JP2000513587A - 不連続プライマー伸長による核酸の反復配列長の決定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 第１の局面において、本発明の方法は、以下の工程；標的核酸にプライマーをアニーリングさせる工程；第１のプライマー伸長試薬を使用して第１のプライマー伸長反応を行う工程；標的−プライマーハイブリッドと未反応の第１のプライマー伸長試薬とを分離する工程；第２のプライマー伸長試薬を使用して第２のプライマー伸長反応を行う工程(ここで、第１または第２のプライマー伸長試薬の少なくとも１つは、ヌクレオチドに結合した標識を有する伸長可能なヌクレオチドを含む)；標的−プライマーハイブリッドを未反応の第２のプライマー伸長試薬から分離する工程；標識によって生成されるシグナルを測定する工程；標識を検出不能にさせるように標識を処理する工程；ならびにこのシグナルが前回のサイクルにおいて検出されるシグナルより実質的に少なくなるまで、上記の工程を反復する工程を包含する。第２の局面において、本発明の方法は、以下の工程：標的核酸にプライマーをアニーリングさせる工程；第１のプライマー伸長試薬を使用して第１のプライマー伸長反応を行う工程；標的−プライマーハイブリッドを未反応の第１のプライマー伸長試薬から分離する工程；第２のプライマー伸長試薬を使用しておよびプライマー停止試薬(プライマー停止試薬は、ヌクレオチドに結合された標識を有するヌクレオチドターミネーターを含む)とともに第２のプライマー伸長反応を行う工程；標的−プライマーハイブリッドを未反応の第２のプライマー伸長試薬および未反応のプライマー停止試薬から分離する工程；標識によって生成されるシグナルを測定する工程；ならびにヌクレオチドターミネーターの組み込みを示すシグナルが検出されるまで、上記の工程を反復する工程を包含する。本発明はさらに、上記の方法を実施するために有用なキットを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 不連続プライマー伸長による核酸の反復配列長の決定 発明の分野 本発明は、核酸の反復配列長を決定するために有用な方法およびキットに関す る。より詳細には、本発明は、不連続プライマー伸長反応を使用することによっ て、核酸の反復配列長を決定するために有用な方法およびキットに関する。 背景 遺伝子の多型性を分析するための方法は、基礎研究、臨床的診断、法医学、お よび他の分野において広範な有用性が見出されてきた。遺伝子の多型性を検出す る１つの特に有用な方法は、短タンデム反復配列(STR)分析、可変数タンデム反 復(VNTR)分析、ミニサテライト分析、およびマイクロサテライト分析として様々 に言及されている方法のような反復配列長おけるバリエーションに基づく。 核酸の反復配列における長さの多型性の検出は、現在でも、反復配列長を決定 するためにゲル電気泳動に依っている。しかし、ゲル電気泳動は、反復配列長の 多型性分析の状況において、いくつかの重要な欠点がある。第１に、電気泳動的 移動度に基づく分子長の測定は、分子サイズと電気泳動的移動度との間の複雑な 関係に起因して、本質的に不正確である。第２に、電気泳動プロセスが増幅され (multiplexed)得る程度は、電気泳動のレーンの数および１つのレーンにおいて 実施される異なる位置のサイズによって制限される。(すなわち、電気泳動的に 同時移動しない位置が、選択されなければならない。) 要旨 本発明の方法は、不連続プライマー伸長反応を含む。ここで、プライマーは、 このプライマーが、プライマー伸長の各々の増加において、単一の反復単位に対 応する量だけ伸長されるように、個々の増加において伸長される。個々のプライ マー伸長の各増加の後に、検出工程が実施される。この検出工程においては、プ ライマーが反復領域の全長に等しい量だけ伸長された場合、シグナルの調節が検 出される。従って、シグナルの調節を引き起こすことが必要とされる個々のプラ イマー伸長の増加数を計数することによって、反復領域を構成する反復単位数が 、決定される。 本発明の目的は、核酸の反復配列の反復領域を構成している反復単位数を決定 するための正確かつ再現性のある方法を提供することである。 本発明の別の目的は、多数の測定を並行して実施し得る核酸の反復配列の反復 領域を構成する反復単位数を決定するための方法を提供することである。 本発明のなおさらなる目的は、電気泳動的分離を必要としない核酸の反復配列 の反復領域を構成する反復単位数を決定するための方法を提供することである。 本発明の目的は、上記の所望の特性を有する核酸の反復配列の反復領域を構成 する反復単位数を決定するための方法を実施するために有用なキットおよび試薬 を提供することである。 第１の局面において、本発明の前述および他の目的は、以下の工程：標的核酸 のプライマー相補性部分をプライマーにアニーリングさせ、それによって標的− プライマーハイブリッドを形成させる工程；第１のプライマー伸長試薬を使用し て第１のプライマー伸長反応を行う工程；標的−プライマーハイブリッドと未反 応の第１のプライマー伸長試薬とを分離する工程；第２のプライマー伸長試薬を 使用して第２のプライマー伸長反応を行う工程(ここで、第１または第２のプラ イマー伸長試薬の少なくとも１つは、ヌクレオチドに結合した標識を有する伸長 可能なヌクレオチドを含む)；標的−プライマーハイブリッドを未反応の第２の プライマー伸長試薬から分離する工程；標識によって生成されるシグナルを測定 する工程；標識を検出不能にさせるように標識を処理する工程；およびこのシグ ナルが前回のサイクルにおいて検出されるシグナルより実質的に少なくなるまで 、上記の工程を反復する工程を包含する標的核酸の反復領域における反復単位数 を決定するための方法によって達成される。 本発明の第１の局面の１つの好ましい実施態様において、第２のプライマー伸 長反応を行う工程は、プライマー停止試薬と標的−プライマーハイブリッドとを 反応させる工程をさらに包含する。 本発明の第１の局面の別の好ましい実施態様において、標的−プライマーハイ ブリッドは、固体支持体に付着される。好ましくは、プライマーまたは標的核酸 のうちの１つが、固体支持体に結合される。 本発明の第１の局面のさらに別の好ましい実施態様において、標識は、蛍光分 子または化学発光分子である。 本発明の第１の局面の別の好ましい実施態様において、標識は、切断可能なリ ンカーを介して伸長可能なヌクレオチドに結合されている。 本発明の別の第１の局面のさらなる好ましい実施態様において、標的核酸は、 分析の前に増幅されている。好ましくは、このような増幅は、PCRを使用して達 成される。 