JP2001505411A - ３つのクラミジア種の検出および識別のための核酸アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、異なるクラミジア種の検出と識別のための診断アッセイ、組成物、および該アッセイを実施するためのキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ３つのクラミジア種の検出および識別のための核酸アッセイ 発明の分野 本発明は、異なるクラミジア種の検出および識別のための診断アッセイと、そ のようなアッセイを行うための組成物およびキットとに関する。 発明の背景 クラミジアは、広範囲にわたる細胞内細菌であり、ヒト、有袋動物、他の哺乳 動物および鳥類で変化に富んだ感染を引き起こすことが知られている。Chlamydi a pneumoniaeおよびChlamydia psittaciは、下部呼吸器官（lower respiratoryt ract）感染の有力な原因である。少なくとも青年の肺炎の少なくとも１０％はC. pneumoniaeに関連している。C．pneumoniaeは、風土病性および流行性の肺炎の 原因であった。２つの病気の治療は、一般に類似しているけれども、C.psittaci は、積極的な治療を正当化する生命を脅かす危険性の高い疾患であると考えられ る。したがって、治療目的にとってこれら２つの種を識別することが有用であろ う。 ペットとして飼われている鳥は、ヒトに対するC.psittaciの重要な感染源であ った。糞便と呼吸器の分泌物に含まれる微生物を排出する感染した鳥とヒトとの 間に、閉鎖的かつ継続的な接触がある時はいつでも、ヒトの病気が大発生が起こ りえる。その原因物質は組織内に存在し、しばしば健康な鳥によって糞便に排出 される。感染した鳥の乾燥した糞便を吸入することがヒト感染の通常の方法であ る。 ヒトおよび鳥のオウム病を研究室で確認することは挑戦的なことであり、また 治療はしばしば経験的で、かつ鳥に接していた履歴を臨床医が引き出すことにも とづいた予測的なものである。補体結合抗体タイタの測定、さらに、かなり一般 的ではないが、患者からのC.psittaciの回収はオウム病を研究室で確認する伝統 的な方法であった。どの方法も感度のよいものではないし、また補体結合はたい へん非特異的なものである。マイクロイムノフルオレッセンス（ＭＩＦ）は、補 体結合（complement fixation：ＣＦ）よりも感度が高く、かつ特異的ではなる が、幅広く使用されるものではない(Wong et al.，1994，Journal of Clinical Microbiology 30，1625-30)。ＭＩＦ解析は解決すべき問題を有し、かつ高度に 訓練された研究室要員を必要とする。 Chlamydia trachomatisは、米国においてもっとも一般的な性行為感染症であ る。C．trachomatisは、トラコーマおよび泌尿生殖系感染を引き起こす。C.trac homatis感染は、また新生児に対しても起こり、その診断および検出には問題が ある。クラミジアを検出する上で、培養試験はもっとも優れた診断基準(diagnos itc gold standard)と考えられている。しかし、真性の細胞内寄生細菌であるこ とから、この細菌の培養は技術的に困難であり、また該細菌は実質的な研究室間 変異で有名である。 ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）等の増殖法は、標的ＤＮＡ配列の検出にとって 一般に感度が高く、特異的な方法である。対象となる３種類のクラジミア種を識 別するためにＰＣＲを利用する試みがなされてきた。Kaltenboeck et al．(1992 ),Journal of Clinical Microbiology 30，1098-1104は、クラミジア種の主要な 細胞膜外タンパク質（MOMP）遺伝子（OmpA)ＤＮＡ配列を標的とし、つづいて制 限エンドヌクレアーゼ分析を使用することで種を区別する２段階ＰＣＲプロセス の使用を報告している。Tjhie et al．(1993)，Journal of Microbiological Me thods 18，137-50,は、属に特異的なOmpAの領域を最初に増幅し、つづいて増幅 産物を種特異的なプローブによって雑種形成することで、種間の区別を行う。 １６ｓのｒＲＮＡ（リボゾームＲＮＡ）遺伝子は、クラミジア種の検出のため の標的として使用されてきた。しかし、種の違いを識別することができないと考 えられてきた。Tjhie et al.，Journal of Microbiological Methods，18:137-1 50（1993）を参照せよ。クラミジアでＰＣＲ検出方法の対象となるものは、Ｏｍ ｐＡ遺伝子であり、また制限フラグメント（ＲＦＬＰ）または２段階プロセスの いずれによる分析にも含まれる。Id．ＲＦＬＰは複雑で時間のかかる方法であり 、特にこの領域でかなりの経験を積んでいない人にとってはそうである。したが って、一回のアッセイで、クラミジア種を素早く、効率的に、かつ高感度で検出 する方法が求められている。 発明の要約 この発明は、容易かつ即座に３つの重要なクラミジア種、すなわちC.trachoma tis，C.psittaci、およびC.pneumoniaeを検出するための新規なアッセイを提供 する。各々の種に特異的な１６ｓｒＲＮＡ遺伝子を標的とした増幅プライマを使 用することで同一時間に同一試料アリコートで３つの種を検出および識別するこ とができよう。このアッセイが知られる前は、その遺伝子がクラミジア種特異的 標的として使用することができるかどうかはわからなかった。ここに記述された アッセイは、非常に高感度で、かつ特異的であり、首尾一貫している。一般に、 複数の標的が同一試料で増幅される場合、感度が犠牲となり、結果は一般にむら のあるものとなる。本発明のアッセイでは、そのような場合はない。特に、本発 明は、核酸を含む試料試料の一つの試験用アリコートに含まれるChlamydia pneu moniae、Chlamydia psittaci、およびChlamydia trachomatisの存在または不在 を検出する方法を含むもので、該方法は、 （ａ）増幅産物を生成するために増幅プロトコルの３つのクラミジア種の一つ に特異的な１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の領域をフランク（flank）するように、試験 用アリコートをセンスおよびアンチセンス核酸プライマ対と接触させるステップ と、 （ｂ）３つのクラミジア種の各々に特異的な増幅産物の有無を検出するステッ プとを有する。好ましくは、３つのクラミジア種の各々に共通な１６ｓｒＲＮＡ の領域をフランクする一組のセンスおよびアンチセンス・プライマと試験用アリ コートとを最初に接触させる。 この方法を実施するための手順およびキットのためのプライマ対を含む組成物 もまた記述し、かつクレームする。 発明の詳細な説明 本発明は容易かつ即座に３つの重要なクラミジア種、すなわちC．trachomatis ,C.psittaci、およびC.pneumoniaeを検出するための新規なアッセイを提供する 。