JP2006506066A - トラコーマクラミジア及び淋菌の増幅及び検出のためのポリヌクレオチド - Google Patents
トラコーマクラミジア及び淋菌の増幅及び検出のためのポリヌクレオチド Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明のポリヌクレオチドは、被験試料においてCT又はNGを増幅及び/又は検出するためのプライマー又はプローブとして使用することができる。ここで提供するプライマー/プローブセットは、2個のプライマーと少なくとも1個のプローブを含む。これらのプライマー/プローブセットは核酸増幅手法に従って使用できる。従って、特定のプライマー/プローブセットにおけるプライマーは標的配列を増幅するために使用できる。ほとんどの場合、プローブは、プライマーの1つによって生成された標的配列のコピーにハイブリダイズし、一般に増幅反応の進行中に生成された標的配列のコピーの検出を容易にする。全てのプライマー/プローブセットが、適切なプライマーとプローブを組み合わせたとき、CT又はNGのいずれかもしくはCTとNGの両方を特異的且つ高い感受性で検出するために核酸増幅手法に従って使用できる。ここで提供するプライマー/プローブセットの個々のプライマー及びプローブは、また、ここで提供するプライマー/プローブセットの中で記述されているもの以外のプライマー及び/又はプローブと組み合わせて使用し得ることが考慮される。
(a)核酸増幅試薬、プローブがその標的配列にハイブリダイズしたとき検出可能なシグナルを生成する標識を組み込んだ少なくとも1つのポリヌクレオチドプローブ配列、少なくとも1つのポリヌクレオチドプライマー及び1つ以上の標的核酸配列を含む被験試料、を含有する反応混合物を形成すること;
(b)前記混合物を、標的核酸配列の少なくとも1コピー又は標的配列に相補的な核酸配列を生成するための増幅条件に供すること;
(c)プローブ:標的ハイブリッドを形成するために、プローブを標的核酸配列又は標的配列に相補的な核酸配列にハイブリダイズさせること;
(d)ハイブリダイズした標識プローブによって生成されるシグナル検出することによって前記プローブ:標的ハイブリッドを検出すること;及び
(e)被験試料中に存在する標的核酸配列の量の指標として、生成されるシグナルの量を標準と比較すること
の工程を含む、被験試料中の標的核酸配列を特異的に増幅、検出及び定量するための方法において使用することができる。
(a)特定反応において使用されるCT又はNGプライマー又はプライマー対によって又は異なる対照プライマーによって増幅され得る;
(b)適切な条件下で対照プローブに特異的にハイブリダイズする;及び
(c)同じ条件下でCT又はNG特異的プローブとハイブリダイズしない
核酸配列である。
(a)適切な条件下で対照配列に特異的にハイブリダイズする;
(b)CT標的配列を検出するときは、同じ条件下でCT配列、CT特異的プローブ又はCT特異的プライマーとハイブリダイズしない;
(c)NG標的配列を検出するときは、同じ条件下でNG配列、NG特異的プローブ又はNG特異的プライマーとハイブリダイズしない;及び
(d)同じ反応混合物中で使用される他のプローブ(例えばCT及び/又はNGプローブ)に組み込まれた標識とは異なる検出可能標識が組み込まれている。従って、これらの様々な標識がそれぞれの標的配列に結合したときこれらによって生成されるシグナルは、識別して、別々に定量することができる。
プライマーとプローブのセット1(配列番号1、4及び5);
プライマーとプローブのセット2(配列番号2、4及び5);
プライマーとプローブのセット3(配列番号3、4及び5);
プライマーとプローブのセット4(配列番号1、4及び6);
プライマーとプローブのセット5(配列番号2、4及び6);
プライマーとプローブのセット6(配列番号3、4及び6);
プライマーとプローブのセット7(配列番号1、4及び7);
プライマーとプローブのセット8(配列番号2、4及び7);
プライマーとプローブのセット9(配列番号3、4及び7);
プライマーとプローブのセット10(配列番号8、9及び10);
プライマーとプローブのセット11(配列番号8、9及び11);及び
プライマーとプローブのセット12(配列番号8、9及び12)
を含むが、これらに限定されない。
以下の実施例は、前述したプライマー/プローブセットを使用した様々なサブタイプのCT及びNGの検出を明らかにするものである。プライマー/プローブセットを含むこれらのDNAプライマー及びプローブは、配列番号1−7がCTに特異的であり、配列番号8−12がNGに特異的であると特定される。