本発明の第１の局面の別の好ましい実施態様において、標識を検出不能にする ように標識を処理する工程は、標識された伸長可能なヌクレオチドから標識を切 断する工程または標識のシグナル生成特性を破壊する工程のいずれかを包含する 。 第２の局面において、本発明の前述および他の目的は、以下の工程：標的核酸 のプライマー相補性部分をプライマーにアニーリングさせ、それによって標的− プライマーハイブリッドを形成させる工程；第１のプライマー伸長試薬を使用し て第１のプライマー伸長反応を行う工程；標的−プライマーハイブリッドと未反 応の第１のプライマー伸長試薬とを分離する工程；第２のプライマー伸長試薬を 使用しておよび第２のプライマー停止試薬(プライマー停止試薬は、ヌクレオチ ドに結合された標識を有するヌクレオチドターミネーターを含む)とともに第２ のプライマー伸長反応を行う工程；標的−プライマーハイブリッドを未反応の第 ２のプライマー伸長試薬および未反応のプライマー停止試薬から分離する工程； 標識によって生成されるシグナルを測定する工程；およびプライマー伸長産物に 標識されたヌクレオチドターミネーターの組み込みを示すシグナルが検出される まで、上記の工程を反復する工程を包含する標的核酸の反復領域における反復単 位数を決定するための方法によって達成される。 本発明の第２の局面の好ましい実施態様において、標的ープライマーハイブリ ッドは、固体支持体に結合される。好ましくは、プライマーまたは標的核酸のう ちの１つが、固体支持体に結合されている。 本発明の第２の局面のなお別の好ましい実施態様において、標識は、蛍光分子 および化学発光分子からなる群より選択される。 本発明の第２の局面のさらなる好ましい実施態様において、標的核酸は、分析 の前に増幅されている。好ましくは、このような増幅は、PCRを使用して達成さ れる。 第３の局面において、本発明の前述および他の目的は、以下を含む標的核酸の 反復領域において反復単位数を決定するために有用なキットによって達成される ：標的核酸のプライマー相補性部分に対して配列相補性を有するプライマー；第 １のプライマー伸長試薬；および第２のプライマー伸長試薬(ここで、第１また は第２のプライマー伸長試薬の少なくとも１つは、ヌクレオチドに結合した標識 を有する伸長可能なヌクレオチドを含む)。 本発明の第３の局面の好ましい実施態様において、プライマーは、固体支持体 に結合される。 本発明の第３の局面のさらなる好ましい実施態様において、標識は、蛍光分子 および化学発光分子からなる群より選択される。 本発明の第３の局面の別の好ましい実施態様において、標識は、切断可能なリ ンカーを介して伸長可能なヌクレオチドに結合されている。 本発明のこれらのならびに他の目的、特徴、および利点は、以下の発明の詳細 な説明、図面および添付の請求の範囲を参照することによってより良好に理解さ れる。 図面の簡単な説明 図１は、標的核酸の略図を示す。 図2A〜Cは、伸長可能なヌクレオチドが標識され、そしてこの標識がプライマ ー伸長の各個々の増加に続いて検出不能にされる本発明の方法の第１の局面を示 す。 図3A〜Bは、ヌクレオチドターミネーターが標識される本発明の方法の第２の 局面を示す。 好ましい実施態様の詳細な説明 ここで、言及は本発明の好ましい実施態様に対して詳細に行われ、この例が、 添付の図面に図示される。本発明が好ましい実施態様とともに記載されると同時 に、本発明がこれらの実施態様に制限されることは意図されないことが理解され る。反対に、本発明は、添付の請求の範囲により規定される本発明内に包含され 得る代替物、改変物および当価物を包含することが意図される。I ．定義 他に記載されない限り、本発明中で使用される以下の用語および句は以下の意 味を有することが意図される： 「ヌクレオシド」とは、ペントースに１’位で連結された、プリン、デアザプ リン（deazapurine）またはピリミジンのヌクレオシド塩基（例えば、アデニン 、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン など）からなる化合物をいう（２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシ形態を含 む）（Stryer）。本明細書中で使用される用語「ヌクレオチド」とは、ヌクレオ シドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）をいう。ここで最も一般的 なエステル化部位はペントースのC-5位で結合したヒドロキシル基である。本開 示の用語において多くの場合、ヌクレオシドは、ヌクレオシドおよびヌクレオチ ドの両方を包含することが意図される。本明細書中で使用される用語、ヌクレオ チドおよびヌクレオシドは、例えば、他に記載されるような、改変ヌクレオシド 塩基部分、改変糖部分および/または改変リン酸エステル部分を有する合成アナ ログを含むことが意図される（Scheit;Eckstein）。 「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドモノ マーの直鎖状ポリマーをいう（一本鎖、二本鎖および三本鎖のデオキシヌクレオ チド、リボヌクレオチド、それらのα-アノマ−形態などが含まれる）。通常、 ヌクレオシドモノマーはホスホジエステル結合により結合され、本明細書中で使 用される場合、用語「ホスホジエステル結合」とは、ホスホジエステル結合また はそのホスフェートアナログを含む結合をいう。ここでリン（phosphorous）原 子は＋５の酸化状態にあり、そして１つ以上の酸素原子が非酸素部分で置換され ている。例示的なホスフェートアナログには、ホスホロチオエート、ホスホロジ チオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロ チオエート、ホスホロアニリデート(phosphoranilidate)、ホスホロアミデート( phosphoramidate)、ボロノホスフェートなどを含み、これには関連する対イオン （例えば、Ｈ、NH₄、Naなど）が、もしそのような対イオンが存在するのならば 、含まれる。あるいは、ホスホジエステル結合または他の結合を介して連結され た、ポリヌクレオチドは非ヌクレオチドモノマーのポリマーを含み得る。これは 標的核酸（例えば、ペプチド核酸（PNA））ポリマーと配列特異的ハイブリッド を形成し得る。ポリヌクレオチドは、代表的には、少数のモノマー単位（例えば 、８〜40）から数千モノマー単位のサイズの範囲である。