JPH07163343A - 耐熱性ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ＤＮＡシークエンシング反応、特に温度循環
による微量ＤＮＡからのシークエンシング反応（サイク
ルシークエンシング）及びプライマー伸長反応並びに核
酸増幅法に特に有用な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを提供
する。 【構成】 下記の性質を有する耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ （１）作用１：鋳型とアニールしたオリゴヌクレオチド
プライマーの３’端のヒドロキシル基に、鋳型に依存し
たデオキシヌクレオチド５’トリフォスフェートのα−
フォスフェートを共有結合させる反応を触媒する。 （２）作用２：５’−３’エキソヌクレアーゼ活性がほ
とんど確認されない。 （３）基質特異性：鋳型として１本鎖ＤＮＡおよび１本
鎖ＲＮＡを利用する事ができ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメ
ラーゼ、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼとして作用す
る。 （４）分子量：５６０００〜６００００ダルトン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡシークエンシング
反応、特に温度循環による微量ＤＮＡからのシークエン
シング反応（サイクルシークエンシング）およびプライ
マー伸長反応並びに核酸増幅法に特に有用な耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術】これまで一般に入手可能なＤＮＡポリメ
ラーゼとしては、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩの
ような中温微生物からのＤＮＡポリメラーゼＩや、その
改変型であるクレノウ酵素あるいはＴ７，Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼのような、中温微生物に感染するファージ由
来のＤＮＡポリメラーゼがある。

【０００３】しかし、これらの酵素はその由来から明ら
かなように、その反応最適温度は３７℃付近で、熱安定
性には欠けるという特徴がある。また、耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼとしてはサーマス・アクアティカス由来のＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス
由来のｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リ
トラリス由来のＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ及びそれら
の改変型のＤＮＡポリメラーゼがある。これらの酵素
は、その有する性質に応じて特定のＤＮＡ標識化、ＤＮ
Ａ塩基配列決定法やプライマー伸長反応などに利用され
ている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】一般にＤＮＡポリメラ
ーゼは、その起源による酵素特性を有しており、その特
性を活かした利用方法がある。例えばＤＮＡ塩基配列決
定において、非耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた場
合、配列決定を使用とする材料（鋳型）の高次構造に起
因して、一般にスタッキングと呼ばれる現象が生じ、正
しくＤＮＡ塩基配列が決定できない場合があるという問
題がある。

【０００５】他方、例えば高度高熱細菌サーマス・サー
モフィラス(Thermus thermophilus)由来のＴｔｈＤＮＡ
ポリメラーゼは、その耐熱性を利用して、ＤＮＡ塩基配
列決定のための反応を高温で行うことにより、コンプレ
ッションを解消することができ、ＤＮＡ塩基配列決定法
の改善に利用されている。

【０００６】しかしながら、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ
は耐熱性ではあるものの、酵素特性として、基質となる
鋳型ＤＮＡや反応によって生じるＤＮＡ鎖を末端から切
断するエキソヌクレアーゼ活性を有するため、基質やプ
ライマー、あるいは生成物の分解が起こりＤＮＡ配列の
シグナルが弱くなったり、正しいシグナル以外にエキス
トラバンドと呼ばれる正しくないバンドが発生しやす
く、より正しくＤＮＡ塩基配列を決定するためには、な
お不十分であった。このような背景の下に、ＴｔｈＤＮ
Ａポリメラーゼから問題となるエキソヌクレアーゼ活性
を大きく欠失させた酵素の開発が切望されていた。

【０００７】本発明の目的はＤＮＡの塩基配列決定等に
適した新規な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを提供する事に
ある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼは以下の性質を有する。 （１）作用１：鋳型とアニールしたオリゴヌクレオチド
プライマーの３’端のヒドロキシル基に、鋳型に依存し
たデオキシヌクレオチド５’トリフォスフェートのα−
フォスフェートを共有結合させる反応を触媒する。 （２）作用２：５’−３’エキソヌクレアーゼ活性がほ
とんど確認されない。 （３）基質特異性：鋳型として１本鎖ＤＮＡおよび１本
鎖ＲＮＡを利用する事ができ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメ
ラーゼ、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼとして作用す
る。 （４）分子量：５６０００〜６００００ダルトン。分子
量の測定は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に
て、標準分子量マーカーとして分子量９４０００、６７
０００、４３０００、３００００を用いて行う。また、
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは次の性質も有す
る。 （５）最適ｐＨ ＤＮＡ合成反応時の最適ｐＨ範囲がｐＨ７〜８付近であ
る。 （６）最適温度 ＤＮＡ合成反応時の最適温度範囲は６０〜８０℃付近で
ある。

