ES2430221T3

ES2430221T3 - Perlas para el análisis de ácidos nucleicos de alto rendimiento

Info

Publication number: ES2430221T3
Application number: ES10001884T
Authority: ES
Inventors: Thomas Froehlich; Dieter Heindl; Angelika Roesler; Tobias Heckel
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2009-02-25
Filing date: 2010-02-24
Publication date: 2013-11-19
Anticipated expiration: 2030-02-24
Also published as: US9347092B2; JP5453132B2; CN101838696A; CN101838696B; EP2224015B1; CA2693539A1; US20100248991A1; EP2224015A1; JP2010193885A; CA2693539C

Abstract

Perla que comprende por lo menos dos cebadores de amplificación específicos de secuencia, en la que uncebador se encuentra unido a dicha perla con un conector cortable inducible mediante la reacción entre un grupoamino funcional de dicho cebador y una fracción carboxi-funcional de dicha perla, y en la que dicho cebadorcomprende además una etiqueta detectable.

Description

Perlas para el análisis de ácidos nucleicos de alto rendimiento

La presente invención se refiere al campo del análisis de ácidos nucleicos y en particular de la detección miniaturizada altamente en paralelo de secuencias de ácidos nucleicos y del análisis de las diferencias entre secuencias de ácidos nucleicos.

La invención se basa en la idea de proporcionar un soporte sólido al que se unen cebadores específicos de secuencia, siendo uno cortable y el otro siendo no cortable, con el fin de analizar secuencias específicas o de detectar la presencia de una SNP, una mutación o cualquier especie de ADN o ARN de interés.

Antecedentes de la técnica

Recientemente, se ha dado a conocer un sistema de secuenciación de rendimiento ultraelevado que se basa en la secuenciación de pirofosfatos, que permite la secuenciación de un genoma bacteriano en esencialmente no más de una semana (documentos WO nº 04/70007 y nº 05/03375; Margulies M. et al., Nature 437:376-80, 2005). Partiendo de ADN genómico fragmentado, se unen fragmentos de una sola molécula a perlas que se capturan en una emulsión en aceite de mezcla de reacción de PCR. La amplificación resulta en una biblioteca de ADN amplificado clonalmente en la que cada perla porta múltiples copias del mismo fragmento.

Tras romper la emulsión y desnaturalizar los productos de PCR en cadenas sencillas, las perlas se depositan en los múltiples pocillos de una placa de picotitulación de fibra óptica, de manera que cada pocillo contenga no más de una sola perla. A continuación, en una reacción de secuenciación mediante síntesis, se lleva a cabo una reacción de extensión de cebador en la que los 4 nucleósidos trifosfato diferentes, A, G, C y T, o los análogos respectivos de los mismos, se suministran en una serie repetitiva de sucesos y la secuencia de la cadena naciente se infiere a partir de productos químicos derivados de la reacción de extensión catalizada por la ADN polimerasa. En particular, la reacción de secuenciación mediante síntesis es una reacción de secuenciación de pirofosfato, caracterizada porque la generación de pirofosfato se detecta de la manera siguiente:

PPi + adenosín-5’-fosfosulfato (APS)ATP, catalizada en presencia de apirasa, ATP + luciferina luz + oxiluciferina, catalizada en presencia de luciferasa. Detección de la luminiscencia de la oxiluciferina.

Con el sistema de secuenciación de rendimiento ultraelevado dado a conocer en los documentos WO nº 04/70007 y nº 05/03375, pueden llevarse a cabo simultáneamente más de 1.000.000 reacciones de secuenciación de pirofosfato. La generación de pirofosfato desencadena una cascada de reacción luminiscentes y finalmente se detecta la luz con una cámara CCD.

Con respecto a esta tecnología, el documento WO nº 04/69849 da a conocer un método para amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos (por ejemplo cada secuencia de una biblioteca de ADN, transcriptoma o genoma) de una manera rápida y económico en un solo tubo de reacción. Más particularmente, el documento WO nº 04/69849 da a conocer una amplificación clonal simultánea (por ejemplo mediante PCR) de una pluralidad de muestras (hasta varios cientos de miles) en un recipiente de reacción. En el presente contexto, el documento WO nº 04/69849 proporciona unos medios para encapsular una pluralidad de muestras de ADN individualmente en una microcápsula de una emulsión (es decir, un microrreactor), llevando a cabo la amplificación de la pluralidad de muestras encapsuladas de ácidos nucleicos simultáneamente, y liberando dicha pluralidad amplificación de ADN de las microcápsulas para reacciones posteriores. Por ejemplo, se hibridan copias individuales de la especie de ácido nucleico molde en perlas de captura que comprenden, por ejemplo, oligonucleótidos de captura o grupos químicos que se unen al ácido nucleico molde. Las perlas se suspenden en solución de amplificación completa y se emulsionan produciendo microrreactores (típicamente de 100 a 200 micrómetros de diámetro). A continuación, se utiliza la amplificación (por ejemplo la PCR) para incrementar clonalmente el número de copia de la especie de molde inicial en los microrreactores, y estas copias se unen a las perlas de captura en los microrreactores. Alternativamente, se añaden perlas de captura a una mezcla de reacción de amplificación que comprende ácido nucleico molde y esta mezcla se emulsiona para producir microrreactores. La amplificación (por ejemplo la PCR) se utiliza para incrementar clonalmente el número de copia de la especie de molde inicial en los microrreactores, y estas copias se unen a las perlas de captura en los microrreactores. De esta manera, los microrreactores según el documento WO nº 05/03375 permiten la amplificación clonal y discreta simultánea de muchos moldes diferentes sin contaminación cruzada de los productos amplificados o reactivos, o el dominio de un molde o conjunto de moldes particular (por ejemplo el sesgo de PCR).

Sin embargo, según el documento WO nº 05/03375 resulta necesario llevar a cabo una etapa de ligación de adaptador en la que una secuencia adaptadora a una pluralidad de moléculas de ácidos nucleicos diferentes que posteriormente puede unirse a una perla con una secuencia adaptadora complementaria unida covalentemente.

Otra técnica importante de análisis del ADN es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) analítica. Sin embargo, la cuantificación mediante PCR hasta el momento se basa en modos de medición análogos. Sin embargo, en algunos casos resultaría altamente deseable un principio de recuento digital, por ejemplo en áreas tales como - la detección del cáncer: la cuantificación de alelos mutantes en un fondo de exceso de tipo salvaje, - la detección de desequilibrios alélicos, - la expresión génica de transcritos raros y/o alelos mutantes en transcritos, - la detección y cuantificación víricas.

De esta manera, la disponibilidad de un recuento digital de ADN/ADNc/ARNm cumple necesidades no satisfechas de la medicina molecular, por ejemplo altamente relevantes para el diagnóstico del cáncer, de células tumorales circulantes, de células embrionarias prenatales en las que debe detectarse un suceso específico dentro de un fondo elevado.

Por lo tanto, era un objetivo de la presente invención proporcionar un método mejorado y reactivos mejorados para el análisis simultáneo de múltiples moléculas de ácidos nucleicos.

En un aspecto particular era un objetivo de la presente invención proporcionar un soporte sólido o una pluralidad de soportes sólidos que pueden utilizarse para mejorar el flujo de trabajo de secuenciación indicado anteriormente o permitir el recuento digital de PCR.

Son bien conocidos de la técnica diversos soportes sólidos que comprenden ácidos nucleicos inmovilizados, tales como perlas que comprenden oligonucleótidos inmovilizados. El diseño y configuración exactos de estas perlas dependen de la aplicación para la que se utilizan: G. Steinberg-Tatman et al. (Bioconjugate Chemistry 17:841-848, 2006) describen un método para sintetizar perlas con dos oligonucleótidos diferentes unidos a la superficie mediante un conector no cortable. Un oligonucleótido se utiliza como sonda de captura específica de secuencia y la otra como secuencia decodificadora.

La patente US nº 5639603 describe perlas con una o más etiquetas oligonucleótidas decodificadoras inmovilizadas.

Xu X. et al., Journal of the American Chemical Society 128:9286-9287, 2006, describen partículas de oro con dos oligonucleótidos diferentes unidos a la superficie para la construcción de nanoestructuras multipartícula ordenadas.

El documento WO nº 2001/062982 y la patente US nº 5.641.658 describen PCR sobre superficies de perlas con dos cebadores inmovilizados. El método de PCR se denomina amplificación de puentes.

El documento WO nº 2001/012862 describe un método para generar una agrupación de oligonucleótidos mediante el corte de diferentes oligonucleótidos que se encuentran unidos a un sustrato mediante diferentes conectores cortables.

El documento WO nº 2007/111937 describe una matriz para parejas de cebadores en la que por lo menos un cebador se une mediante un enlace cortable para el enriquecimiento de ADN genómico utilizado en la secuenciación. Se dan a conocer ejemplos adicionales de enlace cortable en los documentos WO nº 07/081387 y nº 07/136736.

El documento KR nº 2007/044677 describe perlas con un primer y un segundo cebadores de PCR inmovilizados para la utilización en PCR en emulsión. El primer cebador es no cortable. La liberación del segundo cebador se consigue modificando el valor del pH. Sin embargo, la modificación del valor del pH presenta la desventaja de potenciales reacciones secundarias no deseadas y además dificulta el procesamiento adicional de la muestra.

Breve descripción de la invención

De esta manera, la presente invención se refiere a una perla que comprende por lo menos dos cebadores de amplificación específicos de secuencia en los que por lo menos un cebador se une a dicho soporte con un conector cortable inducible. La expresión cortable inducible en el contexto de la presente invención se refiere a que puede inducirse el corte proporcionando un estímulo externo, resultando en una reacción de corte inmediata y esencialmente completa. Preferentemente, dicho conector cortable es un conector fotocortable.

En una primera realización mayor, dicha perla según la presente invención está compuesta de un material seleccionado de entre el grupo que consiste de silicio, dióxido de titanio, óxido de aluminio, óxido de lantánido, vidrio, silicatos, poliestireno, celulosa, sefarosa y poliamida. Una perla es un material puro o está compuesto de dos

o más materiales, mientras que se mezclan o ensamblan dos o más materiales de una manera ordenada en forma de partículas de núcleo-cáscara. La superficie de la perla se funcionaliza de manera que puedan unirse oligonucleótidos.

En una segunda realización mayor, la presente invención se refiere a una biblioteca de perlas tal como se ha dado a conocer anteriormente.

Preferentemente, cada elemento de la pluralidad de cebadores que se unen a la perla mediante un conector cortable porta un marcaje detectable diferente o una mezcla única de múltiples marcajes.

Además, la presente invención se refiere a métodos para preparar cualquiera de las perlas dadas a conocer anteriormente.

En particular, la presente invención se refiere a un método para preparar una perla, que comprende por lo menos dos cebadores específicos de secuencia, caracterizado además porque uno de dichos cebadores es cortable, comprendiendo dicho método las etapas de:

-: proporcionar una perla que porta por lo menos uno o más grupos funcionales, y - hacer reaccionar dicho grupo o grupos funcionales con el grupo o grupos reactivos de dos cebadores específicos de secuencia, en los que se encuentra presente una fracción reactiva cortable en uno de los espaciadores que conectan dicha perla con su grupo funcional o uno de sus grupos funcionales o dicha fracción cortable se encuentra presente en uno de los espaciadores que conecta uno de dichos cebadores específicos de secuencia con su grupo reactivo.

En una primera realización, el método según la presente invención comprende las etapas de:

-: proporcionar una perla que comprende dos grupos funcionales, portando cada uno, un grupo protector diferente,

-: desproteger un primer grupo funcional y hacer reaccionar dicho grupo con el grupo reactivo de un primer cebador, y

-: desproteger el segundo grupo funcional y hacer reaccionar dicho grupo de dicha perla con el grupo reactivo de un segundo cebador.

Dichos dos grupos funcionales se conectan con la perla mediante dos conectores separados, aunque en una realización particular, dichos dos grupos funcionales se conectan con la perla mediante un conector de dos brazos.

En una segunda realización, el método según la presente invención comprende las etapas de:

-: proporcionar una perla que porta exactamente un grupo funcional,

-: desproteger dicho grupo funcional, y

-: hacer reaccionar dicho grupo con una mezcla de un primer y un segundo cebadores específicos de secuencia, comprendiendo dicho primer y segundo cebadores, grupos reactivos idénticos, caracterizado porque uno de dichos cebadores se conecta con su grupo reactivo mediante una fracción cortable.

