JPH08154679A - 遺伝子の変異を同定する方法およびその試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 非放射性標識を用いた、遺伝子の変異を同定
するＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析法において、非放射性標識物
質を増幅されたＤＮＡ配列へ簡便に付加する方法を提供
する。 【構成】 遺伝子（ゲノムＤＮＡ）をプライマーを用い
たポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）に
より増幅し、増幅されたＤＮＡ断片の３’末端に、標識
物質で修飾されたダイデオキシヌクレオチド誘導体をタ
ーミナルトランスフェラーゼの存在下に結合させた後、
ＤＮＡ断片を分離し、分離されたＤＮＡ断片の標識物質
を測定することにより、ゲノムＤＮＡの塩基配列の差異
を分離されたＤＮＡ断片の移動度の相違として検出する
方法およびそのための試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、非放射性標識を使用し
て遺伝子（ゲノムＤＮＡ）の変異を同定する方法、例え
ば遺伝子の突然変異や多型を検出する方法およびそのた
めの試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、ＤＮＡ塩基配列決定技術の進歩に
より、種々の生物について膨大な塩基配列データーが蓄
積されてきた。さらに耐熱性酵素を使用する核酸増幅法
であるポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣ
Ｒ）の出現により、既知の塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドをプライマーとして、生物中の特定の遺伝子を
迅速に、かつ解析可能な量まで増幅させることが可能に
なった。ＤＮＡ塩基配列決定法およびＰＣＲの２つの技
術の登場で、多数の個体間の配列を容易に比較検討する
ことが可能になり、生物学上の多くの疑問に答えること
ができるようになった。たとえば、正常細胞と癌細胞の
遺伝子の塩基配列を比較し検討し、配列が異なっている
箇所を見いだすことで、その遺伝子がコードしているタ
ンパク質の異常を見い出すことができ、癌発生や抑制の
メカニズムを解明することもできる。しかしながら、こ
れらの比較研究は多量の試料を取り扱う必要があるた
め、塩基配列の差異を検出する方法は、迅速かつ経済的
な方法が望ましい。その方法の１つとして、ピーシーア
ール エスエスシーピー（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ：ポリメラ
ーゼ チェイン リアクション シングル−ストランド
コンフォメーションポリモルフィズム、polymerase c
hain reaction-single strand conformation polymorph
ism ）分析法（Genomics, 5, 874-879, 1989年、「実験
医学」第９巻、第10号 (増刊) 第47〜50頁) が開発され
た。

【０００３】ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析法では、放射性物質
を標識したオリゴヌクレオチドであるプライマーあるい
は放射性物質を標識したデオキシヌクレオシド三燐酸を
用いたＰＣＲ法によって、対象とする塩基配列を増幅す
ると同時に放射性物質を標識する。次に得られたＰＣＲ
による増幅産物を変性して単鎖化した後、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法によって分離し、オートラジオグ
ラフィーを行い、放射性物質を検出する。塩基配列の差
異は、分離された単鎖のバンドの移動度の違いとして検
出される。このＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析法は、分子のゲル
電気泳動における移動度がその大きさと形によって左右
されることを応用したものである。非変性条件下におけ
る単鎖核酸は、折り畳まれた構造をとっており、これは
分子内相互作用、すなわちその塩基配列によって決定さ
れるため、変異の違いはそのまま折り畳み構造の違いと
なり移動度の違いとなって検出される。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来のＰＣＲ−ＳＳＣ
Ｐ分析法では、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により分離された単鎖バンドは、あらかじめ放射性物
質で標識されているため、分離後、ゲルをＸ線フィルム
と密着させることによりバンドとして検出される。この
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、多量のサンプルを一度に迅速か
つ経済的に処理できる点が特徴であるが、高感度検出の
ために放射性物質を使用するから、多量サンプルの処理
には必然的に取り扱う放射性物質の量も増大し、人体へ
の影響、廃棄物処理などの問題点が生じてくる。これら
の問題点を解消するために、標識物質として、放射性同
位元素を使用せず、非放射性標識物質を使用することが
考えられる。

【０００５】試料ＤＮＡを放射性同位元素を用いること
なく、ほぼ同等の感度で検出する方法は大きく２つの方
法に分けられる。一つは銀染色法であり、試料ＤＮＡを
アクリルアミドゲル電気泳動により分離し、分離ゲルを
直接、染色溶液に浸漬することで、アクリルアミドゲル
中のＤＮＡを染色しようというものである（Analytical
Biochemistry, 196, 433-438, 1991 年）。この手法
は、試料ＤＮＡを標識しない点で非常に優れているが、
試料ＤＮＡをゲル中に固定するため、分離後のＤＮＡの
生理活性が失われやすく、変異箇所の配列決定などその
後の検討に支障をきたしてしまう。