【０００９】本発明の好ましい耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼはサーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)
由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを改変したものであ
る。サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)
由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、「ＴｔｈＤＮ
Ａポリメラーゼ」と称する）については、その酵素特性
等は明らかにされているが、この酵素が有するＤＮＡポ
リメラーゼ活性以外の５’−３’エキソヌクレアーゼ活
性、逆転転写酵素活性等が、どの様なメカニズムのもと
に活性発現するか等については全く不明であった。

【００１０】本発明者らは、ＤＮＡシークエンシング等
の反応の際に問題となる５’−３’エキソヌクレアーゼ
活性が欠失した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを見いだすこ
とに鋭意研究を重ねた結果、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ
酵素タンパク質の一部領域に５’−３’エキソヌクレア
ーゼ活性を支配する領域が存在する可能性を見いだし、
その領域の一部または全部を欠失させることにより、
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の欠失した耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼを創出することに成功した。

【００１１】ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エ
キソヌクレアーゼ活性を支配する可能性のある領域の一
部または全部を欠失させるためには、対応領域を欠失さ
せる方法であれば、どの様な方法を用いてもよい。例え
ばＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ酵素タンパク質にタンパク
質分解酵素を働かせ、対応領域を分解してもよい。

【００１２】また別の方法の一つは、ＴｔｈＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子を取得し、エキソヌクレアーゼ活性を支
配している可能性のある酵素タンパク質領域に対応する
遺伝子領域を欠失させた発現プラスミドを構築し、該プ
ラスミドで適当な宿主を形質転換し、該形質転換体を培
養し、該培養菌体破砕液より調製する方法を用いること
ができる。

【００１３】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ生産の
為の組み換えプラスミドおよび形質転換体の調製方法の
概略を以下に記載する。組み換えプラスミドの調製に使
用するＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの遺伝子は、特願平４
−１２４６４３に記載の方法により取得できる。取得し
た遺伝子は適当な発現ベクター例えば、ｐＵ１８、ｐＢ
Ｓ、ｐＫＫ２２３−３に挿入する。

【００１４】このように取得・増幅したＤＮＡを幾つか
の制限酵素にて切断後、開始コドン創製のためリンカー
ＤＮＡと結合させてもよいし、直接発現ベクターと結合
させ、閉環後、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性発現
に関与すると思われる遺伝子領域を種々のサイズで欠失
させたプラスミドを作製し、それらを用いて適当な宿
主、例えば大腸菌を形質転換させる。このようにして得
た種々の形質転換体を適当な培地にて培養後、菌体を回
収・破砕・熱処理後、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性及
び５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の有無を測定し、
目的とする５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を示さな
い改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを生産する形質
転換体を取得する。この５’−３’エキソヌクレアーゼ
活性を示さない改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの
ＤＮＡは、配列表の第１位から第１３４０位までに記載
された塩基が欠損していた。即ち、本発明の耐熱性ＤＮ
ＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ断片は、配列表の第
１３４１位から第３０９１位に記載された塩基を含有す
るものである。

【００１５】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
法の概略は以下の通りである。この目的とする改変され
たＤＮＡポリメラーゼは、その生産能を有する組換え菌
を培養し、この菌体より通常のタンパク質精製方法に従
い、精製を進めることができる。例えば、菌体破砕の工
程は、培養液より遠心分離等によって回収した菌体を直
接あるいは凍結後、適当な緩衝液等に懸濁後、超音波破
砕・フレンチプレス・ダイノミル破砕等の物理的処理あ
るいは化学的または生化学的な手法、例えば界面活性剤
処理、細胞膜分解酵素処理により行うことができる。破
砕液からの改変されたＤＮＡポリメラーゼの精製は、菌
体残さを遠心分離・濾過等により除いた後、組換え菌に
よる耐熱性酵素の精製では広く用いられている熱処理に
より、宿主由来のタンパク質の多くを除去することがで
きる。更に濃縮のためには塩析操作を利用することがで
きる。更にＤＮＡポリメラーゼの純度を高めるには、各
種のカラムクロマトグラフィーを例えばＱセファロー
ス、ヘパリンセファロース等のカラムクロマトグラフィ
ーを適当に組み合わせ用いることにより行うことができ
る。

