JP3509025B2 - 不連続プライマー伸長による核酸の反復配列長の決定 - Google Patents
不連続プライマー伸長による核酸の反復配列長の決定Info
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、核酸の反復配列長を決定するために有用な
方法およびキットに関する。より詳細には、本発明は、
不連続プライマー伸長反応を使用することによって、核
酸の反復配列長を決定するために有用な方法およびキッ
トに関する。
方法およびキットに関する。より詳細には、本発明は、
不連続プライマー伸長反応を使用することによって、核
酸の反復配列長を決定するために有用な方法およびキッ
トに関する。
参考文献
Ausubel et al.eds.,Current Protocols in Molecula
r Biology Volume 1,Chapter 2,Section I,John Wiley
＆ Sons,New York（1993） Barany et al.,International Patent Application P
CT/US91/06103 Beattie et al.,Clinical Chemistry,39:719−722（1
993） Beaucage and Iyer,Tetrahedron,48:2223−2311（199
2） Boom et al.,U.S.Patent No.5,234,809 Bronstein,et al.,J.Biolumin.Chemilumin.,4:99−11
1（1990） Caskey and Edwards,U.S.Patent No.5,364,759 Chidgeavadze et al.,Nuccleic Acids Research,12:1
671−1686（1984）;and Chidgeavadze et al.,FEB.Let
t.,183:275−278（1985）． Damha et al.,Nucleic Acids Research,18:3813−382
1（1990） Dieffenbach et al.,in PCR Primer:A Laboratory Ma
nual,Diffenbach and Dveksler,eds.,p 133−142,CSHL
Press,New York（1995） Eckstein ed.,Oligonucleotides and Analogs,Chapte
rs 8 and 9,IRL Press（1991） Guo et al.,Nucleic Acids Research,22（24）:5456
−5465（1994） Jabs et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,86:202（1989） Jeffreys et al.,Cell,60:473（1990） Khan et al.,U.S.Patent Application Serial No.08/
696,808 Kornberg and Baker,DNA Replication 2nd Eddition,
W.H.Freeman,New York（1991）． Kricka,in Nonisotopic DNA Probe Techniques,Krick
a ed.,Chapter 1,Academic Press（1992） Maskos and Southern,Nucleic Acids Research,20:16
79−1684（1992） Metzker et al.,Nucleic Acids Research,22（20）:4
259（1994） Miller et al.,Nucleic Acids Research,16（３）:9
−10（1988） Montpetit et al.,J.Virol.Methods,36:119−128（19
92） Mullis,U.S.Pat.Nos.4,683,195;4,683,195;and 4,68
3,202 Osborne,CABIOS,8:83（1991） Pease et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,91:5022−5026
（1994） Pierce Catalog and Handbook,Pierce Chemical Co.
（1994） Pon et al.,Biotechniques,6:768−775（1988） Ruby et al.,Methods in Enzymology,181:97（1990） Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley（1980） Smeets et al.,Hum,Genet,83:245（1989） Southern et al.,Genomics,13:1008−1017（1992） Walsh et al.,Biotechniques 10（４）:506−513（19
91） Webb,U.S.Patent No.4,659,774 Webber and May,Am.J.Hum.Genet.,44:388（1989） Williamson et al.,Cytogenet.Cell.Genet.,55:457
（1990） 背景 遺伝子の多型性を分析するための方法は、基礎研究、
臨床的診断、法医学、および他の分野において広範な有
用性が見出されてきた。遺伝子の多型性を検出する１つ
の特に有用な方法は、短タンデム反復配列（STR）分
析、可変数タンデム反復（VNTR）分析、ミニサテライト
分析、およびマイクロサテライト分析として様々に言及
されている方法のような反復配列長おけるバリエーショ
ンに基づく。
r Biology Volume 1,Chapter 2,Section I,John Wiley
＆ Sons,New York（1993） Barany et al.,International Patent Application P
CT/US91/06103 Beattie et al.,Clinical Chemistry,39:719−722（1
993） Beaucage and Iyer,Tetrahedron,48:2223−2311（199
2） Boom et al.,U.S.Patent No.5,234,809 Bronstein,et al.,J.Biolumin.Chemilumin.,4:99−11
1（1990） Caskey and Edwards,U.S.Patent No.5,364,759 Chidgeavadze et al.,Nuccleic Acids Research,12:1
671−1686（1984）;and Chidgeavadze et al.,FEB.Let
t.,183:275−278（1985）． Damha et al.,Nucleic Acids Research,18:3813−382
1（1990） Dieffenbach et al.,in PCR Primer:A Laboratory Ma
nual,Diffenbach and Dveksler,eds.,p 133−142,CSHL
Press,New York（1995） Eckstein ed.,Oligonucleotides and Analogs,Chapte
rs 8 and 9,IRL Press（1991） Guo et al.,Nucleic Acids Research,22（24）:5456
−5465（1994） Jabs et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,86:202（1989） Jeffreys et al.,Cell,60:473（1990） Khan et al.,U.S.Patent Application Serial No.08/
696,808 Kornberg and Baker,DNA Replication 2nd Eddition,
W.H.Freeman,New York（1991）． Kricka,in Nonisotopic DNA Probe Techniques,Krick
a ed.,Chapter 1,Academic Press（1992） Maskos and Southern,Nucleic Acids Research,20:16
79−1684（1992） Metzker et al.,Nucleic Acids Research,22（20）:4
259（1994） Miller et al.,Nucleic Acids Research,16（３）:9
−10（1988） Montpetit et al.,J.Virol.Methods,36:119−128（19
92） Mullis,U.S.Pat.Nos.4,683,195;4,683,195;and 4,68
3,202 Osborne,CABIOS,8:83（1991） Pease et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,91:5022−5026
（1994） Pierce Catalog and Handbook,Pierce Chemical Co.