【０００６】もう一つの手法は放射性同位元素のかわり
に、人体への影響が少ない安全な標識物質または標識物
質と結合し得る物質（蛍光物質、ビオチン、ジコキゲニ
ン等）を試料ＤＮＡに結合させることにより検出する方
法である（Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 4045-4049, 1
983 年）。これらの方法のうち、蛍光物質で標識すれ
ば、試料ＤＮＡを電気的に検出することができる。すな
わち、ＰＣＲに用いるプライマーを蛍光標識しておき、
次にＰＣＲにより増幅された産物を変性することによっ
て単鎖化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によっ
て分離し、分離したゲルに励起光を照射し、発生する蛍
光を検出することができる。またビオチンあるいはジコ
キシゲニンで標識しておけば、免疫化学的な検出が可能
となる。すなわち、プライマーをこれらの物質で標識
し、ＰＣＲ後、ゲル電気泳動を行い、固相担体上に試料
ＤＮＡを移行させ、固相上でビオチンあるいはジコキシ
ゲニンを検出する。通常、ビオチンとアビジン、ジコキ
シゲニンと抗ジコキシゲニンなど抗原抗体反応が利用さ
れる。さらに酵素で標識するためには、あらかじめアル
カリホスファターゼ、ペルオキシターゼ、ガラクトシダ
ーゼなどの酵素をアビジン、もしくは抗ジコキシゲニン
と結合しておく。次いで標識と結合し得る物質、例えば
ビオチン、ジコキシゲニン等を結合している試料ＤＮＡ
を反応させる。最終的には、標識された酵素にこれらの
酵素の基質、たとえばアルカリホスファターゼの場合
は、１，２−ジオキセタン誘導体のリン酸塩、ブロモク
ロロインドリルリン酸塩などを加えることにより、試料
ＤＮＡを化学発光法や発色法により検出することができ
る。

【０００７】蛍光物質、ビオチン、ジコキゲニンなどの
非放射性標識物質を使用するＤＮＡの検出方法は、従来
から公知である放射性同位元素に代わる、ＤＮＡの高感
度検出法として知られている技術であり、この方法をＰ
ＣＲ−ＳＳＣＰ法に応用することは容易に考えられる。
しかし、ここでの問題点はこれら標識物質の標識方法で
ある。従来の技術では、プライマーの化学合成（各社か
ら販売されている自動ＤＮＡ合成機が用いられる）時
に、プライマーの任意の箇所に標識することができる。
しかし、この方法では試料ＤＮＡごとに標識されたプラ
イマーを用意するため、多量の試料ＤＮＡを解析する場
合には不利である。ＰＣＲ中に標識されたヌクレオチオ
ドと標識されていないヌクレオチドを混合しておき、標
識されたヌクレオチドを取り込ませることで標識するこ
とも可能である。しかし、この取り込みはランダムにお
こるため、最終的に得られるＰＣＲ産物の分子量は不確
定なもになる（放射性同位元素と異なり、ビオチンなど
の標識物質はそれ自体がヌクレオチドに近い分子量であ
るため）。そのため分子の大きさ、形で分離するＰＣＲ
−ＳＳＣＰ分析法には使用できない。本発明が解決しよ
うとする課題は、放射性同位元素を用いずに遺伝子の変
異を同定する方法において、遺伝子検出に必要な非放射
性標識物質と検出すべき配列への付加を簡便化すること
である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、遺伝
子（ゲノムＤＮＡ）をプライマーを用いたポリメラーゼ
・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）により増幅し、増
幅されたＤＮＡ断片の３’末端に、標識物質で修飾され
たヌクレオチド誘導体をターミナルトランスフェラーゼ
の存在下に結合させた後、ＤＮＡ断片を分離し、分離さ
れたＤＮＡ断片の標識物質を測定することにより、ゲノ
ムＤＮＡの塩基配列の差異を分離されたＤＮＡ断片の移
動度の相違として検出することを特徴とする遺伝子の変
異を同定する方法である。

【０００９】また本発明は、センスプライマー、アンチ
センスプライマー、デオキシヌクレオチド、ＤＮＡポリ
メラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液、標識物質で修
飾されたヌクレオチド誘導体、ターミナルトランスフェ
ラーゼおよびターミナルトランスフェラーゼ用緩衝液を
含むことを特徴とする遺伝子の変異を同定するための試
薬である。

