JP4349545B2 - Fy7ポリメラーゼ - Google Patents
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Description
関連技術についての説明
本出願は、1998年6月17日に提出された米国仮出願番号第60/089,556号(この米国仮出願に開示されている内容は全て、本明細書の一部を構成する。)に対する優先権を主張する。
【0002】
発明の背景
発明の分野
本開示は、改良された強固性(robustness)および有効性を示す熱安定性DNAポリメラーゼに関する。
【0003】
背景
DNAポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)による核酸増幅、自己持続性配列複製(「3SR」)、および高温DNA配列決定といったような、多くの組換えDNA技術において有用な酵素である。熱安定性ポリメラーゼが特に有用である。熱は、ポリメラーゼ活性を消失させないので、変性段階が終わる毎にさらなるポリメラーゼを加える必要はない。
【0004】
しかしながら、多くの熱安定性ポリメラーゼは、産生される生成物の量を制限し得る、または生成物の標準的な指数関数的蓄積におけるプラトー現象の原因となり得る、5'→3'エキソヌクレアーゼまたは構造依存性一本鎖エンドヌクレアーゼ(「SDSSE」)活性を示すことが見出されている。そのような5'→3'ヌクレアーゼ活性は、特に、G+Cに富む標的に対して、10kb以上の長いPCR産物を有効に作り出す能力の減損の原因となり得る。DNA配列決定の適用およびサイクル配列決定の適用において、5'→3'ヌクレアーゼ活性の存在は、所望のバンド強度の減少および/または擬似もしくは背景バンドの発生の原因となり得る。
【0005】
さらに、現在利用できる酵素の多くは、一般に、高い塩の環境、条件に対して感受性がある。現在利用できる酵素は、まずまずのプロセシング能力を有し(より分配的であり−よりしばしば低下し−より詳細に説明する)、dITPを加えて、コンプレッション現象の問題に取り組む−通常、酵素活性を消滅させる。
【0006】
従って、高い塩の条件に対して耐性の増大を有する、改良されたDNAポリメラーゼ、dITPの有効利用、高い産生力、およびGCに富む鋳型に対する改良された性能に対する要請が存在し続けている。
【0007】
発明の要約
本発明の開示は、図1に示すアミノ酸配列を含んでなる、精製された組換え熱安定性DNAポリメラーゼ、さらにはまた、少なくとも約80%の活性を50mM以上の塩濃度で示す、精製された組換え熱安定性DNAポリメラーゼを教示する。本発明の開示はさらに、少なくとも約70%の活性を25mM以上の塩濃度で示す、精製された組換え熱安定性DNAポリメラーゼ、および結合事象(binding event)あたり約30ヌクレオチドの連続移動性(processivity)を有する、精製された組換え熱安定性DNAポリメラーゼを教示する。
【0008】
本発明の開示はまた、熱安定性DNAポリメラーゼをコードする、単離された核酸であって、図1に示すヌクレオチド配列からなる核酸、さらにはまた、その核酸を含んでなる組換えDNAベクター、およびそのベクターで形質転換させた組換え宿主細胞をも教示する。
【0009】
本発明の開示はまた、少なくとも1つの連鎖停止剤および1つ以上のヌクレオチドトリホスフェートの存在下、DNAポリメラーゼで配列決定すべきDNA鋳型から連鎖停止フラグメントを作り出して、該フラグメントの大きさから該DNAの配列を決定するという段階を含んでなる、DNAを配列決定する方法をも教示する。本発明の開示はまた、DNAポリメラーゼを含んでなる、DNAを配列決定するためのキットをも教示する。
【0010】
図面の簡単な説明
図1は、FY7ポリメラーゼに関するアミノ酸配列(およびそれをコードするDNA配列)を示す。
【0011】
図2は、ABIの377型 自動蛍光DNA配列決定装置からのプリントアウトにより示す、Mn条件で調製したFY7ポリメラーゼを使用して配列決定された、M13mp18 DNAのDNA配列を示す。
【0012】
図3は、ABIの377型 自動蛍光DNA配列決定装置からのプリントアウトにより示す、Mg条件で調製したFY7ポリメラーゼを使用して配列決定された、M13mp18 DNAのDNA配列を示す。
【0013】
図4は、様々なKCl濃度の下、Thermo Sequenase(商標)酵素 DNAポリメラーゼ 対 FY7 DNAポリメラーゼの最大ポリメラーゼ活性%を示す。
【0014】