【００１６】このようにして得られたＤＮＡポリメラー
ゼが従来のＴｔｈＤＮＡポリメラーゼに比し著しい特徴
は、ＤＮＡ鎖の５’端からＤＮＡを分解する酵素（５’
−３’エキソヌクレアーゼ）活性が欠失していること。
また、本発明の改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵
素タンパク質の分子量は、天然の酵素に比し小型化され
ていることであり、配列表に於いては、天然型ＴｔｈＤ
ＮＡポリメラーゼをコードしている遺伝子の少なくとも
第１位から第１３４０位までに記載された塩基が欠損し
ていると推測される。該酵素を用いることにより、ＤＮ
Ａシークエンシングの際、プライマーの５’末端を標識
する方法を用いる場合は、天然型のＴｔｈＤＮＡポリメ
ラーゼを用いる場合に比べ、各ＤＮＡ断片のシグナル強
度が強くなり、少量の鋳型ＤＮＡ或いは少量の標識プラ
イマーでＤＮＡのシークエンシングが可能となる。

【００１７】また、内部標識法あるいは３’末端標識法
によりＤＮＡシークエンシングを行う場合は、天然型の
ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを用いる場合に比べ、著しく
エキストラバンドの発生が低減され、より正確に、また
長い範囲のＤＮＡシークエンシングが可能となる。

【００１８】以下実施例により本発明を更に詳細に説明
する。最初に活性測定方法、活性の定義を明らかにして
おく。

【００１９】［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定方法］一般
にＤＮＡポリメラーゼの活性測定は、その条件により同
じ酵素標品であっても見かけ上、著しく異なる挙動を示
すことは、当該業者・研究者においてはよく経験される
ことである。従って、本発明者らは該ＤＮＡポリメラー
ゼの活性測定にあたっては、該ＤＮＡポリメラーゼの活
性測定に通常用いられる条件を以下のように設定し、基
準方法として用いた。 ６７０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液・ｐＨ８．８
（２５℃にての値） ６７ ｍＭ 塩化マグネシウム １６６ ｍＭ 硫酸アンモニウム ２ ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ １００ ｍＭ ２−メルカプトエタノール

【００２０】上記の溶液５μl に、１μｇ／μl のＭ１
３ｍｐ１８ ｓｓＤＮＡを１μl 、１０pmole/μl のプ
ライマーＤＮＡを１μl 、３５ＫＢｑの[3H]- ｄＴＴＰ
を１μl 、更に３７μl の滅菌蒸留水を加え、反応液と
する。この反応液４５μl に酵素液 ５μl を添加し、
穏やかに混和後７５℃にて３０分間加温し反応を進め
る。３０分の反応終了後、氷上に移し冷却し、０．１Ｍ
ピロリン酸ナトリウム５０μl 、１Ｍ過塩素酸１００μ
l を加え１時間以上氷上に放置する。その後、ＧＦ／Ｃ
フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製）にてこれらのサンプ
ルを吸引濾過し、更にフィルターを氷冷０．１Ｍ塩酸及
びエタノールで洗浄後、フィルターを乾燥させ液体シン
チレーションカウンターにて、酸不画分への[3Ｈ] −ｄ
ＴＴＰの取り込みを測定する。活性の定義は、測定値よ
り取り込み量を算出し、３０分反応にて１０ｎＭのｄＴ
ＴＰを酸不溶性画分に取り込ませる酵素量を１ユニット
とした。

【００２１】実施例１ 使用ベクターの構築 本発明で使用したベクターの一種は、ｐＢＲ３２２由来
の市販ベクターｐＫＫ２２３−３より構築した。ｐＫＫ
２２３−３を制限酵素ＰｖｕＩ及びＳａｌＩにて切断
後、その約１．６ｋｂｐの断片を同制限酵素で切断した
ｐＵＣ９に挿入した。次いでこのプラスミドを制限酵素
ＳａｌＩで切断した後、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼで処理
し、約６００ｂｐを削除し更にクレノウＤＮＡポリメラ
ーゼにて末端を平滑化処理後、ライゲースにて閉環し
た。次いで同プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍ
ａＩで切断した後、ＳＤ配列及び制限酵素ＮｃｏＩの切
断サイトを有するオリゴヌクレオチドを挿入し、プラス
ミドｐＬＥＤ−Ｍ１とし本発明に用いた。

