ES2343794T3 - Polinucleotidos para la amplificacion y deteccion de chlamydia trachomatis y neisseria gonorrhoeae. - Google Patents
Polinucleotidos para la amplificacion y deteccion de chlamydia trachomatis y neisseria gonorrhoeae. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2343794T3 ES2343794T3 ES03783231T ES03783231T ES2343794T3 ES 2343794 T3 ES2343794 T3 ES 2343794T3 ES 03783231 T ES03783231 T ES 03783231T ES 03783231 T ES03783231 T ES 03783231T ES 2343794 T3 ES2343794 T3 ES 2343794T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- probes
- primers
- baselineskip
- seq
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Una composición que comprende un primer polinucleótido que consiste en la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 3 y unos segundos polinucleótidos que consisten en la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID Nº: 4.
Description
Polinucleótidos para la amplificación y
detección de Chlamydia trachomatis y Neisseria
gonorrhoeae.
La presente invención se refiere a Chlamydia
trachomatis. En particular la invención se refiere a
composiciones de polinucleótidos y métodos para amplificar y
detectar Chlamydia trachomatis.
Chlamydia trachonzantis (C.
trachomatis o CT) es un agente causante de enfermedades
transmitidas sexualmente comunes. CT causa linfogranuloma venéreo,
diversas patologías inflamatorias de los sistemas urogenitales del
hombre y la mujer y tracoma, una enfermedad crónica que afecta a 500
millones de personas y puede llevar a la ceguera. Cuando no se
diagnostica precozmente y se trata con la terapia adecuada, la
uretritis y la cervicitis inducida por CT pueden llevar a una
variedad de inflamaciones crónicas, tales como, por ejemplo,
vaginitis, salpingitis e inflamación pélvica que pueden resultar en
esterilidad y embarazo extrauterino. Además, los recién nacidos de
madres infectadas pueden contraer infecciones pulmonares y/u
oculares durante el parto.
Teniendo en cuenta el impacto que tienen estos
organismos, los ensayos diagnósticos específicos y rápidos son de
suma importancia. El diagnóstico basado en el crecimiento selectivo
de bacterias patogénicas ha sido el patrón, pero el cultivo de
células consume mucho tiempo y el crecimiento in vitro de
muchos aislados clínicos es difícil. La infección con bacterias
tiene como resultado la formación de una variedad anticuerpos con
serogrupo, especificidad de especie, subespecie, serovariedad
(serotipo) y auxotipo. Se ha usado el suero de pacientes con
infecciones del tracto genital para diagnosticar infección por CT,
sin embargo los ensayos basados en marcadores serológicos son no
cuantitativos por naturaleza y están sujetos a dificultades en la
interpretación. Por ejemplo, los títulos de anticuerpos pueden ser
indetectables en infecciones agudas (falso negativo), pueden
persistir en individuos no infectados con una historia pasada de
infección (falso positivo), pueden producir una indicación de falso
positivo debido a la presencia de especies que interaccionan de
manera cruzada (por ejemplo infección respiratoria causada por
diferentes especies de Clamidia) o pueden no desarrollarse en
absoluto (falso negativo) dependiendo de otros factores (Ngeow,
1996, Ann Acad Med, Singapur 25:300; Black et al., 1991, J
Clin Microbiol 29:1312). Por estas razones, la serología sola no es
adecuada para el diagnóstico de las infecciones por CT.
Las infecciones bacterianas pueden ser
diagnosticadas también mediante la detección de secuencias de ácidos
nucleicos particulares del organismo de infección. Dependiendo de
la secuencia de ácidos nucleicos que se seleccione para la
detección, un ensayo diagnóstico puede ser específico para un género
entero, más de un género, una especie o subespecie, un auxotipo,
una serovariedad (serotipo), una cepa u otro subconjunto de
organismos. Esta selectividad se puede explotar en el desarrollo de
ensayos diagnósticos fiables simples para las especies de patógenos
bacterianos de C. trachomatis.
El documento EP 0 630 971 A describe cebadores
de oligonucleótidos y sondas para la detección de C.
trachomatis que incluyen GGGATTCCTG TAACAACAAG que se usa como
un cebador directo, CCTCTTCCCC AGAACAATAA GAACAC que se usa como un
cebador inverso, y CATAGCACTA TAGAACTCTG CAAGCC que se usa como
sonda de detección, un método de detección de C. trachomatis
en una muestra mediante amplificación por PCR con el uso de
cebadores y sondas, y composiciones y kits de PCR que contienen
estos oligonucleótidos.
Esta información antecedente se proporciona con
el fin de dar a conocer información que el solicitante considera
que es de posible relevancia para la presente invención. No se prevé
necesariamente la admisión, ni debe interpretarse, que nada de la
información precedente constituya una técnica previa en contra de la
presente invención.
La presente invención proporciona reactivos de
polinucleótidos útiles para la detección de Chlamydia
trachomatis. En particular, la presente invención proporciona
cebadores y sondas para los procedimientos de amplificación y
detección de los ácidos nucleicos, que detectan específicamente y
con sensibilidad diversas subespecies o serotipos y auxotipos de
C. trachomatis.
La presente invención proporciona composiciones
que comprenden un primer polinucleótido que consiste en la
secuencia de ácidos nucleicos de la SEC Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID
Nº: 3 y un segundo polinucleótido que consiste en la secuencia de
ácidos nucleicos de la SEC ID Nº:4.
La presente invención también proporciona un
juego de cebadores/sondas seleccionado de los juegos de
cebadores/sondas que consisten en:
Juego de Cebadores y Sondas 1 que consiste en
las SEC ID Nº: 1, 4 y 5;
Juego de Cebadores y Sondas 2 que consiste en
las SEC ID Nº: 2, 4 y 5;
Juego de Cebadores y Sondas 3 que consiste en
las SEC ID Nº: 3, 4 y 5;
Juego de Cebadores y Sondas 4 que consiste en
las SEC ID Nº: 1, 4 y 6;
Juego de Cebadores y Sondas 5 que consiste en
las SEC ID Nº: 2, 4 y 6;
Juego de Cebadores y Sondas 6 que consiste en
las SEC ID Nº: 3, 4 y 6;
Juego de Cebadores y Sondas 7 que consiste en
las SEC ID Nº: 1, 4 y 7;
Juego de Cebadores y Sondas 8 que consiste en
las SEC ID Nº: 2, 4 y 7 y
Juego de Cebadores y Sondas 9 que consiste en
las SEC ID Nº: 3, 4 y 7.
La presente invención además proporciona un
método de detección de Chlamydia trachomatis en una muestra
de ensayo, comprendiendo dicho método:
- (a)
- la formación de una mezcla de reacción que comprende reactivos de amplificación de ácidos nucleicos, una muestra de ensayo que potencialmente contiene una secuencia de Chlamydia trachomatis, y un juego de cebadores/sondas que se selecciona del grupo que consiste en:
- Juego de Cebadores y Sondas 1 que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y 5;
- Juego de Cebadores y Sondas 2 que consiste en las SEC ID Nº: 2, 4 y 5;
- Juego de Cebadores y Sondas 3 que consiste en las SEC ID Nº: 3, 4 y 5;
- Juego de Cebadores y Sondas 4 que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y 6;
- Juego de Cebadores y Sondas 5 que consiste en las SEC ID Nº: 2, 4 y 6;
- Juego de Cebadores y Sondas 6 que consiste en las SEC ID Nº: 3, 4 y 6;
- Juego de Cebadores y Sondas 7 que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y 7;
- Juego de Cebadores y Sondas 8 que consiste en las SEC ID Nº:2, 4 y 7 y
- Juego de Cebadores y Sondas 9 que consiste en las SEC ID Nº: 3, 4 y 7.
- (b)
- el sometimiento de la mezcla a condiciones de amplificación para generar al menos una copia de una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia diana;
- (c)
- la hibridación de la sonda con la secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia diana, para formar un híbrido que comprenda la sonda y la secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia diana y
- (d)
- la detección del híbrido como una indicación de la presencia de Chlamydia trachomatis en la muestra de ensayo.
Además, la presente invención proporciona un kit
que comprende:
- (a)
- un juego de cebadores/sondas, que se selecciona del grupo que consiste en:
- Juego de Cebadores y Sondas 1 que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y 5;
- Juego de Cebadores y Sondas 2 que consiste en las SEC ID Nº: 2, 4 y 5;
- Juego de Cebadores y Sondas 3 que consiste en las SEC ID Nº: 3, 4 y 5;
- Juego de Cebadores y Sondas 4 que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y 6;
- Juego de Cebadores y Sondas 5 que consiste en las SEC ID Nº: 2, 4 y 6;
- Juego de Cebadores y Sondas 6 que consiste en las SEC ID Nº: 3, 4 y 6;
- Juego de Cebadores y Sondas 7 que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y 7;
- Juego de Cebadores y Sondas 8 que consiste en las SEC ID Nº:2, 4 y 7 y
- Juego de Cebadores y Sondas 9 que consiste en las SEC ID Nº: 3, 4 y 7.
- y
- (b)
- reactivos de amplificación.
La presente invención también proporciona un
cebador que tiene una secuencia que consiste en la SEC ID Nº:4.
Los juegos cebador-sonda que se
proporcionan aquí comprenden dos cebadores, y son útiles para la
amplificación de las secuencias diana, por ejemplo, en la PCR. Los
cebadores denominados SEC ID Nº:1-3 y SEC ID Nº:4
amplifican específicamente C. trachomatis.
Las secuencias identificadas aquí como SEC ID
Nº:5-7 son secuencias sonda útiles para detectar
Chlamydia trachomatis amplificada, por ejemplo, cuando se
amplifica Chlamydia trachomatis mediante cebadores que tiene
secuencias que se identifican por las SEC ID Nº:1-3
y 4.
Preferiblemente el juego de cebadores y sondas
comprende dos secuencias de cebador y una secuencia de sonda. Más
preferiblemente, el juego de cebadores y sondas se usa para la PCR.
Los juegos específicos de cebadores y sondas que se pueden emplear
para amplificar y detectar Chlamydia trachomatis incluyen los
juegos de sondas y cebadores del 1 al 9, que se exponen a
continuación.
El método para detectar Chlamydia
trachomatis comprenderá (a) la formación de una mezcla de
reacción que comprende reactivos de amplificación de ácidos
nucleicos, un juego de cebadores/sondas como se ha mencionado
anteriormente y una muestra de ensayo que contiene potencialmente al
menos una secuencia diana; (b) el sometimiento de la mezcla a
condiciones de amplificación para generar al menos una copia de una
secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia diana;
(c) la hibridación de la sonda con la secuencia de ácidos nucleicos
complementaria a la secuencia diana, para formar un híbrido que
comprenda la sonda y la secuencia de ácidos nucleicos complementaria
a la secuencia diana y (d) la detección del híbrido como una
indicación de la presencia de Chlamydia trachomatis en la
muestra de ensayo.
Además, cuando la amplificación es la PCR o un
proceso de amplificación termocíclica similar, la etapa (b) puede
repetirse múltiples veces para incrementar el número de copias de la
secuencia diana. Según otra realización, se puede detectar C.
trachomatis en una sola mezcla de reacción con el uso de juegos
de cebadores/sondas, que consisten en las SEC ID Nº:1, 4 y 6.