【００１０】本発明に使用する標識物質としては、ビオ
チン、キゴシキシゲニン、酵素または蛍光物質があり、
酵素としてはアルカリホスファターゼ、ペルオキシダー
ゼまたはガラクトシダーゼなどが例示される。蛍光物質
としては、フルオロセインイソチオシアネート、ローダ
ミンまたはニトロベンゾジアゾルなどが例示される。

【００１１】本発明に使用するヌクレオチド誘導体と
は、ダイデオキシヌクレオチド（ダイデオキシヌクレオ
シド−三燐酸）誘導体であることが好ましい。

【００１２】本発明に使用する標識物質で修飾されたヌ
クレオチド誘導体としては、化３で示される標識修飾ヌ
クレオチド誘導体がある。

【００１３】

【化３】 （式中、Ｑは７−デアザグアニン、７−デアザアデニ
ン、ウラシルまたはシトシン残基であり、Ｒ¹ ，Ｒ² ，
Ｒ³ およびＲ⁴ は、それぞれ独立に、水素原子、ナトリ
ウム原子またはリチウム原子を表す。ただしナトリウム
原子とリチウム原子が同時に存在することはない。Ａは
標識を示す。）

【００１４】標識物質と結合し得る物質で修飾されたヌ
クレオチド誘導体としては、具体的には、７−（Ｎ−ビ
オチニル−３−アミノ−１−プロピニル）−２’，３’
−ダイデオキシ−７−デアザグアノシン−５’−三燐酸
（化４）、７−（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プ
ロピニル）−２’，３’−ダイデオキシ−７−デアザア
デノシン−５’−三燐酸（化５）、５−（Ｎ−ビオチニ
ル−３−アミノ−１−プロピニル）−２’，３’−ダイ
デオキシウリジン−５’−三燐酸（化６）または５−
（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プロピニル）−
２’，３’−ダイデオキシシチジン−５’−三燐酸（化
７）などがある。

【００１５】このような化合物の製造法は、３−トリフ
ルオロアセチルアミノ−１−プロピニル基が核酸の塩基
に結合したヌクレオシドを調製し、次に５’末端の水酸
基をトリホスフェート化し、３−アミノ−１−プロピル
基が核酸の塩基に結合したヌクレオチドを調製する。さ
らに該化合物とビオチニル−Ｎ−スクシンイミドエステ
ルとを反応させることにより、Ｎ−ビオチニル−３−ア
ミノ−１−プロピオニル基が核酸の塩基に結合したビオ
チン標識化ヌクレオチド誘導体（化４〜７）を製造する
ことができる。

【００１６】

【化４】

【００１７】

【化５】

【００１８】

【化６】

【００１９】

【化７】

【００２０】標識物質で修飾されたヌクレオチド誘導体
としては、具体的には、７−（Ｎ−フルオロセイン−３
−アミノ−１−プロピニル）−２’，３’−ダイデオキ
シ−７−デアザグアノシン−５’−三燐酸、７−（Ｎ−
フルオロセイン−３−アミノ−１−プロピニル）−
２’，３’−ダイデオキシ−７−デアザアデノシン−
５’−三燐酸、５−（Ｎ−フルオロセイン−３−アミノ
−１−プロピニル）−２’，３’−ダイデオキシウリジ
ン−５’−三燐酸または５−（Ｎ−フルオロセイン−３
−アミノ−１−プロピニル）−２’，３’−ダイデオキ
シシチジン−５’−三燐酸などがある。

【００２１】本発明に使用するＤＮＡポリメラーゼとし
ては、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメ
ラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポ
リメラーゼなどがある。ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液と
しては、例えば１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液に１．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂ および０．１％トリトンＸ−１００を含
有する緩衝液が例示される。本発明に使用するターミナ
ルトランスフェラーゼとしては、ウシ胸腺由来のものな
どがある。ターミナルトランスフェラーゼ用緩衝液とし
ては、例えば２００ｍＭカコジル酸ナトリウム、１．５
ｍＭ ＭｇＣｌ ₂および１ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ールを含む緩衝液が例示される。

【００２２】本発明の遺伝子とはゲノムＤＮＡであり、
その調製法は細胞を遠心分離した後、細胞膜を破壊する
ことでＤＮＡを抽出する。一般的にはフェノール抽出や
各種ＤＮＡ吸着物質、例えばイオン交換樹脂やガラスビ
ーズ、シリカ粒子などを添加して除タンパクの操作を行
う。

【００２３】次いでゲノムＤＮＡをプライマーを用いた
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）によ
り増幅する。具体的にはゲノムＤＮＡに、プライマー、
ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ緩衝液を
含有するＰＣＲ溶液を添加し、例えば９４℃で３０秒反
応させる工程および６０℃、２分間反応させる工程を３
０回繰り返す。プライマーとしては、既知配列を有する
２種のオリゴヌクレオチド（センスプライマーおよびア
ンチセンスプライマー）を使用する。