図5は、Thermo Sequenase(商標)酵素 DNAポリメラーゼ 対 FY7 DNAポリメラーゼを使用しての放射能標識化DNA配列決定反応における、DNA配列決定能力に対する高い塩濃度の効果を示す。
【0015】
図6−10は、Thermo Sequenaseの性能に対する、増大する塩濃度の効果を示す。25mM程度の低い濃度では、データの特質は、読取り長さが少なくとも600塩基から約450塩基まで減少するという点で影響を受ける。50mMの塩では、その読取り長さはさらに約350塩基まで、75mMでは約250塩基まで減少して、100mMでは、その読取り長さは無視できる。
【0016】
図11−15は、FY7 DNAポリメラーゼの性能に対する、増大する塩濃度の効果を示す。少なくとも75mMのKClには、性能に対して有害な効果はなく、100mMのKClでは、データの特質において僅かな減少しかない。
【0017】
図16は、FY7 DNAポリメラーゼに関して測定した連続移動性と比較する、Thermo Sequenase DNAポリメラーゼ、AmpliTaq FS DNAポリメラーゼに関して測定した連続移動性を示す。
【0018】
図17は、dGTP(グアノシントリホスフェート)アナログであるdITP(イノシントリホスフェート)を72℃で取り込む放射能標識化配列決定反応において、FY7 ポリメラーゼ 対 Thermo Sequenase DNAポリメラーゼを使用した場合に得られる、改良された読取り長さを示す。
【0019】
図18−22は、蛍光標識化ターミネーターDNA配列決定反応において、Thermo Sequenase DNAポリメラーゼによりもたらされる読取り長さおよびデータの特質に対する、増大する伸長段階時間の効果を示す。
【0020】
図23−27は、蛍光標識化ターミネーターDNA配列決定反応において、FY7 DNAポリメラーゼによりもたらされる読取り長さおよびデータの特質に対する、増大する伸長段階時間の効果を示す。
【0021】
発明の詳細な説明
DNA配列決定のための改良されたポリメラーゼを得る目的で、完全な長さのThermus thermophilusおよびThermus aquaticus DNAポリメラーゼI酵素において見出されるエキソヌクレアーゼ活性を減少させることにより、一連のポリメラーゼ変異体を構築した。6つの保存されたモチーフ(GutmanおよびMinton(1993)Nucleic Acids Research 21,4406−4407)をpol I型ポリメラーゼのアミノ末端ドメインにおいて同定することができ、これには、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性が存することが示されている。さらに、これらの保存された領域における6つのカルボキシレート残基は、Thermus aquaticus DNA pol Iのエキソヌクレアーゼドメインの活性部位に位置すべき結晶構造で示されている(Kimら,(1995)Nature 376,612−616)。次の通り、TthおよびTaqポリメラーゼにおける6つの保存されたモチーフのうちの3つでのカルボキシレートおよび他の残基に対する部位特異的変異誘発により、点変異を起こした:
Taq D18A、Taq T140V、Taq D142N/D144N。これらは全て、エキソヌクレアーゼドメインの外側に変異F667Yを有する。
Tth D18A、Tth T141V、Tth D143N/D145N。これらは全て、エキソヌクレアーゼドメインの外側に変異F669Yを有する。
【0022】
エキソヌクレアーゼ活性、連続移動性、鎖置換、塩耐性、熱安定性、および配列決定の特質に関して、全てのポリメラーゼを評価した。1つのFY7ポリメラーゼ、Tth D18A、F669Yを以下でさらに詳細に記載する。
【0023】
実施例
方法
インビトロでの変異誘発
PCRを使用して、アスパラギン酸をクローン化された完全な長さのF669Y Tth(プラスミド pMR10)のコドン18(D18A)でアラニンアミノ酸変化へと導入した。変異原性プライマー1(CTGTTCGAACCCAAAGGCCGTGTCCTCCTGGTGGCCGGCCACCAC)は、コドン18およびBstBI制限部位が含まれるpMR10のヌクレオチド19−60とつながる。オリゴヌクレオチドプライマー2(GAGGCTGCCGAATTCCAGCCTCTC)は、pMR10のEcoRI部位とつながる。pMR10を鋳型DNAとして使用した。PCR産物をBstBIおよびEcoRIで消化させ、pMR10の2つのフラグメント:5000bpのKpnI/BstBIおよび2057bpのEcoRI/KpnIに結合させて、プラスミドpMR12を作成した。E. coli株の細胞 DH1λ+を一次形質転換に使用して、株 M5248(λ cI857)をタンパク質発現に使用したが、cI+およびcI857対立遺伝子をもつE. coli株の比較可能な対はいずれも利用することができた。あるいはまた、rec+ cI+株をいずれもナリジキシン酸のような化学薬剤により導入して、ポリメラーゼを産生することができた。