Los polinucleótidos que se usan en la presente
invención también se pueden proporcionar como parte de un kit útil
para amplificar y/o detectar C. trachomatis. Los kits
comprenden uno o más recipientes apropiados que contienen uno o más
juegos de cebadores/sondas o combinaciones de cebadores/sondas de
acuerdo con la presente invención, una enzima que tiene actividad
de polimerasa y desoxinucleótidos trifosfato. Al menos una secuencia
preferiblemente lleva un marcador.
En otro aspecto de la invención, un
polinucleótido diana control y una sonda polinucleotídica control se
incluyen en cualquiera de los métodos o kits que se proporcionan
aquí. En este aspecto de la invención, el juego de cebadores es
preferiblemente complementario a la secuencia diana al igual que la
diana control, mientras que la sonda diana es preferiblemente
complementaria sustancialmente sólo a la secuencia polinucleotídica
diana y la sonda control es preferiblemente complementaria
sustancialmente sólo a la diana control.
La presente invención proporciona composiciones
que comprenden polinucleótidos que pueden hibridar específicamente
con una secuencia de ácidos nucleicos o un complemento de la misma,
de Chlamydia trachonzantis (C. trachomatis o CT).
Estos polinucleótidos pueden usarse para
amplificar Chlamydia trachomatis, y para detectar
específicamente la presencia de cada organismo para la exclusión de
los otros. Actualmente, se conocen 16 cepas de Chlamydia
trachomatis, y el método detecta de de manera específica y
apropiada todas las cepas conocidas.
El término "hibrida específicamente" como
se usa aquí se refiere a la capacidad de un ácido nucleico de unirse
de manera específica y detectable a un segundo ácido nucleico. Los
polinucleótidos hibridan específicamente con hebras de ácido
nucleico diana en condiciones de hibridación y lavado que minimizan
las cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos
no específicos.
Una "secuencia diana" o una "secuencia de
ácidos nucleicos diana" como se usa aquí significa una secuencia
de ácidos nucleicos de CT o complemento de la misma, que se
amplifica, se detecta o tanto se amplifica como se detecta usando
uno o más de los polinucleótidos que se proporcionan aquí.
Adicionalmente, mientras el término secuencia diana a veces se
refiere a una secuencia de ácidos nucleicos de doble hebra, los
expertos en la materia reconocerán que la secuencia diana puede ser
también de una sola hebra. En casos en los que la diana es una
doble hebra, las secuencias polinucleotídicas del cebador de la
presente invención preferiblemente amplificarán ambas hebras de la
secuencia diana. Puede seleccionarse una secuencia diana que sea más
o menos específica para un organismo particular. Por ejemplo, la
secuencia diana puede ser específica de un género entero; más de un
género, una especie o subespecie, un serogrupo, un auxotipo, un
serotipo, una cepa, aislado u otro subconjunto de organismos. Las
secuencias polinucleotídicas de la presente invención se seleccionan
por su capacidad para hibridar específicamente con una gama de
subespecies o serotipos o auxotipos de CT.
El término "muestra de ensayo" como se usa
aquí, significa una muestra que se ha tomado de un organismo o
fluido biológico que se sospecha que contiene o potencialmente
contiene una secuencia diana de CT. La muestra de ensayo puede
tomarse de cualquier fuente biológica, tal como por ejemplo, tejido,
sangre, saliva, esputo, mucosidad, sudor, orina, frotis uretral,
frotis cervical, frotis anal o urogenital, frotis conjuntival,
líquido de las lentes oculares, líquido cefalorraquídeo, leche,
líquido ascítico, líquido sinovial, líquido peritoneal, líquido
amniótico, caldos de fermentación, cultivos celulares, mezclas de
reacciones químicas y similares. La muestra de ensayo se puede usar
(i) directamente como se obtiene de la fuente o (ii) después de un
pretratamiento para modificar el carácter de la muestra. Por lo
tanto, la muestra de ensayo puede pretratarse antes de usarse
mediante, por ejemplo, la preparación de suero o plasma de la
sangre, la rotura de células o partículas virales, la preparación
de líquidos a partir de materiales sólidos, la dilución de fluidos
viscosos, la filtración de líquidos, la destilación de líquidos, la
concentración de líquidos, la desactivación de componentes de
interferencia, la adición de reactivos, la purificación de ácidos
nucleicos y similares.
El término "marcador" como se usa aquí
significa una molécula o un resto que tiene una propiedad o
característica que se puede detectar y opcionalmente, se puede
cuantificar. Un marcador puede detectarse directamente con, como
por ejemplo (y sin limitación), radioisótopos, fluoróforos,
quimioluminóforos, enzimas, partículas coloidales, micropartículas
fluorescentes y similares, o un marcador puede detectarse
indirectamente, como por ejemplo, con miembros específicos de
unión. Se entenderá que los marcadores directamente detectables
pueden necesitar componentes adicionales tales como, por ejemplo,
sustratos, reactivos activadores, restos desactivadores, luz y
similares, para permitir la detección y/o cuantificación del
marcador. Cuando se usan los marcadores indirectamente detectables,
se usan generalmente en combinación con un "conjugado". Un
conjugado es generalmente un miembro de unión específica que se ha
unido o asociado a un marcador directamente detectable. Se conocen
bien en la técnica las químicas de asociación para sintetizar un
conjugado y pueden incluir, por ejemplo, cualquier medio químico
y/o físico que no destruya la propiedad de unión específica del
miembro de unión específica o la propiedad detectable del marcador.
"Miembro de unión específica", como se usa aquí significa un
miembro de un par de unión, es decir, dos moléculas diferentes en
las que una de las moléculas a través de, por ejemplo, medios
químicos o físicos se une específicamente a la otra molécula. Además
de pares de unión específica de antígeno y anticuerpo otros pares
de unión específica incluyen, pero no se pretende que se limiten a,
avidina y biotina; haptenos y anticuerpos específicos para
haptenos; secuencias complementarias de nucleótidos; cofactores de
enzimas o sustratos y enzimas y similares.
Un polinucleótido, en el contexto de la presente
invención, es un polímero de ácido nucleico, de ácido ribonucleico
(ARN), de ácido desoxirribonucleico (ADN), de ARN o ADN modificado o
de miméticos del ARN o del ADN (tal como, sin limitación los APN) y
derivados de los mismos y homólogos de los mismos. Por lo tanto, los
polinucleótidos incluyen polímeros compuestos de nucleobases que se
forman de manera natural, azúcares y enlaces internucleosídicos
covalentes (cadena principal), al igual que polímeros que tienen
porciones que no se forman de manera natural que funcionan de
manera similar. Dichos polímeros de ácidos nucleicos modificados o
sustituidos se conocen bien en la técnica y para los fines de la
presente invención, se les denomina "análogos". Los
polinucleótidos son preferiblemente polímeros modificados o no
modificados de ácido desoxirribonucleico o de ácido ribonucleico
para facilitar la preparación y el conocimiento al experto en la
materia.
Los análogos de polinucleótidos que son útiles
en la presente invención incluyen polímeros con cadenas principales
modificadas o enlaces internucleosídicos no naturales. De acuerdo
con la presente invención, las cadenas principales modificadas
incluyen aquellas que conservan un átomo de fósforo en la cadena
principal, tales como fosforotioatos, fosforotioatos quirales,
fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil
y otros alquilfosfonatos, al igual que aquellas que ya no tienen un
átomo de fósforo, tales como cadenas principales formadas por
enlaces internucleosídico alquilo o cicloalquilo de cadena corta,
mezclas de enlaces internucleosídicos alquilo o cicloalquilo y
heteroátomos o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o
heterocíclicos de cadena corta. Un ejemplo de dicha cadena
principal que no contiene fósforo es un enlace morfolino (véanse,
por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº: 5.185.444,
5.034.506 y 5.142.047). Como se sabe en la técnica, los polímeros
de ácidos nucleicos modificados (análogos) pueden contener uno o más
restos de azúcar modificados. Por ejemplo, los restos de azúcar
pueden modificarse mediante la sustitución en la posición 2' con un
grupo 2-metoxietoxi (2-MOE) (véase,
por ejemplo, Martin et al., (1995) Helv. Chim. Acta,
78:486-504).
La presente invención también contempla análogos
que son miméticos del ARN o el ADN, en los que tanto el azúcar como
el enlace internucleosídico de las unidades de nucleótidos se
remplazan con grupos nuevos. En estos miméticos las unidades de
base se mantienen mediante hibridación con la secuencia diana. Un
ejemplo de dicho mimético, que ha demostrado tener excelentes
propiedades de hibridación, es un ácido péptido nucleico (APN)
(Nielsen et al., (1991) Science,
254:1497-1500; Solicitud de Patente Internacional WO
92/20702). En compuestos de APN, la cadena principal de azúcar de
un oligonucleótido se reemplaza por una cadena principal que
contiene amida, por ejemplo una cadena principal de
aminoetilglicina. Las nucleobases se conservan y se unen
directamente o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la
amida.
\newpage
Los polinucleótidos que se contemplan para
usarse en la invención incluyen además derivados en los que la
molécula de ácido nucleico se ha modificado covalentemente por
sustitución química, enzimática u otros medios apropiados con un
resto que no sea un nucleótido que se forma de manera natural, por
ejemplo un resto que funciona como un marcador, como se describe
aquí.
La presente invención abarca además el uso de
homólogos de polinucleótidos que tienen secuencias de ácidos
nucleicos que se exponen en las SEC ID Nº: 1-7. Los
homólogos son ácidos nucleicos que tienen al menos una alteración
en la secuencia primaria, que no destruye la capacidad del
polinucleótido de hibridar específicamente con una secuencia diana,
como se describe anteriormente. Por consiguiente, se puede alterar
una secuencia primaria, por ejemplo, por la inserción, adición,
deleción o sustitución de uno o más de los nucleótidos de, por
ejemplo, las SEC ID Nº: 1-7. Por lo tanto, los
homólogos que son fragmentos de una secuencia que se describe en
las SEC ID Nº: 1-7 pueden tener una secuencia
consecutiva de por lo menos aproximadamente 7, 10, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o más nucleótidos de las secuencias de
ácidos nucleicos de las SEC ID Nº:1-7, y
conservarán la capacidad de hibridarse específicamente con una
secuencia diana, como se describe anteriormente.
Generalmente, los homólogos tendrán una
secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos un 50%, 60%, 70%,
80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos
con una secuencia de ácidos nucleicos que se expone en las SEC ID
Nº:1-7. La identidad con respecto a dichas
secuencias se define aquí como el porcentaje de nucleótidos en la
secuencia candidata que son idénticos a los polinucleótidos
conocidos después de alinear las secuencias e introducir huecos, si
es necesario para conseguir el máximo porcentaje de identidad. No se
debe interpretar que las deleciones terminales (5' ó 3') o
internas, las extensiones o inserciones dentro de la secuencia de
nucleótidos afecten a la identidad.