【００２４】本発明では、上記工程にて増幅されたＤＮ
Ａ断片の３’末端に、標識物質で修飾されたヌクレオチ
ド誘導体をターミナルトランスフェラーゼの存在下に作
用させて、標識物質を結合させる。使用する反応溶液
は、標識物質で修飾されたヌクレオチド誘導体、ターミ
ナルトランスフェラーゼおよびターミナルトランスフェ
ラーゼ用緩衝液を含むものである。上記工程にて増幅さ
れたＤＮＡ断片の３’末端に、この緩衝液を加え、例え
ば３７℃で、約２０分間反応させる。反応停止液（例え
ば９５％ ホルムアミド、２０ｍＭ エチレンジアミン
四酢酸ナトリウム、０．０５％ ブロムフェノールブル
ー、０．０５％ キシレンシアノール）を１０μｌ加え
て、約８０℃で約２分間加熱した後、氷上にて急冷し
て、反応を終了させる。ＰＣＲ増幅工程とターミナルト
ランスフェラーゼ反応工程は、別個に行うことが好まし
い。

【００２５】さらに、増幅されたＤＮＡ断片を分離す
る。分離する手段としては、ゲル電気泳動法が好まし
い。特に非変性アクリルアミドゲル電気泳動法が好まし
い。

【００２６】次いで、分離されたＤＮＡ断片の標識物質
を測定する。標識物質が酵素の場合には、酵素発色試薬
または発光試薬を反応させ、発色強度または発光強度を
測定する。アルカリホスファターゼの場合には、例えば
基質である１，２−ジオキセタン誘導体のリン酸塩など
の発光試薬を反応させ、発光強度を測定する。またはブ
ロモロロインドリルリン酸、フェニルリン酸二ナトリウ
ムおよび４−アミノアンチピリンなどの発色試薬を反応
させ、発色強度を測定する。ペルオキシダーゼの場合に
は、例えば基質である過酸化水素、４−アミノアンチピ
リン、アニリン誘導体またはフェノール誘導体などの発
色試薬を反応させ、発色強度を測定する。ガラクトシダ
ーゼの場合には、例えばｏ−ニトロフェニル−β−ガラ
クトピラノシドなどの発色試薬を反応させ、発色強度を
測定する。

【００２７】標識物質がビオチンの場合には、例えばビ
オチンにストレプトアビジンを反応させ、次いでビオチ
ン化酵素を反応させた後、酵素発色試薬または発光試薬
を反応させ、発色強度または発光強度を測定する。標識
物質がジゴキシゲニンの場合には、例えば酵素結合抗ジ
ゴキシゲニンを反応させた後、酵素発色試薬または発光
試薬を反応させ、発色強度または発光試薬を測定する。
酵素発色試薬または発光試薬としては、前述のアルカリ
ホスファターゼの場合には、例えば基質である１，２−
ジオキセタン誘導体のリン酸塩などの発光試薬またはブ
ロモロロインドリルリン酸、フェニルリン酸二ナトリウ
ムおよび４−アミノアンチピリンなどの発色試薬、ペル
オキシダーゼの場合には、例えば過酸化水素、４−アミ
ノアンチピリン、アニリン誘導体またはフェノール誘導
体などの発色試薬、ガラクトシダーゼの場合には、例え
ばｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシドなどの
発色試薬が例示される。標識物質と結合し得る物質が蛍
光物質の場合には、紫外線や可視領域のレーザー光を照
射し、発生する蛍光強度を測定する。

【００２８】本発明では、分離されたＤＮＡ断片の標識
物質を上述にようにして測定することにより、ゲノムＤ
ＮＡの塩基配列の差異を分離されたＤＮＡ断片の移動度
の相違として検出する。

【００２９】本発明の遺伝子の変異を同定するための試
薬は、センスプライマー、アンチセンスプライマー、デ
オキシヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリ
メラーゼ用緩衝液、標識物質で修飾されたヌクレオチド
誘導体、ターミナルトランスフェラーゼおよびターミナ
ルトランスフェラーゼ用緩衝液を含む。

