KR100828714B1 - 리보핵산을 이용한 멀티플렉스 증폭방법 - Google Patents

Abstract

5' 말단의 바이오틴과 프라이머 서열 사이에 리보핵산이 포함된 2종 이상의 프라이머 세트를 스트렙트아비딘이 커플링된 비드와 접촉시켜 프라이머를 비드에 고정화시키는 단계; 상기 비드에 고정화된 프라이머를 주형을 포함하는 PCR 반응 완충액에 첨가하는 단계; 오일에 상기 혼합물을 적가하여 에멀션을 형성하는 단계; 및 상기 형성된 에멀션을 PCR 하는 단계를 포함하는 멀티플렉스(multiplex) PCR 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 보다 용이하고 효율적이고 편리하게 멀티플렉스 핵산 증폭반응을 수행할 수 있어, 유전자의 진단 및 연구 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

멀티플렉스 PCR, 비드, 프라이머, 에멀션

Description

리보핵산을 이용한 멀티플렉스 증폭방법{A method for multiplexing amplification using ribonucleotides}

도 1은 프라이머가 결합된 비드와 증폭 반응액-미네랄오일 에멀션을 이용한 멀티플렉스 반응을 수행하는 개략도이다.

도 2는 특정 조건에서 비드와 프라이머가 결합되고 유리됨을 나타내는 전기영동 사진이다.

도 3은 프라이머에 결합된 비드를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.

도 4는 기름-물 에멀션에 갇힌 비드를 광학 현미경을 이용해 관찰한 사진이다.

도 5는 물-기름 에멀션과 프라이머가 결합된 비드를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.

중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR)의 발명을 통해 시험관내에서 핵산을 증폭하는 일이 가능해졌다(USP 4683195; 4683202; 4965188; Saiki et al., 1985, Science 230:1350-1354; Mullis et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273).

위에서 기술된 원천 논문을 기초로 프라이머를 이용하는 핵산의 증폭 방법이 개발되었는데, 여기에는 리가제 연쇄 반응(Ligase chain reaction, Wu and Wallace, 1989, Genomics 4:560-569), 중합효소 리가제 연쇄반응(polymerase ligase chain reaction, Barany, 1991, PCR Methods and Applic. 1: 5-16); Gap LCR (WO9001069), Repair Chain reaction (EP 439182 A2); Strand displacement amplification(USP 5455166) 등이 있다.

일반적으로 위와 같은 핵산 증폭을 통한 진단이나 특정 유전자의 검색 기법은 한번에 하나의 주형을 검색한다는 점에서 한계를 가진다. 여러 개의 주형을 증폭해야 하는 상황에서 각각의 주형을 한번에 하나씩 증폭하는 것은 번거롭고 시간을 많이 소비하는 작업이다. 예를 들면 같은 환자에게 같은 증상이 발생할 지라도 발병의 원인이 여러 종류의 감염성 병원체에 의한 경우가 많아서 다양한 병원체의 진단이 개별적으로 필요하게 된다. 또한 암이나 유전적인 결함 등은 여러 유전자의 복합적인 변이에 기인한다고 알려져 있다. 유전자 다형성(polymorphim)이나 돌연변이(mutation)는 다양한 유전자의 좌위(loci)변화에 기인하여 추가적인 접합체(zygote)의 검사가 필요하다. 일반적인 환경에서 제한된 시료에서 추출할 수 있는 핵산의 양은 유한하므로, 제한된 양의 핵산을 이용하여 핵산 증폭을 통한 반복적인 진단이 불가능할 경우가 자주 발생한다. 이런 이유로 같은 시료로부터 동시에 많은 주형의 핵산을 분석하는 기법이 필요하고, 이런 분석기법을 멀티플렉스 반응 (multiplex reaction)이라고 한다.