【0024】
ポリメラーゼの精製
プラスミドpMR12を含むM5248を、100mg/ml アンピシリンを含む、1リットルのLB培地(1% トリプトン、0.5% 酵母エキス、1% NaCl)、好ましくは2X LB培地にて30℃で培養した。OD600が1.0に達したら、その培養物を42℃で1.5時間保持(induce)した。次いで、その培養物を20℃未満まで冷却して、細胞をSorvall RC−3B遠心機における5000rpmにて4℃での15〜30分間の遠心分離により収集した。収集した細胞を−80℃で保存した。
【0025】
細胞ペレットを予め温めておいた溶解緩衝液(50mM Tris−HCl pH 8.0、10mM MgCl2、16mM (NH4)2SO4、1mM EDTA、0.1%、好ましくは0.2% Tween 20、0.1%、好ましくは0.2% NP40)25mlに再縣濁させた。好ましくは、その溶解緩衝液は300mM NaClを含む。再縣濁させた細胞を75−85℃で10−20分間インキュベートし、1分間音波処理して、遠心分離により澄ませた。澄ませたライゼートを、100mM、好ましくは300mM NaClを含む緩衝液A(50mM Tris−HCl pH 8.0、1mM EDTA、0.1% Tween 20、0.1% NP40)にて平衡化したジエチルアミノエチルセルロース(Whatman DE 52)の300mlのカラムを通過させた。画分をポリメラーゼ活性に関してアッセイし、ピークのポリメラーゼ活性を実証する画分をプールし、緩衝液Aで50mM NaClまで希釈して、緩衝液A中の50mM NaClで平衡化したヘパリンセファロースカラム(20ml)へと充填した。ポリメラーゼを緩衝液A中の50mMから700mMまでのNaClの直線的な塩のグラジエントでカラムから溶出した。画分をポリメラーゼ活性に関してアッセイし、ピークの活性を実証する画分をプールして、最終緩衝液(20mM Tris−HCl pH 8.5、50%(v/v) グリセロール、0.1mM EDTA、0.5% Tween 20、0.5% NP40、1mM DTT、100mM KCl)に対して透析した。精製されたタンパク質をFY7と名付ける。アミノ酸配列(およびそれをコードするDNA配列)を図1に示す。
【0026】
細菌株
E. coli株:DHIλ+[gyrA96、recA1、relA1、endA1、thi-1、hsdR17、supE44、λ+];M5248[λ(bio275、cI857、cIII+、N+、λ(H1))]。
【0027】
PCR
E. coli DHIλ+由来のプラスミドDNA(pMR10)をSDSアルカリ溶解法(Sambrookら,Molecular Cloning,第2版,Cold Spring Harbor Press,1989)により調製した。反応条件は次の通りであった:反応物100μlあたり、10mM Tris−HCl pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.001% ゼラチン、1uM 各々のプライマー、2.5U Taqポリメラーゼ。サイクリング条件は、94℃で2分間、次いで、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で3分間、続いて、72℃で7分間を35サイクルであった。
【0028】
実施例1:M n 条件での酵素の調製
次の「プレミックス(pre-mix)」プロトコルにおいて、試薬は全て、2つの溶液;試薬混合物Aおよび試薬混合物Bに含まれる。
【0029】
試薬混合物A
次の試薬を組合わせて、試薬混合物A 10mlを製造した:
2.5ml 1M HEPPS N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N'−(3−プロパンスルホン酸)、pH 8.0;
500μl 1M 酒石酸、pH 8.0;
50,000単位 FY7 DNAポリメラーゼ;
1単位 Thermoplasma acidophilum 無機ピロホスファターゼ;
