CN109476695A

CN109476695A - 用于测定rna翻译速率的方法

Info

Publication number: CN109476695A
Application number: CN201780039820.3A
Authority: CN
Inventors: B·B·李; J·赵
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 2016-06-27
Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2019-03-15
Also published as: US11155857B2; EP3478702A4; WO2018005283A1; US20190177782A1; EP3478702A1

Abstract

本发明提供了以快速、经济和靶向性的方式测定与核糖体结合的RNA(如mRNA)的翻译速率的方法。

Description

用于测定RNA翻译速率的方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求2016年6月27日提交的美国临时申请号62/355,122的权益。所述申请的全部内容通过引用整体并入本文。

权利声明

本发明是在国立卫生研究院授予的授权号为P50CA168504的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

发明背景

迄今为止，基因表达分析都集中在检测与基因表达相关的核酸的量，这是因为能相对容易地分离、扩增和定量核酸种类。例如，由于已经拥有了用于检测核酸的化学、酶促、扩增、杂交、测序和其他技术，因此通常能够以在成本、劳动力和时间方面有效的方式对给定时间和/或细胞状态下由细胞表达的mRNA分子(即，转录组(transcriptome))进行大规模分析。然而，越来越多的人认识到，确定细胞内核酸如mRNA的翻译状态(即，翻译组(translatome))是用于确定基因表达谱的更准确的测定方法，因为翻译组和基因表达的蛋白产物(即，蛋白质组(proteome))之间的相关性要比转录组和蛋白质组之间的相关性强的多(参见，例如，美国专利号6,013,437和8,486,865；Ingolia(2016)Cell 165:22-33；Kinget al.(2016)Brief Funct.Genomics 15:22-31；Brar and Weissman(2015)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.16:651-664；Kitchen et al.(2014)Nat.Neurosci.17:1491-1499；Gawron et al.(2014)Proteomics 14:2647-2662；Kuersten et al.(2013)WileyInterdiscip.Rev.RNA 4:617-630；Thoreen et al.(2012)Nature 485:109-113；以及Ingolia et al.(2011)Cell 147:789-802)。然而，已知的用于翻译组分析的方法，例如多聚核糖体分析和核糖体分析耗时、昂贵、费力，并且通常需要高度特异性的仪器和试剂(参见，例如，美国专利号6,013,437和8,486,865；Ingolia et al.(2012)Nat.Protoc.7:1534-1550；Ingolia et al.(2009)Science 324:218-223；Gao et al.(2015)Nat.Methods 12:147-153；Lee et al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:E2424-E2432；Gandin et al.(2014)J.Vis.Exp.87:51455；Esposito et al.(2010)J.Vis.Exp.40:1948；以及Benes andCastoldi(2010)Methods 50:244-249)。因此，迫切需要以成本有效且劳动力有效的方式快速进行核酸翻译速率测定的方法，并且该方法不需要使用高度专业化的仪器或试剂。

发明概述

本发明通过使用被称为“翻译速率的靶向性分析”(Targeted Profiling ofTranslation Rate,TPTR)的方法，以成本、劳动力和时间有效的方式克服了在确定核酸翻译速率方面长期存在的困难，所述方式无需使用高度专业化的仪器或试剂。

在一个方面，本发明提供了一种确定RNA-核糖体复合物群内与核糖体结合的靶RNA丰度的方法，所述方法包括：a)通过以下步骤产生受保护的免于被试剂降解的RNA片段群，所述试剂降解不被核糖体保护的核酸：i)使所述RNA-核糖体复合物群与试剂接触，所述试剂优选地使所述核糖体在所述RNA分子的一个或多个限定区域处停留足够多的时间，从而使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留，以及ii)使所述RNA-核糖体复合物群与试剂接触，所述试剂降解不被核糖体保护的核酸；b)使用逆转录酶和至少2条逆转录引物将未降解的RNA转化为互补DNA(cDNA)，其中i)所述至少2条逆转录引物中每一条的3'部分都具有这样的序列：其与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补，并在所述逆转录酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域发生退火反应，ii)所述至少2条逆转录引物的5'部分具有与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同的序列，以及iii)所述至少2条逆转录引物中每一条的长度均为至少约6个核苷酸；c)使用正向和反向扩增引物以及DNA聚合酶通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述cDNA，以形成靶RNA的限定区域的可检测数量的扩增的cDNA，其中i)所述正向扩增引物的3'部分具有这样的序列：其与区域基本互补，所述区域与所述相应的逆转录引物的序列相比更符合所述cDNA的3'，并且其在所述DNA聚合酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述cDNA发生退火反应；ii)所述反向扩增引物的3'部分包含这样的序列：其与相应的逆转录引物的5'部分基本相同，并且在所述DNA聚合酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述cDNA的互补链或其通过延伸所述正向扩增引物而形成的扩增产物发生退火反应；和iii)所述PCR产物比所述逆转录引物的长度更长；d)用至少一种不同的正向和/或反向扩增引物重复步骤c)，以形成不同靶RNA的限定区域的可检测数目的扩增的cDNA；和e)将检测到的步骤c)的扩增的cDNA与检测到的步骤d)的扩增的cDNA进行比较，以确定所述RNA-核糖体复合物群内与核糖体结合的靶RNA的丰度。

本发明进一步提供了许多实施方案，其可以应用于本发明的任何方面和/或与本申请描述的任何其他实施方案相组合。例如，在一个实施方案中，所述RNA-核糖体复合物的所述RNA和/或所述靶RNA是信使RNA(mRNA)、非编码RNA、长非编码RNA(lncRNA)、RNA非翻译区(UTR)、假基因RNA，及其组合。在另一个实施方案中，通过裂解细胞获得所述RNA-核糖体复合物群，任选地其中用包含一种或多种去污剂的化学物质、机械破碎、超声处理和/或冷冻和解冻裂解所述细胞。在又一个实施方案中，所述细胞的形式选自下组：培养的细胞、活组织检查、新鲜细胞、FFPE经福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)细胞、石蜡化细胞和冷冻细胞。在又一个实施方案中，所述优选地使所述核糖体在所述RNA分子的一个或多个限定区域处停留的试剂是环己酰亚胺、lactimidomycin、三尖杉酯碱(harringtonine)和/或其衍生物及其组合。在另一个实施方案中，所述RNA分子的所述一个或多个限定区域选自下组：翻译起始位点和翻译终止位点。在又一个实施方案中，足以使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的时间为至少5秒。在又一个实施方案中，所述降解不被核糖体保护的核酸的试剂选自下组：DNA酶(DNase)和RNA酶(RNase)。在另一个实施方案中，使所述RNA-核糖体复合物在与RNA酶(RNase)接触之前、同时或之后与DNA酶(DNase)接触。在又一个实施方案中，所述不被核糖体保护的核酸是mRNA、非编码RNA、长非编码RNA(lncRNA)、RNA非翻译区(UTR)、假基因RNA，及其组合。在又一个实施方案中，所述不被核糖体保护的核酸是DNA和/或核糖体RNA。在另一个实施方案中，使所述RNA-核糖体复合物在与所述降解核酸的试剂接触之前与所述优选地使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的试剂接触。在又一个实施方案中，使所述RNA-核糖体复合物在与所述降解核酸的试剂接触的同时与所述优选地使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的试剂接触。在又一个实施方案中，在将所述被保护免于降解的RNA片段群转化为cDNA之前对其进行纯化。在另一个实施方案中，所述至少2条逆转录引物中每一条的3'部分均在所述一个或多个限定区域的上游30个核苷酸和下游30个核苷酸的区域内，所述3'部分与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补。在又一个实施方案中，所述基本互补的区域在所述一个或多个限定区域的上游20个核苷酸和下游20个核苷酸的区域内。在又一个实施方案中，所述基本互补的区域在所述一个或多个限定区域的上游15个核苷酸和下游15个核苷酸的区域内。在另一个实施方案中，所述至少2条逆转录引物中的每一条的3'部分均具有这样的序列：其与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补，并且具有这样的序列和/或长度：其在所述逆转录酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域发生退火反应，任选地其中所述3'部分是所述至少2条逆转录引物的3’末端。在又一个实施方案中，所述至少2条逆转录引物的5'部分具有这样的序列：其与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同，任选地其中所述5'部分是所述至少2条逆转录引物的5'末端。在又一个实施方案中，所述至少2条逆转录引物的5'部分具有与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同的序列，并且在所述至少2条逆转录引物中具有共同的序列，用于结合步骤c)所述的反向扩增引物。

在另一个实施方案中，所述至少2条逆转录引物的所述RNA结合区域长到足以结合逆转录酶。在又一个实施方案中，所述至少2条逆转录引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA。在又一个实施方案中，所述逆转录酶的活性温度为约40℃至50℃。在另一个实施方案中，所述至少2条逆转录引物中的至少1条的长度为约6至500个核苷酸。在又一个实施方案中，所述至少2条逆转录引物中的至少1条包含经修饰的碱基和/或经修饰的骨架。在又一个实施方案中，所述经修饰的骨架包含亚甲基吗啉环和二氨基磷酸酯键。在另一个实施方案中，所述至少2条逆转录引物中的至少1条包含可检测标记。在又一个实施方案中，所述至少2条逆转录引物选自下组：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40条逆转录引物。在又一个实施方案中，所述延伸温度在逆转录期间向上倾斜。在另一个实施方案中，所述PCR是实时PCR，例如定量实时PCR(qPCR)。在又一个实施方案中，所述正向和反向扩增引物与所述cDNA模板和扩增产物的结合区域长到足以结合所述DNA聚合酶。在又一个实施方案中，所述正向扩增引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA，并且所述反向扩增引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA的互补链。在另一个实施方案中，所述DNA聚合酶的活性温度至少为约50℃。在又一个实施方案中，至少1条所述正向或反向扩增引物包含经修饰的碱基和/或经修饰的骨架。在又一个实施方案中，所述经修饰的骨架包含亚甲基吗啉环和二氨基磷酸酯键。在另一个实施方案中，至少1条所述正向或反向扩增引物包含可检测标记。在又一个实施方案中，所述可检测标记是一种或多种荧光团，任选地其中所述荧光团是染料或荧光标记的核酸探针，所述染料的荧光强度和/或光谱在与双链DNA结合时发生变化。在又一个实施方案中，在PCR扩增期间所述退火和延伸循环温度在每个循环内向上倾斜。在另一个实施方案中，不对扩增的cDNA进行测序。在又一个实施方案中，所述cDNA和/或扩增的cDNA不用于产生cDNA文库。在又一个实施方案中，所述RNA-核糖体复合物、未降解的RNA、cDNA和/或扩增的cDNA不经梯度或凝胶进行大小选择。

在另一个方面，本发明提供了一种确定RNA-核糖体复合物群内与核糖体结合的靶RNA丰度的方法，所述方法包括：a)通过以下步骤产生受保护的免于被试剂降解的RNA片段群，所述试剂降解不被核糖体保护的核酸：i)使所述RNA-核糖体复合物群与试剂接触，所述试剂优选地使所述核糖体在所述RNA分子的一个或多个限定区域处停留足够多的时间，从而使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留，以及ii)使所述RNA-核糖体复合物群与试剂接触，所述试剂降解不被核糖体保护的核酸；b)使用逆转录酶和至少1条逆转录引物将未降解的RNA转化为互补DNA(cDNA)，其中i)所述至少1条逆转录引物中每一条的3'部分都具有这样的序列：其与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补，并在所述逆转录酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域发生退火反应，ii)所述至少1条逆转录引物的5'部分具有与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同的序列，以及iii)所述至少1条逆转录引物的长度为至少约6个核苷酸；c)使用正向和反向扩增引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述cDNA，以形成靶RNA的限定区域的可检测数量的扩增的cDNA，其中i)所述正向扩增引物的所述3'部分具有这样的序列：其与区域基本互补，所述区域与所述逆转录引物的序列相比更符合所述cDNA的3'，并且其在所述DNA聚合酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述cDNA发生退火反应；ii)所述反向扩增引物的3'部分包含这样的序列：其与所述逆转录引物的5'部分相同，并且在所述DNA聚合酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述cDNA的互补链或其通过延伸所述正向扩增引物而形成的扩增产物发生退火反应；和iii)所述PCR产物比所述逆转录引物的长度更长；d)用至少一种不同的逆转录引物和至少1种不同的正向和/或反向扩增引物重复步骤b)和c)，以形成不同靶RNA的限定区域的可检测数目的扩增的cDNA；和e)将步骤c)检测到的扩增的cDNA与步骤d)检测到的扩增的cDNA进行比较，以确定所述RNA-核糖体复合物群内与核糖体结合的靶RNA的丰度。

如上所述，本发明进一步提供了许多实施方案，其可以应用于本发明的任何方面和/或与本申请描述的任何其他实施方案相组合。例如，在一个实施方案中，步骤b)和c)在同一容器中进行。在另一个实施方案中，步骤b)所述的逆转录酶在步骤c)之前或期间被热灭活，并且步骤c)所述的DNA聚合酶被热激活。在又一个实施方案中，所述RNA-核糖体复合物的RNA和/或所述靶RNA是信使RNA(mRNA)、非编码RNA、长非编码RNA(lncRNA)、RNA非翻译区(UTR)、假基因RNA，及其组合。在又一个实施方案中，通过裂解细胞获得所述RNA-核糖体复合物群，任选地其中用包含一种或多种去污剂的化学物质、机械破碎、超声处理和/或冷冻和解冻裂解所述细胞。在另一个实施方案中，所述细胞的形式选自下组：培养的细胞、活组织检查、新鲜细胞、FFPE经福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)细胞、石蜡化细胞和冷冻细胞。在又一个实施方案中，优选地使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的所述试剂选自下组：环己酰亚胺、lactimidomycin、三尖杉酯碱(harringtonine)和/或其衍生物及其组合。在又一个实施方案中，所述RNA分子的所述一个或多个限定区域选自下组：翻译起始位点和翻译终止位点。在另一个实施方案中，足以使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的时间为至少5秒。在又一个实施方案中，所述降解不被核糖体保护的核酸的试剂选自下组：DNA酶(DNase)和RNA酶(RNase)。在又一个实施方案中，使所述RNA-核糖体复合物在与RNA酶(RNase)接触之前、同时或之后与DNA酶(DNase)接触。在另一个实施方案中，所述不被核糖体保护的核酸是mRNA、非编码RNA、长非编码RNA(lncRNA)、RNA非翻译区(UTR)、假基因RNA，及其组合。在又一个实施方案中，所述不被核糖体保护的核酸是DNA和/或核糖体RNA。在又一个实施方案中，使所述RNA-核糖体复合物在与所述降解核酸的试剂接触之前与所述优选地使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的试剂接触。在另一个实施方案中，使所述RNA-核糖体复合物在与所述降解核酸的试剂接触的同时与所述优选地使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的试剂接触。在又一个实施方案中，在将所述被保护免于降解的RNA片段群转化为cDNA之前对其进行纯化。在又一个实施方案中，所述至少1条逆转录引物中每一条的3'部分均在所述一个或多个限定区域的上游30个核苷酸和下游30个核苷酸的区域内，所述3'部分与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补。在另一个实施方案中，所述基本互补的区域在所述一个或多个限定区域的上游20个核苷酸和下游20个核苷酸的区域内。在又一个实施方案中，所述基本互补的区域在所述一个或多个限定区域的上游15个核苷酸和下游15个核苷酸的区域内。在又一个实施方案中，所述至少1条逆转录引物中的每一条的3'部分均具有这样的序列：其与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补，并且具有这样的序列和/或长度：其在所述逆转录酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域发生退火反应，其中所述3'部分是所述至少1条逆转录引物的3’末端。