1998년에 챔버린(Chamberlain et al., Nucleic Acid Research, 16:11141-11156 (1998))등은 최초로 인간 디스트로핀(dystrophin) 유전자를 이용하여 멀티플렉스 반응을 수행하였고, 이 후 Caskey 등이나 Wu 등에 의해서 유전질환이나 감염성 질환에 대해서도 멀티플렉스 반응이 진행되었다(Caskey, et al., EP 364225 A3, USP 5582989, Wu, et al., USP 5612473). 이런 종류의 멀티플렉스 증폭반응을 원활히 수행하기 위해서는 매우 세심한 프라이머 디자인과 반복실험을 통한 적절한 조건이 필요한데, 이것은 많은 비용 문제가 발생한다.

이러한 문제점의 원인은 첫째 "우선증폭(preferential amplification)"이라고 할 수 있다. 만일 여러 개의 프라이머 세트 중 하나의 세트가 약간이라도 증폭효율이 좋다면 PCR 반응의 지수성장적 반응 특성상 한쪽으로 반응물이 치우치게(biased) 되고, 결과적으로 나머지 세트의 증폭이 거의 일어나지 않는 결과를 초래한다. 이 문제는 모든 프라이머의 길이, G+C 함량을 비슷하게 조절하고, 증폭 효율이 떨어지는 세트의 프라이머 농도 등을 높게 조절하면 일부 문제가 해결되기도 한다. 또한 Wu 등은 우선 증폭을 억제하기 위해 프라이머에 이노신(Inosine)을 첨가하여 증폭 효율을 고르게 하였고 (Wu et al., USP 5738995), Shubber 등은 프라이머의 3' 말단은 상보서열을 이용하고, 5' 말단은 일반서열(universal sequence)를 이용하여 서로 다른 효율의 증폭 세트를 표준화(normalization)하였다(Shubber et al., Genome Research, 5:488-493(1995)).

두번째는 프라이머간에서 일어나는 반응이다. 이런 문제점을 해결하기 위해 서는 프라이머 디자인시 BLAST 검색이나 PRIMER3 등의 전문 프라이머 디자인 프로그램을 이용하면 가능하지만, 많은 프라이머를 이용할 때는 양상이 매우 복잡해지며 프라이머의 선택성에 많은 제한을 받는다. 또한 아무리 주의 깊게 프라이머를 디자인하고 선택할 지라도 실제 실험에선 많은 위양성(false positive)이나 위음성(false negative)의 문제가 발생한다. 프라이머가 기초가 되는 핵산의 증폭 방법은 프라이머 혼성화의 특수성 (specificity of primer hybridization)과 밀접한 관련이 있다. 각각의 증폭법에서 엄격한 조건(stringent condition)이라 할 수 있는 특정하게 높아진 온도에서 특정 프라이머는 특정 주형에만 혼성화가 되지만, 비교적 덜 엄격한 조건인 상온에서 조합된 반응물의 경우는 프라이머의 혼성화 특수성이 매우 낮아지므로 프라이머는 일부만 특별한 주형에 결합하고 일부는 특별하지 않은 주형에 결합하거나, 다른 프라이머에 결합하여 원치 않는 반응물을 생성하게 된다. 이런 비특이적 프라이머의 결합 및 연장반응은 원하던 주형과의 결합 및 연장과 경쟁에서 우위를 점하게 되고 이것은 전체적인 PCR 반응의 효율을 떨어뜨리는 원인이 된다. 이런 비특이적 증폭 중 가장 자주 발생하는 형태는 프라이머 이합체(primer dimer)이다. 프라이머 이합체의 크기는 대략 두개의 프라이머의 길이의 합과 비슷하고, 하나의 프라이머가 다른 프라이머를 주형으로 연장될 때 발생한다. 그 결과로 생성된 프라이머 이합체는 원래 계획했던 주형에 비해 짧은 길이와 높은 농도를 가지고 있어 더 좋은 주형이 되므로 더 효과적으로 증폭되어 전체 PCR 반응의 효율을 저해한다.