【００３０】また本発明の試薬は必要により、さらに標
識物質検出試薬を含む。標識物質検出試薬としては、酵
素発色または発光試薬があり、酵素発色試薬としてはア
ルカリホスファターゼ発色または発光試薬、ペルオキシ
ダーゼ発色または発光試薬またはガラクトシダーゼ発色
または発光試薬がある。アルカルホスファターゼ発色試
薬としては、ブロモロロインドリルリン酸、フェニルリ
ン酸二ナトリウムおよび４−アミノアンチピリンからな
る群から選ばれた試薬がある。またアルカルホスファタ
ーゼ発光試薬としては、１，２−ジオキセタン誘導体の
リン酸塩がある。ペルオキシダーゼ発色試薬としては、
過酸化水素、４−アミノアンチピリンおよびアニリン誘
導体またはフェノール誘導体がある。またガラクトシダ
ーゼ発色試薬としては、ｏ−ニトロフェニル−β−ガラ
クトピラノシドがある。

【００３１】またストレプトアビジンおよびビオチン化
酵素および酵素発色または発光試薬も標識検出試薬とし
て使用できる。また酵素結合抗ジゴキシゲニンおよび酵
素発色または発光試薬も同様である。これらに使用する
酵素発色試薬は前述したアルカリホスファターゼ発色ま
たは発光試薬、ペルオキシダーゼ発色または発光試薬ま
たはガラクトシダーゼ発色または発光試薬などである。

【００３２】本発明試薬の一実施態様は、センスプライ
マー、アンチセンスプライマー、デオキシヌクレオチ
ド、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝
液、ビオチンで修飾されたダイデオキシヌクレオシチド
─５’−三燐酸誘導体、ターミナルトランスフェラー
ゼ、ターミナルトランスフェラーゼ用緩衝液、ストレプ
トアビジン、ビオチン化酵素および酵素発色または発光
試薬を含む試薬である。

【００３３】本発明の試薬濃度は、センスプライマー、
アンチセンスプライマー各約１〜１００、好ましくは約
１０ｐｍｏｌｅ、デオキシヌクレオチド約２０〜２００
０μＭ、好ましくは約１〜３００μＭ、ＤＮＡポリメラ
ーゼ約１〜１０Ｕ、好ましくは２〜８Ｕ、ヌクレオチド
誘導体約５〜１０００μＭ、好ましくは１０〜１００μ
Ｍ、ターミナルトランスフェラーゼ約０．１〜１０Ｕ、
好ましくは０．５〜５Ｕである。

【００３４】

【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ産物の３’末端に、
標識物質または標識物質と結合し得る物質で標識された
ヌクレオチドを１分子のみ結合させることができる。す
なわちセンスプライマー、アンチセンスプライマー、Ｄ
ＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液を
含むＰＣＲ反応液および標識されたヌクレオチド、例え
ばダイデオキシヌクレオチド誘導体（化１）、ターミナ
ルトランスフェラーゼおよびターミナルトランスフェラ
ーゼ用緩衝液を加え、ＤＮＡポリメラーゼおよびターミ
ナルトランスフェラーゼの両酵素反応を行うことによ
り、ＰＣＲ産物の３’末端に標識物質または標識物質と
結合し得る物質で標識されたヌクレオチドを１分子のみ
結合させることができる。１分子のみの標識物質または
標識物質と結合し得る物質の結合が可能な理由として
は、増幅産物の３’末端にターミナルトランスフェラー
ゼにより１分子の標識されたヌクレオチド、例えば標識
されたダイデオキシヌクレオチド誘導体（化１）が組み
込まれることにより、ヒドロキシル基がなくなり、合成
による伸長はもはや可能ではなくなるためであると考え
られる。

【００３５】さらにこの標識されたダイデオキシヌクレ
オチド誘導体は、標識されていないデオキシヌクレオチ
ドより優先的にターミナルトランスフェラーゼによっ
て、３’末端に付加されるため、ＰＣＲ反応に使用され
なかったデオキシヌクレオチドを除去することなく、直
接、標識が可能になる。したがって、本発明によれば、
プライマーを標識することなく、しかも放射性同位元素
を使用せずにＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析法が可能になり、一
定量の標識物質を結合させるにあたって、例えば余剰の
ヌクレオチドを除く等のＰＣＲ産物の処理が不要になっ
た。

【００３６】

【実施例】以下、実施例を挙げて、本発明を詳細に説明
する。実施例１ 標識物質を用いないＰＣＲ反応 １００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（３名、Ａ，Ｂ，Ｃ）、
２０ｐｍｏｌｅのセンスプライマー、２０ｐｍｏｌｅの
アンチセンスプライマー、終濃度２００μＭのデキシヌ
クレオチド三燐酸、２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼをＴａｑＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液（１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ ₂ 、０．１％ト
リトンＸ−１００）に加え、全量を１０μｌとし、９４
℃、３０秒〜６０℃、２分のＰＣＲを３０回行った。

