ES2326316T3 - Deteccion, identificacion y diferenciacion de taxones eubacteriales utilizando un ensayo de hibridacion. - Google Patents
Deteccion, identificacion y diferenciacion de taxones eubacteriales utilizando un ensayo de hibridacion. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2326316T3 ES2326316T3 ES03782334T ES03782334T ES2326316T3 ES 2326316 T3 ES2326316 T3 ES 2326316T3 ES 03782334 T ES03782334 T ES 03782334T ES 03782334 T ES03782334 T ES 03782334T ES 2326316 T3 ES2326316 T3 ES 2326316T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- seq
- probes
- hybridization
- species
- identification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims description 70
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 46
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title description 10
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 title description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 161
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 20
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims abstract description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 64
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 64
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 54
- 239000003999 initiator Substances 0.000 claims description 40
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 35
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 33
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 5
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 40
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 39
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 abstract description 36
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 28
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 28
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 abstract description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 abstract description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 abstract description 2
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 abstract 3
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 241000894007 species Species 0.000 description 22
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 20
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 20
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 20
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 20
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 14
- 241000191984 Staphylococcus haemolyticus Species 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 241000192099 Staphylococcus schleiferi Species 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000192087 Staphylococcus hominis Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000201854 Staphylococcus chromogenes Species 0.000 description 2
- 241000191982 Staphylococcus hyicus Species 0.000 description 2
- 241000191980 Staphylococcus intermedius Species 0.000 description 2
- 241001134656 Staphylococcus lugdunensis Species 0.000 description 2
- 241001147691 Staphylococcus saprophyticus Species 0.000 description 2
- 241000192097 Staphylococcus sciuri Species 0.000 description 2
- 241000191978 Staphylococcus simulans Species 0.000 description 2
- 241000192086 Staphylococcus warneri Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000157302 Bison bison athabascae Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- 238000003820 Medium-pressure liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 1
- 108020005093 RNA Precursors Proteins 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001147687 Staphylococcus auricularis Species 0.000 description 1
- 241001147736 Staphylococcus capitis Species 0.000 description 1
- 241001147695 Staphylococcus caprae Species 0.000 description 1
- 241001147698 Staphylococcus cohnii Species 0.000 description 1
- 241000193817 Staphylococcus pasteuri Species 0.000 description 1
- 241001464905 Staphylococcus saccharolyticus Species 0.000 description 1
- 241000191973 Staphylococcus xylosus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- -1 alkyl phosphorothioates Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000013139 quantization Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Un juego de dos sondas de polinucleótidos, hibridándose dichas dos sondas específicamente a SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 u homólogos, o a su forma de RNA en donde T está reemplazado por U, o a su forma complementaria, en donde no existen más de 25 nucleótidos entre dichas dos sondas, para identificación de Staphylococcus aureus, constituidas por SEQ IDs NO 15 y 20, o SEQ IDs NO 15 y 21, o SEQ IDs NO 17 y 16, o SEQ IDs NO 17 y 19, o SEQ IDs NO 27 y 28, o SEQ IDs NO 29 y 22, o SEQ IDs NO 30 y 18.
Description
Detección, identificación y diferenciación de
taxones eubacteriales utilizando un ensayo de hibridación.
La presente invención se refiere a un método
para la detección y/o identificación específicas de especies de
Staphylococcus, en particular Staphylococcus aureus,
utilizando nuevas secuencias de ácido nucleico derivadas de la
región ITS (Espaciador Interno Transcrito).
La presente invención se refiere también a
dichas nuevas secuencias de ácido nucleico derivadas de la región
ITS, entre los genes 16S y 23S de ácido ribonucleico ribosómico
(rRNA) o rRNA para utilización con objeto de la detección y/o
identificación específicas de especies de Staphylococcus, en
particular de S. aureus, en una muestra biológica.
La misma se refiere también a iniciadores de
ácido nucleico para utilización con objeto de la amplificación de
dicha región espaciadora de especies de Staphylococcus en una
muestra.
El género Staphylococcus incluye
actualmente 32 especies descritas y 15 subespecies. Desde el punto
de vista clínico humano, S. aureus es la más importante,
pero algunas especies coagulasa-negativas son
patógenos emergentes especialmente en infecciones hospitalarias
entre los pacientes sometidos a cuidados intensivos.
Ciertas especies del género
Staphylococcus se aíslan más frecuentemente como agentes
etiológicos de una diversidad de infecciones en humanos. Los
agentes más preocupantes son S. aureus, S.
epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis,
S. warneri y S. saprophyticus.
S. schleiferi ha sido considerado como un
patógeno importante en algunos países europeos, pero ha sido
consignado raras veces en los EE.UU., lo que demuestra la
variabilidad de la epidemiología local de los patógenos.
En medicina veterinaria, S. aureus, S.
intermedius y S. hyicus son los patógenos más
importantes.
Staphylococcus aureus es uno de
los patógenos hospitalarios más comunes. El mismo es responsable de
varias enfermedades, que comprenden desde abscesos cutáneos
superficiales a infecciones intramusculares amenazantes para la
vida. Su propensión a establecer una vehiculación prolongada entre
los pacientes hospitalizados y resistencia creciente a los
antibióticos hacen muy difícil el control de este organismo en el
hospital.
El conocimiento de la epidemiología de la
colonización por S. aureus entre los pacientes ha arrojado
nueva luz acerca de las dificultades potenciales en la interrupción
de la transmisión hospitalaria. El control eficaz de S.
aureus en el hospital y la comunidad requiere medidas más
agresivas que incluyen diagnóstico precoz de los pacientes
colonizados o, dicho de otro modo, que incluyen un paso de
cribado.
Dado que la bacteremia por Staphylococcus
aumenta todavía en frecuencia, es necesario y urgente proporcionar
métodos más rápidos de detección y/o identificación, utilizando
sondas y/o iniciadores más sensibles y más específicos.
La presente invención se define por las
reivindicaciones adjuntas.
Es un objeto de la presente descripción
proporcionar nuevas secuencias de ácido nucleico derivadas de una
región particular del ITS de especies de Staphylococcus, que
pueden utilizarse para la detección y/o identificación de especies
de Staphylococcus, en particular de S. aureus.
La presente descripción proporciona, así pues,
una molécula de ácido nucleico aislada constituida por SEQ ID NO 1,
la forma de RNA de dicha SEQ ID NO 1 en donde T está reemplazado por
U, la forma complementaria de dicha SEQ ID NO 1, o cualquier
homólogo, y el uso de dicha molécula de ácido nucleico como diana
para la detección y/o identificación de especies de
Staphylococcus.
Un aspecto de la presente descripción se refiere
a nuevos polinucleótidos para uso como sondas y/o iniciadores, que
tienen como diana una región particular de la región espaciadora de
rRNA 16S-23S de Staphylococcus aureus, y que
permiten la detección y/o identificación de especies de
Staphylococcus, en particular de Staphylococcus
aureus.
La presente descripción proporciona por tanto
una molécula de ácido nucleico aislada que se hibrida
específicamente a SEQ ID NO 1, o a la forma de RNA de dicha SEQ ID
NO 1 en donde T está reemplazado por U, o a la forma complementaria
de dicha SEQ ID NO 1, o a cualesquiera secuencias homólogas de la
misma, o a un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos de la
misma, para la detección y/o identificación de especies de
Staphylococcus, en particular de Staphylococcus
aureus.
Otro aspecto de la presente descripción se
refiere a conjuntos de sondas para la detección y/o identificación
de especies de Staphylococcus, en particular de
Staphylococcus aureus en una muestra.
Otro aspecto de la presente descripción
concierne a iniciadores que permiten la amplificación específica de
la región espaciadora 16S-23S de rRNA de especies de
Staphylococcus, en particular de S. aureus.
Otro objeto de la presente descripción es una
composición que contiene cualquiera de las nuevas secuencias de la
invención, o cualquiera de los nuevos conjuntos de sondas y/o
iniciadores de la invención; o una combinación de los mismos.
Otro objeto de la presente descripción es un
kit, en el cual se utilizan dichas sondas y/o iniciadores, para
detección y/o identificación de especies de Staphylococcus,
en particular de Staphylococcus aureus.
Otro objeto de la presente descripción es un
método de hibridación rápido y fiable para detección y/o
identificación de especies de Staphylococcus, en particular
de Staphylococcus aureus.
Otro objeto de la presente descripción es un
método de hibridación basado en PCR en tiempo real para detección
y/o identificación de especies de Staphylococcus, en
particular de Staphylococcus aureus.
Tabla 1: Lista de SEQ IDs
Tabla 2: Pares de iniciadores
Tabla 3: Conjunto de sondas
Tabla 4: Especies de Staphylococcus
Las siguientes definiciones sirven para ilustrar
los términos y expresiones utilizados en las diferentes
realizaciones de la presente invención como se expone más
adelante.
Los términos "espaciador" e "ITS"
(Espaciador Interno Transcrito) son términos abreviados que se
refieren ambos a la región entre el rRNA 16S y 23S o entre los
genes 16S y 23S de rRNA.
El término "sonda" se refiere a
oligonucleótidos o polinucleótidos monocatenarios que tienen una
secuencia que es suficientemente complementaria para hibridarse a
la secuencia diana a detectar.
Preferiblemente, las sondas son 70%, 80%, 90%, o
más de 95% homólogas al complemento exacto de la secuencia diana a
detectar. Estas secuencias diana son o bien DNA genómico o RNA
precursor, o regiones amplificadas de los mismos.