비특이적 증폭은 전체 PCR 반응의 시작 시에 프라이머 이합체의 결합을 억제 하면 극복가능하다. 하나의 방법으로 핫-스타트 기법(hot-start protocol)이 있는데, 이것은 하나 이상의 반응물을 반응액의 반응 온도가 충분히 엄격한 온도에 도달하기 전까지 물리 화학적인 방법으로 반응에 참가하지 못하게 하여 프라이머의 이합체 증폭을 억제하는 방법이다. 일반적인 핫-스타트 기법은 반응액의 온도가 높아졌을 때 반응기의 덮개를 열어서 하나 이상의 빠진 반응물을 추가하는 방식으로 진행되는데, 이는 매우 노동집약적이며 반응물의 오염 위험이 존재한다. 이에 대한 대안으로 왁스와 같은 열 감수성 물질을 이용하여 반응물의 특정 성분 중 하나를 상온에서는 고체상 왁스에 가두어 반응액에서 분리하고, 높은 온도에서는 왁스를 액화시켜 왁스는 반응액의 상부로 떠오르고 왁스에 의해 반응에 참가하지 못했던 성분은 섞이도록 하는 방식이 있다(USP 5412876).

다른 방법으로는 특정한 화합물을 열 가역성 공유결합으로 DNA 중합효소에 수식하여 상온에서 DNA 중합효소의 활성을 억제하는 방법이다. 활성이 억제된 DNA 중합효소는 높은 온도에서 공유 결합된 수식기가 떨어져 나가면서 활성화된 DNA 중합효소로 전환된다 (USP 5773258, 5677152).

비공유적인 수식을 통한 방법으로는 DNA 중합효소에 특이적인 항체를 이용하는 방법이 있다. 이 역시 상온에서는 항체가 중합효소에 비공유적으로 결합하여 중합반응을 억제하고, 고온에서는 항체가 변형되고 중합효소는 활성을 유지하여 중합효소의 중합반응이 고온에서만 시작되도록 하는 방식이다(USP 5338671).

위의 두 가지 방법과는 달리 DNA 중합효소를 수식하지 않고, 프라이머의 말단을 수식하는 방법도 있다. Tomas가 USP 6509157 B1에 소개한 바와 같이 프라이 머의 3' 말단을 트리아릴메틸기로 수식하여 열을 가하였을 때만 프라이머의 연장반응이 진행될 수 있도록 한다.

USP 5418149에서는 우라실(dUTP) 염기와 우라실 가수 분해효소(UDG)를 이용하여 비특이적 증폭을 억제하였다. 우라실과 우라실 가수 분해효소가 첨가된 PCR 반응에서 상온에서 이루어진 비특이적 증폭 산물은 45-60도 정도의 온도에서 우라실 가수분해효소에 의해 분해된다. 이 방법은 비특이적 증폭산물이 생성되는 반응과 이것이 분해되는 반응이 서로 경쟁하게 되어 비특이적 증폭산물이 완전히 제거되지 않게 되는 단점이 있다.

제한된 시료를 이용하여 여러 번의 PCR을 수행할 때 문제가 되는 점은 충분한 주형의 확보를 위해 Jeffery등은 소량의 주형을 고체상의 마이크로웰(micro-well)에 고정하여 여러 번의 반복적인 PCR을 수행할 수 있는 시스템을 개발하기도 하였다(USP 6605451).

이와는 다른 개념으로 Dressman 등(Dressman et al., PNAS, l00(15): 8817-8822, 2003)은 프라이머를 고체상 비드(bead)에 고정하고 각각의 비드를 물과 기름의 에멀션(emulsion)에 따로 독립시켜 PCR을 수행하는 기법을 소개하였으나, 본 발명의 리보핵산을 이용하여 에멀션 내에서 고정된 프라이머의 유리를 증진시킨 기재는 없다.

