. supE44. λ+]; M5248 [λ (bio275. cI857. cIII+. N+.λ (H1))].
- PCR
- Plasmid-DNA von E. coli DHIλ (pMR10) wurde hergestellt durch ein alkalisches SDS-Lyseverfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning 2. Ausgabe, Cold Spring Habor Press, 1989). Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl. 1,5 mM MgCl2, 0,001% Gelatine, 1 μM von jedem Primer, 2,5 U Taq-Polymerase, pro 100 μl Reaktion. Cyclisierungsbedingungen waren 94°C 2 Minuten, dann 35 Cyclen von 94°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 3 Minuten, gefolgt von 72°C für 7 Minuten.
- Beispiel 1 Formulierung des Enzyms in Mn-Bedingungen
- In dem folgendem „Vormisch-"Protokoll sind alle Reagenzien in zwei Lösungen enthalten; die Reagenzmischung A und die Reagenzmischung B.
- Reagenzmischung A
- Die folgenden Reagenzien wurden kombiniert, um 10 ml der Reagenzmischung A zu erzeugen:
2,5 ml 1 M HEPPS N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N'-(3-propansulfonsäure), pH 8,0
500 μl 1 M Tartarsäure, pH 8,0
50,000 Einheiten FY7-DNA-Polymerase
1 Einheit anorganische Thermoplasma-acidophilum-Pyrophosphatase
100 μl 100 mM dATP
100 μl 100 mM dTTP
100 μl 100 mM dCTP
500 μl 100 mM dITP
9,375 μl 100 μM C-7-Propargylamino-4-rhodamin-6-G-ddATP
90 μl 100 μM C-5-Propargylamino-4-rhodamin-X-ddCTP
6,75 μl 100 μM C-7-Propargylamino-4-rhodamin-110-ddGTP
165 μl 100 μM C-5-Propargylamino-4-tetramethylrhodamin-ddUTP
10 μl 50 mM EDTA
1 ml Glycerin - Das Volumen wurde auf 10000 μl ergänzt mit entionisiertem H2O
- Reagenzmischung B
- Die folgenden Reagenzien wurden kombiniert, um 10 ml der Reagenzmischung B zu erzeugen:
10 μl 1 M MES 2-(N-Morpholino)emansulfonsäure, pH 6,0
200 μl 1 M MgCl2
75 μl 1 M MnSO4 - Das Volumen wurde auf 10000 μl mit entionisiertem H2O ergänzt.
- Beispiel 2: Verwendung der Formulierung aus Beispiel 1
- Zwei (2) μl Reagenzmischung A, 2 μl Reagenzmischung B, 200 ng M13mp18 DNA, 5 pmol Primer (M13-40 Vorwärts-5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA), und entionisiertes Wasser auf ein Gesamtvolumen von 20 μl wurden zusammen gemischt und 20 Cyclen von (95°C 30 Sekunden. 60°C 1 Minute) in einem thermischen Cyclisierer unterzogen. Nach dem Cyclisieren wurden 4 μl einer Lösung zugegeben, die 1,5 M Natriumacetat, 250 mM EDTA enthielt. Die Lösung wurde gemischt und 4 Volumina (100 μl) Ethanol zugegeben. Die DNA wurde ausgefällt durch Inkubation auf Eis für 15-20 Minuten nach der Zentrifugation. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde gewaschen mit 70%igem Ethanol, getrocknet und resuspendiert in 4 μl Formamid, das Beladungsfarbstoff enthielt. Die resuspendierte DNA ließ man dann auf einem automatisierten Fluoreszenz-DNA-Sequenziergerät (ABI Model 377-Instrument) laufen. Der Ausdruck der DNA-Sequenz aus der Maschine ist als
2 gezeigt. - Beispiel 3 Formulierung des Enzyms in Mg-Bedingungen
- In dem folgendem „Vormisch-"Protokoll sind alle Reagenzien in einer Lösung enthalten.
- Sequenziervormischung
- Die folgenden Reagenzien wurden kombiniert, um 800 μl Sequenzier-Vormischung zu erzeugen.