これら３つの種は、各々の種に対する特異的１６ｓｒＲＮＡを標的とした増幅 プライマの使用を通して同一時間に同一試料アリコートで、検出および識別する こ とができよう。 本発明のアッセイは、研究室で異なる臨床上の試料からのさまざまな標本を試 験したり、複数の種を一回で試験することを可能とさせる。例えば、アッセイは 、頚管内スワブ試料からのC．trachomatis、鳥の排出腔スワブ試料からのC.psit taci、および粘液試料からのC.pneumoniaeを等しく識別すること可能とすると思 われる。このアッセイは、クラミジア属の特定の試料を最初に試験し、続けて３ つの関連するクラミジア種の各々に対する第２回目の試験を行う上で、通常のス トックされたアッセイ用試薬の使用に対して著しい改善である。 定義 特に定義しない限り、すべての技術用語および科学用語はここでは本発明が属 する技術分野において通常の知識を有する者が一般に理解している意味と同様の 意味を持つ。Singleton et al．（1994）Dictionary of Microbiology and Mole cular Biology，second edition，John Wiley and Sons(New York);Walker(ed) （1998）The Cambridge Dictionary of Science and Technology，The press sy ndicated of the University of Cambridge(New York);およびHale and Marham （1991）The Harper Collins Dictionary of Biology Harper Perennial（New Y ork）のすべては、当業者に対してこの発明で使用されるほとんどの用語の一般 辞書を提供する。いかなる方法および材料もここで記述されたものと類似の、あ るいは同等のものではあるけれども、特定の好ましい方法および材料を記述する 。本発明の目的のために、以下の用語を以下のように定義する。 「単離(isolated)」または「生物学的に純粋(biologically pure)」という用 語は、天然の状態で見いだされるような常に付随する成分を実質的に、あるいは 本質的に含まないことを意味する。 「核酸(nucleic acid)」という用語は、単鎖または二重鎖形状のいずれかであ るデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド・ポリマーに言及するもの で、限定しない限り、自然に生ずるヌクレオチドと同様の方法で核酸にハイブリ ダイズする天然ヌクレオチドの既知の類似体を包含する。別に示さない限り、特 定の核酸配列は任意に相補的な配列を含む。 ２本の単鎖状の核酸が二重鎖を形成する場合、それらが「雑種形成」する。二 重鎖（double-strandedness）の領域は、一つまたは両方の単鎖の核酸の完全な 長さ、または単鎖の核酸のすべてを含む。および他の単鎖核酸の準配列(subseqe unce)、さらに他の単鎖の核酸の準配列、または二重鎖の領域は、各核酸の準配 列を含む。核酸の雑種形成の概要は、Tijssen（1993）Laboratory Technicques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Pr obes Part I Charpter 2“Overview of principles of hybridization and stra tegy of nucleic acid probe asays”，Elsevier（New York）に見いだされる。 サウザンおよびノーザン・ハイブリダイゼーション等の核酸雑種形成実験のコ ンテクストにある「厳密な雑種形成洗浄条件(stringent hybridiztion wash con ditions)」は配列依存性を持っており、また異なる環境パラメータ下で異なる。 核酸の雑種形成についての広範囲にわたるガイドは、Tijssen（上掲）に見いだ される。一般に、厳密性の高い雑種形成洗浄条件は、所定のイオン強度およびｐ Ｈにおける特定の配列に対する融点（Ｔ_m）よりも約５℃低いように選択される 。Ｔ_mは、完全に一致したプローブに標的配列が５０％雑種形成する温度（所定 のイオン強度およびｐＨ下で）である。たいへん厳密な条件が特定のプローブに 対するＴ_m点と等しくなるように選択される。厳密な条件下で互いに雑種形成す る核酸は、該核酸がコードするポリペプチドが実質的に同一であるならばそれで もなお、実質的に同一である。このことは、例えば核酸の複製が遺伝子コードに よて許容される最大コドン変質（maximum codon degeneracy）を用いて生成され る場合に生ずる。 ２つの核酸配列のコンテクストにある「同一(identical)」という用語は、最 大対応関係に位置合わせした場合に同一である２つの配列における残基に言及す る。核酸は、基準となる核酸に対して少なくとも約７０％同一、好ましくは少な くとも約８０％同一、さらに任意に約９０％あるいはそれ以上同一である。 「プライマ(primer)」という用語は、精製された制限消化(restriction diges t)にあるように天然に生ずるか、あるいは合成されるかにかかわりなく、ここで はオリゴヌクレオチドに言及するものであり、標的配列の鎖と雑種形成する能力 が ある。末端３’ヌクレオチドが雑種形成した場合、それはプライマの伸張合成が 誘導される条件下で合成の開始点として作用する。このような条件には、一般に ４種類の異なるヌクレオチドトリフォスフェート（ヌクレオチド試薬）および熱 安定性の酵素が適当なバッファに存在すること、さらに適当な温度でなされるこ とが含まれる。プライマ対（primer pairs）がここで言及される場合、この対は 二重鎖標的核酸のセンス鎖と雑種形成することができる一つのプライマ(「アンチ センスプライマ)と、さらに、二重鎖標的核酸のアンチセンス鎖と雑種形成する ことのできる一つのプライマ（アンチセンス・プライマ）とを意味する。プライ マ対は、増幅される標的核酸の領域をフランクするように設計され、ポリメラー ゼ鎖反応のような増幅プロトコルで使用する場合に増幅される標的領域を生ずる であろう。 ヌクレオチド配列に対して「実質的に相同(substantially homologous)」また は「実施的に相補的(substantially complementary)」なプライマによって意味 されることは、プライマと標的配列との間に安定かつ特異的な結合が生ずるよう に、標的配列と雑種形成するのに十分な相補性を示し、自然に生ずるヌクレオチ ドあるいは類似体、例えば７−デアズアグアノシン（deazaguanosine）またはイ ノシン等を含むポリニヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。安定した 雑種形成複合体（二重鎖）を形成するために必要とされる相同性の度合いは、増 幅媒体のstringencyによって変動する。プライマは、増幅すべき各々の特定の配 列の標的鎖に対して実質的に相同とすべきである。このことは、標準的な増幅条 件下で適当な鎖と雑種形成するのに十分な相補性を持つものでなければならない ことを意味している。