Por lo tanto, los polinucleótidos que se usan en
la presente invención comprenden cebadores y sondas que hibridan
específicamente con una secuencia diana de la invención, por ejemplo
las moléculas de ácido nucleico que tienen una cualquiera de las
secuencias de ácidos nucleicos que se exponen en las SEC ID Nº:
1-7, incluyendo análogos y/o derivados de dichas
secuencias de ácidos nucleicos y homólogos de las mismas que pueden
hibridar específicamente con una secuencia diana de la invención.
Como se describe a continuación, los polinucleótidos de la invención
se pueden usar como cebadores y/o sondas para amplificar o detectar
Chlamydia trachomatis.
Los polinucleótidos que se usan de acuerdo con
la presente invención pueden preparase mediante técnicas
convencionales bien conocidas por los expertos en la materia. Por
ejemplo, se pueden preparar los polinucleótidos usando la síntesis
de fase sólida convencional, usando equipos comercialmente
disponibles, tales como el disponible por parte de Applied
Biosystems USA Inc. (Ciudad de Foster, California), DuPont
(Wilmington, Delaware) o Milligen (Bedford, Massachussets). Los
polinucleótidos modificados, tales como los fosforotioatos y los
derivados alquilados, también pueden prepararse fácilmente por
métodos similares conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo las
Patentes de Estados Unidos 5.464.746; 5.424.414 y 4.948.882.
Los polinucleótidos que se usan de acuerdo con
la presente invención pueden emplearse directamente como sondas
para la detección o cuantificación, o ambas, de los ácidos nucleicos
de CT y/o NG en una muestra de ensayo. Se pone en contacto la
muestra de ensayo con al menos uno de los polinucleótidos de la
presente invención en las condiciones adecuadas de hibridación y
después se detecta la hibridación entre la secuencia diana y al
menos uno de los polinucleótidos mediante métodos bien conocidos en
la técnica.
Los polinucleótidos que se usan en la presente
invención pueden incorporar uno o más marcadores detectables. Los
marcadores detectables son moléculas o restos que tienen una
propiedad o característica que se puede detectar directa o
indirectamente y se eligen de modo que la capacidad del
polinucleótido para hibridarse con su secuencia diana no esté
afectada negativamente. Los métodos de marcaje de secuencias de
ácidos nucleicos se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo,
Ausubel et al., (1997 & actualizaciones) Current
Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, Nueva York).
Los marcadores de detección tienen la misma
definición que los "marcadores" que se definen anteriormente y
los "marcadores de captura" se usan generalmente para separar
productos de la extensión y sondas asociadas con cualquiera de
dichos productos, de otros reactivos de amplificación. Los miembros
de unión específica (como se define anteriormente) son adecuados
para este fin. También, las sondas que se usan de acuerdo con este
método pueden estar bloqueadas en sus extremos 3', así no se
extienden en condiciones de hibridación. Se conocen bien los
métodos para prevenir la extensión de una sonda y son una cuestión
de elección para un experto en la materia. Generalmente, bastará
añadir un grupo fosfato al extremo 3' de la sonda para los fines de
bloquear la extensión de la
sonda.
sonda.
En casos en los que se emplean marcadores para
detectar productos amplificados por cebadores, las secuencias de
cebadores se pueden marcar opcionalmente con un marcador de captura
o un marcador de detección. La secuencia de la sonda se usa para
hibridar con la secuencia generada mediante la secuencia del
cebador, y generalmente hibrida con una secuencia que no incluye la
secuencia del cebador. De manera similar a la secuencia del cebador,
la secuencia de la sonda puede marcarse también con un marcador de
captura o un marcador de detección con la advertencia de que cuando
el cebador se marca con un marcador de captura, la sonda se marca
con un marcador de detección, y viceversa. Tras la formación de los
híbridos de secuencia de copia/sonda, se pueden usar los marcadores
diferenciales (es decir marcadores de captura y detección) en la
secuencia de copia y en la secuencia de sonda para separar y
detectar dichos híbridos. En una realización de la presente
invención, la detección se realiza de acuerdo con los protocolos
que se usan mediante la instrumentación Abbott LCx® (Laboratorios
Abbott; Abbot Park, IL) comercialmente disponible.
Los polinucleótidos que se usan de acuerdo con
la presente invención también son adecuados para usarse como sondas
de captura en ensayos tipo sándwich. Las sondas de captura y los
ensayos de hibridación en sándwich se conocen bien en la técnica.
En resumen, la sonda de captura polinucleotídica se une a un soporte
sólido y se pone en contacto con una muestra de ensayo en las
condiciones adecuadas de hibridación tales que se forma un híbrido
sonda:diana entre la sonda de captura y cualquier ácido nucleico
diana presente en la muestra de ensayo. Después de una o más etapas
apropiadas de lavado, se detecta el híbrido sonda:diana, normalmente
por medio de una segunda sonda de "divulgación" o por medio de
un anticuerpo específico que reconoce la molécula híbrida. Se
considera, por lo tanto, que el uso de polinucleótidos de CT y/o NO
de la invención como sonda de captura o divulgación o ambas, en
dichos ensayos de hibridación en sándwich está dentro del ámbito de
la presente invención.
La presente invención también contempla el uso
de polinucleótidos en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos
modificados. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.627.030
describe un método para amplificar la señal de detección en un
ensayo de hibridación de ácidos nucleicos. En el ensayo que se
describe, una primera secuencia de sonda polinucleotídica hibrida
con una secuencia diana en las condiciones adecuadas, posteriormente
el híbrido sonda:diana se inmunocaptura y se inmoviliza. Una
segunda secuencia de sonda polinucleotídica que contiene muchas
unidades de secuencia repetidas hibrida después con el componente de
la sonda del híbrido sonda:diana. Se consigue la detección mediante
la hibridación de muchas sondas de secuencias de ácidos nucleicos
marcados, presentes una a una de las unidades de secuencia repetidas
en la segunda sonda. Por lo tanto, la unión de múltiples sondas
marcadas a la segunda sonda amplifica la señal de detección y
aumenta la sensibilidad del ensayo. Por lo tanto se considera que,
el uso de polinucleótidos de la actual invención en ensayos de
hibridación modificados de este tipo, directamente como primera
sonda o como segunda sonda después de la modificación, para
incorporar unidades de secuencia repetidas adicionales mediante
técnicas patrón, está dentro del ámbito de la presente
invención.
Los polinucleótidos que se usan en la invención
se usan como cebadores o sondas para amplificar y/o detectar CT en
una muestra de ensayo. Los juegos de cebadores/sondas que se
proporcionan aquí comprenden dos cebadores y al menos una sonda.
Estos juegos de cebadores/sondas se pueden emplear de acuerdo con
las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos. Por lo tanto,
los cebadores en cualquier juego de cebadores/sondas particular se
pueden emplear para amplificar la secuencia diana. En la mayoría de
los casos, la sonda hibrida con las copias de la secuencia diana
que se generan por uno de los cebadores y generalmente facilita la
detección de cualquiera de las copias de la secuencia diana
generada durante el curso de la reacción de amplificación. Todos los
juegos de cebadores/sondas se pueden emplear de acuerdo con
procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos para detectar
CT de manera específica y con sensibilidad cuando se combinan los
cebadores y sondas apropiados. Se contempla que los cebadores y
sondas individuales de los juegos de cebadores/sondas que se
proporcionan aquí pueden usarse alternativamente en combinación con
cebadores y/o sondas que no sean aquellos que se describen en los
juegos de cebadores/sondas que se proporcionan aquí.
Se conocen bien los procedimientos de
amplificación en la técnica e incluyen, pero sin limitación, la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la TMA, la amplificación
por círculo rodante, la amplificación basada en secuencias de
ácidos nucleicos (NASBA) y la amplificación por desplazamiento de
hebra (SDA). Un experto en la materia entenderá que para usar los
cebadores en ciertas técnicas de amplificación se puede necesitar su
modificación, por ejemplo, para SDA el cebador comprende
nucleótidos adicionales cerca de su extremo 5' que constituyen un
sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción. De
manera similar, para NASBA el cebador comprende nucleótidos
adicionales cerca del extremo 5' que constituyen un promotor de la
ARN polimerasa. Por lo tanto, se considera que los polinucleótidos
modificados están dentro del ámbito de la presente invención.
Como se sabe bien en la técnica, se necesita
tener en cuenta ciertos criterios cuando se selecciona un cebador
para una reacción de amplificación. Por ejemplo, cuando se necesita
un par de cebadores para la reacción de amplificación, se deben
seleccionar los cebadores de modo que la probabilidad de formar
dúplex 3' esté minimizada, y de modo que las temperaturas de fusión
(T_{M}) sean lo suficientemente similares para optimizar el
apareamiento con la secuencia diana y minimizar la cantidad de
apareamiento no específica. En este contexto, los polinucleótidos
de acuerdo con la presente invención se proporcionan en
combinaciones que se pueden usar como cebadores en las reacciones
de amplificación para amplificar específicamente secuencias de
ácidos nucleicos diana.
El método de amplificación de la presente
invención generalmente comprende (a) la formación de una mezcla de
reacción que comprende reactivos de amplificación de ácidos
nucleicos, al menos un juego de cebadores/sondas de la presente
invención y una muestra de ensayo que se sospecha que contiene al
menos una secuencia diana y (b) el sometimiento de la mezcla a
condiciones de amplificación para generar al menos una copia de una
secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia
diana.
La etapa (b) de los métodos anteriores se puede
repetir cualquier número adecuado de veces (antes de la etapa (c)
en el método de detección), por ejemplo, mediante ciclación térmica
de la mezcla de reacción entre 10 y 100 veces, generalmente entre
aproximadamente 20 y aproximadamente 60 veces, más generalmente
entre aproximadamente 25 y aproximadamente 45 veces.
Los reactivos de amplificación de ácidos
nucleicos incluyen reactivos que se conocen bien y que pueden
incluir, pero sin limitación, una enzima que tiene al menos
actividad polimerasa, cofactores de enzimas tales como magnesio o
manganeso; sales; dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD) y
desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) tales como, por ejemplo,
desoxiadenosina trifosfato, desoxiguanosina trifosfato,
desoxicitosina trifosfato y desoxitimina trifosfato.
Las condiciones de amplificación son condiciones
que generalmente fomentan el apareamiento y la extensión de una o
más secuencias de ácidos nucleicos. Se sabe bien que dicho
apareamiento depende de un modo más bien predecible de diversos
parámetros, que incluyen la temperatura, la fuerza iónica, la
longitud de secuencia, la complementariedad y el contenido en G:C
de las secuencias. Por ejemplo, bajar la temperatura en el medio de
las secuencias complementarias de ácido nucleico fomenta el
apareamiento de cebadores. Para cualquier juego de secuencias dado,
la temperatura de fusión o Tm, se puede estimar mediante cualquiera
de diversos métodos conocidos. Generalmente, las aplicaciones
diagnósticas utilizan temperaturas de hibridación que están
aproximadamente 10ºC (por ejemplo, de 2ºC a 18ºC) por debajo de la
temperatura de fusión. La fuerza iónica o la concentración de
"sal" también afecta a la temperatura de fusión, puesto que
pequeños cationes tienden a estabilizar la formación de dúplex
anulando la carga negativa de la cadena principal de fosfodiéster.