Las sondas pueden formarse por clonación de
plásmidos recombinantes que contienen inserciones que incluyen las
secuencias de nucleótidos correspondientes, en caso necesario por
escisión de las últimas de los plásmidos clonados después de
utilización de las nucleasas adecuadas y recuperación de las mismas,
v.g. por fraccionamiento de acuerdo con el peso molecular.
Las sondas pueden sintetizarse también
químicamente, por ejemplo por el método convencional del
fosfo-triéster.
El término ácidos nucleicos
"complementarios", como se utiliza en esta memoria, significa
que las secuencias de ácido nucleico pueden formar una doble hélice
perfectamente apareada en bases una con otra.
Los términos "poli(ácido nucleico)",
"ácido nucleico", y "polinucleótido" corresponden a cDNA
bicatenario o monocatenario o DNA genómico o RNA, que contienen al
menos 5, 10, 20, 30, 40 ó 50 nucleótidos contiguos. Un poli(ácido
nucleico) que tiene una longitud menor que 100 nucleótidos se
designa como un "oligonucleótido".
Dichos términos pueden referirse también a
nucleótidos modificados tales como inosina o nucleótidos que
contienen grupos modificados que no alteran esencialmente sus
características de hibridación.
Las secuencias de poli(ácido nucleico)
monocatenario se representan siempre en la presente invención desde
el extremo 5' al extremo 3'.
Las mismas pueden utilizarse como tales, o en su
forma complementaria, o en su forma de RNA en donde T está
reemplazado por U.
\newpage
El término "vecino más próximo" significa
el taxón que se sabe o se espera esté relacionado más estrechamente
en términos de homología de DNA y que debe diferenciarse del
organismo de interés.
La expresión "hibridación específica de
taxón" o "sonda específica de taxón" significa que la sonda
se hibrida solamente al DNA o RNA del taxón para el cual fue
diseñada, y no a DNA o RNA de otros taxones.
El término taxón puede hacer referencia a un
género completo o un subgrupo dentro de un género, una especie o
incluso subtipo dentro de una especie (subespecies, serovars,
sequevars, biovars ...).
El término "amplificación específica" o
"iniciadores específicos" hace referencia al hecho de que
dichos iniciadores amplifican solamente la región espaciadora de
estos organismos para los cuales fueron diseñados, y no de otros
organismos.
El término "sensibilidad" se refiere al
número de negativos falsos: es decir, si 1 de las 100 especies a
detectar está ausente, el test muestra una sensibilidad de (100 -
1/100) % = 99%.
El término "especificidad" se refiere al
número de positivos falsos: es decir si en 100 cepas detectadas 2
parecen pertenecer a organismos para los cuales no está diseñado el
test, la especificidad del test es (100 - 2/100) % = 98%.
Los oligonucleótidos o polinucleótidos
seleccionados como "preferentes" exhiben una sensibilidad y
especificidad mayor que 80%, preferente mayor que 90% y muy
preferiblemente mayor que 95%.
El término "soporte sólido" puede hacer
referencia a cualquier sustrato al cual pueda acoplarse una sonda
de polinucleótido, con tal que la misma retenga sus características
de hibridación y con tal que el nivel de ruido de fondo de la
hibridación se mantenga bajo. Usualmente el sustrato sólido será una
placa de microtitulación, una membrana (v.g. nailon o
nitrocelulosa) o una microesfera (cuenta). Antes de la aplicación a
la membrana o fijación puede ser conveniente modificar la sonda de
ácido nucleico a fin de facilitar la fijación o mejorar la
eficiencia de hibridación. Tales modificaciones pueden abarcar
adición de colas de homopolímeros, acoplamiento con grupos
reactivos diferentes tales como grupos alifáticos, grupos NH_{2},
grupos SH, grupos carboxílicos, o acoplamiento con biotina,
haptenos o proteínas.
El término "marcado" se refiere al uso de
ácidos nucleicos marcados. La marcación puede llevarse a cabo por
el uso de nucleótidos marcados incorporados durante el paso de
polimerización de la amplificación tal como se ilustra por Saiki
et al. (1988) o Bej et al. (1990) o por el uso de
iniciadores marcados, o por cualquier otro método conocido por las
personas expertas en la técnica. La naturaleza del marcador puede
ser isotópica (^{32}P, ^{35}S, etc.) o no isotópica (biotina,
digoxigenina, tinte fluorescente, biotina, enzima, etc.).
El término "señal" se refiere a Un juego de
ondas electromagnéticas (por ejemplo fluorescencia), o cambios en
la corriente eléctrica que transportan información. La señal puede
ser directamente visible, o puede hacerse visible y/o interpretable
por medios o dispositivos diferentes.
La "muestra" puede ser cualquier material
biológico. Este material biológico puede tomarse directamente del
ser humano, o animal infectado, o después de cultivo o
enriquecimiento, o de alimentos, del medio ambiente, etc.
El material biológico puede ser por ejemplo,
expectoración de cualquier tipo, lavados bronquiales, sangre,
tejido de la piel, biopsias, material de cultivo de linfocitos
sanguíneos, colonias, etc. Dichas muestras pueden prepararse o
extraerse de acuerdo con cualquiera de los métodos conocidos en la
técnica.
Las especies de Staphylococcus que son
clínicamente relevantes en el significado de la presente invención
son S. aureus, S. auricularis, S. capitis, S. caprae, S. cohnii,
S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S.
pasteuri, S. saccharolyticus, S. saprophyticus, S. schleiferi, S.
simulans, S. warneri, y S. xylosus (Tabla 4).
El ITS es conocido ya para algunas especies de
Staphylococcus (WO 96/00298).
En estudios ulteriores, la secuenciación total
del genoma de diferentes especies de Staphylococcus ha
revelado que estos organismos contienen al menos 5 operones de RNA
ribosómico en su genoma.
En particular, dentro de las especies de
Staphylococcus, las cepas de S. aureus exhiben una
diversidad de secuencias espaciadoras incluso dentro de un mismo
aislado.
Dichos ITS diferentes, más de 16 tipos de
secuencias, varían también en longitud dentro del intervalo de 300
a 550 pares de bases.
Para resolver los problemas generados por esta
variabilidad muy alta, la presente descripción proporciona una
región particular del ITS, identificada y delimitada por su gran
ventaja de ofrecimiento de una secuencia diana única para la
detección y/o identificación de todas las especies de
Staphylococcus, y en particular de todas las especies de
Staphylococcus clínicamente relevantes, y más particularmente
de S. aureus.
De hecho, se ha descubierto que la secuencia
diana de la descripción se encuentra en todos los tipos de
espaciadores de todas y cada una de las especies de
Staphylococcus, en particular de todas las especies de
Staphylococcus que son clínicamente relevantes.
Esta región particular del ITS, a la que se hace
referencia también como la "región diana" o "secuencia
diana", puede definirse como una molécula de ácido nucleico
constituida por SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, o como una molécula de
ácido nucleico que es homóloga a SEQ ID NO 1 o 2, su forma de RNA en
donde T está reemplazado por U, o su forma complementaria.
Este término "secuencia diana" abarca todas
las secuencias homólogas encontradas en el ITS de cualquier especie
de Staphylococcus, haciéndose referencia también en lo
sucesivo en esta memoria a dichas secuencias homólogas como
"homólogos". El grado de homología es entonces mayor que 75%,
generalmente mayor que 80%, e incluso mayor que 90%.
En el marco de esta descripción,
"homólogos" son entonces secuencias homólogas a SEQ ID NO 1 ó 2
o a cualquier fragmento de las mismas, localizadas en la región ITS
de cualquier especie de Staphylococcus, derivándose SEQ ID
NO 1 y 2 de cepas diferentes de S. aureus.
Nuevos polinucleótidos para uso como sondas y/o
iniciadores diseñados a partir de la secuencia diana de la
descripción para la detección y/o identificación de especies de
Staphylococcus son también un objeto de la invención.
Dicho de otro modo, un objeto de la invención se
refiere a nuevos polinucleótidos para uso como sondas y/o
iniciadores, que se hibridan con la secuencia diana de la invención
para la detección y/o identificación de especies de
Staphylococcus.
En particular, un objeto de la descripción es
una molécula de ácido nucleico aislada que se hibrida
específicamente a SEQ ID NO 1 ó 2, o a la forma de RNA de dichas
SEQ ID NO 1 ó 2 en donde T está reemplazado por U, o a la forma
complementaria de dichas SEQ ID NO 1 ó 2, o un fragmento de al menos
20 nucleótidos contiguos de las mismas, o a cualquiera de sus
homólogos, para la detección y/o identificación de especies de
Staphylococcus, en particular de S. aureus.
Sondas de polinucleótidos preferidas tienen una
longitud comprendida entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50
bases, de modo más preferible entre aproximadamente 10 y
aproximadamente 25 nucleótidos y son suficientemente homólogas a la
secuencia diana.
Pueden utilizarse como sondas polinucleótidos de
SEQ IDs NO 1 a 70 y cualquiera de sus homólogos.
Las sondas preferidas son polinucleótidos de SEQ
IDs NO 14, 16 a 22, 25 a 32, 35 a 42 y homólogos.
Iniciadores preferidos de la descripción son
polinucleótidos de DNA monocatenarios capaces de actuar como un
punto de iniciación para la síntesis de la secuencia diana. La
longitud y la secuencia de un iniciador deben ser tales que
permitan iniciar la síntesis de los productos de extensión.