在另一个实施方案中，所述至少1条逆转录引物的5'部分具有与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同的序列，其中所述5'部分是所述至少1条逆转录引物的5'末端。在又一个实施方案中，所述至少1条逆转录引物的5'部分具有与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同的序列，并且在所述至少1条逆转录引物中具有共同的序列，用于结合步骤c)所述的反向扩增引物。在又一个实施方案中，所述至少1条逆转录引物的RNA结合区域长到足以结合逆转录酶。在另一个实施方案中，所述至少1条逆转录引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA。在又一个实施方案中，所述逆转录酶的活性温度为约40℃至50℃。在又一个实施方案中，所述至少1条逆转录引物中的至少1条的长度为约6至500个核苷酸。在另一个实施方案中，所述至少1条逆转录引物中的至少1条包含经修饰的碱基和/或经修饰的骨架。在又一个实施方案中，所述经修饰的骨架包含亚甲基吗啉环和二氨基磷酸酯键。在又一个实施方案中，所述至少1条逆转录引物中的至少1条包含可检测标记。在另一个实施方案中，所述至少1条逆转录引物选自下组：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40条逆转录引物。在又一个实施方案中，所述延伸温度在逆转录期间向上倾斜。在又一个实施方案中，所述PCR是实时PCR，例如qPCR。在另一个实施方案中，所述正向和反向扩增引物与cDNA模板和扩增产物的结合区域长到足以结合所述DNA聚合酶。在又一个实施方案中，所述正向扩增引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA，并且所述反向扩增引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA的互补链。在又一个实施方案中，所述DNA聚合酶的活性温度至少为约50℃。在另一个实施方案中，至少1条所述正向或反向扩增引物包含经修饰的碱基和/或经修饰的骨架。在又一个实施方案中，所述经修饰的骨架包含亚甲基吗啉环和二氨基磷酸酯键。在又一个实施方案中，至少1条所述正向或反向扩增引物包含可检测标记。在另一个实施方案中，所述可检测标记是一种或多种荧光团，任选地其中所述荧光团是染料或荧光标记的核酸探针，所述染料的荧光强度和/或光谱在与双链DNA结合时发生变化。在又一个实施方案中，在PCR扩增期间所述退火和延伸循环温度在每个循环内向上倾斜。在又一个实施方案中，不对扩增的cDNA进行测序。在另一个实施方案中，所述cDNA和/或扩增的cDNA不用于产生cDNA文库。在又一个实施方案中，所述RNA-核糖体复合物、未降解的RNA、cDNA和/或扩增的cDNA不经梯度或凝胶进行大小选择。

在本发明任何方法的一些实施方案中，所述PCR产物的长度为约20至约500个碱基对。在本发明任何方法的其他实施方案中，所述PCR产物的长度为约50至约150个碱基对。在本发明任何方法的其他实施方案中，RNA-核糖体复合物群内与核糖体结合的靶RNA的丰度表明了所述靶RNA的翻译速率。

附图简述

图1显示了将本发明的步骤与核糖体分析和多聚核糖体分析方法进行比较的图。

图2显示了可用于本发明的引物设计原理的示例性示意图，其不应被解释成是限制性的。

图3显示了用mTOR抑制剂Torin-1处理了1小时的MDA-MB-468细胞中5种目的基因相对于β-肌动蛋白(ACTB)的mRNA翻译变化结果，通过本发明的核糖体分析方法测得所述结果。

图4显示了用mTOR抑制剂Torin-1处理了1小时的MDA-MB-468细胞中其他代表性目的基因相对于β-肌动蛋白(ACTB)的mRNA翻译变化结果，通过本发明的核糖体分析方法测得所述结果。

图5包括三个图，标识为图A、B和C。图A显示了采用本发明的方法，使用若干种不同细胞系跨生物重复进行的mRNA翻译测定的重现性。图B和C显示了从图A中描述的实验所得的qPCR产物的解离曲线，并且大体显示了在每个样品中形成了单个qPCR产物，并且基本上不形成其他产物，如引物二聚体。

图6提供了图3和4中所示信息的定量mRNA翻译倍数变化数据。

发明详述

本发明部分地提供了通过使用被称为“翻译速率的靶向性分析”(TPTR)的方法，以靶向性的方式针对特定目的基因测定RNA到蛋白质的翻译速率的方法。通常，本发明的TPTR方法涉及核糖体-RNA复合物，例如存在于细胞裂解物中的核糖体-RNA复合物，所述核糖体-RNA复合物经过处理能导致核糖体在RNA种类上停留，从而使得在限定区域如翻译起始位点处发生富集，其中该区域处的丰度与各个基因的翻译速率相关。实际上，诸如核糖体分析和多聚核糖体分析这样的已建立的技术清楚地证实，检测到的与核糖体相结合的RNA的量与所述核糖体的翻译活性相关，因此与RNA或其序列结合的核糖体越多，直接表明翻译活性水平越高。未被核糖体覆盖的任何核酸区域，例如mRNA、核糖体RNA、基因组DNA等，都会被降解，并且抗降解的RNA片段会被转化为互补DNA(cDNA)。可以量化源自预先限定的目的基因的片段的丰度(例如通过定量聚合酶链式反应(qPCR)量化)，作为这些基因的翻译速率的读数。将所述方法中的逆转录和/或qPCR步骤设计成特异性地作用于含有由核糖体停留剂富集的所述限定区域的那些片段。

本发明具有许多意想不到的优点。例如，本申请描述的方法能够允许以时间、成本和劳动力有效的方式确定翻译速率，而不需要高度专业化的仪器和/或试剂。此外，认为使用核糖体停留来导致核糖体在限定区域处的富集能提高逆转录和qPCR的保真度，同时保持了其在该区域处的丰度与各基因的翻译速率之间的相关性。针对这些区域设计出的基因特异性逆转录和PCR引物克服了难以用足够强的信号检测和/或扩增小核酸种类的挑战，并且同时保持了丰度和基因翻译速率之间的相关性并克服了引物二聚体的问题。最后，通过下面描述的基于概率的数学模型可知，所述方法不需要在核糖体分析中以基于凝胶的方式对RNA片段进行大小选择、生成文库以及测序，此外，也不需要在多聚核糖体分析中发生的基于梯度的裂解物组分分离。

A.生成受核糖体保护的RNA

本申请描述的方法可用于确定RNA-核糖体复合物群内与核糖体结合的靶RNA的丰度。术语“核糖体”是指熟知的核糖核蛋白颗粒，其具有小的和大的亚基，在蛋白质合成期间将RNA翻译成蛋白质。根据由模板信使RNA(mRNA)定义的序列，多个氨基酸经由肽键连接形成蛋白质。在细菌中，这些亚基的沉降系数为30和50，因此分别被称为“30S”和“50S”亚基。在真核生物中，沉降系数为40和60。虽然与待翻译的RNA相结合的核糖体(称为“RNA-核糖体复合物”)是翻译的中心结构组分，但是该术语可以进一步包括介导翻译的许多其他组分中的任何一个或多个，除其他外，尤其包括起始、延伸、终止和再循环因子、转移RNA、氨基酸、氨酰基合成酶、镁和产物多肽。

RNA翻译也称为“多肽的合成”，涉及起始、延伸和终止阶段。起始阶段始于起始复合物的形成，所述起始复合物由两个核糖体亚基、蛋白质起始因子、mRNA和起始因子tRNA组成，能识别开放阅读框的起始密码子AUG。随着以下循环的重复得以进行延伸：带电荷的tRNA结合核糖体(该步骤称为“识别”)、肽键的形成、以及易位，这些步骤涉及延伸因子和酶，例如肽基转移酶，其催化氨基酸部分添加到延长的链上。终止因子识别mRNA中的终止信号，例如碱基序列UGA，从而终止多肽的合成并从核糖体释放出多肽链和mRNA。循环因子使核糖体亚基解离，然后用于新一轮蛋白质的合成(参见，例如，Kapp et al.(2004)Annu.Rev.Biochem.73:657-704)。在真核生物中，核糖体通常附着于内质网(ER)和高尔基体区室的膜上。另外，核糖体在诸如线粒体等的细胞器以及在植物细胞、在叶绿体和在其他亚细胞区室中是有活性的。

细胞内存在许多核酸分子类型，并且某些类型(例如mRNA)与核糖体相结合。如本申请使用的术语“核酸分子”或“核酸”是指由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成的聚合物，或者合成产生的化合物(例如，在美国专利号5,948,902以及其中引用的参考文献中描述的PNA)，所述合成产生的化合物可以以类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式与天然存在的核酸杂交，例如，可以参与Watson-Crick碱基配对相互作用。本申请使用的术语“核糖核酸”和“RNA”是指由核糖核苷酸组成的聚合物。本申请使用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”是指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。术语“核苷”和“核苷酸”旨在包括这样的部分：其不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，还含有已经经过修饰的其它杂环碱基。此类修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、烷基化的核糖或其他杂环。此外，术语“核苷”和“核苷酸”包括这样的部分：其不仅含有常规核糖和脱氧核糖，而且还含有其他糖。修饰的核苷或核苷酸还包括对糖部分的修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团取代，或者被官能化为醚、胺等。在一个实施方案中，核酸分子为基因组DNA或衍生自基因组DNA，例如片段或染色体。这种基因组DNA可以包含外显子组DNA，即富含有转录序列的一小类全基因组DNA，其在基因组中含有一组外显子。在其他实施方案中，所述靶核酸包含转录组(即核酸群中(例如在细胞或细胞群中)的所有mRNA或“转录物”的集合)，翻译组(即核酸群中(例如在细胞或细胞群中)所有被翻译成蛋白质的mRNA或“转录物”的集合)，甲基化组(methylome)(即基因组中的甲基化位点群和甲基化模式)，磷酸化组(phosphorylome)等。

本领域已知有许多类型的RNA，包括mRNA、前体mRNA、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、hnRNA、snRNA、非编码RNA(例如，小非编码RNA如miRNA、前体miRNA、初级miRNA、miRNA*、抗miRNA和PIWI RNA，以及长非编码RNA(lnRNA))等。如下所述，本申请描述的方法涉及核酸的降解，所述核酸包括基因组DNA、小RNA等，其未与核糖体结合和/或没有通过与核糖体结合而被保护免于降解。

可以使用本领域熟知的方法衍生得到用于本发明所述方法的RNA-核糖体复合物。在一些实施方案中，所述RNA-核糖体复合物在体外产生，例如通过使用重组或重构的RNA和核糖体蛋白产生。在其他实施方案中，所述RNA-核糖体复合物以包含此类复合物的样品的形式从生物来源获得。在任一情况下，本申请使用的术语“样品”是泛指，并且旨在包括含有RNA-核糖体复合物的各种来源和组合物。因此，所述样品可以是生物样品，但该术语还包括其他样品，例如，包含核酸的人工样品。示例性样品包括，但不限于，全血；血液制品，如血浆或血清；红细胞；白血细胞；白细胞层(buffy coat)；拭子，包括但不限于口腔拭子、咽拭子、阴道拭子、尿道拭子、宫颈拭子、咽拭子、直肠拭子、病变拭子、脓肿拭子、鼻咽拭子等；尿；痰；唾液；精液；淋巴液；羊水；脑脊液；腹膜积液；胸腔积液；来自囊肿的液体；滑液；玻璃状液；水状液；囊液；洗眼液；眼吸出物(eye aspirates)；肺灌洗液；肺吸出物；组织，包括但不限于，肝、脾、肾、肺、肠、脑、心脏、肌肉、胰腺、细胞培养物、植物组织或样品，以及从上述样品中获得的裂解物、提取物、或材料和组分，或者可以存在于样品上或样品中的任何细胞以及微生物和病毒等。从含有核酸的临床或法医环境获得的材料也在术语“样品”的预期含义内。在一个实施方案中，可以使用来自生物来源的核酸来源，所述生物来源例如具有特定病症如癌症的受试者，和/或在特定条件下接受治疗(例如用生物过程的治疗剂或调节剂治疗)的受试者。此类样品的非限制性实例包括冷冻组织样品、新鲜组织样品、石蜡包埋样品和已保存的样品，如福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE样品)的样品或用交联固定剂(如，例如戊二醛)处理过的其他样品。

如上所述，术语“样品”还包括加工过的样品，例如保存的、固定的和/或稳定化的样品。如本申请所述，可用于根据本申请所述的本发明方法提取待片段化的核酸分子的合适样品可以含有从在应用本发明方法之前存在了1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年或更长时间的宿主生物体中回收得到的生物材料。

根据本发明的方法特别适用于使用来自于组织样品、整个组织、整个器官、体液、肿瘤解剖物、细胞培养物、细胞裂解物、细胞提取物等的RNA-核糖体复合物产生RNA翻译测定值。在一些实施方案中，所述生物样品包含或获自“细胞群”，该术语表示至少两个细胞。

此外，在一些实施方案中，生物样品和/或其中的RNA-核糖体复合物可以以任何目的组合进行合并，例如合并相同类型的和/或相同处理后的细胞，合并不同类型的和/或经过了不同处理的细胞等。

对于使用生物样品(例如全细胞或组织样品)来获得RNA-核糖体复合物的实施方案，通常有用的是从其他生物材料中提取RNA-核糖体复合物以产生RNA-核糖体复合物群用于分析。因此，在收集样品之后，可以将RNA-核糖体复合物从收集的细胞、生物液体等中释放到粗提取物中，然后进行其他的处理以制备用于后续操作的样品，例如去除未受核糖体保护的核酸、纯化、过滤、脱盐等。

可以使用公知的化学、物理或电解裂解方法从生物样品中释放出RNA-核糖体复合物。例如，化学方法通常使用裂解剂破坏细胞并从细胞中提取出RNA-核糖体复合物。通常，在使用化学提取和/或变性方法的情况下，可以通过将试剂从外部引入到样品中来掺入适当的试剂。

或者，可以使用物理方法来提取核酸并使DNA结合蛋白发生变性。例如，美国专利号5,304,487中讨论了在微通道内使用物理性突起或在腔室或通道内使用边缘尖锐的颗粒来刺穿细胞膜并提取其内容物。将这种结构与用于搅拌的压电元件组合起来可以为裂解提供合适的剪切力。在下面关于核酸片段化的内容中更详细地描述了这些元件。还可以使用更传统的细胞提取方法，例如，使用机械破碎法，采用具有受限的横截面尺寸的通道等，当样品以足够大的流动压力通过该通道时，所述受限的横截面尺寸能导致细胞裂解。

在一些实施方案中，可以通过向样品施加交流电流来进行细胞提取和污染蛋白质的变性。更具体地，使细胞样品流过微管阵列，同时在流体流上施加交流电流。在本发明的装置内可以使用多种其他方法来实现细胞裂解/提取，包括，例如，对细胞进行超声搅拌、冻融、研磨或迫使细胞通过微观几何孔径，从而使细胞经受高剪切应力，最终导致破裂。

提取后，RNA-核糖体复合物可以，但不需要，与粗提取物的其他成分(例如变性蛋白质、细胞膜颗粒、盐等)进行分离。通常通过离心、过滤、絮凝等来除去颗粒物质。可以很方便地将各种类型的滤器并入到装置中。此外，在使用化学变性方法的情况下，在进行后续步骤之前可能需要对样品进行脱盐。对样品进行脱盐和分离核酸通常可以在一个步骤中进行，例如，通过将核酸结合到固相上并洗去污染性盐或者对样品进行凝胶过滤色谱分析，将盐通过透析膜等。用于核酸结合的合适的固体支持物包括，例如，硅藻土、二氧化硅(即玻璃棉)等。合适的凝胶排阻介质也是本领域公知的，也可以很方便地并入到本发明的装置中，并且可以从例如Pharmacia和Sigma Chemical处商购获得。

可以在其他的腔室中进行分离和/或凝胶过滤/脱盐，或者，可以将特定的色谱介质并入到通向后续反应室的通道或流体通道中。或者，一个或多个流体通道或腔室的内表面本身可以被衍生化，从而提供适合于所需纯化的官能团，例如，带电基团、亲和结合基团等。

或者，脱盐方法通常可以利用DNA相对于其他成分所具有的高电泳迁移率和负电荷。电泳方法也可用于从其他细胞污染物和碎片中纯化出核酸。在一个实例中，所述装置的分离通道或腔室以流体的形式连接到两个单独的其中设置有电极(如铂电极)的“场”通道或腔室。使用适当的屏障或“捕获膜”将所述两个场通道与所述分离通道隔开，所述屏障或“捕获膜”允许电流通过但不允许核酸或其他大分子通过。所述屏障通常起到两个基本作用：首先，所述屏障将向正电极迁移的核酸保留在分离室内；以及其次，所述屏障防止与电极处的电解相关的不利效应进入反应室(例如，充当盐接界的作用)。此类屏障可包括，例如，透析膜、致密凝胶、PEI过滤器或其他合适的材料。在施加适当的电场时，样品中存在的核酸将向正电极迁移并被捕获在捕获膜上。然后通过施加适当的流体流从腔室中洗去不在膜上的样品杂质。在逆转电压后，核酸以基本上更纯的形式从膜上释放出来。场通道可以设置在分离室或通道的相同或相反侧/端部上，并且可以与本申请所述的混合成分结合使用，以确保最大的操作效率。此外，也可以将粗过滤器覆盖在屏障上，以避免颗粒物质、蛋白质或核酸对屏障造成任何污染，从而允许重复使用。