（1994） Pon et al.,Biotechniques,6:768−775（1988） Ruby et al.,Methods in Enzymology,181:97（1990） Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley（1980） Smeets et al.,Hum,Genet,83:245（1989） Southern et al.,Genomics,13:1008−1017（1992） Walsh et al.,Biotechniques 10（４）:506−513（19
91） Webb,U.S.Patent No.4,659,774 Webber and May,Am.J.Hum.Genet.,44:388（1989） Williamson et al.,Cytogenet.Cell.Genet.,55:457
（1990） 背景 遺伝子の多型性を分析するための方法は、基礎研究、
臨床的診断、法医学、および他の分野において広範な有
用性が見出されてきた。遺伝子の多型性を検出する１つ
の特に有用な方法は、短タンデム反復配列（STR）分
析、可変数タンデム反復（VNTR）分析、ミニサテライト
分析、およびマイクロサテライト分析として様々に言及
されている方法のような反復配列長おけるバリエーショ
ンに基づく。
核酸の反復配列における長さの多型性の検出は、現在
でも、反復配列長を決定するためにゲル電気泳動に依っ
ている。しかし、ゲル電気泳動は、反復配列長の多型性
分析の状況において、いくつかの重要な欠点がある。第
１に、電気泳動的移動度に基づく分子長の測定は、分子
サイズと電気泳動的移動度との間の複雑な関係に起因し
て、本質的に不正確である。第２に、電気泳動プロセス
が増幅され（multiplexed）得る程度は、電気泳動のレ
ーンの数および１つのレーンにおいて実施される異なる
位置のサイズによって制限される。（すなわち、電気泳
動的に同時移動しない位置が、選択されなければならな
い。） 要旨 本発明の方法は、不連続プライマー伸長反応を含む。
ここで、プライマーは、このプライマーが、プライマー
伸長の各々の増加において、単一の反復単位に対応する
量だけ伸長されるように、個々の増加において伸長され
る。個々のプライマー伸長の各増加の後に、検出工程が
実施される。この検出工程においては、プライマーが反
復領域の全長に等しい量だけ伸長された場合、シグナル
の調節が検出される。従って、シグナルの調節を引き起
こすことが必要とされる個々のプライマー伸長の増加数
を計数することによって、反復領域を構成する反復単位
数が、決定される。
でも、反復配列長を決定するためにゲル電気泳動に依っ
ている。しかし、ゲル電気泳動は、反復配列長の多型性
分析の状況において、いくつかの重要な欠点がある。第
１に、電気泳動的移動度に基づく分子長の測定は、分子
サイズと電気泳動的移動度との間の複雑な関係に起因し
て、本質的に不正確である。第２に、電気泳動プロセス
が増幅され（multiplexed）得る程度は、電気泳動のレ
ーンの数および１つのレーンにおいて実施される異なる
位置のサイズによって制限される。（すなわち、電気泳
動的に同時移動しない位置が、選択されなければならな
い。） 要旨 本発明の方法は、不連続プライマー伸長反応を含む。
ここで、プライマーは、このプライマーが、プライマー
伸長の各々の増加において、単一の反復単位に対応する
量だけ伸長されるように、個々の増加において伸長され
る。個々のプライマー伸長の各増加の後に、検出工程が
実施される。この検出工程においては、プライマーが反
復領域の全長に等しい量だけ伸長された場合、シグナル
の調節が検出される。従って、シグナルの調節を引き起
こすことが必要とされる個々のプライマー伸長の増加数
を計数することによって、反復領域を構成する反復単位
数が、決定される。
本発明の目的は、核酸の反復配列の反復領域を構成し
ている反復単位数を決定するための正確かつ再現性のあ
る方法を提供することである。
ている反復単位数を決定するための正確かつ再現性のあ
る方法を提供することである。
本発明の別の目的は、多数の測定を並行して実施し得
る核酸の反復配列の反復領域を構成する反復単位数を決
定するための方法を提供することである。
る核酸の反復配列の反復領域を構成する反復単位数を決
定するための方法を提供することである。
本発明のなおさらなる目的は、電気泳動的分離を必要
としない核酸の反復配列の反復領域を構成する反復単位
数を決定するための方法を提供することである。
としない核酸の反復配列の反復領域を構成する反復単位
数を決定するための方法を提供することである。
本発明の目的は、上記の所望の特性を有する核酸の反
復配列の反復領域を構成する反復単位数を決定するため
の方法を実施するために有用なキットおよび試薬を提供
することである。
復配列の反復領域を構成する反復単位数を決定するため
の方法を実施するために有用なキットおよび試薬を提供
することである。
第１の局面において、本発明の前述および他の目的
は、以下の工程：標的核酸のプライマー相補性部分をプ
ライマーにアニーリングさせ、それによって標的−プラ
イマーハイブリッドを形成させる工程；第１のプライマ
ー伸長試薬を使用して第１のプライマー伸長反応を行う
工程；標的−プライマーハイブリッドと未反応の第１の
プライマー伸長試薬とを分離する工程；第２のプライマ
ー伸長試薬を使用して第２のプライマー伸長反応を行う
工程（ここで、第１または第２のプライマー伸長試薬の
少なくとも１つは、ヌクレオチドに結合した標識を有す
る伸長可能なヌクレオチドを含む）；標的−プライマー
ハイブリッドを未反応の第２のプライマー伸長試薬から
分離する工程；標識によって生成されるシグナルを測定
する工程；標識を検出不能にさせるように標識を処理す
る工程；およびこのシグナルが前回のサイクルにおいて
検出されるシグナルより実質的に少なくなるまで、上記
の工程を反復する工程を包含する標的核酸の反復領域に
おける反復単位数を決定するための方法によって達成さ
れる。
は、以下の工程：標的核酸のプライマー相補性部分をプ
ライマーにアニーリングさせ、それによって標的−プラ
イマーハイブリッドを形成させる工程；第１のプライマ
ー伸長試薬を使用して第１のプライマー伸長反応を行う
工程；標的−プライマーハイブリッドと未反応の第１の
プライマー伸長試薬とを分離する工程；第２のプライマ
ー伸長試薬を使用して第２のプライマー伸長反応を行う
工程（ここで、第１または第２のプライマー伸長試薬の
少なくとも１つは、ヌクレオチドに結合した標識を有す