Preferiblemente, un iniciador tiene una longitud
de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 nucleótidos, con
preferencia aproximadamente 15 a aproximadamente 25. Su longitud y
secuencia específicas deben seleccionarse dependiendo de las
condiciones utilizadas tales como temperatura y concentración
iónica.
Los iniciadores preferidos amplifican la
secuencia diana. Dicho de otro modo, los iniciadores preferidos
amplifican SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 y/u homólogos.
Los iniciadores preferidos son polinucleótidos
de SEQ IDs NO 51, 52, 53, 55, 58, 65, 67, 68, 69, 70, y
homólogos.
El hecho de que los iniciadores de amplificación
no tienen que coincidir exactamente con la secuencia modelo
correspondiente para garantizar una amplificación apropiada está
ampliamente documentado en la bibliografía (Kwok et al.,
1990).
El método de amplificación utilizado puede ser o
bien la reacción en cadena de polimerasa (PCR; Saiki et al.,
1988), reacción en cadena de ligasa (LCR; Landgren et al.,
1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991), amplificación basada
en secuencias de ácido nucleico (NASBA; Guatelli et al.,
1990; Compton, 1991), sistema de amplificación basado en
transcripción (TAS; Kwoh et al., 1989), amplificación por
desplazamiento de cadena (SDA; Duck, 1990; Walker et al.,
1992) o amplificación por medio de la replicasa Q\beta (Lizardi
et al., 1988; Lomeli et al., 1989) o cualquier otro
método adecuado para amplificar moléculas de ácido nucleico conocido
en la técnica.
Los polinucleótidos preferidos para uso como
iniciadores o como sondas se enumeran en la Tabla 1.
Los polinucleótidos pueden diferir en secuencia
de cualquiera de los polinucleótidos especificados en la Tabla 1, o
de cualquiera de sus homólogos, sea por adición a o eliminación de
cualquiera de sus extremos respectivos de uno o varios nucleótidos,
o por cambio de uno o más nucleótidos dentro de dichas secuencias, o
una combinación de ambos, con tal que los equivalentes obtenidos
entonces se hibriden todavía con la secuencia diana como los
polinucleótidos sin modificar correspondientes. Dichos
polinucleótidos equivalentes comparten al menos 75% de homología,
preferiblemente más de 80%, muy preferiblemente más de 85% de
homología con los polinucleótidos sin modificar
correspondientes.
Cuando se utiliza un equivalente de un
polinucleótidos, puede ser necesario modificar las condiciones de
hibridación para obtener la misma especificidad que en el caso del
polinucleótidos sin modificar correspondiente.
Como consecuencia, será necesario también
modificar de acuerdo con ello la secuencia de otros polinucleótidos
cuando los polinucleótidos deben utilizarse en un conjunto en las
mismas condiciones de hibridación. Estas modificaciones pueden
realizarse de acuerdo con principios conocidos en la técnica, v.g.,
tales como los descritos en Hames B e Higgins S (Eds): Nucleic acid
hybridization. Practical approach. IRL Press, Oxford, Reino Unido,
1985.
Los polinucleótidos iniciadores y/o sondas de la
descripción pueden comprender también análogos de nucleótidos tales
como fosforotioatos (Matsukura et al., 1987),
alquilfosforotioatos (Miller et al., 1979) o ácidos nucleicos
peptídicos (Nielsen et al., 1991; Nielsen et al.,
1993) o pueden contener agentes de intercalación (Asseline et
al., 1984), etc.
Los iniciadores modificados o sondas requieren
adaptaciones con respecto a las condiciones en las cuales se
utilizan los mismos a fin de obtener la especificidad y sensibilidad
requeridas. Sin embargo, los resultados de la hibridación deben
mantenerse esencialmente iguales que los obtenidos con los
polinucleótidos sin modificar.
La introducción de estas modificaciones puede
ser ventajosa con objeto de influir en algunas características
tales como la cinética de hibridación, la reversibilidad de la
formación de híbridos, la estabilidad biológica de las moléculas de
polinucleótidos, etc.
Las sondas e iniciadores de la descripción se
utilizan en métodos, que son también objetos de la presente
invención, para la detección y/o identificación de especies de
Staphylococcus, en particular de S. aureus.
La detección y/o identificación de la secuencia
diana puede realizarse utilizando un método de electroforesis, un
método de hibridación o un método de secuenciación.
Un método de la descripción para la detección de
una o más especies de Staphylococcus en una muestra comprende
los pasos siguientes:
- En primer lugar, y en caso necesario, los
ácidos nucleicos presentes en la muestra se hacen disponibles para
amplificación y/o hibridación.
- En segundo lugar, y también en caso necesario,
los ácidos nucleicos, en caso de estar presentes, se amplifican con
uno u otro sistema de amplificación de la diana, como se especifica
más adelante. Usualmente, la amplificación es necesaria para
intensificar la señal de hibridación subsiguiente. Sin embargo, para
algunas muestras, o para algunos sistemas de amplificación de
señales muy sensibles, la amplificación podría no ser necesaria.
- En tercer lugar, los ácidos nucleicos
presentes en la muestra o el producto amplificado resultante se
ponen en contacto con las sondas, y se deja que transcurra la
hibridación.
- Finalmente, los híbridos se detectan
utilizando un sistema de detección conveniente y compatible. A
partir de las señales o patrones de hibridación observados, puede
deducirse la presencia o ausencia de una o varias especies de
Staphylococcus.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema de amplificación utilizado puede ser
más o menos universal, dependiendo de la aplicación específica
necesaria.
Por utilización de iniciadores universales
localizados en las regiones flanqueantes conservadas (genes 16S y
23S) del espaciador de rRNA, se amplificará la región espaciadora de
la mayoría, si no la totalidad, de los organismos de origen
eubacterial.
Para algunas aplicaciones puede ser apropiado
amplificar no todos los organismos presentes en la muestra sino una
o varias especies de Staphylococcus. Esto puede conseguirse
utilizando iniciadores específicos localizados en la región diana
de especies de Staphylococcus, y por ejemplo los
polinucleótidos de SEQ IDs NO 69 y 70 o sus homólogos pueden
utilizarse como un par de iniciadores de este tipo, o
preferiblemente los polinucleótidos de SEQ IDs NO 58 y 68 o sus
homólogos.
En particular, un método de la descripción para
detección y/o identificación de especies de Staphylococcus,
particularmente de Staphylococcus aureus, en una muestra
comprende los pasos de:
(i) en caso necesario, liberar, aislar y/o
concentrar los poli(ácidos nucleicos) en la muestra;
(ii) en caso necesario, amplificar la región
espaciadora 16S-23S de rRNA, o un fragmento que
comprende la secuencia diana, o la secuencia diana o un fragmento
de la misma, con al menos un par de iniciadores adecuado;
(iii) hibridar los poli(ácidos nucleicos) del
paso (i) o (ii) con al menos una sonda polinucleotídica que se
hibrida a la secuencia diana, en donde la secuencia diana está
constituida por SEQ ID NO 1 ó 2 u homólogos de las mismas o a su
forma de RNA en donde T está reemplazado por U, o a su forma
complementaria, o a un fragmento de al menos 20 nucleótidos
contiguos de la misma,
(iv) detectar los híbridos formados, y
(v) interpretar la o las señales obtenidas y
deducir la presencia de especies de Staphylococcus y/o
identificar las especies de Staphylococcus en la
muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, las sondas de la invención se
hibridan en condiciones de alta severidad.
En condiciones de alta severidad, se forman
únicamente híbridos de ácido nucleico complementarios. De acuerdo
con ello, la severidad de las condiciones de ensayo determina la
cantidad de complementariedad necesaria entre dos cadenas de ácido
nucleico que forman un híbrido. La severidad se selecciona para
maximizar la diferencia en estabilidad entre el híbrido formado con
la diana y el ácido nucleico distinto de la diana.
Las condiciones de hibridación se eligen de tal
manera que la señal de hibridación obtenida cuando un polinucleótido
de la invención se hibrida específicamente a una secuencia diana,
es diferente de la señal obtenida cuando dicho polinucleótido se
hibrida a una secuencia diana de manera inespecífica.
En la práctica, las diferentes señales pueden
visualizarse por ejemplo cuando su intensidad es dos, cinco, diez o
más veces mayor con una hibridación específica a la diana, en
comparación con la hibridación inespecífica a la secuencia diana,
por ejemplo el sistema LiPA.
Las diferentes señales pueden visualizarse
también cuando se representan picos diferentes en un análisis de
curva de fusión, por ejemplo cuando se utiliza un método PCR en
tiempo real.
El fragmento mencionado en la amplificación o el
paso de hibridación de cualquier método de la descripción puede
comprender 20 a 50, 20 a 80 ó 20 a 100 nucleótidos contiguos de SEQ
ID NO 1 ó 2 o de cualesquiera homólogos.
En una realización, una técnica muy conveniente
y ventajosa para la detección de secuencias diana que están
presentes posiblemente en la muestra es el método PCR en tiempo
real.
Existen diferentes formatos para la detección de
DNA amplificado, particularmente sondas TaqMan^{TM}, sondas
Molecular Beacons, o sondas de hibridación FRET.
Concerniente a las sondas TaqMan^{TM}, una
sonda de hibridación monocatenaria se marca con dos componentes.