본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 멀티플렉스 증폭 방법을 연구하던 중, 5' 말단의 바이오틴과 프라이머 서열 사이에 리보핵산을 포함함으로써 고정화된 프라이머가 에멀션 내에서 용이하게 유리되어 멀티플렉스 PCR 이 효율적으로 수행될 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 멀티플렉스 PCR 효율이 증가된 5' 말단의 바이오틴과 프라이머 서열 사이에 리보핵산이 포함된 2종 이상의 프라이머 세트를 스트렙트아비딘이 커플링된 비드와 접촉시켜 프라이머를 비드에 고정화시키는 단계; 상기 비드에 고정화된 프라이머를 주형을 포함하는 PCR 반응 완충액에 첨가하는 단계; 오일에 상기 혼합물을 적가하여 에멀션을 형성하는 단계; 및 상기 형성된 에멀션을 PCR 하는 단계를 포함하는 멀티플렉스(multiplex) PCR 방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

5' 말단의 바이오틴과 프라이머 서열 사이에 리보핵산이 포함된 2종 이상의 프라이머 세트를 스트렙트아비딘이 커플링된 비드와 접촉시켜 프라이머를 비드에 고정화시키는 단계;

상기 비드에 고정화된 프라이머를 주형을 포함하는 PCR 반응 완충액에 첨가하는 단계;

오일에 상기 혼합물을 적가하여 에멀션을 형성하는 단계; 및

상기 형성된 에멀션을 PCR 하는 단계를 포함하는 멀티플렉스(multiplex) PCR 방법을 제공한다.

본 발명은 하나의 시험관 내에서 멀티플렉스 반응을 통한 핵산의 증폭시 발생하는 프라이머의 비특이적 결합 및 증폭을 억제하고자 하나의 시험관 내에서 이 루어지는 각각 세트의 반응을 비드와 물과 에멀션 시스템을 이용하여 물리적으로 분리하여 핵산을 증폭하는 방법을 제시한다.

도 1은 프라이머가 결합된 비드와 증폭 반응액-미네랄오일 에멀션을 이용한 멀티플렉스 반응을 수행하는 개략도이다. 본 발명에서는 멀티플렉스 PCR을 수행하기 위하여 스트렙트아비딘이 수식(modification)되어 있는 직경 1㎛ 정도의 작은 비드에 5' 말단이 바이오틴으로 수식되어 있고 리보핵산을 포함하는 프라이머를 고정화하고 이를 프라이머로 이용하여 PCR 반응액을 완성하였다. 여기에서, 리보핵산은 RNA가 높은 pH와 높은 온도에서 자가 절단(self cleavage)하는 성질을 이용하여 PCR 반응액의 약알칼리성의 pH와 PCR 개시 온도인 94℃에서 프라이머들이 비드로부터 보다 용이하게 유리되도록 하기 위한 것이다. 리보핵산은 프라이머의 5' 말단에 위치한 바이오틴과 프라이머 서열 사이에 위치한다. 한 세트의 프라이머는 동일한 비드에 고정화가 되고, 서로 다른 세트의 프라이머들은 서로 다른 비드에 고정화된다. 본 발명에서는 스트렙트아비딘이 수식되어 있는 비드에 고정화된 프라이머들이 PCR 반응액의 pH9 완충액 조건과 개시 온도인 94℃ 5분 조건에서 비드로부터 유리됨을 확인하였다. 첫번째 대조실험으로 리보핵산을 포함하지 않고 5' 말단에 바이오틴이 수식되어 있는 프라이머 역시 비드에 고정화가 되고, PCR 반응액의 pH9 완충액 조건과 개시 온도인 94℃ 5분 조건에서 유리됨을 확인하였으나, 리보핵산을 포함하는 프라이머에 비해 낮은 효율로 유리되었다. 두번째 대조군으로 리보핵산을 포함하지 않고, 5' 말단에 바이오틴이 수식되어 있지 않은 프라이머의 경우에는 스트렙트아비딘이 수식되어 있는 비드에 흡착 등의 예상할 수 없는 구조 로 결합하지 않는다는 사실을 확인하였다.

상기에서 확인된 사실을 이용하여 한 세트의 프라이머가 고정화된 비드를 일반적인 PCR에서의 프라이머처럼 PCR 반응액에 첨가하고 PCR을 수행하였다. 이는 앞서 확인한 바와 같이 높은 pH와 높은 온도에서 비드로부터 유리된 프라이머가 일반적인 프라이머처럼 PCR에 순조롭게 참여하여 일반적인 PCR과 같은 결과를 도출하는지를 알아보기 위함이다. 여러 종류의 프라이머 세트에 대해 검사한 결과 모두 순조롭게 PCR에 참여하여 DNA를 증폭함을 확인하였다.