る伸長可能なヌクレオチドを含む）；標的−プライマー
ハイブリッドを未反応の第２のプライマー伸長試薬から
分離する工程；標識によって生成されるシグナルを測定
する工程；標識を検出不能にさせるように標識を処理す
る工程；およびこのシグナルが前回のサイクルにおいて
検出されるシグナルより実質的に少なくなるまで、上記
の工程を反復する工程を包含する標的核酸の反復領域に
おける反復単位数を決定するための方法によって達成さ
れる。
本発明の第１の局面の１つの好ましい実施態様におい
て、第２のプライマー伸長反応を行う工程は、プライマ
ー停止試薬と標的−プライマーハイブリッドとを反応さ
せる工程をさらに包含する。
て、第２のプライマー伸長反応を行う工程は、プライマ
ー停止試薬と標的−プライマーハイブリッドとを反応さ
せる工程をさらに包含する。
本発明の第１の局面の別の好ましい実施態様におい
て、標的−プライマーハイブリッドは、固体支持体に付
着される。好ましくは、プライマーまたは標的核酸のう
ちの１つが、固体支持体に結合される。
て、標的−プライマーハイブリッドは、固体支持体に付
着される。好ましくは、プライマーまたは標的核酸のう
ちの１つが、固体支持体に結合される。
本発明の第１の局面のさらに別の好ましい実施態様に
おいて、標識は、蛍光分子または化学発光分子である。
おいて、標識は、蛍光分子または化学発光分子である。
本発明の第１の局面の別の好ましい実施態様におい
て、標識は、切断可能なリンカーを介して伸長可能なヌ
クレオチドに結合されている。
て、標識は、切断可能なリンカーを介して伸長可能なヌ
クレオチドに結合されている。
本発明の別の第１の局面のさらなる好ましい実施態様
において、標的核酸は、分析の前に増幅されている。好
ましくは、このような増幅は、PCRを使用して達成され
る。
において、標的核酸は、分析の前に増幅されている。好
ましくは、このような増幅は、PCRを使用して達成され
る。
本発明の第１の局面の別の好ましい実施態様におい
て、標識を検出不能にするように標識を処理する工程
は、標識された伸長可能なヌクレオチドから標識を切断
する工程または標識のシグナル生成特性を破壊する工程
のいずれかを包含する。
て、標識を検出不能にするように標識を処理する工程
は、標識された伸長可能なヌクレオチドから標識を切断
する工程または標識のシグナル生成特性を破壊する工程
のいずれかを包含する。
第２の局面において、本発明の前述および他の目的
は、以下の工程：標的核酸のプライマー相補性部分をプ
ライマーにアニーリングさせ、それによって標的−プラ
イマーハイブリッドを形成させる工程；第１のプライマ
ー伸長試薬を使用して第１のプライマー伸長反応を行う
工程；標的−プライマーハイブリッドと未反応の第１の
プライマー伸長試薬とを分離する工程；第２のプライマ
ー伸長試薬を使用しておよび第２のプライマー停止試薬
（プライマー停止試薬は、ヌクレオチドに結合された標
識を有するヌクレオチドターミネーターを含む）ととも
に第２のプライマー伸長反応を行う工程；標的−プライ
マーハイブリッドを未反応の第２のプライマー伸長試薬
および未反応のプライマー停止試薬から分離する工程；
標識によって生成されるシグナルを測定する工程；およ
びプライマー伸長産物に標識されたヌクレオチドターミ
ネーターの組み込みを示すシグナルが検出されるまで、
上記の工程を反復する工程を包含する標的核酸の反復領
域における反復単位数を決定するための方法によって達
成される。
は、以下の工程：標的核酸のプライマー相補性部分をプ
ライマーにアニーリングさせ、それによって標的−プラ
イマーハイブリッドを形成させる工程；第１のプライマ
ー伸長試薬を使用して第１のプライマー伸長反応を行う
工程；標的−プライマーハイブリッドと未反応の第１の
プライマー伸長試薬とを分離する工程；第２のプライマ
ー伸長試薬を使用しておよび第２のプライマー停止試薬
（プライマー停止試薬は、ヌクレオチドに結合された標
識を有するヌクレオチドターミネーターを含む）ととも
に第２のプライマー伸長反応を行う工程；標的−プライ
マーハイブリッドを未反応の第２のプライマー伸長試薬
および未反応のプライマー停止試薬から分離する工程；
標識によって生成されるシグナルを測定する工程；およ
びプライマー伸長産物に標識されたヌクレオチドターミ
ネーターの組み込みを示すシグナルが検出されるまで、
上記の工程を反復する工程を包含する標的核酸の反復領
域における反復単位数を決定するための方法によって達
成される。
本発明の第２の局面の好ましい実施態様において、標
的−プライマーハイブリッドは、固体支持体に結合され
る。好ましくは、プライマーまたは標的核酸のうちの１
つが、固体支持体に結合されている。
的−プライマーハイブリッドは、固体支持体に結合され
る。好ましくは、プライマーまたは標的核酸のうちの１
つが、固体支持体に結合されている。
本発明の第２の局面のなお別の好ましい実施態様にお
いて、標識は、蛍光分子および化学発光分子からなる群
より選択される。
いて、標識は、蛍光分子および化学発光分子からなる群
より選択される。
本発明の第２の局面のさらなる好ましい実施態様にお
いて、標的核酸は、分析の前に増幅されている。好まし
くは、このような増幅は、PCRを使用して達成される。
いて、標的核酸は、分析の前に増幅されている。好まし
くは、このような増幅は、PCRを使用して達成される。
第３の局面において、本発明の前述および他の目的
は、以下を含む標的核酸の反復領域において反復単位数
を決定するために有用なキットによって達成される：標
的核酸のプライマー相補性部分に対して配列相補性を有
するプライマー；第１のプライマー伸長試薬；および第
２のプライマー伸長試薬（ここで、第１または第２のプ
ライマー伸長試薬の少なくとも１つは、ヌクレオチドに
結合した標識を有する伸長可能なヌクレオチドを含
む）。
は、以下を含む標的核酸の反復領域において反復単位数
を決定するために有用なキットによって達成される：標
的核酸のプライマー相補性部分に対して配列相補性を有
するプライマー；第１のプライマー伸長試薬；および第
２のプライマー伸長試薬（ここで、第１または第２のプ
ライマー伸長試薬の少なくとも１つは、ヌクレオチドに
結合した標識を有する伸長可能なヌクレオチドを含
む）。
本発明の第３の局面の好ましい実施態様において、プ
ライマーは、固体支持体に結合される。
ライマーは、固体支持体に結合される。
本発明の第３の局面のさらなる好ましい実施態様にお
いて、標識は、蛍光分子および化学発光分子からなる群
より選択される。
いて、標識は、蛍光分子および化学発光分子からなる群