ポリヌクレオチドが「 ATGCCTG」のような文字の配列により表される場合は常に、ヌクレオチドは５’ →３’の順で、左から右に存在し、他に記載されない限り、「Ａ」はデオキシア デノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシ ンを示し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。 「伸長可能なヌクレオチド」とは、プライマー伸長反応の間にプライマー伸長 生成物中に取り込まれた場合に、このようなプライマー伸長生成物のさらなる伸 長を可能にする任意のヌクレオチドを意味する。例示的な伸長可能なヌクレオチ ドには、2'-デオキシヌクレオチド三リン酸（例えば、2'-デオキシウリジン-5'- 三リン酸、2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸、2'-デオキシ-7-デアザデオキ シグアノシン-5'-三リン酸、2'-デオキシアザノシン-5'-三リン酸、2'-デオキシ チミジン-5'-三リン酸および2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸）が挙げられる 。必要に応じて、１つ以上の伸長可能なヌクレオチドには標識を含む。 「ヌクレオチドターミネーター」とは、プライマー伸長生成物中に取り込まれ た場合にこのようなプライマー伸長生成物のさらなる伸長を阻害する任意のヌク レオチドを意味する。ヌクレオチドターミネーターの１つの必須条件は、ヌクレ オチドターミネーターがリボフラノース糖部分を含む場合に、さらなるヌクレオ チドを取り込むために引き続いてポリメラーゼによって使用され得るヒドロキシ 基を、３’部位が有してはならないことである。あるいは、リボフラノースアナ ログが使用され得る（例えば、アラビノース）。例示的なヌクレオチドターミネ ーターには、2',3'-ジデオキシ-β-Ｄ-リボフラノシル、β-Ｄ-アラビノフラノ シル、3'-デオキシ-β-Ｄ-アラビノフラノシル、3'-アミノ-2',3'-ジデオキシ- β-Ｄ-リボフラノシルおよび2',3'-ジデオキシ-3'-フルオロ-β-Ｄ-リボフラノ シル（Chidgeavadze）が挙げられる。ヌクレオチドターミネーターはまた、可逆 性（reversable）ヌクレオチドターミネーター（Metzker）を含む。 「ポリメラーゼ」は、プライマーの３’末端またはプライマー伸長生成物上に 、このようなプライマーまたはプライマー反応生成物が標的核酸とアニールされ る場合に、ヌクレオチドの標的配列依存的取り込みを導く反応を触媒し得る酵素 または他の触媒を意味する。例示的なポリメラーゼには、Pfu DNAポリメラーゼ 、E.ColiポリメラーゼＩ、T-7ポリメラーゼ、逆転写酵素、Taq DNAポリメラーゼ などが挙げられるが、これらに限定されない（KornbergおよびBaker）。 「標識」とは、本発明のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに結合した場合 に、公知の検出方法を使用してこのようなヌクレオチドまたはポリヌクレオチド を検出可能にさせる任意の部分を意味する。標識は、直接標識（それ自体が検出 可能である）または間接標識（他の薬剤と組み合わせて検出可能である）であり 得る。例示的な直接標識には、蛍光団（fluorophore）、発色団、ラジオアイソ トープ、スピンラベル、化学発光標識などが挙げられるが、これらに限定されな い。例示的な間接標識には、シグナル生成事象を触媒する酵素、および抗原また はビオチンのようなリガンド（高親和性で検出可能な抗リガンドに特異的に結合 し得る（例えば、標識抗体またはアビジン））が挙げられる。 「プライマー伸長反応」とは、標的−プライマーハイブリッドとヌクレオチド との間の反応を意味する。これは、付加されたヌクレオチドが標的核酸の対応す るヌクレオチドに相補的であるように、プライマーの３’末端へのヌクレオチド の付加を生じる。 「プライマー伸長試薬」とは、プライマー伸長反応をもたらすのに必須である 構成成分を含む試薬を意味する。プライマー伸長試薬には、代表的には、（ｉ） ポリメラーゼ酵素；（ii）緩衝液；および（iii）1つ以上の伸長可能なヌクレオ チドが挙げられる。 「特異的結合対」とは、互いに特異的に結合して結合複合体を形成する分子対 をいう。特異的結合対の例には、抗体−抗原（またはハプテン）対、リガンド− レセプター対、酵素−基質対、ビオチン−アビジン対、相補的な塩基対を有する ポリヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。 「プライマー」とは、特定の標的配列と選択的にアニールし得るポリヌクレオ チドをいい、そして、これ以降では、プライマーが5'→3'の方向で伸長される場 合、プライマー伸長反応の開始点として作用し得るポリヌクレオチドをいう。II. 本発明の方法に使用される材料 Ａ．標的核酸 本発明とともに使用される標的核酸は、任意の生存している、またはかつて生 存していた生物（原核生物、真核生物、植物、動物、およびウイルスを含むがこ れらに限定されない）に由来し得る。標的核酸は、細胞の核（例えば、ゲノムDN A）が起源であり得るか、または核外核酸（例えば、プラスミド、ミトコンドリ ア核酸など）であり得る。 多数の方法が、本発明に使用する標的核酸の単離および精製に利用可能である 。好ましい精製方法は、実質的にタンパク質を含まない標的核酸を提供して効率 的なプライマー伸長および核酸増幅を可能にするべきである。好ましい精製方法 には、（ｉ）好ましくは、自動DNA抽出機（例えば、PE Applied Biosystems(Fo ster City,CA)から入手可能であるModel 341 DNA Extractor）を使用する有機溶 媒抽出、引き続き、例えば、フェノール/クロロホルム有機試薬を使用するエタ ノール沈殿（Ausubel）；（ii）固相吸着法（Walsh,Boom）；および（iii）塩誘 導DNA沈殿法（Miller）（このような方法は代表的には「塩析」方法と呼ばれ る）が挙げられる。必要に応じて、上記の精製法の各々は酵素切断工程に先んじ て行われて、サンプルからタンパク質を除去するのを助ける（例えば、プロテイ ナーゼＫまたは他の類似のプロテアーゼでの切断）。 本発明の方法の感度を増加させるため、好ましくは、標的核酸は、適切な核酸 増幅手順を使用して、本方法の実施の前に増幅される。このような増幅は直線的 か,または指数関数的である。好ましい実施態様において、標的核酸の増幅は、 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して達成され得る（Mullis）。