Cuando el primer componente, el denominado agente de fluorescencia,
es excitado con luz de una longitud de onda adecuada, la energía
absorbida se trasfiere al segundo componente, el denominado
apagador, de acuerdo con el principio de transferencia de energía
por resonancia de fluorescencia. Durante el paso de reasociación de
la región PCR, la sonda de hibridación se fija al DNA diana y es
degradada por la actividad de exonucleasa 5'-3' de
la polimerasa, por ejemplo polimerasa Taq, durante la fase de
elongación. Como resultado, el componente fluorescente excitado y
el apagador se separan espacialmente uno de otro y de este modo
puede medirse una emisión de fluorescencia del primer componente
(EP B 0543942 y US 5.210.015).
Concerniente a las sondas Molecular Beacons, las
sondas están marcadas también con un primer componente y con un
apagador, estando localizados preferiblemente los marcadores en
extremos diferentes de una sonda al menos parcialmente
auto-complementaria. Como resultado de la estructura
secundaria de la sonda, ambos componentes se encuentran en solución
en proximidad espacial. Después de la hibridación a los ácidos
nucleicos diana, ambos componentes se separan uno de otro de tal
manera que después de la excitación con luz de una longitud de onda
adecuada, puede medirse la emisión de fluorescencia del primer
componente (US 5.118.801).
El formato de test de la sonda de hibridación de
Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia (FRET) es
especialmente útil para todas las clases de ensayos de hibridación
homogéneos (Matthews, J.A. y Kricka, L.J., Anal Biochem 169 (1988)
1-25). El mismo se caracteriza por dos sondas de
hibridación monocatenarias que se utilizan simultáneamente y son
complementarias a sitios adyacentes de la misma cadena de un ácido
nucleico diana (amplificado). Ambas sondas están marcadas con
componentes fluorescentes diferentes. Cuando es excitado con luz de
una longitud de onda adecuada, un primer componente transfiere la
energía absorbida al segundo componente de acuerdo con el principio
de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de tal
manera que puede medirse una emisión de fluorescencia del segundo
componente únicamente cuando ambas sondas de hibridación están
fijadas a posiciones adyacentes de la molécula diana a detectar.
\newpage
Cuando se reasocian a la secuencia diana, las
sondas de hibridación deben estar localizadas muy próximas una a
otra, en una disposición de cabeza con cola. Usualmente, la laguna
entre el extremo 3' marcado de la primera sonda y el extremo 5'
marcado de la segunda sonda es lo más pequeña posible, y está
constituida particularmente por aproximadamente 0 a 25 bases, y con
preferencia aproximadamente a aproximadamente 5 bases. Esto permite
una proximidad estrecha del compuesto FRET donante y el compuesto
FRET aceptor, que es típicamente 10-100
\ring{A}ngstrom.
Alternativamente a la monitorización del aumento
en fluorescencia del componente FRET aceptor, es posible también
monitorizar la disminución de fluorescencia del componente FRET
donante como medida cuantitativa del suceso de hibridación.
Entre todos los formatos de detección conocidos
en la técnica de PCR en tiempo real, se ha demostrado que el
formato de la sonda de hibridación FRET es sumamente sensible,
exacto y fiable (WO 97/46707; WO 97/46712; WO 97/46714). No
obstante, el diseño de secuencias sonda de hibridación FRET
apropiadas puede verse limitado a veces por las características
especiales de la secuencia de ácido nucleico diana a detectar.
Como alternativa al uso de dos sondas de
hibridación FRET, es también posible utilizar un iniciador marcado
por fluorescencia y una sola sonda polinucleotídica marcada
(Bernard, P.S., et al., Anal. Biochem. 255 (1998)
101-7). A este respecto, el mismo puede
seleccionarse arbitrariamente, tanto si el iniciador está marcado
con el FRET donante como si lo está con el compuesto FRET
aceptor.
Las sondas de hibridación FRET (denominadas
también Hybprobes o sondas FRET) pueden utilizarse también para
análisis de curvas de fusión (WO 97/46707; WO 97/46712; WO
97/46714). En un ensayo de este tipo, el ácido nucleico diana se
amplifica primeramente en una reacción PCR típica con iniciadores de
amplificación adecuados. Las sondas de hibridación pueden estar
presentes ya durante la reacción de amplificación o añadirse
subsiguientemente. Una vez completada la reacción PCR, la
temperatura de la muestra se aumenta consecutivamente. La
fluorescencia se detecta con tal que la sonda de hibridación esté
unida al DNA diana. A la temperatura de fusión, la sonda de
hibridación se desprende de su diana, y la señal fluorescente se
reduce inmediatamente hasta el nivel de ruido de fondo. Esta
disminución se monitoriza con una gráfica apropiada de fluorescencia
frente a tiempo y temperatura de tal modo que puede calcularse la
negativa de una primera función derivada. El valor de temperatura
correspondiente al máximo obtenido de una función de este tipo se
toma luego como la temperatura de fusión determinada de dicho par
de sondas de hibridación FRET.
Las mutaciones puntuales o polimorfismos dentro
del ácido nucleico diana dan como resultado una complementariedad
menor que 100% entre el ácido nucleico diana y las sondas FRET,
redundando así en una temperatura de fusión reducida. Esto permite
una detección común de una agrupación de variantes de secuencia por
medio de hibridación FRET-Hybprobe, mientras que
subsiguientemente, diferentes miembros de dicha agrupación pueden
llegar a discriminarse por medio de la realización de análisis de
curvas de fusión.
En lugar de sondas de hibridación FRET, pueden
utilizarse alternativamente Molecular Beacons para análisis de
curvas de fusión.
Contando con la disponibilidad de la PCR en
tiempo real y el análisis de curvas de fusión de PCR homogénea en
tiempo real, la discriminación de ciertos tipos de especies o cepas
se hace posible utilizando tintes de fijación de DNA bicatenario
tales como SybrGreen^{TM}I, o bien, alternativamente, sondas de
hibridación diseñadas específicamente que se hibridan a secuencias
diana diferentes pero similares.
En el primer caso, es preciso determinar la
temperatura de fusión del producto PCR generado bicatenario. No
obstante, este método tiene sólo aplicaciones limitadas dado que las
pocas diferencias no pueden monitorizarse eficientemente, debido a
que las variaciones menores de secuencia conducen únicamente a
diferencias sutiles de temperatura de fusión.
Alternativamente, las sondas de hibridación
pueden utilizarse de tal manera que se puede determinar la
temperatura de fusión de híbrido sonda/ácido nucleico diana.
Existen diferentes plataformas PCR de tiempo
real tales como los equipos ABI/Prism^{TM}, y en particular el
aparato LightCycler^{TM}, basados todos ellos en el mismo
principio consistente en medir la emisión de luz, monitorizar
continuamente el pico de emisión durante el ciclo de fusión,
determinar y visualizar las temperaturas (picos de fusión) a las
cuales las sondas marcadas se desprenden de los productos de
amplificación. Los datos de los picos de fusión son característicos
de una secuencia particular [sonda:diana] debido a que los errores
de apareamiento entre sonda y diana afectan a la cinética de la
fusión, produciendo picos de fusión diferentes para cada especie de
interés.
La plataforma LightCycler^{TM} ofrece muchas
ventajas y en particular un ahorro de tiempo y la utilización
posible de varios sistemas de detección de sondas fluorescentes
diferentes específicas de la secuencia tales como sondas de
hibridación (Hybprobes), sondas TaqMan^{TM}, Molecular Beacons y
bisondas (SYBR Green I).
En un método preferido de la presente invención,
se utiliza el sistema Hybprobe, constituido por dos sondas
polinucleotídicas adyacentes derivadas de la región diana de la
invención, en una orientación de cabeza con cola, espaciadas unos
pocos nucleótidos, generalmente 0 a 25, con preferencia
aproximadamente 1 a aproximadamente 5. Una de las sondas está
marcada en su extremo 3' con un tinte donante, y la otra está
marcada con una molécula aceptora en su extremo 5', y está
bloqueada con fosfato en el extremo 3' (para prevenir su acción como
iniciador). El tinte donante es generalmente fluoresceína, y la
molécula aceptora generalmente LC Red640 ó 705.
La detección de la secuencia diana de la
descripción puede realizarse también por una cadena PCR interna
marcada y una sonda de detección localizada en la cadena opuesta.
La señal es dependiente de la aproximación espacial de los tintes,
y es dependiente de la cantidad de la diana.
Cuando ambas sondas se hibridan a su secuencia
diana, la luz emitida por el donante se trasmite al fluoróforo
aceptor por Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia
(FRET), y la fluorescencia emitida (640 ó 705 nm) puede detectarse.
La intensidad de la fluorescencia emitida aumenta en paralelo con el
DNA diana, producto de la amplificación.
Las sondas LightCycler ofrecen la ventaja sobre
las sondas TaqMan^{TM} de no requerir hidrólisis y, por tanto, no
requerir extensión adicional de los tiempos de PCR
(reasociación-elongación \leq 12 s). Por tanto,
es posible aprovechar la ventaja de la ciclación térmica a alta
velocidad del instrumento LightCycler, y completar el programa PCR
en sólo 45 minutos.
Y las generaciones más recientes de esta
plataforma PCR en tiempo real son capaces de monitorizar varias
sondas en una sola reacción, permitiendo la detección y/o
identificación de diferentes Staphylococci, al nivel de
especies y también a niveles taxonómicos inferiores.