在类似的方面，通过利用能减缓或阻止其他污染物流动并且同时允许核酸更快通过的凝胶短柱或其他合适的基质或凝胶，可以利用带负电荷的核酸的高电泳迁移率来将核酸与污染物分离开来。

在一些实施方案中，可能需要提取某些种类的核酸，例如DNA或RNA，基于大小的种类(例如，基因组核酸、质粒核酸、转录核酸、小核酸、微小核酸、染色体核酸等)，基于链型的种类(例如，单链或双链核酸)，基于组成的种类(例如，cDNA或cRNA)等。可以使用用于分离所需核酸的常规技术，并且这些技术是本领域熟知的，例如在Sambrook和Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual中所公开的，以及在实施例中所描述的技术。

非限制性的示例性技术包括以下方法：使用由可以吸附核酸的二氧化硅膜、纤维素化合物膜等填充的暗盒，用乙醇沉淀或用异丙醇沉淀，用苯酚-氯仿进行提取等。此外，可以提及使用离子交换树脂、键合有疏水性取代基如十八烷基的二氧化硅载体、具有尺寸排阻效应的树脂的固相萃取柱、色谱法等方法。

本发明的方法是可靠的，从而可以对样品进行一种以上类型的和/或重复的生物样品干扰(perturbation)，以根据需要获得合适的RNA-核糖体复合物用于分析。例如，化学(例如，去污剂)裂解细胞可足以释放合适的RNA-核糖体复合物用于分析而无需增加其他操作，如大范围的流体洗涤、机械破碎、超声处理、冷冻和解冻、研磨等。

用于本发明方法的RNA-核糖体复合物，无论是纯化的，以半纯化形式存在的，还是存在于生物样品中(例如，在细胞内)的，都要进行处理，从而使得一个或多个核糖体优选地在RNA分子的一个或多个限定区域处停留。通常，核糖体停留剂在限定的区域处引起核糖体富集，使得富集程度与各自基因的翻译速率相关。与非富集区域相比，优选定量这些富集区域的丰度，这是因为在核酸扩增如定量PCR(qPCR)扩增之前具有更大的基线模板丰度，因此具有更好的定量可靠性。如下文的进一步描述，针对目的基因的富集区域序列特异性地设计逆转录和核酸扩增引物。

优先地使核糖体在RNA分子的一个或多个限定区域处停留的许多核糖体停留剂是本领域已知的。例如，环己酰亚胺(CHX)和lactimidomycin(LTM)(参见，例如，美国专利公开号2013/0096012；以及King和Gerber(2016)Brief Funct.Genomics 15:22-31)。关于核糖体定位的术语“停留”是指核糖体在RNA的特定序列和/或空间方向上的物理稳定化。关于核糖体定位的术语“优选的”是指相对于核糖体在沿RNA分子所有可能的区域上的统计学随机分布而言，在RNA分子的一个或多个限定区域处停留的核糖体的统计学显著性地富集。在一些实施方案中，可以使用p值来测定统计学显著性，例如，检测相对于不存在核糖体停留剂的条件下，在核糖体停留剂存在的条件下核糖体占据的RNA位置，并且p值为0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、或更低，例如p≤0.05。可以使用许多众所周知的统计学检验，例如学生t检验。例如，CHX和LTM优选地将核糖体稳定在翻译起始位点上，并且至少CHX还优选地将核糖体稳定在翻译终止位点上。此外，三尖杉酯碱(harringtonine)特异性地使核糖体停留在翻译起始位点上。因此，例如，在存在CHX的条件下的RNA-核糖体复合物群能证明在翻译起始位点(例如，起始密码子)处停留的核糖体数量和在翻译终止位点(例如，终止密码子)处停留的核糖体数量统计学显著性地增加。根据本发明的方法，还考虑使用与核糖体停留相关的此类化合物的化学衍生物如高三尖杉酯碱(homoharringtonine)。根据本发明的方法，还考虑使用不会引起核糖体与RNA分离的任何已知的翻译扫描、起始、延伸或终止停留剂。

特别地，已知CHX与大核糖体亚基的出口(E)位点结合，并靠近脱酰基tRNA的3'羟基通常结合的位置，从而防止脱酰基tRNA从所述(E)位点释放出来并阻断后续的核糖体易位(美国专利公开号2013/0096012；Schneider-Poetsch et al.(2010)Nat.Chem.Biol.6:209-217；和Klinge et al.(2011)Science 334:941-948)。因此，CHX在肽延伸期间而非在5'UTR扫描期间导致核糖体停留，从而使得核糖体在翻译起始位点累积。还已知LTM优选地以不同于CHX的机制作用于起始核糖体，因为LTM在脱酰基tRNA存在时不与(E)位点结合，而是仅在起始步骤期间结合，在所述起始步骤中引发剂tRNA直接进入能被LTM接近的肽基(P)位点以及空(E)位点(Ju et al.(2009)J.Am.Chem.Soc.131:1370-1371；Sugawara et al.(1992)J.Antibiot.45:1433-1441；Schneider-Poetsch et al.(2010)Nat.Chem.Biol.6:209-217；以及Steitz(2008)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.9:242-253)。

在一些实施方案中，可以使用一般的核糖体停留剂来引起位于活跃翻译的RNA上的核糖体的全面富集。当目的RNA区域足量并且结合本申请所述的RNA扩增技术时，在相对于也含有核糖体的RNA其他区域不存在一个或多个目的RNA区域的特异性富集的情况下，仍然可以检测到目的RNA区域的靶向性分析。例如，依米丁和氯霉素是公知的核糖体停留剂。类似地，可以通过交联将核糖体稳定在翻译后的RNA区域上。术语“交联”是指分子的共价结合。用于进行交联的试剂是本领域公知的，并且包括，例如，物理方法如热或紫外线辐射，以及化学方法如使用甲醛、多聚甲醛或其它已知的化学交联剂。

可以在与任何生物样品裂解剂接触之前和/或同时，使RNA-核糖体复合物与一种或多种核糖体停留剂接触。类似地，可以在与核酸降解剂接触之前和/或同时，使RNA-核糖体复合物与一种或多种核糖体停留剂接触。使RNA-核糖体复合物与一种或多种核糖体停留剂接触足够长的时间以使核糖体停留。这种接触的时间长度可以是，但不限于，约5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟或更长，或两者之间的任何范围(包括端值)，例如约15秒至约3分钟。

除非另有说明，否则本申请使用的术语“约”是指所列举的值和所述列举的值上下浮动10％的范围。在一些实施方案中，所述范围可以在所列举的值的9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低的范围内。

对于其中的核糖体在所结合的RNA的一个或多个限定区域处停留并且可能富集的RNA-核糖体复合物，也可以使其与核酸降解剂接触。所述核酸降解剂降解未被结合的核糖体空间保护的核酸，并保留被结合的核糖体空间保护的RNA。本领域已知许多核酸降解处理方式，包括热降解、酸水解和酶消化。例如，热降解涉及基于热的核酸片段化。在一个实施方案中，可以使用80℃、85℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃或更高的温度。孵育时间可以在几秒至几分钟至几小时的范围内。对于基于机械破碎的片段化，可以使用用玻璃球、不锈钢球、氧化锆球等切割核酸的方法。通常，通过机械方法(例如，雾化、超声处理和方法)降解多核苷酸分子会导致片段具有钝端以及3'-和5'-突出末端的异质性混合。在一些实施方案中，可能需要使用本领域已知的方法或试剂盒(例如Lucigen DNA终止子End Repair Kit^TM)来修复片段末端以产生最适于插入如克隆载体的钝位点的末端。

在一个实施方案中，使用酶促降解，其涉及使用核酸裂解酶，例如脱氧核糖核酸内切酶DNA酶，如DNA酶I；脱氧核糖核酸外切酶，例如脱氧核糖核酸外切酶I、III、6和8；核糖核酸内切酶，如RNA酶A、H.III、L、P、PhyM、T1、T2 U2和V；以及核糖核酸外切酶，如PNP酶、RNA酶PH、R、D、T、寡核糖核酸酶、核糖核酸外切酶I和核糖核酸外切酶II；或其任意组合。例如，当希望降解基因组DNA和暴露的RNA种类时，可以使用一种或多种脱氧核糖核酸酶和一种或多种核糖核酸酶的组合。可以用各种酶量、孵育条件、孵育温度、孵育缓冲液、孵育时间和孵育长度进行核酸降解，使得不受核糖体保护的核酸分子被降解至平均长度为约100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1，或介于两者之间的任意范围(包括端值)，例如约1至约20个核苷酸。在一些实施方案中，所述方法可以接受较低的降解效率，例如将核酸降解至50-100个核苷酸的长度(特别是对于高度翻译基因的基因组DNA区域)。预期受核糖体保护的RNA分子也被降解至约25至35个核苷酸的长度，例如28、29或30个核苷酸，这是核糖体保护的足迹(footprint)。此外，核糖体足迹(ribosome footprint)可能会被部分地降解，从而使得进入逆转录的最终RNA长度大于足迹大小。如下面描述的数学模型所证实的，根据本发明的方法允许这种部分降解。

在某些实施方案中，在将被保护免于核酸降解的RNA片段群用于下游加工之前对其进行纯化。用于核酸纯化的合适的方法是本领域公知的并且可商购获得(例如，和RNA沉淀方法、基于硅胶柱的方法、凝胶纯化方法等)，并且在上文中有描述。

B.检测受核糖体保护的RNA

与特别需要费力、昂贵且耗时的步骤(如大小选择、生成文库、梯度分离)的传统翻译组分析方法不同的是，本发明的方法通过转化为互补DNA(cDNA)和基于寡核苷酸的cDNA扩增(例如，使用聚合酶链式反应(PCR)如定量PCR(qPCR)等步骤)来检测受核糖体保护的RNA。具体地，通过逆转录(RT)将所述受核糖体保护的RNA转化为第一链cDNA，并将得到的cDNA作为模板用于基于寡核苷酸的扩增和检测方法中。

在一些实施方案中，RT、扩增和检测步骤在同一容器中进行。在其他实施方案中，RT在与扩增和检测步骤分开的容器中进行。下面进一步描述本发明的两种变化形式。

术语“逆转录酶活性”和“逆转录”是指一类聚合酶的酶活性，所述聚合酶的特征在于其是RNA依赖性的DNA聚合酶，其可以使用RNA链作为模板合成DNA链(即cDNA)。“逆转录PCR”或“RT-PCR”是这样的PCR反应：其使用RNA模板和逆转录酶，或具有逆转录酶活性的酶，在DNA依赖性DNA聚合酶引物延伸的多个循环之前首先产生单链DNA分子。多重PCR是指这样的PCR反应：其在单个反应中产生多于一种的扩增产物，通常通过在单个反应中包含两种以上的引物进行。类似地，多重逆转录是指在单个反应中产生一种以上类型的cDNA的逆转录反应，通常通过在单个反应中包含一种以上的逆转录引物进行。

示例性的逆转录酶包括，但不限于，美国专利号4,943,531中所述的莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(M-MLV)RT，美国专利号5,405,776中所述的一种缺乏RNA酶H活性的M-MLV-RT的突变形式，美国专利号7,883,871中公开的牛白血病病毒(BLV)RT、劳氏肉瘤病毒(RSV)RT、禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)RT和逆转录酶。

在一些实施方案中，逆转录酶和PCR在一种叫作逆转录PCR的程序中进行，其可以以终点或实时测定的形式进行。它涉及两种单独的分子合成：(i)从RNA模板合成cDNA；和(ii)通过PCR扩增复制新合成的cDNA。为了解决通常与逆转录PCR相关的技术问题，已经在考虑了该程序的三个基本步骤的条件下开发出了许多方案：(a)RNA变性和反向引物杂交；(b)cDNA合成；以及(c)PCR扩增。在所谓的“非偶联的”逆转录PCR程序(例如，两步法逆转录PCR)中，使用针对逆转录酶活性的最佳缓冲条件，以独立的步骤进行逆转录。在cDNA合成后，除了其他条件之外，将反应中的MgCl₂和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的浓度调节至最适合DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的DNA聚合酶活性的条件，并根据标准条件进行PCR(参见美国专利号4,683,195和4,683,202)。相反，“偶联的”RT PCR方法使用针对逆转录酶和DNA聚合酶活性而优化过的通用缓冲液。在一个实施方案中，反向引物的退火是在添加酶之前的单独的步骤，然后再将所述酶加入到单个反应容器中。在另一个版本中，逆转录酶活性是热稳定的Tth DNA聚合酶的组分。在存在Mn²⁺的条件下进行退火和cDNA合成，然后在用螯合剂除去了Mn²⁺后，在不存在Mn²⁺的情况下进行PCR。最后，“连续性的”方法(例如，一步法逆转录PCR)将三个逆转录PCR步骤整合到单个连续反应中，这样就避免了打开反应管来添加组分或酶。连续性逆转录PCR被描述为是利用热稳定的Taq DNA聚合酶和Tth聚合酶的逆转录酶活性的单酶系统，并被描述为利用AMV RT和Taq DNA聚合酶的双酶系统，其中可以省略掉最开始的65℃ RNA变性步骤。

一步法逆转录PCR与非偶联逆转录PCR相比具有几个优势。一步法逆转录PCR与非偶联逆转录-PCR相比，需要对反应混合物试剂和核酸产物进行的处理更少(例如，非偶联逆转录-PCR需要在两个反应步骤之间打开反应管来添加组分或酶)，因此没有那么费力，从而减少了所需的人工小时数。一步法逆转录PCR需要的样品也更少，并降低了污染的风险。一步法逆转录PCR的灵敏度和特异性已被证明非常适合于研究给定样品中一个至几个基因的表达水平。通常，该方法限于使用基因特异性引物来启动cDNA的合成。在此类方法中，可以在DNA聚合酶热活化之前或期间对逆转录酶进行热灭活。

无论逆转录以及核酸扩增和/或检测是在不同的容器中独立地进行，还是在同一容器中连续地进行，根据下文进一步讨论的寡核苷酸参数，都可以使用许多不同类型的核酸扩增技术。例如，在一些实施方案中，可以通过多种方法完成核酸扩增。聚合酶链式反应(PCR)及其变化形式是最常用于扩增特定靶DNA序列的方法，虽然在一些实施方案中也可以使用其他技术，例如，基于核酸序列的扩增(NASBA)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)反应、转录介导的扩增(TMA)反应和滚环扩增(RCA)。

PCR通常是指用于在体外扩增所需核苷酸序列的方法，其涉及将摩尔过量的两种或更多种可延长寡核苷酸引物引入到包含具有所需靶序列的样品的反应混合物中，其中所述引物与所述双链靶序列的相反链互补。在存在DNA聚合酶的条件下将反应混合物进行热循环程序，从而使得双侧为DNA引物的所需靶序列得到扩增。

PCR扩增通常具有三个阶段：指数期、线性期和平台期。指数期是PCR扩增的第一阶段。在该指数期期间，反应组分是过量的。假设反应效率为100％，则每个循环的产物都精确地翻倍，并且所述反应是特异性且精确的。线性期是PCR扩增的第二阶段，在此期间反应组分被连续消耗但变得具有局限性，因此扩增变慢并且反应变得高度可变。PCR扩增的最后阶段是平台期。在平台期，反应组分不足以进行扩增，并且产生很少的产物或不产生产物。

PCR技术在许多出版物中都有描述，包括，PCR：A Practical Approach,M.J.McPherson,et al.,IRL出版社(1991),Innis等人的PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications,Academic出版社(1990)，以及PCR Technology：Principalsand Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich,Stockton出版社(1989)。PCR在许多美国专利中也有描述，包括美国专利号4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188；4,889,818；5,075,216；5,079,352；5,104,792；5,023,171；5,091,310和5,066,584。术语“PCR片段”或“逆转录PCR片段”或“扩增子”是指在特定靶核酸扩增后产生的多核苷酸分子(或统称为多个分子)。PCR片段通常是，但并不仅仅是DNA的PCR片段。PCR片段可以是单链的或双链的，或是其具有任何浓度比的混合物。PCR片段或RT-PCR片段的长度可以是约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500个核苷酸或更多，或介于两者之间的任何范围(包括端值)，例如长度为约20至约500个核苷酸，长度为约50至约150个核苷酸等。