En una tercera realización, el método según la presente invención comprende las etapas de:

-: proporcionar una perla que porta exactamente un grupo funcional, y

-: desproteger dicho grupo funcional y hacer reaccionar dicho grupo con un oligonucleótido que representa un primer y un segundo cebadores de amplificación que se encuentran conectados mediante una fracción cortable.

En una cuarta realización, el método según la presente invención comprende las etapas de:

-: proporcionar una perla que porta grupos OH protegidos, los cuales se encuentran protegidos con dos grupos protectores ortogonales diferentes,

-: escindir uno de dichos grupos protectores ortogonales y sintetizar el primer cebador sobre la perla,

-: escindir el segundo de dichos grupos protectores ortogonales y sintetizar el segundo cebador sobre la perla.

Tal como es conocido por el experto en la materia, los grupos protectores ortogonales pueden eliminarse selectivamente según las condiciones aplicadas.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 La figura 1 ilustra el principio de ensayo basado en cebadores que son específicos para el ácido nucleico diana y se encuentran inmovilizados sobre un portador sólido codificado (por ejemplo perlas). El cebador estacionario 1 se utiliza para la captura de dianas, mientras que el cebador 2 se escinde fotolíticamente del portador para inducir la amplificación de PCR clonal de la diana capturada en emulsión.

Fig. 2 La figura 2 ilustra la reacción de conjugación de éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), mientras que Rx=1 representa un cebador fotocortable y Rx=2, un cebador estacionario. Fig. 3A-B La medición de absorbancia en la figura 3A demuestra la solubilización de una sonda oligonucleótida modificada con fluoresceína (ID de secuencia nº 1) al escindirla fotolíticamente de perlas de sefarosa.

La medición de citometría de flujo en la figura 3B muestra el corte fotolítico, indicado por la reducción de la intensidad de fluorescencia al someter a una reacción de fotólisis en suspensión o en emulsión a perlas de sefarosa conjugadas con sondas oligonucleótidas modificadas con fluoresceína (ID de secuencia nº 1).

Fig. 4 La figura 4 ilustra el ensayo de endonucleasa de restricción que detecta productos de PCR convencional y productos de PCR inmovilizados en perlas que portan cebador estacionario y cebador fotocortable (ID de secuencia nº 2 y nº 3).

Fig. 5 La figura 5 muestra la detección e identificación mediante electroforesis en gel de ADN de doble cadena obtenido tras PCR convencional o tras PCR utilizando cebadores inmovilizados en perlas (ID de secuencia nº 2 y nº 3) en suspensión.

Fig. 6 La figura 6 muestra la detección e identificación mediante electroforesis en gel de ADN de doble cadena obtenido tras PCR convencional o tras PCR utilizando cebadores inmovilizados en perlas (ID de secuencia nº 2 y nº 3) en emulsión.

Fig. 7 La figura 7 demuestra mediante tratamiento de endonucleasa de restricción y electroforesis en gel que pueden obtenerse productos de PCR específicos mediante PCR en emulsión y cebadores inmovilizados en perlas (ID de secuencia nº 4 y nº 5) utilizando ADNc de HeLa o un amplicón a modo de molde.

Fig. 8 La figura 8 ilustra el ensayo de endonucleasa de restricción que detecta productos de PCR inmovilizados en un conjunto de perlas diferentes que portan cebador estacionario y cebador fotocortable (ID de secuencia nº 4 a nº 9) tras PCR multiplexada.

Fig. 9A-B Los electroferogramas en las figuras 9A y B muestran la detección e identificación de ADN de doble cadena obtenido tras PCR multiplexada utilizando un conjunto de diferentes cebadores inmovilizados en perlas (ID de secuencia nº 4 a nº 9) en suspensión y en emulsión.

Descripción detallada de la invención

De esta manera, la presente invención se refiere a una perla que comprende por lo menos dos cebadores de amplificación específicos de secuencia en los que por lo menos un cebador se une a dicha perla con un conector cortable inducible.

Una perla según la presente invención resulta especialmente útil para un método de análisis de un ácido nucleico mediante la puesta en contacto de dicho ácido nucleico con múltiples perlas, que comprende una pareja de cebadores de captura y la posterior amplificación. En general, un método según la presente invención comprende las tres etapas siguientes:

-: selección de una secuencia o una agrupación mixta de secuencias de interés sometiendo el ADN diana a perlas que portan cada molécula de captura específica de una secuencia individual.

-: captura de estadísticamente 1 molécula diana por cada perla,

-: amplificación por PCR, siendo el número de perlas que porta material específico de gen amplificado proporcional al número de moléculas diana específicas de secuencia.

En consecuencia, la presente invención proporciona una posibilidad para el análisis miniaturizado y altamente paralelo de ácidos nucleicos e incluye aplicaciones tales como la detección cualitativa y/o cuantitativa de genes de interés, el análisis de la expresión génica y la detección de mutaciones, aunque no se encuentra limitada a ellos.

En el contexto de la presente invención, resultan aplicables las definiciones siguientes:

"múltiples moléculas de ácidos nucleicos" se entiende como una población de moléculas caracterizada porque se encuentran representadas por lo menos dos secuencias diferentes de ácidos nucleicos. En la mayoría de casos se encuentra representada una pluralidad de muchas secuencias diferentes.

La expresión "pluralidad de perlas" se entiende como un número superior a 1.000, preferentemente superior a

10.000 y más preferentemente superior a 100.000 perlas.

La expresión "pareja de cebadores de amplificación específicos de secuencia" se entiende como dos moléculas oligonucleótidas que conjuntamente pueden actuar como pareja de cebadores de amplificación de manera que durante una reacción de amplificación de ácidos nucleicos se genera un producto de amplificación con una longitud definida.

La expresión "conector cortable" se refiere a una entidad química que comprende un enlace químico que con un tratamiento específico puede resolverse de manera que las partes restantes de la molécula permanezcan intactas. Preferentemente, el conector cortable es un "conector cortable inducible", que se define como un conector cortable que puede resolverse proporcionando un estímulo externo. Un ejemplo típico de un conector cortable inducible es un conector fotocortable, en el que el enlace se resuelve mediante el tratamiento con luz de una longitud de onda definida.

El término "captura" se entiende como (i) hibridar una población de moléculas de ácidos nucleicos con una secuencia específica de ácidos nucleicos que se encuentra inmovilizada sobre un soporte sólido, tal como una perla y que es por lo menos parcialmente complementaria a una secuencia de interés que puede encontrarse representada en dicha población de moléculas de ácidos nucleicos, e (ii) la eliminación de moléculas de ácidos nucleicos no hibridadas de los complejos de hibridación formados.

La expresión "aislamiento clonal" se refiere a la separación de una pluralidad de perlas de manera que cada perla individual se encuentre en una localización diferente. Preferentemente dicha localización es un micropocillo o un pocillo de matriz "picowell".

La expresión "amplificación clonal" se refiere a la amplificación de una población de moléculas de ácidos nucleicos de manera que los productos de amplificación originados a partir de diferentes moléculas diana originales se encuentran físicamente separados entre sí. Por ejemplo, todos los productos de amplificación originados a partir de la misma molécula diana original de ácidos nucleicos pueden inmovilizarse sobre una perla incluida en una micela.

El término "emulsión" en el contexto de la presente invención se refiere a una emulsión de agua en aceite, caracterizada porque se encapsulan pequeñas gotas hidrofílicas que comprenden una única perla en una micela circundada por un líquido lipofílico.

La expresión "secuenciación mediante síntesis" se refiere a determinar si durante una reacción de extensión de cebador, se ha incorporado un nucleósido trifosfato específico que por sí mismo puede alargarse durante la etapa posterior de reacción de extensión de cebador.

La expresión "someter a un gradiente térmico" se refiere al calentamiento o enfriamiento de una muestra de interés partiendo de una primera temperatura definida y finalizando en una segunda temperatura definida. El gradiente puede ser un gradiente continuo que preferentemente es lineal o, alternativamente, a un gradiente escalonado. En el caso de que se sometan a dicho gradiente productos de PCR o híbridos de sondas de ácidos nucleicos y moléculas diana, puede llevarse a cabo un análisis de curvas de fusión o un seguimiento de la dependencia de la temperatura de la hibridación.

La expresión "PCR en tiempo real" se refiere a una reacción en cadena de polimerasa caracterizada porque se realiza un seguimiento del progreso de la reacción de amplificación por lo menos una vez en cada ciclo de amplificación. Preferentemente, se realiza un seguimiento de la amplificación con un pigmento fluorescente intercalante o, alternativamente, con una sonda de hibridación de ácidos nucleicos específica de amplicón, tal como, por ejemplo, la sonda 5'-nucleasa TaqMan, una sonda de baliza molecular o una pareja de sondas de hibridación FRET.

El término "desactivación" se refiere a la reducción de la emisión de fluorescencia de un compuesto fluorescente que es causada por una segunda entidad química que es encuentra en estrecha proximidad espacial a dicho compuesto fluorescente.

La expresión "análisis mutacional cuantitativo" se entiende como un método que comprende las etapas de: (i) cribar una pluralidad de moléculas de ácidos nucleicos con secuencias esencialmente idénticas para variaciones de la secuencia, e (ii) determinar la tasa o las tasas a las que se encuentra presente por lo menos una o varias de dichas variaciones de secuencia en dicha pluralidad de moléculas de ácidos nucleicos. Por ejemplo, dichas variaciones de secuencia pueden ser un polimorfismo de un solo nucleótido.

Preparación de una perla según la presente invención

La presente invención requiere la unión covalente reversible de un primer cebador de amplificación específico de secuencia a un soporte sólido mediante una molécula de conector flexible y cortable de manera que el cebador pueda hibridarse con una molécula diana y liberarse a la solución para la amplificación y detección de la diana, mientras que un segundo cebador de amplificación específico de secuencia permanece unido covalentemente a la superficie bajo condiciones de corte. La molécula de conector cortable puede cortarse con ácido, base, luz o cualquier otro medio bien conocido por el experto en la materia. Preferentemente se une exactamente un cebador a la perla mediante un conector cortable.

En el caso de que el soporte sólido sea una perla o una pluralidad de perlas, las perlas presentan un tamaño medio de entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 250 mm. Preferentemente, las perlas presentan un diámetro medio de entre aproximadamente 20 mm y aproximadamente 100 m. Resulta altamente prefernete que las perlas presenten un diámetro medio de entre aproximadamente 30 mm y 80 mm. Por ejemplo, las perlas pueden presentar un diámetro medio de aproximadamente 40 mm.

El material de las perlas a las que se unirán los dos cebadores debe ser estable frente a la oxidación y a la hidrólisis, y puede ser inorgánico, por ejemplo silicio o dióxido de titanio u óxido de aluminio o vidrio, u orgánico, por ejemplo poliestireno, celulosa, poliamida y otros. Una perla es un material puro o está compuesto de dos o más materiales, mientras que se mezclan o ensamblan dos o más materiales de una manera ordenada en forma de partículas de núcleo-cáscara.

La superficie de las perlas puede ser porosa o lisa. La superficie de la perla se funcionaliza de manera que puedan unirse oligonucleótidos. Por lo tanto, la superficie de las perlas presenta una superficie funcionalizada que comprende un grupo amino funcional.

La fracción funcional correspondiente del cebador es un grupo carboxi.

El grupo funcional se introduce sobre la superficie, por ejemplo mediante silanización de vidrio-silicato óxidos de lantánido con un silano modificado o la perla por sí misma contiene a priori grupos funcionales que se crean durante la producción de la perla, por ejemplo mediante copolimerización de poliestireno y un alqueno apropiado que contiene el grupo funcional. Los grupos funcionales presentes a priori pudieron transformarse en otros grupos funcionales mediante la utilización de conectores heterobifuncionales. Dicho conector podía ser cortable o no cortable. Mediante este procedimiento pueden crearse perlas con diferentes funcionalidades ortogonales.

El término ortogonal se refiere a que un primer grupo funcional reacciona con un primer oligonucleótido modificado en presencia de un segundo grupo funcional que reacciona simultáneamente con el segundo oligonucleótido modificado. Una pareja de dichos grupos funcionales es succinilamidocarboxi y alquino, lo que requiere un oligonucleótido modificado con amino y con azido.

La unión secuencial de dos oligonucleótidos diferentes al mismo tipo de grupo funcional superficial se consigue mediante la utilización de grupos protectores ortogonales (G. Steinberg-Tatman et al. , Bioconjugate Chemistry 17:841-848, 2006).