一般的に、P CRは、初期変性工程（これは二本鎖核酸サンプルの鎖を分離する）、続いて、（ ｉ）アニーリング工程（これは増幅プライマーを標的配列の隣接する位置に特異 的にアニーリングさせる）；（ii）伸長工程（これはプライマーを5'→3'方向に 伸長させ、それによって標的核酸に相補的なアンプリコン核酸を形成する）、な らびに（iii）変性工程（これはアンプリコンおよび標的配列の分離を生じさせ る）の繰り返しから構成される。上記の工程の各々は、異なる温度で行われ得、 ここで温度変化はサーマルサイクラーを使用して達成され得る（PE Applied Bio systems,Foster City,CA）。 本発明での使用のための標的核酸の一般構造は、図1に示される。ここで標的 核酸５は、５’隣接部位10（これはプライマー相補部位15を含む）、３’隣接領 域25および５’隣接部位と３’隣接部位との間に配置された反復領域20を含む。 標的核酸の反復領域20は複数の反復単位(R)_n21を含み、ここでＲは反復単位を示 し、そしてｎは反復領域を構成する反復単位数を示す。反復単位Ｒは任意の型の 反復モチーフ、例えば、マイクロサテライト反復（WebberおよびMay；Smeets;Wi lliamson）、ミニサテライト反復（Jeffreys、Caskey）またはα-サテライト反 復（Jabs）であり得るが、これらに制限されない。 反復領域は複数の型の反復単位またはそれ自体が多型である反復単位から構成 され得る。 Ｂ．プライマー 本発明の使用のためのプライマーは、プライマーアニーリングの特異性（すな わち、プライマー伸長反応において所望されない標的配列が関与する頻度）とプ ライマー伸長の効率（すなわち、プライマー伸長反応において所望の標的配列が 関与する程度）の間のバランスを得るために設計される。 プライマーアニーリングの特異性は、一般にプライマーの長さおよびアニーリ ング反応の温度により制御される。約18と24塩基との間のポリヌクレオチドが好 ましい。なぜならば、アニーリング温度がプライマー融解温度の２、３℃以内に 設定される場合、このようなポリヌクレオチドは非常に配列特異性である傾向が あるからである（Dieffenbach）。プライマー伸長を容易にするために、３’末 端のプライマーは-OH基またはプライマーの３’末端にヌクレオチドの取り込み を可能にする他の部分を含む。多数のコンピュータープログラムが異なる状況に おけるプライマー選択を容易にするために存在する（Osborne；Montpetit）。 プライマーの配列は、プライマーが標的核酸の５’隣接部分のプライマー相補 性部位にアニールするように選択される。好ましくは，プライマーの３’末端が 標的核酸の反復領域の５’末端に近接するように、プライマーはアニールする。 しかし、プライマーはまた、標的の５’隣接部分に対して少なくとも部分的に固 定される限り、標的核酸の反復領域のセグメントにアニールし得る。 好ましくは、本発明のプライマーは、標準化学（例えば、ホスホルアミダイト 化学（Beaucage））を使用して、自動DNA合成機（例えば、PE Applied Biosyste ms(Foster City,CA)model 392または394 DNA/RNA Synthesizer）で従来どおり合 成される。代替方法においては、プライマーは生物学的供給源から単離され得る 。 Ｃ．固相支持体 本発明の方法の好ましい実施態様において，標的-プライマーハイブリッドは 分離工程の間、固相支持体に結合される。このような結合は、標的核酸またはプ ライマーポリヌクレオチドのいずれかを介してであり得る。 本発明での使用のための固相支持体は広範な形態を有し得、これには、微粒子 、ビーズ、膜、スライド、プレート、微細加工チップ（micromachined chip）な どを含む。さらに、本発明の固相支持体は広範な種々の組成物（ガラス、プラス チック、ケイ素、アルカンチオエート誘導体化金、セルロース、低架橋型または 高架橋型ポリスチレン、シリカゲル、ポリアミドなどを含む）を含み得る。 標的-プライマーハイブリッドの結合がプライマーを介する場合、プライマー は、それらが合成された固相支持体上を用いて使用され得るか、またはそれらは 別々に合成され、そして本発明の方法の分離工程の間またはその工程の前の使用 のために固相支持体に結合され得る。 プライマーが同じ固相支持体上で合成されそして使用される場合、このような 支持体は種々の形態を含み得、そして種々の連結部分を含み得る。このような支 持体は、微粒子もしくは平面アレイ、または実質的に均一なプライマー集団を有 するマトリクスの領域を含み得る。広範な種々の微粒子合成支持体は本発明で使 用され得、これには、制御された細孔ガラス（CPG）、高度に架橋したポリスチ レン、アクリルコポリマー、セルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス 、ポリアクロレインなどから成る微粒子が含まれる。微粒子支持体には、市販の ヌクレオシド誘導体化CPGおよびポリスチレンビーズ（例えば、Applied Biosyst ems，Foster City，CAから入手可能）；誘導体化磁気ビーズ；ポリエチレングリ コールでグラフト化されたポリスチレン（例えば、TentaGel，Rapp Polymere，T ubingen Germany）などがさらに含まれる。支持体特性（例えば、材料、多孔度 、サイズ、形状など）および使用される連結部分の型の選択は、プライマーが使 用される条件に依存する。例えば、本発明において、ポリメラーゼ酵素の立体的 障害を最小にし、およびヌクレオチド基質への接近を容易にする、支持体および リンカーが好ましい。最も適切な微粒子支持体を選択する場合に考慮される他の 重要な因子には、サイズの均一性、合成支持体としての有効性、既知の表面積の 程度、および光学特性（例えば、透明の滑らかなビーズは、表面上で多数のビー ズを処理する場合に計測的利点を提供する）が含まれる。 上記のように、プライマーもまた、単一の（または2、3の）固相支持体上で合 成され得、プライマーで均一に被膜化されたアレイの領域を形成する。すなわち 、このようなアレイにおける各領域内で、同じプライマーが合成される。このよ うなアレイを合成するための技術は、他の場所に開示されている（Pease;Southe rn）。 プライマーが別々に合成され、そして続いて使用のために固相支持体に結合さ れる場合、プライマーは共有結合または非共有結合を介して支持体に結合され得 る。プライマーが非共有結合を介して固体支持体に結合される場合、プライマー は特異的な結合対の一方のメンバー（例えば、ビオチン）を含み、対の他方のメ ンバー（例えば、アビジン）は固体支持体に結合される。