Aunque las concentraciones típicas de sal dependen de la naturaleza
y valencia del catión, los expertos en la materia las entienden
fácilmente. De manera similar, se sabe que un alto contenido en G:C
y una longitud de secuencia aumentada estabilizan la formación de
dúplex porque el apareamiento de bases G:C implica 3 puentes de
hidrógeno mientras que los pares A:T tienen sólo dos, y porque las
secuencias más largas tienen más puentes de hidrógeno que mantienen
unidas las secuencias. Por lo tanto, un alto contenido en G:C y
longitudes de secuencia más largas afectan a las condiciones de
hibridación mediante el aumento de la temperatura de fusión.
Una vez se han seleccionado las secuencias para
una aplicación diagnóstica dada, se conocerá el contenido en G:C y
la longitud y se pueden tener en cuenta para determinar precisamente
qué condiciones de hibridación abarcará. Puesto que la fuerza
iónica se optimiza generalmente para la actividad enzimática, el
único parámetro que queda por variar es la temperatura.
Generalmente, la temperatura de hibridación se selecciona para que
esté cerca o sea la Tm de los cebadores o sonda. Por lo tanto, la
obtención de condiciones apropiadas de hibridación para un juego
particular de cebadores/sondas está bien dentro de los conocimientos
comunes de alguien que practica esta técnica.
Como se menciona previamente, las secuencias de
cebadores (SEC ID Nº: 1-4) de cualquier juego de
cebadores/sondas particular, pueden usarse por ellas solas o con
polinucleótidos adicionales, como cebadores de amplificación de
acuerdo con procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos bien
conocidos en la técnica. Dichas reacciones incluyen, pero no se
pretende que se limiten a, la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) que se describe en las Patentes de Estados Unidos 4.683.195 y
4.683.202, la reacción en cadena de la ligasa (LCR) que se describe
en el documento EP-A-320 308, y la
gap LCR (GLCR) que se describe en la patente de Estados Unidos Nº
5.427.930. Cada una de estas reacciones de amplificación ejemplares
genera múltiples copias de una secuencia diana de ADN.
En una realización de la presente invención, el
método de detección generalmente comprende (a) la formación de una
mezcla de reacción que comprende reactivos de amplificación de
ácidos nucleicos; al menos un juego de cebadores/sondas de la
presente invención, y una muestra de ensayo que se sospecha que
contiene al menos una secuencia diana; (b) el sometimiento de la
mezcla a condiciones de amplificación para generar al menos una
copia de una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la
secuencia diana; (c) la hibridación de la sonda con la secuencia de
ácidos nucleicos complementaria a la secuencia diana para formar un
híbrido que comprenda la sonda y la secuencia de ácidos nucleicos
complementaria a la secuencia diana y (d) la detección del híbrido
como una indicación de la presencia de la secuencia diana (CT y/o NG
y/o una secuencia control) en la muestra.
Se pueden detectar amplicones específicos que se
producen por amplificación de las secuencias de ácidos nucleicos
diana usando los polinucleótidos de la presente invención, como se
describe anteriormente, mediante una diversidad de métodos
conocidos en la técnica. Por ejemplo, uno o más de los cebadores que
se usan en las reacciones de amplificación pueden marcarse de modo
que pueda detectarse un amplicón directamente por técnicas
convencionales posteriores a la reacción de amplificación. Como
alternativa, se puede añadir después de que la reacción de
amplificación esté completa una sonda que consiste en una versión
marcada de uno de los cebadores que se usan en la reacción de
amplificación o un tercer polinucleótido diferente de las secuencias
de cebador marcado y que es complementario a una región de la
secuencia amplificada. Después se somete la mezcla a las condiciones
de hibridación y lavado apropiadas y se detecta el marcador por
métodos convencionales.
El producto de la amplificación que se produce
como se indica anteriormente se puede detectar durante o después de
la amplificación de la secuencia diana. Los métodos para detectar la
amplificación de una secuencia diana durante la amplificación se
han indicado anteriormente, y se describen, por ejemplo, en la
Patente de Estados Unidos Nº 5.210.015. Se puede emplear la
electroforesis en gel para detectar los productos de una reacción
de amplificación después de su finalización. Como alternativa, los
productos de amplificación hibridan con las sondas, después se
separan de otros componentes de la reacción y se detectan usando
micropartículas y sondas marcadas.
Se apreciará fácilmente que un procedimiento que
permita que tanto la amplificación como la detección de secuencias
de ácidos nucleicos diana tengan lugar al mismo tiempo en un solo
recipiente de reacción cerrado sería ventajoso. Dicho procedimiento
evitaría el riesgo de contaminación de "arrastre" en las etapas
de procesamiento post-amplificación, y también
facilitaría exploraciones de alto rendimiento o ensayos y la
adaptación del procedimiento a la automatización.
Además, este tipo de procedimiento permite el
control a "tiempo real" de la reacción de amplificación al
igual que el control en el "punto-final" más
convencional.
Por lo tanto, la presente invención incluye el
uso de los polinucleótidos en un método para amplificar y detectar
específicamente secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra
de ensayo en un formato de un solo tubo. Esto puede conseguirse,
por ejemplo, incluyendo un tinte intercalante tal como el verde SYBR
o un anticuerpo que detecte específicamente la secuencia de ácidos
nucleicos amplificada en el recipiente de reacción. Como
alternativa un tercer polinucleótido diferente de las secuencias de
cebador, que es complementario a una región de la secuencia que se
amplifica, puede incluirse en la reacción, como cuando se usa un
juego de sondas/cebadores de la invención.
Para usarse en un ensayo como se describe
anteriormente, en el que tanto la amplificación con cebadores de
polinucleótidos como la detección de secuencias diana usando una
sonda polinucleotídica se producen al mismo tiempo en un solo
recipiente de reacción cerrado, la sonda polinucleotídica necesita
tener ciertas propiedades. Por ejemplo, puesto que la sonda estará
presente durante la reacción de amplificación, no debería interferir
en el progreso de esta reacción y también debería ser estable en
las condiciones de la reacción. Además, para el control a tiempo
real de las reacciones, la sonda debería ser capaz de unirse a su
secuencia diana en las condiciones de la reacción de amplificación
y emitir una señal sólo tras unirse a esta secuencia diana. Los
ejemplos de moléculas de sonda que son particularmente adecuados
para este tipo de procedimiento incluyen sondas fluorescibles y
sondas TaqMan®.
La presente invención, por lo tanto, contempla
el uso de polinucleótidos como las sondas TaqMan®. Como se sabe en
la técnica, las sondas TaqMan® son sondas de ácidos nucleicos con
doble marcaje fluorogénico, compuestas de un polinucleótido
complementario a la secuencia diana, que está marcado en el extremo
5' terminal con un fluoróforo y en el extremo 3' terminal con un
inactivador. Las sondas TaqMan®se usan generalmente como sondas de
tiempo real en las reacciones de amplificación. En la sonda libre,
la cercana proximidad del fluoróforo y inactivador asegura que el
fluoróforo se extinga internamente. Durante la fase de extensión de
la reacción de amplificación, la actividad nucleasa 5' de la
polimerasa escinde la sonda y se libera el fluoróforo. Después, el
fluoróforo liberado puede emitir fluorescencia y por lo tanto
produce una señal detectable.
La presente invención además contempla el uso de
los polinucleótidos como sondas "fluorescibles". Las sondas
fluorescibles se conocen bien en la técnica, por ejemplo, véanse las
Patentes de Estados Unidos Nº: 6.150.097; 5.925.517 y 6.103.476.
Básicamente, las sondas fluorescibles son sondas polinucleotídicas
capaces de formar una estructura tallo-bucle
(horquilla). El bucle es una estructura de una sola hebra que
contiene secuencias complementarias a la secuencia diana, mientras
que el tallo generalmente no está relacionado con la secuencia
diana e hibrida consigo mismo para formar una región de doble hebra.
Los nucleótidos que son complementarios a la secuencia diana y
pueden hibridar consigo mismos pueden también formar parte de la
región del tallo. Un resto de fluoróforo se une a un brazo del
tallo y un resto del inactivador se une al otro brazo. Cuando el
polinucleótido adopta una forma de horquilla, el fluoróforo y el
inactivador están en cercana proximidad y por lo tanto la energía
que emite el fluoróforo la absorbe el inactivador y la emite como
calor, dando como resultado la extinción interna del fluoróforo.
Tras la unión del polinucleótido a su secuencia diana, el fluoróforo
y el inactivador se separan espacialmente y el fluoróforo puede
emitir fluorescencia produciendo una señal detectable.
Preferiblemente, los cebadores y sondas de la presente invención se
seleccionan de modo que la sonda se una establemente (por ejemplo,
menos del 5% de sonda unida al amplicón se desplaza durante 24 horas
en las condiciones de hibridación de la sonda con el amplicón) al
amplicón cuando se enfría la reacción desde una temperatura de
desnaturalización, por ejemplo, de 90ºC a 96ºC, a una temperatura
por debajo de la Tm para la unión de la sonda con el amplicón.
La presente invención contempla además el uso de
polinucleótidos que se utilizan en la invención como sondas
lineales junto con un fluoróforo y un inactivador de alta eficacia,
como los Black Hole Quenchers (BHQ^{TM}; Biosearch Technologies,
Inc., Novato, CA). Como se sabe en la técnica, la alta eficacia de
inactivación y la carencia de fluorescencia nativa de los tintes
BHQ^{TM} permite que ocurra la inactivación en ovillo aleatorio
en sondas lineales marcadas en un extremo terminal con un fluoróforo
y en el otro con un tinte BHQ^{TM}, asegurando de esta manera que
el fluoróforo no emita fluorescencia cuando la sonda está en una
solución. Tras la unión a su secuencia diana, la sonda se estira,
por lo tanto el fluoróforo y el inactivador se separan
espacialmente y el fluoróforo emite fluorescencia. Un experto en la
materia apreciará que los tintes BHQ^{TM} también pueden usarse
como el resto inactivador de la fluorescencia en sondas
fluorescibles o TaqMan®.
Un experto en la materia puede determinar
fácilmente los fluoróforos e inactivadores de la fluorescencia
adecuados para usarse con los polinucleótidos que se utilizan en la
presente invención (véase también, Tyagi et al., Nature
Biotechnol., 16:49-53 (1998); Marras et al.,
Genet. Anal.: Biomolec. Eng., 14:151-156 (1999)).
Muchos fluoróforos e inactivadores de la fluorescencia están
comercialmente disponibles, por ejemplo por parte de Molecular
Probes (Eugene OR) o Biosearch Technologies, Inc. (Novato, CA). Los
ejemplos de fluoróforos que se pueden usar en la presente invención
incluyen, pero sin limitación, fluoresceína y derivados de
fluoresceína tales como dihalo-(C_{1} a
C_{8})dialcoxicarboxifluoresceína, ácido
5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico
(EDANS), coumarina y derivados de coumarina amarillo, Lucifer, rojo
Texas, tetrametilrodamina,
tetracloro-6-carboxifluoresceína,
5-carboxirodamina, tintes de cianina y similares.
Los inactivadores de la fluorescencia incluyen, pero sin
limitación, DABCYL, ácido
4'-(4-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABSYL),
4-dimetilaminofenilazofenil-4'-maleimidina
(DABMI), tetrametilrodamina, carboxitetrametilrodamina (TAMRA),
tintes BHQ^{TM} y similares. Se conocen bien los métodos de unión
de fluoróforos y inactivadores de la fluorescencia a los ácidos
nucleicos.