200 μl of 500 mM Tris-HCl pH 9,5. 20 mM MgCl2
100 μl 40 Einheiten/μl FY7 DNA-Polymerase. 0,0008 Einheiten/μl anorganische Phosphatase Thermoplasma Acidophilum
100 μl 10 mM dITP. 2 mM dATP, 2 mM dTTP, 2 mM dCTP
100 μl 0,125 μM C-7-Propargylamino-4-rhodamin-6-G-ddATP
100 μl 1,2 μM C-5-Propargylamino-4-rhodamin-X-ddCTP
100 μl 0,09 μM C-7-Propargylamino-4-rhodamin-110-ddGTP
100 μl 2,2 μMC-5-Propargylamino-4-tetramethylrhodamin-ddUTP - Beispiel 4 Verwendung der Formulierung aus Beispiel 3
- Vier (4) μl Sequenzier-Vormischung. 200 ng M13mp18 DNA, 5 pmol Primer (M13-40 Vorwärts-5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA), und entionisiertes Wasser auf ein Gesamtvolumen von 20 μl wurden zusammengemischt und 25 Cyclen (95°C 30 Sekunden. 60°C 2 Minuten) in einem thermischen Cyclisierer unterzogen. Nach dem Cyclisieren wurden 7 μl 7,5 M Ammoniumacetat zugegeben. Die Lösung wurde gemischt und 4 Volumina (100 μl) Ethanol wurde zugegeben. Die DNA wurde ausgefällt durch Inkubation auf Eis für 15-20 Minuten, gefolgt von Zentrifugation. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde gewaschen mit 70% Ethanol, getrocknet und resuspendiert in 4 μl Formamid, das Beladungsfarbstoff enthielt. Die resuspendierte DNA ließ man dann auf einem automatisierten Fluoreszenz-DNA-Sequenziergerät (ABI-Modell-377-Instrument) laufen. Der Ausdruck der DNA-Sequenz aus der Maschine ist als
3 gezeigt. - Beispiel 5 Polymeraseaktivität gegen Salzkonzentration (KCl) für Thermo-SequenaseTM-Enzyme und FY7-Enzym
- Der Prozentsatz der maximalen Polymeraseaktivität wurde gemessen für Thermo-SequenaseTM-Enzym-DNA-Polymerase und FY7-DNA-Polymerase unter variierendem KCl-Konzentrationen. Die Ergebnisse sind dargestellt in
4 . Die Daten zeigen an, dass FY7 ein viel höheres Salzoptimum wie auch einen breiteren Bereich der Toleranz für Salz in der Reaktionsmischung besitzt als die Thermo-SequnaseTM. Die Salzkonzentration, die 50% Aktivität ergibt, ist fünffach höher für FY7 als für Thermo Sequenase. - Der Effekt der hohen Salzkonzentrationen auf die DNA-Sequenzierfähigkeit in radioaktiv markiertem DNA-Sequenzierreaktionen wurde auch untersucht. Die Ergebnisse sind in
5 präsentiert. Bei KCl-Konzentrationen von 50 mM oder höher wird die Thermo-SequenaseTM-Polymerase-Leistungsfähigkeit verschlechtert auf Niveaus, bei denen nutzbare Daten nicht extrahiert werden können. FY7-DNA-Polymerase ist jedoch fähig, ziemlich gute Sequenzierdaten bei Konzentration von KCl von 100 mM zu ergeben. - Beispiel 6 Fluoreszenz-Sequenzierungs-Salztoleranz
- Diese Experimente untersuchten den Effekt der oben demonstrierten Polymeraseaktivität in hohen Salzkonzentrationen auf die DNA-Sequenzierfähigkeit in fluoreszierend markierten Terminator-DNA-Segzenzierreaktionen. Die Ergebnisse sind in
6 -15 präsentiert. -
6 -10 zeigen den Effekt von steigender Salzkonzentration auf die Leistungsfähigkeit der Thermo-Sequenase. Bei Konzentrationen so gering wie 25 mM wird die Datenqualität beeinflusst, wobei die Leselänge verringert wird von mindestens 600 Basen auf 450 Basen. Bei 50 mM Salz wird die Leselänge weiter verringert auf ungefähr 350 Basen. 75 mM auf ungefähr 250 Basen und bei 100 mM ist die Leselänge vernachlässigbar. -
11 -15 zeigen den Effekt steigender Salzkonzentration auf die Leistungsfähigkeit der FY7 DNA-Polymerase. Es gibt keinen schädlichen Effekt auf die Leistungsfähigkeit bis mindestens 75 mM KCl und nur eine leichte Abnahme in der Datenqualität bei 100 mM KCl. - Da anerkannt wird, dass einige Typen von DNA-Präparaten mit Salz kontaminiert sein können (was für die DNA-Sequenzier-Datenqualität schädlich ist), ermöglicht die Verwendung von FY7-DNA-Polymerase eine robustere Sequenzierreaktion über einen breiteren Bereich von Template-Bedingungen.