En el caso de que la perla sea una perla de oro o la perla se recubra con una película metálica, por ejemplo con con tiol-oro, se hacen reaccionar oligonucleótidos modificados directamente con la superficie.

Los métodos generales para la unión covalente de un cebador a un soporte sólido son bien conocidos en el campo. Por ejemplo, los oligonucleótidos cebadores en primer lugar se sintetizan mediante una reacción estándar de fosforamidita. Dicho cebador sintetizado puede modificarse adicionalmente con una molécula de conector cortable durante o después de la síntesis del oligonucleótido. La unión de un cebador cortable y de un cebador no cortable puede conseguirse mediante cualesquiera medios de reacción de unión conocidos para pocillos múltiples que se describen en la literatura de tecnologías de micromatrices o mediante cualquier otro método conocido. Se dan a conocer y revisan ejemplos en:

-: Wittebolle, L. et al., Journal of Chemical Technology and Biotechnology 81:476-480, 2006.

-: Steinberg, G. et al., Biopolymers 73:597-605, 2004.

-: Di Giusto, D.A. et al., Topics in Current Chemistry 261:131-168, 2005.

-: Zatsepin, T.S. et al., Bioconjugate Chemistry 16:471-489, 2005.

El soporte sólido y preferentemente la perla, que según la presente invención comprende por lo menos dos cebadores específicos de secuencia, en la que uno de dichos cebadores es cortable, se prepara de una nueva manera imprevista de combinar diferentes etapas de reacción en fase sólida y síntesis de oligonucleótidos, las cuales, como etapas individuales per se, ya son conocidas de la técnica. De esta manera, el soporte sólido según la presente invención se prepara mediante un método que comprende las etapas de:

-: proporcionar un soporte sólido que porta por lo menos uno o más grupos funcionales, y

-: hacer reaccionar dicho grupo o grupos funcionales con el grupo o grupos reactivos de dos cebadores específicos

de secuencia, en los que una fracción reactiva cortable se encuentra presente en uno de los espaciadores que conecta dicho soporte sólido con su grupo funcional o se encuentra presente uno de sus grupos funcionales o dicha fracción cortable dentro de uno de los espaciadores que conecta uno de dichos cebadores específicos de secuencia con su grupo reactivo.

Existen por lo menos seis alternativas para producir dicho soporte sólido:

(i) en una primera realización, el método según la presente invención comprende las etapas de:

-: proporcionar un soporte sólido que comprende dos grupos funcionales independientes, portando cada uno, un grupo protector diferente,

-: desproteger un primer grupo funcional y hacer reaccionar dicho grupo con el grupo reactivo de un primer cebador, estando caracterizado dicho cebador porque porta una fracción cortable entre su grupo reactivo y la secuencia de nucleótidos misma, y

(ii) En una segunda realización, el método según la presente invención comprende las etapas de:

-: proporcionar un soporte sólido que comprende dos grupos funcionales independientes, portando cada uno, un grupo protector diferente, en el que uno de dichos grupos funcionales se conecta con el soporte sólido mediante una fracción cortable,

(iii) En una tercera realización, el método según la presente invención comprende las etapas de:

-: proporcionar un soporte sólido que comprende dos grupos funcionales, portando cada uno, un grupo protector diferente, estando conectados dichos grupos funcionales al soporte sólido mediante un conector ramificado,

-: desproteger un primer grupo funcional y hacer reaccionar dicho grupo con el grupo reactivo de un primer cebador, estando caracterizado dicho primer cebador porque porta una fracción cortable entre su grupo reactivo y la secuencia de nucleótidos misma, y

(iv) En una cuarta realización, el método según la presente invención comprende las etapas de:

-: proporcionar un soporte sólido que comprende dos grupos funcionales, portando cada uno, un grupo protector diferente, estando conectados dichos grupos funcionales al soporte sólido mediante un conector ramificado, en el que uno de dichos grupos funcionales se encuentra conectado con el soporte sólido mediante una fracción cortable,

(v) En una quinta realización, el método según la presente invención comprende las etapas de:

-: proporcionar un soporte sólido que porta exactamente un grupo funcional,

-: desproteger dicho grupo funcional, y

-: hacer reaccionar dicho grupo con una mezcla de un primer y un segundo cebadores específicos de secuencia, comprendiendo dicho primer y segundo cebadores, grupos reactivos idénticos, caracterizado porque por lo menos uno de dichos cebadores se conecta con su grupo reactivo mediante una fracción cortable.

(vi) En una sexta realización, el método según la presente invención comprende las etapas de:

-: proporcionar una perla que porta exactamente un grupo funcional, y

Pueden utilizarse diferentes tipos de conectores para preparar perlas según la invención: conectores modificados con amino, conectores modificados con biotina, los cuales pueden utilizarse para unir grupos aminos o biotina a un extremo de un oligonucleótido, y conectores fotocortables internos, los cuales pueden utilizarse en combinación con cualquier otro modificador.

Los conectores cortables son bien conocidos de la técnica y pueden discriminarse en dos clases. La primera clase requiere una especie reactiva, por ejemplo una especie reductora u OH- o H+, con el fin de llevar a cabo el corte. Son ejemplos de puentes disulfuro que podrían cortarse mediante reducción con tioles o "conectores" lábiles frente a bases, tales como un monómero de ARN incorporado en el extremo de un oligonucleótido. La segunda clase se corta por medios físicos, por ejemplo mediante irradiación, tal como iluminación o calentamiento.

Los conectores fotocortables son conectores en los que un enlace covalente se rompe mediante la irradiación con luz. La longitud de onda de irradiación debe seleccionarse de manera que las nucleobases de los oligonucleótidos unidos no absorban, con el fin de evitar reacciones secundarias tales como la dimerización o fotooxidación de T-T. En el caso de que los pigmentos orgánicos se unan a la perla, por ejemplo dentro de una sonda de detección, la longitud de onda de irradiación no se corresponde con la absorción de dichos pigmentos.

Los conectores fotocortables típicamente adecuados se derivan, por ejemplo, de alcoholes ortonitrobencílicos y son bien conocidos en la literatura. El corte fotolítico se consigue mediante irradiación con luz UV de longitud de onda >340 nm.

Los conectores fotocortables que pueden introducirse durante la síntesis de oligonucleótidos se describen ejemplarmente en las referencias siguientes:

-: WO 92/002528,

-: WO 07/082713

-: US 5,258,506

-: Olejnik J. et al., Nucleic Acids Research 26:3572-3576, 1998.

-: Hausch F. y Jaeschke, A., Nucleic Acids Research 28:28, e35, 2000.

-: Hausch F. y Jaeschke, A., Tetrahedron 57:1261-1268, 2001.

-: Wenzel T. et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 22:1579-1581, 2003.

-: Dell’Aquila C. et al., Tetrahedron Letters 38:5289-5292, 1997.

-: Ordoukhanian P. y Taylor J.-S., Journal of the American Chemical Society 117:9570-9571, 1995.

-: Saran D. et al., Bioconjugate Chemistry 18:275-279, 2007.

-: Piggott A.M. y Karuso P., Tetrahedron Letters 46:8241-8244, 2005.

Un modo particular de corte fotolítico indirecto puede llevarse a cabo mediante fotogeneración de especies reactivas como H+ u OH-, en el que la formación de dichas especies reactivas resulta en el corte de un enlace covalente lábil frente a una base o ácido. Los documentos WO nº 2006/117556 y nº 99/41007 describen métodos para la fotogeneración de ácidos y bases. Los conectores lábiles frente a bases o ácidos son bien conocidos de la técnica (por ejemplo Chitkul B., Tetrahedron Letters 42:6211-6214, 2001).

Un conector térmicamente cortable se describe en Keller K.A., Tetrahedron Letters 46:1181-1184, 2005.

Los oligonucleótidos inmovilizados en cualquier caso se unen a la superficie de manera que la captura inicial de diana resulta facilitada y de que el PCR todavía resulta eficiente, incluso con un cebador inmovilizado. Lo anterior se consigue dejando suficiente espacio entre la superficie de la perla y la secuencia del cebador. Por lo tanto, se unen a los oligonucleótidos conectores largos tales como conectores PEG o múltiples conectores cortos. Un segundo parámetro que influye sobre la captura es la densidad de carga superficial en la perla, que podría controlarse mediante un procedimiento apropiado de producción de perlas o mediante dilución de los oligonucleótidos, que debe inmovilizarse con compuestos no nucleotídicos que presentan el mismo grupo funcional que el oligonucleótido que debe inmovilizarse.

Utilización de un soporte sólido según la presente invención

Tal como se ha indicado anteriormente, el soporte sólido según la presente invención es una perla o una pluralidad de perlas. Las perlas según la presente invención puede utilizarse en un método de análisis de múltiples moléculas de ácidos nucleicos de interés, que comprende las etapas siguientes:

a) proporcionar una pluralidad de perlas, caracterizada porque cada perla comprende por lo menos una pareja de

cebadores de amplificación específicos de secuencia, caracterizada adicionalmente porque por lo menos uno de

dichos cebadores se une a la perla mediante un conector cortable,

b) capturar las moléculas de ácidos nucleicos de interés en una muestra,

c) aislar clonalmente dicha pluralidad de perlas,

d) cortar dicha cebador o cebadores,

e) amplificar clonalmente dicho ácido nucleico, creando de esta manera múltiples productos de amplificación,

f) analizar dichos productos de amplificación.

En la fig. 1 se muestra una vista general ejemplar: una muestra se somete a una población de perlas que comprenden una pareja de cebadores de amplificación, uno de los cuales es fotocortable (etapas a, b). La amplificación clonal se lleva a cabo mediante la realización de una PCR en emulsión (etapas c, d y e). Posteriormente se analizan los productos de amplificación (etapa f).

En detalle, las etapas generales se llevaron a cabo de la manera siguiente:

a) Proporcionar una pluralidad de perlas

La preparación de dichas perlas se ha dado a conocer en detalle anteriormente.

b) Captura de las moléculas de ácidos nucleicos de interés en una muestra

A continuación, las moléculas diana se hibridan con las perlas que contienen el cebador cortable y el cebador no cortable. Las condiciones de hibridación adecuadas con respecto al sistema de tampones apropiado y las temperaturas de hibridación apropiadas son bien conocidas de la técnica y pueden optimizarse según las condiciones específicas, tales como las longitudes y secuencias de los cebadores de amplificación utilizados específicamente. Preferentemente la hibridación se lleva a cabo utilizando un exceso molar de perlas en comparación con la secuencia o secuencias, las cuales pueden amplificarse con el fin de capturar el máximo número posible de ácidos nucleicos diana. En particular, se ha demostrado que un exceso molar de 1:5 a 1:100, y preferentemente de 1: 10 a 1:50 resulta particularmente ventajoso. En el caso de que se detecten y/o analicen múltiples secuencias diana diferentes, debe utilizarse una biblioteca de perlas con las correspondientes múltiples parejas de cebadores diferentes.

c) Aislar clonalmente dicha pluralidad de perlas

El aislamiento clonal es un requisito para obtener datos cuantitativos de las variaciones de secuencia presentes en la pluralidad de moléculas de ácidos nucleicos que se analizan. En principio existen dos modos diferentes de aislamiento clonal.

En una primera realización, en primer lugar se añaden a las perlas reactivos de PCR, tales como la ADN polimerasa termoestable, los desoxinucleósidos trifosfato y un tampón apropiado. A continuación se genera una emulsión de agua-en-aceite, caracterizada porque cada perla se encapsula en una única micela que contiene una solución acuosa que permite llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos. Las condiciones apropiadas se dan a conocer en, por ejemplo, el documento WO nº 04/069849.

En una realización más preferente, se encuentran contenidas aproximadamente 3.000 perlas en 1 microlitro de una emulsión 1:2 de agua a aceite.

En una segunda realización alternativa, la etapa c) comprende la distribución de dicha pluralidad de perlas en las cavidades de una placa de microtitulación o de picotitulación. El tamaño de las cavidades corresponde al diámetro de las perlas, de manera que una cavidad sólo puede llenarse con una perla.