En una realización de la presente invención, las
sondas son sondas fluorescibles. Como se sabe en la técnica,
necesitan cumplirse ciertos criterios para que una sonda
fluorescible tenga éxito en el control o detección de una reacción
de amplificación. La presente invención, por lo tanto, proporciona
sondas fluorescibles que comprenden polinucleótidos de la presente
invención junto con regiones autocomplementarias flanqueantes. Los
polinucleótidos de la presente invención pueden formar la región de
bucle de la sonda fluorescible o pueden formar la región del bucle
o parte de la región del tallo. Por lo tanto, las secuencias
autocomplementarias del tallo pueden no estar relacionadas con la
secuencia diana o pueden contener uno o más nucleótidos que son
complementarios a la secuencia diana.
Un experto en la materia entenderá que la
selección de cebadores a usar con la sonda fluorescible también
necesita cumplir ciertos criterios. Por ejemplo, es importante que
no haya áreas de complementariedad que puedan causar que la sonda
fluorescible se una a un cebador, lo que daría como resultado una
elevada señal de fondo.
La presente invención proporciona:
combinaciones, que comprenden dos cebadores y al menos una sonda,
que se pueden usar para amplificar y detectar específicamente
secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra de ensayo. En
una realización relacionada, los juegos de cebadores/sondas se
proporcionan para la amplificación y detección de secuencias de
ácidos nucleicos diana mediante PCR fluorescible.
Como se sabe en la técnica, se pueden usar
sondas fluorescibles para controlar el progreso de una reacción de
amplificación a tiempo real. Durante el curso de una reacción de
amplificación, tal como una PCR, la sonda fluorescible interacciona
con su secuencia diana a la temperatura de apareamiento para la
sonda y se genera una señal fluorescente. Según aumenta el número
de hebras marcadas que se producen en la reacción de amplificación,
el número de sondas fluorescibles unidas a sus secuencias diana
aumenta simultáneamente, como lo hace la fuerza de la señal
fluorescente.
Por lo tanto, de acuerdo con la presente
invención, las combinaciones de dos cebadores y al menos una sonda,
como se describe anteriormente, pueden usarse en los ensayos de
amplificación y detección de punto final, en los que la fuerza de
la señal detectable se mide al finalizar la reacción de
amplificación o en los ensayos de amplificación y detección a
tiempo real, en los que la fuerza de la señal detectable se controla
durante el curso de la reacción de amplificación.
Se conocen en la técnica diversos tipos de
patrones para ensayos cuantitativos. Por ejemplo, el patrón puede
consistir en una curva patrón que se obtiene mediante la
amplificación y detección de cantidades conocidas de ácidos
nucleicos de CT en las condiciones del ensayo. Como alternativa, se
puede incluir un patrón interno en la reacción. Dichos patrones
internos generalmente comprenden una secuencia de ácidos nucleicos
diana control y una sonda polinucleotídica control. El patrón
interno puede además incluir opcionalmente un par adicional de
cebadores. La secuencia primaria de estos cebadores control puede no
estar relacionada con los polinucleótidos de la presente invención
y ser específica para la secuencia de ácidos nucleicos diana
control. Como alternativa, no se necesita usar un cebador adicional
si la secuencia diana control se diseña de modo que se une a un
extremo con un cebador de un primer juego de cebadores/sondas
dirigido a una primera secuencia diana (por ejemplo, CT), y se une
al otro extremo con un cebador de un segundo juego de
cebadores/sondas dirigido a una segunda secuencia diana (por
ejemplo, NG), de modo que las copias se generarán en condiciones de
amplificación.
En el contexto de la presente invención, una
secuencia de ácidos nucleicos diana control es una secuencia de
ácidos nucleicos que:
- (a)
- puede amplificarse por un cebador de CT o por un par de cebadores que se usan en una reacción particular o por diferentes cebadores control;
- (b)
- hibrida específicamente con la sonda control en las condiciones adecuadas y
- (c)
- no hibrida con una sonda específica CT en las mismas condiciones.
En el contexto de la presente invención, además
de satisfacer las necesidades estándar para las moléculas de sonda,
la sonda polinucleotídica control para usarse en reacciones de
cuantificación:
- (a)
- hibrida específicamente con la secuencia control en las condiciones adecuadas;
- (b)
- cuando se está detectando una secuencia diana de CT, no hibrida en las mismas condiciones con una secuencia de CT, con la sonda específica de CT o con los cebadores específicos de CT;
- (c)
- incorpora un marcador detectable que es diferente del marcador incorporado en otras sondas (por ejemplo sondas de CT) en uso en la misma mezcla de reacción. Por lo tanto, pueden distinguirse y cuantificarse por separado las señales que se generan mediante estos marcadores diversos cuando se unen a sus respectivas secuencias diana.
Un experto en la materia reconocerá que la
secuencia real de ácidos nucleicos del ácido nucleico diana control
y de la sonda control no son importantes, siempre que ambas cumplan
los criterios que se resumen anteriormente.
\newpage
En el contexto de la presente invención, se
puede cuantificar la cantidad de ácido nucleico diana en una muestra
de ensayo usando métodos de "punto final" o métodos de
"tiempo real". Un experto en la materia apreciará que cuando
los polinucleótidos de la presente invención se usan como sondas
específicas de CT en ensayos cuantitativos, pueden ser sondas de
hibridación convencionales, sondas lineales BHQ^{TM}, sondas
TaqMan®, sondas fluorescibles o combinaciones o versiones
modificadas de las mismas. En una realización de la presente
invención, los polinucleótidos se usan como sondas
fluorescibles.
La presente invención también contempla la
provisión de uno cualquiera o más de los juegos de cebadores/sondas
de la invención junto con una secuencia de ácidos nucleicos diana
control, que se puede amplificar mediante el par de cebadores
especificado, y una sonda polinucleotídica control para las
reacciones cuantitativas. La presente invención proporciona además
la inclusión de cebadores control, que amplifican específicamente
la secuencia de ácidos nucleicos diana control, en las reacciones
cuantitativas. Los métodos de amplificación y/o detección, en los
que los polinucleótidos de acuerdo con la presente invención se
pueden emplear, son adecuados para su adaptación como ensayos de
alto rendimiento. Los ensayos de alto rendimiento proporcionan la
ventaja de explorar muchas muestras al mismo tiempo y disminuir de
manera significativa el tiempo que se necesita para procesar un
gran número de muestras. La presente invención, por lo tanto;
contempla el uso de la composición de polinucleótidos de la
presente invención en la exploración o ensayo de alto rendimiento
para detectar y/o cuantificar los ácidos nucleicos de CT en una
pluralidad de muestras de ensayo.
Para los ensayos de alto rendimiento, los
componentes de la reacción se encuentran normalmente en un
transportador o plataforma multicontenedor, tal como una placa
multipocillo de microtitulación, que permite una pluralidad de
reacciones de ensayo que contienen diferentes muestras de ensayo a
controlar en el mismo ensayo. La presente invención también
contempla ensayos de alto rendimiento altamente automatizados para
aumentar la eficacia del proceso de exploración o ensayo. Muchos
sistemas de exploración o ensayo de alto rendimiento están
comercialmente disponibles en este momento, como también lo están
las capacidades de automatización para muchos procedimientos tales
como, por ejemplo la extracción de muestra y reactivo usando una
pipeta, la dosificación de líquidos, las incubaciones temporizadas,
el formateado de muestras en micromatrices, el termociclado en
microplaca y las lecturas en microplaca en un detector apropiado,
dando como resultado en unos tiempos de rendimiento mucho más
rápidos.
De acuerdo con la presente invención se pueden
proporcionar los juegos de cebadores/sondas como parte de un kit
que permite la detección y/o cuantificación de los ácidos nucleicos
de CT. Dichos kits comprenden uno o más juegos de cebadores/sondas
de la invención.
En una realización de la presente invención, se
proporcionan los polinucleótidos en combinaciones en los kits para
su uso como cebadores para amplificar específicamente los ácidos
nucleicos de CT en una muestra de ensayo. En una realización
relacionada, se proporcionan los polinucleótidos en combinaciones
que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos como se expone en
las SEC ID Nº: 1 y 4 y/o SEC ID Nº: 8 y 9.
En otra realización, en los kits los juegos de
cebadores/sondas comprenden las secuencias de ácidos nucleicos como
se expone en las SEC ID Nº: 1, 4 y 5; SEC ID Nº: 2, 4 y 5; SEC ID
Nº: 3, 4 y 5, SEC ID Nº: 1, 4 y 6 y SEC ID Nº: 2, 4 y 6.
Los kits para la detección de ácidos nucleicos
de CT pueden contener adicionalmente un ácido nucleico diana
control y una sonda polinucleotídica control. Por lo tanto, en una
realización de la presente invención, los kits comprenden una de
las combinaciones anteriores de polinucleótidos, que comprende al
menos dos cebadores y al menos una sonda, junto con una secuencia
de ácidos nucleicos diana control, que puede amplificarse mediante
el par de cebadores especificado y una sonda polinucleotídica
control. La presente invención además proporciona kits que incluyen
cebadores control, que amplifican específicamente la secuencia de
ácidos nucleicos diana control.
Los kits pueden incluir opcionalmente reactivos
de amplificación, componentes de reacción y/o recipientes de
reacción. Generalmente, al menos una secuencia lleva un marcador,
pero es posible la detección sin ésta. Por lo tanto, uno o más de
los polinucleótidos proporcionados en el kit pueden tener un
marcador detectable incorporado o el kit puede incluir reactivos
para marcar los polinucleótidos. Uno o más de los componentes del
kit puede estar liofilizado y además el kit puede comprender
reactivos adecuados para la reconstitución de los componentes
liofilizados. El kit puede contener adicionalmente instrucciones
para el uso.
La composición de polinucleótidos, los métodos y
los kits de la presente invención son útiles para la detección y/o
cuantificación de ácidos nucleicos de CT en los entornos clínicos o
de investigación. Por lo tanto, en estos entornos los
polinucleótidos pueden usarse en ensayos para diagnosticar la
infección por CT en un sujeto o para controlar la cantidad de una
secuencia de ácidos nucleicos diana de CT en un sujeto infectado con
CT. El control de la cantidad de bacterias en un sujeto es
particularmente importante para identificar o controlar la
respuesta a la terapia antibacteriana.
Los cebadores y las sondas útiles para
amplificar y/o detectar Chlamydia trachomatis (CT) o
Neisseria gonorrhoeae (NG)* se presentan a continuación en
la Tabla 1.
En la Tabla 1, las secuencias de sonda
polinucleotídica complementarias a las secuencias bacterianas se
indican en letras mayúsculas; los nucleótidos en letras minúsculas
son autocomplementarios de modo que forman un tallo de una sonda
fluorescible en las condiciones adecuadas; y en algunos casos, los
nucleótidos complementarios a las secuencias bacterianas también
forman parte del tallo autocomplementario de la sonda
fluorescible.