- Beispiel 7 Polymerase-Processivity
- Die Processivity (Anzahl von Nucleotiden, eingebaut pro DNA-Polymerase-Bindungsereignis) wurde gemessen für verschiedene DNA-Sequenzierpolymerasen. Die Ergebnisse sind in
16 präsentiert. Thermo-Sequenase-DNA-Polymerase besitzt eine Processivity von nur ~4 Nucleotiden pro Bindungsereignis. AmpliTaq-FS-DNA-Polymerase besitzt eine Processivity von ~15 Nucleotiden pro Bindungsereignis. FY7-DNA-Polymerase besitzt eine Processivity von mehr als siebenmal größer als die Thermo-Sequenase-DNA-Polymerase und zweimal größer als AmpliTaq-FS-DNA-Polymerase bei –30 Nukleotiden pro Bindungsereignis. - Beispiel 8 Polymerase-Extension mit dITP bei 72°C
- Die untersuchten Serien verbesserten die Leselänge, die erhalten wurde, wenn FY7-Polymerase verwendet wurde, gegenüber Thermo-Sequenase-DNA-Polymerase in radioaktiv markierten Sequenzierreaktionen, die das dGTP (Guanosintriphosphat)-Analogon dITP (Inosintriphosphat) bei 72°C einbauen. Die Ergebnisse sind in
17 präsentiert. FY7 ist fähig, > 50-100 mehr Nukleotide unter Standard-33P[α-dATP]-Sequenzierbedingungen einzubauen als Thermo-Sequenase. - Beispiel 9 Effekt der Extensionsschrittzeit auf die Leselänge
- Diese Serien von Experimenten untersuchten den Effekt einer steigenden Extensionsschrittzeit der Leselänge und Datenqualität von Thermo-Sequenase und FY7-DNA-Polymerasen in fluoreszierend markierten Terminator-DNA-Sequenzierbedingungen. Die Ergebnisse sind in
18 -27 präsentiert. -
18 -22 zeigen den Effekt steigender Extensionsschrittzeit auf die Leselänge und Datenqualität, die von Thermo-Sequenase-DNA-Polymerase produziert wird. Diese Daten zeigen, dass ein Minimum von 2 Minuten Extensionsschritt von Thermo-Sequenase erforderlich ist, um eine Qualitätslesung von mindestens 600 Basen zu erreichen. Die Signalstärke steigt allgemein auf ein Maximum bei einer 4-Minuten- Extension (die Zeit, die in dem kommerziellen Produkt spezifiziert ist, die dieses Enzym und Verfahren nutzt). -
23 -27 zeigen den Effekt steigender Extensionsschrittzeit auf die Leselänge und Datenqualität, die durch FY7-DNA-Polymerase produziert wird. Diese Daten zeigen, dass ein Minimum eines 30-Sekunden-Extensionsschrittes von FY7 gefordert wird, um eine Qualitätslesung von mindestens 600 Basen zu erreichen. Das Plateau der Signalstärken bei ungefähr einer Minute Extensionszeit. Die FY7-DNA-Polymerase kann Daten einer Qualität erzeugen, die zu Thermo Sequenase in einem Viertel bis einer Hälfte der Zeit der Extensionsreaktion äquivalent ist. - Obwohl die oben gegebenen Beispiele verschiedene Ausführungsformen der Erfindung im Detail beschreiben, werden viele Variationen jenen Fachleuten offenbar sein. Demgemäss sind die oben angegebenen Beispiele für Veranschaulichungszwecke beabsichtigt und sollten in keinster Weise verwendet werden, um den Umfang der anhängenden Ansprüche zu beschränken. SEQUENZLISTE
Claims (10)
- Gereinigte rekombinante wärmestabile DNA-Polymerase, umfassend die Aminosäuresequenz, die in
1 dargelegt ist. - Isolierte Nukleinsäure, die eine wärmestabile DNA-Polymerase kodiert, wobei die Nukleinsäure aus der Nukleotidsequenz besteht, die in
1 dargelegt ist. - Rekombinanter DNA-Vektor, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 2.
- Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 3, umfassend das Plasmid pMR10.
- Rekombinante Wirtszelle, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 3.
- Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 5, die E. coli ist.
- Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 6, die E. coli ist, die die cI'- und c1875-Allele trägt.
- Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 6, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus DHIλ'[gyrA96, recAI, relAI, endAI, thi-1, hsdR17, supE44, λ'] und M5248 [λ (bio275. c1857, cIII+, N+, λ (HI))].
- Verfahren zum Sequenzieren von DNA, umfassend den Schritt des Erzeugens von Ketten-terminierten Fragmenten mit der DNA-Polymerase nach Anspruch 1 aus dem DNA-Template, das sequenziert werden soll, bei Vorhandensein mindestens eines Ketten-terminierenden Mittels und eines oder mehrerer Nukleotidtriphosphate und Bestimmen der Sequenz der DNA aus den Größen der Fragmente mit der DNA-Polymerase nach Anspruch 1.
- Kit zum Sequenzieren von DNA, umfassend die DNA-Polymerase nach Anspruch 1.
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