Además, se ha demostrado que los métodos
diseñados para la tecnología Taqman pueden convertirse fácilmente
entre tecnología HybProbe con resultados equivalentes (Haematologica
Vol. 85 (12), pp. 1248-1254, diciembre 2000).
Por consiguiente, otro objeto de la invención se
refiere a conjuntos de 2 sondas polinucleotídicas, a las que se
hace referencia también como HybProbes, hibridándose ambas HybProbes
a la misma secuencia diana, adyacentes una a otra, con no más de 25
nucleótidos entre dichas dos HybProbes, preferiblemente con no más
de 10 nucleótidos, y en particular con no más de 5 nucleótidos.
Una de las HybProbes está marcada con un
fluoróforo aceptor y la otra con un fluoróforo donante de un par de
transferencia de energía por fluorescencia, de tal modo que, después
de la hibridación de las dos HybProbes con la secuencia diana, los
fluoróforos donante y aceptor están dentro de 0 a 25 nucleótidos uno
de otro, y preferiblemente dentro de 0 a 5 nucleótidos uno de
otro.
Para detección y/o identificación de especies de
Staphylococcus, en particular especies de
Staphylococcus clínicamente relevantes, puede utilizarse un
juego de dos sondas polinucleotídicas, hibridándose dichas dos
sondas a SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, o a la forma de RNA de dicha SEQ
ID NO 1 ó 2 en donde T está reemplazado por U, o a la forma
complementaria de dichas SEQ ID NO 1 ó 2, o a homólogos, en donde
existen no más de 25 nucleótidos, preferiblemente no más de 5
nucleótidos, entre dichas dos sondas.
Un juego de sondas de la descripción puede estar
compuesto también de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más sondas, pero el
mismo está constituido preferiblemente por 2 a 5 sondas, y más
preferiblemente por 2 ó 3 sondas.
Los juegos de sondas enumerados en la Tabla 3 y
sus homólogos son juegos preferidos de la invención.
Pueden utilizarse también juegos de dos
polinucleótidos, uno para uso como iniciador, y el otro para uso
como sonda, hibridándose ambos iniciador y sonda citados a la
secuencia diana constituida por SEQ ID NO 1 ó 2, por la forma de
RNA de dicha SEQ ID NO 1 ó 2 en donde T está reemplazado por U, por
la forma complementaria de dicha SEQ ID NO 1 ó 2, o por
cualesquiera homólogos, en donde existen no más de 25 nucleótidos,
preferiblemente no más de 5 nucleótidos, entre dicho iniciador y
dicha sonda.
Los juegos de al menos dos polinucleótidos se
utilizan en métodos para la detección y/o identificación de
especies de Staphylococcus, en particular de S.
aureus.
Un método de la presente descripción para
detección y/o identificación de especies de Staphylococcus en
una muestra, comprende los pasos de:
(i) en caso necesario, liberar, aislar y/o
concentrar los poli(ácidos nucleicos) en la muestra;
(ii) amplificar la región espaciadora
16S-23S de rRNA, o la secuencia diana, o una parte
del espaciador que comprende la secuencia diana, o una parte de la
secuencia diana, con al menos un par de iniciadores adecuado;
(iii) hibridar los poli(ácidos nucleicos) con al
menos un juego de al menos dos HybProbes que se hibridan a la
secuencia diana, en donde la secuencia diana está constituida por
SEQ ID NO 1 ó 2, o por la forma de RNA de dicha SEQ ID NO en donde
T está reemplazado por U, o por la forma complementaria de dicha SEQ
ID NO, o por cualesquiera homólogos, o por un fragmento de al menos
20 nucleótidos contiguos de la misma,
(iv) detectar los híbridos formados en el paso
(iii);
(v) deducir la presencia de especies de
Staphylococcus, o identificar la(s) especie(s)
de Staphylococcus en la muestra a partir de las señales de
hibridación diferencial obtenidas en el paso (iv).
\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo, un par de iniciadores utilizado en
el paso de amplificación es cualquier combinación de un iniciador
directo constituido por SEQ ID NO 45, 49, 50, 52, 56, 61, 63, 64,
65, 66, 67, 68, o sus homólogos, y un iniciador inverso constituido
por SEQ ID NO 46, 47, 48, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 62, o sus
homólogos.
Por ejemplo, un juego de dos HybProbes utilizado
en el paso de hibridación es cualquier combinación de 2 HybProbes
seleccionadas entre los polinucleótidos de SEQ IDs NO 3 a 70 o sus
homólogos, con tal que la laguna entre dichas dos HybProbes cuando
se hibridan a la secuencia diana es menor que 25 nucleótidos,
preferiblemente menor que 5 nucleótidos.
Una de las ventajas del sistema HybProbes reside
en el hecho de que ello permite la detección de variación de
secuencia, con inclusión de mutaciones, polimorfismos y otras
especies de ácido nucleico variantes, basadas en el concepto
molecular siguiente: una de las HybProbe es una "sonda de
anclaje" de fijación fuerte, mientras que la "sonda
sensora" adyacente abarca la región de variación de secuencia.
Durante la fusión del producto PCR final, la alteración de la
secuencia se detecta como un cambio en la temperatura de fusión (Tm)
de la sonda sensora.
Por ejemplo, si la muestra contiene únicamente
SEQ ID NO 1, la utilización de HybProbes que se hibriden
específicamente a dicha SEQ ID NO 1 generaría un único pico de
fusión. Si existe también un homólogo en la muestra, la utilización
de las mismas dos HybProbes generaría dos picos, en la medida en que
existe una sola base apareada erróneamente que induce por regla
general un cambio de temperatura fácilmente observable.
Dependiendo de los polinucleótidos
seleccionados, su Tm y las condiciones de hibridación, la
fluorescencia puede medirse durante el paso de amplificación,
generando luego curvas de amplificación, o después del paso de
amplificación, para un análisis de curvas de fusión que genere
curvas de fusión.
Así pues, la señal obtenida puede visualizarse
en la forma de curvas de amplificación o en la forma de curvas de
fusión, a partir de las cuales es posible deducir la presencia de
especies de Staphylococcus, y/o inferir qué
Staphylococcus están presentes.
En particular, un método para la detección y/o
identificación de especies de Staphylococcus en una muestra
comprende también los pasos de:
(i) en caso necesario, liberar, aislar y/o
concentrar los poli(ácidos nucleicos) en la muestra;
(ii) amplificar la secuencia diana, o una parte
de la misma, con un par de iniciadores que está marcado;
(iii) hibridar los poli(ácidos nucleicos) con al
menos una HybProbe que se hibrida, en posición adyacente a dicho
iniciador marcado con menos de 25 nucleótidos interpuestos, a SEQ ID
NO 1, o a la forma de RNA de dicha SEQ ID NO en donde T está
reemplazado por U, o a la forma complementaria de dicha SEQ ID NO 1,
o a cualesquiera homólogos, o a un fragmento de al menos 20
nucleótidos contiguos de la misma,
(iv) detectar los híbridos formados, y
(v) deducir la presencia de especies de
Staphylococcus, y/o identificar la(s)
especie(s) de Staphylococcus en la muestra a partir
de las señales obtenidas en el paso (iv).
\vskip1.000000\baselineskip
Un método de la descripción que utiliza el
sistema HybProbes, puede adaptarse para la detección e
identificación de Staphylococcus aureus, permitiendo la
distinción de S. aureus de otras especies, y en particular
de los Staphylococci coagulasa-negativos
(CoNS).
A continuación, en el paso de amplificación, los
iniciadores adecuados son pares de iniciadores que amplifican
específicamente la secuencia diana que está constituida por SEQ ID
NO 1, o de la forma de RNA de dicha SEQ ID NO en donde T está
reemplazado por U, o de la forma complementaria de dicha SEQ ID
NO.
En el paso de hibridación, las HybProbes
deberían hibridarse específicamente a SEQ ID NO 1 ó 2, o a la forma
de RNA en donde T está reemplazado por U, o a la forma
complementaria.
Por esta razón, las cepas de S. aureus
pueden distinguirse inequívocamente de todos los restantes
organismos examinados por análisis de curvas de fusión.
Adicionalmente, sólo los CoNS dan lugar a picos
de fusión; no se obtienen en ningún caso señales relevantes con DNA
distinto de Staphylococci o DNA genómico humano.
Los pares de iniciadores preferidos utilizados
en este ejemplo particular son cualesquiera combinaciones de
iniciadores directos seleccionados entre SEQ ID NO 68 ó 69 o sus
homólogos e iniciadores inversos seleccionados entre SEQ ID NO 58 ó
70 o sus homólogos.
Los juegos de HybProbes enumeradas en la Tabla 3
o sus homólogos son Los juegos preferidas de HybProbes de la
invención. Un juego más preferida de 2 HybProbes está constituida
por SEQ ID NO 17 u homólogos y SEQ ID NO 19 u homólogos.
El juego de HybProbes constituido por SEQ ID NO
17 y 19 es capaz de detectar S. aureus, S. epidermidis
y S. haemolyticus con una sensibilidad alta.
Cada polinucleótido enumerado en la Tabla 1,
correspondiente a SEQ ID NO 1 hasta SEQ ID NO 70 y cualquiera de
sus homólogos, puede ser utilizado en cualesquiera métodos de la
presente invención como iniciador y/o como sonda, solo o en
combinación.