【００２２】実施例２ 目的遺伝子の取得及び改変 本発明に用いたサーマス・サーモフィラス(Thermus the
rmophilus)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子は
特願平４−１２４６４３に記載の方法に従い取得した。
具体的にはサーマス・サーモフィラスＨＢ８(Thermus t
hermophilus HB8)の染色体ＤＮＡを次の方法で分離し
た。同菌株を１５０ｍｌの１．５％ポリペプトン、１．
５％酵母エキス、０．２％NaCl（ｐＨ７．５）よりなる
液体培地で７０℃一晩振盪培養後、遠心（８０００ｒｐ
ｍ，１０分）により集菌した。

【００２３】１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含んだ溶液２４ｍｌに懸濁させ、３ｍｌ
のリゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えて、その後
１０％ＳＤＳ溶液を６ｍｌ加えた。３０ｍｌのフェノー
ルを加えてゆるやかに撹拌混合し、１０，０００ｒｐ
ｍ，１５分間の遠心で水層と溶媒層に分け、水層を採取
した。この操作を再びおこない、この水層に２倍量のエ
タノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり撹拌しな
がらＤＮＡをガラス棒にまきつかせて分離した。これを
１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ
を含んだ溶液（以下ＴＥと記載）で溶解した。これを等
量のクロロホルム・フェノール溶液で処理後、遠心によ
り水層を分取し、２倍量のエタノールを加えて、上記の
方法でもう一度ＤＮＡを分離し２ｍｌのＴＥで溶解し
た。

【００２４】このようにして分離したサーマス・サーモ
フィラス染色体ＤＮＡ１μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
（東洋紡製）５ユニットで３７℃，１５分反応させ、限
定分解を行った後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにて完全に
切断したｐＵＣ１９ ０．５μｇとＴ4 −ＤＮＡリガー
ゼ（東洋紡績（株）製）１ユニットで１６℃、１２時間
反応させＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡは、E.coli
JM109のコンピテントセルを形質転換し、使用したＤＮ
Ａ１μｇ当り約１×１０⁶ 個の形質転換体のコロニーが
得られた。得られたコロニーは５０μｇ／ｍｌアンピシ
リン入りＬ培地（１％ポリペプトン，０．５％酵母エキ
ス，０．５％塩化ナトリウム、０．２５ｍＭＩＰＴＧ）
で３７℃で１８時間培養し、菌体を破砕し、７５℃、３
０分処理した液を用いて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性
を測定し、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子がクローン
化された菌株のスクリーニングを実施した。上記方法に
より約３，０００個のコロニーの耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を測定したところ、２個の耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を有するコロニーを得た。これらの保有する
プラスミドには内部にＨｉｎｄＩＩＩサイトを１箇所含
む約６ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片が存在しており、このプ
ラスミドをｐＵＰＬ０とした。

【００２５】次いでｐＵＰＬ０よりＨｉｎｄＩＩＩにて
約２．８ｋｂｐ、及び３．２ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片を
切り出し、それぞれｐＵＣ１９へ導入してｐＵＰＬ０１
及びｐＵＰＬ０２を構築した。それぞれでE.coliJM109
を形質転換し、この形質転換体を培養後上記方法により
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定したところ活性は
認められなかった。次にｐＵＰＬ０２をＸｈｏＩ、Ｓａ
ｌＩ処理後再環状化し、ｐＵＰＬ０３を構築した。更に
ｐＵＰＬ０１をＨｉｎｄＩＩＩ処理して得られる２．８
ｋｂｐの断片をｐＵＰＬ０３のＨｉｎｄＩＩＩサイトに
導入しｐＵＰＬ１を構築した。このｐＵＰＬ１でE.coli
JM109を形質転換した菌株では耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ活性が確認された。このｐＵＰＬ１のＨｉｎｄＩＩＩ
切断によって得られる約２．８ｋｂｐ断片の末端を平滑
化処理後、ＳｍａＩ処理したｐＬＥＤ−Ｍ１に挿入しｐ
ＬＥＤ−ＰＣを構築した。このｐＬＥＤ−ＰＣをＢａｍ
ＨＩ処理し、生じる小断片を除いた後、ｐＵＰＬ０３の
ＢａｍＨＩ切断によって得られる小断片を挿入、結合し
ｐＬＥＤ−ＮＳを構築した。次いで、ｐＬＥＤ−ＮＳを
ＦｓｐＩにて切断後、開始コドン創出のためＮｄｅＩリ
ンカーを結合させ、更に、ＮｄｅＩ、ＳｏｈＩにて切断
し約１．６ｋｂの断片を得た。この断片を、ｐＬＥＤ−
ＮＳをＮｄｅＩ、ＳｐｈＩにて切断し得られた約２．９
ｋｂの断片と結合し、ｐＫＰＯＬ−ＮＦ２を構築した。