より選択される。
本発明の第３の局面の別の好ましい実施態様におい
て、標識は、切断可能なリンカーを介して伸長可能なヌ
クレオチドに結合されている。
て、標識は、切断可能なリンカーを介して伸長可能なヌ
クレオチドに結合されている。
本発明のこれらのならびに他の目的、特徴、および利
点は、以下の発明の詳細な説明、図面および添付の請求
の範囲を参照することによってより良好に理解される。
点は、以下の発明の詳細な説明、図面および添付の請求
の範囲を参照することによってより良好に理解される。
図面の簡単な説明
図１は、標的核酸の略図を示す。
図2A〜Ｃは、伸長可能なヌクレオチドが標識され、そ
してこの標識がプライマー伸長の各個々の増加に続いて
検出不能にされる本発明の方法の第１の局面を示す。
してこの標識がプライマー伸長の各個々の増加に続いて
検出不能にされる本発明の方法の第１の局面を示す。
図3A〜Ｂは、ヌクレオチドターミネーターが標識され
る本発明の方法の第２の局面を示す。
る本発明の方法の第２の局面を示す。
好ましい実施態様の詳細な説明
ここで、言及は本発明の好ましい実施態様に対して詳
細に行われ、この例が、添付の図面に図示される。本発
明が好ましい実施態様とともに記載されると同時に、本
発明がこれらの実施態様に制限されることは意図されな
いことが理解される。反対に、本発明は、添付の請求の
範囲により規定される本発明内に包含され得る代替物、
改変物および当価物を包含することが意図される。
細に行われ、この例が、添付の図面に図示される。本発
明が好ましい実施態様とともに記載されると同時に、本
発明がこれらの実施態様に制限されることは意図されな
いことが理解される。反対に、本発明は、添付の請求の
範囲により規定される本発明内に包含され得る代替物、
改変物および当価物を包含することが意図される。
I.定義
他に記載されない限り、本発明中で使用される以下の
用語および句は以下の意味を有することが意図される： 「ヌクレオシド」とは、ペントースに1'位で連結され
た、プリン、デアザプリン（deazapurine）またはピリ
ミジンのヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニ
ン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デ
アザグアノシンなど）からなる化合物をいう（2'−デオ
キシおよび2'−ヒドロキシ形態を含む）（Stryer）。本
明細書中で使用される用語「ヌクレオチド」とは、ヌク
レオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステ
ル）をいう。ここで最も一般的なエステル化部位はペン
トースのＣ−５位で結合したヒドロキシル基である。本
開示の用語において多くの場合、ヌクレオシドは、ヌク
レオシドおよびヌクレオチドの両方を包含することが意
図される。本明細書中で使用される用語、ヌクレオチド
およびヌクレオシドは、例えば、他に記載されるよう
な、改変ヌクレオシド塩基部分、改変糖部分および／ま
たは改変リン酸エステル部分を有する合成アナログを含
むことが意図される（Scheit;Eckstein）。
用語および句は以下の意味を有することが意図される： 「ヌクレオシド」とは、ペントースに1'位で連結され
た、プリン、デアザプリン（deazapurine）またはピリ
ミジンのヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニ
ン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デ
アザグアノシンなど）からなる化合物をいう（2'−デオ
キシおよび2'−ヒドロキシ形態を含む）（Stryer）。本
明細書中で使用される用語「ヌクレオチド」とは、ヌク
レオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステ
ル）をいう。ここで最も一般的なエステル化部位はペン
トースのＣ−５位で結合したヒドロキシル基である。本
開示の用語において多くの場合、ヌクレオシドは、ヌク
レオシドおよびヌクレオチドの両方を包含することが意
図される。本明細書中で使用される用語、ヌクレオチド
およびヌクレオシドは、例えば、他に記載されるよう
な、改変ヌクレオシド塩基部分、改変糖部分および／ま
たは改変リン酸エステル部分を有する合成アナログを含
むことが意図される（Scheit;Eckstein）。
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」
とは、ヌクレオチドモノマーの直鎖状ポリマーをいう
（一本鎖、二本鎖および三本鎖のデオキシヌクレオチ
ド、リボヌクレオチド、それらのα−アノマー形態など
が含まれる）。通常、ヌクレオシドモノマーはホスホジ
エステル結合により結合され、本明細書中で使用される
場合、用語「ホスホジエステル結合」とは、ホスホジエ
ステル結合またはそのホスフェートアナログを含む結合
をいう。ここでリン（phosphorous）原子は＋５の酸化
状態にあり、そして１つ以上の酸素原子が非酸素部分で
置換されている。例示的なホスフェートアナログには、
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロ
セレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニ
ロチオエート、ホスホロアニリデート（phosphoranilid
ate）、ホスホロアミデート（phosphoramidate）、ボロ
ノホスフェートなどを含み、これには関連する対イオン
（例えば、Ｈ、NH4、Naなど）が、もしそのような対イ
オンが存在するのならば、含まれる。あるいは、ホスホ
ジエステル結合または他の結合を介して連結された、ポ
リヌクレオチドは非ヌクレオチドモノマーのポリマーを
含み得る。これは標的核酸（例えば、ペプチド核酸（PN
A））ポリマーと配列特異的ハイブリッドを形成し得
る。ポリヌクレオチドは、代表的には、少数のモノマー
単位（例えば、８〜40）から数千モノマー単位のサイズ
の範囲である。ポリヌクレオチドが「ATGCCTG」のよう
な文字の配列により表される場合は常に、ヌクレオチド
は5'→3'の順で、左から右に存在し、他に記載されない
限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデ
オキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを
示し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが理解され
る。
とは、ヌクレオチドモノマーの直鎖状ポリマーをいう
（一本鎖、二本鎖および三本鎖のデオキシヌクレオチ
ド、リボヌクレオチド、それらのα−アノマー形態など
が含まれる）。通常、ヌクレオシドモノマーはホスホジ
エステル結合により結合され、本明細書中で使用される
場合、用語「ホスホジエステル結合」とは、ホスホジエ
ステル結合またはそのホスフェートアナログを含む結合
をいう。ここでリン（phosphorous）原子は＋５の酸化
状態にあり、そして１つ以上の酸素原子が非酸素部分で
置換されている。例示的なホスフェートアナログには、
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロ
セレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニ
ロチオエート、ホスホロアニリデート（phosphoranilid
ate）、ホスホロアミデート（phosphoramidate）、ボロ
ノホスフェートなどを含み、これには関連する対イオン
（例えば、Ｈ、NH4、Naなど）が、もしそのような対イ
オンが存在するのならば、含まれる。あるいは、ホスホ
ジエステル結合または他の結合を介して連結された、ポ
リヌクレオチドは非ヌクレオチドモノマーのポリマーを
含み得る。これは標的核酸（例えば、ペプチド核酸（PN
A））ポリマーと配列特異的ハイブリッドを形成し得
る。ポリヌクレオチドは、代表的には、少数のモノマー
単位（例えば、８〜40）から数千モノマー単位のサイズ
の範囲である。ポリヌクレオチドが「ATGCCTG」のよう
な文字の配列により表される場合は常に、ヌクレオチド
は5'→3'の順で、左から右に存在し、他に記載されない
限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデ
オキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを
示し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが理解され
る。
「伸長可能なヌクレオチド」とは、プライマー伸長反
応の間にプライマー伸長生成物中に取り込まれた場合
に、このようなプライマー伸長生成物のさらなる伸長を
可能にする任意のヌクレオチドを意味する。例示的な伸
長可能なヌクレオチドには、2'−デオキシヌクレオチド
三リン酸（例えば、2'−デオキシウリジン−5'−三リン
酸、2'−デオキシグアノシン−5'−三リン酸、2'−デオ
キシ−７−デアザデオキシグアノシン−5'−三リン酸、
2'−デオキシアザノシン−5'−三リン酸、2'−デオキシ
チミジン−5'−三リン酸および2'−デオキシシチジン−
5'−三リン酸）が挙げられる。必要に応じて、１つ以上
の伸長可能なヌクレオチドには標識を含む。
応の間にプライマー伸長生成物中に取り込まれた場合
に、このようなプライマー伸長生成物のさらなる伸長を
可能にする任意のヌクレオチドを意味する。例示的な伸
長可能なヌクレオチドには、2'−デオキシヌクレオチド
三リン酸（例えば、2'−デオキシウリジン−5'−三リン
酸、2'−デオキシグアノシン−5'−三リン酸、2'−デオ
キシ−７−デアザデオキシグアノシン−5'−三リン酸、
2'−デオキシアザノシン−5'−三リン酸、2'−デオキシ
チミジン−5'−三リン酸および2'−デオキシシチジン−
5'−三リン酸）が挙げられる。必要に応じて、１つ以上
の伸長可能なヌクレオチドには標識を含む。
「ヌクレオチドターミネーター」とは、プライマー伸
長生成物中に取り込まれた場合にこのようなプライマー
伸長生成物のさらなる伸長を阻害する任意のヌクレオチ
ドを意味する。ヌクレオチドターミネーターの１つの必
須条件は、ヌクレオチドターミネーターがリボフラノー
ス糖部分を含む場合に、さらなるヌクレオチドを取り込
むために引き続いてポリメラーゼによって使用され得る
ヒドロキシ基を、3'部位が有してはならないことであ
る。あるいは、リボフラノースアナログが使用され得る
（例えば、アラビノース）。例示的なヌクレオチドター
ミネーターには、2',3'−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフ
ラノシル、β−Ｄ−アラビノフラノシル、3'−デオキシ
−β−Ｄ−アラビノフラノシル、3'−アミノ−2',3'−
ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシルおよび2',3'−ジ
デオキシ−3'−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル（Ch
idgeavadze）が挙げられる。ヌクレオチドターミネータ
ーはまた、可逆性（reversable）ヌクレオチドターミネ
ーター（Metzker）を含む。
長生成物中に取り込まれた場合にこのようなプライマー
伸長生成物のさらなる伸長を阻害する任意のヌクレオチ
ドを意味する。ヌクレオチドターミネーターの１つの必
須条件は、ヌクレオチドターミネーターがリボフラノー
ス糖部分を含む場合に、さらなるヌクレオチドを取り込
むために引き続いてポリメラーゼによって使用され得る
ヒドロキシ基を、3'部位が有してはならないことであ
る。あるいは、リボフラノースアナログが使用され得る
（例えば、アラビノース）。例示的なヌクレオチドター
ミネーターには、2',3'−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフ
ラノシル、β−Ｄ−アラビノフラノシル、3'−デオキシ
−β−Ｄ−アラビノフラノシル、3'−アミノ−2',3'−
ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシルおよび2',3'−ジ
デオキシ−3'−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル（Ch
idgeavadze）が挙げられる。ヌクレオチドターミネータ
ーはまた、可逆性（reversable）ヌクレオチドターミネ
ーター（Metzker）を含む。
「ポリメラーゼ」は、プライマーの3'末端またはプラ
イマー伸長生成物上に、このようなプライマーまたはプ
ライマー反応生成物が標的核酸とアニールされる場合
に、ヌクレオチドの標的配列依存的取り込みを導く反応