“缓冲液”是添加到扩增反应液中的化合物，其通过调节扩增反应物的pH来改变所述扩增反应物的一种或多种组分的稳定性、活性和/或寿命(longevity)。本发明的缓冲剂与PCR扩增相容。某些缓冲剂是本领域公知的并且包括，但不限于，Tris、Tricine、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)和HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)。另外，PCR缓冲液通常可含有高达约70mM的KCl和约1.5mM或更高的MgCl₂，高达每种约50-200mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP核苷酸。本发明的缓冲液可含有添加剂以优化有效的逆转录PCR或PCR反应。

添加剂是添加到组合物中的化合物，其调节所述组合物的一种或多种组分的稳定性、活性和/或寿命(longevity)。在某些实施方案中，所述组合物是扩增反应组合物。在某些实施方案中，添加剂使污染物酶失活，稳定蛋白质折叠和/或减少聚集。可包括在扩增反应中的示例性添加剂包括，但不限于，甜菜碱、甲酰胺、KCl、CaCl₂、MgOAc、MgCl₂、NaCl、NH₄OAc、NaI、Na(CO₃)₂、LiCl、MnOAc、NMP、海藻糖、二甲基亚砜(“DMSO”)、甘油、乙二醇、二硫苏糖醇(“DTT”)、焦磷酸酶(包括，但不限于嗜酸热原体无机焦磷酸酶(“TAP”))、牛血清白蛋白(“BSA”)、丙二醇、甘氨酰胺、CHES、Percoll^TM、金精三羧酸、20、21、40、60、85、Brij 30、NP-40、Triton X-100、CHAPS、CHAPSO、Mackernium、LDAO(N-十二烷基-N、N-二甲基胺-N-氧化物)、两性洗涤剂(Zwittergent)3-10、Xwittergent 3-14、Xwittergent SB 3-16、Empigen、NDSB-20、T4G32、大肠杆菌SSB、RecA、缺口核酸内切酶、7-deazaG、dUTP、UNG、阴离子去污剂、阳离子去污剂、非离子去污剂、两性洗涤剂(zwittergent)、甾醇、渗透剂、阳离子和可能改变扩增效率的任何其他化学品、蛋白质或辅助因子。在某些实施方案中，扩增反应中包括两种或更多种添加剂。

术语“模板”或“模板核酸”是指在PCR反应或逆转录-PCR反应中用作扩增的起始材料或模板的多个核酸分子。模板核酸序列可包括天然存在的和合成的分子。示例性的模板核酸序列包括，但不限于，通过与核糖体结合而被保护免于降解的RNA。

“靶序列”、“靶DNA”或“靶RNA”或“靶核酸”或“靶核酸序列”是指待分析的模板核酸的区域。

术语“退火”和“杂交”可互换使用，并且是指一个核酸与另一个核酸的碱基配对相互作用，其导致形成双链体、三链体或其他更高级的结构。在某些实施方案中，主要的相互作用通过Watson/Crick和Hoogsteen型氢键具有碱基特异性，例如，A/T和G/C。在某些实施方案中，碱基堆积和疏水性相互作用可能也有助于双链体的稳定性。

本申请使用的用于杂交的“严格条件”是指这样的条件：在所述条件下，与靶序列具有互补性的核酸主要与所述靶序列杂交，并且基本上不与非靶序列杂交，或者，在一些实施方案中，尽管以某些方式与非靶序列杂交，但能充分地与适合用本发明所述方法进行检测的目的靶序列杂交。严格条件通常是序列依赖性的，并且因许多因素而变化。通常，序列越长，所述序列与其靶序列特异性杂交的温度就越高。严格条件的非限制性实例在Tijssen(1993),Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes第I部分,第二章“Overview of principlesof hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”,Elsevier,N.Y.中有详细的描述。当提及多核苷酸序列时，也可以想到互补的或部分互补的序列。优选地，它们能够在高度严格的条件下与参考序列杂交。通常，为了使杂交速率最大化，选择相对低严格性的杂交条件：比热熔点(Tm)低约20至25℃。通常，为使杂交序列有至少约85％的核苷酸互补性，要选择高度严格的洗涤条件，其比所述Tm低约5至15℃。为使杂交序列具有至少约70％的核苷酸互补性，要选择中等严格的洗涤条件，其比Tm低约15至30℃。高度许可性(非常低的严格性)的洗涤条件可低至Tm以下50℃，从而使得杂交序列之间具有高水平的错配。本领域技术人员应当认识到，也可以改变杂交和洗涤阶段中的其他物理和化学参数，以此来影响来自靶序列和探针序列之间特定水平的同源性的可检测杂交信号结果。通常，优选的高度严格条件包括在42℃下在50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS中孵育，或在65℃下在5xSSC和1％SDS中孵育，并在65℃下在0.2x SSC和0.1％SDS中洗涤。对于涉及核酸扩增反应中寡核苷酸结合严格性并且不涉及洗涤的应用，例如在逆转录和/或PCR测定法中，寡核苷酸的结合严格性通常取决于温度，并且当杂交温度接近于熔解温度(例如，在下面描述的熔解温度和退火温度范围内)时发生高度严格性结合。

“DNA依赖的DNA聚合酶活性”是指使用脱氧核糖核酸(DNA)作为模板来合成互补的和反向平行的DNA链的DNA聚合酶的活性。在某些实施方案中，所述核酸聚合酶是热稳定聚合酶，其可具有一种以上上述特定的催化活性。本申请使用的应用于酶的术语“热稳定的”是指这样的酶：其在升高的温度(例如，在55℃或更高的温度)下保持其生物活性，或在加热和冷却重复循环后保持其生物活性。

本申请使用的“扩增聚合酶活性”是指催化脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合的酶活性。通常，所述酶会在与靶核酸模板序列发生退火反应的引物的3'末端处开始合成，并且会朝着模板链的5'末端前进。

热稳定DNA聚合酶的非限制性实例可以包括，但不限于，从以下嗜热细菌分离得到的聚合酶：水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq聚合酶)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)(Tth聚合酶)、栖热球菌(Thermococcus litoralis)(Tli或VENT^TM聚合酶)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu或DEEPVENT^TM聚合酶)、沃斯氏热球菌(Pyrococcuswoosii)(Pwo聚合酶)和其他火球菌属、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)(Bst聚合酶)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac聚合酶)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)(Tac聚合酶)、橡胶栖热菌(Thermusrubber)(Tru聚合酶)、布氏栖热菌(Thermus brockianus)(DYNAZYME^TM聚合酶)、海栖热袍菌(Thermotoga maritime)(Tma)和栖热袍菌属(Thermotoga)(Tsp聚合酶)的其他菌属、以及嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth聚合酶)。PCR反应可含有一种以上具有互补特性的热稳定聚合酶，从而更有效地扩增靶序列。例如，可以为具有高持续合成能力(复制大核苷酸区段的能力)的核苷酸聚合酶补充另一种具有校对能力(在靶核酸序列延伸期间纠正错误的能力)的核苷酸聚合酶，从而建立起能够以高保真度复制长的靶序列的PCR反应。热稳定聚合酶可以以其野生型的形式使用。或者，可以修饰聚合酶使其含有酶的片段或含有突变，所述突变提供了能促进PCR反应的有益特性。在一个实施方案中，所述热稳定聚合酶可以是Taq DNA聚合酶。具有增强特性的Taq聚合酶的许多变体是已知的并且包括，但不限于，AmpliTaq^TM、AmpliTaq^TM、Stoffel片段、SuperTaq^TM、SuperTaq^TMplus、LA Taq^TM、LApro Taq^TM和EX Taq^TM。

受RNA保护的RNA和由其产生的相应cDNA是短核酸种类，使用标准方法难以对它们进行扩增、检测和定量。然而，本申请已经确定，根据逆转录和核酸扩增阶段的特定参数设计寡核苷酸可以克服这些困难。

术语“寡核苷酸”是指具有至少2个共价连接在一起的核苷酸的核酸分子。寡核苷酸的长度通常为约5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450个或更多的核苷酸至高达约500个核苷酸。核酸和多核苷酸是任意长度的聚合物，包括更长的长度，例如，大于500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000等。术语“核苷酸”通常是指多核苷酸的单个单位(即，单体)。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其修饰的形式。术语“寡核苷酸”包括核酸引物和探针。

本申请使用的术语“扩增引物”或“PCR引物”或“引物”是指可酶促延伸的寡核苷酸，其包含限定序列，所述限定序列被设计成以反向平行的方式与靶核酸序列的互补的、引物特异性部分杂交。因此，相对于其靶多核苷酸序列通常为摩尔过量的引物引发模板依赖性的酶促DNA合成和所述靶序列的扩增。引物延伸的发生不需要引物核酸与其模板序列具有100％的互补性；只要引物3'末端的倒数第二个碱基能够与模板核酸碱基配对，那么具有小于100％互补性的引物就足以进行杂交和聚合酶延伸。优选地，但不是必要地，PCR引物是合成的，并且通常长度为约10至约100个核苷酸。

术语“探针”包括含有特定部分的多核苷酸，所述特定部分被设计成以序列特异性的方式与特定核酸序列(例如靶核酸序列)的互补区域杂交。本发明的寡核苷酸探针的精确序列和长度部分取决于其所结合的靶多核苷酸的性质。可以改变结合位置和长度以获得用于特定实施方案的适合的退火和熔解特性。做出这种设计选择的指导可以在许多众所周知的描述实时核酸扩增技术的参考文献中找到，例如在美国专利号5,763,181；6,787,304；和7,112,422中描述的TaqMan^TM和CataCleave^TM测定法。

可以通过任何合适的方法(例如化学合成)合成和制备寡核苷酸，这一点在本领域是已知的。可以很方便地使用许多计算机程序(例如，Primer-Express)来根据下面描述的寡核苷酸设计参数设计出最佳引物组。

图2提供了非限制性的示例性示意描述，并且下面的图示将翻译起始密码子表示为RNA分子的限定区域，虽然同样的原理也可以应用于对应于核糖体停留剂的任何其他限定的目的区域(例如，翻译停止位点、茎环结构等)。除了图2中所示的本发明的实施方案，本申请还考虑和描述了其他实施方案，例如组合使用短逆转录寡核苷酸与长反向和正向PCR引物。

以下一般原理可用于设计适合根据本发明方法使用的寡核苷酸。

设计出的逆转录寡核苷酸(例如，图2中的引物A)具有3'部分(或被称为3'区域)序列，其与核糖体富集的限定区域内的序列互补。例如，所述3'区域序列与最靠近目的基因的翻译起始密码子的3'区域互补，以便进行区域特异性的逆转录。这种互补区域可以是在翻译起始密码子上游30个核苷酸(即在5'侧)和下游30个核苷酸(即在3'侧)的区域内。或者，所述区域可以是所述翻译起始密码子分别上游29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸内或与其相等，以及下游29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8个或更少的核苷酸内或与其相等，或之间的任何范围(包括端值)，例如所述翻译起始密码子的下游3个核苷酸和上游11个核苷酸。具有互补性的3'区序列还应具有等于或高于逆转录酶的活性温度的熔解温度，例如至少约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃，或其间的任何范围(包括端值)，例如在约40℃和50℃之间。引物A的5'部分(或者称为5'区域)具有这样的序列：其与下文进一步描述的反向扩增引物的3'区域基本相同，从而允许核酸扩增。该5'区域应具有等于或高于核酸扩增过程中DNA聚合酶的活性温度的熔解温度，例如至少约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃或更高，或其间的任意范围(包括端值)，例如在约50℃和65℃之间。

在一些实施方案中，预期BR(反向扩增引物)结合RT引物的RNA结合区域下游的几个核苷酸(即，进入通过逆转录反应形成的区域)，例如1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸，但条件是BF和BR之间的重合不会大到引起形成大量的引物二聚体。在此类实施方案中，鉴于核糖体足迹(ribosome footprint)的较小尺寸，因此将下游核苷酸的数量最小化。

关于本申请所述的任何核酸，例如本发明所述寡核苷酸，术语“3'区域”和“5'区域”是指相对于核酸聚合物的5'(上游)至3'(下游)组织来说，特定序列的相对方向。因此，在一个实施方案中，3'区域表示在同一核酸分子上处于另一序列下游的序列区域。在另一个实施方案中，5'区域表示在同一核酸分子上处于另一序列上游的序列区域。在一些实施方案中，3'区域或5'区域可以分别是或包含在核酸分子的3'末端或5'末端的序列。

本申请使用的有关酶的术语“活性温度”是指这样的温度：在所述温度下，酶具有足够的活性以发挥酶促功能，根据本发明的方法产生可检测的核酸分子。例如，市售的逆转录酶类通常具有足以产生大量cDNA的最佳活性，所述cDNA的量可以根据本发明方法中所使用的标准实验室技术，在约40℃和50℃之间进行检测。许多野生型和重组的逆转录酶是已知的，并且用于产生足够高的和/或最佳的酶活性、持续合成能力、最大的cDNA延伸长度等的温度和其他条件也是众所周知的，而且根据本申请所述的寡核苷酸设计参数和本发明的方法可以与寡核苷酸配对。(参见万维网，例如，promega.com/resources/pubhub/choosing-the-right-reverse-transcriptase/和sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/reverse-transcription.html)。

寡核苷酸的热熔点(Tm)是约有50％的寡核苷酸及其互补序列为双链体时的温度。可以使用本领域公知的方法从寡核苷酸序列计算出所述寡核苷酸的双链区的Tm。例如，寡核苷酸的Tm可以使用下式进行计算：Tm＝4℃ x(引物中G和C的数量)+2℃ x(引物中A和T的数量)。该公式对于具有<14个碱基的双链区的寡核苷酸是成立的，并假定该反应在存在50mM单价阳离子的条件下进行。对于具有>14个碱基的双链区的较长寡核苷酸，可以使用下式：Tm＝64.9℃+41℃ x(引物中G和C的数量-16.4)/N，其中N是引物长度。另一个常用公式则考虑了反应物的盐浓度(Rychlik和Rhoads(1989)Nucl.Acids Res.17:8543；PCR CoreSystems Technical Bulletin#TB254,Promega Corporation；Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.and Mueller,P.R.et al.(1993)In:Current Protocols in Molecular Biology 15.5,Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley and Sons,New York)：Tm＝81.5℃+16.6℃ x(log₁₀[Na⁺]+[K⁺])+0.41℃ x(％GC)-675/N，其中N是寡核苷酸中核苷酸的数量。

最复杂的Tm计算方式考虑了准确的序列和碱基堆积参数，而不仅仅是碱基组成(如在Borer et al.(1974)J.Mol.Biol.86:843；SantaLucia(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95:1460；Allawi and SantaLucia(1997)Biochem.36:10581；以及von Ahsen et al.(1999)Clin.Chem.45:2094中的描述)，为Tm＝ΔH kcal℃*MolΔS+Rln([引物]/2)-273.15℃，其中ΔH是根据螺旋起始因子进行调整的碱基堆积相互作用的焓，ΔS是根据螺旋起始因子和根据盐对系统熵的贡献进行调整的碱基堆积的熵，以及R是通用气体常数(1.987Cal/℃ mole)。如果满足以下条件，那么上述等式是成立的：i)引物不是自身互补的，ii)引物浓度远大于靶标浓度；iii)引物是“寡核苷酸”而不是长聚合物；和iv)盐对聚合物的影响与对寡核苷酸的影响显著不同。对于自身互补的寡核苷酸，等式的分母则变为ΔS+R ln([引物]/4)。如果浓度几乎相等，则等式的分母变为ΔS+R ln([引物]-[靶标]/2)。

万维网上有许多用于计算寡核苷酸的熔解温度的电子版可商购的工具(参见，例如，Integrated DNA Technologies网站上提供的OligoAnalyazer 3.1计算器)。

寡核苷酸的退火温度通常比所述寡核苷酸的Tm低约5℃，尽管它可以被确定为比所述寡核苷酸的Tm低约4.9、4.8.4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1、3.0℃或更低，或其间的任何范围(包括端值)，例如比所述寡核苷酸的Tm低约5℃至约3℃。