【００２６】実施例３ 形質転換体の調製 実施例２にて取得した、改変されたＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子を有するプラスミドｐＫＰＯＬ−ＮＦ２を用い
て、市販のE.coli JM109コンピテントセル（東洋紡績
（株）製）を形質転換し、改変された耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ生産菌株を取得した。

【００２７】実施例４ 改変された耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ生産菌株の培養 実施例３で取得した改変された耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ生産菌をアンピシリンを含む寒天培地上で生育させた
後、同様にアンピシリンを含むTerrefic Broth(Tartof
and Hobbs 1987) に植菌し、３７℃にて約１６時間激し
く振盪培養し、培養終了後遠心分離（８０００ｒｐｍ、
１０分）にて菌体を回収した。

【００２８】 実施例５ 改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製 実施例４にて取得した菌体を、１０ｍＭ ２−メルカプ
トエタノール、５％グリセロールを含むリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に懸濁した後、超音波破砕機にて約９０
秒間処理した後、遠心分離により菌体残さを取り除い
た。この上清を組換え菌による耐熱性酵素の精製では広
く用いられている熱処理（７５℃、３０分）し、宿主由
来のタンパク質の多くを不溶化させ、遠心分離により除
去した。更に、この上清にポリエチレンイミンを終濃度
が０．０１−０．１％の範囲で添加し、室温にてしばら
く放置後、硫酸アンモニウムを対液約４０−５０％の範
囲で添加し、目的とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを沈
澱させ遠心分離により回収した。これを５０ｍＭ ＫＣ
ｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、７ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール、５％ グリセロールを含むＴｒｉｓ−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、同緩衝液に対して透析を
行った。

【００２９】次いでこの緩衝液にて平衡化したＱセファ
ロース（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー
に供し、０−０．５Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液にて溶
出した。ここで得た活性画分をＮａＣｌを含まない同緩
衝液に対し透析し、続いて同緩衝液で平衡化されたヘパ
リンセファロースカラムクロマトグラフィーに供し、０
−０．８Ｍ ＮａＣｌを含む同緩衝液にて溶出した。こ
こで得た活性画分をＮａＣｌを含まない同緩衝液に対し
透析し、改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ標品とし
た。

【００３０】 実施例６ 改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの特性 実施例５で得られた５’−３’エキソヌクレアーゼ活性
の欠失した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの酵素特性は以下
のようであった。 （１）最適ｐＨ 酵素活性測定時に用いる緩衝液として、Ｔｒｉｓ−塩
酸、エタノールアミン−塩酸等を用いて種々ｐＨを変化
させ、最適ｐＨの測定を行ったところ、最適ｐＨは７〜
８付近であった。 （２）作用温度 実施例１の条件下で各温度における改変された耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼの活性を測定したところ、作用温度は
室温から９０℃以上であり、最適温度は６０〜８０℃付
近であり、９０℃においても最適温度での活性に比べ約
１０％の活性を呈し、従来知られている耐熱性酵素に比
べ、高温下での作用性が高かった。 （３）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にて、標準分子量
マーカーとして分子量９４０００、６７０００、４３０
００、３００００を用いた場合、分子量は５６０００〜
６００００ダルトンであった。 （４）５’−３’エキソヌクレアーゼ活性 天然型のサーマス・サーモフィラス(Thermus thermophi
lus)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに比べ、１０％以
下であった。

【００３１】比較例１ ＤＮＡシークエンシング反応 市販の天然型のサーマス・サーモフィラス(Thermus the
rmophilus)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いたシ
ークエンシング キットを用いて通常のラジオアイソト
ープを使用する方法でＭ１３ｓｓＤＮＡのシークエンシ
ングを実施した。この際に得られたシークエンシングの
オートラジオグラムを図１に示す。