を触媒し得る酵素または他の触媒を意味する。例示的な
ポリメラーゼには、Pfu DNAポリメラーゼ、E.Coliポリ
メラーゼＩ、Ｔ−７ポリメラーゼ、逆転写酵素、Taq DN
Aポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定され
ない（KornbergおよびBaker）。
イマー伸長生成物上に、このようなプライマーまたはプ
ライマー反応生成物が標的核酸とアニールされる場合
に、ヌクレオチドの標的配列依存的取り込みを導く反応
を触媒し得る酵素または他の触媒を意味する。例示的な
ポリメラーゼには、Pfu DNAポリメラーゼ、E.Coliポリ
メラーゼＩ、Ｔ−７ポリメラーゼ、逆転写酵素、Taq DN
Aポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限定され
ない（KornbergおよびBaker）。
「標識」とは、本発明のヌクレオチドまたはポリヌク
レオチドに結合した場合に、公知の検出方法を使用して
このようなヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを検出
可能にさせる任意の部分を意味する。標識は、直接標識
（それ自体が検出可能である）または間接標識（他の薬
剤と組み合わせて検出可能である）であり得る。例示的
な直接標識には、蛍光団（fluorophore）、発色団、ラ
ジオアイソトープ、スピンラベル、化学発光標識などが
挙げられるが、これらに限定されない。例示的な間接標
識には、シグナル生成事象を触媒する酵素、および抗原
またはビオチンのようなリガンド（高親和性で検出可能
な抗リガンドに特異的に結合し得る（例えば、標識抗体
またはアビジン））が挙げられる。
レオチドに結合した場合に、公知の検出方法を使用して
このようなヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを検出
可能にさせる任意の部分を意味する。標識は、直接標識
（それ自体が検出可能である）または間接標識（他の薬
剤と組み合わせて検出可能である）であり得る。例示的
な直接標識には、蛍光団（fluorophore）、発色団、ラ
ジオアイソトープ、スピンラベル、化学発光標識などが
挙げられるが、これらに限定されない。例示的な間接標
識には、シグナル生成事象を触媒する酵素、および抗原
またはビオチンのようなリガンド（高親和性で検出可能
な抗リガンドに特異的に結合し得る（例えば、標識抗体
またはアビジン））が挙げられる。
「プライマー伸長反応」とは、標的−プライマーハイ
ブリッドとヌクレオチドとの間の反応を意味する。これ
は、付加されたヌクレオチドが標的核酸の対応するヌク
レオチドに相補的であるように、プライマーの3'末端へ
のヌクレオチドの付加を生じる。
ブリッドとヌクレオチドとの間の反応を意味する。これ
は、付加されたヌクレオチドが標的核酸の対応するヌク
レオチドに相補的であるように、プライマーの3'末端へ
のヌクレオチドの付加を生じる。
「プライマー伸長試薬」とは、プライマー伸長反応を
もたらすのに必須である構成成分を含む試薬を意味す
る。プライマー伸長試薬には、代表的には、（ｉ）ポリ
メラーゼ酵素；（ii）緩衝液；および（iii）１つ以上
の伸長可能なヌクレオチドが挙げられる。
もたらすのに必須である構成成分を含む試薬を意味す
る。プライマー伸長試薬には、代表的には、（ｉ）ポリ
メラーゼ酵素；（ii）緩衝液；および（iii）１つ以上
の伸長可能なヌクレオチドが挙げられる。
「特異的結合対」とは、互いに特異的に結合して結合
複合体を形成する分子対をいう。特異的結合対の例に
は、抗体−抗原（またはハプテン）対、リガンド−レセ
プター対、酵素−基質対、ビオチン−アビジン対、相補
的な塩基対を有するポリヌクレオチドなどが挙げられる
が、これらに限定されない。
複合体を形成する分子対をいう。特異的結合対の例に
は、抗体−抗原（またはハプテン）対、リガンド−レセ
プター対、酵素−基質対、ビオチン−アビジン対、相補
的な塩基対を有するポリヌクレオチドなどが挙げられる
が、これらに限定されない。
「プライマー」とは、特定の標的配列と選択的にアニ
ールし得るポリヌクレオチドをいい、そして、これ以降
では、プライマーが5'→3'の方向で伸長される場合、プ
ライマー伸長反応の開始点として作用し得るポリヌクレ
オチドをいう。
ールし得るポリヌクレオチドをいい、そして、これ以降
では、プライマーが5'→3'の方向で伸長される場合、プ
ライマー伸長反応の開始点として作用し得るポリヌクレ
オチドをいう。
II.本発明の方法に使用される材料
A.標的核酸
本発明とともに使用される標的核酸は、任意の生存し
ている、またはかつて生存していた生物（原核生物、真
核生物、植物、動物、およびウイルスを含むがこれらに
限定されない）に由来し得る。標的核酸は、細胞の核
（例えば、ゲノムDNA）が起源であり得るか、または核
外核酸（例えば、プラスミド、ミトコンドリア核酸な
ど）であり得る。
ている、またはかつて生存していた生物（原核生物、真
核生物、植物、動物、およびウイルスを含むがこれらに
限定されない）に由来し得る。標的核酸は、細胞の核
（例えば、ゲノムDNA）が起源であり得るか、または核
外核酸（例えば、プラスミド、ミトコンドリア核酸な
ど）であり得る。
多数の方法が、本発明に使用する標的核酸の単離およ
び精製に利用可能である。好ましい精製方法は、実質的
にタンパク質を含まない標的核酸を提供して効率的なプ
ライマー伸長および核酸増幅を可能にするべきである。
好ましい精製方法には、（ｉ）好ましくは、自動DNA抽
出機（例えば、PE Applied Biosystems（Foster City,C
A）から入手可能であるModel 341 DNA Extractor）を使
用する有機溶媒抽出、引き続き、例えば、フェノール／
クロロホルム有機試薬を使用するエタノール沈殿（Ausu
bel）；（ii）固相吸着法（Walsh,Boom）；および（ii
i）塩誘導DNA沈殿法（Miller）（このような方法は代表
的には「塩析」方法と呼ばれる）が挙げられる。必要に
応じて、上記の精製法の各々は酵素切断工程に先んじて
行われて、サンプルからタンパク質を除去するのを助け
る（例えば、プロテイナーゼＫまたは他の類似のプロテ
アーゼでの切断）。
び精製に利用可能である。好ましい精製方法は、実質的
にタンパク質を含まない標的核酸を提供して効率的なプ
ライマー伸長および核酸増幅を可能にするべきである。
好ましい精製方法には、（ｉ）好ましくは、自動DNA抽