La distribución de las perlas en las cavidades puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante agitación constante, agitación suave o mediante centrifugación. Los reactivos de PCR, tales como la ADN polimerasa termoestable, los desoxinucleósidos trifosfato y un tampón apropiado, se añaden antes, o preferentemente después, de la distribución de las perlas en las cavidades de la placa de microtitulación o de picotitulación. Alternativamente, la adición de dichos reactivos de PCR puede llevarse a cabo después de la etapa d).

d) Cortar dicho cebador o cebadores

Las perlas que comprenden dicho cebador que se encuentra unido mediante un conector cortable seguidamente se exponen a condiciones de corte con el fin de cortar el conector que une el cebador cortable a la perla. En el caso de que el aislamiento clonal se haya llevado a cabo mediante la distribución de dicha pluralidad de perlas en cavidades de una placa de microtitulación o de picotitulación, la molécula de conector cortable puede ser cortable por ácido, base, luz o cualquier otro medio bien conocido por el experto en la materia. Preferentemente, el conector es un conector fotocortable debido a que se evita la adición de un reactivo adicional.

En el caso de que el aislamiento clonal se haya llevado a cabo mediante la generación de una emulsión de agua-enaceite, incluso se requiere la utilización de un método de corte basado en la fotoactivación. A este respecto existen varios métodos conocidos de la técnica.

e) Amplificar clonalmente dicho ácido nucleico, creando de esta manera múltiples productos de amplificación

A continuación, las mezclas de reacción se exponen a un protocolo de termociclado apropiado con el fin de llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos. El cebador de amplificación todavía inmovilizado (no cortable) se hibrida con la molécula de ácidos nucleicos diana, así como con los productos amplificados, manteniéndolos de esta manera en la superficie de la perla. El cebador de amplificación que se ha escindido de la perla es capaz de moverse libremente en solución, de manera que puede llevarse a cabo una reacción de amplificación efectiva.

Como consecuencia, la presente invención proporciona además un método para producir una pluralidad de perlas portadoras de ácido nucleico molde, en la que cada perla comprende hasta 1.000.000 copias o más de una sola secuencia de ácidos nucleicos. Bajo condiciones optimizadas, cada perla puede comprender más de 20 millones de copia de un solo ácido nucleico.

Con el fin de evitar la generación de productos de amplificación no específicos, resulta altamente ventajoso aplicar un protocolo de PCR denominado de inicio en caliente. Son conocidos de la técnica varios métodos. Por ejemplo, resulta posible utilizar una ADN polimerasa que se inactiva reversiblemente como resultado de una modificación química lábil al calor (patentes US nº 5.773.258 y nº 5.677.152). Un enfoque alternativo para conseguir una inhibición lábil al calor de la ADN polimerasa Taq es la adición de anticuerpos monoclonales inducidos contra el enzima purificado (Kellogg D.E. et al. , Biotechniques 16:1134-7, 1994). Alternativamente, pueden añadirse fragmentos cortos de ADN de doble cadena (Kainz P. et al. , Biotechniques 28:278-82, 2000) u oligonucleótidos aptámeros a la mezcla de reacción (patente US nº 5.693.502) (Lin Y. y Jayasena S.D., J. Mol. Biol. 271:100-11, 1997) con el fin de generar un efecto de inicio en caliente. Todavía alternativamente, la patente EP nº 0 799 888 da a conocer una adición de oligonucleótidos 3'-bloqueados a las reacciones de PCR. Debido al bloqueo 3', estos oligonucleótidos no pueden actuar como cebadores. Los oligonucleótidos bloqueados están diseñados para competir/interactuar con los cebadores de PCR, lo que resulta en una menor producción de productos no específicos. Otra alternativa es la utilización de cebadores oligonucleótidos fosforotioato en combinación con una exonucleasa III en las mezclas de reacción de PCR (patente EP nº 0 744 470). En este caso, una exonucleasa 3', que habitualmente acepta sustratos de ADN de doble cadena, así como de cadena sencilla, degrada los artefactos dúplex, tales como dímeros de cebadores, así como amplicones contaminantes de arrastre, dejando los cebadores de amplificación de cadena sencilla sin degradar. De manera similar, se ha propuesto la utilización de cebadores con extremos 3' modificados abásicos y la eliminación dependiente de molde por parte de la endonucleasa IV de E. coli (patente US nº 5.792.607). Una realización particular de la idea general se encuentra en la patente EP nº 1 275 735. La memoria de esta patente da a conocer una composición para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, que comprende: (i) una ADN polimerasa termoestable, (ii) una exonucleasa 3'-5' termoestable, e

(iii) por lo menos un cebador para la amplificación de ácidos nucleicos con un residuo 3'-terminal modificado que no resulta alargado por dicha ADN polimerasa termoestable, así como métodos para llevar a cabo una reacción de PCR utilizando dicha composición.

En particular, la amplificación clonal puede llevarse a cabo en forma de una PCR específica de alelo. En este método de detección, se utilizan cebadores de amplificación específicos de variante durante la amplificación, los cuales habitualmente presentan un residuo nucleótido terminal discriminante en el extremo 3'-terminal del cebador que sólo es complementario a una variante especial del ácido nucleico diana que debe detectarse. La patente US nº 5.595.890, por ejemplo, describe dichos métodos para la amplificación específica de alelo y su utilización para detectar mutaciones puntuales clínicamente relevantes, por ejemplo en el oncogén k-ras. La patente US nº

5.521.301 también describe métodos para la amplificación específica de alelo para el genotipado del sistema AB0 de grupos sanguíneos. En contraste, la patente US nº 5.639.611 da a conocer la utilización de amplificación específica de alelo en relación a la detección de la mutación puntual responsable de la anemia drepanocítica. Dichos métodos para detectar variantes de secuencia, polimorfismos y, principalmente, mutaciones puntuales, requieren una amplificación específica de alelo, en particular en el caso de que la variante de secuencia que debe detectarse se encuentre presente en una cantidad menor que una variante de la misma sección del ácido nucleico (o del mismo gen) que se encuentra presente en exceso. Esta situación se produce, por ejemplo, en el caso de que el objetivo sea detectar células tumorales diseminantes en líquidos corporales, tales como suero, suero o plasma, con ayuda de la amplificación específica de alelo (patente US nº 5.496.699). Con este fin, en primer lugar el ADN se aísla a partir de líquidos corporales tales como sangre, suero o plasma, que están compuestos de una cantidad relativamente reducida de ADN procedente de células tumorales diseminantes y un exceso de ADN de células no proliferantes. Por lo tanto, las mutaciones en el gen k-Ras que son significativas para el ADN tumoral deben detectarse basándose en unas cuantas copias de ADN tumoral en presencia de un exceso de ADN de tipo salvaje.

f) Análisis de dichos productos de amplificación

En el caso de que el aislamiento clonal de la etapa c) se haya llevado a cabo mediante la generación de una emulsión de agua-en-aceite, resulta necesario que en una primera etapa, la pluralidad de perlas que portan los productos de amplificación se distribuyan en cavidades de una placa de microtitulación o de picotitulación. Posteriormente existen dos realizaciones alternativas para el análisis de los productos de amplificación generados.

(i) Secuenciación

En una primera realización, el ADN unido a cada perla puede someterse a una reacción de secuenciación. Preferentemente, dicha reacción de secuenciación es una secuenciación mediante una reacción de síntesis, caracterizada porque se realiza un seguimiento de la incorporación de desoxinucleósidos específicos en la cadena naciente de ADN de una reacción de extensión de cebador. Más preferentemente, dicha secuenciación mediante una reacción de síntesis es una reacción de secuenciación de pirofosfato, en la que se lleva a cabo el seguimiento de dicha incorporación mediante la detección de la generación de pirofosfato (patente EP nº 932 700, patente US nº 6.210.891).

Mediante la provisión de perlas específicas de secuencia, se evita la preamplificación de una determinada diana mediante PCR, lo que resulta necesario según los métodos conocidos de la técnica. Por el contrario, según la presente invención, la emPCR misma se lleva a cabo con múltiples perlas, aunque todas las perlas portan la misma pareja de cebadores de amplificación. Más exactamente, las perlas presentan un cebador directo y un cebador reverso inmovilizados, siendo ambos específicos para el mismo gen. El cebador no cortable puede presentar una secuencia adicional en el extremo 5', seguido de una secuencia de cebado específica de un gen. El cebador cortable presenta una secuencia específica en el extremo 5', que previamente a la reacción de secuenciación puede actuar como sitio de unión del cebador de secuenciación. Después de la parte 3' de dicho cebador cortable se encuentra una secuencia específica de un gen. Resulta menos preferente, aunque todavía se encuentra comprendido dentro del alcance de la presente invención, que la secuencia correspondiente al sitio de unión del cebador de secuenciación se encuentre presente en el extremo 5' del cebador no cortable.

Pueden agrupar muchas perlas diferentes, conteniendo cada una parejas de cebadores para diferentes genes. A continuación, la diana se hibrida con las perlas en una reacción de captura. A continuación se genera una emulsión adecuada para la emPCR. Seguidamente la emulsión se somete a condiciones que cortan el conector cortable. A continuación las perlas se someten a "amplificación clonal" mediante emPCR. Tras romper la emulsión y lavar, las perlas se separan físicamente en una placa de picotitulación y el producto de amplificación se descodifica/detecta y/o cuantifica mediante secuenciación, por ejemplo con el aparato FLX de secuenciación genómica (Roche Applied Science, nº de cat. 04 896 548 001).

En resumen, las ventajas principales son:

-: que la diana puede añadirse directamente a las perlas

-: no resulta necesaria la preamplificación de los genes o amplicones de interés

-: existe la posibilidad de suministrar una agrupación de perlas de captura específicas de secuencia. Los grupos de perlas de captura específicas de secuencia pueden agruparse en aplicaciones específicas, tales como la expresión génica de genes oncológicamente relevantes y otros.

(ii) Análisis de PCR de punto final

En una segunda realización alternativa, el ADN amplificado que todavía se encuentra unido a la perla puede analizarse directamente por medios de detección apropiados. En otras palabras: se lleva a cabo un ensayo de PCR caracterizado porque la generación del amplicón se somete a una medición de punto final.

Las perlas presentan un cebador directo y un cebador inverso inmovilizados, ambos específicos para un gen o región de secuencia de ácidos nucleicos de interés. Uno de los cebadores es cortable y el segundo cebador es no cortable. Se agrupan muchas perlas diferentes, conteniendo cada una parejas de cebadores para diferentes genes/secuencias. La muestra de ácidos nucleicos diana se hibrida con las perlas en una reacción de captura. Se genera una emulsión adecuada para la emPCR. Seguidamente la emulsión se somete a condiciones que cortan el conector cortable. A continuación las perlas se someten a "amplificación clonal" mediante emPCR. Tras romper la emulsión y lavar, las perlas se separan físicamente en una PTP (placa de picotitulación) y se detecta el producto de amplificación en un ensayo de punto final. En una realización particular, dicha detección se lleva a cabo sometiendo los amplicones generados a un gradiente térmico. Como consecuencia resulta posible llevar a cabo un análisis de curva de fusión (patentes US nº 6.174.670 y nº 5.871.908).

Los productos de amplificación preferentemente se detectan a partir de la fluorescencia. Por ejemplo, la mezcla de amplificación ya puede contener una fracción de unión a ácido nucleico de doble cadena, tal como un pigmento de unión a ADN fluorescente que emite una señal fluorescente correspondiente tras interactuar con el ácido nucleico de doble cadena tras la excitación con luz de una longitud de onda adecuada. Los pigmentos SybrGreenI y SybrGold (Molecular Probes) o los pigmentos dados a conocer en el documento WO nº 2004/038038 han demostrado resultar particularmente adecuados para dicha aplicación. Alternativamente pueden utilizarse otros pigmentos intercalantes.

Debido al hecho de que la detección de amplicones con el formato SybrGreen no puede discriminar entre productos específicos y artefactos de amplificación tales como dímeros de cebadores, habitualmente se lleva a cabo posteriormente un análisis de curvas de fusión. Tras completar la reacción de PCR, la temperatura de la muestra se incrementa constitutivamente y se detecta la fluorescencia con la condición de que SybrGreen se encuentre unido al ADN de doble cadena presente en las muestras. Tras disociarse el ADN de doble cadena, la señal se reduce inmediatamente. Se realiza un seguimiento de esta reducción con un gráfico adecuado de fluorescencia frente a temperatura-tiempo, de manera que pueda determinarse un valor de primera derivada, en la que se observa la máxima reducción de fluorescencia. Debido a que los dímeros de cebadores de ADN de doble cadena habitualmente son cortos, la disociación en ADN de cadena sencilla se produce a temperaturas más bajas que la disociación del producto de amplificación específico de doble cadena.