在一些实施方案中，在引物A的3'区域和引物A的5'区域之间提供间隔区以增加寡核苷酸的长度，使得寡核苷酸的总长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250或更多个核苷酸，或其间的任何范围(包括端值)，例如长度为约50至约150个核苷酸。相对于逆转录引物的实际长度来说，更重要的是最终的核酸扩增(例如qPCR)产物具有足够用于检测(例如使用染料检测)的长度，所述染料的荧光强度和/或光谱在与双链DNA结合时发生变化，比如双链核酸嵌入染料(如染料)。通过使用更长的正向或反向PCR引物可能能够弥补长度。例如，预期逆转录引物可以仅仅是RNA结合区域，并且通过使用长的反向和/或正向PCR引物能使核酸扩增产物的长度(例如，qPCR产物的长度)足够长，并且间隔区域将会非常短或者不存在。

核酸的扩增寡核苷酸(例如，图1中的引物BF和BR)通常也是根据某些参数进行设计，并且可以具有上述用于逆转录寡核苷酸的物理属性和/或下述物理属性(例如，相似的寡核苷酸长度；通过逆转录中的线性扩增或例如通过qPCR的指数扩增得到的相似的扩增核酸长度；相似的修饰等)。例如，引物BF具有这样的序列：其和与相应的逆转录引物的序列相比更符合cDNA的3'(即在RNA坐标上更符合5')的部分或区域互补。因此，对于引物BF的3'部分(或者称为3'区域)，考虑到它是DNA而不是RNA，它在序列上与最靠近翻译起始位点5'处的区域是相同的，以便允许通过qPCR进行区域特异性扩增。这种互补性区域可以是在翻译起始密码子上游30个核苷酸(即5'侧)和下游30个核苷酸(即3'侧)的区域内。或者，所述区域可以是所述翻译起始密码子分别上游29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸内或与其相等，以及下游0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更少的核苷酸内或与其相等，或之间的任何范围(包括端值)，例如所述翻译起始密码子的上游13个核苷酸和下游0个核苷酸。引物BF相对于引物A的相对5'位置变化导致足够小的重叠，使得在一定程度上避免形成不需要的核酸产物(如qPCR引物二聚体)，所述不需要的核酸产物会不利地降低检测和定量目的核酸扩增产物的能力。在一些实施方案中，引物A和BF所靶向的区域中的重叠小于约0、1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸，或其间的任何范围，例如1至3个核苷酸。引物BR的一些部分，例如引物BR的3'区域，与上述引物A的5'区域的一部分相同。可以将引物BF和BR的结合区域设计成在核酸扩增过程中具有等于或高于DNA聚合酶活性温度的熔解温度，例如至少为约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃或更高，或其间的任何范围(包括端值)，例如在约50℃和65℃之间。使用引物BF和BR进行核酸扩增所产生的核酸扩增产物的长度为至少约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500或更多个核苷酸，或其间的任何范围(包括端值)，例如长度在约20和约500个核苷酸之间，长度在约50和约150个核苷酸之间等。对于将荧光强度和/或光谱在与双链DNA结合时发生变化的染料(如嵌入染料)用作可检测标记而进行的核酸扩增，这种至少约50个碱基对的长度使得能可靠地检测所述标记，尽管更短的寡核苷酸也可能是可靠的。扩增寡核苷酸(如正向和反向引物)也可以在其5'末端进行延伸，例如通过掺入其他核苷酸序列进行延伸，以增加最终的扩增产物长度。

引物A(RNA结合区)和BF中的短结合区域，以及BF和BR与cDNA的结合区域及其互补链，可能会分别导致熔解温度低于制造商所建议的逆转录酶和qPCR聚合酶的最佳反应温度。因此，在一些实施方案中，可以使用倾斜的温度方案来平衡引物-模板间的去退火和酶活性效应。在一个实施方案中，对于逆转录，可以逐步地(即，倾斜地)，每步约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或更高，在不同时间间隔升高温度，如每隔1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟等，或其间的任何范围(包括端值)。例如，逆转录温度倾斜方案可以以40℃、42℃、44℃、46℃、48℃和50℃这种顺序进行孵育，每个温度下孵育10分钟。类似地，对于使用PCR进行的核酸扩增，温度和其维持时间可以在每个扩增循环内逐步地(即，倾斜地)，每步约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或更高，在不同时间间隔发生变化，如每隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多秒。例如，核酸扩增方法可以在退火和延伸阶段具有50℃ 15秒，55℃ 15秒，60℃15秒和65℃45秒这种顺序的热循环方案，并在65℃步骤的后半部分进行信号检测。

在某些实施方案中，所述寡核苷酸内的互补性区域可位于所述寡核苷酸的末端，基本上位于所述寡核苷酸的末端(例如，所述同源区域的末端在所述寡核苷酸末端的约30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少的比例内)，或在所述寡核苷酸的内部。

如实施例中所述，可以合并寡核苷酸(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100个或更多个，或其间任何范围的逆转录引物，如2-5个逆转录引物和/或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100个或更多个，或其间任何范围的核酸扩增引物对，如2-5个核酸扩增引物对，所有都可以是单独的或与其他寡核苷酸一起的，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100个或更多个，或其间任何范围的寡核苷酸探针)。例如，在同一个反应中可以使用逆转录引物的混合物以进行多重逆转录。类似地，在核酸扩增反应中可以使用核酸扩增引物对的混合物，可单独使用也可与其他寡核苷酸如核酸探针进一步组合使用。此外，如果要在同一容器中进行逆转录和核酸扩增，可以使用逆转录和/或核酸扩增引物的不同组合方式。反应中寡核苷酸的组合数可以很大并且可能大至所有已知基因(例如，整个翻译组)的逆转录和/或检测。

除了上述对本发明方法有用的寡核苷酸设计的特殊考虑之外，本领域众所周知的考虑因素也可用于设计逆转录和/或核酸扩增寡核苷酸。例如，可以对用于结合靶区域的序列进行选择，使得在可能的情况下，逆转录和核酸扩增的组合效应是为了检测仅从目的基因中产生的序列的丰度。逆转录和核酸扩增中的所有互补结合区域应具有足以分别与逆转录酶和DNA聚合酶进行充分结合的长度。也可采取避免极端的GC含量、发夹环结构、二聚体形成序列等来进行寡核苷酸的设计。

互补百分比是指可以与第二核酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的核酸分子中的残基百分比(例如，10个中有5、6、7、8、9、10个，即为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。术语“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基会与第二核酸序列中相同数量的连续残基进行氢键结合。本申请使用的术语“基本上互补”是指这样的互补程度：其对于所比较的核酸序列具有至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、20、125、130、135、140、145、150或更多个核苷酸的区域(例如所比较核酸序列的整个长度)，或其间的任何范围(包括端值)，例如13-20个核苷酸，具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更高的同一性，例如100％的同一性，或者是指在严格的条件下杂交的两个核酸。通常地，除了序列互补性之外，根据本发明的方法使用的并且与靶序列基本上互补的寡核苷酸在所述方法的条件下特异性地并且主要与所述靶序列杂交，并且基本上(例如，本质上)不与非靶序列杂交。然而，鉴于在靶核酸的扩增和检测中所涉及的短杂交长度，因此在某些实施方案中，可能无法避免与非靶相似序列的杂交。如果所识别的非靶序列不会显著扰乱研究人员对靶序列的分析(例如，所述非靶序列不会进行高度翻译，所述非靶序列来自于仍然提供冗余生物学功能的不同基因等)，那么这些实施方案在本发明的范围内。

本申请使用的术语“基本上相同”是指这样的同源性程度：对于所比较的核酸序列具有至少约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、20、125、130、135、140、145、150或更多个核苷酸的区域(例如所比较核酸序列的整个长度)，或其间的任何范围(包括端值)，例如13-20个核苷酸，两个核酸序列之间具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性，例如100％的同一性。在将RNA序列与DNA序列进行比较的实施方案中，出于序列比较和同源性测定的目的，认为尿苷核苷酸与胸苷核苷酸是相同的。

在一些实施方案中，寡核苷酸可以包含一种或多种修饰，例如在3'末端、5'末端、内部、碱基内、骨架内等进行化学修饰，可单独修饰或组合修饰，从而为寡核苷酸提供新的或增强的特征，例如改善的稳定性或抗降解性(参见美国专利公开号2016/0108470)。

例如，在一个实施方案中，寡核苷酸在其3'末端进行化学修饰(例如用双脱氧核糖核苷酸进行修饰)，以阻止所述寡核苷酸参与引物延伸。例如，可以通过使用DNA聚合酶I(大肠杆菌)或T7DNA聚合酶的Klenow片段突变体(F762Y)，用双脱氧胸腺嘧啶三磷酸在寡核苷酸的3'末端进行3'末端封端(Tabor和Richardson(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6339-6343)。

在另一个实施方案中，所述寡核苷酸可以有一种或多种阻断剂。阻断剂是指核苷酸(或其衍生物)、经修饰的寡核苷酸和/或被掺入到本发明的核酸抑制剂中的一种或多种其他修饰，以防止或抑制该种核酸分子被DNA酶的活性降解或消化。

寡核苷酸可以包含可检测标记。术语“标记”、“可检测部分”、“可检测试剂”等术语是指可以通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的组合物。例如，有用的标记包括荧光染料、发光剂、放射性同位素(例如³²P、³H等)、电子致密试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原以及蛋白或可以被检测(例如，通过亲和力测定)的其他实体。术语“标签(tag)”可以与术语“标记(label)”同义使用，但通常是指基于亲和力的部分，例如，用于纯化的“组氨酸标签”，或与生物素相互作用的“链霉亲和素标签”。

可以使用本领域已知的用于将核酸或其他生物分子与标记缀合的任何方法，例如，使用在Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,Academic Press,Inc.,San Diego中描述的方法。例如，可以以非酶促方式进行标记。例如，可以使用Universal LabelingSystem^TM(ULS^TM)技术(ULS^TM阵列的CGH标记试剂盒；由Kreatech Biotechnology BV公司制造)，并且也可以使用类似技术。简而言之，ULS^TM标记是以铂(II)与核酸的稳定结合特性为基础的(van Gijlswijk et al.(2001)Expert Rev.Mol.Diagn.1:81-91)。ULS分子由与选择的可检测分子偶联的单官能铂络合物组成。可以使用替代的方法来标记RNA，例如，在Ausubel,et al,(Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley&Sons,1995)和Sambrook,et al,(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,(2001)ColdSpring Harbor,N.Y.)中所示的方法。对于荧光标记的方法，可以使用直接标记法或间接标记法。直接标记法是指这样的方法：将核酸转化为单链核酸，使短链核酸与其杂交，并且将已经与荧光物质(例如Cy染料)结合的核苷酸化合物与所述核苷酸混合，从而在一步中标记核酸。间接标记法是指这样的方法：将核酸转化为单链核酸，使短链核酸与其杂交，将具有能够与荧光物质(例如，Cy染料)结合的取代基的核苷酸化合物(例如，具有氨基烯丙基的核苷酸化合物)和天然核苷酸混合在一起，首先合成具有所述取代基的核酸，然后通过氨基烯丙基结合荧光物质(例如，Cy-染料)，从而标记所述核酸。对于将标记化合物如荧光物质引入核酸的方法，可以使用随机引物法(引物延伸法)、缺口平移法、PCR法、末端标记法等。

其他标记方法也是众所周知的。例如，随机引物法是这样的方法：将具有几个bp(碱基对)至十个以上bp的随机引物核酸进行杂交，并使用聚合酶同时进行扩增和标记，从而合成标记的核酸。缺口平移法是这样的方法：例如，对已经用DNA酶I引入了缺口的双链核酸施加DNA聚合酶的作用以分解DNA，并同时利用聚合酶活性合成标记的核酸。PCR方法是这样的方法：制备出两种引物，并使用所述引物进行PCR反应，从而同时进行扩增和标记以获得标记的核酸。末端标记法是这样的方法：在标记5'末端的方法中，通过与T4多核苷酸激酶进行磷酸化反应，将标记化合物如荧光物质并入经碱性磷酸酶去磷酸化的核酸的5'末端中。标记3'末端的方法是这样的方法：将标记化合物如荧光物质加入到具有末端转移酶的核酸的3'末端。对于标记的样品核酸等，也可以使用含有其的非纯化溶液。对于使用这种非纯化溶液的情况，酶等仍然残留在所述溶液中，因此，在制备后，优选使所述溶液中残留的酶失活。其基本观点是防止对数据的再现性产生影响。对于使酶失活的方法，任何方法都是可能的，只要它们能使酶失活即可，但是优选在添加螯合剂或者60℃或更高温度下进行加热处理方法中选择任何一种或两种。加热温度优选为60℃或更高。加热时间为足够1分钟或更长，且最优选地，优选在65℃或更高温度下进行加热处理5分钟或更长时间。此外，对于使用Klenow片段的标记方法的情况，还可以通过使用涡旋混合器等使酶失活。

“标记的”分子(例如，核酸、蛋白质或抗体)是这样的分子：其通过接头或化学键共价地，或通过离子、范德华力、静电或氢键非共价地与标记物结合，使得可以通过检测与所述分子结合的标记物的存在来检测所述分子的存在。来自标记物的信号可以指示被标记的分子的量。

其中一种标记物是荧光染料。本申请使用的“荧光染料”是指这样一种荧光化合物：其在被比发射出的光波长更短的光激发时发射出光。术语“荧光的供体”或“荧光供体”是指这样一种荧光染料：其发射出的光用本发明中描述的测定法测定。更具体地，荧光供体提供能被荧光受体吸收的能量。术语“荧光的受体”或“荧光受体”是指吸收从所述荧光供体发射出的能量的第二荧光染料或淬灭分子。所述第二荧光染料吸收从所述荧光供体发射出的能量，并且发射出比所述荧光供体发射出的光波长更长的光。所述淬灭分子吸收由所述荧光供体发射出的能量。

本发明在实践中可以使用任何发光分子，优选荧光染料和/或荧光淬灭剂，包括，例如，Alexa Fluor^TM350、Alexa Fluor^TM430、Alexa Fluor^TM488、Alexa Fluor^TM532、AlexaFluor^TM546、Alexa Fluor^TM568、Alexa Fluor^TM594、Alexa Fluor^TM633、Alexa Fluor^TM647、Alexa Fluor^TM660、Alexa Fluor^TM680、7-二乙氨基香豆素-3-羧酸、荧光素、Oregon Green488、Oregon Green 514、四甲基罗丹明、罗丹明X、德克萨斯红染料、QSY 7、QSY33、Dabcyl、FL、630/650、6501665、BODIPY二烷基氨基香豆素、Cy5.5、Cy5、Cy3.5、Cy3、DTPA(Eu³⁺)-AMCA和TTHA(Eu³⁺)AMCA。

在一个实施方案中，报告分子是衍生化的荧光有机染料，用于经由连接部分连接到探针的3'末端或5'末端。优选地，淬灭剂分子也是有机染料，其可以是或可以不是荧光的，取决于本发明的实施方案。所述淬灭剂分子可以是荧光的。通常，无论所述淬灭剂分子是荧光的还是简单地通过非辐射衰变释放出从报告分子转移的能量，所述淬灭剂的吸收带应基本上与报告分子的荧光发射带重合。在本申请中，将吸收来自激发的报告分子的能量但不以辐射的方式释放能量的非荧光淬灭剂分子称为显色分子。

示例性的报告分子-淬灭剂对可以选自呫吨(xanthene)染料(包括荧光素)和罗丹明染料。这些化合物的许多合适的形式可商购获得，它们在苯基部分上具有取代基，所述取代基可用作键合位点或键合官能团以用于连接寡核苷酸。另一组荧光化合物是萘胺，其在α或β位具有氨基。这些萘胺化合物包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐和2-对-甲苯胺基-6-萘磺酸盐。其他染料包括3-苯基-7-异氰酸基香豆素、吖啶类如9-异硫氰酸基吖啶和吖啶橙、N-(对-(2-苯并噁唑基)苯基)马来酰亚胺、苯并噁二唑、芪类、芘类等。在一个实施方案中，报告分子和淬灭剂分子选自荧光素和罗丹明染料。