出機（例えば、PE Applied Biosystems（Foster City,C
A）から入手可能であるModel 341 DNA Extractor）を使
用する有機溶媒抽出、引き続き、例えば、フェノール／
クロロホルム有機試薬を使用するエタノール沈殿（Ausu
bel）；（ii）固相吸着法（Walsh,Boom）；および（ii
i）塩誘導DNA沈殿法（Miller）（このような方法は代表
的には「塩析」方法と呼ばれる）が挙げられる。必要に
応じて、上記の精製法の各々は酵素切断工程に先んじて
行われて、サンプルからタンパク質を除去するのを助け
る（例えば、プロテイナーゼＫまたは他の類似のプロテ
アーゼでの切断）。
本発明の方法の感度を増加させるため、好ましくは、
標的核酸は、適切な核酸増幅手順を使用して、本方法の
実施の前に増幅される。このような増幅は直線的か，ま
たは指数関数的である、好ましい実施態様において、標
的核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用
して達成され得る（Mullis）。一般的に、PCRは、初期
変性工程（これは二本鎖核酸サンプルの鎖を分離す
る）、続いて、（ｉ）アニーリング工程（これは増幅プ
ライマーを標的配列の隣接する位置に特異的にアニーリ
ングさせる）；（ii）伸長工程（これはプライマーを5'
→3'方向に伸長させ、それによって標的核酸に相補的な
アンプリコン核酸を形成する）、ならびに（iii）変性
工程（これはアンプリコンおよび標的配列の分離を生じ
させる）の繰り返しから構成される。上記の工程の各々
は、異なる温度で行われ得、ここで温度変化はサーマル
サイクラーを使用して達成され得る（PE Applied Biosy
stems,Foster City,CA）。
標的核酸は、適切な核酸増幅手順を使用して、本方法の
実施の前に増幅される。このような増幅は直線的か，ま
たは指数関数的である、好ましい実施態様において、標
的核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用
して達成され得る（Mullis）。一般的に、PCRは、初期
変性工程（これは二本鎖核酸サンプルの鎖を分離す
る）、続いて、（ｉ）アニーリング工程（これは増幅プ
ライマーを標的配列の隣接する位置に特異的にアニーリ
ングさせる）；（ii）伸長工程（これはプライマーを5'
→3'方向に伸長させ、それによって標的核酸に相補的な
アンプリコン核酸を形成する）、ならびに（iii）変性
工程（これはアンプリコンおよび標的配列の分離を生じ
させる）の繰り返しから構成される。上記の工程の各々
は、異なる温度で行われ得、ここで温度変化はサーマル
サイクラーを使用して達成され得る（PE Applied Biosy
stems,Foster City,CA）。
本発明での使用のための標的核酸の一般構造は、図１
に示される。ここで標的核酸５は、5'隣接部位10（これ
はプライマー相補部位15を含む）、3'隣接領域25および
5'隣接部位と3'隣接部位との間に配置された反復領域20
を含む。標的核酸の反復領域20は複数の反復単位（Ｒ）
n21を含み、ここでＲは反復単位を示し、そしてｎは反
復領域を構成する反復単位数を示す。反復単位Ｒは任意
の型の反復モチーフ、例えば、マイクロサテライト反復
（WebberおよびMay;Smeets;Williamson）、ミニサテラ
イト反復（Jeffreys、Caskey）またはα−サテライト反
復（Jabs）であり得るが、これらに制限されない。
に示される。ここで標的核酸５は、5'隣接部位10（これ
はプライマー相補部位15を含む）、3'隣接領域25および
5'隣接部位と3'隣接部位との間に配置された反復領域20
を含む。標的核酸の反復領域20は複数の反復単位（Ｒ）
n21を含み、ここでＲは反復単位を示し、そしてｎは反
復領域を構成する反復単位数を示す。反復単位Ｒは任意
の型の反復モチーフ、例えば、マイクロサテライト反復
（WebberおよびMay;Smeets;Williamson）、ミニサテラ
イト反復（Jeffreys、Caskey）またはα−サテライト反
復（Jabs）であり得るが、これらに制限されない。
反復領域は複数の型の反復単位またはそれ自体が多型
である反復単位から構成され得る。
である反復単位から構成され得る。
B.プライマー
本発明の使用のためのプライマーは、プライマーアニ
ーリングの特異的（すなわち、プライマー伸長反応にお
いて所望されない標的配列が関与する頻度）とプライマ
ー伸長の効率（すなわち、プライマー伸長反応において
所望の標的配列が関与する程度）の間のバランスを得る
ために設計される。
ーリングの特異的（すなわち、プライマー伸長反応にお
いて所望されない標的配列が関与する頻度）とプライマ
ー伸長の効率（すなわち、プライマー伸長反応において
所望の標的配列が関与する程度）の間のバランスを得る
ために設計される。
プライマーアニーリングの特異性は、一般にプライマ
ーの長さおよびアニーリング反応の温度により制御され
る。約18と24塩基との間のポリヌクレオチドが好まし
い。なぜならば、アニーリング温度がプライマー融解温
度の２、３℃以内に設定される場合、このようなポリヌ
クレオチドは非常に配列特異性である傾向があるからで
ある（Dieffenbach）。プライマー伸長を容易にするた
めに、3'末端のプライマーは−OH基またはプライマーの
3'末端にヌクレオチドの取り込みを可能にする他の部分
を含む。多数のコンピュータープログラムが異なる状況
におけるプライマー選択を容易にするために存在する
（Osborne;Montpetit）。
ーの長さおよびアニーリング反応の温度により制御され
る。約18と24塩基との間のポリヌクレオチドが好まし
い。なぜならば、アニーリング温度がプライマー融解温
度の２、３℃以内に設定される場合、このようなポリヌ
クレオチドは非常に配列特異性である傾向があるからで
ある（Dieffenbach）。プライマー伸長を容易にするた
めに、3'末端のプライマーは−OH基またはプライマーの
3'末端にヌクレオチドの取り込みを可能にする他の部分
を含む。多数のコンピュータープログラムが異なる状況
におけるプライマー選択を容易にするために存在する
（Osborne;Montpetit）。
プライマーの配列は、プライマーが標的核酸の5'隣接
部分のプライマー相補性部位にアニールするように選択
される。好ましくは，プライマーの3'末端が標的核酸の
反復領域の5'末端に近接するように、プライマーはアニ
ールする。しかし、プライマーはまた、標的の5'隣接部