Una segunda realización basada también en un
método de hibridación es la técnica Line Probe Assay. La Line Probe
Assay (LiPA) es un formato de hibridación inversa (Saiki et
al., 1989) que utiliza tiras de membrana sobre las cuales
pueden aplicarse convenientemente varias sondas polinucleotídicas
(con inclusión de polinucleótidos de control negativos o positivos)
como líneas paralelas.
La técnica LiPA, como ha sido descrita por
Stuyver et al. (1993) y en la solicitud internacional WO
94/12670, proporciona un test de hibridación rápido y cómodo para
el usuario. Los resultados pueden leerse en el transcurso de 4
horas después del comienzo de la amplificación. Después de la
amplificación, durante la cual se incorpora usualmente un marcador
no isotópico en el producto amplificado, y desnaturalización
alcalina, el producto amplificado se pone en contacto con las
sondas en la membrana y la hibridación se lleva a cabo durante
aproximadamente 1 a 1,5 h. Como consecuencia, los híbridos formados
se detectan por un procedimiento enzimático que da como resultado
un precipitado visual púrpura-pardo. El formato LiPA
es completamente compatible con dispositivos de escaneo disponibles
comercialmente, haciendo así posible la interpretación automática de
los resultados. Todas las ventajas citadas hacen que el formato
LiPA sea fiable para uso en un escenario de rutina.
El formato LiPA es una herramienta ventajosa
para detección y/o identificación de patógenos a nivel de especies
pero también a niveles taxonómicos superiores o inferiores. Por
ejemplo, pueden seleccionarse configuraciones-sonda
en tiras LiPA de tal manera que las mismas pueden detectar el género
completo de Staphylococcus o pueden identificar especies
dentro del género (v.g. Staphylococcus aureus,
epidermidis, etc.) o pueden en algunos casos detectar
incluso subtipos (subespecies, serovars, sequevars, biovars, etc.,
lo que sea clínicamente relevante) dentro de una
especie.
especie.
La posibilidad de generar simultáneamente
resultados de hibridación con un gran número de sondas es otra
ventaja de la tecnología LiPA. En muchos casos, la cantidad de
información que puede obtenerse por una combinación particular de
sondas excede notablemente en número a los datos obtenidos por
utilización de ensayos de una sola sonda. Por consiguiente, la
selección de sondas en la tira de membrana es de la máxima
importancia, dado que Un juego optimizada de sondas generará el
máximo de información posible.
Estas sondas pueden aplicarse a tiras de
membrana en localizaciones diferentes, y el resultado se interpreta
como positivo si al menos una de estas sondas es positiva.
Alternativamente, estas sondas pueden aplicarse como una mezcla en
el mismo lugar, reduciendo con ello el número de líneas en una tira.
Esta reducción puede ser conveniente a fin de hacer la tira más
concisa o con objeto de poder ampliar el número total de sondas en
una sola tira.
Otro enfoque alternativo, teniendo en cuenta sus
beneficios prácticos, es la síntesis de polinucleótidos que
albergan las secuencias de dos o más sondas diferentes, a las que se
hace referencia como sondas degeneradas, que pueden procesarse
luego adicionalmente y aplicarse a la tira como una sola molécula de
polinucleótido. Este enfoque podría simplificar considerablemente
los procedimientos de fabricación de las tiras LiPA. Por ejemplo,
se requieren sondas con secuencias de nucleótidos A y B a la vez
para detectar todas las cepas del taxón X. en la última
alternativa, puede sintetizarse una sonda que tenga la secuencia de
nucleótidos AB. Esta sonda tendrá las características combinadas de
las sondas A y B.
En virtud de las propiedades arriba mencionadas,
el sistema LiPA puede considerarse como un formato eficiente para
un método de hibridación en el cual es necesario que se detecten
simultáneamente varios organismos en una muestra.
Sin embargo, debe quedar claro que cualquier
otro ensayo de hibridación, en el cual se utilicen sondas diferentes
en las mismas condiciones de hibridación y lavado, puede ser
utilizado para los métodos de detección y/o selección arriba
mencionados. Por ejemplo, puede ser posible inmovilizar el ácido
nucleico diana a un soporte sólido, y utilizar mezclas de
diferentes sondas, todas ellas marcadas de modo diferente, dando
como resultado una señal de detección diferente para cada una de
las sondas hibridadas a la diana. Y en la actualidad están
disponibles muchos soportes diferentes.
\newpage
Como ejemplo, se reseña a continuación el
procedimiento a seguir para la detección de una o más especies de
Staphylococcus en una muestra utilizando el formato LiPA:
- En primer lugar, y en caso necesario, los
ácidos nucleicos presentes en la muestra se ponen a disposición
para amplificación y/o hibridación.
- En segundo lugar, los ácidos nucleicos, en
caso de estar presentes, se amplifican con uno u otro sistema de
amplificación de la diana, como se especifica más adelante.
Usualmente, la amplificación es necesaria para intensificar la
señal de hibridación subsiguiente.
- En tercer lugar, eventualmente después de un
paso de desnaturalización, los ácidos nucleicos presentes en la
muestra o el producto amplificado resultante se ponen en contacto
con tiras LiPA sobre las cuales están inmovilizadas una o más
sondas (por ejemplo sondas de DNA, RNA, degeneradas o modificadas),
que permiten la detección de los organismos de interés, y se deja
que transcurra la hibridación.
- Por último, eventualmente después de haber
realizado un paso de lavado, se detectan los híbridos utilizando un
sistema de detección conveniente y compatible. A partir de las
señales de hibridación o patrones observados, puede deducirse la
presencia o ausencia de uno o varios organismos buscados en dicha
muestra biológica particular.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema de amplificación utilizado puede ser
más o menos universal, dependiendo de la aplicación específica
necesaria.
Utilizando iniciadores universales localizados
en las regiones flanqueantes conservadas del espaciador de rRNA, es
decir en el gen 16S y el gen 23S, se amplificará la región
espaciadora de la mayoría, si no la totalidad, de los organismos de
origen eubacterial.
Para algunas aplicaciones puede ser apropiado
amplificar no todos los organismos presentes en la muestra sino más
específicamente especies de Staphylococcus. Esto puede
conseguirse utilizando iniciadores específicos localizados en la
región diana de especies de Staphylococcus; por ejemplo los
polinucleótidos de SEQ IDs NO 69 y 70 o sus homólogos pueden
utilizarse como un par de iniciadores de este tipo.
Un método para detección y/o identificación de
especies de Staphylococcus en una muestra, comprende los
pasos de:
(i) en caso necesario, liberar, aislar y/o
concentrar los poli(ácidos nucleicos) presentes en la muestra;
(ii) en caso necesario, amplificar la región
espaciadora 16S-23S de rRNA, o una parte de la
misma, con al menos un par de iniciadores adecuado;
(iii) hibridar los poli(ácidos nucleicos) con al
menos una sonda polinucleotídica que se hibrida a la secuencia
diana constituida por SEQ ID NO 1 ó 2 o por la forma de RNA de dicha
SEQ ID NO 1 ó 2 en donde T está reemplazado por U, o por la forma
complementaria de dicha SEQ NO, o por cualesquiera homólogos o por
un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos de la misma,
(iv) detectar los híbridos formados en el paso
(iii); (v) identificar el o los microorganismos presentes en la
muestra a partir de las señales diferenciales de hibridación
obtenidas en el paso (iv).
\vskip1.000000\baselineskip
La parte del ITS mencionada en el paso de
amplificación, es un polinucleótido que comprende la secuencia
diana, o la secuencia diana propiamente dicha, estando constituida
la secuencia diana por SEQ ID NO 1 ó 2, o de la forma de RNA de
dichas SEQ ID NO 1 ó 2 en donde T está reemplazado por U, o de la
forma complementaria de dichas SEQ ID NO 1 ó 2, o de cualesquiera
homólogos, o de un fragmento de al menos 20 nucleótidos contiguos
de las
mismas.
mismas.
Preferentemente, la presente descripción
proporciona un método como se ha descrito arriba en el cual se
detectan simultáneamente al menos 2 microorganismos.
Un juego de sondas como se describen en el paso
(iii) comprende al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve o más sondas de la descripción, o equivalentes de las
mismas.
En un método preferido de la descripción, el
juego de sondas que se describe en el paso (iii) comprende al menos
dos sondas.
Sondas preferidas son polinucleótidos de SEQ ID
NO 1 a 70 y sus homólogos.
La presente descripción proporciona también un
método como se ha descrito arriba, en el cual las sondas que se
especifican en el paso (iii) se combinan con al menos otra sonda,
preferentemente también de la región espaciadora
16S-23S de rRNA, permitiendo la detección simultánea
de diferentes bacterias patógenas que es probable estén presentes
en la misma muestra.
Las sondas preferidas se diseñan para conseguir
la eficiencia óptima en las mismas condiciones de hibridación a fin
de que las mismas pueden utilizarse en juegos para hibridación
simultánea; esto aumenta notablemente la utilidad de estas sondas y
da como resultado una ganancia importante de tiempo y mano de
obra.
Un kit que contiene cualquiera de los
polinucleótidos de la presente descripción es también un objeto de
la descripción.