【００３７】実施例２ ＰＣＲ産物の３’末端の標識 実施例１で得たＰＣＲ反応液５μｌ、ターミナルトラン
スフェラーゼ５Ｕ、終濃度が８０μＭの７−（Ｎ−ビオ
チニル−（３−アミノ−１−プロピニル））−２’３’
−ジデオキシ−７−デアザシチジン−５’−三燐酸をタ
ーミナルトランスフェラーゼ用緩衝液（２００ｍＭ カ
コジル酸ナトリウム、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭ
２−メルカプトエタノール）に加え、全量を１０μｌ
とし、３７℃で２０分間反応した。反応停止液（９５％
ホルムアミド、２０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸ナ
トリウム、０．０５％ ブロムフェノールブルー、０．
０５％ キシレンシアノール）を１０μｌ加えた。８０
℃で２分間加熱した後、氷上にて急冷した。

【００３８】実施例３ ５％ポリアクリルアミドゲルによる試料の分離 市販のアクリルアミド、ビスアクリルアミドを用いて、
５％ポリアクリルアミドゲル（架橋度１％、５％グリセ
ロール、幅２０ｃｍ、長さ４０ｃｍ、厚さ０．３５ｍｍ
を作製した。３’末端を標識したＰＣＲプロダクト１μ
ｌをゲルに添加した。ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭトリス緩
衝液、８９ｍＭほう酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．
３）で６５Ｗの定電力で２０℃、２時間電気泳動を行
い、試料を分離した。

【００３９】実施例４ 試料の検出 泳動の終わったゲルと市販のナイロンメンブレンに密着
させ、分離した試料（Ａ，Ｂ，Ｃ）をナイロンメンブレ
ンに１時間ブロテッィングした。ハイブリダイゼーショ
ンバックに入れ、ブロッキング緩衝液（１０ｍＭ リン
酸緩衝液、５％ＳＤＳ、１２５ｍＭ ＮａＣｌ）２０ｍ
ｌを加え、５分間振盪後排出した。１μｇ／ｍｌとなる
ようにブロッキング緩衝液２０ｍｌで希釈したストレプ
トアビジンを加え、５分間振盪後、排出した。１０倍希
釈したブロッキング緩衝液２０ｍｌで２回、１０分間ず
つ振盪後、排出した。０．５μｇ／ｍｌとなるようにブ
ロッキング緩衝液２０ｍｌで希釈したビオチン化アルカ
リフォスファターゼを加え、５分間振盪後、排出した。
トリス緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．
２、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭ ＮａＣｌ）で２
回、１０分間ずつ振盪後、排出した。０．３４ｍｇ／ｍ
ｌの化学発光基質（ルミジェン社ＰＰＤ、１，２−ジオ
キセタン誘導体のリン酸塩）を加え、５分間振盪後、排
出した。ナイロンメンブレンをハイブリダイゼーション
バックに入れたままＸ線フィルムと接触させ、１０分間
露光し、フィルム上にＤＮＡを検出した。その結果、３
種類の試料（Ａ，Ｂ，Ｃ）すべてにおいてバンドパター
ンが異なり、それぞれ異なった配列を有することがわか
った（図１）。

【００４０】比較例１ 上記実施例１におけるセンスプライマーに代えて、放射
性標識物質（³²Ｐ）を結合したセンスプライマーを使用
して、ＰＣＲを行い、次いで実施例３と同様にして、電
気泳動により分離して、検出した結果を図２に示す。い
ずれの試料もバンドパターンが異なり、それぞれ異なっ
た配列を有することがわかった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法により検出された遺伝子の電気泳
動の結果を示す図面代用写真である。