如下列参考文献所示，有许多用于将报告分子或淬灭剂分子连接到寡核苷酸的5'或3'末端的连接部分和方法：Eckstein,editor,Oligonucleotides and Analogues:APractical Approach(IRL出版社,Oxford,1991)；Zuckerman et al.,Nucleic AcidsResearch,15:5305-5321(1987)(寡核苷酸上的3'硫醇基团)；Sharma et al.,NucleicAcids Research,19:3019(1991)(3'巯基)；Giusti et al.,PCR Methods andApplications,2:223-227(1993)和Fung et al.,美国专利号4,757,141(经由Aminolink^TMII的5'磷酸氨基基团，前者可从Applied Biosystems(Foster City,加州)获得)Stabinsky,美国专利号4,739,044(3'氨基烷基磷酰基基团)；Agrawal et al.,Tetrahedron Letters,31:1543-1546(1990)(经由氨基磷酸酯键的连接)；Sproat et al.,Nucleic Acids Research,15:4837(1987)(5'巯基基团)；Nelson et al.,Nucleic AcidsResearch,17:7187-7194(1989)(3'氨基基团)等。也可以通过用亚磷酰胺部分衍生化的染料在固相合成结束时方便地将罗丹明和荧光素染料连接到寡核苷酸的5'羟基上，例如，Woo等人的美国专利号5,231,191；和Hobbs,Jr.,美国专利号4,997,928。

寡核苷酸可以包含核酸亲和标签。如本申请使用的“亲和标签”可以是指肽亲和标签或核酸亲和标签。亲和标签通常是指可以与分子结合(例如，通过小分子、蛋白质、共价键结合)的蛋白质或核酸序列。亲和标签可以是非天然序列。肽亲和标签可以包含肽。肽亲和标签可以是能够作为分裂系统的一部分的标签(例如，两个无活性肽片段可以反式组合在一起形成活性亲和标签)。核酸亲和标签可以包含核酸。核酸亲和标签可以是能够选择性地结合已知核酸序列(例如，通过杂交结合)的序列。核酸亲和标签可以是能够选择性地结合蛋白质的序列。亲和标签可以与天然蛋白质融合。亲和标签可以与核苷酸序列融合。有时可以将一个、两个或多个亲和标签与天然蛋白质或核苷酸序列融合。可以使用体外或体内转录的方法将亲和标签引入寡核苷酸中。核酸亲和标签可以包括，例如，化学标签、结合RNA的蛋白结合序列、结合DNA的蛋白结合序列、可与亲和标记的多核苷酸杂交的序列、合成的RNA适配体或合成的DNA适配体。化学核酸亲和标签的实例可以包括，但不限于，含有生物素、荧光染料和地高辛的三磷酸核糖核酸。结合蛋白质的核酸亲和标签的实例可以包括，但不限于，MS2结合序列、U1A结合序列、茎环结合蛋白序列、boxB序列、eIF4A序列、或被RNA结合蛋白识别的任何序列。核酸亲和标记的寡核苷酸的实例可以包括，但不限于，生物素化的寡核苷酸、2,4-二硝基苯基寡核苷酸、荧光素寡核苷酸和与伯胺缀合的寡核苷酸。

寡核苷酸可以具有修饰的核苷(即，碱基-糖组合)。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。这类杂环碱基的两种最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是这样的核苷：其进一步包括与所述核苷的糖部分共价连接的磷酸基团。对于包括戊呋喃醇基糖的核苷，所述磷酸基团可以与所述糖的2'、3'或5'羟基部分连接。在形成寡核苷酸时，所述磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性的聚合化合物。反过来，可以将该线性聚合化合物的两个末端进一步连接起来以形成环状化合物；然而，线性化合物通常才是合适的。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，因此可以以一定的方式折叠来产生完全或部分的双链化合物。在寡核苷酸内，通常认为磷酸基团可以形成寡核苷酸的核苷间骨架。所述寡核苷酸的键或骨架可以是3'至5'的磷酸二酯键。

寡核苷酸可以包含修饰的骨架和/或修饰的核苷间键。修饰的骨架可以包括在骨架中保留了磷原子的骨架以及在骨架中不具有磷原子的骨架。其中含有磷原子的合适的修饰的寡核苷酸骨架可以包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸酯、甲基和其它烷基膦酸酯(如3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、次膦酸酯)、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、磷酰二胺、硫代磷酰胺、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、sclenophosphates和具有正常的3'-5'键的硼酸磷酸酯，2'-5'连接的类似物，以及具有反向极性的寡核苷酸骨架(其中一个或多个核苷酸间键为3'至3'，5'至5'或2'至2'键)。具有反向极性的合适的寡核苷酸可以在最3'核苷酸间键处包含单个3'至3'键(即，单个反向核苷残基，其中核碱基缺失或者在原处被羟基基团代替)。还可以包括各种盐(例如，氯化钾或氯化钠)、混合盐和游离酸形式。寡核苷酸可以包含一种或多种硫代磷酸酯和/或杂原子核苷间键，特别是-CH₂-NH-O-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-(即亚甲基(甲基亚胺基)或MMI骨架)、-CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂-和-O-N(CH₃)-CH₂-CH₂-(其中天然的磷酸二酯核苷酸间键表示为-O-P(＝O)(OH)-O-CH₂-)。

寡核苷酸可以包含吗啉基骨架结构。例如，核酸可以包含6元吗啉环以代替核糖环。在这些实施方案中的一些，磷酰二胺或其他非磷酸二酯核苷间键可以代替磷酸二酯键。

寡核苷酸可以包含由短链烷基或环烷基核苷间键形成的多核苷酸骨架，由混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键形成的多核苷酸骨架，或者由一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的多核苷酸骨架。这些可以包括具有以下部分的多核苷酸骨架：吗啉基键(其部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基和硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；核糖乙酰基骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸盐骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及其他具有混合的N、O、S和CH₂组分的骨架。

寡核苷酸可以包含核酸模拟物。术语“模拟物”可以包括这样的多核苷酸：其中只有呋喃糖环或者呋喃糖环和核苷酸间键都被非呋喃糖基团取代，仅呋喃糖环的取代物也可称为糖替代物。可以保留杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分，用于与合适的靶核酸杂交。其中一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖骨架可以被含有酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架取代。核苷酸可以保留下来，并且直接或间接地与骨架酰胺部分的氮杂氮原子结合。PNA化合物中的骨架可以包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单位，其赋予PNA含有酰胺的骨架。杂环碱基部分可以直接或间接地与骨架酰胺部分的氮杂氮原子结合。

寡核苷酸可以包含连接的吗啉基单位(即，吗啉基核酸)，所述吗啉基单位具有与吗啉环连接的杂环碱基。连接基团可以连接吗啉基核酸中的吗啉基单体单元。非离子型的基于吗啉基的寡聚化合物可以与细胞蛋白质较少地发生不需要的相互作用。基于吗啉基的多核苷酸可以是寡核苷酸的非离子型模拟物。可以使用不同的连接基团将吗啉类中的多种化合物连接起来。另一类多核苷酸模拟物可被称为是环己烯基核酸(CeNA)。可以用环己烯基环代替通常存在于核酸分子中的呋喃糖环。可以制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体，并使用亚磷酰胺化学法将其用于寡聚化合物的合成。将CeNA单体引入核酸链中能提高DNA/RNA杂交体的稳定性。CeNA寡腺苷酸可以与核酸补体形成复合物，所述复合物与天然复合物具有相似的稳定性。其他修饰可以包括锁核酸(LNA)，其中2'-羟基与糖环的4'碳原子连接，从而形成2'-C,4'-C-氧亚甲基连接键，从而形成双环糖部分。所述连接键可以是亚甲基(-CH2-)，其是桥接2'氧原子和4'碳原子的基团，其中n是1或2。LNA和LNA类似物可以与互补核酸显示出非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3至+10℃)，对3'-核酸外切降解具有稳定性，以及具有良好的溶解性。

寡核苷酸可以包含一个或多个取代的糖部分。合适的多核苷酸可以包含选自下组的糖取代基：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C₁-C₁₀烷基或C₂-C₁₀烯基和炔基。特别合适的是O((CH2)_nO)mCH₃、O(CH₂)_nOCH₃、O(CH₂)_nNH2、O(CH₂)_nnCH₃、O(CH₂)_nONH₂和O(CH₂)_nON((CH₂)_nCH₃)₂，其中n和m为从1至约10。糖取代基可选自下组：C₁-C₁₀低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、插入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学特性的基团、或用于改善寡核苷酸的药效学特性的基团、以及具有相似性质的其他取代基。合适的修饰可以包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH₂CH₂OCH₃，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE(即，烷氧基烷氧基基团)。其他合适的修饰可以包括2'-二甲氨基氧乙氧基(即，O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基团，也称为2'-DMAOE)和2'-二甲氨基乙氧基乙氧基(也称为2'-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE)(即，2'-O-CH₂O-CH₂-N(CH₃)₂)。

其他合适的糖取代基可包括甲氧基(-O-CH₃)、氨基丙氧基(-OCH₂CH₂CH₂NH₂)、烯丙基(-CH₂-CH(＝CH₂))、-O-烯丙基(-O-CH₂-CH(＝CH₂))和氟(F)。2'-糖取代基可以是在阿拉伯糖(上)位或核糖(下)位。合适的2'-阿拉伯糖修饰为2'-F。也可以在寡聚化合物上的其他位置进行类似的修饰，特别是3'末端核苷上或2'-5'连接的核苷酸中糖的3'位置以及5'末端核苷酸的5'位置。寡聚化合物也可以具有代替戊呋喃基糖的糖模拟物，如环丁基部分。

寡核苷酸还可包括核碱基(通常简称为“碱基”)修饰或取代。本申请使用的“未修饰的”或“天然的”核碱基可以包括嘌呤碱基(如腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))和嘧啶碱基(如胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。修饰的核碱基可以包括其他合成的和天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C(＝C-CH3))尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核碱基可包括三环嘧啶如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-钳位，例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(吡啶并(3',2':4,5)吡咯并(2,3-d)嘧啶-2-酮)。

杂环碱基部分可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代的杂环碱基部分，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。核碱基可用于提高多核苷酸化合物的结合亲和力。这些可包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代可使核酸双链体的稳定性增加0.6-1.2℃，并且(例如，当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时)可以是合适的碱基取代。

寡核苷酸修饰可以包括将一个或多个部分或缀合物化学连接到寡核苷酸上，所述一个或多个部分或缀合物可以增强所述寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。这些部分或缀合物可以包括与官能团(如伯或仲羟基)共价结合的缀合物基团。缀合物基团可包括，但不限于，插入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、能增强寡聚物的药效学特性的基团、以及能增强寡聚物的药代动力学特性的基团。缀合物基团可包括，但不限于，胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。能增强药效学特性的基团包括改善摄取、增强抗降解性和/或增强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。能增强药代动力学特性的基团包括改善核酸的摄取、分布、代谢或排泄的基团。缀合物部分可包括但不限于脂质部分(如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代胆固醇、脂肪族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸酯)、聚胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈酰基部分、或者十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。

在一些实施方案中，将所述核酸扩增寡核苷酸用于实时核酸扩增法中。由于扩增后扩增子的检测既费力又费时，所以已经开发出了实时的方法来在扩增过程中监测扩增，并且该方法在本领域中是众所周知的。这些方法通常使用与新合成的DNA结合的荧光标记探针，或者染料，所述染料在插入双链DNA时荧光发射增加。实时的检测方法适用于PCR检测基因组DNA或基因组RNA中的靶核酸序列。

定量PCR(qPCR)用于扩增以及同时定量一种或多种靶向核酸模板。所述量可以是拷贝的绝对量或者是当归一化为已知的DNA投入(例如，内参或外参)或其他的归一化基因(例如，管家基因如β-肌动蛋白)时的相对量。用于qPCR检测的三种常用方法是：(1)插入双链DNA的非特异性荧光染料，(2)用荧光报告分子标记的序列特异性探针，所述荧光报告分子仅在探针(例如，分子信标)杂交后才能进行检测，和(3)被PCR聚合酶水解的序列特异性探针，例如探针。qPCR与定量竞争性PCR和定量比较性PCR均兼容，前者使用针对每个靶序列的内部竞争物(internal competitor)进行归一化，后者使用样品中所包含的归一化基因或用于RT-PCR的管家基因(参见Held et al.(1996)Genome Research 6:986-994)进行归一化。

通常将探针设计成使得能够在没有靶标的情况下通过两个发色团之间的荧光共振能量转移(FRET)淬灭供体发射。当一对供体发色团(处于激发态)和受体发色团非常接近时，前者可以将能量转移给后者。这种转移通常是非辐射的并且通过偶极-偶极的耦合而发生。能充分增加发色团之间距离的任何方法都会降低FRET的效率，使得可以以辐射的方式检测到供体发色团的发射。常见的供体发色团包括FAM、TAMRA、VIC、JOE、Cy3、Cy5和德克萨斯红。对受体发色团进行选择，使得它们的激发光谱与供体的发射光谱重叠。其中一个配对的例子是FAM-TAMRA。还存在可以淬灭各类供体的非荧光受体。合适的供体-受体FRET对的其他例子是本领域技术人员已知的。可用于实时检测PCR的FRET探针的常见例子包括分子信标(例如，美国专利号5,925,517)、TaqMan^TM探针(例如，美国专利号5,210,015和5,487,972)和CataCleave^TM探针(例如，美国专利号5,763,181)。

可以使用熟知的市售仪器进行核酸扩增。例如，可以使用Applied7300实时PCR系统进行qPCR反应，其也被用于下述实施例中。该系统由热循环仪、激光器、电荷耦合器件(CCD)、相机和计算机组成。该系统在热循环仪上以96孔格式扩增样品。在扩增期间，通过光纤电缆对所有96个孔实时收集激光诱导的荧光信号，并在CCD处检测。该系统包括用于运行仪器和用于分析数据的软件。

在一些实施方案中，将检测到的目的核酸扩增产物的量与参照核酸扩增产物的量进行比较。例如，参照物可以是另一个目的实验基因或预期在样品中保持恒定的对照。对于参照，可以使用预期在样品中保持恒定的管家基因(例如，维持基本细胞功能所需的基因)。在本申请所述的方法中能用作参照的管家基因可以包括编码转录因子、转录抑制子、RNA剪接基因、翻译因子、tRNA合成酶、RNA结合蛋白、核糖体蛋白、RNA聚合酶、蛋白质加工蛋白、热休克蛋白、组蛋白、细胞周期调节因子、凋亡调节因子、癌基因、DNA修复/复制基因、碳水化合物代谢调节因子、柠檬酸循环调节因子、脂质代谢调节因子、氨基酸代谢调节因子、核苷酸合成调节因子、NADH脱氢酶、细胞色素C氧化酶、ATP酶、线粒体蛋白、溶酶体蛋白、蛋白酶体蛋白、核糖核酸酶、氧化酶/还原酶、细胞骨架蛋白、细胞粘附蛋白、通道或转运蛋白、受体、激酶、生长因子、组织坏死因子等的基因。可用于所述方法的管家基因的具体实例包括，例如，HSP90、ACTB、UBC和TUBA1B。在一些实施方案中，整个翻译组在整体上减少或增加，从而使得术语“管家基因”是指变化趋势广泛代表了大部分翻译组变化的基因。

除了相对定量以外，本发明的方法还可以包括以绝对定量的模式比较靶核酸的量，例如通过比较在单独反应中的或者在早期步骤中人工加入到样品中的靶核酸固定标准物的量来实现。

如上所述，本发明方法的一个优点是不需要对大小进行选择。以下针对RNA降解的数学模型证明了为什么测得的RNA翻译速率的倍数变化与片段大小选择无关，进而使得按照本发明的方法不需要进行大小选择。

假设给定基因具有T个转录物，其如上所述经历降解。假设在条件C下，有r_C比例的转录物在预限定区域处被足迹大小为f的核糖体保护，并且在任何给定的未被保护的核苷酸处存在降解概率p，则保留了整个预限定区域的片段(即能被qPCR检测到的片段)总数为