A.CT及びNGコンセンサスプライマー
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションPCRによって全ての公知のCT又はNGサブタイプを検出するためにコンセンサスプライマーを設計した。以下の実施例では、これらのプライマーは、CTについては配列番号1及び配列番号4であり、NGについては配列番号8及び配列番号9であった。配列番号3は、これらのポリヌクレオチドの精製の容易さに関連する、本発明の一部の実施態様に関して、配列番号1に比べて利点を有することが認められた。しかし、これらの実施態様は以下では例示しておらず、発明者は配列番号3ではなく配列番号1の使用を選択する。
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって増幅CT又はNG標的配列とハイブリダイズするためにコンセンサスプローブを設計した。これらのプローブ配列は、自己相補的5’及び3’末端を生成するために末端ヌクレオチドを付加し、及びポリヌクレオチドの反対側の末端に蛍光(fluo)及び消光成分を付加することにより、分子ビーコンアッセイにおけるプローブとしての使用のために修飾した(表2参照)。従って、配列番号6のCTプローブ配列が配列番号7の分子ビーコンプローブの基礎であり、配列番号10のNGプローブ配列が配列番号12の分子ビーコンプローブの基礎であった。2つ以上のビーコンプローブを同じ分子ビーコンアッセイにおいて同時に使用する場合は、種々のプローブシグナルを区別するために異なる励起−発光プロフィールを有する蛍光成分を使用した。
当技術分野で公知の方法を用いてCT DNAをCT血清型Ba、Apache−2系統(ATCC VR−347、Rockville,Maryland)から単離し、CTコンセンサスプライマー/プローブセットの感受性、特異性及び交叉反応性を評価するために使用した。NG DNAを同様に作製し、CTコンセンサスプライマー/プローブセットの感受性、特異性及び交叉反応性を評価するために使用した。
CT及びNGプライマー/プローブセットの間の交叉反応を調べるため、被験試料中のCT及びNG DNAを同時に検出するようにCTとNGの両方についての標的DNA及びプライマー/プローブセットを各々の反応混合物中に併合した。CT及びNG DNAは実施例2におけるように作製し、試料は以下で概説するように調製した。CTプライマー/プローブセットNo.7(配列番号1及び4をプライマーとし、配列番号7をプローブとする)及びNGプライマー/プローブセットNo.12(配列番号8及び9をプライマーとし、配列番号12をプローブとする)を実施例1で述べたように作製し、CT及びNG DNAの希釈物を増幅及び検出するために一緒に又は別々に使用した。
本発明のいずれのプライマー及びプローブがどの程度の感受性で一連のCT血清型を検出し得るかを調べるために、15のCT血清型の希釈物パネルを、CT及びNGの両方についてのプライマー/プローブセット、及び適切な陰性(Neg)及び陽性(1x及び.12x)対照試料を含む反応物において試験した。CTプライマー/プローブセットNo.7及びNGプライマー/プローブセットNo.12を実施例1で述べたように作製し、CT及びNG対照DNAを実施例2で述べたように作製した。
本発明のいずれのプライマー及びプローブがどの程度の感受性で一連のNGサブタイプを検出し得るかを調べるために、7つのNG表現型の希釈物パネルを、CT及びNGの両方についてのプライマー/プローブセット、及び適切な陰性(Neg)及び陽性(1x及び.12x)対照試料を含む反応物において試験した。CTプライマー/プローブセットNo.7及びNGプライマー/プローブセットNo.12を実施例1で述べたように作製し、CT及びNG対照DNAを実施例2で述べたように作製した。
Claims (16)
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11及び配列番号12から成る群より選択される核酸配列を有する2つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物。