【図２】放射性標識したプライマーを使用した遺伝子同
定法による結果を示す図面代用写真である。

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子（ゲノムＤＮＡ）をプライマーを
   用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣ
   Ｒ）により増幅し、増幅されたＤＮＡ断片の３’末端
   に、標識物質で修飾されたヌクレオチド誘導体をターミ
   ナルトランスフェラーゼの存在下に結合させた後、ＤＮ
   Ａ断片を分離し、分離されたＤＮＡ断片の標識物質を測
   定することにより、ゲノムＤＮＡの塩基配列の差異を分
   離されたＤＮＡ断片の移動度の相違として検出すること
   を特徴とする遺伝子の変異を同定する方法。
2. 【請求項２】 ヌクレオチド誘導体が、ダイデオキシヌ
   クレオシド−５’−三燐酸誘導体である請求項１記載の
   方法。
3. 【請求項３】 標識物質で修飾されたヌクレオチド誘導
   体が、化１で示される標識修飾ヌクレオチド誘導体であ
   る請求項１記載の方法。 【化１】 （式中、Ｑは７−デアザグアニン、７−デアザアデニ
   ン、ウラシルまたはシトシン残基であり、Ｒ¹ ，Ｒ² ，
   Ｒ³ およびＲ⁴ は、それぞれ独立に、水素原子、ナトリ
   ウム原子またはリチウム原子を表す。ただしナトリウム
   原子とリチウム原子が同時に存在することはない。Ａは
   標識を示す。）
4. 【請求項４】 標識物質がビオチン、ジゴキシゲニン、
   酵素または蛍光物質である請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオ
   キシダーゼまたはガラクトシダーゼである請求項１記載
   の方法。
6. 【請求項６】 蛍光物質がフルオロセインイソチオシア
   ネート、ローダミンまたはニトロベンゾジアゾルである
   請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 標識物質で修飾されたヌクレオチド誘導
   体が、７−（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プロピ
   ニル）−２’，３’−ダイデオキシ−７−デアザグアノ
   シン−５’−三燐酸、７−（Ｎ−ビオチニル−３−アミ
   ノ−１−プロピニル）−２’，３’−ダイデオキシ−７
   −デアザアデノシン−５’−三燐酸、５−（Ｎ−ビオチ
   ニル−３−アミノ−１−プロピニル）−２’，３’−ダ
   イデオキシウリジン−５’−三燐酸または５−（Ｎ−ビ
   オチニル−３−アミノ−１−プロピニル）−２’，３’
   −ダイデオキシシチジン−５’−三燐酸である請求項１
   記載の方法。
8. 【請求項８】 標識物質で修飾されたヌクレオチド誘導
   体が、７−（Ｎ−フルオロセイン−３−アミノ−１−プ
   ロピニル）−２’，３’−ダイデオキシ−７−デアザグ
   アノシン−５’−三燐酸、７−（Ｎ−フルオロセイン−
   ３−アミノ−１−プロピニル）−２’，３’−ダイデオ
   キシ−７−デアザアデノシン−５’−三燐酸、５−（Ｎ
   −フルオロセイン−３−アミノ−１−プロピニル）−
   ２’，３’−ダイデオキシウリジン−５’−三燐酸また
   は５−（Ｎ−フルオロセイン−３−アミノ−１−プロピ
   ニル）−２’，３’−ダイデオキシシチジン−５’−三
   燐酸である請求項１記載の方法。
9. 【請求項９】 増幅されたＤＮＡ断片を分離する方法
   が、ゲル電気泳動法である請求項１記載の方法。
10. 【請求項１０】 ゲル電気泳動法が、非変性アクリルア
    ミドゲル電気泳動法である請求項１記載の方法
11. 【請求項１１】 遺伝子（ゲノムＤＮＡ）をプライマー
    を用いたポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣ
    Ｒ）により増幅し、増幅されたＤＮＡ断片の３’末端
    に、ビオチンで修飾されたダイデオキシヌクレオシド−
    ５’−三燐酸誘導体をターミナルトランスフェラーゼの
    存在下に結合させた後、ＤＮＡ断片を分離し、分離され
    たＤＮＡ断片のビオチンにストレプトアビジン、ビオチ
    ン化酵素および酵素発色試薬または発光試薬を作用させ
    て、発色強度または発光強度を測定することにより、ゲ
    ノムＤＮＡの塩基配列の差異を分離されたＤＮＡ断片の
    移動度の相違として検出することを特徴とする遺伝子の
    変異を同定する方法。
12. 【請求項１２】 センスプライマー、アンチセンスプラ
    イマー、デオキシヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、
    ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液、標識物質で修飾されたヌ
    クレオチド誘導体、ターミナルトランスフェラーゼおよ
    びターミナルトランスフェラーゼ用緩衝液を含むことを
    特徴とする遺伝子の変異を同定するための試薬。