T·{r_c+(1-r_c)(1-p)^f}

假设对样品进行大小选择以保留所有大小为f+U或更小的片段(其中U为限定的核苷酸长度)，那么在大小选择后可检测片段的数量n_C为

n_c＝T{r_c+(1-r_c)(1-p)^f}·{p²+2(1-p)p²+3(1-p)²p²+…+(U+1)(1-p)^Up²}

n_c＝T·{r_c+(1-r_c)(1-p)^f}·{1-(1-p)^U+1(1+p+pU)}

对于两个条件C＝1和C＝2，在所述条件之间翻译的相对倍数变化为

因此，根据本发明的方法测得的翻译速率的倍数变化与所选的片段大小无关。

除了不需要对核酸进行大小选择之外，本发明的方法也不需要对核酸进行测序，或创建和/或分析由生成的cDNA形成的文库。然而，如果需要的话，可以使用这些方法和其他方法。例如，可以使用许多用于检测和分析核酸的基于核酸杂交的、基于测序的和/或基于扩增的测定法，如Southern印迹、Northern印迹、比较基因组杂交(CGH)、染色体微阵列分析(CMA)、表达分析、DNA微阵列、高密度寡核苷酸微阵列、全基因组RNA表达阵列、数字PCR(dPCR)、逆转录PCR、连接链反应(有时称为寡核苷酸连接酶扩增OLA)、循环探针技术(CPT)、链置换测定法(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)(用于环化片段)、侵入性切割测定法、nCounter分析(纳米串技术)、基因组测序、从头(denovo)测序、焦磷酸测序、聚合酶克隆(polony)测序、拷贝数变化(CNV)分析测序、小核苷酸多态性(SNP)分析、全外显子组测序、原位杂交、DNA或RNA荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)、RNA测序和表观遗传分析(如甲基化模式测序、磷酸化模式测序等)。

可以使用适于平行进行大量测序反应的所谓“下一代”测序技术。该技术包括焦磷酸测序、纳米孔测序、使用可逆终止子的单碱基延伸、基于连接的测序、单分子测序技术、大规模平行测序(MPSS)等，在例如美国专利号7,057,056；5,763,594；6,613,513；6,841,128和6,828,100，以及PCT公开申请号WO 07/121,489 A2和WO 06/084132 A2中有描述。

许多使用或检测核酸的技术也适用于阵列，这些阵列由于在密集排布的位置上发生了大量的个体反应而对尺寸变化敏感。本申请使用的“阵列”包括可寻址区域(即，特征，例如以点为形式的特征)的任何一维、二维或基本上二维(以及三维)的排布，所述可寻址区域载有核酸，特别是寡核苷酸或其合成的模拟物(即，上述定义的寡核苷酸)等。在阵列是核酸阵列的情况下，核酸可被吸附、物理吸附、化学吸附、或共价连接到阵列沿核酸链的任何一个或多个点处。基于阵列的测定法是本领域公知的，并且包括，例如，比较基因组杂交(CGH)和基于阵列的比较基因组杂交(aCGH)。

C.试剂盒

本申请的公开内容还提供了试剂盒形式，其包含包装单位，所述包装单位具有一种或多种用于产生受核糖体保护的核酸片段和/或用于如本申请所述从其衍生出的cDNA扩增的试剂。该试剂盒还可以含有以下一项或多项：缓冲液、说明书和阳性或阴性对照。试剂盒可以包括以合适的比例混合在一起的试剂的容器，用于实施本申请所述的方法。试剂容器优选含有单位量的试剂，其避免了在实施所述方法时的测量步骤。

试剂盒还可以含有用于定量实时PCR的试剂，包括但不限于，热稳定核酸聚合酶、缓冲液、荧光检测试剂和核酸扩增引物，以扩增目的实时PCR产物并允许根据本申请所述的方法定量检测靶核酸序列。

在另一个实施方案中，试剂盒的试剂还包含用于提取RNA-核糖体复合物(例如从生物样品提取的RNA-核糖体复合物)的试剂。在适用的情况下，试剂盒的试剂还可以包括用于逆转录PCR分析的试剂。

范例

通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为是限制性的。

实施例1：一种用于快速且靶向性地测定mRNA翻译速率的方法的实施方案

现有常用的用于测定mRNA翻译速率的方法(如多聚核糖体分析和核糖体分析)昂贵、冗长，并且实施起来很费力。本申请已经确定并描述了本申请所述替代方法能够克服这些问题，从而有效地测定mRNA翻译速率。这些方法在本申请中被称为“翻译速率的靶向性分析”(TPTR)方法。如本申请所述，还考虑了这些方法的变化形式，例如对方案、试剂、孵育时长等进行修改。

例如，在一些实施方案中，使用真空抽吸从在合适的条件下培养在塑料表面上的贴壁的哺乳动物细胞中除去培养基。例如，在37°和5％CO₂下，在加湿室中培养MDA-MB-468(ATCC，培养在RPMI培养基(Gibco)中，所述RPMI培养基补充有10％的胎牛血清(GeminiBioproducts)、1X GlutaMAX(Gibco)、10mM HEPES(Gibco)、1X抗生素-抗真菌剂(Gibco))，并在处理前一天以每孔(9.6cm²)(Falcon 6孔组织-培养物处理板)4ml培养基500,000个细胞进行接种，并在第二天进行处理。然后通过以下步骤得到细胞裂解物：加入补充有100μg/ml环己酰亚胺的冰冷PBS，使PBS/环己酰亚胺溶液与细胞接触约15秒，然后真空吸出所述PBS/环己酰亚胺溶液，然后与裂解缓冲液接触(每100mm细胞培养皿加300μl或与其相当的体积:面积比)，所述裂解缓冲液含有20mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl、5mM MgCl₂、1mMDTT、1mg/ml环己酰亚胺、1％v/v Triton^TMX-100、25Kunitz单位/ml DNA酶I。将裂解缓冲液机械地分散在培养皿的表面上，并将该培养皿转移到液氮中以冷冻内容物。然后将该培养皿转移到湿冰上并孵育至内容物解冻为止。然后使用细胞刮棒将细胞机械性地从培养皿表面去除。将除去的培养皿内容物转移到冰上的微量离心管中，并通过25号针头研磨10次。在冰上孵育约2至5分钟后，将研磨后的培养皿内容物在4℃下以20,000x g离心3至5分钟。回收上清液，其为澄清的裂解物，并得到适当体积的澄清裂解物(例如100μl)进行处理。

加入RNA酶I(1,000U)(每100μl裂解物中加入10μl体积)，并将混合物在4℃孵育1小时并轻轻搅拌。然后分离并纯化RNA片段。具体地，在每110μl上述反应样品中加入440μl的将混合物混合并在室温下孵育5分钟。然后，在每440μl的TRIzol混合物中加入88μl的氯仿，将所得混合物混合，然后在室温下孵育约3分钟。然后将孵育的混合物在4℃下以12,000x g离心15分钟，并回收250μl的上层水相。向回收的上层水相中加入2μl的将混合物混合，向所述混合物中加入375μl的100％异丙醇，并且也将所得的混合物混合并在干冰上或在更低的温度下孵育30分钟或更长的时间。然后将混合物转移至室温进行解冻，随后在4℃下以20,000x g离心30分钟。然后除去上清液，加入1,000μl的70％冰冷的乙醇，通过混合洗涤沉淀，然后将洗涤混合物在4℃以20,000x g离心10分钟，去除上清液，将混合物在室温下温育至沉淀物干燥为止，并将干燥的沉淀物重新悬浮在10μl水中。如果RNA纯度不够，可以加水至180μl，加入1μl的GlycoBlue，20μl的3M NaOAc，混合，加入300μl的100％异丙醇并混合，然后进行所述纯化过程。

然后逆转录RNA片段。具体地，将2μl的下述引物混合物A加入到10μl的RNA溶液中，将混合物在80℃下孵育2分钟，然后以0.3℃/秒逐渐降温，直至达到30℃的温度，然后冷却至4℃。然后加入以下组分至所述终浓度：1XIII第一链缓冲液，dNTP(每种均为500μM)，5mM DTT，20U和200UIII逆转录酶。使用温度斜坡，以40℃、42℃、44℃、46℃、48℃和50℃的顺序将混合物在每个温度下孵育10分钟，然后(a)如果不需要进行cDNA纯化的话，则在70℃孵育15分钟然后冷却至4℃，或者(b)如果需要进行cDNA纯化的话则冷却至4℃。如果需要的话，可以随后通过以下步骤分离和纯化cDNA：向每20μl逆转录反应物中加入2.2μl的1N NaOH，混合，在98℃孵育20分钟，然后冷却至4℃，并如上所述进行处理，具体为：加水至180μl，加入20μl的3M NaOAc，2μl的GlycoBlue，混合，加入300μl 100％的异丙醇，混合，然后进行上述其他步骤。

然后使用qPCR对特定cDNA种类进行定量。具体地，将cDNA溶液稀释到水中至最终体积为600μl。然后将稀释的cDNA转移到各个qPCR反应物中(每个反应物中转移6μl)，进入含有10μl 2X主反应混合物和4μl的引物混合物B(如下所述)的预混合的混合物中，并将所得的混合物混合。然后在Applied7300实时PCR系统中以以下方案进行qPCR反应：95℃ 120秒和40个循环，所述循环包括[95℃ 15秒,50℃ 15秒,55℃ 15秒,60℃ 15秒，以及65℃45秒(温度斜坡)]，其中在每个循环的最后一步检测qPCR的荧光信号。

最后，分析qPCR荧光信号以计算目的cDNA片段相对于源自参照基因的等同片段的丰度。

如上所述，使用引物(例如，DNA寡核苷酸)进行逆转录和qPCR。意外地，确定了这些引物的设计以满足几个标准，以适于扩增和定量含有源自目的特定基因的目标靶点(例如，翻译起始位点)的RNA片段丰度(图2)。一般的引物设计原则如上文所述并示于图2中。对于经mTOR抑制剂Torin-1处理了1小时的哺乳动物细胞系MDA-MB-468，用于测定其5个基因相对于参照基因的mRNA翻译速率的特异性引物序列如下表1所示。

表1：引物序列

引物混合物A含有A1至A6所有引物在水中的混合物(每种均为1μM)。引物混合物B含有两种引物的混合物，其中每种引物都以1μM存在于水中，一种引物是选自BF1至BF6的引物(取决于目的靶基因)，第二种引物是通用引物BR。在本发明的方法和核糖体分析方法(一种确定mRNA翻译速率的既定方法)之间，针对每个基因所确定的相对于参照物的翻译速率变化结果是可比较的(图3)。

实施例2：用于快速且靶向性地测定mRNA翻译速率的方法的其他实施方案

如上所述，现有常用的用于测定mRNA翻译速率的方法(如多聚核糖体分析和核糖体分析)昂贵、冗长，并且实施起来很费力。本申请已经确定并描述了本申请所述的替代方法能够克服这些问题，从而能有效地测定mRNA翻译速率。如上所述，这些方法在本申请中被称为“翻译速率的靶向性分析”(TPTR)方法。如本申请所述，还考虑了这些方法的变化形式，例如对方案、试剂、孵育时长等进行修改。

例如，在一些实施方案中，使用真空抽吸从在合适的条件下培养在塑料表面上的贴壁的哺乳动物细胞中除去培养基。例如，在37°和5％CO₂条件下，在加湿室中培养MDA-MB-468(ATCC，培养在RPMI培养基(Gibco)中，所述RPMI培养基补充有10％的胎牛血清(GeminiBioproducts)、1X GlutaMAX(Gibco)、10mM HEPES(Gibco)、1X抗生素-抗真菌剂(Gibco))和HMECs-hTERT(Clontech，培养在DMEM/F12(Gibco)中，所述DMEM/F12补充有0.6％的胎牛血清(Gemini Bioproducts)、1ng/ml的霍乱毒素(Sigma-Aldrich)、10ng/ml EGF(Sigma-Aldrich)、10μg/ml的胰岛素(Gibco)、0.5μg/ml的氢化可的松(Sigma-Aldrich)、1X抗生素-抗真菌剂(Gibco))，并在处理前一天以每孔(9.6cm²)(Falcon 6孔组织-培养物处理板)4ml培养基500,000个细胞进行接种，并在第二天进行处理。然后通过以下步骤得到细胞裂解物：加入补充有100μg/ml环己酰亚胺的冰冷PBS，使PBS/环己酰亚胺溶液与细胞接触约60秒，然后真空吸出所述PBS/环己酰亚胺溶液，然后与裂解缓冲液接触(每9.6cm²细胞培养面积加200μl或与其相当的体积:面积比)，所述裂解缓冲液具有20mM Tris(pH 7.4)、150mMNaCl、5mM MgCl₂、1mM DTT、1mg/ml环己酰亚胺、1％v/v的Triton^TMX-100。将裂解缓冲液机械地分散在培养皿的表面上，并将该培养皿转移到液氮中以冷冻内容物。然后将该培养皿转移到湿冰上并孵育至内容物解冻为止。然后使用细胞刮棒将细胞机械性地从培养皿表面去除。将除去的培养皿内容物转移到冰上的微量离心管中，并转移到液氮上以冷冻所述内容物。然后将培养皿转移到湿冰上并且孵育至内容物解冻为止，并且随后在4℃下在20,000xg离心5分钟。回收上清液，其为澄清的裂解物，使用RNA HS测定试剂盒测定RNA浓度，并将适量的澄清裂解物稀释到合适体积的裂解缓冲液(例如，100μl总体积中含有500ngRNA)中进行处理。

向每100μl稀释的裂解物中加入10μl体积的RNA酶I(1,000U)和5μl体积的TurboDNA酶(10U)，并将混合物在4℃孵育1小时并轻轻搅拌。然后分离并纯化RNA片段。具体地，在每115μl上述反应样品中加入460μl的将混合物混合并在室温下孵育5分钟。然后，在每460μl的TRIzol混合物中加入92μl的氯仿，将所得混合物混合，然后在室温下孵育约3分钟。然后将孵育的混合物在4℃以12,000x g离心15分钟，并回收250μl的上层水相。向回收的上层水相中加入2μl的(15mg/ml)，将混合物混合，向所述混合物中加入375μl的100％异丙醇，并且也将所得的混合物混合并在干冰上或在更低的温度下孵育30分钟或更长的时间。然后将混合物转移至室温进行解冻，随后在4℃以20,000x g离心30分钟。然后除去上清液，加入1,000μl的70％冰冷的乙醇，通过混合洗涤沉淀物，然后将洗涤混合物在4℃以20,000x g离心10分钟，去除上清液，将混合物在室温下孵育至沉淀物干燥为止，并将干燥的沉淀物重新悬浮在10μl水中。如果RNA纯度不够，可以加水至180μl，加入1μl的GlycoBlue，20μl的3M NaOAc，混合，加入300μl的100％异丙醇并混合，然后进行所述纯化过程。该步骤不是必需的，并且图中所示的数据并不是通过该步骤产生的。

然后逆转录RNA片段。具体地，将2μl的下述引物混合物A加入到10μl的RNA溶液中，将混合物在80℃孵育2分钟，然后以0.3℃/秒逐渐降温，直至达到30℃的温度，然后冷却至4℃。然后将以下组分加入至所述终浓度：1XIII第一链缓冲液，dNTP(每种均为500μM)，5mM DTT，20U和200UIII逆转录酶。使用温度斜坡，以40℃、42℃、44℃、46℃、48℃和50℃的顺序将混合物在每个温度下孵育10分钟，然后(a)如果不需要进行cDNA纯化的话，则在70℃孵育15分钟然后冷却至4℃，或者(b)如果需要进行cDNA纯化的话，则冷却至4℃。如果需要的话，可以随后通过以下步骤分离和纯化cDNA：向每20μl逆转录反应物中加入2.2μl的1N NaOH，混合，在98℃孵育20分钟，然后冷却至4℃，并如上所述进行处理，具体为：加水至178μl，加入20μl的3M NaOAc，2μl的GlycoBlue，混合，加入300μl的100％异丙醇，混合，然后进行上述其他步骤。对于生成图中所示数据而进行的实验，使用选项(b)。

然后使用qPCR对特定cDNA种类进行定量。具体地，将cDNA溶液稀释到水中至最终体积为500μl。然后将稀释的cDNA转移到各个qPCR反应物中(每个反应物中转移5μl)，进入含有10μl 2X主反应混合物，4μl的引物混合物B(如下所述)和1μl水的预混合的混合物中，并将所得的混合物混合。然后在Applied7300实时PCR系统中以以下方案进行qPCR反应：95℃ 120秒和40个循环，所述循环包括[95℃ 15秒,50℃ 15秒,55℃ 15秒,60℃ 15秒，以及65℃45秒(温度斜坡)]，其中在每个循环的最后一步检测qPCR的荧光信号，然后使用以下方案得到标准解离曲线：95℃ 15秒，60℃ 60秒，温度逐渐升高至高达95℃(在每次温度升高时均测定荧光)，95℃ 15秒和60℃ 15秒。