いくつかの方法（例え ば、5'-アミノポリヌクレオチドとイソチオシアネート機能化ガラス支持体（Guo ）との反応を介して）が、固体支持体へのポリヌクレオチドの共有結合に利用可 能である。プライマーを、共有的または非共有的のいずれかで固体支持体に結合 するための広範な例示的な結合部分は、他の場所に開示されている（Pon;Webb;B arany;Damha;Beattie;MaskosおよびSouthern）。 プライマー-テンプレートハイブリッドの結合がテンプレート核酸を介し、そ してテンプレート核酸がPCRアンプリコンである場合、共有結合または非共有結 合のための手段は、PCRを担うために使用されるPCRプライマーに取り込まれ得る 。従って、PCRプライマーは、特異的な結合対のメンバー（例えば、ビオチン） 、または共有結合を形成するための機能化された固体支持体と反応し得る反応性 部分（例えば、イソチオシアネート機能化ガラス支持体と反応する５'-アミノ基 ）を含み得る。 Ｄ．標識化ヌクレオチド 本発明の方法において、1つ以上の伸長可能なヌクレオチドおよび/またはヌク レオチドターミネーターは、標識を含む。標識は、標識がプライマー伸長反応に おいて標識化ヌクレオチドのポリメラーゼ媒介性取り込みを実質的に妨害しない 様式で、ヌクレオチドに結合する。多くの代替的な方法が、本発明での使用に適 した様式で、ヌクレオチドを標識化するために利用可能である（Kricka）。標識 化方法の好ましいクラスにおいて、ヌクレオチドのヌクレオシド塩基（すなわち 、プリン塩基のＮ-6位またはピリミジン塩基のＣ-5位）は、標識を含むように改 変される。標識化ヌクレオチドの特に好ましいクラスは、プロパルギルエトキシ アミノヌクレオチドである（Khan）。 本発明の１つの好ましい実施態様において、標識された伸長可能なヌクレオチ ドは、例えば、適切な試薬または電磁放射を用いて処理した場合に、検出不能に され得る。この実施態様において、標識された伸長可能なヌクレオチドは、ヌク レオチドから標識を除去するか、または標識のシグナル生成特性を破壊するかの いずれかによって検出不能にされ得る。 いくつかの方法が、伸長可能なヌクレオチドに、標識が容易に除去され得るよ うに標識を結合するために利用可能である。標識をヌクレオチドに結合するため の例示的な切断可能なリンカーには、N-[4-(p-アジドサリチルアミド)ブチル]-3 '-[2'-ピリジルジチオ]プロピオンアミド（APDP）、ビス[2-(スクシンイミドオ キシカルボニルオキシル)エチル]スルホン(BSOCOES)、ジスクシンイミジル（dis uccininimdyl）タータレート（DST）、およびエチレングリコビス-[スクシンイ ミジルスクシネート]（EGS）などが含まれるが、これらに限定されない（Pierce Catalog）。 シグナル生成特性が、適切な試薬または電磁放射で処理した場合に破壊され得 る好ましい標識には、（蛍光特性が、高強度の光への暴露を介する光分解によっ て、または酸化化学物質（例えば、酸素、次亜塩素酸ナトリウム、過マンガン酸 塩(permanginate)など）での処理による化学的分解によって、破壊され得る蛍光 標識が含まれる。標識の代替的な好ましいクラスには、不可逆的な酵素インヒビ ターとの反応によって、または変性によって検出不能にされ得る酵素、および単 一な光生成変換のみを受け得、従って自己破壊性である化学発光標識が含まれる 。 Ｅ．第１および第２のプライマー伸長試薬 本発明には、本発明の方法に従って使用される場合、プライマーの伸長を単一 反復単位の不連続な増加において進行させ得る（すなわち、プライマーは不連続 なプライマー伸長反応１サイクルあたり１つの反復単位によってのみ伸長される ）、第１および第２のプライマー伸長試薬が含まれる。 本発明の第１のプライマー伸長試薬は、プライマー伸長反応を、プライマーが 完全な反復単位よりも少ない量によって伸長される程度までのみ進行させ得る、 １セットの伸長可能なヌクレオチドを含む。従って、反復単位の特定の配列に依 存して、第1のプライマー伸長試薬は種々の可能な伸長可能なヌクレオチドの組 み合わせを含み得る。例えば、反復単位の配列がAGCTである場合、第１のプライ マー伸長試薬は、伸長可能なヌクレオチドであるＴ（Ａと相補的である）、Ｔお よびＣ（ＡおよびＧと相補的である）、またはＴおよびＣおよびＧ（ＡおよびＧ およびＣと相補的である）を含み得る。しかし、非制御性の連続的なプライマー 伸長を妨害するために、第１のプライマー伸長試薬は全ての伸長可能なヌクレオ チドＴおよびＣおよびＧおよびＡを含んではならない。 特定の状況において、第１のプライマー伸長試薬を、各サブ試薬が、反復配列 のサブ部分が形成される程度までのみプライマーが伸長され得るに十分な伸長可 能なヌクレオチドを含むように、別々のサブ試薬にサブ分割することが望ましい 。例えば、反復単位がATGCCGTである場合、第１のプライマー伸長試薬の１つの サブ試薬は、伸長可能なヌクレオチドＴ、Ａ、およびＣを含み得、一方、第１の プライマー伸長試薬の別のサブ試薬は伸長可能なヌクレオチドＧおよびＣを含み 得る。 本発明の第２のプライマー伸長試薬は、プライマー伸長反応を、第１のプライ マー伸長試薬によって合成されない反復単位の部分が合成される程度までのみ進 行させ得る、１セットの伸長可能なヌクレオチドを含む。従って、反復単位の特 定の配列および第１のプライマー試薬の組成に依存して、第２のプライマー伸長 試薬は、種々の可能なヌクレオチド組み合わせを含み得る。上記の実施例を継続 して、反復単位の配列がAGCTであり、そして第１のプライマー伸長試薬が伸長可 能なヌクレオチドＴおよびＣを含む場合、第２のプライマー伸長試薬は伸長可能 なヌクレオチドＧおよびＡを含み得る。 Ｆ．プライマー停止試薬 本発明は、一旦、プライマー伸長産物がプライマー停止試薬と反応した場合、 さらなるプライマー伸長が達成され得ないように、プライマー伸長の終結を引き 起こすためのプライマー停止試薬を含む。 本発明のプライマー停止試薬は、1つ以上のヌクレオチドターミネーターを含 み、そして必要に応じて、プライマー伸長反応を、プライマーがプライマー伸長 反応において完全な反復単位よりも少ない量にまで伸長される程度までのみ進行 させる、1セットの伸長可能なヌクレオチドを含む。従って、反復単位の特定の 配列、標的核酸の3’隣接部分の配列、ならびに第１および第２のプライマー伸 長 試薬の組成に依存して、プライマー停止試薬は、種々の可能な伸長可能なヌクレ オチドおよびヌクレオチドターミネーターの組み合わせを含み得る。