본 발명에서는 위의 결과를 바탕으로 배경 기술에서 서술한 멀티플렉스 PCR의 여러가지 단점 중 가장 문제가 된다고 여겨지는 프라이머들의 비특이적 증폭을 억제할 수 있는 방법을 물과 기름의 에멀션 시스템을 이용하였다. 프라이머들의 비특이적 증폭을 억제하기 위해 프라이머가 고정된 하나의 비드를 하나의 에멀션에 물리적으로 분리하고 PCR을 수행한 후 모두를 다시 섞어서 분석한다면 앞서 기술된 문제점이 해결되리라 예상한다.

일반적인 PCR 반응액에 프라이머 대신 프라이머가 고정된 비드를 넣고, PCR 반응액 부피의 두배가 되는 미네랄오일과 소량의 계면 활성제를 넣고, 자석막대를 이용하여 에멀션이 생성될 수 있도록 빠른 속도로 혼합하였다. 이 단계에서 만들어진 물-미네랄오일 에멀션을 광학 현미경으로 관찰한 결과 대부분의 경우 에멀션 하나에 비드가 하나가 들어 있는 모습이 관찰되었다. 이 후 PCR 반응을 수행하고 물-기름 에멀션을 에테르를 이용하여 기름을 추출하여 에멀션을 해체하고 PCR 반응액을 아가로스 겔 전기영동법으로 멀티플렉스 PCR 산물을 분석하였다. 이에 대한 대 조군으로 같은 PCR 반응액을 에멀션을 이용하지 않고 반응하거나 비드를 이용하지 않고 에멀션만 이용하여 PCR을 수행하거나 에멀션과 비드 모두를 이용하지 않고, PCR을 진행하여 PCR 수행 가능 여부를 조사한 결과, 위의 3가지 대조군과 1가지 실험군 모두에서 반응산물이 생성됨을 확인하였다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 PCR 반응액의 pH는 약알칼리성인 것이 바람직하다. 프라이머의 5' 말단의 바이오틴에 인접한 리보핵산은 약알칼리의 pH 및 고온에서 자가 절단되므로, 프라이머가 비드에 고정되고, 에멀션 형성에 의해 프라이머 세트가 에멀션 내에 위치하여 PCR을 수행하기 위해서는 프라이머가 비드로부터 유리되어야 한다. 따라서, 상기 리보핵산은 약알칼리의 pH 및 고온, 예를 들면, 94℃의 조건에서 자가 절단되어 비드로부터 유리되므로, 일반 PCR 처럼 용액 속에 유리된 상태의 프라이머가 되어 PCR을 효율적으로 수행할 수 있는 것이다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 비드에 고정화된 프라이머는 PCR 반응의 시작 또는 반응 중간에 유리될 수 있다. 상기 비드에 고정화된 프라이머는 약알칼리의 pH 및 고온 조건에서 유리될 수 있는데, 상기 조건은 PCR 반응의 초기 조건에 해당되어 초기에 고정화된 비드는 유리될 수 있는 것이다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 하나의 에멀션은 하나의 프라이머 세트를 포함하도록 상기 비드와 오일의 양을 조절할 수 있다. 본 발명의 목적이 여러 종류의 프라이머 세트를 이용하여 한 번의 반응으로 여러 종류의 PCR 산물을 효율적으로 증폭하는 것이므로, 가능하면 다른 프라이머 세트의 영향을 받지 않고 PCR을 하는 것이 바람직하다. 따라서, 하나의 에멀션은 하나의 프라이머 세트를 포함하면, 하나의 에멀션 내에서 한 세트의 프라이머만이 PCR에 관여하므로, 다른 프라이머 세트의 영향을 받지 않고, 효율적으로 증폭이 수행될 수 있다. 그리하여, 비드와 오일의 양을 조절함으로써 하나의 에멀션에 하나의 프라이머 세트를 포함하도록 하는 것이 바람직한 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 특정조건에서 프라이머와 비드의 결합 및 유리 확인