El kit comprende los componentes siguientes:
- -
- al menos un polinucleótido que se hibrida a la secuencia diana constituida por SEQ ID NO 1 ó 2, a la forma de RNA de dicha SEQ ID NO 1 ó 2, en donde T está reemplazado por U, a la forma complementaria de dicha SEQ ID NO 1 ó 2, o a cualquiera de sus homólogos:
- -
- un tampón de hibridación, o componentes necesarios para producir dicho tampón.
\vskip1.000000\baselineskip
Un kit preferido comprende
- -
- al menos un juego de dos HybProbes que se hibridan, adyacentes una a otra con menos de 25 nucleótidos, preferiblemente menos de 5 nucleótidos, a la secuencia diana constituida por SEQ ID NO 1 ó 2 a la forma de RNA de dicha SEQ ID NO 1 ó 2, en donde T está reemplazado por U, a la forma complementaria de dicha SEQ ID NO 1 ó 2, o a cualquiera de sus homólogos;
- -
- un tampón de hibridación, o componentes necesarios para producir dicho tampón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
El método utilizado en los ejemplos es un método
para la detección de Staphylococci, en particular S.
aureus, S. epidermidis y S. haemolyticus,
utilizando las HybProbes de SEQ ID NO 17 y 19, en combinación con
un juego de iniciadores del género Staphylococcus de SEQ ID
NO 58 y 68.
Las HybProbe se marcan: SEQ ID NO 17 en 3' con
fluoresceína, y SEQ ID NO 19 en 5' con LCred640.
En total, se investigaron 63 aislados de S.
aureus (con inclusión de uno representativo de la subespecie
anaerobius de S. aureus), 48 aislados de S.
epidermidis y 16 aislados de S. haemolyticus de
diferentes orígenes geográficos.
Si los aislados no daban los resultados
esperados, el gDNA se retipificó por PCR de tRNA (Vaneechoutte, M.
et al., 1998, Int. J. Syst. Bacteriol. (48)
127-139) y/o el cultivo se retipificó por ApiSTAPH
(Biomérieux).
La instrumentación consiste en el
LightCycler^{TM} (versión 1.2) proporcionado con el software
adecuado (software LC, versión 3.5) que permite una detección por
PCR de fluorescencia en tiempo real.
Para extracción del DNA de cultivos puros,
pueden utilizarse diferentes métodos de purificación:
- -
- Lisis con lisostafina (5 \mug/\mul) durante 1 h a 37ºC y purificación con el kit de aislamiento de DNA de sangre QIAamp (Qiagen)
- -
- El método de Pitcher et al. (1989)
- -
- El kit de aislamiento de DNA MagNAPure LC III (bacterias, hongos) con el instrumento MagNAPure. Las células bacterianas cultivadas durante una noche en placas LB o cultivos en pico de flauta se suspendieron en 100 a 1000 \mul de TE pH8 durante el almacenamiento a -20ºC. Se utilizaron 2 \mul a 20 \mul para extracción de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
- -
- Mini kit de DNA QIAamp (nº de catálogo 52306-QIAGEN). El cultivo se pretrató enzimáticamente utilizando lisozima y lisostafina.
Se incubaron muestras de sangre en frascos de
cultivo de sangre aerobios BacT/ALERT FA) y se incubaron en un
sistema BacT/Alert 3D (Organon Teknika) a 37ºC hasta resultado
positivo. La positividad se monitorizó por un cambio de color del
verde oscuro al amarillo.
Se congelaron partes alícuotas (1,5 ml) de los
cultivos de sangre a -70ºC hasta su utilización.
Se preparó DNA genómico como se describe en el
prospecto del paquete del Kit de Aislamiento de DNA MPLC III. Como
se recomienda para los frascos de cultivo de sangre Organon Teknika,
antes de la PCR se centrifugó el producto eluido durante 10 s a
14.000 rpm para reducir a un sedimento las partículas de carbono
extraídas.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo las instrucciones del fabricante de
las Sondas de Hibridación Master de DNA del kit
LC-FastStart (cat. nº 3.003.248 o nº
2.239.272):
- -
- puede utilizarse cualquier material muestra adecuado para PCR en términos de pureza, concentración, y ausencia de inhibidores;
- -
- los iniciadores deben encontrarse a una concentración final de 0,3 a 1 \muM cada uno;
- -
- las HybProbes a una concentración final de 0,2 \muM cada una, o doble;
- -
- la concentración de MgCl_{2} debería optimizarse, y pude variar de 1 a 5 mM;
- -
- y debe ejecutarse un control negativo.
Las condiciones de amplificación y fusión se
describen a continuación en esta memoria. Se utilizó la versión de
software LC 3.5. Los ajustes de cuantificación eran F2/retroceso en
F1 (muestras). Para el ajuste de la referencia se utilizó el modo
aritmético. El cálculo del punto de cruzamiento (Ct) estaba basado
en el máximo de la segunda derivada. El método de cálculo para el
pico de fusión era polinómico. El área del pico se utilizó para
calcular el valor Tm.
\newpage
Programa de amplificación y curvas de
fusión:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los aislados de S. aureus
examinados (n = 63) se amplificaron con éxito (intervalo Ct
17,25-33,51) y dieron un solo pico de fusión
uniforme con un valor Tm medio de 53,13 \pm 0,52ºC cualquiera que
fuese el origen geográfico o del espécimen.
Debe indicarse que la subespecie de S.
aureus subesp. anaerobius caía junto con la especie S.
aureus.
Todos los aislados recibidos como S.
epidermidis (n = 48) y S. haemolyticus (n = 16) pudieron
detectarse utilizando la curva de fusión. Usualmente no se
observaron curvas de cuantificación. El valor medio Tm para los
aislados de S. epidermidis era 44,55ºC \pm 0,21ºC, y para
los aislados de S. haemolyticus el mismo era 44,96ºC \pm
0,24ºC. No había diferencia alguna observada entre los aislados de
diferente origen geográfico o de muestra.
Todos los aislados recibidos como S.
aureus o S. haemolyticus reaccionaban como era de
esperar. Sin embargo, se obtuvieron resultados que se desviaban
para 5 aislados de S. epidermidis.
Dos de éstos, uno procedente del Reino Unido y
el otro de Italia, se identificaron posteriormente como S.
hominis. Otro aislado de S. epidermidis procedente del
Reino Unido exhibió un valor Tm de 49,02ºC y pudo determinarse
posteriormente sólo como una especie de Staphylococcus (no
Staphylococcus aureus, S. epidermidis o S.
haemolyticus). El aislado del Reino Unido se retipificó después
de ello como un S. haemolyticus. Y un aislado de España que
producía un pico de fusión pequeño nada característico se retipificó
como S. intermedius o S. chromogenes.
Se testaron más de 50 especies bacterianas
diferentes (Mycobacteria, Pseudomonas, Streptococci, etc.) así como
varios hongos. Ninguno de los organismos testados generaba curvas de
cuantificación o picos de fusión con el ensayo.
Se detectan todos los aislados de S.
aureus investigados (sensibilidad 100%) y podían distinguirse
inequívocamente de todos los restantes aislados estudiados.
Asimismo, para S. epidermidis y S.
haemolyticus la sensibilidad era 100%.
Por esta razón utilizando este juego particular
de HybProbes de SEQ IDs NO 17 y 19, se detectan ambas especies sin
ser diferenciadas una de otra o de otros CoNS.
No se observaron reactividades cruzadas
indeseables, con organismos de los patógenos testados.
\newpage
Sumario de los test de sensibilidad y
especificidad.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se testaron en total partes alícuotas de 16
frascos de cultivo de sangre positivos inoculados con muestras de
pacientes.
De los 5 frascos en que se cultivó S.
aureus, 4 pudieron identificarse como tales. Uno no presentaba
pico alguno. De hecho, el DNA de las muestras se retipificó como
S. schleiferi.
De los 10 frascos que se encontraron positivos
para S. epidermidis, 7 exhibieron un pico a
44-45ºC - como era de esperar - mientras que 3
exhibían picos desplazados a 47ºC. Después de retipificar el DNA de
las muestras que se desviaban, se identificaron las mismas como
S. hominis.
Un frasco, positivo para S. haemolyticus,
producía el pico de fusión esperado a 44,59ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
En total se han estudiado 51 cepas CoNS,
distintas de S. epidermidis y S. haemolyticus. Los
resultados se resumen en la tabla siguiente.
La amplificación se observó en gel para la
totalidad de las cepas de todas las especies excepto dos (S.
schleiferi y S. sciuri) para las cuales los resultados
son ambiguos (véase también más adelante). Algunos CoNS producían
una curva de crecimiento (amplificación), con el valor Ct
correspondiente, pero la fluorescencia del punto final era muy baja
(0,004 o menos) en comparación con los valores obtenidos para S.
aureus (v.g. 0,03 para 10^{3} copias).
La mayoría de las especies examinadas eran
detectables por el análisis de la curva de fusión, con la excepción
de S. chromogenes, S. hyicus y S. simulans.
Los resultados para S. schleiferi y S.
sciuri son imprecisos; para ambas especies se observaron picos
de fusión, pero no podían discriminarse con certeza de un agente
contaminante potencial. Los resultados obtenidos con iniciadores
universales sugieren que ambas especies no serán probablemente
detectables; existía una prueba clara de amplificación en gel, pero
las HybProbes no generaban una señal en el LC.
El intervalo de Tm observado para CoNS es 39 a
48ºC. Este valor es claramente diferente del observado para S.
aureus, pero solapa perfectamente el intervalo de S.
epidermidis y S. haemolyticus.