例えば、反 復単位の配列がAGCTであり、および3'隣接部分の第１のヌクレオチドがＧであり 、および第１ならびに第２のプライマー伸長試薬が伸長可能なヌクレオチドＴ、 Ｃ、Ｇ、およびＡを含む場合、プライマー停止試薬はヌクレオチドターミネータ ーＣのみを含む（このようなヌクレオチドターミネーターは3'隣接部分に位置す るＧと相補的である）。あるいは、第１および第２のプライマー伸長試薬が伸長 可能なヌクレオチドＴおよびＣのみを含む場合、プライマー停止試薬は伸長可能 なヌクレオチドＧおよびＡならびにヌクレオチドターミネーターＣを含む。 本発明の特定の局面において、プライマー停止試薬は、標識化ヌクレオチドタ ーミネーターを含む。ヌクレオチドターミネーターの標識化は、本質的に、上記 のＤ節に記載されるように達成される。 III．方法 本発明の方法の第１の局面の好ましい実施態様は、図2A〜Ｃに模式的に示され る。図において、本発明の方法は、配列「AC」を有する２コピーの２塩基反復お よび反復領域に隣接するＧヌクレオチドを有する3'隣接部分25から成る反復領域 20を有する標的核酸５に適用される。第１の局面のこの好ましい実施態様におい て、プライマー200は標的核酸５のプライマー相補的部分15にアニールし、それ によって標的-プライマーハイブリッドを形成する。次いで標的-プライマーハイ ブリッドを、標識化伸長可能なヌクレオチドＴを含む第１のプライマー伸長試薬 と反応させ、プライマー伸長産物210の3'末端に標識化Ｔヌクレオチドを取り込 ませる。第１のプライマー伸長試薬との反応に続いて、第１のプライマー伸長試 薬を標的-プライマーハイブリッドから分離し、そして標的-プライマーハイブリ ッドを、伸長可能なＧヌクレオチドを含む第２のプライマー伸長試薬と反応させ 、プライマー伸長産物215の3'末端にＧヌクレオチドを付加させる。次いで、未 反応の第２のプライマー伸長試薬を標的-プライマーハイブリッドから分離し、 そしてプライマー伸長産物に取り込まれた標識化伸長可能なヌクレオチドの量を 決定するための測定を行う。図のヒストグラムによって示されるように、プロセ ス のこの時点において、大きなシグナルが検出され、このことは、取り込まれた標 識化Ｔヌクレオチドの存在を示す。最後に、続いての不連続なプライマー伸長反 応サイクルのための標的-プライマーハイブリッドを調製するために、取り込ま れた伸長可能なヌクレオチドに結合した標識を検出不能にする。実施例において 、上記のプロセス工程を、図2Bおよび2Cに示されように、さらに２回繰り返す。 図2Cにおける第３のサイクルにおいて、測定されたシグナルの強度は、第１の２ つのサイクルにおいて見られるシグナル強度と比較した場合、実質的に減少する 。なぜなら、標識化伸長可能なヌクレオチドＴは、この時点でプライマー伸長産 物に取り込まれ得ないからである。従って、第３のサイクルにおいて見られる測 定されたシグナルにおけるこの減少は、反復領域がAC反復単位の2コピーのみを 含むことを示す。 本発明の方法の第二の局面の好ましい実施態様は、図３A〜Bに示される。以前 と同様に、この方法は、配列「AC」を有する２塩基反復の２コピーおよび反復領 域に隣接するGヌクレオチドを有する３’隣接部分からなる反復領域を有する標 的核酸に適用される。第二の局面のこの好ましい実施態様において、以前と同様 に、プライマ〜200は、標的核酸５のプライマー相補的部分15にアニーリングし 、それにより標的プライマーハイブリッドを形成する。次いで、標的プライマー ハイブリッドを、非標識伸長可能ヌクレオチドTを含む第一のプライマー伸長試 薬と反応させ、非標識Tヌクレオチドをプライマー伸長産物310の３’末端に組み 込ませる。第一のプライマー伸長試薬との反応に続いて、第一のプライマー伸長 試薬は、標的プライマーハイブリッドから分離され、そして標的プライマーハイ ブリッドを、伸長可能Gヌクレオチドを含む第二のプライマー伸長試薬および標 識化Cヌクレオチドターミネーターを含むプライマー停止試薬と反応させ、その 結果、G伸長可能ヌクレオチドのみがプライマー伸長産物315の３’末端に付加さ れる。次に、未反応の第二のプライマー伸長試薬およびプライマー停止試薬を標 的プライマーハイブリッドから分離し、そして測定を行ってプライマー伸長産物 に組み込まれた標識ヌクレオチドターミネーターの量を決定する。図に示される ように、プロセスのこの時点で、シグナルは、検出されず、これは、標識された ヌクレオチドターミネーターが、プロセスのこのサイクルの間にプライマー伸長 産 物に組み込まれていないことを示す。図３Bにおいて、上記のプロセス工程が反 復される。図３Bに示されるこの第二のサイクルにおいて、測定されたシグナル の強度は、プロセスの第一の工程において観察された名目上ゼロのシグナル強度 に比較して、実質的に増加している。なぜなら、第二の工程の間に、標識された ヌクレオチドCターミネーターは、プライマー伸長産物中に組み込まれるからで ある。 以下の考察は、本発明の第一および第二の局面の上記の方法工程のより詳細な 記載を提供する。 Ａ．プライマーアニーリング アニーリング反応を、配列特異性を保証するのに十分であり、なお許容し得る 割合で安定なハイブリッドを形成させるのに十分に許容可能なストリンジェント な条件下で行う。プライマーアニーリングに要求される温度および時間の長さは 、塩基の組成、プライマーの長さおよび濃度、ならびに使用される溶媒の性質（ 例えば、DMSO、ホルムアミド、またはグリセロールのような共溶媒およびマグネ シウムのような対イオンの濃度）を含むいくつかの因子に依存する。代表的には 、合成ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、アニーリング溶媒にお ける標的プライマーハイブリッドの融解温度より約５〜10℃低い温度で行われる 。好ましくは、アニーリング温度は、55〜75℃の範囲であり、そしてプライマー 濃度は、約0.2μＭである。これらの好ましい条件下で、アニーリング反応は、 わずか数秒で完了する。 Ｂ．プライマー伸長反応 プライマー伸長反応をもたらすのに必要とされる時間は、標的配列の長さおよ び濃度に、ならびに反応温度に依存する。代表的な条件下でのヌクレオチド付加 の速度についての見積もりは、緩衝液、ｐＨ、塩濃度、ポリメラーゼ酵素、およ びＤＮＡテンプレートの性質に依存して、１秒あたり35〜100ヌクレオチドまで 変化する。 単一反復単位の不連続な増分にて進行するプライマー伸長反応を達成するため に、本発明の方法に従って、プライマー伸長反応は、２つの独立な工程：第一の プライマー伸長反応および第二のプライマー伸長反応、に分けられる。第一のプ ライマー伸長反応において、プライマーは、単一反復単位の長さよりも短い量だ け伸長し、ここでプライマー伸長の程度の制御は、第一のプライマー伸長試薬の 組成によってもたらされる。