- 配列番号1又は配列番号2の核酸配列を有する第一ポリヌクレオチド及び配列番号4の核酸配列を有する第二ポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- 配列番号8の核酸配列を有する第一ポリヌクレオチド及び配列番号9の核酸配列を有する第二ポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- 配列番号2の核酸配列を有する第一ポリヌクレオチド、配列番号4の核酸配列を有する第二ポリヌクレオチド、配列番号8の核酸配列を有する第三ポリヌクレオチド及び配列番号9の核酸配列を有する第四ポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- プライマーとプローブのセット1(配列番号1、4及び5);
プライマーとプローブのセット2(配列番号2、4及び5);
プライマーとプローブのセット3(配列番号3、4及び5);
プライマーとプローブのセット4(配列番号1、4及び6);
プライマーとプローブのセット5(配列番号2、4及び6);
プライマーとプローブのセット6(配列番号3、4及び6);
プライマーとプローブのセット7(配列番号1、4及び7);
プライマーとプローブのセット8(配列番号2、4及び7);
プライマーとプローブのセット9(配列番号3、4及び7);
プライマーとプローブのセット10(配列番号8、9及び10);
プライマーとプローブのセット11(配列番号8、9及び11);及び
プライマーとプローブのセット12(配列番号8、9及び12)
から成るプライマー/プローブセットより選択されるプライマー/プローブセット。 - 前記プライマー/プローブセットが、
プライマーとプローブのセット4(配列番号1、4及び6)
である、請求項5に記載のプライマー/プローブセット。 - 前記プライマー/プローブセットが、
プライマーとプローブのセット10(配列番号8、9及び10)
である、請求項5に記載のプライマー/プローブセット。 - 前記プライマー/プローブセットがプライマーとプローブのセット4(配列番号1、4及び6)である、請求項5に記載のプライマー/プローブセットを含み、プライマーとプローブのセット10(配列番号8、9及び10)をさらに含む、物質の組成物。
- (a)核酸増幅試薬、トラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)及び/又は淋菌(Neisseria gonorrhoeae)の標的配列を潜在的に含む被験試料及び請求項1に記載の組成物を含む反応混合物を形成すること;及び
(b)前記混合物を、前記標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも1コピーを生成するための増幅条件に供すること
を含む、被験試料中のトラコーマクラミジア及び/又は淋菌を増幅する方法。 - 前記増幅条件が前記試料の温度を変化させることを含み、及び前記温度変化を10−100回反復する、請求項9に記載の方法。
- 配列番号2、4、5、6、7、8、9、10、11及び12から成る群より選択される核酸配列を有する単離ポリヌクレオチド。
- 検出可能標識を含む、請求項11に記載の単離ポリヌクレオチド。
- (a)核酸増幅試薬、トラコーマクラミジア及び/又は淋菌の標的配列を潜在的に含む被験試料及び
(i)請求項11に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド、又は
(ii)請求項1に記載の少なくとも1つの組成物、又は
(iii)請求項5に記載の少なくとも1つのプライマー/プローブセット
を含む反応混合物を形成すること;
(b)前記混合物を、前記標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも1コピーを生成するための増幅条件に供すること;
(c)プローブと前記標的配列に相補的な核酸配列を含むハイブリッドを形成するために、プローブを前記標的配列に相補的な核酸配列にハイブリダイズすること;及び
(d)前記ハイブリッドを、被験試料におけるトラコーマクラミジア及び/又は淋菌の存在の指標として検出すること
を含む、被験試料においてトラコーマクラミジア及び/又は淋菌を検出する方法。 - 前記反応混合物が、対照標的ポリヌクレオチド及び対照ポリヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- (a)請求項11に記載のポリヌクレオチド、及び
(b)増幅試薬
を含むキット。 - (a)配列番号2、4、5、6、7、8、9、10、11及び12から成る群より選択される、異なる核酸配列を各々有する、2つ以上のポリヌクレオチド、及び
(b)増幅試薬
を含む、請求項15に記載のキット。
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