したがって、プライマ配列は鋳型の正確な配列を反映する 必要なない。例えば、非相補的ヌクレオチド・フラグメントは、プライマの５’ 末端に結合してもよく、該プライマ配列の残りの部分は鎖に対して相補的である 。あるいは、非相補的な複数の塩基またはより長い配列は、雑種形成し、それに よって伸張産物の合成のための鋳型を形成するのに十分な標的配列の配列との相 補性を持っているプライマの中に散在させる。 アッセイ 本発明は、核酸を含む試料から単一試験用アリコートにおけるChlamydia pneu moniae、Chlamydia psittaci、Chlamydiatrachomatisの有無を検出するためのア ッセイまたは方法に関するもので、該アッセイまたは方法は、 （ａ）増幅産物を生成するために増幅プロトコルで３種類のクラミジア種の一つ に特異的な１６ｓｒＲＮＡの領域を各対がフランクするように、センスおよびア ンチセンス核酸プライマの対と試験用アリコートと接触させるステップと、 （ｂ）３種類のクラミジア種の各々に特異的な増幅産物の有無を検出するステッ プとを有する。試験用アリコートが最初に、３種類のクラミジア種のすべてに共 通な１６ｓｒＲＮＡの領域をフランクするセンスおよびアンチセンス・プライマ に接触する場合に最良の結果が認められる。そのような領域は、例えば配列番号 １および２に記述されたプライマによってフランクされる領域である。 したがって、本発明のアッセイは、３種類のクラミジア種の一つが含まれるか 、あるいはそのような種が含まれないことを望んでいる生物学的試料の単一アリ コートによって有利に達成できる。試料は、細菌が存在していると思われる任意 の源から得ることができよう。核酸の任意の源は、精製されたかたちで、あるい は粗抽出物または組織または細胞が含まれる未精製のかたちで、出発核酸として 使用することができる。一般に興味ある試料としては、ヒト、有袋動物、および 他のほ乳類動物、さらに鳥類があげられる。通常試験される組織および体液由来 の試料は、限定されるものではないが、精予、咽頭スワブ、咽頭鼻部スワブ、ヒ ト肺、脾臓、および肝臓試料、気管支肺胞洗浄、糞便、血液、および排泄腔組織 があげられる。アッセイに先立って試料を精製したり、前処理する必要はないが 、外来性のタンパク質や他のデブリ、例えば糞が顕著な組織の場合は、試料を低 速遠心にかけたりすることでアッセイ前にデブリを取り除くことが好ましい。 ひとたび試料が得られると、その試料を増幅プロトコルにかける。任意に、第 一のステップは、１６ｓｒＲＮＡ遺伝子を一般に標的することで、クラミジア属 を標的にすることが含まれる。１６ｓｒＲＮＡ遺伝子は、Gaydos et al.，J．Cl in.Microbiol．30:796-800（1992）で一般的な標的として記述されている。１６ ｓＲＮＡ由来の配列もまた、ジーンバンク（GenBank）（National Center for Biotechnology Information，Natl．Library of Medicine，National Institute s of Health，8600 Rockville Pike，Bethesda，Maryland 20894）において、C.pn eumoniaeは寄託番号L06108、C.psittaciは寄託番号M13769、さらにC.trachomati sは寄託番号M59l78として見つけることができる。これらの配列は、遺伝子領域 を増幅する増幅プライマを得るために当業者に知られているように並べることが できる。遺伝子領域は、しかし、以下に説明するように３つの種を見分けるため に特異的に標的にされる領域を包含するものでなければならない。このステップ で使用されるプライマは、配列番号１および２で記述されたプライマによってフ ランクされた１６ｓｒＲＮＡの領域またはそのようなプライマが雑種形成する配 列と部分的に重なり合う漁期を標的にすることがもっとも必要である。配列番号 １および２に記述されたプライマは、 センス５’−３’ACG GAA TAA TGA CTT CGG（配列番号１） アンチセンス５’−３’TAC CTG GTA OGO TCA ATT（配列番号２） であることがもっとも好ましい。上記プライマが使用される場合、結果として生 ずる増幅生成物は約４３６塩基対（ｂｐ）の長さである。 もし、上記ステップが用いられるならば、増幅産物による解決は種特異的プラ イマによって直接接触される。もし、上記ステップが用いられなければ、試験試 料アリコートそれ自身が種特異的プライマと直接接触する。「単一試験アリコー ト（single test aliquot）は、３つの種のすべてに由来する生成物が一緒に増 幅される試験試料由来の一つのアリコートである。種特異的プライマは、センス およびアンチセンス・プライマの対であり、該プライマの各々の対はクラミジア 種の一つに対して独特である１６ｓｒＲＮＡの領域をフランクおよび標的にする 。本発明は、特に有用で効果的であることがわかったプライマを説明するもので 、これらのプライマは請求の範囲に記述されたアッセイにとってもっとも好まし い。プライマ対は次の通りである。 C．trachomatisについて センス５’−３’GCA ATT GTT TCG GCA ATT G（配列番号３） アンチセンス５’−３’AGC GGG TAT TAA CCG CCT（配列番号４） C．pneumoniaeおよびC.psittaciについて センス５’−３’ATA ATG ACT TCG GTT ATT（配列番号５） C．psittaciについて アンチセンス５’−３’TGT TTT AGA TGC CTA AAC AT（配列番号６） C．pneumoniaeについて アンチセンス５’−３’CGT CAT CGC CTT GGT GGG CTT（配列番号７） これらのプライマが使用される場合、増幅産物はC．trachomatisでは約４１２ ｂｐ、C．pneumoniaeでは２２１ｂｐ、さらにC．psittaciでは１２７ｂｐである 。これらのプライマもまた、種特異的プローブとして使用することができる。指 名されたプライマ一対もまた、もしそのように望むならば単独で一つの種を個々 に検出することができる。 リストアップした上記のプライマが相補的である標的核酸の各々の領域と部分 的に一致する核酸の一領域と雑種形成するプライマを使用することが望ましい。 リストしたものと実質的に同一のプライマも好ましい。もっとも好ましいのは、 同一領域に対して実質的に相補的なプライマである。 プライマと試料とを一緒に増幅プロトコルでインキュベーションすることで、 もし存在するならば、検出される各々の種を示す増幅核酸産物が得られる。核酸 プライマで配列を増幅するのに適した核酸増幅方法は知られている。そのような 増幅方法として当業者が注目する方法としては、ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)、 リガーゼ鎖反応(ＬＣＲ)、Ｑβ−レプリカーゼ増幅、および他のＲＮＡポリメラ ーゼを介した方法（例：ＮＡＳＢＡ）が、例えばBerger，Sambrook et al．（19 89）Molecular Cloning‐A Laboratory Manual（2nd Ed）Vol．