\newpage
Sumario de los resultados LC obtenidos para
cepas de las especies de Staphylococcus examinadas.
Claims (5)
1. Un juego de dos sondas de polinucleótidos,
hibridándose dichas dos sondas específicamente a SEQ ID NO 1 o SEQ
ID NO 2 u homólogos, o a su forma de RNA en donde T está reemplazado
por U, o a su forma complementaria, en donde no existen más de 25
nucleótidos entre dichas dos sondas, para identificación de
Staphylococcus aureus, constituidas por SEQ IDs NO 15 y 20,
o SEQ IDs NO 15 y 21, o SEQ IDs NO 17 y 16, o SEQ IDs NO 17 y 19, o
SEQ IDs NO 27 y 28, o SEQ IDs NO 29 y 22, o SEQ IDs NO 30 y 18.
2. Una composición que comprende un juego de dos
sondas de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Un método para detección e identificación de
Staphylococcus aureus en una muestra, que comprende los
pasos de:
(i) en caso necesario, liberar, aislar y/o
concentrar los poli(ácidos nucleicos) en la muestra;
(ii) en caso necesario, amplificar la región
espaciadora 16S-23S de rRNA, o un fragmento que
comprende la secuencia diana, o la secuencia diana o un fragmento
de la misma, con al menos un par de iniciadores adecuado;
(iii) hibridar los poli(ácidos nucleicos) del
paso (i) o (ii) con al menos un juego de dos sondas
polinucleotídicas de acuerdo con la reivindicación 1
(iv) detectar los híbridos formados por
realización de un análisis de curva de fusión, y
(v) identificar la o las señales obtenidas y
deducir la presencia de especies de Staphylococcus e
identificar la especie Staphylococcus aureus en la
muestra.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3
en donde un par de iniciadores adecuado está constituido por
cualquier combinación de un polinucleótido iniciador directo
seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO 45, 49, 50, 52,
56, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 68 y sus homólogos, y un polinucleótido
iniciador inverso seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO
46, 47, 48, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 62, y sus homólogos.
5. Un kit para identificación de especies de
Staphylococcus que comprende los componentes siguientes:
- -
- al menos un juego de dos sondas de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1,
- -
- un tampón de hibridación, o componentes necesarios para producir dicho tampón.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP02447247 | 2002-12-06 | ||
| EP02447247 | 2002-12-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2326316T3 true ES2326316T3 (es) | 2009-10-07 |
Family
ID=32479868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03782334T Expired - Lifetime ES2326316T3 (es) | 2002-12-06 | 2003-12-08 | Deteccion, identificacion y diferenciacion de taxones eubacteriales utilizando un ensayo de hibridacion. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20060115819A1 (es) |
| EP (1) | EP1567668B1 (es) |
| JP (2) | JP2006508671A (es) |
| AT (1) | ATE430209T1 (es) |
| AU (1) | AU2003289984A1 (es) |
| CA (1) | CA2504911C (es) |
| DE (1) | DE60327462D1 (es) |
| DK (1) | DK1567668T3 (es) |
| ES (1) | ES2326316T3 (es) |
| HK (1) | HK1085159A1 (es) |
| WO (1) | WO2004052606A2 (es) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2326316T3 (es) * | 2002-12-06 | 2009-10-07 | Innogenetics N.V. | Deteccion, identificacion y diferenciacion de taxones eubacteriales utilizando un ensayo de hibridacion. |
| KR101065904B1 (ko) * | 2003-09-02 | 2011-09-19 | 소니 에릭슨 모빌 커뮤니케이션즈 에이비 | 두 메모리 사이의 보안성 데이터 전송 |
| US20060099618A1 (en) * | 2004-09-30 | 2006-05-11 | Innogenetics, N.V. | Detection, identification and differentiation of Serratia species using the spacer region |
| JP4967095B2 (ja) * | 2005-08-12 | 2012-07-04 | 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | 黄色ブドウ球菌濃度測定方法及び食中毒可能性判定方法 |
| US20090286691A1 (en) * | 2006-01-20 | 2009-11-19 | Genein Co., Ltd. | Oligonucleotide for Detection of Bacteria Associated with Sepsis and Microarrays and Method for Detection of the Bacteria Using the Oligonucleotide |
| CN101627133A (zh) * | 2007-01-08 | 2010-01-13 | 株式会社美迪基尼斯 | 用于金黄色葡萄球菌检测的dna芯片 |
| JP2010524454A (ja) | 2007-04-19 | 2010-07-22 | モレキュラー ディテクション インコーポレーテッド | 抗生物質耐性細菌の検出および分析のための方法、組成物、およびキット |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5541308A (en) * | 1986-11-24 | 1996-07-30 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms |
| US5210015A (en) * | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| CZ291483B6 (cs) | 1994-06-24 | 2003-03-12 | Innogenetics N. V. | Způsob detekce a identifikace mikroorganismu ve vzorku a kompozice, proba, primer a kit k provádění tohoto způsobu |
| US6737248B2 (en) * | 1996-01-05 | 2004-05-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Staphylococcus aureus polynucleotides and sequences |
| US5849488A (en) * | 1996-02-27 | 1998-12-15 | Oulutech Ltd. | DNA-sequence-based diagnosis of mastitis from a milk sample |
| JP3844996B2 (ja) * | 2000-11-15 | 2006-11-15 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 反復性ｐｃｒ産物の融解曲線解析方法 |
| ES2326316T3 (es) | 2002-12-06 | 2009-10-07 | Innogenetics N.V. | Deteccion, identificacion y diferenciacion de taxones eubacteriales utilizando un ensayo de hibridacion. |
-
2003
- 2003-12-08 ES ES03782334T patent/ES2326316T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-08 CA CA2504911A patent/CA2504911C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-12-08 JP JP2004558030A patent/JP2006508671A/ja active Pending
- 2003-12-08 DK DK03782334T patent/DK1567668T3/da active
- 2003-12-08 AT AT03782334T patent/ATE430209T1/de active
- 2003-12-08 AU AU2003289984A patent/AU2003289984A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-08 EP EP03782334A patent/EP1567668B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-08 US US10/537,787 patent/US20060115819A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-08 WO PCT/EP2003/013907 patent/WO2004052606A2/en active Application Filing
- 2003-12-08 DE DE60327462T patent/DE60327462D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-02-28 HK HK06102673.4A patent/HK1085159A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-04-18 US US12/105,380 patent/US8945850B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-12-09 JP JP2009279519A patent/JP5156726B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1567668B1 (en) | 2009-04-29 |
| CA2504911A1 (en) | 2004-06-24 |
| CA2504911C (en) | 2015-08-11 |
| DE60327462D1 (de) | 2009-06-10 |
| DK1567668T3 (da) | 2009-08-17 |
| EP1567668A2 (en) | 2005-08-31 |
| AU2003289984A8 (en) | 2004-06-30 |
| US8945850B2 (en) | 2015-02-03 |
| WO2004052606A3 (en) | 2004-07-29 |
| WO2004052606A2 (en) | 2004-06-24 |
| US20080199878A1 (en) | 2008-08-21 |
| JP2006508671A (ja) | 2006-03-16 |
| ATE430209T1 (de) | 2009-05-15 |
| JP2010088447A (ja) | 2010-04-22 |
| US20060115819A1 (en) | 2006-06-01 |
| AU2003289984A1 (en) | 2004-06-30 |
| JP5156726B2 (ja) | 2013-03-06 |
| HK1085159A1 (en) | 2006-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2869285T3 (es) | Secuencias para la detección e identificación de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) con MREJ de tipo xxi | |
| ES2597841T3 (es) | Detección, identificación y diferenciación de especies de Proteus utilizando la región espaciadora | |
| JP5156726B2 (ja) | ハイブリダイゼーションアッセイを使用する真正細菌群の検出、同定および区別 | |
| ES2386748T3 (es) | Secuencias de cebador y sonda para detectar Chlamydia trachomatis | |
| CA2925168A1 (en) | Detection of methicillin-resistant staphylococcus aureus in biological samples | |
| AU2018316218A1 (en) | Compositions and methods for detecting Staphylococcus aureus | |
| Mu et al. | Loop-mediated isothermal amplification: Rapid and sensitive detection of the antibiotic resistance gene ISAba1-blaOXA-51-like in Acinetobacter baumannii | |
| US9273361B2 (en) | Detection, identification and differentiation of eubacterial taxa using a hybridization assay | |
| ES2343794T3 (es) | Polinucleotidos para la amplificacion y deteccion de chlamydia trachomatis y neisseria gonorrhoeae. | |
| ES2393302T3 (es) | Detección, identificación y diferenciación de la especie serratia utilizando la región intergénica | |
| US9234248B2 (en) | Simultaneous quantitative multiple primer detection of Clostridium difficile | |
| JP2010536343A (ja) | 薬剤耐性菌検出方法 | |
| ES2349090T3 (es) | Ensayo multiplex de detección de organismos patogénicos. | |
| US20100092949A1 (en) | Methods for detecting staphylococcus aureus | |
| CN116716422A (zh) | 检测肺炎克雷伯菌k1基因和k2基因的引物、探针、试剂盒及方法 | |
| JP2021040517A (ja) | 皮膚常在菌の検出用オリゴヌクレオチドセット、キット及び皮膚常在菌の検出方法 | |
| ES2404483A1 (es) | Método de detección clínica estandarizada del patógeno Acinetobacter baumannii. |