最后，分析qPCR荧光信号以计算目的cDNA片段相对于源自参照基因的等同片段的丰度，并且分析解离曲线数据以确定所形成的不同qPCR产物的数量。

如上所述，意外地，确定了用于逆转录和qPCR的引物(例如，DNA寡核苷酸)设计以满足几个标准，以适于扩增和定量含有源自目的特定基因的目标靶点(例如，翻译起始位点)的RNA片段丰度(图2)。对于经mTOR抑制剂Torin-1处理了1小时的哺乳动物细胞系MDA-MB-468，用于测定其几个基因相对于参照基因的mRNA翻译速率的特异性引物序列如下表2所示。

表2：引物序列

引物混合物A含有A1至A18所有引物的水混合物(每种均为1μM)。引物混合物B含有两种引物的混合物，其中每种引物均以1μM存在于水中，一种引物是选自BF1至BF18的引物(取决于目的靶基因)，第二种引物是通用引物BR。在本发明的方法和核糖体分析方法(一种确定mRNA翻译速率的既定方法)之间，针对每个基因所确定的相对于参照物的翻译速率变化结果是可比较的(图4和6)。另外，图5A和6表明，本发明的方法在目的细胞系的生物重复品中是可再现的。图5B-5C表明，本发明的方法通常导致在每个样品中形成单个qPCR产物，并且基本上不形成其他的产物，如引物二聚体。

以引用方式并入

本申请全文所引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请，以及附图和序列表的内容均通过引用并入本申请。

等同方式

本领域技术人员应当认识到，或能够通过使用不超过常规的实验明确本申请所述的本发明具体实施方案的许多等同方式。这些等同方式应当涵盖在以下权利要求中。

Claims

1.一种确定RNA-核糖体复合物群内与核糖体结合的靶RNA丰度的方法，所述方法包括：

a)通过以下步骤产生受保护的免于被试剂降解的RNA片段群，所述试剂降解不被核糖体保护的核酸：

i)使所述RNA-核糖体复合物群与试剂接触，所述试剂优选地使所述核糖体在所述RNA分子的一个或多个限定区域处停留足够多的时间，从而使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留，以及

ii)使所述RNA-核糖体复合物群与试剂接触，所述试剂降解不被核糖体保护的核酸；

b)使用逆转录酶和至少2条逆转录引物将未降解的RNA转化为互补DNA(cDNA)，其中

i)所述至少2条逆转录引物中每一条的3'部分都具有这样的序列：其与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补，并在所述逆转录酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域发生退火反应，

ii)所述至少2条逆转录引物的5'部分具有与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同的序列，以及

iii)所述至少2条逆转录引物中每一条的长度均为至少约6个核苷酸；

c)使用正向和反向扩增引物以及DNA聚合酶通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述cDNA，以形成靶RNA的限定区域的可检测数量的扩增的cDNA，其中

i)所述正向扩增引物的3'部分具有这样的序列：其与区域基本互补，所述区域与所述相应的逆转录引物的序列相比更符合所述cDNA的3'，并且其在所述DNA聚合酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述cDNA发生退火反应；

ii)所述反向扩增引物的3'部分包含这样的序列：其与相应的逆转录引物的5'部分基本相同，并且在所述DNA聚合酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述cDNA的互补链或其通过延伸所述正向扩增引物而形成的扩增产物发生退火反应；和

iii)所述PCR产物比所述逆转录引物的长度更长；

d)用至少一种不同的正向和/或反向扩增引物重复步骤c)，以形成不同靶RNA的限定区域的可检测数目的扩增的cDNA；和

e)将步骤c)检测到的扩增的cDNA与步骤d)检测到的扩增的cDNA进行比较，以确定所述RNA-核糖体复合物群内与核糖体结合的靶RNA的丰度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNA-核糖体复合物的所述RNA和/或所述靶RNA是信使RNA(mRNA)、非编码RNA、长非编码RNA(lncRNA)、RNA非翻译区(UTR)、假基因RNA，及其组合。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过裂解细胞获得所述RNA-核糖体复合物群，任选地其中用包含一种或多种去污剂的化学物质、机械破碎、超声处理和/或冷冻和解冻裂解所述细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞的形式选自下组：培养的细胞、活组织检查、新鲜细胞、FFPE经福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)细胞、石蜡化细胞和冷冻细胞。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述优选地使所述核糖体在所述RNA分子的一个或多个限定区域处停留的试剂是环己酰亚胺、lactimidomycin、三尖杉酯碱(harringtonine)和/或其衍生物及其组合。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述RNA分子的所述一个或多个限定区域选自下组：翻译起始位点和翻译终止位点。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中足以使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的时间为至少5秒。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述降解不被核糖体保护的核酸的试剂选自下组：DNA酶(DNase)和RNA酶(RNase)。

9.根据权利要求8所述的方法，其中使所述RNA-核糖体复合物在与RNA酶(RNase)接触之前、同时或之后与DNA酶(DNase)接触。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述不被核糖体保护的核酸是mRNA、非编码RNA、长非编码RNA(lncRNA)、RNA非翻译区(UTR)、假基因RNA，及其组合。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述不被核糖体保护的核酸是DNA和/或核糖体RNA。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中使所述RNA-核糖体复合物在与所述降解核酸的试剂接触之前与所述优选地使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的试剂接触。

13.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中使所述RNA-核糖体复合物在与所述降解核酸的试剂接触的同时与所述优选地使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的试剂接触。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中在将所述被保护免于降解的RNA片段群转化为cDNA之前对其进行纯化。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物中每一条的3'部分均在所述一个或多个限定区域的上游30个核苷酸和下游30个核苷酸的区域内，所述3'部分与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述基本互补的区域在所述一个或多个限定区域的上游20个核苷酸和下游20个核苷酸的区域内。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述基本互补的区域在所述一个或多个限定区域的上游15个核苷酸和下游15个核苷酸的区域内。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物中的每一条的3'部分均具有这样的序列：其与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补，并且具有这样的序列和/或长度：其在所述逆转录酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域发生退火反应，任选地其中所述3'部分是所述至少2条逆转录引物的3’末端。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物的5'部分具有这样的序列：其与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同，任选地其中所述5'部分是所述至少2条逆转录引物的5'末端。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物的5'部分具有与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同的序列，并且在所述至少2条逆转录引物中具有共同的序列，用于结合步骤c)所述的反向扩增引物。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物的所述RNA结合区域长到足以结合逆转录酶。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶的活性温度为约40℃至50℃。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物中的至少1条的长度为约6至500个核苷酸。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物中的至少1条包含经修饰的碱基和/或经修饰的骨架。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述经修饰的骨架包含亚甲基吗啉环和二氨基磷酸酯键。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物中的至少1条包含可检测标记。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中至少2条逆转录引物选自下组：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40条逆转录引物。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述延伸温度在逆转录期间向上倾斜。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述PCR是实时PCR。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述实时PCR是定量实时PCR(qPCR)。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述正向和反向扩增引物与所述cDNA模板和扩增产物的结合区域长到足以结合所述DNA聚合酶。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述正向扩增引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA，并且所述反向扩增引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA的互补链。

34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述DNA聚合酶的活性温度为至少约50℃。

35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中至少1条所述正向或反向扩增引物包含经修饰的碱基和/或经修饰的骨架。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述经修饰的骨架包含亚甲基吗啉环和二氨基磷酸酯键。

37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中至少1条所述正向或反向扩增引物包含可检测标记。

38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述可检测标记是一种或多种荧光团，任选地其中所述荧光团是染料或荧光标记的核酸探针，所述染料的荧光强度和/或光谱在与双链DNA结合时发生变化。

39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中在PCR扩增期间所述退火和延伸循环温度在每个循环内向上倾斜。

40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中不对所述扩增的cDNA进行测序。

41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述cDNA和/或扩增的cDNA不用于产生cDNA文库。

42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述RNA-核糖体复合物、未降解的RNA、cDNA和/或扩增的cDNA不经梯度或凝胶进行大小选择。

43.一种确定RNA-核糖体复合物群内与核糖体结合的靶RNA丰度的方法，所述方法包括：

b)使用逆转录酶和至少1条逆转录引物将未降解的RNA转化为互补DNA(cDNA)，其中

i)所述至少1条逆转录引物中每一条的3'部分都具有这样的序列：其与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补，并在所述逆转录酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域发生退火反应，

ii)所述至少1条逆转录引物的5'部分具有与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同的序列，以及

iii)所述至少1条逆转录引物的长度为至少约6个核苷酸；

c)使用正向和反向扩增引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述cDNA，以形成靶RNA的限定区域的可检测数量的扩增的cDNA，其中

i)所述正向扩增引物的所述3'部分具有这样的序列：其与区域基本互补，所述区域与所述逆转录引物的序列相比更符合所述cDNA的3'，并且其在所述DNA聚合酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述cDNA发生退火反应；

ii)所述反向扩增引物的3'部分包含这样的序列：其与所述逆转录引物的5'部分基本相同，并且在所述DNA聚合酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述cDNA的互补链或其通过延伸所述正向扩增引物而形成的扩增产物发生退火反应；和

iii)所述PCR产物比所述逆转录引物的长度更长；

d)用至少一种不同的逆转录引物和至少1种不同的正向和/或反向扩增引物重复步骤b)和c)，以形成不同靶RNA的限定区域的可检测数目的扩增的cDNA；和

44.根据权利要求43所述的方法，其中步骤b)和c)在同一容器中进行。

45.根据权利要求43或44所述的方法，其中步骤b)所述的逆转录酶在步骤c)之前或期间被热灭活，并且步骤c)所述的DNA聚合酶被热激活。

46.根据权利要求43-45中任一项所述的方法，其中所述RNA-核糖体复合物的RNA和/或所述靶RNA是信使RNA(mRNA)、非编码RNA、长非编码RNA(lncRNA)、RNA非翻译区(UTR)、假基因RNA，及其组合。

47.根据权利要求43-46中任一项所述的方法，其中通过裂解细胞获得所述RNA-核糖体复合物群，任选地其中用包含一种或多种去污剂的化学物质、机械破碎、超声处理和/或冷冻和解冻裂解所述细胞。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述细胞的形式选自下组：培养的细胞、活组织检查、新鲜细胞、FFPE经福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)细胞、石蜡化细胞和冷冻细胞。

49.根据权利要求43-48中任一项所述的方法，其中优选地使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的所述试剂选自下组：环己酰亚胺、lactimidomycin、三尖杉酯碱(harringtonine)和/或其衍生物及其组合。

50.根据权利要求43-49中任一项所述的方法，其中所述RNA分子的所述一个或多个限定区域选自下组：翻译起始位点和翻译终止位点。

51.根据权利要求43-50中任一项所述的方法，其中足以使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的时间为至少5秒。

52.根据权利要求43-51中任一项所述的方法，其中所述降解不被核糖体保护的核酸的试剂选自下组：DNA酶(DNase)和RNA酶(RNase)。

53.根据权利要求52所述的方法，其中使所述RNA-核糖体复合物在与RNA酶(RNase)接触之前、同时或之后与DNA酶(DNase)接触。

54.根据权利要求43-53中任一项所述的方法，其中所述不被核糖体保护的核酸是mRNA、非编码RNA、长非编码RNA(lncRNA)、RNA非翻译区(UTR)、假基因RNA，及其组合。

55.根据权利要求43-54中任一项所述的方法，其中所述不被核糖体保护的核酸是DNA和/或核糖体RNA。

56.根据权利要求43-55中任一项所述的方法，其中使所述RNA-核糖体复合物在与所述降解核酸的试剂接触之前与所述优选地使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的试剂接触。

57.根据权利要求43-55中任一项所述的方法，其中使所述RNA-核糖体复合物在与所述降解核酸的试剂接触的同时与所述优选地使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的试剂接触。

58.根据权利要求43-57中任一项所述的方法，其中在将所述被保护免于降解的RNA片段群转化为cDNA之前对其进行纯化。

59.根据权利要求43-58中任一项所述的方法，其中所述至少1条逆转录引物中每一条的3'部分均在所述一个或多个限定区域的上游30个核苷酸和下游30个核苷酸的区域内，所述3'部分与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述基本互补的区域在所述一个或多个限定区域的上游20个核苷酸和下游20个核苷酸的区域内。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述基本互补的区域在所述一个或多个限定区域的上游15个核苷酸和下游15个核苷酸的区域内。

62.根据权利要求43-61中任一项所述的方法，其中所述至少1条逆转录引物中的每一条的3'部分均具有这样的序列：其与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补，并且具有这样的序列和/或长度：其在所述逆转录酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域发生退火反应，其中所述3'部分是所述至少1条逆转录引物的3’末端。

63.根据权利要求43-62中任一项所述的方法，其中所述至少1条逆转录引物的5'部分具有与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同的序列，其中所述5'部分是所述至少1条逆转录引物的5'末端。

64.根据权利要求43-63中任一项所述的方法，其中所述至少1条逆转录引物的5'部分具有与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同的序列，并且在所述至少1条逆转录引物中具有共同的序列，用于结合步骤c)所述的反向扩增引物。

65.根据权利要求43-64中任一项所述的方法，其中所述至少1条逆转录引物的所述RNA结合区域长到足以结合逆转录酶。

66.根据权利要求43-65中任一项所述的方法，其中所述至少1条逆转录引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA。

67.根据权利要求43-66中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶的所述活性温度为约40℃至50℃。

68.根据权利要求43-67中任一项所述的方法，其中所述至少1条逆转录引物中的至少1条的长度为约6至500个核苷酸。

69.根据权利要求43-68中任一项所述的方法，其中所述至少1条逆转录引物中的至少1条包含经修饰的碱基和/或经修饰的骨架。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述经修饰的骨架包含亚甲基吗啉环和二氨基磷酸酯键。

71.根据权利要求43-70中任一项所述的方法，其中所述至少1条逆转录引物中的至少1条包含可检测标记。

72.根据权利要求43-71中任一项所述的方法，其中至少1条逆转录引物选自下组：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40条逆转录引物。

73.根据权利要求43-72中任一项所述的方法，其中所述延伸温度在逆转录期间向上倾斜。

74.根据权利要求43-73中任一项所述的方法，其中所述PCR是实时PCR。

75.根据权利要求74所述的方法，其中所述实时PCR是定量实时PCR(qPCR)。

76.根据权利要求43-75中任一项所述的方法，其中所述正向和反向扩增引物与所述cDNA模板和扩增产物的结合区域长到足以结合所述DNA聚合酶。

77.根据权利要求43-76中任一项所述的方法，其中所述正向扩增引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA，并且所述反向扩增引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA的互补链。

78.根据权利要求43-77中任一项所述的方法，其中所述DNA聚合酶的活性温度为至少约50℃。

79.根据权利要求43-78中任一项所述的方法，其中至少1条所述正向或反向扩增引物包含经修饰的碱基和/或经修饰的骨架。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述经修饰的骨架包含亚甲基吗啉环和二氨基磷酸酯键。

81.根据权利要求43-80中任一项所述的方法，其中至少1条所述正向或反向扩增引物包含可检测标记。

82.根据权利要求43-81中任一项所述的方法，其中所述可检测标记是一种或多种荧光团，任选地其中所述荧光团是染料或荧光标记的核酸探针，所述染料的荧光强度和/或光谱在与双链DNA结合时发生变化。

83.根据权利要求43-82中任一项所述的方法，其中在PCR扩增期间所述退火和延伸循环温度在每个循环内向上倾斜。

84.根据权利要求43-83中任一项所述的方法，其中不对所述扩增的cDNA进行测序。

85.根据权利要求43-84中任一项所述的方法，其中所述cDNA和/或扩增的cDNA不用于产生cDNA文库。

86.根据权利要求43-85中任一项所述的方法，其中所述RNA-核糖体复合物、未降解的RNA、cDNA和/或扩增的cDNA不在梯度或凝胶上进行大小选择。

87.根据权利要求1-86中任一项所述的方法，其中所述PCR产物的长度为约20至约500个碱基对。

88.根据权利要求87所述的方法，其中所述PCR产物的长度为约50至约150个碱基对。

89.根据权利要求1-88中任一项所述的方法，其中RNA-核糖体复合物群内与核糖体结合的靶RNA的丰度表明了所述靶RNA的翻译速率。