1-3;およびAusub el、同様にMullis et al.，Methods and Applications（Innis et al．eds）Aca demic Press Inc．San Diego，CA(1990)（Innis）;Arnheim & Levinson（Octobe r 1，1990）C&EN 36-47;Journal of NIH Research（1991）3，81-94;(Kwohetal ．（1989）Proc.Natl．Acad．Scl．USA 86，1173;Guatelli et al．（1990）Pro c．Natl．Acad．Sci.USA 87，1874;Lomell et al．（1989）J．Clin．Chem 35， 1826;Landegren Biotechnology 8，291-294;Wu and Wallance，（1989）Gene 4 ，560;Barringer et al．（1990）Gene 89，117およびSooknanan and Malek（19 95）Biotechnoogy 13:563-564があげられる。当業者は、本質的に任意のＲＮＡ がＰＣＲ伸張のための適当な二重鎖ＤＮＡに変換することができることも正当に 評価する。Ausubel, Sambrook and Berger（上掲）を参照せよ。ここで記述する方法およびプライマ は、好ましくはＰＣＲ増幅プロトコルで使用される。増幅バッファは、好ましく はｐＨが約８．３ないし約９．２であり、ＭｇＣｌ₂濃度が約１．５ｍＭないし 約３．５ｍＭである。 増幅かつ同定されるべき核酸配列は、増幅産物または「標的」配列であって、 それをフランクするプライマ対の間に存在し、そらにその存在は目的とする種を 示す。 プライマ（またはプローブ）として使用されるオリゴヌクレオチドは、Beauca ge and Caruthers(1981)，Tetrahedron letts.，22(20):1859-1862に記載された 固相ホスホラミダイドトリエステル法にもとづいて、例えばNeedham-VanDevante r et al．（1983）Nucleic Acids Res.，12:6159-6168に記述されているように 自動合成装置を用いて、化学的に合成されるのが一般的である。オリゴヌクレオ チドもまた、当業者に知られている様々な製造元に注文制作を依頼したり、注文 したりすることができる。オリゴヌクレオチドの精製は、必要に応じて、Pearso n and Regnier（1983）J．Chrorn 255:137-149に記載されているように、未変性 アクリルアミド・ゲル電気泳動またはアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによって 一般に行われる。合成オリゴヌクレオチドの配列は、Maxam and Gilbert（1980 ）in Grossman and Moldave(eds.)Academic Press，New York，Methods in Enzy mology 65:499-560の化学分解法を用いて確認することができる。 当業者は、所定の核酸配列で変更を加えることについての多くの方法を認識す ることもあろう。そのような周知の方法としては、特定部位の突然変異誘発、変 性オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅、核酸を含む細胞を変異誘発物質また は放射線に曝すこと、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成(例えば、大きな核 酸を生成するために連結反応および／またはクローニングと一緒に使われる)や 、他の周知の方法があげられる(参照：Giliman and Smith（1979）Gene 8:81-97 ;Roberts et al．（1987）Nature 328:731-734およびSambrook et.al．（1989） Molecular Cloning‐A Laboratory Manual（2nd Ed）Vol．1-3;Innis，Ausbel,B erger，Needham VanDevanter and Mullis(上掲))。 ここで説明するアッセイ方法で使用されるプライマは、効率及び増幅を最大限 のものにするため、一本鎖とすることが好ましいが、しかし二重鎖であってもよ い。もし二重鎖であるならば、プライマは伸長生成物調製のための使用に先立て 最初にその鎖を分離するために処理される。好ましくは、プライマはオリゴデオ キシリボヌクレオチドである。プライマは酵素存在下で伸長産物の合成を刺激（ prime）するために十分に長くなければならない。プライマの正確な長さは、い ろいろな因子に依存するであろう。例えば、温度、プライマの源、および方法の 使用である。もっとも一般的には、増幅プライマは長さが８ないし１００のヌク レオチドであり、好ましくは１０ないし３０の長さのヌクレオチドである。より 一般的には、プライマは長さが約１８から２８個の核酸である。プライマ対は、 標的としているＤＮＡのセンス鎖（翻訳される核酸からなる鎖）と雑種形成する 一つのプライマと、標的としているＤＮＡのアンチセンス鎖（翻訳されない核酸 の鎖）と雑種形成する一つのプライマとを含む。プライマ対は増幅されるべき領 域をフランクするであろう。短いプライマ分子は鋳型と十分に安定な雑種形成複 合体を形成するために冷却温度（cooler temperature）を一般に必要とする。 増幅をベースとするアッセイは、当業者に周知である(Innis、上掲を参照せよ )。ここで提供された核酸配列および他のガイドラインは、対象とするクラミジ ア種に関する１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の一部を増幅するためのプライマを当業者が ルーチンワークとして選択するのに十分なほど当業者に教えるものである。当業 者は、全体的に核酸の雑種形成とプライマ選択とについて慣れ親しんでいると思 われる。Gait et．Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach，IRL Pre ss，Oxford(1984):W.H.A．Juijpers Nucleic Acids Resarch 18(17)，5197(1994 );K．L.Dueholm J．Org．Chem．59，5767-5773(1994);S．Agrawal（ed.）Method s in Molecular Biology，volume 20;およびTijssen（1993）Laboratory Techiq ues in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Aci d Probes、例えばPart I Chapter 2"Overview of principles of hybridiztion and the strategy of nucleic acid probe assays"、Elsevier，New Yorkは、核 酸雑種形成の基本的なガイドを提供する。さらに、ＰＣＲ増幅産物は、任意にFo dor et al.（1991）Science，251:767-777;Sheldon et al．