Alternativamente, la mezcla de amplificación ya puede contener una o más sondas de hibridación que se etiquetan con por lo menos una fracción fluorescente. En este contexto de la presente invención, resultan particularmente útiles las balizas moleculares, las sondas de hibridación FRET y las sondas de marcaje único.

Las sondas de hibridación balizas moleculares se marcan con un primer componente y con un desactivador, estando preferentemente localizados los marcajes en ambos extremos de la sonda. Como resultado de la estructura secundaria de la sonda, ambos componentes son contiguos en solución. Tras la hibridación con los ácidos nucleicos diana, se separan ambos componentes de manera que tras la excitación con luz de una longitud de onda adecuada, puede medirse la emisión fluorescente del primer componente (patente US nº 5.118.801).

El formato de ensayo de sonda de hibridación FRET resulta especialmente útil para todo tipo de ensayo de hibridación homogénea (Matthews J.A. y Kricka L.J., Analytical Biochemistry 169:1-25, 1988). Se caracteriza por dos sondas de hibridación de cadena sencilla que se utilizan simultáneamente y son complementarias a sitios contiguos de la misma cadena del ácido nucleico diana amplificado. Ambas sondas se marcan con componentes fluorescentes diferentes. Al excitarse con luz de una longitud de onda adecuada, un primer componente transfiere la energía absorbida al segundo componente según el principio de transferencia de energía por resonancia fluorescente, de manera que puede medirse una emisión fluorescente del segundo componente al unirse ambas sondas de hibridación a posiciones contiguas de la molécula diana que debe detectarse. Alternativamente al seguimiento del incremento de fluorescencia del componente aceptor de FRET, también resulta posible realizar un seguimiento de la reducción de la fluorescencia del componente donador de FRET como medición cuantitativa del suceso de hibridación.

La sonda de marcaje único consiste de un único oligonucleótido marcado con un único pigmento fluorescente en el extremo 5' ó 3' (documento WO nº 02/14555). Pueden utilizarse dos diseños diferentes: las sondas de desactivación G y las sondas activadoras nitroindol. En la realización de desactivación G, el pigmento fluorescente se une a un C en el extremo 5' ó 3' del oligo. La fluorescencia se reduce significativamente al hibridarse la sonda con la diana en el caso de que se encuentren dos G en la cadena diana delante de C y en posición 1 junto a la sonda oligonucleótida complementaria. En la realización de activación con nitroindol, el pigmento fluorescente se une a nitroindol en el extremo 5' ó 3' del oligonucleótido. El nitroindol de alguna manera reduce la señal fluorescente de la sonda libre. La fluorescencia se incrementa al hibridarse la sonda con el ADN diana debido a un efecto de activación.

Todas las sondas de hibridación dadas a conocer anteriormente se utilizan para el análisis de curvas de fusión. En dicho ensayo, el ácido nucleico diana se amplifica en primer lugar en una reacción de PCR típica con cebadores de amplificación adecuados. Las sondas de hibridación ya pueden encontrarse presentes durante la reacción de amplificación o añadirse posteriormente. Tras completar la reacción de PCR, la temperatura de la muestra se incrementa constitutivamente y se detecta la fluorescencia con la condición de que la sonda de hibridación se encuentre unida al ADN diana. A la temperatura de fusión, las sondas de hibridación son liberadas de su diana y la señal fluorescente se reduce inmediatamente hasta el nivel de fondo. Se realiza un seguimiento de esta reducción con un gráfico adecuado de fluorescencia frente a temperatura-tiempo, de manera que pueda determinarse un valor de primera derivada, en la que se observa la máxima reducción de fluorescencia.

En el caso de una aplicación caracterizada porque sólo se amplifica uno, dos o unos cuantos genes diana diferentes, resulta posible discriminar los diferentes productos de amplificación sometiendo los amplicones generados a un gradiente térmico y llevando a cabo un análisis de curvas de fusión. Mediante la utilización del formato de detección SybrGreen resulta fácilmente posible la discriminación entre por lo menos dos amplicones diferentes. Mediante la utilización del formato de detección basado en sondas de hibridación resulta fácilmente posible discriminar con una o más sondas de hibridación etiquetadas con el mismo compuesto o compuestos fluorescentes entre por lo menos 4 variaciones de secuencia de amplicón diferentes que se amplifican con el mismo cebador de amplificación o con cebadores de amplificación diferentes. En el caso de que se utilicen marcajes diferentes para las diferentes sondas de hibridación, resulta posible discriminar correspondientemente más variaciones diferentes de secuencia de amplicón.

Según la presente invención también existe otro escenario de detección que se basa en la introducción de etiquetas detectables. Por lo tanto, la presente invención proporciona una perla o una pluralidad de perlas que comprende por lo menos dos cebadores de amplificación específicos de secuencia, en la que por lo menos un cebador se une a dicho soporte con un conector cortable y dicho cebador comprende además una etiqueta detectable.

En particular, la presente invención proporciona además una biblioteca de perlas, en la que cada perla comprende una pareja diferente de dos cebadores de amplificación específicos de secuencia, en la que por lo menos un cebador se une a dicho soporte con un conector cortable y dicho cebador comprende además una etiqueta detectable. En una realización muy particular, la perla es la etiqueta por sí misma o es modificada sobre la superficie con etiquetas medibles.

En el presente contexto, las perlas que portan secuencias de cebador específicas se encuentran codificadas con cualquier tipo de etiqueta detectable que permita la detección específica de las perlas. Por ejemplo, la etiqueta detectable puede ser una etiqueta de masa, un marcaje de fluorescencia o de color o una etiqueta e-Tag o una etiqueta de Raman, aunque no se encuentra limitada a ellas. Son ejemplos adicionales, haptenos tales como la digoxigenina o la biotina, o péptidos pequeños, la totalidad de los cuales son detectables con un anticuerpo.

Para cada perla específica de secuencia puede seleccionarse otra etiqueta o un número específico de una pluralidad de etiquetas, que codifica mediante un color diferente, una masa diferente u otro, la secuencia específica unida a perla. Dependiendo del número de marcajes disponibles diferentes, pueden analizarse múltiples secuencias diana.

Preferentemente el cebador unido a la perla mediante un conector cortable porta una etiqueta detectable. Tras cortar y alargar el cebador "cortable", la etiqueta se incorpora en el producto de PCR sobre las perlas y puede detectarse. Las perlas que contienen producto amplificado de diferentes secuencias pueden diferenciarse y contarse, permitiendo de esta manera la detección cualitativa y cuantitativa de secuencias específicas. De esta manera, más preferentemente, cada elemento de la pluralidad de cebadores que se unen a la perla mediante un conector cortable porta una etiqueta detectable o pluralidad de etiquetas detectable.

En el caso del marcaje del cebador cortable con una etiqueta fluorescente, lo anterior puede llevarse a cabo de manera que el marcaje se encuentre desactivado cuando no es alargado por la polimerasa para formar un amplicón de PCR. Un mecanismo de desactivación contemplado es la utilización de cebadores similares a sondas de hibridación de marcaje único, en las que se produce la activación al interactuar con la cadena diana complementaria. Alternativamente, podrían utilizarse cebadores similares a balizas moleculares, en los que se produce la activación al linearizarse el oligonucleótido. En consecuencia, la utilización de cebadores desactivados minimiza la posibilidad de cualquier señalización fluorescente de fondo.

En el caso de que el cebador cortable se encuentre marcado con una etiqueta hapteno, tal como biotina y digoxigenina, el producto de amplificación puede detectarse mediante una reacción de quimioluminiscencia utilizando avidina o anti-Dig en la correspondiente reacción posterior de quimioluminiscencia. En una realización particular, cada elemento de la pluralidad de cebadores que se encuentra unidos a la perla con un conector cortable porta un número diferente de marcajes biotina o Dig que puede detectarse en una cascada de reacción mediante fluorescencia o quimioluminiscencia. Por lo tanto, se utiliza un conjugado de POD-estreptavidina y de AP-antiDig en combinación con sustratos fluorogénicos o quimioluminogénicos con diferentes características de emisión. Para la fluorescencia, un ejemplo ejemplar es la utilización de fluoresceína y un conjugado de anti-fluoresceína-galactosa. La dependencia del tiempo o intensidad de señal de la señal de fluorescencia o de quimioluminiscencia y la longitud de onda de emisión también pueden utilizarse adicionalmente para la descodificación.

Alternativamente, el cebador cortable y/o el cebador no cortable se modifican con un número variable de Iso-G e Iso-C (que son ortogonales respecto a las parejas de bases estándares). A continuación se incorporan iso-G e iso-C marcados con biotina y/o Dig durante la reacción de amplificación y finalmente se detectan mediante una cascada de reacción, tal como se ha indicado anteriormente. También podrían utilizarse etiquetas ortogonales que sean capaces de interactuar específicamente con una secuencia complementaria pero que no puedan interactuar con ADN o ARN unido al extremo 5' de los cebadores, para la "descodificación mediante hibridación" en una matriz en la que secuencias complementarias de las etiquetas se encuentren inmovilizadas en una posición específica conocida. Dichas etiquetas ortogonales son análogos de ácidos nucleicos, tales como oligonucleótidos que contienen isoG o isoC, L-ADN, AGN y homoADN.

Se conocen en la literatura muchas otras estrategias diferentes de codificación y algunas de ellas se encuentran disponibles comercialmente. Se dan a conocer ejemplos en las referencias siguientes:

Fluorescencia:

Tong A.K. et al., Nature Biotechnology 19:756-759, 2001.

Masa:

Kokoris, M. et al., Molecular Diagnosis 5:329-340, 2000.

Espectroscopía de Raman:

Sun L. et al., Analytical Chemistry 79:3981-3988, 2007. Ng P., Nucleic Acids Research 34:e84/1-e84/10, 2006.

Revisiones sobre el análisis multiplex:

Finkel N.H. et al., Anal. Chem. 76:352A-359A, 2004. Braeckmans K. et al., Nat. Rev. Drug Discov. 1:447-456, 2002.

En una realización particular, también pueden utilizarse perlas codificadas en combinación con los modos de detección de utilización de entidades fluorescentes tales como pigmentos de unión a ADNdc o sondas fluorescentes de hibridación, tal como se ha dado a conocer anteriormente.

(iii) PCR en tiempo real

En el caso de que el aislamiento clonal en la etapa c) se haya llevado a cabo mediante la distribución de dicha pluralidad de perlas en las cavidades de una placa de microtitulación o de picotitulación, la reacción de PCR de la etapa ya puede seguirse en tiempo real durante la etapa e) tal como se ha dado a conocer anteriormente utilizando un formato de detección apropiado. En otras palabras, las etapas e) y f) se llevan a cabo simultáneamente mediante la realización de un análisis de PCR en tiempo real.

Se agrupan muchas perlas diferentes, conteniendo cada una, parejas de cebadores para diferentes genes. La diana se hibrida con las perlas. Se utiliza un microdispositivo, tal como una placa de picotitulación (PTP) para separar físicamente diferentes perlas, portando cada una dos cebadores de PCR, siendo ambos específicos para un gen. Uno de los cebadores inmovilizados sobre las perlas contiene un conector cortable. Se añaden reactivos de PCR a las perlas separadas físicamente sobre la PTP. A continuación, las perlas se exponen a condiciones de corte con el fin de corte el conector que une el cebador cortable a la matriz de soporte. La mezcla de reacción se expone a ciclado de PCR. El cebador todavía inmovilizado (no cortable) se hibrida con las moléculas amplificadas en estrecha proximidad, manteniéndolas en la superficie. Se lleva a cabo la PCR dentro de pocillos individuales de la PTP y se realiza un seguimiento en tiempo real. También en la presente realización, los amplicones pueden someterse posteriormente a un gradiente térmico con el fin de llevar a cabo un análisis de las curvas de fusión.

Con el fin de identificar los productos de amplificación en tiempo real, el experto en la materia conocerá que pueden utilizarse los mismos modos de codificación de las perlas. El experto en la materia también conocerá que para la detección del producto de amplificación, pueden utilizarse pigmentos de unión a ADN de doble cadena o sondas de hibridación fluorescente tal como se ha dado a conocer anteriormente para el análisis de PCR de punto final.