100μl 100mM dATP;
100μl 100mM dTTP;
100μl 100mM dCTP;
500μl 100mM dITP;
9.375μl 100μM C−7−プロパルギルアミノ−4−ローダミン−6−G−ddATP;
90μl 100μM C−5−プロパルギルアミノ−4−ローダミン−X−ddCTP;
6.75μl 100μM C−7−プロパルギルアミノ−4−ローダミン−110−ddGTP;
165μl 100μM C−5−プロパルギルアミノ−4−テトラメチルローダミン−ddUTP;
10μl 50mM EDTA;
1ml グリセロール;
体積を脱イオンH2Oで10,000μlとした。
【0030】
試薬混合物B
次の試薬を組合わせて、試薬混合物A 10mlを製造した:
10μl 1M MES 2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸、pH 6.0;
200μl 1M MgCl2;
75μl 1M MnSO4;
体積を脱イオンH2Oで10,000μlとした。
【0031】
実施例2:実施例1から得られた調製物の使用
試薬混合物A 2μl、試薬混合物B 2μl、M13mp18 DNA 200ng、プライマー(M13−40 前方 5'−GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA)5pmole、および全体積を20μlとする脱イオン水を一緒に混合して、熱サイクラーに(95℃で30秒間、60℃で1分間)25サイクルかけた。サイクリング後、1.5M 酢酸ナトリウム、250mM EDTAを含む溶液4μlを加えた。その溶液を混合して、エタノール4体積(100μl)を加えた。氷上での15−20分間のインキュベーション、続いて、遠心分離により、DNAを沈殿させた。上清を除去して、ペレットを70% エタノールで洗浄し、乾燥させて、充填色素を含むホルムアミド4μlに再縣濁させた。次いで、再縣濁させたDNAを自動蛍光DNA配列決定装置(ABIの377型装置)で操作した。その機械からのDNA配列のプリントアウトを図2として示す。
【0032】
実施例3:M g 条件での酵素の調製
次の「プレミックス」プロトコルにおいて、試薬は全て、1つの溶液に含まれる。
【0033】
配列決定プレミックス
次の試薬を組合わせて、配列決定プレミックス800μlを製造した:
200μl 500mM Tris−HCl pH 9.5、20mM MgCl2;
100μl 40単位/μl FY7 DNAポリメラーゼ、0.0008単位/μl Thermoplasma acidophilum 無機ピロホスファターゼ;
100μl 10mM dITP、2mM dATP、2mM dTTP、2mM dCTP;
100μl 0.125μM C−7−プロパルギルアミノ−4−ローダミン−6−G−ddATP;
100μl 1.2μM C−5−プロパルギルアミノ−4−ローダミン−X−ddCTP;
100μl 0.09μM C−7−プロパルギルアミノ−4−ローダミン−110−ddGTP;
100μl 2.2μM C−5−プロパルギルアミノ−4−テトラメチルローダミン−ddUTP。
【0034】
実施例4:実施例3から得られた調製物の使用
配列決定プレミックス4μl、M13mp18 DNA 200ng、プライマー(M13−40 前方 5'−GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA)5pmole、および全体積を20μlとする脱イオン水を一緒に混合して、熱サイクラーに(95℃で30秒間、60℃で2分間)25サイクルかけた。サイクリング後、7.5M 酢酸アンモニウム7μlを加えた。その溶液を混合して、エタノール4体積(100μl)を加えた。氷上での15−20分間のインキュベーション、続いて、遠心分離により、DNAを沈殿させた。上清を除去して、ペレットを70% エタノールで洗浄し、乾燥させて、充填色素を含むホルムアミド4μlに再縣濁させた。次いで、再縣濁させたDNAを自動蛍光DNA配列決定装置(ABIの377型装置)で操作した。その機械からのDNA配列のプリントアウトを図3として示す。
【0035】
実施例5:T hermo S equenase( 商標 ) 酵素およびFY7酵素に関するポリメラーゼ活性 対 塩濃度 ( KC l)