第二のプライマー伸長反応において、プライマーは 、第一のプライマー伸長反応との組み合わせにおいて、プライマーが単一の反復 単位の長さに等しい量だけ伸長するような量だけ伸長する。 本発明の方法の第一の局面に従って、第一または第二のプライマー伸長試薬の １つは、標識された伸長可能なヌクレオチドを含む。 また、本発明の方法の第一の局面に従って、上記の２工程不連続プライマー伸 長反応の改変において、第二のプライマー伸長試薬は、プライマー停止試薬を含 む。従って、第二のプライマー伸長反応の後に、プライマーが標的核酸の反復領 域の末端まで伸長されている場合、ヌクレオチドターミネーターは、プライマー 伸長産物中に組み込まれ、このようにして、そのプライマー伸長産物のいかなる さらなる伸長も防止している。これは、標的核酸の反復領域を越えて任意の偽プ ライマー伸長が起こる可能性を除去するので有利である。。本発明のこの実施態 様は、反復配列の２つの対立遺伝子が同時に調査される場合に特に好ましい。 本発明の第二の局面に従って、標識化ヌクレオチドターミネーターを含むプラ イマー停止試薬は、第二のプライマー伸長反応に含まれる。好ましくは、標識さ れたヌクレオチドターミネーターは、標的核酸の３’隣接部分の３’末端でのヌ クレオチド（このような標的核酸の反復領域に隣接する）に相補的であるように 選択される。 Ｃ．プライマーの分離およびプライマー伸長試薬 第一と第二のプライマー伸長反応との間において、分離工程が、第一および第 二のプライマー伸長試薬の混合を防止し、それにより制御されないプライマー伸 長を予防するために行われる。分離工程をもたらすために使用される手段は、標 的プライマーハイブリッドを第一および/または第二のプライマー伸長試薬から 分離し得る任意の手段であり得る。例示的な分離方法には、HPLC、電気泳動、液 体-液体抽出、固体-液体抽出、吸着などが含まれるがこれらに限定されない。 好ましい実施態様において、標的プライマーハイブリッドは、プライマー伸長 試薬が、単に固体支持体を洗浄することによって標的プライマーハイブリッドか ら分離され得るように、分離工程の間に固体支持体に結合される。この実施態様 に従って、プライマーは、第一のプライマー伸長反応を行う前および後に固体支 持体に結合され得る。洗浄条件は、標的プライマーハイブリッドが実質的に破壊 され、そしてプライマー伸長試薬の非特異的な吸着が最小化されるようなもので ある。 Ｄ．シグナルの測定 第一または第二のプライマー伸長反応のいずれかの後に、検出工程が行われ、 ここで、プライマー伸長産物中に組み込まれたインタクトな標識の量が決定され る。利用される標識のタイプにとって適切な任意の検出方法が使用され得る。従 って、可能な検出方法には、放射能検出、光学吸収検出（例えば、ＵＶ可視吸収 検出）、光学発光検出（例えば、蛍光または化学発光）が含まれる。 測定工程は、実施される本発明の局面、ならびに第一および第二のプライマー 伸長試薬の組成に依存して、プロセスにおける種々の時点で起こり得る。第一の 局面において、好ましくは、測定工程は、標識された伸長可能なヌクレオチドを 含むプライマー伸長試薬が標的プライマーハイブリッドと反応し、そしてそれか ら分離した後に起こる。第二の局面において、測定工程は、標識されたヌクレオ チドターミネーターを含むプライマー伸長試薬が標的プライマーハイブリッドと 反応し、そしてそれから分離した後に起こる。 Ｅ．標識を検出不能にする 本発明の第一の局面に従って、一旦標識からのシグナルが、引き続く不連続プ ライマー伸長のサイクルを行う前に検出されると、その標識は、検出不能になる 。 １つの好ましい実施態様において、標識は、プライマー伸長産物に組み込まれ た標識された伸長可能なヌクレオチドから標識を切除することによって検出不能 にされる。ヌクレオチドからの標識の切断のために使用される方法は、標識とヌ クレオチドとを結合するために使用された切断可能な結合のタイプに依存する。 上記を参照のこと。例示的な切断試薬には、チオール、塩基、過ヨウ素酸塩、ヒ ドロキシルアミンなどが含まれる。１つの好ましい方法において、標識は、ウリ シルヌクレオチドの塩基部分に結合され、そして検出に続いて、標識は、標識さ れた伸長可能なヌクレオチドから、酵素ウリシルＮ-グリコシラーゼ（ＵＮＧ） での処置によって切除される。 第二の好ましい実施態様において、標識は、標識自体のシグナル生成特性を破 壊することによって検出不能にされる。使用された標識のタイプに依存して、標 識のシグナル生成特性を破壊するために使用され得るいくつかの方法が存在する 。例えば、標識が蛍光色素である場合、標識は、酸素が豊富な環境下で、強力な 光源を使用する色素の光脱色によって検出不能にされ得る。標識が酵素である場 合、標識は、酵素をシグナル生成反応を触媒不能にする不可逆的酵素インヒビタ ーと標識とを反応させることによって、検出不能にされ得る。標識が、単一光産 生変換のみを経験し得る化学蛍光剤である場合、標識は、自己破壊的（autodist ructing）であり、従って標識を検出不能にする別々の反応を必要としない（Bro nstein）。IV ．方法の実施のためのキット 本発明には、本発明の方法の種々の局面および実施態様を行うためのキットが 含まれる。第一の局面において、本発明のキットは、プライマー、第一のプライ マー伸長試薬、および第二のプライマー伸長試薬を含み、ここで少なくとも１つ の第一または第二のプライマー伸長試薬には、結合した標識を有する伸長可能な ヌクレオチドが含まれる。好ましくは、伸長可能なヌクレオチドに結合した標識 は、標識をプライマー伸長産物から切除するために、および/または標識のシグ ナル生成特性を破壊するために有効な処置工程の後に検出不能にされ得る。好ま しくは、プライマーは、固体支持体に結合されるか、または特定の結合対を介し て、または共有結合部分を介して固体支持体に結合され得る。別の好ましい実施 態様において、本発明のこの局面は、プライマーまたは標的核酸を介した標的プ ライマーハイブリッドの結合のための固相支持体を含む。任意的に、本発明のこ の第一の局面のキットは、プライマー停止試薬を含む。 第二の局面において、本発明のキットは、プライマー、第一の伸長試薬、第二 のプライマー伸長試薬、およびプライマー停止試薬を含み、ここでプライマー停 止試薬には、結合した標識を有するヌクレオチドターミネーターが含まれる。第 二のプライマー伸長試薬およびプライマー停止試薬は、別々にかまたは混合物と して一緒にかのいずれかでパッケージングされ得る。好ましくは、プライマーは 、固体支持体に結合されるているか、あるいは特定の結合対を介してか、または 共有結合部分を介して固体支持体に結合され得る。