Además, resulta posible utilizar cualquier tipo de formato de detección conocido de la técnica para la PCR en tiempo real. En particular, también resulta posible utilizar el formato bien conocido de nucleasa 5' TaqMan. En este caso, se marca una sonda de hibridación de cadena sencilla con dos componentes. Al excitar el primer componente con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida es transferida al segundo componente, el denominado desactivador, según el principio de transferencia de energía por resonancia fluorescente. Durante la etapa de hibridación de la reacción de PCR, la sonda de hidrolización se une al ADN diana y es degradada por la actividad de exonucleasa 5' a -3' de la polimerasa Taq durante la etapa de alargamiento posterior. Como resultado, el componente fluorescente excitado y el desactivador se encuentran separados espacialmente entre sí y, de esta manera, puede medirse una emisión fluorescente del primer componente (patente US nº 5.804.375). Sin embargo, dicho formato de ensayo es incompatible con un posterior análisis de curvas de fusión.

(iv) Preparación de bibliotecas

Además de los métodos de análisis de múltiples moléculas de ácidos nucleicos, la presente invención proporciona además una biblioteca preparada mediante los métodos de la invención. La biblioteca puede prepararse mediante la utilización de, por ejemplo, ADN genómico, ADNc celular total, una biblioteca de ADN genómico, una biblioteca de ADNc o una biblioteca de plásmidos como material de partida para la amplificación. La biblioteca puede derivarse de cualquier población de ácidos nucleicos, por ejemplo de origen biológico o sintético.

De esta manera, más exactamente, la presente invención se refiere además a un método para la amplificación de múltiples moléculas de ácidos nucleicos de interés, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una pluralidad de perlas, caracterizada porque cada perla comprende por lo menos una pareja de cebadores de amplificación específicos de secuencia, caracterizada adicionalmente porque por lo menos uno de dichos cebadores se une a la perla mediante un conector cortable, b) capturar las moléculas de ácidos nucleicos de interés en una muestra, c) aislar clonalmente dicha pluralidad de perlas, d) cortar dicha cebador o cebadores, e) amplificar clonalmente dicho ácido nucleico, creando de esta manera múltiples productos de amplificación, f) almacenar dichos múltiples productos de amplificación clonamente en las cavidades de una placa de microtitulación o de picotitulación

En el caso de que la etapa c) se lleve a cabo mediante la preparación de una emulsión según la presente invención, la etapa f) comprende al inicio la etapa de distribuir dicha pluralidad de perlas en cavidades de una placa de microtitulación o de picotitulación. En el caso de que la etapa c) comprenda la etapa de distribuir dicha pluralidad de perlas en las cavidades de una placa de microtitulación o de picotitulación, los productos de amplificación pueden almacenarse directamente dentro de la misma placa de microtitulación o picotitulación.

En el caso de que bibliotecas preparadas previamente se amplifiquen según la invención, resulta posible utilizar un tipo de perla con una pareja específica de cebadores de amplificación. En el caso de que se amplifique según la invención ADN genómico o ADNc celular total, las perlas deben comprender una población de secuencias aleatorizadas de cebadores directos e inversos.

Además, la presente invención se refiere adicionalmente a una biblioteca preparada mediante los métodos dados a conocer anteriormente.

Aplicaciones de la invención

(i) Secuenciación

El análisis de secuenciación según la presente invención puede utilizarse para una diversidad de diferentes aplicaciones.

En muchos casos se desea analizar múltiples copias de una diana particular para potenciales variaciones de secuencia. Según la presente invención, se evita la preamplificación de una determinada diana mediante PCR, la cual resulta necesaria según los métodos conocidos de la técnica. Por el contrario, según la presente invención, la emPCR misma se lleva a cabo con múltiples perlas del mismo tipo, caracterizada porque todas las perlas portan la misma pareja de cebadores de amplificación.

De esta manera, en un aspecto, el análisis de secuenciación según la presente invención puede utilizarse para el análisis cuantitativo de mutaciones. En este aspecto, los datos obtenidos de la pluralidad de diferentes reacciones de secuenciación revelan una pluralidad de diferentes variaciones que se producen en el ácido nucleico diana de una muestra que ha sido amplificado. Además, los datos obtenidos proporcionan información cuantitativa del porcentaje, de la frecuencia en que se encontraba presente originalmente cada variación de secuencia en la muestra analizada.

Además, dicho análisis también puede llevarse a cabo en un enfoque multiplex. En este caso, se determinan las variaciones de secuencia de varios ácidos nucleicos diana diferentes que se encuentran presentes en una muestra. El número de diferentes dianas que pueden analizarse mediante este método sólo se encuentra limitado por el número de diferentes perlas que puede proporcionarse de manera que cada perla porte una pareja específica de cebadores de amplificación.

En otro aspecto, también resulta posible analizar un gen complejo o un locus génico, la secuencia del cual no puede amplificarse mediante la realización de sólo una única reacción de PCR. En este caso, se proporcionan múltiples especies diferentes de perlas, caracterizadas porque cada perla porta una pareja específica de cebadores de amplificación diseñada para amplificar una región particular del ADN diana que se analizará. En este contexto, el diseño de los cebadores debe llevarse a cabo de manera que los tamaños de los productos de amplificación generados no exceda una longitud que no pueda ser secuenciada completamente en la etapa de secuenciación posterior. De esta manera, preferentemente, los tamaños de amplicón generados presentan un tamaño inferior a

1.000 nucleótidos, y más preferentemente inferior a 500 nucleótidos. También preferentemente, las secuencias de los amplicones generados comprenden solapamientos entre sí, de manera que la información de secuencia generada finalmente se conoce con un grado elevado de confianza sin ningún hueco.

En particular, dicho análisis resulta útil para analizar múltiples polimorfismos observados en genes o loci génicos particulares, los cuales se ha demostrado que están asociados a una predisposición a una determinada enfermedad

o para el pronóstico de una enfermedad. Por ejemplo, el método inventivo puede utilizarse para analizar genes humanos, tales como el gen codificante de la distrofia muscular o los genes HNPCC.

En un aspecto adicional, el análisis de secuenciación según la presente invención puede utilizarse para el seguimiento de la expresión génica. En este aspecto se utiliza el ADNc que ha sido preparado de manera que el extremo 5' presenta una secuencia diana que es capaz de actuar como un sitio de unión a cebador para la posterior reacción de amplificación. Como segundo cebador dentro de dicha reacción de amplificación puede utilizarse un cebador oligo-dT. La introducción del sitio de unión a cebador en el extremo 5' del ADNc puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido de la técnica. Por ejemplo, para la síntesis del ADNc de segunda cadena, resulta posible utilizar un cebador que comprende una parte 5' y una parte 3'. La parte 5' comprende el sitio de unión a cebador que por sí mismo no se hibrida con el ADNc de primera cadena. La parte 3' comprende una secuencia por lo menos parcialmente aleatorizada y preferentemente aleatorizada por completo, de manera que es capaz de hibridarse con sustancialmente la totalidad de las moléculas de ADNc de primera cadena.

Alternativamente, en el caso de que sólo deba amplificarse la expresión de un número limitado de ácidos nucleicos diana, la síntesis de ADNc de primera y segunda cadenas se lleva a cabo con una población que comprende un número limitado de secuencias de cebador. Para la síntesis de ADNc de primera cadena, se utiliza una composición de cebadores que comparte una primera parte 5' común correspondiente a un primer sitio de unión a cebador de amplificación, pero correspondiente al diferente número de dianas para las que se realizará un seguimiento que presentan diferentes partes 3'. De manera similar, para la síntesis de ADNc de segunda cadena se utiliza una composición de cebadores que comparte una segunda parte 5' común correspondiente a un primer sitio de unión a cebador de amplificación, pero correspondiente al diferente número de dianas para las que se realizará un seguimiento que presentan diferentes partes 3'.

De manera similar al método de análisis cuantitativo de mutaciones, los datos obtenidos mediante la posterior secuenciación también revelan información cuantitativa sobre la frecuencia en la que los ADNc se encuentran representados en la muestra original.

En un aspecto lateral adicional, la pareja de cebadores de amplificación específicos de secuencia puede sustituirse con una población de cebadores completamente aleatorizados. En este caso, el método según la presente invención también puede utilizarse para secuenciar una población de moléculas de ácidos nucleicos con muchas secuencias diferentes, tal como una muestra de ADN genómico o una muestra de ADNc total.

(ii) PCR de punto final y PCR en tiempo real

Las realizaciones de PCR según la presente invención pueden utilizarse para la cuantificación absoluta o relativa de ácidos nucleicos.

En el caso de la cuantificación relativa, se utilizan por lo menos dos parejas de cebadores de amplificación específicos de secuencia con el fin de amplificar dos secuencias de ácidos nucleicos diferentes que se encuentran presentes en una muestra. Los cebadores fotocortables preferentemente comprenden diferentes etiquetas para la posterior detección, es decir, cada elemento de la pluralidad de cebadores que se encuentran unidos a la perla mediante un conector cortable porta un marcaje detectable diferente. Alternativamente, en el caso de que sólo se analice un número limitado de dianas, los productos de amplificación se discriminan mediante el análisis de curvas de fusión, mediante la utilización de sondas de hibridación marcadas de manera diferente o utilizando cebadores codificados con digoxigenina o biotina. La muestra puede ser, por ejemplo, una muestra de ADN genómico, una muestra de ADNc o una muestra de ARN. En este último caso debe llevarse a cabo una RT-PCR en una etapa.

En el caso de la cuantificación absoluta, se añade a la muestra una cantidad conocida de ácidos nucleicos estándares, los cuales pueden amplificarse con cebadores tales como los dados a conocer anteriormente y detectarse con cebadores apropiadamente etiquetados o sondas apropiadamente marcados.

En el caso del seguimiento mediante PCR de punto final, la abundancia de señales positivas para cada tipo de secuencia diana amplificada se determina y se comparan entre sí con el fin de obtener datos de cuantificación relativa o, en el caso de la utilización de un estándar conocido, absoluta.

En el caso de la PCR en tiempo real, se obtienen datos cuantitativos durante el procedimiento de amplificación según protocolos bien conocidos y utilizados frecuentemente en la técnica.

De esta manera, mediante tanto seguimiento de PCR de punto final como seguimiento de PCR en tiempo real según la invención resulta posible comparar la abundancia de ARN diferentes en una muestra original o, en otras palabras, resulta posible realizar un seguimiento de la expresión génica de una manera relativa.

En un aspecto adicional, los presentes métodos de PCR de punto final, así como de PCR en tiempo real pueden utilizarse para el análisis mutacional según los protocolos basados en la amplificación específica de alelo, que también se denomina tecnología ARMS (patentes US nº 5.137.806, nº 5.595.890 y nº 5.639.611). En dicha realización particular, se utilizan cebadores con residuo nucleótido discriminante de 3' que son capaces de amplificar únicamente una variación particular de secuencia de una secuencia diana particular, pero que no amplifican una segunda variación de secuencia conocida.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Preparación de cebadores y cebadores fotocortables Se llevó a cabo síntesis de oligonucleótidos en una escala de 4 veces 1 mmol en un sintetizador ABI 394. Se utilizó tac CPG disponible comercialmente (Proligo) como el material de soporte. Todos los demás compuestos químicos para la síntesis estándar se obtuvieron de Glen Research. Se utilizaron fosforamiditas con grupos protectores tercbutilfenoxi-acetilo (conocidos como monómeros "tac" o "Expedite") de Proligo. Como reactivo de adición de caperuza

5 anhídrido terc-butilfenoxiacetil-acético (tac2O) en tetrahidrofurano.

Se utilizaron los modificadores disponibles comercialmente siguientes:

-: modificador 5’ amino C6: (6-(4-monometoxitritilamino)hexil-(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)-fosforamidita,

-: espaciador fosforamidita 18 (18-O-dimetoxitritilhexaetilenglicol,1[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita,

-: espaciador fotocortable [4-(4,4’-dimetoxitritiloxi)butiramidometil)-1-(2-nitrofenil)-etil]-2-cianoetil-(N,N-diisopropil)-fosforamidita,

-: biotín-fosforamidita-dT (5’-dimetoxitritiloxi-5-[N-((4-t-butilbenzoil)-biotinil)-aminohexil)-3-acrilimido]-2’-deoxiUridín-3’-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita)

-: Biotín-fosforamidita (1-dimetoxitritiloxi-2-(N-biotinil-4-aminobutil)-propil-3-O-(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)fosforamidita),

-: Fluoresceín-fosforamidita (1-dimetoxitritiloxi-2-(N-tiourea-(di-O-pivaloil-fluoresceín)-4-aminobutil)-propil-3-O-(2cianoetil)-(N,N-diisopropil)-fosforamidita),

-: Fluoresceín-dT-fosforamidita (5’-dimetoxitritiloxi-5-[N-((3’,6’-dipivaloilfluoresceinil)-aminohexil)-3-acrilimido]-2’deoxiuridín-3’-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita).