（1993）Clinical C hemistry 39(4):718-719、およびKozal et al．（1996）Nature Medicine 2(7): 753-759 に記載されているようなポリマーアレイ上で検出される。 増幅プライマの３’末端がＰＣＲでは５’末端よりも重要であることを理解す るであろう。研究者は、増幅プライマの３’末端にあるわずかなヌクレオチドの みが増幅すべきＤＮＡと相補的であるＰＣＲ産物を報告している。この点に関し て、プライマの３’末端にあるヌクレオチドは、例えば検出目的で、標的核酸と は無関係な構造的な特徴を含むことができる。プライマの選択は、増幅される試 料で生ずる可能性のある任意の既知の配列間で相補性がないように行われる。当 業者は、プライマ配列の定常領域が任意であることを理解できよう。プライマは 、それ自身の５’末端に標識を含んでおり、その例として以下に説明するものか 、あるいは他のヌクレオチドである。好ましくは、そのような５’末端のヌクレ オチド配列は既知の標的配列に対して相補的ではない。そのようなプライマに対 する５’付加としては、限定されるものではないが、化学的に修飾またはビオチ ニレート化した配列、制限エンドヌクレアーゼ・クローニング部位、プロモータ 配列、制御配列、酵素結合部位、所望の特定機能を果たす他の遺伝子またはヌク レオチド配列があげられる。 一般に、プライマの３’末端の末端ヌクレオチドにたいして、少なくとも約５ ０〜７０％、好ましくは１００％の不適正雑種形成を持つ既知のＤＮＡ配列から 可能性のあるもっともきわどい不適正雑種形成によって、すべてのプライマ配列 が完全に相補的なＤＮＡにのみ雑種形成するように選択される。 プライマは、該プライマ内に副次的な構造が形成されないように選択される。 自己相補的（self-complementary）プライマの雑種形成特性は乏しい。なぜなら 、プライマの相補的部分が自己雑種形成する(すなわち、ヘアピン構造を形成)。 プライマはまた、プライマが互いに雑種形成しないように選択され、それによっ て溶液中でのプライマの重複形成やＰＣＲ実施中に起こりうるプライマの連結を を防ぐことができる。プリマに少なくとも１を越える数だけの定常領域があるな らば、それ自身で雑種形成することなく、またはヘアピン構造を形成しないよう に、プライマの定常領域が選択される。 増幅プライマのセット（すなわち、指数的増幅に使用される５’および３’プ ライマ）が単一の長さのものである場合、大ざっぱに同一であるように、また全 体的な塩基組成が正確（すなわち、核酸のＡ＋Ｔ対Ｇ＋Ｃの比が同じ）であるよ うに選択される。 異なる長さの複数のプライマの場合、A+TとG+Cとの比は、プライマＤＮＡ雑種 形成のための融点温度（thermal melting temperature）を選択し、また選択さ れた融点温度とほぼ同じ温度を持つ各プライマのためにA+TとG+Cとの比やプロー ブの長さを選択することで決定される。 増幅産物は、当業者に周知の手段によって検出することができる。生成物は、 サイズとリガンドの使用を通じて検出することができる。用語「リガンド」また は「リガンド結合末端(ligand binding end)」は、直接的または間接的に他の構 成要素によって検出または補足されてもよい構成要素に言及する。リガンドは、 該リガンドを持たない分子が補足されないか、さもなければ抗リガンドに引き寄 せられる。リガンドは、核酸配列に対して間接的あるいは直接的に結合してもよ いものである必要がある。 直接的なリガンド結合の例として、ビオチン標識ヌクレオチドの使用またはジゴ キシゲニン（digoxigenin）の使用が含まれる。これらの分子は、リガンド結合 成分として用いることができる。それらは、それらのアンチ・リガンド、例えば ビオチンの場合はアビジンまたはストレプトアビジンによって容易に捕捉され、 適当な気質に結合する。それらの試薬はすべて容易に入手可能であり、例えばジ ゴキシゲン試薬については、Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CAを見 よ。 リガンドは、二者択一的に配列の構成要素であるアンチ・リガンドを持つ特定 の核酸配列か、該配列にとって特異的な核酸配列である。リガンドは、基質上で 処理可能な標識分子を含むもので、該標識分子は物理的または化学的にリガンド を持っていない分子から分離される。あるいは、リガンド分子は、標識または本 質的に検出可能であるアンチ・リガンド分子に対する親和性を持つことができる 。それらの組成物は、分光器的、光化学的、生化学的、免疫化学的、あるいは化 学的手段によってさらに検出することができる。例えば、有用な核酸標識として 、酵素(例えば、LacZ、CAT、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファ ターゼ、およびその他であり、検出可能な酵素として使用され、マーカー遺伝子 産物としてまたはＥＬＩＳＡにおいて)、核酸割り込み(例えば、エチジウムブロ マ イド)、さらにコロイド金または彩色ガラスまたはプラスチック等の比色標識（ 例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズ、基質、コファ クタ、阻害剤、蛍光成分(例えば、フォルオレセインおよびその誘導体、テキサ ス・レッド、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等)、 化学発光成分(例えば、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタルアジンジオ ン)、磁気粒子等があげられよう。標識試薬は任意に、例えばモノクローナル抗 体、ポリクロナール抗体、タンパク質、または親和性マトリックス等の別のポリ マー、炭水化物または脂質、蛍光色素、高密度電子（electron-dense）試薬、酵 素(例えば、一般にＥＬＩＳＡで使用される)、あるいは抗血清またはモノクロー ナル抗体が利用可能であるハプテンとタンパク質があげられる。核酸の標識に適 した幅広い範囲の標識物および結合方法は知られており、また科学文献および特 許文献の両方で集中的に報告されており、さらにそれらは核酸、あるいは増幅さ れた核酸の標識のために、本発明の方法による検出および単離のために、本発明 で一般に適用可能である。標識の選択は、所望する感度、化合物の結合の容易さ 、安定性の要求、入手可能なインストロメンテーション、さらに投棄設備に応じ る。核酸の分離および検出は、いかなる既知の方法、例えばイムノブロッティン グ、放射性または生物発光マーカーの追跡、サザンブロット、ノーザンブロット 、サウスウェスタンブロット、ノースウェストブロット、または他の方法であっ て、大きさ、電荷、または親和性にもとづいた分子を追跡する他の方法があげら れる。 標識を検出するための手段は、当業者に既知である。したがって、例えば、標 識が放射性標識である場合、検出手段としてシンチレーションカウンタまたはオ ートラジオグラフィで使用されるような写真フィルムがあげられる。標識が蛍光 標識である場合、適当な波長の光で蛍光色素を励起させ、つづいて結果として生 ずる蛍光を、例えば顕微鏡検査、目視検査、写真フィルムを介して、電荷結合素 子（ＣＣＤ）または光電子増倍管等の電子検出器を用いることで、検出可能であ る。 