Los ácidos nucleicos que tienen secuencias
polinucleotídicas de la Tabla 1 pueden combinarse en combinaciones
adecuadas para formar un juego de cebadores/sondas útil en el
contexto de la presente invención. Juegos de cebadores/sondas
adecuados incluyen, pero sin limitación:
Juego de Cebadores y Sondas 1: SEC ID Nº: 1, 4,
y 5;
Juego de Cebadores y Sondas 2: SEC ID Nº: 2, 4,
y 5;
Juego de Cebadores y Sondas 3: SEC ID Nº: 3, 4,
y 5;
Juego de Cebadores y Sondas 4: SEC ID Nº: 1, 4,
y 6;
Juego de Cebadores y Sondas 5: SEC ID Nº: 2, 4,
y 6;
Juego de Cebadores y Sondas 6: SEC ID Nº: 3, 4,
y 6;
Juego de Cebadores y Sondas 7: SEC ID Nº: 1, 4,
y 7;
Juego de Cebadores y Sondas 8: SEC ID Nº: 2, 4,
y 7 y
Juego de Cebadores y Sondas 9: SEC ID Nº: 3, 4,
y 7.
Los siguientes ejemplos son sólo para fines
ilustrativos y no deben considerarse limitantes del ámbito de esta
invención de ninguna manera.
Los siguientes ejemplos demuestran la detección
de varios subtipos de CT y NO usando los juegos de cebadores/sondas
que se describen anteriormente. Estos cebadores y sondas de ADN que
comprenden los juegos de cebadores/sondas se identifican como las
SEC ID Nº: 1-7 son específicos para CT.
En los siguientes ejemplos, las SEC ID Nº: 1 y 4
se usan como cebadores consenso de amplificación específicos para
la secuencia diana de CT. Las SEC ID Nº: 6 ó 7 se usan como sondas
consenso de hibridación interna para el producto de la
amplificación de CT.
La parte de los ejemplos que se refiere a la
detección de NG no forma parte de la invención reivindicada.
Se designaron cebadores consenso para detectar
todos los subtipos conocidos de CT mediante la hibridación de
oligonucleótidos por PCR. En los siguientes ejemplos, estos
cebadores fueron la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 4 para CT y la SEC
ID Nº: 8 y la SEC ID Nº: 9 para NG. Se observó que la SEC ID Nº: 3
tenía ciertas ventajas en comparación con la SEC ID Nº: 1 para
alguna realización de la presente invención, que se refieren a la
facilidad de purificación de estos polinucleótidos. Sin embargo,
esas realizaciones no se ilustran a continuación, y los inventores
prefieren usar la SEC ID Nº: 1 a usar la SEC ID Nº: 3.
Se diseñaron las sondas consenso para hibridar
con la secuencia diana amplificada de CT o NG mediante la
hibridación de oligonucleótidos. Se modificaron estas secuencias de
sonda para usarse como sondas en un ensayo fluorescible mediante la
adición de nucleótidos terminales para generar extremos 5' y 3'
autocomplementarios y de restos fluorescentes (fluo) e
inactivadores en extremos opuestos del polinucleótido (véase la
Tabla 2). Por lo tanto, la secuencia de sonda de CT de la SEC ID
Nº: 6 fue la base de la sonda fluorescible de la SEC ID Nº: 7 y la
secuencia de sonda de NG de la SEC ID Nº: 10 fue la base de la sonda
fluorescible de la SEC ID Nº: 12. Cuando se usó más de una sonda
fluorescible, simultáneamente en el mismo ensayo fluorescible se
usaron los restos fluorescentes con diferentes perfiles de
excitación-emisión para diferenciar entre las
distintas señales de sonda.
Se sintetizaron las secuencias de sonda usando
metodología de síntesis de oligonucleótidos estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló el ADN de CT de los serotipos Ba de CT,
cepa Apace-2 (ATCC VR-347.
Rockville, Maryland), usando métodos conocidos en la técnica, y se
usó para valorar la sensibilidad, especificidad y reactividad
cruzada de los juegos de cebadores/sondas consenso de CT. El ADN de
NG se preparó de manera similar y se usó para valorar la
sensibilidad, especificidad y la reactividad cruzada de los juegos
de cebadores/sondas consenso.
En muestras de control negativas ("Neg"),
se sustituyó un volumen igual de diluyente por una muestra de ADN.
Se incluyeron diversas concentraciones de una muestra de ADN de una
concentración conocida como control positivo (".12x",
"1x", "10x").
Se designó un polinucleótido diana de control
interno (IC) como control positivo para la amplificación, para
usarse con cebadores de CT y NG. La secuencia diana para la
amplificación era complementaria a un cebador de CT en un extremo y
a un cebador de NG en el otro extremo, de modo que, en la presencia
de ambos cebadores, la secuencia control se amplificaría en
condiciones de amplificación. El polinucleótido se diseñó para
producir un amplicón complementario a la sonda control, por ejemplo
una sonda fluorescible, pero no complementaria a las sondas en uso
para la detección de CT o NG. Se preparó este polinucleótido diana
control usando métodos bien conocidos en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el ADN de CT como se describe en el
Ejemplo 2. Se evaluó el juego de cebadores/sondas 7 (es decir, las
SEC ID Nº: 1 y 4 se usaron como cebadores y la SEC ID Nº: 7 como la
sonda). Se prepararon todas las secuencias como se describe en el
Ejemplo 1.
Se amplificaron por PCR las diluciones del ADN
de CT aislado y se detectaron usando el juego de cebadores/sondas
7. Se realizó la PCR en Tampón GeneAmp® PCR Gold 1x, EDTA 0,25 mM y
EGTA 0,125 mM. Se usó la ADN polimerasa Amplitaq Gold® en una
concentración de 10 unidades/reacción, con dNTP (dATP, dGTP, dTTP y
dCTP) presentes a una concentración final de 0,20 mM cada uno. Se
usó una concentración final de 8 mM de MgCl_{2} en un volumen
total de reacción de 0,1 ml. Los volúmenes de muestra fueron 50
\mul, que contenían 10^{1}-10^{6} ó ningún
cuerpo elemental de Clamidia (EB)/reacción. Se usaron los cebadores
a una concentración de 200-400 nM cada uno y las
sondas fluorescibles a una concentración de 100 nM cada una. Una
secuencia diana control interno(IC) y una sonda control
estaban presentes a una concentración final de 500 copias/reacción y
100 nM
respectivamente.
respectivamente.
Se amplificaron las mezclas de reacción en un
termociclador de Perkin-Elmer. Las mezclas de
reacción se incubaron primero a 95ºC durante 9,5 minutos. Después
se realizó la amplificación por PCR en 45 ciclos siendo cada ciclo
durante 30 segundos a 95ºC y después durante 60 segundos a 59ºC.
Después de que se termociclaran las muestras de reacción, se
mantuvieron las mezclas durante 3 minutos a 95ºC y después durante
10 minutos se bajó la temperatura a 25ºC para la hibridación de la
sonda. Los productos de la reacción se detectaron en un lector
robótico de fluorescencia de microplacas usando la siguiente
emisión máxima y anchuras de banda (en nm):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos de este experimento se presentan en la
Tabla 4 y demuestran la detección del serotipo Ba de CT a
concentraciones tan bajas como 10 EB/reacción usando el juego de
cebadores/sondas 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, este Ejemplo demuestra una buena
respuesta diana en un intervalo de 10 a 10^{6} EB/reacción.
\newpage
Para ensayar para reacciones cruzadas entre los
juegos de cebadores/sondas de CT y NG, se combinaron ADN diana y
juegos de cebadores/sondas tanto para CT como para NG en cada mezcla
de reacción para detectar simultáneamente ADN de CT y NG en las
muestras de ensayo. Los ADN de CT y NG se prepararon como en el
Ejemplo 2, y las muestras se prepararon como se resume a
continuación. El juego de cebadores/sondas de CT nº 7 (SEC ID Nº: 1
y 4 como cebadores y SEC ID Nº: 7 como sonda) y el juego de
cebadores/sondas de NG nº 12 (SEC ID Nº: 8 y 9 como cebadores y SEC
ID Nº: 12 como sonda) se prepararon como se describe en el Ejemplo 1
y se usaron juntos o separados para amplificar y detectar las
diluciones del ADN de CT y NG.
Las muestras incluyeron dos paneles de
reactividad cruzada (muestras 1-58 y muestras
1B-23B) al igual que controles negativos y
controles positivos (.12x, 1x y 10x). Cada mezcla de reacción
comprendió una concentración final de cebador directo de CT de 0,40
\muM (SEC ID Nº: 1), de cebador inverso de CT de 0,20 \muM (SEC
ID Nº: 4), de sonda fluorescible de CT de 0,10 \muM (SEC ID Nº:
7), de cebador directo de NG de 0,20 \muM (SEC ID Nº: 8), de
cebador inverso de NG de 0,20 \muM (SEC ID Nº: 9), de sonda
fluorescible de NG de 0,10 \muM (SEC ID Nº: 12), 5 unidades de la
ADN Polimerasa Amplitaq, dNTP 1 mM y MgCl_{2} 8 mM en Tampón II
de PCR 1x. Se ciclaron reacciones de 100 \mul 45 veces mediante 30
segundos a 95ºC y 1 minuto a 59ºC para la amplificación del ADN,
seguido de un ciclo de 3 minutos a 95ºC y 10 minutos a 25ºC para la
desnaturalización final y apareamiento de la sonda.
De manera importante, la detección de CT no se
alteraba en gran medida por la inclusión del juego de
cebadores/sondas de NG con el juego de cebadores/sondas de CT en
las mezclas de reacción de CT, manteniéndose la sensibilidad a
aproximadamente 10^{7} organismos por reacción. De manera similar,
no se alteró la detección de NG por la inclusión del juego de
cebadores/sondas de CT con el juego de cebadores/sondas de NG en las
mezclas de reacción de NG, manteniéndose la sensibilidad a
aproximadamente 10^{7} organismos por reacción.
Los reactivos del ensayo de NG detectaron NG,
pero no detectaron ninguna de las otras más de 50 cepas de Neisseria
no transmitidas sexualmente (no-STD), ni tampoco 3
cepas de Clamidia (trachomatis, pneumoniae y psittaci).
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar si y con qué sensibilidad los
cebadores y sondas de la invención podrían detectar una gama de
serovariedades de CT, se ensayó un panel de dilución de 15 serotipos
de CT en reacciones que incluyeron juegos de cebadores/sondas tanto
para CT como para NG, y muestras de control negativas (Neg) y
positivas (1x y .12x) adecuadas. Se preparó el juego de
cebadores/sondas de CT nº 7 y el juego de cebadores/sondas de NG nº
12 como se describe en el Ejemplo 1, y se preparó el ADN control de
CT y NG como en el Ejemplo 2.
Las muestras de serovariedad de CT estuvieron
presentes en las mezclas de reacción a unas concentraciones finales
en el intervalo de 10-1000 moléculas por reacción.