【００３２】実施例７ 本発明により改変された耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡシークエンシング 市販のＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡシーク
エンシングキット（東洋紡（株）社製）のパーツを用い
て、Ｍ１３ｓｓＤＮＡのシークエンシングを本発明によ
り取得された改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに使
用酵素を置き換えて実施した。その際に得られたシーク
エンスラダーを図２に示す。比較例１では、正しくない
場所にエキストラバンドのシグナルが数多く確認される
が、改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた場
合、これらのエキストラバンドは殆ど認められないか、
あるいは認められる場合においても、正しいシグナルに
比してシグナルは弱く、実用上問題の無いレベルであっ
た。

【００３３】

【発明の効果】本発明によって取得される５’−３’エ
キソヌクレアーゼ活性の殆ど欠失したサーマス・サーモ
フィラス(Thermus thermophilus)由来の改変された耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼは、天然型の耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼに比して、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が
殆ど欠失していることより、共在するＤＮＡサンプルを
分解すること無く、種々のＤＮＡポリメラーゼを利用す
る反応において有利である。例えば、ＤＮＡシークエン
シングにこの改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使
用することにより、天然型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
を用いる場合に比べエキストラバンドの減少・エキスト
ラバンドシグナルの低下が認められ、ＤＮＡシークエン
シング効率・精度の向上がもたらされる。特に従来のＤ
ＮＡシークエンシング法より、酵素とＤＮＡサンプルが
活性化条件で混在する時間の長いサイクルシークエンシ
ング法においては、その効果は顕著である。