DYNAL BIOTECH 사에서 판매하는 Dynalbeads MyOne 스트렙트아비딘(cat No. 650.01) 10㎕(10mg/mL) 를 100㎕의 1X B&W 완충액(5mM Tris-Cl, 0.5mM EDTA, 1M NaCl, pH7.5)에 3번 세정한다. 이때 비드의 회수는 충분한 크기의 네오다이뮴 자석을 이용한다. 이 후 1X B&W 완충액에 최종농도 100pmole/㎕로 녹인 프라이머를 7㎕ 넣고 최종 부피가 50㎕가 되도록 1X B&W 완충액으로 채운후 상온에서 30분간 보관한다. 여기서 첫번째로 10㎕를 샘플링한다. 이후 1X B&W 완충액 50㎕로 3번 세정한 후 비드를 1X PCR 반응 완충액(100 mM Tris-HCl, 400 mM KCl, 15 mM MgCl₂, pH 9.0) 50㎕에 희석한 후 상온에서 10분간 보관하고, 두번째로 10㎕를 샘플링한다. 이 후 남은 용액을 94℃에서 30분간 보관하고 세번째로 10㎕를 샘플링한다. 이 실험에 이용한 프라이머는 아래와 같은 서열로 구성되어 있으며 두 개의 대조군도 함께 제시한다.

실험군 프라이머: 5'-바이오틴-UATGATTAGGCAGAGGTGAAA(서열번호 1)

대조군 프라이머 1: 5'-바이오틴-TATGATTAGGCAGAGGTGAAA(서열번호 2)

대조군 프라이머 2: 5'-OH-TATGATTAGGCAGAGGTGAAA(서열번호 2)

실험군 프라이머는 5' 말단이 바이오틴으로 수식되어 있으며, 5' 끝은 리보핵산인 U로 치환되어 있다. 대조군 프라이머 1은 실험군 프라이머에서 U대신 데옥시 리보핵산인 T로 치환되어 있으며, 대조군 프라이머 2는 5' 말단의 수식이 없이 히드록실기가 노출되어 있고, 마지막은 데옥시 리보핵산으로 구성되어 있다.

이 실험에서 얻어진 3개의 샘플을 20% 비변성 PAGE에서 분석하였다. 도 2는 특정 조건에서 비드와 프라이머가 결합되고 유리됨을 나타내는 전기영동 사진이다. 도 2에서, RB는 바이오틴과 리보핵산이 포함된 프라이머를 나타내며, B는 리보핵산 없이 바이오틴만 포함된 프라이머를 나타내며, C는 리보핵산 및 바이오틴 모두 없는 프라이머를 나타낸다. 또한, 숫자 1, 2 및 3은 상기에서 샘플링한 순서를 나타낸다.

도 2에서 보여주는 바와 같이, 각 시료의 1번에서 관찰되는 밴드는 과량의 프라이머를 도입함으로 인해 결합되지 않고 유리되는 것을 나타내며, C1의 밴드가 RB1 및 B1보다 더 아래 쪽에 위치한 이유는 C1에는 바이오틴이 포함되지 않기 때문에 바이오틴이 포함된 RB1 및 B1보다 분자량이 작아서 더 빨리 이동하였기 때문이다. 각 시료의 2번은 1X PCR 반응 완충액(100 mM Tris-HCl, 400 mM KCl, 15 mM MgCl₂, pH 9.0) 50㎕에 희석한 후 상온에서 10분간 보관한 후의 결과이므로, 고온 조건 없이 pH9.0의 조건인 1X PCR 반응 완충액 중에는 프라이머가 유리되지 않아 밴드가 관찰되지 않음을 알 수 있다. 반면에, 각 시료의 3번은 상기 2번 시료를 94℃에서 5분간 보관한 후 시료를 샘플링한 것이므로, 고온 조건 및 pH9.0의 조건에 모두 해당되어 RB3 및 B3 시료에서 모두 프라이머가 유리되어 밴드를 관찰할 수 있었다. 반면, C3 시료에서는 밴드가 관찰되지 않았는데, 이는 상기 시료는 초기에 프라이머가 비드에 전혀 결합이 되지 않았기 때문에 유리 조건에서도 밴드가 관찰되지 않는 것이다. 또한, RB3 시료의 밴드가 B3 시료의 밴드보다 진하다는 것을 알 수 있는데, 이는 고온 조건 및 pH9.0의 조건에서 리보핵산이 포함된 RB3 시료가 리보핵산이 포함되지 않은 B3 시료보다 더욱 효율적으로 유리됨을 알 수 있는 것이다. 따라서, 리보핵산의 존재는 비드에 고정화된 프라이머의 유리를 효율적으로 증진시킨다는 것을 알 수 있는 것이다.