Cada mezcla de reacción comprendía una concentración final de
cebador directo de CT de 0,40 \muM (SEC ID Nº: 1), de cebador
inverso de CT de 0,20 \muM (SEC ID Nº: 4), de sonda fluorescible
de CT de 0,10 \muM (SEC ID Nº: 7), de cebador directo de NG de
0,45 \muM (SEC ID Nº: 8), de cebador inverso de NG de 0,25 \muM
(SEC ID Nº: 9), de sonda fluorescible de NG de 0,10 \muM (SEC ID
Nº: 12), 3 unidades de ADN Polimerasa Amplitaq, dNTP 1 mM y
MgCl_{2} 8 mM en
Tampón de PCR II 1x. Se ciclaron reacciones de
100 \mul 45 veces mediante 30 segundos a 95ºC y 1 minuto a 59ºC
para la amplificación del ADN, seguido de un ciclo de 3 minutos a
95ºC y 10 minutos a 25ºC para una desnaturalización final y el
apareamiento de la sonda.
Se detectaron 16 serovariedades de Chlamydia
trachomatis usando juegos de cebadores/sondas de la presente
invención por encima de concentraciones de 10-1000
copias por reacción.
<110> Abbott Laboratories
\hskip1cmPabish, Edward K.
\hskip1cmMarshall, Ron L.
\hskip1cmYu, Hong
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POLINUCLEÓTIDOS PARA LA
AMPLIFICACIÓN Y DETECCIÓN DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS Y
NEISSERIA GONORRHOEAE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 6873.US.O1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> No Asignado Aún
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
12-11-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para la Versión de Windows
4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo de CT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo Preferido de CT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> d = a o g o t/u en la posición 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo Más Preferido de
CT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Inverso de CT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda de CT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda Alternativa de CT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda Fluorescible de CT
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo de NG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Inverso de NG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda de NG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda Alternativa de NG
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda Fluorescible de NG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Abbott Laboratories
\hskip1cmPabish, Edward K.
\hskip1cmMarshall, Ron L.
\hskip1cmYu, Hong
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POLINUCLEÓTIDOS PARA LA
AMPLIFICACIÓN Y DETECCIÓN DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS Y
NEISSERIA GONORRHOEAE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 6873WOO1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> No Asignado Todavía
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
07-11-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 10/292.420
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
12-11-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para la Versión de Windows
4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo de CT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo Preferido de CT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> d = a o g o t/u en la posición 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo Más Preferido de
CT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Inverso de CT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda de CT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda Alternativa de CT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda Fluorescible de CT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo de NG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Inverso de NG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda de NG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda Alternativa de NG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda Fluorescible de NG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (10)
1. Una composición que comprende un primer
polinucleótido que consiste en la secuencia de ácidos nucleicos de
la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 3 y unos segundos
polinucleótidos que consisten en la secuencia de ácidos nucleicos
de la SEC ID Nº: 4.
2. La composición de la reivindicación 1 que
comprende un primer polinucleótido que consiste en la secuencia de
ácidos nucleicos de la SEC ID Nº: 2 y un segundo polinucleótido que
consiste en la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID Nº:
4.
3. Un juego de cebadores/sondas seleccionado de
los juegos de cebadores/sondas que consisten en:
Juego de Cebadores y Sondas 1 que consiste en
las SEC ID Nº: 1, 4 y 5;
Juego de Cebadores y Sondas 2 que consiste en
las SEC ID Nº: 2, 4 y 5;
Juego de Cebadores y Sondas 3 que consiste en
las SEC ID Nº: 3, 4 y 5;
Juego de Cebadores y Sondas 4 que consiste en
las SEC ID Nº: 1, 4 y 6;
Juego de Cebadores y Sondas 5 que consiste en
las SEC ID Nº: 2, 4 y 6;
Juego de Cebadores y Sondas 6 que consiste en
las SEC ID Nº: 3, 4 y 6;
Juego de Cebadores y Sondas 7 que consiste en
las SEC ID Nº: 1, 4 y 7;
Juego de Cebadores y Sondas 8 que consiste en
las SEC ID Nº: 2, 4 y 7 y
Juego de Cebadores y Sondas 9 que consiste en
las SEC ID Nº: 3, 4 y 7.
4. El juego de cebadores/sondas de la
reivindicación 3, en la que el juego de cebadores/sondas es el juego
de Cebadores y Sondas 4 que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y
6.
5. Un método para la detección de Chlamydia
trachomatis en una muestra de ensayo, comprendiendo dicho
método:
- (a)
- la formación de una mezcla de reacción que comprende reactivos de amplificación de ácidos nucleicos, una muestra de ensayo que contiene potencialmente una secuencia de Chlamydia trachomatis, y un juego de cebadores/sondas, que se seleccionan del grupo que consiste en:
- Juego de Cebadores y Sondas 1 que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y 5;
- Juego de Cebadores y Sondas 2 que consiste en las SEC ID Nº: 2, 4 y 5;
- Juego de Cebadores y Sondas 3 que consiste en las SEC ID Nº: 3, 4 y 5;
- Juego de Cebadores y Sondas 4 que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y 6;
- Juego de Cebadores y Sondas 5 que consiste en las SEC ID Nº: 2, 4 y 6;
- Juego de Cebadores y Sondas 6 que consiste en las SEC ID Nº: 3, 4 y 6;
- Juego de Cebadores y Sondas 7 que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y 7;
- Juego de Cebadores y Sondas 8 que consiste en las SEC ID Nº: 2, 4 y 7 y
- Juego de Cebadores y Sondas 9 que consiste en las SEC ID Nº: 3, 4 y 7.
- (b)
- el sometimiento de la mezcla a condiciones de amplificación para generar al menos una copia de ácidos nucleicos complementaria a al secuencia diana;
- (c)
- la hibridación de la sonda con la secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia diana, para formar un híbrido que comprenda la sonda y la secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia diana y
- (d)
- la detección del híbrido como una indicación de la presencia de Chlamydia trachomatis en la muestra de ensayo.
6. El método de la reivindicación 5, en el que
el juego de cebadores/sondas es el Juego de Cebadores y Sondas 4
que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y 6.
7. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 5 y 6 en las que dicha mezcla de reacción además
comprende un polinucleótido diana control y una sonda
polinucleotídica control.
8. Un kit que comprende:
- (a)
- un juego de cebadores/sondas, que se selecciona del grupo que consiste en:
- Juego de Cebadores y Sondas 1 que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y 5;
- Juego de Cebadores y Sondas 2 que consiste en las SEC ID Nº: 2, 4 y 5;
- Juego de Cebadores y Sondas 3 que consiste en las SEC ID Nº: 3, 4 y 5;
- Juego de Cebadores y Sondas 4 que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y 6;
- Juego de Cebadores y Sondas 5 que consiste en las SEC ID Nº: 2, 4 y 6;
- Juego de Cebadores y Sondas 6 que consiste en las SEC ID Nº: 3, 4 y 6;
- Juego de Cebadores y Sondas 7 que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y 7;
- Juego de Cebadores y Sondas 8 que consiste en las SEC ID Nº: 2, 4 y 7 y
- Juego de Cebadores y Sondas 9 que consiste en las SEC ID Nº: 3, 4 y 7 y
- (b)
- reactivos de amplificación.
9. Un kit de acuerdo con la reivindicación 8 que
comprende:
- (a)
- Juego de Cebadores y Sondas 4 que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4 y 6 y
- (b)
- reactivos de amplificación.
10. Un cebador que tiene una secuencia que
consiste en la SEC ID Nº: 4.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US292420 | 1999-04-15 | ||
| US10/292,420 US7807802B2 (en) | 2002-11-12 | 2002-11-12 | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2343794T3 true ES2343794T3 (es) | 2010-08-10 |
Family
ID=32229456
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10158028T Expired - Lifetime ES2395871T3 (es) | 2002-11-12 | 2003-11-07 | Polinucleótidos para la amplificación y detección de Neisseria gonorrhoeae |
| ES03783231T Expired - Lifetime ES2343794T3 (es) | 2002-11-12 | 2003-11-07 | Polinucleotidos para la amplificacion y deteccion de chlamydia trachomatis y neisseria gonorrhoeae. |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10158028T Expired - Lifetime ES2395871T3 (es) | 2002-11-12 | 2003-11-07 | Polinucleótidos para la amplificación y detección de Neisseria gonorrhoeae |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7807802B2 (es) |
| EP (2) | EP2210957B1 (es) |
| JP (1) | JP4744878B2 (es) |
| AT (1) | ATE466103T1 (es) |
| CA (2) | CA2505698C (es) |
| CY (1) | CY1110307T1 (es) |
| DE (1) | DE60332378D1 (es) |
| DK (1) | DK1560929T3 (es) |
| ES (2) | ES2395871T3 (es) |
| PT (1) | PT1560929E (es) |
| SI (1) | SI1560929T1 (es) |
| WO (1) | WO2004043227A2 (es) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7807802B2 (en) * | 2002-11-12 | 2010-10-05 | Abbott Lab | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae |
| JP4937911B2 (ja) * | 2004-08-05 | 2012-05-23 | ユルーン ボッシュ ジーケンハウス | ｏｐａ遺伝子の５’非翻訳領域を用いたナイセリア・ゴノレアの検出法 |
| ES2659145T3 (es) | 2007-04-13 | 2018-03-14 | Abbott Molecular Inc. | Secuencia de cebador y sonda para detectar Chlamydia trachomatis |
| DE102007055386B4 (de) * | 2007-11-20 | 2015-07-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Verfahren zur Kalibrierung eines Sensorelements |
| CA2908877A1 (en) * | 2013-04-25 | 2014-10-30 | Orion Diagnostica Oy | Strand-invasion based dna amplification method |
| WO2018089942A1 (en) * | 2016-11-10 | 2018-05-17 | Slipchip Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of chlamydia trachomatis |
| US20190284618A1 (en) * | 2016-11-10 | 2019-09-19 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of neisseria gonorrhoeae |
| US10450616B1 (en) | 2018-05-09 | 2019-10-22 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis |
| JP7033500B2 (ja) * | 2018-05-29 | 2022-03-10 | サントリーホールディングス株式会社 | アルコール飲料 |
| US10954572B2 (en) | 2019-07-25 | 2021-03-23 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Neisseria gonorrhoeae |
| US11891662B2 (en) | 2019-12-02 | 2024-02-06 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for amplification and detection of human beta actin |