別の好ましい実施態様におい て、本発明のこの局面は、プライマーまたは標的核酸を介する標的プライマーハ イブリッドの結合のための固相支持体を含む。 本開示において言及されるすべての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊 行物または特許出願が、特別にそして個々に参考として援用されることが示され る場合と同程度に本明細書中に参考として援用される。 いくつかの実施態様のみが上記に詳細に記載されたが、分子生物学分野の当業 者は、好ましい実施態様において、その教示から逸脱することなく、多くの改変 が可能であることを明確に理解する。従って、すべてのこのような改変が以下の 請求の範囲に含まれることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブラスバンド，アンドリュー ジェイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94061, レッドウッド シティ，ルビー ストリー ト 1035 【要約の続き】 プライマー伸長試薬から分離する工程；第２のプライマ ー伸長試薬を使用しておよびプライマー停止試薬(プラ イマー停止試薬は、ヌクレオチドに結合された標識を有 するヌクレオチドターミネーターを含む)とともに第２ のプライマー伸長反応を行う工程；標的−プライマーハ イブリッドを未反応の第２のプライマー伸長試薬および 未反応のプライマー停止試薬から分離する工程；標識に よって生成されるシグナルを測定する工程；ならびにヌ クレオチドターミネーターの組み込みを示すシグナルが 検出されるまで、上記の工程を反復する工程を包含す る。本発明はさらに、上記の方法を実施するために有用 なキットを含む。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．標的核酸の反復領域における反復単位数を決定するための方法であって： （ａ）該標的核酸のプライマー相補性部分をプライマーにアニーリングさせる工 程であって、それによって標的−プライマーハイブリッドを形成する、工程； （ｂ）第１のプライマー伸長試薬を使用して第１のプライマー伸長反応を行う工 程； （ｃ）該標的−プライマーハイブリッドと未反応の該第１のプライマー伸長試薬 を分離する工程； （ｄ）第２のプライマー伸長試薬を使用して第２のプライマー伸長反応を行う工 程であって、ここで該第１または第２のプライマー伸長試薬の少なくとも１つが 、ヌクレオチドに結合された標識を有する伸長可能なヌクレオチドを含む、工程 ； （ｅ）該標的−プライマーハイブリッドを未反応の該第２のプライマー伸長試薬 から分離する工程； （ｆ）該標識によって生成されるシグナルを測定する工程； （ｇ）該標識を検出不能にさせるように、該標識を処理する工程；ならびに （ｈ）該シグナルが前回のサイクルにおいて検出されるシグナルより実質的に少 なくなるまで該工程（ａ）〜（ｇ）のサイクルを反復する工程、 を包含する、方法。 ２．前記工程（ｄ）が、前記標的−プライマーハイブリッドとプライマー停止試 薬とを反応させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。 ３．前記標的−プライマーハイブリッドが固体支持体に結合されている、請求項 １に記載の方法。 ４．前記プライマーが固体支持体に結合されている、請求項１に記載の方法。 ５．前記標的核酸が固体支持体に結合されている、請求項１に記載の方法。 ６．前記標識が、蛍光分子および化学発光分子からなる群より選択される、請求 項１に記載の方法。 ７．前記標識が、切断可能なリンカーを介して伸長可能なヌクレオチドに結合さ れている、請求項１に記載の方法。 ８．前記標的核酸が分析の前に増幅されている、請求項１に記載の方法。 ９．前記増幅がPCRを使用して達成される、請求項８に記載の方法。 １０．前記標識を検出不能にさせるように、該標識を処理する工程が、前記標識 された伸長可能なヌクレオチドから該標識を切断することを包含する、請求項１ に記載の方法。 １１．前記標識を検出不能にさせるように、該標識を処理する工程が、該標識の シグナル生成特性を破壊することを包含する、請求項１に記載の方法。 １２．標的核酸の反復領域における反復単位数を決定するための方法であって： （ａ）該標的核酸のプライマー相補性部分をプライマーにアニーリングさせる工 程であって、それによって標的−プライマーハイブリッドを形成する、工程； （ｂ）第１のプライマー伸長試薬を使用して第１のプライマー伸長反応を行う工 程； （ｃ）該標的−プライマーハイブリッドを未反応の該第１のプライマー伸長試薬 から分離する工程； （ｄ）第２のプライマー伸長試薬を使用しておよびプライマー停止試薬とともに 、第２のプライマー伸長反応を行う工程であって、該プライマー停止試薬は、ヌ クレオチドに結合された標識を有するヌクレオチドターミネーターを含む、工程 ； （ｅ）該標的−プライマーハイブリッドを未反応の該第２のプライマー伸長試薬 および未反応の該プライマー停止試薬から分離する工程； （ｆ）該標識によって生成されるシグナルを測定する工程；ならびに （ｇ）該ヌクレオチドターミネーターの組み込みを示すシグナルが検出されるま で該工程（ａ）〜（ｆ）のサイクルを反復する工程、 を包含する、方法。 １３．前記標的−プライマーハイブリッドが固体支持体に結合されている、請求 項１２に記載の方法。 １４．前記プライマーが固体支持体に結合されている、請求項１２に記載の方法 。 １５．前記標的核酸が固体支持体に結合されている、請求項１２に記載の方法。 １６．前記標識が、蛍光分子および化学発光分子からなる群より選択される、請 求項１２に記載の方法。 １７．前記標的核酸が分析の前に増幅されている、請求項１２に記載の方法。 １８．前記増幅がPCRを使用して達成される、請求項１７に記載の方法。 １９．標的核酸の反復領域における反復単位数を決定するために有用なキットで あって： 該標的核酸のプライマー相補性部分に配列相補性を有するプライマー； 第１のプライマー伸長試薬；および 第２のプライマー伸長試薬、 を含み、ここで該第１または第２のプライマー伸長試薬の少なくとも１つは、ヌ クレオチドに結合した標識を有する伸長可能なヌクレオチドを含む、キット。 ２０．前記プライマーが固体支持体に結合されている、請求項１９に記載のキッ ト。 ２１．前記標識が、蛍光分子および化学発光分子からなる群より選択される、請 求項１９に記載のキット。 ２２．前記標識が、切断可能なリンカーを介して前記伸長可能なヌクレオチドに 結合されている、請求項１９に記載のキット。