様々なKCl濃度の下、最大ポリメラーゼ活性%をThermo Sequenase(商標)酵素 DNAポリメラーゼおよびFY7 DNAポリメラーゼに関して測定した。その結果を図4に示す。そのデータは、反応混合物において、FY7がThermo Sequenase(商標)よりずっと高い塩の最適条件、さらにはまた、塩に対して広範囲の耐性を有することを示す。50%の活性を与える塩濃度は、Thermo Sequenaseに関するよりFY7に関するほうが5倍高い。
【0036】
放射能標識化DNA配列決定反応におけるDNA配列決定能力に対する高い塩濃度の効果もまた試験した。その結果を図5に示す。50mM以上のKCl濃度では、Thermo Sequenase(商標) ポリメラーゼ性能は、使用可能なデータを得ることができないレベルまで低下する。しかしながら、FY7 DNAポリメラーゼは、100mMのKCl濃度でも極めて良好な配列決定データを与えることができる。
【0037】
実施例6:蛍光配列決定の塩耐性
これらの実験は、蛍光標識化ターミネーターDNA配列決定反応において、先に実証したDNA配列決定能力に対する高い塩濃度でのポリメラーゼ活性の効果を試験した。その結果を図6−15に示す。
【0038】
図6−10は、Thermo Sequenaseの性能に対する、増大する塩濃度の効果を示す。25mM程度の低い濃度では、データの特質は、読取り長さが少なくとも600塩基から約450塩基まで減少するという点で影響を受ける。50mMの塩では、その読取り長さはさらに約350塩基まで、75mMでは約250塩基まで減少して、100mMでは、その読取り長さは無視できる。
【0039】
図11−15は、FY7 DNAポリメラーゼの性能に対する、増大する塩濃度の効果を示す。少なくとも75mMのKClには、性能に対して有害な効果はなく、100mMのKClでは、データの特質において僅かな減少しかない。
【0040】
幾つかのタイプのDNA調製物には、塩が混入し得る(これは、DNA配列決定データの特質に対して有害である)ことが認められるので、FY7 DNAポリメラーゼの使用は、より広範囲の鋳型条件に対して、より強固な配列決定反応を可能とする。
【0041】
実施例7:ポリメラーゼの連続移動性
連続移動性(DNAポリメラーゼの結合事象あたりに取り込まれるヌクレオチドの数)を様々なDNA配列決定ポリメラーゼに関して測定した。その結果を図16に示す。Thermo Sequenase DNAポリメラーゼは、結合事象あたり4ヌクレオチドまでの連続移動性しか有していない。FY7 DNAポリメラーゼは、結合事象あたり30ヌクレオチドまでで、Thermo Sequenase DNAポリメラーゼより7倍大きい、そしてAmpliTaq FS DNAポリメラーゼより2倍まで大きい連続移動性を有する。
【0042】
実施例8:72℃で d ITPでのポリメラーゼ伸長
そのシリーズは、dGTP(グアノシントリホスフェート)アナログであるdITP(イノシントリホスフェート)を72℃で取り込む放射能標識化配列決定反応において、FY7 ポリメラーゼ 対 Thermo Sequenase DNAポリメラーゼを使用した場合に得られる、改良された読取り長さを試験した。その結果を図17に示す。FY7は、標準的な33P[α−dATP]配列決定条件下、Thermo Sequenaseより50−100多いヌクレオチドを取り込むことができる。
【0043】
実施例9:読取り長さに対する伸長段階時間の効果
これらの実験シリーズは、蛍光標識化ターミネーターDNA配列決定反応において、Thermo SequenaseおよびFY7 DNAポリメラーゼの読取り長さおよびデータの特質の増大する伸長段階時間の効果を試験した。その結果を図18−27に示す。
【0044】
図18−22は、Thermo Sequenase DNAポリメラーゼによりもたらされる読取り長さおよびデータの特質に対する、増大する伸長段階時間の効果を示す。このデータは、少なくとも600塩基の良質な読取りが達成されるために、最低2分の伸長段階がThermo Sequenaseにより必要とされることを示す。シグナル強度は、通例、4分の伸長(この酵素および方法を利用する市販の製品において指定される時間)で最大まで増大する。
【0045】
図23−27は、FY7 DNAポリメラーゼによりもたらされる読取り長さおよびデータの特質に対する、増大する伸長段階時間の効果を示す。このデータは、少なくとも600塩基の良質な読取りが達成されるために、最低30秒の伸長段階がFY7により必要とされることを示す。シグナル強度は、約1分の伸長時間でプラトーに達する。FY7 DNAポリメラーゼは、4分の1〜2分の1の伸長反応時間でThermo Sequenaseと同等の特質のデータをもたらすことができる。
【0046】