【００３４】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３２２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： genomic DNA 起源 生物名：サーマス サーモフィラス(Thermus thermophi
lus) 株名：ＨＢ８（ＡＴＣＣ２７６３４） TCTAGAGGAA GCATGAGCCT CACCCTGGCA GACAAGGTGG TCTACGAGGA GGAGATCCAG 60 AAAAGCCGCT TCATCGCCAA GGCGGCCCCC GTGGCCTCGG AGGAGGAGGC CTTGGCGTTT 120 TTGGCCGAGA ACCGGGAGCC TGAGGCCACC CACAACGGCC ACGCCTACAA GATCGGCCTC 180 CTCTACCGCT TCTCTGACGA CGGGGAGCCC TCGGGCACCG CAGGCAGGCC CATCCTCCAC 240 GCCATAGAGG CCCAGGGCCT GGACCGGGTG GCGGTCCTGG TGGTGCGCTA CTTCGGCGGG 300 GTGAAGCTCG GGGCCGGGGG GCTTGTGCGG GCCTACGGGG GGGTGGCGGC GGAGGCCTTA 360 AGGCGGGCGC CCAAGGTCCC CTTGGTGGAG CGGGTGGGGC TCGCCTTCCT CGTGCCCTTC 420 GCCGAGGTGG GCCGGGTCTA CGCCCTCCTG GAGGCCCGCG CCCCTGAAGG CCGAGGAGAC 480 CTACACCCCG GAGGCGTGCG CTTCGCCCTC CTCCTCCCCA AGCCCGAGCG GGAAGGTTTC 540 CTCAGGGCGC TCCTGGACGC CACCCGGGGA CAGGTGGCCC TGGAGTAGC ATG GAG 595 Met Glu 1 GCG ATG CTT CCG CTC TTT GAA CCC AAA GGC CGG GTC CTC CTG GTG GAC 643 Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val Asp 5 10 15 GGC CAC CAC CTG GCC TAC CGC ACC TTC TTC GCC CTG AAG GGC CTC ACC 691 Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly Leu Thr 20 25 30 ACG AGC CGG GGC GAA CCG GTG CAG GCG GTC TAC GGC TTC GCC AAG AGC 739 Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys Ser 35 40 45 50 CTC CTC AAG GCC CTG AAG GAG GAC GGG TAC AAG GCC GTC TTC GTG GTC 787 Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe Val Val 55 60 65 TTT GAC GCC AAG GCC CCC TCC TTC CGC CAC GAG GCC TAC GAG GCC TAC 835 Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu Ala Tyr 70 75 80 AAG GCG GGG AGG GCC CCG ACC CCC GAG GAC TTC CCC CGG CAG CTC GCC 883 Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala 85 90 95 CTC ATC AAG GAG CTG GTG GAC CTC CTG GGG TTT ACC CGC CTC GAG GTC 931 Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu Glu Val 100 105 110 CCC GGC TAC GAG GCG GAC GAC GTT CTC GCC ACC CTG GCC AAG AAG GCG 979 Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys Lys Ala 115 120 125 130 GAA AAG GAG GGG TAC GAG GTG CGC ATC CTC ACC GCC GAC CGC GAC CTC 1027 Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg Asp Leu 135 140 145 TAC CAA CTC GTC TCC GAC CGC GTC GCC GTC CTC CAC CCC GAG GGC CAC 1075 Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu Gly His 150 155 160 CTC ATC ACC CCG GAG TGG CTT TGG GAG AAG TAC GGC CTC AGG CCG GAG 1123 Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro Glu 165 170 175 CAG TGG GTG GAC TTC CGC GCC CTC GTG GGG GAC CCC TCC GAC AAC CTC 1171 Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp Asn Leu 180 185 190 CCC GGG GTC AAG GGC ATC GGG GAG AAG ACC GCC CTC AAG CTC CTC AAG 1219 Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 195 200 205 210 GAG TGG GGA AGC CTG GAA AAC CTC CTC AAG AAC CTG GAC CGG GTA AAG 1267 Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Val Lys 215 220 225 CCA GAA AAC GTC CGG GAG AAG ATC AAG GCC CAC CTG GAA GAC CTC AGG 1315 Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp Leu Arg 230 235 240 CTC TCC TTG GAG CTC TCC CGG GTG CGC ACC GAC CTC CCC CTG GAG GTG 1363 Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 GAC CTC GCC CAG GGG CGG GAG CCC GAC CGG GAG GGG CTT AGG GCC TTC 1411 Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg Ala Phe 260 265 270 CTG GAG AGG CTG GAG TTC GGC AGC CTC CTC CAC GAG TTC GGC CTC CTG 1459 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 290 GAG GCC CCC GCC CCC CTG GAG GAG GCC CCC TGG CCC CCG CCG GAA GGG 1507 Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 295 300 305 GCC TTC GTG GGC TTC GTC CTC TCC CGC CCC GAG CCC ATG TGG GCG GAG 1555 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp Ala Glu 310 315 320 CTT AAA GCC CTG GCC GCC TGC AGG GAC GGC CGG GTG CAC CGG GCA GCA 1603 Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg Ala Ala 325 330 335 GAC CCC TTG GCG GGG CTA AAG GAC CTC AAG GAG GTC CGG GGC CTC CTC 1651 Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly Leu Leu 340 345 350 GCC AAG GAC CTC GCC GTC TTG GCC TCG AGG GAG GGG CTA GAC CTC GTG 1699 Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp Leu Val 355 360 365 370 CCC GGG GAC GAC CCC ATG CTC CTC GCC TAC CTC CTG GAC CCC TCC AAC 1747 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 375 380 385 ACC ACC CCC GAG GGG GTG GCG CGG CGC TAC GGG GGG GAG TGG ACG GAG 1795 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 390 395 400 GAC GCC GCC CAC CGG GCC CTC CTC TCG GAG AGG CTC CAT CGG AAC CTC 1843 Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg Asn Leu 405 410 415 CTT AAG CGC CTC GAG GGG GAG GAG AAG CTC CTT TGG CTC TAC CAC GAG 1891 Leu Lys Arg Leu Glu Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr His Glu 420 425 430 GTG GAA AAG CCC CTC TCC CGG GTC CTG GCC CAC ATG GAG GCC ACC GGG 1939 Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 450 GTA CGG CGG GAC GTG GCC TAC CTT CAG GCC CTT TCC CTG GAG CTT GCG 1987 Val Arg Arg Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu Leu Ala 455 460 465 GAG GAG ATC CGC CGC CTC GAG GAG GAG GTC TTC CGC TTG GCG GGC CAC 2035 Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 470 475 480 CCC TTC AAC CTC AAC TCC CGG GAC CAG CTG GAA AGG GTG CTC TTT GAC 2083 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 GAG CTT AGG CTT CCC GCC TTG GGG AAG ACG CAA AAG ACA GGC AAG CGC 2131 Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 TCC ACC AGC GCC GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG GAG GCC CAC CCC ATC 2179 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 530 GTG GAG AAG ATC CTC CAG CAC CGG GAG CTC ACC AAG CTC AAG AAC ACC 2227 Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr 535 540 545 TAC GTG GAC CCC CTC CCA AGC CTC GTC CAC CCG AGG ACG GGC CGC CTC 2275 Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 550 555 560 CAC ACC CGC TTC AAC CAG ACG GCC ACG GCC ACG GGG AGG CTT AGT AGC 2323 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 TCC GAC CCC AAC CTG CAG AAC ATC CCC GTC CGC ACC CCC TTG GGC CAG 2371 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 AGG ATC CGC CGG GCC TTC GTG GCC GAG GCG GGT TGG GCG TTG GTG GCC 2419 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val Ala 595 600 605 610 CTG GAC TAT AGC CAG ATA GAG CTC CGC GTC CTC GCC CAC CTC TCC GGG 2467 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 615 620 625 GAC GAA AAC CTG ATC AGG GTC TTC CAG GAG GGG AAG GAC ATC CAC ACC 2515 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile His Thr 630 635 640 CAG ACC GCA AGC TGG ATG TTC GGC GTC CCC CCG GAG GCC GTG GAC CCC 2563 Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 CTG ATG CGC CGG GCG GCC AAG ACG GTG AAC TTC GGC GTC CTC TAC GGC 2611 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 ATG TCC GCC CAT AGG CTC TCC CAG GAG CTT GCC ATC CCC TAC GAG GAG 2659 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 690 GCG GTG GCC TTT ATA GAG CGC TAC TTC CAA AGC TTC CCC AAG GTG CGG 2707 Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 695 700 705 GCC TGG ATA GAA AAG ACC CTG GAG GAG GGG AGG AAG CGG GGC TAC GTG 2755 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr Val 710 715 720 GAA ACC CTC TTC GGA AGA AGG CGC TAC GTG CCC GAC CTC AAC GCC CGG 2803 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn Ala Arg 725 730 735 GTG AAG AGC GTC AGG GAG GCC GCG GAG CGC ATG GCC TTC AAC ATG CCC 2851 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 GTC CAG GGC ACC GCC GCC GAC CTC ATG AAG CTC GCC ATG GTG AAG CTC 2899 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 770 TTC CCC CGC CTC CGG GAG ATG GGG GCC CGC ATG CTC CTC CAG GTC CAC 2947 Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 775 780 785 GAC GAG CTC CTC CTG GAG GCC CCC CAA GCG CGG GCC GAG GAG GTG GCG 2995 Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu Val Ala 790 795 800 GCT TTG GCC AAG GAG GCC ATG GAG AAG GCC TAT CCC CTC GCC GTG CCC 3043 Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 CTG GAG GTG GAG GTG GGG ATG GGG GAG GAC TGG CTT TCC GCC AAG GGT 3091 Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Gly 820 825 830 TAGGGGGGCC CTGCCGTTTA GAGGAAGTTC AAGGGGTTGT CCCTCAGAAA CGCCTCCAGG 3151 GGAACGCCCT CTGGGCCTAC CAGGAGGCCT TTAGCCCCAA AGGTGCGGGT GAAGGCTTCC 3211 AGGCCCTGGG 3221