13. 【請求項１３】 ヌクレオチド誘導体が、ダイデオキシ
    ヌクレオシド−５’−三燐酸誘導体である請求項１２記
    載の試薬。
14. 【請求項１４】 標識物質で修飾されたヌクレオチド誘
    導体が、化２で示される標識修飾ヌクレオチド誘導体で
    ある請求項１２記載の試薬。 【化２】 （式中、Ｑは７−デアザグアニン、７−デアザアデニ
    ン、ウラシルまたはシトシン残基であり、Ｒ¹ ，Ｒ² ，
    Ｒ³ およびＲ⁴ は、それぞれ独立に、水素原子、ナトリ
    ウム原子またはリチウム原子を表す。ただしナトリウム
    原子とリチウム原子が同時に存在することはない。Ａは
    標識を示す。）
15. 【請求項１５】 標識物質がビオチン、ジゴキシゲニ
    ン、酵素または蛍光物質である請求項１２記載の試薬。
16. 【請求項１６】 酵素がアルカリホスファターゼ、ペル
    オキシダーゼまたはガラクトシダーゼである請求項１５
    記載の試薬。
17. 【請求項１７】 蛍光物質がフルオロセインイソチオシ
    アネート、ローダミンまたはニトロベンゾジアゾルであ
    る請求項１５記載の試薬。
18. 【請求項１８】 標識物質で修飾されたヌクレオチド誘
    導体が、７−（Ｎ−ビオチニル−３−アミノ−１−プロ
    ピニル）−２’，３’−ダイデオキシ−７−デアザグア
    ノシン−５’−三燐酸、７−（Ｎ−ビオチニル−３−ア
    ミノ−１−プロピニル）−２’，３’−ダイデオキシ−
    ７−デアザアデノシン−５’−三燐酸、５−（Ｎ−ビオ
    チニル−３−アミノ−１−プロピニル）−２’，３’−
    ダイデオキシウリジン−５’−三燐酸または５−（Ｎ−
    ビオチニル−３−アミノ−１−プロピニル）−２’，
    ３’−ダイデオキシシチジン−５’−三燐酸である請求
    項１２記載の試薬。
19. 【請求項１９】 標識物質で修飾されたヌクレオチド誘
    導体が、７−（Ｎ−フルオロセイン−３−アミノ−１−
    プロピニル）−２’，３’−ダイデオキシ−７−デアザ
    グアノシン−５’−三燐酸、７−（Ｎ−フルオロセイン
    −３−アミノ−１−プロピニル）−２’，３’−ダイデ
    オキシ−７−デアザアデノシン−５’−三燐酸、５−
    （Ｎ−フルオロセイン−３−アミノ−１−プロピニル）
    −２’，３’−ダイデオキシウリジン−５’−三燐酸ま
    たは５−（Ｎ−フルオロセイン−３−アミノ−１−プロ
    ピニル）−２’，３’−ダイデオキシシチジン−５’−
    三燐酸である請求項１２記載の試薬。
20. 【請求項２０】 さらに標識物質検出試薬を含む請求項
    １２記載の試薬。
21. 【請求項２１】 標識物質検出試薬が、酵素発色または
    発光試薬である請求項２０記載の試薬。
22. 【請求項２２】 酵素発色試薬がアルカリホスファター
    ゼ発色または発光試薬、ペルオキシダーゼ発色または発
    光試薬またはガラクトシダーゼ発色または発光試薬であ
    る請求項２１記載の試薬。
23. 【請求項２３】 アルカルホスファターゼ発色試薬が、
    ブロモクロロインドリルリン酸、フェニルリン酸二ナト
    リウムおよび４−アミノアンチピリンからなる群から選
    ばれた試薬である請求項２２記載の試薬。
24. 【請求項２４】 アルカルホスファターゼ発光試薬が、
    １，２−ジオキセタン誘導体のリン酸塩である請求項２
    ２記載の試薬。
25. 【請求項２５】 ペルオキシダーゼ発色試薬が、過酸化
    水素、４−アミノアンチピリンおよびアニリン誘導体ま
    たはフェノール誘導体である請求項２２記載の試薬。
26. 【請求項２６】 ガラクトシダーゼ発色試薬が、ｏ−ニ
    トロフェニル−β−ガラクトピラノシドである請求項２
    ２記載の発色試薬。
27. 【請求項２７】 標識物質検出試薬が、ストレプトアビ
    ジンおよびビオチン化酵素および酵素発色または発光試
    薬である請求項２０記載の試薬。
28. 【請求項２８】 標識物質検出試薬が、酵素結合抗ジゴ
    キシゲニンおよび酵素発色または発光試薬である請求項
    ２０記載の試薬。
29. 【請求項２９】 酵素発色試薬がアルカリホスファター
    ゼ発色または発光試薬、ペルオキシダーゼ発色または発
    光試薬またはガラクトシダーゼ発色または発光試薬であ
    る請求項２７または２８記載の試薬。
30. 【請求項３０】 センスプライマー、アンチセンスプラ
    イマー、デオキシヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、
    ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液、ビオチンで修飾されたダ
    イデオキシヌクレオシド─５’−三燐酸誘導体、ターミ
    ナルトランスフェラーゼ、ターミナルトランスフェラー
    ゼ用緩衝液、ストレプトアビジン、ビオチン化酵素およ
    び酵素発色試薬または発光試薬を含むことを特徴とする
    遺伝子の変異を同定するための試薬。