先の実施例は、本発明の様々な態様を詳細に記載するが、多くの変更が当業者に明らかである。従って、先の実施例は、説明を目的とするものであって、付記する特許請求の範囲を制限するために何ら使用すべきものではない。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、FY7ポリメラーゼに関するアミノ酸配列(およびそれをコードするDNA配列)を示す。
【図2】 図2は、ABIの377型 自動蛍光DNA配列決定装置からのプリントアウトにより示す、Mn条件で調製したFY7ポリメラーゼを使用して配列決定された、M13mp18 DNAのDNA配列を示す。
【図3】 図3は、ABIの377型 自動蛍光DNA配列決定装置からのプリントアウトにより示す、Mg条件で調製したFY7ポリメラーゼを使用して配列決定された、M13mp18 DNAのDNA配列を示す。
【図4】 図4は、様々なKCl濃度の下、Thermo Sequenase(商標)酵素 DNAポリメラーゼ 対 FY7 DNAポリメラーゼの最大ポリメラーゼ活性%を示す。
【図5】 図5は、Thermo Sequenase(商標)酵素 DNAポリメラーゼ 対 FY7 DNAポリメラーゼを使用しての放射能標識化DNA配列決定反応における、DNA配列決定能力に対する高い塩濃度の効果を示す。
【図6−10】 図6−10は、Thermo Sequenaseの性能に対する、増大する塩濃度の効果を示す。25mM程度の低い濃度では、データの特質は、読取り長さが少なくとも600塩基から約450塩基まで減少するという点で影響を受ける。50mMの塩では、その読取り長さはさらに約350塩基まで、75mMでは約250塩基まで減少して、100mMでは、その読取り長さは無視できる。
【図11−15】 図11−15は、FY7 DNAポリメラーゼの性能に対する、増大する塩濃度の効果を示す。少なくとも75mMのKClには、性能に対して有害な効果はなく、100mMのKClでは、データの特質において僅かな減少しかない。
【図16】 図16は、FY7 DNAポリメラーゼに関して測定した連続移動性(processivity)と比較する、Thermo Sequenase DNAポリメラーゼ、AmpliTaq FS DNAポリメラーゼに関して測定した連続移動性を示す。
【図17】 図17は、dGTP(グアノシントリホスフェート)アナログであるdITP(イノシントリホスフェート)を72℃で取り込む放射能標識化配列決定反応において、FY7 ポリメラーゼ 対 Thermo Sequenase DNAポリメラーゼを使用した場合に得られる、改良された読取り長さを示す。
【図18−22】 図18−22は、蛍光標識化ターミネーターDNA配列決定反応において、Thermo Sequenase DNAポリメラーゼによりもたらされる読取り長さおよびデータの特質に対する、増大する伸長段階時間の効果を示す。
【図23−27】 図23−27は、蛍光標識化ターミネーターDNA配列決定反応において、FY7 DNAポリメラーゼによりもたらされる読取り長さおよびデータの特質に対する、増大する伸長段階時間の効果を示す。
Claims (10)
- 図1に示すアミノ酸配列を含んでなる、精製組換え熱安定性DNAポリメラーゼ。
- 熱安定性DNAポリメラーゼをコードする、単離された核酸であって、図1に示すヌクレオチド配列からなる核酸。
- 請求項2記載の核酸を含んでなる組換えDNAベクター。
- プラスミドpMR10を含んでなる、請求項3記載の組換えDNAベクター。
- 請求項4記載のベクターで形質転換させた組換え宿主細胞。
- E. coliである、請求項5記載の組換え宿主細胞。
- cI+及びcI857対立遺伝子をもつE. coliである、請求項6記載の組換え宿主細胞。
- DHIλ+[gyrA96、recA1、relA1、endA1、thi−1、hsdR17、supE44、λ+]及びM5248[λ(bio275、cI857、cIII+、N+、λ(H1))]よりなる群から選択される、請求項6記載の組換え宿主細胞。
- 少なくとも1つの連鎖停止剤及び1つ以上のヌクレオチドトリホスフェートの存在下、請求項1に記載のDNAポリメラーゼで配列決定すべきDNA鋳型から連鎖停止フラグメントを作り出して、該フラグメントの大きさから該DNAの配列を決定するという段階を含んでなる、DNAの配列決定方法。
- 請求項1記載のDNAポリメラーゼを含んでなる、DNA配列決定用キット。
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