Family Cites Families (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4948882A (en) | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
| US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
| DE3650349T2 (de) | 1985-03-15 | 1995-12-14 | Antivirals Inc | Immunotestmittel für polynukleotid und verfahren. |
| US5185444A (en) | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| CA1323293C (en) | 1987-12-11 | 1993-10-19 | Keith C. Backman | Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization |
| IT1224253B (it) | 1988-04-08 | 1990-09-26 | Sclavo Spa | Oligonucleotidi sintetici utili per la determinazione di chlamydia trachomatis in un campione biologico |
| DE68907772T2 (de) | 1988-04-15 | 1993-11-04 | Innogenetics Nv | Hybridisationssonden zum nachweis von neisseria-staemme. |
| WO1990015159A2 (en) | 1989-05-31 | 1990-12-13 | Gene-Trak Systems | Nucleic acid probes for the detection of chlamydia trachomatis |
| DE3925613A1 (de) * | 1989-06-22 | 1991-01-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neisseria-spezifische dna-sonde |
| US5232829A (en) | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| US5427930A (en) | 1990-01-26 | 1995-06-27 | Abbott Laboratories | Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction |
| US5453355A (en) * | 1990-01-26 | 1995-09-26 | Abbott Laboratories | Oligonucleotides and methods for the detection of Neisseria gonorrhoeae |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| AU1411492A (en) | 1991-01-31 | 1992-09-07 | Washington University | Polypeptides and polynucleotides useful for the diagnosis and treatment of pathogenic neisseria |
| DK51092D0 (da) | 1991-05-24 | 1992-04-15 | Ole Buchardt | Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf |
| ATE198773T1 (de) * | 1991-10-23 | 2001-02-15 | Baylor College Medicine | Fingerabdruckartige identifikation von bakterienstämmen mittels amplifikation repetitiver dna-sequenzen |
| AU2844792A (en) | 1991-12-11 | 1993-06-17 | Becton Dickinson & Company | Probes to chlamydia trachomatis |
| US5424414A (en) | 1991-12-17 | 1995-06-13 | Abbott Laboratories | Haptens, tracers, immunogens and antibodies for 3-phenyl-1-adamantaneacetic acids |
| US5464746A (en) | 1991-12-17 | 1995-11-07 | Abbott Laboratories | Haptens, tracers, immunogens and antibodies for carbazole and dibenzofuran derivatives |
| JPH07509783A (ja) | 1992-10-30 | 1995-10-26 | ティー セル ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | 試料中の全分子の測定及びそれに基づく方法 |
| US5550040A (en) * | 1993-06-23 | 1996-08-27 | Hoffman-La Roche Inc. | Method, reagents and kits for the detection of Neisseria gonorrhoeae |
| US5925517A (en) | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
| CA2150986C (en) | 1994-06-17 | 1999-11-02 | Mary Kathryn Meyer | Oligonucleotide primers and probes for detection of bacteria |
| CA2126952C (en) | 1994-06-28 | 2010-12-14 | Sithian Pandian | Probe, kit, and method of amplification for increasing the sensitivity of nucleic acid hybridization assays |
| DE19534579C2 (de) | 1995-09-18 | 2000-06-08 | Max Planck Gesellschaft | Nucleinsäure-Moleküle codierend Proteine, die die Adhäsion von Neisseria-Zellen an humane Zellen vermitteln |
| DE69738687D1 (de) | 1996-04-12 | 2008-06-26 | Phri Properties Inc | Sonden, kits und assays |
| DE19632041A1 (de) | 1996-08-08 | 1998-02-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Amplifikation von Neisseria gonorrhoeae Nukleinsäuresequenzen |
| JP2001505411A (ja) | 1996-09-05 | 2001-04-24 | アメリカ合衆国 | ３つのクラミジア種の検出および識別のための核酸アッセイ |
| FR2764293B1 (fr) | 1997-06-05 | 2001-09-14 | Bio Merieux | Fragment nucleotidique de l'arn 23s de bacteries du genre chlamydia, utilisations comme sonde, amorce, et dans un reactif et un procede de detection |
| US7459524B1 (en) | 1997-10-02 | 2008-12-02 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | Chlamydia protein, sequence and uses thereof |
| US5962273A (en) | 1997-11-04 | 1999-10-05 | Becton Dickinson And Company | Detection of Neisseria gonorrhoeae by amplification and detection of its nucleic acid |
| US6077669A (en) * | 1997-11-04 | 2000-06-20 | Becton Dickinson And Company | Kit and method for fluorescence based detection assay |
| AU741141B2 (en) | 1997-11-04 | 2001-11-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Specific and sensitive method for detecting nucleic acids |
| KR100735651B1 (ko) | 1997-11-28 | 2007-07-06 | 세로노 제네틱스 인스티튜트 에스.에이. | 클라미디아 트라코마티스 게놈 서열과 폴리펩티드, 이의단편 및 이의 용도, 특히, 감염의 진단, 예방 및 치료 용도 |
| DK0925789T4 (da) | 1997-12-02 | 2009-07-13 | Pfizer Prod Inc | Anvendelse af azithromycin ved topisk behandling af öjeninfektioner |
| ES2304065T3 (es) | 1998-05-01 | 2008-09-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Antigenos y composiciones de neisseria meningitidis. |
| GB9814902D0 (en) | 1998-07-10 | 1998-09-09 | Univ Nottingham | Screening of neisserial vaccine candidates against pathogenic neisseria |
| JP2002525027A (ja) | 1998-07-27 | 2002-08-13 | コナート ラボラトリーズ リミテッド | Ｃｈｌａｍｙｄｉａ抗原および対応するＤＮＡフラグメントならびにそれらの使用 |
| US20030147924A1 (en) | 1998-07-27 | 2003-08-07 | Aventis Pasteur Limited/Aventis Pasteur Limitee | Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof |
| US6660275B2 (en) | 1998-07-27 | 2003-12-09 | Aventis Pasteur Limited | Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof |
| CA2336534A1 (en) | 1998-07-27 | 2000-02-10 | Connaught Laboratories Limited | Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof |
| WO2000006739A2 (en) | 1998-07-27 | 2000-02-10 | Connaught Laboratories Limited | Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof |
| WO2000011183A2 (en) | 1998-08-20 | 2000-03-02 | Connaught Laboratories Limited | Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof |
| AU1202200A (en) | 1998-10-09 | 2000-05-01 | Chiron Corporation | Neisseria genomic sequences and methods of their use |
| DK1535928T3 (da) | 1998-10-22 | 2008-10-20 | Univ Montana | Vaccinesammensætninger indeholdende Omp85-proteiner af Neisseria gonorrhoeae og Neisseria meningitidis |
| EP1129202A2 (en) | 1998-10-28 | 2001-09-05 | Aventis Pasteur Limited | Chlamydia antigenes and corresponding dna fragments and uses thereof |
| US6649370B1 (en) | 1998-10-28 | 2003-11-18 | Aventis Pasteur Limited | Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof |
| US6403101B1 (en) | 1998-10-28 | 2002-06-11 | Connaught Laboratories Limited | Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof |
| US6403102B1 (en) | 1998-10-29 | 2002-06-11 | Connaught Laboratories Limited | Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof |
| CA2352759A1 (en) | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Aventis Pasteur Limited | Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof |
| US20020094340A1 (en) | 1998-12-01 | 2002-07-18 | Andrew D. Murdin | Chlamydia antigens and corresponding dna thereof |
| GB9828000D0 (en) | 1998-12-18 | 1999-02-10 | Chiron Spa | Antigens |
| BR0010361A (pt) | 1999-04-30 | 2003-06-10 | Chiron Corp | Seq ências genÈmicas de neisseria e uso destas |
| DE19956820A1 (de) | 1999-11-25 | 2001-05-31 | Roche Diagnostics Gmbh | Spezies-spezifischer Nachweis von Nukleinsäuren mittels eines Analyseelementes |
| WO2002055739A2 (en) * | 2001-01-15 | 2002-07-18 | Cytyc Corporation | Nucleic acid extraction solution and use thereof |
| US7807802B2 (en) * | 2002-11-12 | 2010-10-05 | Abbott Lab | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae |
-
2002
- 2002-11-12 US US10/292,420 patent/US7807802B2/en active Active
-
2003
- 2003-11-07 SI SI200331833T patent/SI1560929T1/sl unknown
- 2003-11-07 CA CA2505698A patent/CA2505698C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-11-07 ES ES10158028T patent/ES2395871T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-07 WO PCT/US2003/035525 patent/WO2004043227A2/en active Application Filing
- 2003-11-07 ES ES03783231T patent/ES2343794T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-07 CA CA2769657A patent/CA2769657C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-07 AT AT03783231T patent/ATE466103T1/de active
- 2003-11-07 DE DE60332378T patent/DE60332378D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-07 DK DK03783231.8T patent/DK1560929T3/da active
- 2003-11-07 PT PT03783231T patent/PT1560929E/pt unknown
- 2003-11-07 JP JP2004551860A patent/JP4744878B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-07 EP EP10158028A patent/EP2210957B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-07 EP EP03783231A patent/EP1560929B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-04-21 US US12/764,301 patent/US8580495B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-07-22 CY CY20101100692T patent/CY1110307T1/el unknown
-
2013
- 2013-10-16 US US14/055,791 patent/US9187789B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2015
- 2015-10-07 US US14/877,446 patent/US20160024562A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2505698A1 (en) | 2004-05-27 |
| US9187789B2 (en) | 2015-11-17 |
| WO2004043227A3 (en) | 2004-07-15 |
| JP2006506066A (ja) | 2006-02-23 |
| CA2769657C (en) | 2016-06-14 |
| CA2505698C (en) | 2016-06-28 |
| SI1560929T1 (sl) | 2010-08-31 |
| EP1560929A2 (en) | 2005-08-10 |
| ES2395871T3 (es) | 2013-02-15 |
| CY1110307T1 (el) | 2015-01-14 |
| CA2769657A1 (en) | 2004-05-27 |
| JP4744878B2 (ja) | 2011-08-10 |
| DE60332378D1 (de) | 2010-06-10 |
| EP1560929B1 (en) | 2010-04-28 |
| US20040091870A1 (en) | 2004-05-13 |
| US20100267038A1 (en) | 2010-10-21 |
| DK1560929T3 (da) | 2010-07-19 |
| EP1560929A4 (en) | 2006-11-08 |
| US20160024562A1 (en) | 2016-01-28 |
| ATE466103T1 (de) | 2010-05-15 |
| US20140120536A1 (en) | 2014-05-01 |
| WO2004043227A2 (en) | 2004-05-27 |
| EP2210957B1 (en) | 2012-09-26 |
| US8580495B2 (en) | 2013-11-12 |
| EP2210957A1 (en) | 2010-07-28 |
| PT1560929E (pt) | 2010-08-04 |
| US7807802B2 (en) | 2010-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9187789B2 (en) | Polynucleotides for the amplification and detection of chlamydia trachomatis and neisseria gonorrhoeae | |
| ES2659543T3 (es) | Ensayo de Gardnerella vaginalis | |
| ES2386748T3 (es) | Secuencias de cebador y sonda para detectar Chlamydia trachomatis | |
| ES2366798T3 (es) | Detección múltiple en tiempo real de tres especies bacterianas responsables de enfermedades de transmisión sexual. | |
| EP2557156B1 (en) | Primer and probe for detecting chlamydia trachomatis, and method for detecting chlamydia trachomatis using same | |
| US6210876B1 (en) | Nucleic acid primers and probes for detecting Chlamydia pneumoniae | |
| US20130017539A1 (en) | Methods and compositions for chlamydia trachomatis diagnostic testing | |
| JP2001505781A (ja) | レジオネラ・ニューモフィラを検出するための核酸プライマー及びプローブ | |
| JP2010536343A (ja) | 薬剤耐性菌検出方法 | |
| WO2011008942A2 (en) | Simultaneous quantitative multiple primer detection of clostridium difficile | |
| CN113646444A (zh) | 检测军团菌属的方法 | |
| JP4766878B2 (ja) | ハイブリダイゼーションアッセイを使用する真正細菌群の検出、同定および識別 | |
| US20100092949A1 (en) | Methods for detecting staphylococcus aureus | |
| CA3193888A1 (en) | Rapid identification and typing of vibrio parahaemolyticus | |
| CA3193878A1 (en) | Multiplex detection and typing of vibrio cholerae |