10 Se utilizó el protocolo estándar para las síntesis. El producto se cortó del soporte durante 2 h a temperatura ambiente con amonio al 33% y se purificó mediante cromatografía de fase inversa en una columna porosa Oligo R3 de 4,6x50 mm. Cromatografía: tampón A: acetato de trietilamonio 0,1 M en agua, pH 6,8; tampón B: acetato de trietilamonio 0,1 M en agua/acetonitrilo 1:1, gradiente de 2 minutos de 0% B a 100% B en 45 minutos. Se midió la absorción de UV del eluyente a 260 nm. Se obtuvo una fracción principal que contenía el oligonucleotido amino

15 modificado. Se eliminó el solvente en una centrífuga de vacío.

La tabla a continuación muestra las secuencias y modificaciones de cebadores oligonucleótidos inmovilizados en perlas de sefarosa activada con éster de N-hidroxisuccinimida (NHS). Las letras mayúsculas representan secuencias adaptadoras genéricas para la codificación, amplificación, enriquecimiento y pirosecuenciación de perlas, mientras

20 que las letras minúsculas representan secuencias específicas de gen.

Tabla 2:

ID de secuencia: Gen diana Secuencia (5’-> 3’)

nº 1: - 5’-AmMC6-(isp18)3-PCL-C-FAMdT-GTGCGTCCCTACTCTACC

nº 2: - 5’-AmMC6-(isp18)3-CCTATCCCCTGTGTGCCTTG

nº 3: - 5’-AmMC6-(isp18)3-PCL-TB-CCATCTCATCCCTGCGTGTC

nº 4: NM_004048 (B2M) 5’-AmMC6-(isp18)3-GCCTCCCTCGCGCCATCAGcctggtctttctatctcttgtactac

nº 5: NM_004048 (B2M) 5’-AmMC6-(isp18)3-PCL-TB-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGgcatcttcaaacctccatga

nº 6: NM_199166 (ALAS) 5’-AmMC6-(isp18)3-GCCTCCCTCGCGCCATCAGcctggaatgagtcgccacccacg

nº 7: NM_199166 (ALAS) 5’-AmMC6-(isp18)3-PCL-TB-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGcagctcccgctctaagtcca

nº 8: NM_000194 (HPRT) 5’-AmMC6-(isp18)3-, GCCTCCCTCGCGCCATCAGcctggactgtagattttatcagactga

nº 9: NM_000194 (HPRT) 5’-AmMC6-(isp18)3-PCL-TB-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGtggattatactgcctgaccaa

nº 10: NM_000190 (PBGD) 5’-AmMC6-(isp18)3-GCCTCCCTCGCGCCATCAGgcggagccatgtctggtaa

nº 11: NM_000190 (PBGD) 5’-AmMC6-(isp18)3-PCL-TB-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGccagggtacgaggctttcaa

5’-AmMC6 ... Modificador 5'-amino C6; isp18 ... espaciador interno 18, hexaetilenglicol; PCL ... conector 2-nitrobencilo fotocortable; FAMdT ... Fluoresceín-desoxitimidina TB = Bíotín desoxitimidina; el sitio de restricción MvaI se encuentra subrayado

Ejemplo 2:

Preparación de perlas y corte fotolítico

5 Se conjugaron oligonucleótidos amino-modificados que contenían conector estacionario y fotocortable (ID de secuencia nº 1 a nº 9), respectivamente, con perlas de sefarosa funcionalizadas con éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) (Roche/454-Life Sciences, Branford, CT, USA) siguiendo el protocolo estándar. Se representa el mecanismo de la reacción química en la fig. 2.

10 Para inducir el corte fotolítico del conector nitrobencilo, estas perlas se sometieron a irradiación de UV en una celda de cuarzo QS1.000 (camino óptico de 1 cm) utilizando una lámpara de UV de doble longitud de onda de 8 W (Camag, Berlin, Alemania) a 366 nm. La distancia entre la celda de cuarzo y la lámpara de UV era de 2 cm.

Ejemplo 3:

15 Análisis de la reacción de corte fotolítico (correspondiente a la figura 3)

El presente ejemplo describe la detección del corte fotolítico de sondas oligonucleótidas modificadas con 20 fluoresceína inmovilizadas en perlas de sefarosa.

Se lavaron extensivamente 5x106 perlas conjugadas con sondas oligonucleótidas modificadas con fluoresceína (ID de secuencia nº 1), después se suspendieron en 100 ml de tampón Tris/HCl 50 mM, pH 7,5, y se irradiaron durante 15 minutos tal como se describe en el Ejemplo 2. Posteriormente las perlas se centrifugaron y se analizó el

25 sobrenadante para los oligonucleótidos modificados con fluoresceína (FAM) fotocortados mediante la medición de la absorbancia utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) (fig. 3A).

Además, se suspendieron 0,6x106 perlas que portaban sondas oligonucleótidas modificadas con fluoresceína (ID de secuencia nº 1) en 800 ml de mezcla de reacción de PCR (Tabla 3).

Tabla 3:

Reactivo: concentración final

Tween -80: 0,01 %

BSA: 0,10 %

MgSO4: 2,5 mM

Glicerol: 3,6 %

Tris-H2SO4 pH 8,9 NH4-SO4: 58,1 mM 17,4 mM

dATP, dGTP, dCTP, dTTP: 0,40 mM cada uno

Polimerasa Taq Expand HiFi: 0,04 U/ml

Alternativamente, se suspendió la misma cantidad de perlas en 190 ml de mezcla de reacción de PCR que, a su vez, se emulsificó siguiendo las instrucciones del fabricante (manual del usuario del kit GS emPCR, Roche/454-Life 35 Sciences, Branford, CT, USA). Las perlas suspendidas o emulsificadas se irradiaron durante 15 minutos tal como se ha descrito en el Ejemplo 2. A continuación, las perlas se lavaron extensivamente con isopropanol y tampón Tris/HCl 50 mM, pH 7,5. Se analizó el corte fotolítico mediante la medición de la intensidad de fluorescencia de las perlas antes y después de la irradiación utilizando un citómetro de flujo estándar (fig. 3B). Tal como puede deducirse a partir de la figura, el corte fotolítico mediante irradiación de UV en ambos casos resultó en una pérdida significativa

40 de intensidad de fluorescencia de la población de perlas.

Ejemplo 4:

PCR de perlas fotoactivadas 45 (correspondiente a las figuras 4 y 5)

El presente ejemplo describe la detección de productos de PCR específicos utilizando PCR de perlas y cebador inmovilizado en perlas fotocortable. El molde para la PCR de perlas y una PCR de control estándar fue un amplicón artificial de 239 pb. El amplicón se diseñó de manera que contuviese un sitio de restricción MvaI y un sitio NIaIII. El

50 tratamiento con endonucleasa de restricción de dicho amplicón tras la PCR de perlas o la PCR de control se esperaba que resultase en patrones característicos de fragmentos de diferente longitud, tal como se predice en la fig. 4.

Se suspendieron 0,3x106 perlas que portaban sondas oligonucleótidas estacionarias y fotocortables (ID de secuencia nº 2 y nº 3) en 100 ml de mezcla de reacción de PCR (Tabla 3) que contenía 1 pg de un amplicón artificial de 239 pb. El amplicón incluía una secuencia que era complementaria a los oligonucleótidos sobre las perlas. La suspensión se irradió durante 15 minutos tal como se describe en el Ejemplo 2. A continuación, la suspensión se transfirió a cámaras de reacción de PCR (es decir, tubos de PCR). Se llevó a cabo la PCR en un termociclador estándar, de la manera siguiente:

•: 1 ciclo (4 minutos a 94°C) - inicio en caliente;

•: 40 ciclos (30 segundos a 94°C, 60 segundos a 58°C, 90 segundos a 68°C) -desnaturalización, hibridación, polimerización;

•: 25 ciclos (30 segundos a 94°C, 6 minutos a 58°C) -desnaturalización, polimerización;

•: Almacenamiento a 10°C.

Tras completar la reacción de PCR, las perlas que portaban el material amplificado se extrajeron, se lavaron en tampón Tris/HCl 50 mM, pH 7,5, y se sometieron a tratamiento con endonucleasa de restricción (aproximadamente 5 U) durante 2 h a 37ºC. A continuación, las perlas se centrifugaron y se analizó el sobrenadante para productos de PCR específicos mediante electroforesis en gel de agarosa (fig. 5, derecha). Se llevó a cabo una reacción de PCR de control utilizando sondas oligonucleótidas no inmovilizadas (fig. 5, izquierda). Tal como puede observarse en la fig. 5, la PCR de perlas resultó en los fragmentos de ADN grandes y pequeños esperados, indicando que tanto el corte fotolítico como la reacción de PCR en perlas habían funcionado con éxito.

Ejemplo 5:

PCR en emulsión de perlas fotoactivadas (correspondiente a la figura 6)

El presente ejemplo describe la detección de productos de PCR específicos utilizando PCR en emulsión de perlas y cebador inmovilizado en perlas fotocortable.

Se suspendieron 0,4x106 perlas que portaban sondas oligonucleótidas estacionarias y fotocortables (ID de secuencia nº 2 y nº 3) en 30 ml de tampón de captura (Tris/HCl 2 mM, pH 7,5, Mg(CH3-COO)2 0,5 mM) que contenía 4 pg de un amplicón artificial de 239 pb. El amplicón incluía una secuencia que era complementaria a los oligonucleótidos sobre las perlas. El amplicón se hibridó con las perlas en un termociclador estándar de la manera siguiente:

•: 1 ciclo (5 minutos a 80ºC) - desnaturalización;

•: 1 ciclo (reducción de 0,1 °C/segundo hasta 70°C, 1 minuto a 70°C) -apareamiento;

•: 1 ciclo (reducción de 0,1 °C/segundo hasta 60°, 1 minuto a 60°) -apareamiento;

•: 1 ciclo (reducción de 0,1 °C/segundo hasta 50°, 1 minuto a 50°) -apareamiento;

•: 1 ciclo (reducción de 0,1°/segundo hasta 20ºC, 5 minutos a 20ºC) -apareamiento;

A continuación, las perlas se emulsificaron siguiendo las instrucciones del fabricante (manual de usuario del kit GS emPCR, Roche/454-Life Sciences, Branford, CT, USA). La emulsión se irradió durante 30 minutos tal como se describe en el Ejemplo 2. A continuación, la emulsión se transfirió a cámaras de reacción de PCR (es decir, tubos de PCR). Se llevó a cabo la PCR en un termociclador estándar, de la manera siguiente:

•: 1 ciclo (4 minutos a 94°C) - inicio en caliente;

•: Almacenamiento a 10°C.

Tras completarse la reacción de PCR, las perlas emulsificadas se recuperaron mediante una serie de etapas de lavado y centrifugación utilizando en primer lugar un exceso de isopropanol, en segundo lugar un exceso de tampón etanol (Tris/HCl 10 mM, pH 7,5, etanol al 70%) y en tercer lugar de tampón Tris/HCl 50 mM, pH 7,5. A continuación, las perlas lavadas se sometieron a tratamiento de endonucleasa de restricción (aproximadamente 5 U) durante 2 h a 37ºC. A continuación, las perlas se centrifugaron y se analizó el sobrenadante para productos de PCR específicos mediante electroforesis en gel de agarosa. A modo de control se llevó a cabo una reacción de PCR utilizando sondas oligonucleótidas no inmovilizadas. Tal como se muestra en la fig. 6, la PCR en emulsión de perlas y el posterior tratamiento con endonucleasa de restricción resultó en la generación del fragmento de ADN esperado, indicando que tanto el corte fotolítico como la posterior reacción de emPCR habían funcionado con éxito.

Ejemplo 6:

PCR en emulsión de perlas fotoactivadas utilizando ADNc como molde (correspondiente a la figura 7)

El presente ejemplo describe la detección de productos de PCR específicos utilizando ADNc humano utilizando la PCR en emulsión de perlas y cebador inmovilizado en perlas fotocortable.

Se suspendieron 0,4x106 perlas que portaban sondas oligonucleótidas estacionarias y fotocortables específicas para el gen microglobulina -2 (ID de secuencia nº 4 y nº 5) en 30 ml de tampón de captura (Tris/HCl 2 mM, pH 7,5, Mg(CH3-COO)2 0,5 mM) que contenía ADNc humano obtenido de la línea celular HeLa.