同様に、酵素標識は該酵素に対する適当な基質を提供し、さらに結果として生 ずる反応産物を検出することで可能である。最後に、単純な比色標識は、標識に 関連した色を観察することによってしばしば単純に検出される。したがって、種 々 のディップスティック・アッセイでは、結合した金がしばしばピンクに見え、一 方で種々の結合したビーズがビードの色に見える。 リガンドのないものからリガンド結合分子の捕捉および分離のための環境とし て使用される基質は、使用されるリガンドおよび所望のフォーマットに応じる。 例えば、固体表面は任意に、紙、または膜(例えば、ニトロセルロース)、マイク ロタイタ・ディッシュ(例えばＰＶＣ、ポリプロピレン、またはポリスチレン)、 試験管(ガラスまたはプラスチック)、ディプスティック(例えば、グラス、ＰＶ Ｃ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス等)、マイクロ遠心管、または ガラス、シリカ、プラスチック、金属、またはポリマー・ビーズまたはここに記 載されているような他の基質である。所望のアンチ・リガンドは、共有結合、ま たは非特異的結合を介して基質に非共有的に付着してもよい。 天然および合成である幅広い範囲の有機および無機ポリマーを、固形表面の材 料として用いてもよい。ポリマーの実例としては、リエチレン、ポリプロピレン 、ポリ(４-メチルブテン)、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ(エチレン テレフタレート)、レーヨン、ナイロン、ポリ(ビニールブチレート)、ポリ塩化 ビニリデンジフルオリド(PVDF)、シリコーン、ポリフルオロアルデヒド、セルロ ース、酢酸セルロース、ニトロセルロース等があげられる。アッセイに応じた適 当な他の材料は、紙、ガラス、セラミック、金属、メタロイド、半導体材料、セ メント等があげられる。さらに、ゲルを形成する基質、例えばタンパク質(例え ば、ゼラチン)、リポ多糖、ケイ酸塩、アガロース、およびポリアクリルアミド を使用することができる。いくつかの水相を形成するポリマー、例えばデキスト ラン、ポリアルキレングリコールまたは界面活性剤、例えばリン脂質、長鎖（１ ２ないし２４炭素原子）アルキルアンモニウム塩等も適している。固形表面が多 孔性である場合、種々のポアサイズがシステムの性質によって使用されるかもし れない。 表面の準備中、複数の異なる材料を例えば積層体として任意に採用し、種々の 特性を得る。例えば、ゼラチンのようなタンパク質コーティングを、非特異的結 合を避けること、共有結合を単純化すること、信号検出を高めること等に使用す ることができる。もし化合物と表面との共有結合が求められるならば、該表面は 一般に多官能価あるいは多官能価になる能力のあるものであろう。表面に存在し 、かつリンキングのために使用されるであろう官能基として、カルボン酸、アル デヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、水酸基、メルカプト基等をあげるこ とができる。共有結合に加えて、アンチ・リガンド成分を非共有結合するための 種々の方法が使用可能である。適当なリガンド-アンチリガンドおよび標識方法 に関する追加の情報について、核酸に関連している。例えば、Essential Molecu lar Biology，ed．K.H．Andy Choo，Humana Press（1994）を見よ。 キット さらに熟考することは、ここに記載するアッセイのためのキットである。上 記した方法で有用な試薬の組み合わせ、特にプライマをインストラクションとと もに一緒に詰めて下記のアッセイに使用できる。好ましいキットは、３つの対か らなるプライマを含むもので、各対はセンスおよびアンチセンス核酸プライマを 含み、該プライマは３種類のクラミジア種、すなわちChlamydia pneumoniae、Ch lamydia psittaci、およびChlamydia trachomatisの各々に特異的な１６ｓｒＲ ＮＡの領域をフランクし、さらに単一の試験アリコートによるアッセイの実行を 命令する。また、ここに提供される記述によって同定されるので、単一のプライ マが１を上回る数の対の要素としての役割を果たす。増幅バッファ等をさらにキ ットに含めることができよう。ここに引用された参考文献のすべてが一般的な背 景技術として引用され、さらにここで援用される。以下の実施例はただ本発明を 説明するためのものであって、本発明の限界として構成される。 実施例 以下に記述する典型的なアッセイ方法は、ヒトおよび鳥類でクラミジアを検出 するための、入れ子状態の多重ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）である。このアッ セイは、臨床上の検体に存在するＰＣＲの阻害剤を回避するための高い感度をも たらす。標的配列は１６ｓのrRNA遺伝子である。第一のステップPCRは特定の属 であり、そして第二のステップのPCRは多重化されており(すなわち、多数のプラ イマ・セットが同一試験管内に有する)、C．pneumoniae、C．psittaci、およびC ．trachomatisを区別する。 ２つのＰＣＲステップの各々の感度は、５感染価（infectivity units）である 。われわれは、オウム病が発生している間にＰＣＲおよび血清学的証拠を用いる ことで、C．psittaciがペットショップで購入した鳥からヒトに伝染したと推断 した。また、われわれはこの方法を用いてペットショップからの生きた鳥および 死んだ鳥の両方をC．psittaciによる感染について試験した。ＰＣＲ結果を培養 方法と比較した。ＰＣＲを鳥類の検体に適用すると、C．psittaciの検出率が培 養方法に比べて著しく増大した。 微生物の増殖および生成 クラミジア（Chlamydiae）は、すでに報告されているようにして増殖させた(( Wong et al．1992，Journal of Clinical Microbiology 30，1625-30.)。手短か に言うと、指数的増殖Ｈｅｐ−２細胞単層上に解凍したストックカルチャーを遠 心することでクラミジアを伝播させた。１０％の胎児牛血清を含む新鮮な培地（ Isocove'sModified Dulbecco's Mediu・）中でガラスビーズを使って母体となっ た単層を破砕することで、クラミジアの基本小体（elementary bodies）を播種 後７２時間に収集した。破砕された細胞懸濁液を音波破砕し、さらに５００ｘｇ 、１０分間の遠心によって部分精製し、そのレノグラフィン（renografin）上で の遠心を行った。 血清学 補体結合反応およびマイクロイムノフルオレッセンス法はすでに記述されてい る(Wong et al.1994，Journal of Clinical Microbiology 32，2417-21.)。 臨床検体の調製 臨床検体には、凝固していない血液、咽頭スワブ、糞便、組織、および排出腔 スワブが含まれる。これらの検体を、市販のキット（QiaAmp Blood and QiaAmp Tissue kits(Qiagen Inc，9600 DeSoto Ave，Chatsworth，CA 91311，USA)）を 用いてＰＣＲ用に調製した。