결국, 바이오틴과 리보핵산이 있는 프라이머의 경우 비드와의 결합 및 알칼리와 고온 조건에서 비드로부터의 유리가 가장 좋았고, 바이오틴만 수식되어 있는 경우에도 결합 후 알칼리와 고온 조건에서 비드로부터 일부가 유리되며, 바이오틴과 리보핵산이 없는 대조군의 경우에는 비드에 전혀 결합되지 않음을 알 수 있었다.

실시예 2 : 프라이머가 결합된 비드를 이용한 PCR

상기 실시예 1에서 만들어진 프라이머 비드 결합체를 실제 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하였다. 반응 용액은 다음과 같다.

	일반 PCR	비드 PCR
주형	200ng	200ng
프라이머	각각 0.2μM	비드 2㎍
dNTPs	각각 0.25mM	각각 0.25mM
MgCl2	0.2mM	0.2mM
Taq DNA 중합효소	1 유닛	1 유닛
10×반응 완충액	2㎕	2㎕
총	20㎕	20㎕

다음과 같은 조건에서 PCR 반응을 수행하였다(이하 PCR 조건은 동일하다).

예비변성		사이클링		최종 신장
온도	시간	온도	시간	온도	시간
94℃	5분	94℃	30초	72℃	10분
		55℃	30초
		72℃	30초
1회		30회 반복		1회

이용된 프라이머들은 다음과 같다.

100bp HBV 정방향: 5'-바이오틴-UATGATTAGGCAGAGGTGAAA(서열번호 1)

100bp HBV 역방향: 5'-바이오틴-UGGGGAGGAGATTAGGTTAAA(서열번호 3)

150bp HPV 정방향: 5'-바이오틴-UGTTTAGGACAGGCATTTCA(서열번호 4)

150bp HPV 역방향: 5'-바이오틴-UTCATTATCATATGCCCACTGA(서열번호 5)

250bp HSV 정방향: 5'-바이오틴-UAATCAACGAGGTCTTGGAC(서열번호 6)

250bp HSV 역방향: 5'-바이오틴-UTCACCTCCCAGTAGTACGTC(서열번호 7)

도 3은 프라이머에 결합된 비드를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다. 도 3에서, B는 비드에 부착된 프라이머를 나타내며, C는 유리 프라이머를 나타낸다. 도 3에 보여주는 바와 같이, 3 종류 프라이머가 결합된 비드를 이용한 PCR 결과물은 일반 PCR을 하였을 때와 비슷한 결과를 도출하였음을 알 수 있었다.

실시예 3 : 에멀션에 갇힌 프라이머가 결합된 비드의 관찰

멀티플렉스 PCR시 프라이머의 비특이적 증폭을 억제하기 위해서 본 발명에서는 물-미네랄 오일 에멀션을 이용하여 하나의 비드를 하나의 에멀션에 따로 물리적으로 분리하여 프라이머의 비특이적 증폭을 억제하였다. 이를 위해서 다음과 같은 조성으로 반응물을 준비한 후 2mL 둥근바닥 유리 바이알(No.430661, Corning)에 미세 자석 막대(no. 58948-353, VWR scientific)을 이용하여 자석 교반기(no. 565, VWR scientific)에서 1400rpm으로 30분간 교반하여 제작하였고, 이중 1㎕용액을 500배 광학 현미경으로 에멀션에 갇힌 프라이머가 결합된 비드를 관찰하였다. 도 4는 기름-물 에멀션에 갇힌 비드를 광학 현미경을 이용해 관찰한 사진이다. 도 4에서 보여주는 바와 같이, 하나의 에멀션에 한 세트의 프라이머가 결합된 비드가 갇혀 있음을 확인할 수 있었다.