【図面の簡単な説明】

【図１】天然型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＭ１
３ｓｓＤＮＡのシークエンシングの結果を示す電気泳動
パターンの写真である。

【図２】本発明による改変された耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いたＭ１３ｓｓＤＮＡシークエンシングの結果
を示す電気泳動パターンの写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 岡 正則 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の性質を有する耐熱性ＤＮＡポリメ
   ラーゼ （１）作用１：鋳型とアニールしたオリゴヌクレオチド
   プライマーの３’端のヒドロキシル基に、鋳型に依存し
   たデオキシヌクレオチド５’トリフォスフェートのα−
   フォスフェートを共有結合させる反応を触媒する。 （２）作用２：５’−３’エキソヌクレアーゼ活性がほ
   とんど確認されない。 （３）基質特異性：鋳型として１本鎖ＤＮＡおよび１本
   鎖ＲＮＡを利用する事ができ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメ
   ラーゼ、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼとして作用す
   る。 （４）分子量：５６０００〜６００００ダルトン。
2. 【請求項２】 請求項１記載の耐熱性ＤＮＡポリメラー
   ゼをコードしているＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 請求項１記載の耐熱性ＤＮＡポリメラー
   ゼを用いることを特徴とするＤＮＡ塩基配列決定方法。
4. 【請求項４】 請求項２記載のＤＮＡ断片を含有する組
   換え発現ベクター。
5. 【請求項５】 宿主細胞を請求項４記載の組換え発現ベ
   クターにより形質転換して得られる形質転換体。
6. 【請求項６】 宿主細胞が大腸菌である請求項５記載の
   形質転換体。
7. 【請求項７】 請求項６記載の形質転換体を培養して、
   耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを生産させ、ついで該耐熱性
   ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性
   ＤＮＡポリメラーゼの製造法。