血液および組織を除くすべての検体を、５００ｘｇ 、５分間にわたる分画遠心にかけて、Qiagenキットを用いるＤＮＡ抽出に先立っ て破片（デブリ）を沈殿させた。 PCR増幅 ＰＣＲ用の試料は、クラスII層流フード（class II laminar flow hood）内で 調製し、ＰＣＲ産物の分析はそれぞれ別の場所で実施した。10mM Tris-HCI、pH8 .3、50mM KCl，2.5mM MgCl₂を含む５０μｌの反応容量、２００μＭの各デオキ シヌクレオシドトリフォスフェート、０．１０％のＢＳＡ(Sigma Chemlcal Co， St.Louis，MO)、１．２５ユニットのTaqポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)、 ０．２μＭの各外側（outer）プライマ、および５μｌの試料を一滴のミネラル オイルにオーバーレイし、Perkin-Elmer Thermalcycler Model 480(Perkin-Elme r Cetus Corp.，Norwalk，Conn.)に置いて、９５℃、２分間を１サイクル行い、 その後９４℃を１分間、５５℃を３０秒、および７２℃を１分間のサイクルを３ ５回繰り返した。入れ子状態となった、または内側ＰＣＲ反応混合物は、外側Ｐ ＣＲ産物を１μｌ、各内側プライマを０．２μｌ含む点以外は、第一のものと同 様なものとした。サイクル条件は同一とした。 属特異的第一ステップ・プライマ１６ｓｒＲＮＡ センス5'-3’ACG GAA TAA TGA CTT CGG（配列番号１） アンチセンス5'-3’TAC CTG GTA CGC TCA ATT（配列番号２） 遺伝子産物：４３６ｂｐ 種特異的第２ステップ・プライマ １６ｓｒＲＮＡ C．tr センス5'-3’GCA ATT GTT TCG GCA ATT G（配列番号３） C．tr アンチセンス5'-3’AGC GGG TAT TAA CCG CCT（配列番号４） C．pn psi センス5'-3’ATA ATG ACT TCG GTT GTT ATT（配列番号５） C．psi アンチセンス 5'-3’TGT TTT AGA TGC CTA AAC AT（配列番号６） C．pn アンチセンス5'-3’CGT CAT CGC CTT GGT GGG CTT（配列暗号７） 外側および内側ＰＣＲの両方ともOpti-Prime PCR optimization Kit(Stratage ne，La Jolla，CA)によって最適化された。増殖産物は、２．５％アガロースゲ ル［１．５％Nusieve GTGアガロース(FMC Bioproducts，Rockland，ME)］含むTr is-ホウ酸塩-EDTAを用いた電気泳動によって分離し、臭化エチジウム蛍光によっ て視覚化した。 PCRプライマのすべてが共に感度が高く、かつ特異的であった。外側および内 側のプライマ・セットのいずれも他の呼吸器の病原体とは交差反応しなかった。 表１は特異性について試験した微生物のリストである。 属および種の両方で、各々のプライマ・セットの感度は、５感染価(Infectivi tyunit)よりも低い。多重ＰＣＲは、各クラミジア生物の検出のための５つのプ ライマすべてを含んでおり、１μｌの第一ステップＰＣＲさんぶつを用いる第２ ステップＰＣＲとして実行される。各クラミジア種の５感染価を属、第一ステッ プＰＣＲで用いた。 ペットストアから購入した病気の鳥を所有する者の病気のため、複数の病気の 鳥と数人のヒトの咽頭スワブおよび血液試料からなる３通りの異なる群に対して C．psittaciについての試験が求められた。われわれに送られてきた検体のすべ てを２ステップＰＣＲを用いて行った。培養およびＰＣＲについて試験した鳥の 検体の３つの群を表２にまとめた。培養陽性検体のすべてがＰＣＲ陽性であった 。 第一のジョージア群で試験した４個体からのヒト血清では、１つがC．psittac iに対するＭＩＦタイタが１：５１２であった。これらの個体から採取した咽頭 スワブはすべてＰＣＲネガティブであった。W.バージニア群から試験用に送られ たヒト試料はなく、すべてが鳥から単利されたものである。W.バージニア群のＰ ＣＲ陽性鳥類に曝された病人のC．psittaciに対するMIFタイタは、１：１６から １：５１２の範囲である。 われわれの経験によれば、アガロースゲルを視覚化するのに十分な産物が時々 第一ステップＰＣＲで得られない場合があり、それはＰＣＲ用臨床検体の調製／ 精製の後でも試料中に阻害剤がいまだ存在しているためである。われわれは、陽 性の試料がもっともすばやく、かつ効率的に、第一ステップＰＣＲ産物のわずか な部分を用いた第２ステップのＰＣＲによって同定されることを発見した。この 研究の焦点は、もし感染していることが知られる鳥の積荷からこれらの鳥の所有 者へChlamydia psittaciの伝播があるかどうかを判断することであった。 オウム病を確証するための感度が高く、かつ特異的な試験が不足している。わ れわれは新規の入れ子状態の多重ＰＣＲを開発した。これは同時にC.pneunionia e、C．psittaci，およびC．trachomatisを区別かつ検出するものである。このＰ ＣＲは、研究する際に、われわれにとって入手可能な検体のすべてに適用された 。 第一ジョージア群の検体では、さらされたヒトの一部は培養およびＰＣＲのた めに凝固していない血液および咽頭スワッブを集めた。新鮮な鳥の糞もまた対応 する家族から集めた。第一のジョージア群で試験された鳥の２分の１からの糞に 、ＰＣＲおよび（または）培養で証明されたようにC.psittaciが含まれていた。 ＰＣＲ陽性鳥の病気の家族の一人がC.psittaciに対するＭＩＦタイタが１：５１ ２であった。我々は、しばらくの間病気であって、回復し、さらに（または）医 療を求めて、抗生物質による治療を受けた人々を研究するようになった。したが って、回収された少数の咽頭スワブでは、ＰＣＲ陽性は認められなかった。検体 の第２のジョージア群は、２６匹の死んだ鳥由来の組織であり、これらの鳥は病 気の鳥の最初の群として同じペットストアから得たものである。これらは、ジョ ージア州動物疾患撲滅獣医（Animal Disease Eradication Veterinarian for th e State of Georgia）によって回収されたものであり、ジョージア大学で、検屍 、肉眼検査、伝統的な組織化学的染色(MachiaveloおよびGimenez染色)、および 免疫組織化学的染色によってC.psittaciの存在について試験を行った。 試験に先立った乱雑な取り扱いにより、多くのものがそれらの方法を使って正確 に試験されず、多くの鳥が試験で陰性となった。従来の方法による試験には不適 当であるこれらの鳥からの組織検体は、ＰＣＲおよび培養方法を用いて試験する ために、われわれに送られてきた。この研究では、ＰＣＲを鳥類の検体に適用す ることで、培養や伝統的な組織化学および免疫組織化学染色と比較して、 C.psittaciの検出率が著しく高まる。 Ｗ．