미네랄 오일 층		PCR 반응액 층
Span80	4.5%	주형	각각 2㎍
Tween80	1.6%	dNTPs	각각 0.25mM
Triton X-100	0.2%	10×완충액	1×
		비드	각각 20㎍
		MgCl2	2mM
		Taq DNA 중합효소	40 유닛
미네랄 오일	400㎕로 맞춤	증류수	200㎕로 맞춤

여기에 이용된 프라이머의 서열은 다음과 같다.

100bp HBV 정방향: 5'-바이오틴-UATGATTAGGCAGAGGTGAAA(서열번호 1)

100bp HBV 역방향: 5'-바이오틴-UGGGGAGGAGATTAGGTTAAA(서열번호 3)

150bp HPV 정방향: 5'-바이오틴-UGTTTAGGACAGGCATTTCA(서열번호 4)

150bp HPV 역방향: 5'-바이오틴-UTCATTATCATATGCCCACTGA(서열번호 5)

실시예 4 : 2-plex PCR

상기 실시예 3에서 만들어진 물-미네랄오일 PCR 반응액을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응을 수행하고 물-기름 에멀션을 디에틸에테르를 이용하여 기름을 추출하여 에멀션을 해체하고 PCR 반응액을 아가로스 겔 전기영동법으로 멀티플렉스 PCR 산물을 분석하였다. 이에 대한 대조군으로 같은 PCR 반응액을 에멀션을 이용하지 않고 반응하거나 비드를 이용하지 않고 에멀션만 이용하여 PCR을 수행하거나 에멀션과 비드 모두를 이용하지 않고, PCR을 진행하여 PCR 수행 가능 여부를 조사하였다. 도 5는 물-기름 에멀션과 프라이머가 결합된 비드를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다. 도 5에서 보여주는 바와 같이, 위의 3가지 대조군과 1가지 실험군 모두에서 반응 산물이 생성됨을 확인하였다. 그러나, 에멀션과 비드 모두를 이용했을 경우에 PCR 산물이 가장 많이 생성됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면 멀티플렉스 PCR을 효율적으로 수행할 수 있는 것이다.

이상에서 설명하고 입증하였듯이, 물-에멀션오일 시스템과 프라이머가 결합된 비드를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행할 때 발생하는 문제점인 프라이머의 비 특이적 결합 및 증폭반응을 억제하는 방법을 제시하였고, 이것이 원활히 수행됨을 증명하였다. 본 발명에서 제시된 방법을 이용한다면 일반적인 멀티플렉스 PCR에서 수행하기 어려운 많은 수의 멀티플렉스 PCR을 효과적으로 수행할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

1. 5' 말단의 바이오틴과 프라이머 서열 사이에 우라실이 포함된 2종 이상의 프라이머 세트를 스트렙트아비딘이 커플링된 비드와 접촉시켜 프라이머를 비드에 고정화시키는 단계;

   상기 비드에 고정화된 프라이머를 주형을 포함하는 PCR 반응 완충액에 첨가하는 단계;

   오일에 상기 혼합물을 적가하여 에멀션을 형성하는 단계; 및

   상기 형성된 에멀션을 PCR 하는 단계를 포함하는 멀티플렉스(multiplex) PCR 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 PCR 반응액의 pH가 9인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 비드에 고정화된 프라이머는 PCR 반응의 시작 또는 반응 중간에 유리되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 프라이머가 고정화된 비드 20㎍을 포함하는 PCR 반응 완충액 200㎕에 상기 오일 400㎕를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.

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