Se incubó el ADNc con las perlas utilizando el procedimiento de hibridación del Ejemplo 5. A continuación, las perlas se emulsificaron, se irradiaron y se sometieron a amplificación mediante PCR tal como se describe de manera general en el Ejemplo 5.

Tras completarse la reacción de PCR, las perlas emulsificadas se recuperaron tal como se describe en el Ejemplo 5. Las perlas lavadas seguidamente se sometieron a tratamiento de endonucleasa de restricción y se analizaron para productos de PCR específicos mediante electroforesis en gel de agarosa. A modo de control se llevó a cabo una PCR en emulsión de perlas fotoactivadas utilizando 2,4 pg de un amplicón de 147 pb del gen microglobulina -2 como molde. El fragmento de ADN esperado tal como se muestra en la figura 7 indica que tanto el corte fotolítico como la posterior reacción de emPCR habían funcionado con éxito con el ADNc humano como molde. Se obtuvieron resultados similares utilizando ADNc de HeLa y perlas que portaban sondas oligonucleótidas estacionarias y fotocortables específicas para el gen profobilinógeno desaminasa (ID de secuencia nº 10 y nº 11).

Ejemplo 7:

PCR de perlas fotoactivadas multiplexado

(correspondiente a las figuras 8 y 9)

Se llevaron a cabo en un único tubo los procedimientos siguientes, incluyendo la captura de múltiples ADN de molde, la amplificación del ADN y la recuperación de un conjunto de perlas diferentes unidas a su molde amplificado correspondiente.

a) PCR en suspensión de perlas fotoactivadas multiplexado

El presente ejemplo describe la detección simultánea de múltiples productos de PCR específicos utilizando PCR en suspensión de perlas fotoactivadas (fig. 8).

Se suspendió en 100 ml de mezcla de reacción de PCR un conjunto de perlas diferentes (0,2x106 perlas cada uno) unidas a sondas oligonucleótidas estacionarias y fotocortables específicas para los genes aminolevulinato sintasa, microglobulina -2 e hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (ID de secuencia nº 4, nº 5, nº 6, nº 7, nº 8 y nº 9) (Tabla 3). Dicha suspensión se suplementó con amplicones (aproximadamente 0,5 pg de cada uno) de los genes aminolevulinato sintasa (127 pb), microglobulina -2 (174 pb) e hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (181 pb). La suspensión se irradió y se sometió a amplificación mediante PCR tal como se describe de manera general en el Ejemplo 4.

Tras completarse la reacción de PCR, las perlas se lavaron y se sometieron a tratamiento de endonucleasa de restricción tal como se describe en el Ejemplo 4. Tras la centrifugación de las perlas, el sobrenadante se analizó para productos de PCR específicos utilizando un chip cromatográfico de microfluidos (Bioanalizador 2100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

Se muestran los resultados en la fig. 9a. Se obtuvieron claramente 3 picos diferentes, que representan los tamaños de fragmentos que corresponden a los tamaños de fragmentos que son los teóricamente esperados amplicones de 127 pb, 174 pb y 181 pb.

b) PCR en emulsión de perlas fotoactivadas multiplexado

El presente ejemplo describe la detección simultánea de múltiples productos de PCR específicos utilizando PCR en emulsión de perlas fotoactivadas (fig. 8).

Se suspendió en 30 ml de tampón de captura (Tris/Cl 2 mM, pH 7,5, Mg(CH3-COO)2 0,5 mM) un conjunto de perlas diferentes (0,2x106 perlas cada uno) unidas a sondas oligonucleótidas estacionarias y fotocortables específicas para los genes aminolevulinato sintasa, microglobulina -2 e hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (ID de secuencia nº 4, nº 5, nº 6, nº 7, nº 8 y nº 9). El tampón de captura contenía amplicones (aproximadamente 1,5 pg de cada uno) de los genes aminolevulinato sintasa (127 pb), microglobulina -2 (174 pb) e hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (181 pb).

El ADN se hibridó con las perlas siguiendo el procedimiento del Ejemplo 5. A continuación se emulsificaron las perlas, se irradiaron y se sometieron a amplificación mediante PCR tal como se describe de manera general en el Ejemplo 5. Tras completarse la reacción de PCR, se recuperaron las perlas emulsificadas tal como se describe en el Ejemplo 5. Las perlas lavadas seguidamente se sometieron a tratamiento de endonucleasa de restricción (aproximadamente 5 U) durante 2 h a 37ºC. Tras la centrifugación de las perlas, el sobrenadante se analizó para productos de PCR específicos (fig. 9B) utilizando un chip cromatográfico de fluidos (Bioanalizador 2100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

Se muestran los resultados en la fig. 9b. Nuevamente, se obtuvieron claramente 3 picos diferentes, que representan los tamaños de fragmentos que corresponden a los tamaños de fragmentos que son los teóricamente esperados amplicones de 127 pb, 174 pb y 181 pb. De esta manera, los resultados demuestran claramente que la presente invención resulta altamente valiosa para las aplicaciones multiplex en solución, así como en forma de PCR en emulsión.

Ejemplo 8:

Secuenciación de ácidos nucleicos utilizando PCR en emulsión de perlas fotoactivadas monoplex

Se llevó a cabo el experimento siguiente para someter a ensayo la detección específica de una secuencia diana obtenida tras PCR en emulsión de perlas utilizando un sistema de secuenciación de alto rendimiento basado en la secuenciación de pirofosfato (Margulies M. et al., Nature 437:376-80, 2005).

Para este protocolo se unieron covalentemente 0,4x106 perlas de sefarosa, con un diámetro medio de entre 25 y 35 mm, a sondas oligonucleótidas estacionarias y fotocortables (ID de secuencia nº 2 y nº 3). Estas perlas se mezclaron con 4 pg de un amplicón artificial de 239 pb. El amplicón incluía una secuencia que era complementaria a los oligonucleótidos sobre las perlas.

Se hibridó el amplicón con las perlas, se emulsificó, se irradió y se amplificó mediante PCR utilizando el procedimiento en el Ejemplo 5. Tras completarse la reacción de PCR, se recuperaron las perlas emulsificadas tal como se describe en el Ejemplo 5. El ADN sobre las perlas lavadas se separó en cadenas sencillas y se hibridó el cebador de secuenciación siguiendo las instrucciones del fabricante (manual de usuario del kit GS emPCR, Roche/454-Life Sciences, Branford, CT, USA). A continuación, se secuenciaron simultáneamente 250.000 perlas mediante secuenciación de pirofosfato utilizando el secuenciador genómico FLX de Roche/454-Life Sciences (Branford, CT, USA). El procesamiento de los datos utilizando el software GS Amplicon Variant Analyzer confirmó la detección exclusiva del amplicón indicado.

Ejemplo 9:

Secuenciación de ácidos nucleicos utilizando PCR en emulsión de perlas fotoactivadas multiplex

Se llevó a cabo el experimento siguiente para someter a ensayo la detección y descodificación simultáneas de secuencias diana obtenidas tras PCR en emulsión de perlas multiplexada utilizando un sistema de secuenciación de alto rendimiento basado en la secuenciación de pirofosfato (Margulies M. et al., Nature 437:376-80, 2005).

Para este protocolo, se utilizó un conjunto de perlas diferentes, con un diámetro medio de entre 25 y 35 mm, mientras que cada tipo de perla se unió covalentemente a sondas oligonucleótidas estacionarias y fotocortables específicas para los genes aminolevulinato sintasa, microglobulina -2 e hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (ID de secuencia nº 4, nº 5, nº 6, nº 7, nº 8 y nº 9). Se mezclaron 0,6x106 perlas, 0,2x106 perlas de cada tipo de perla, con amplicones (aproximadamente 0,5 pg de cada uno) de los genes aminolevulinato sintasa (127 pb), microglobulina -2 (174 pb) e hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (181 pb). Los amplicones se hibridaron con las perlas, se emulsificaron, se irradiaron y se amplificaron mediante PCR utilizando el procedimiento del Ejemplo 5. Tras completarse la reacción de PCR, las perlas emulsificadas se recuperaron tal como se describe en el Ejemplo 5.

El ADN sobre las perlas lavadas se separó en cadenas sencillas y el cebador se secuenciación se hibridó siguiendo las instrucciones del fabricante (manual de usuario del kit GS emPCR, Roche/454-Life Sciences, Branford, CT, USA). A continuación, se secuenciaron simultáneamente 250.000 perlas mediante secuenciación de pirofosfato utilizando el secuenciador genómico FLX de Roche/454-Life Sciences (Branford, CT, USA). El procesamiento de los datos utilizando el software GS Amplicon Variant Analyzer confirmó la detección simultánea de una mezcla de diferentes amplicones.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG

<120> Perlas para el análisis de ácidos nucleicos de alto rendimiento

<130> 25935 FT

<150> EP09002628

<151> 2009-02-25

<160> 11

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN de cadena sencilla

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN de cadena sencilla

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN de cadena sencilla

<400> 3

<210> 4

<211> 45

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN de cadena sencilla

<400> 4 <210> 5

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN de cadena sencilla

<400> 5

<210> 6

<211> 42

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN de cadena sencilla

<400> 6

<210> 7

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN de cadena sencilla

<400> 7

<210> 8

<211> 46

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN de cadena sencilla

<400> 8

<210> 9

<211> 40

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN de cadena sencilla

<400> 9

<210> 10

<211> 38

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN de cadena sencilla

<400> 10

<210> 11

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN de cadena sencilla

<400> 11

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Perla que comprende por lo menos dos cebadores de amplificación específicos de secuencia, en la que un cebador se encuentra unido a dicha perla con un conector cortable inducible mediante la reacción entre un grupo amino funcional de dicho cebador y una fracción carboxi-funcional de dicha perla, y en la que dicho cebador comprende además una etiqueta detectable.
2.

Perla según la reivindicación 1, en la que dicha perla está compuesta de un material seleccionado de entre el grupo que consiste de silicio, dióxido de titanio, óxido de aluminio, óxido de lantánido, vidrio, silicatos, poliestireno, celulosa, sefarosa y poliamida.
3.

Perla según la reivindicación 2, en la que dicho conector cortable es un conector fotocortable.
4.

Biblioteca de perlas según las reivindicaciones 1 a 3.
5.

Biblioteca según la reivindicación 4, caracterizada porque cada elemento de la pluralidad de cebadores que se encuentran unidos a la perla mediante un conector cortable porta una etiqueta detectable diferente.
6.

Método para preparar una perla según las reivindicaciones 1 a 3, que comprende:

-

proporcionar una perla que porta por lo menos un grupo funcional, y

-

hacer reaccionar dicho grupo o grupos funcionales con el grupo o grupos reactivos de dos cebadores específicos de secuencia, en los que una fracción reactiva cortable se encuentra presente en uno de los espaciadores que conecta dicho soporte sólido con su grupo funcional o se encuentra presente uno de sus grupos funcionales o dicha fracción cortable dentro de uno de los espaciadores que conecta uno de dichos cebadores específicos de secuencia con su grupo reactivo.
7. Método según la reivindicación 6, que comprende:

-

proporcionar una perla que comprende dos grupos funcionales, portando cada uno, un grupo protector diferente,

-

desproteger un primer grupo funcional y hacer reaccionar dicho grupo con el grupo reactivo de un primer cebador,

-

desproteger el segundo grupo funcional y hacer reaccionar dicho grupo de dicha perla con el grupo reactivo de un segundo cebador.
8.

Método según la reivindicación 7, en el que dichos dos grupos funcionales se encuentran conectados a la perla mediante un conector de dos brazos.
9.

Método según la reivindicación 6, que comprende:

-

proporcionar una perla que porta exactamente un grupo funcional,

-

desproteger dicho grupo funcional y hacer reaccionar dicho grupo con una mezcla de un primer y un segundo cebadores específicos de secuencia, comprendiendo dichos primer y segundo cebadores, grupos reactivos idénticos, caracterizado porque uno de dichos cebadores se conecta con su grupo reactivo mediante una fracción cortable.
10. Método según la reivindicación 6, que comprende:

-

proporcionar una perla que porta exactamente un grupo funcional,- desproteger dicho grupo funcional y hacer reaccionar dicho grupo con un oligonucleótido que representa un primer y un segundo cebadores de amplificación que se encuentran conectados mediante una fracción cortable.