バージニアにおけるペットストアの従業員や、病気の鳥または死んだ鳥の 飼い主がオウム病様の疾患で病気になった時、われわれはC.psittaciの領域にあ るペットストアから４５羽の鳥（糞、排出腔スワブ、または組織）を試験するよ うに依頼された。C.psittaciに対する高ＭＩＦタイタを持つ人々は、ＰＣＲ陽性 の病気の鳥にさらされていた。 われわれのＰＣＲは、C.pneumoniaeからC.psittaciを区別し、この研究で使用 されたいかなる他の方法よりも多く陽性の検体を検出した。また、検体の品質が 悪いと他の試験では失敗に終わる場合でもうまくいった。培養陽性検体はつねに ＰＣＲ陽性であり、またC.psittaciに対するＭＩＦタイタが高い人々はＰＣＲ陽 性の鳥にさらされていた。ヒトから鳥への伝播の最も強力な推論は、陽性ＰＣＲ はオウム病様の病気を持つヒトに属する鳥から生ずるということである。 ヒトの陽性検体はオーストラリア南東部でのオウム病の発生から得られた。わ れわれは、C.psittaciの検出および特徴付けのために一人の患者の剖検肺組織か らなる４つの検体を受け取った。患者は、免疫蛍光および補体結合タイタによっ てC.psittaciに抗体陽転した。彼の剖検肺組織もまた、種特異的ＰＣＲを用いて オーストラリアのC.psittaciに対してもＰＣＲ陽性であった。しかし、ＰＣＲで 検出できなかったため病因論的な動因としてC.pneumoniaeを締め出すことはでき なかった。微生物の単離およびC.pneumoniaeの検出のために、組織がわれわれに 送られた。われわれは組織からC.psittaciを培養することができなかった一方で 、４つの肺検体のうちの３つがC.psittaciに対してのみＰＣＲ陽性となり、C.pn eumoniaeは検出できなかった。 われわれのアッセイは、診断を下す臨床医に取って重要なファクタであるC.pn eumoniaeとC.psittaciとの識別を行った。われわれが剖検肺検体を試験した患者 のオーストラリアの主治医は、診断に用いられる試験の多くで固有の交差反応性 によって、C.pneumoniaeを除外するまでオウム病の診断に同意しなかったであろ う。ＰＣＲアッセイはこの研究で用いられた他の方法よりも多くの陽性検体を検 出した。他の試験で陽性の検出がうまくいかなかったのは検体の品質が悪いから であった。培養陽性検体はいつでもＰＣＲ陽性であり、C.psittaciに対す るＭＩＦタイタが高い人々はＰＣＲ陽性の鳥にさらされていた。鳥からヒトへの 伝播のもっとも強力な証拠は、陽性ＰＣＲが研究室で裏付けられたオウム病を持 つヒトにかわれていた鳥という結果になる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＺＷ (72)発明者 スケルトン，スティーブン，ケー. アメリカ合衆国 30084 ジョージア州 タッカー ウェッジウッド トレイス 6424 (72)発明者 フィールズ，バリー，エフ. アメリカ合衆国 30033 ジョージア州 デカター ホックス ヒルズ 2612

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．核酸含有試料からの単一の試験アリコート中のChlamydia pneumoniae、Chla mydia psittaci、およびChlamydia trachomatisの有無を検出する方法であって 、 （ａ）増幅産物を生成する増幅プロトコルで各ペアが３つのクラミジア(Chlam ydia)種の一つに特異的な１６ｓのｒＲＮＡの領域をフランクするように、前記 試験アリコートをセンスおよびアンチセンス核酸プライマ対と接触させるステッ プと、 （ｂ）前記３つのクラミジア種の各々に特異的な増幅産物の有無を検出するス テップと、 を有することを特徴とする方法。 ２．前記ステップ（ａ）に先だって、前記試験アリコートを、前記３つのクラミ ジア種のすべてに共通な１６ｓのｒＲＮＡの領域をフランクするセンスおよびア ンチセンスプライマの対と接触させるステップをさらに有することを特徴とする 請求項１に記載の方法。 ３．前記３つのクラミジア種に共通なプライマは配列番号１および配列番号２に 詳述されていることを特徴とする請求項２に記載の方法。 ４．前記ステップ（ａ）で使用されるプライマは配列番号３ないし配列番号７に 詳述されていることを特徴とする配列番号３ないし配列番号７に詳述されている ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ５．前記試料は痰であること特徴とする請求項１に記載の方法。 ６．前記試料は鼻咽頭スワブであることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ７．前記試料は気管支肺胞洗浄であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ８．前記試料は前記ステップ（ａ）に供する前に精製されることを特徴とする請 求項１に記載の方法。 ９．前記試料は請求項２によって加えられたステップに先立って精製されること を特徴とする請求項２に記載の方法。 １０．前記増幅プロトコルは、約８．３から約９．２のｐＨで起こることを特徴 とする請求項１に記載の方法。 １１．前記増幅プロトコルは、約１．５から約３．５の濃度でＭｇＣｌ₂による バッファ中で起こることを特徴とする請求項１０に記載の方法。 １２．前記試料は血液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 １３．前記試料は糞便であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 １４．前記試料は排出腔組織であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 １５．１６ｓのｒＲＮＡ遺伝子に相補的であり、かつC.trachomatisに対して特 異的であるセンスおよびアンチセンス核酸プライマからなる単離した対を含むこ とを特徴とする組成物。 １６．前記プライマは配列番号３および配列番号４に詳述されていることを特徴 とする請求項１５に記載の組成物。 １７．１６ｓのrＲＮＡ遺伝子に相補的であり、かつC.psittaciに対して特異的 であるセンスおよびアンチセンス核酸プライマからなる単離した対を含むことを 特徴とする組成物。 １８．前記プライマは配列番号５および配列番号６に詳述されていることを特徴 とする請求項１７に記載の組成物。 １９．１６ｓのｒＲＮＡ遺伝子に相補的であり、かつC.pneumoniaeに対して特異 的であるセンスおよびアンチセンス核酸プライマからなる単離した対を含むこと を特徴とする組成物。 ２０．前記プライマは配列番号５および配列番号７に詳述されていることを特徴 とする請求項１９に記載の組成物。 ２１．Chlamydia pneumoniae、C.psittaciおよびC.trachomatisの有無を検出す るためのキットであって、 （ａ）プライマの３つの対、各対は３つのクラミジア種の一つに特異的な１６ ｓのｒＲＮＡの領域をフランクすること、 （ｂ）単一の試験アリコートによってアッセイを実行するための命令と、を有 することを特徴とするキット。 ２２．前記プライマは、配列番号１から配列番号７に詳述されていることを特徴 とする請求項２１のキット。