分に対して少なくとも部分的に固定される限り、標的核
酸の反復領域のセグメントにアニールし得る。
部分のプライマー相補性部位にアニールするように選択
される。好ましくは，プライマーの3'末端が標的核酸の
反復領域の5'末端に近接するように、プライマーはアニ
ールする。しかし、プライマーはまた、標的の5'隣接部
分に対して少なくとも部分的に固定される限り、標的核
酸の反復領域のセグメントにアニールし得る。
好ましくは、本発明のプライマーは、標準化学（例え
ば、ホスホルアミダイト化学（Beaucage））を使用し
て、自動DNA合成機（例えば、PE Applied Biosystems
（Foster City,CA）model 392または394 DNA/RNA Synth
esizer）で従来どおり合成される。代替方法において
は、プライマーは生物学的供給源から単離され得る。
ば、ホスホルアミダイト化学（Beaucage））を使用し
て、自動DNA合成機（例えば、PE Applied Biosystems
（Foster City,CA）model 392または394 DNA/RNA Synth
esizer）で従来どおり合成される。代替方法において
は、プライマーは生物学的供給源から単離され得る。
C.固相支持体
本発明の方法の好ましい実施態様において，標的−プ
ライマーハイブリッドは分離工程の間、固相支持体に結
合される。このような結合は、標的核酸またはプライマ
ーポリヌクレオチドのいずれかを介してであり得る。
ライマーハイブリッドは分離工程の間、固相支持体に結
合される。このような結合は、標的核酸またはプライマ
ーポリヌクレオチドのいずれかを介してであり得る。
本発明での使用のための固相支持体は広範な形態を有
し得、これには、微粒子、ビーズ、膜、スライド、プレ
ート、微細加工チップ（micromachined chip）などを含
む。さらに、本発明の固相支持体は広範な種々の組成物
（ガラス、プラスチック、ケイ素、アルカンチオエート
誘導体化金、セルロース、低架橋型または高架橋型ポリ
スチレン、シリカゲル、ポリアミドなどを含む）を含み
得る。
し得、これには、微粒子、ビーズ、膜、スライド、プレ
ート、微細加工チップ（micromachined chip）などを含
む。さらに、本発明の固相支持体は広範な種々の組成物
（ガラス、プラスチック、ケイ素、アルカンチオエート
誘導体化金、セルロース、低架橋型または高架橋型ポリ
スチレン、シリカゲル、ポリアミドなどを含む）を含み
得る。
標的−プライマーハイブリッドの結合がプライマーを
介する場合、プライマーは、それらが合成された固相支
持体上を用いて使用され得るか、またはそれらは別々に
合成され、そして本発明の方法の分離工程の間またはそ
の工程の前の使用のために固相支持体に結合され得る。
介する場合、プライマーは、それらが合成された固相支
持体上を用いて使用され得るか、またはそれらは別々に
合成され、そして本発明の方法の分離工程の間またはそ
の工程の前の使用のために固相支持体に結合され得る。
プライマーが同じ固相支持体上で合成されそして使用
される場合、このような支持体は種々の形態を含み得、
そして種々の連結部分を含み得る。このような支持体
は、微粒子もしくは平面アレイ、または実質的に均一な
プライマー集団を有するマトリクスの領域を含み得る。
広範な種々の微粒子合成支持体は本発明で使用され得、
これには、制御された細孔ガラス（CPG）、高度に架橋
したポリスチレン、アクリルコポリマー、セルロース、
ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレイ
ンなどから成る微粒子が含まれる。微粒子支持体には、
市販のヌクレオシド誘導体化CPGおよびポリスチレンビ
ーズ（例えば、Applied Biosystems,Foster City,CAか
ら入手可能）；誘導体化磁気ビーズ；ポリエチレングリ
コールでグラフト化されたポリスチレン（例えば、Tent
aGel,Rapp Polymere,Tubingen Germany）などがさらに
含まれる。支持体特性（例えば、材料、多孔度、サイ
ズ、形状など）および使用される連結部分の型の選択
は、プライマーが使用される条件に依存する。例えば、
本発明において、ポリメラーゼ酵素の立体的障害を最小
にし、およびヌクレオチド基質への接近を容易にする、
支持体およびリンカーが好ましい。最も適切な微粒子支
持体を選択する場合に考慮される他の重要な因子には、
サイズの均一性、合成支持体としての有効性、既知の表
面積の程度、および光学特性（例えば、透明の滑らかな
ビーズは、表面上で多数のビーズを処理する場合に計測
的利点を提供する）が含まれる。
される場合、このような支持体は種々の形態を含み得、
そして種々の連結部分を含み得る。このような支持体
は、微粒子もしくは平面アレイ、または実質的に均一な
プライマー集団を有するマトリクスの領域を含み得る。
広範な種々の微粒子合成支持体は本発明で使用され得、
これには、制御された細孔ガラス（CPG）、高度に架橋
したポリスチレン、アクリルコポリマー、セルロース、
ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレイ
ンなどから成る微粒子が含まれる。微粒子支持体には、
市販のヌクレオシド誘導体化CPGおよびポリスチレンビ
ーズ（例えば、Applied Biosystems,Foster City,CAか
ら入手可能）；誘導体化磁気ビーズ；ポリエチレングリ
コールでグラフト化されたポリスチレン（例えば、Tent
aGel,Rapp Polymere,Tubingen Germany）などがさらに
含まれる。支持体特性（例えば、材料、多孔度、サイ
ズ、形状など）および使用される連結部分の型の選択
は、プライマーが使用される条件に依存する。例えば、
本発明において、ポリメラーゼ酵素の立体的障害を最小
にし、およびヌクレオチド基質への接近を容易にする、
支持体およびリンカーが好ましい。最も適切な微粒子支
持体を選択する場合に考慮される他の重要な因子には、
サイズの均一性、合成支持体としての有効性、既知の表
面積の程度、および光学特性（例えば、透明の滑らかな
ビーズは、表面上で多数のビーズを処理する場合に計測
的利点を提供する）が含まれる。
上記のように、プライマーもまた、単一の（または
２、３の）固相支持体上で合成され得、プライマーで均
一に被膜化されたアレイの領域を形成する。すなわち、
このようなアレイにおける各領域内で、同じプライマー
が合成される。このようなアレイを合成するための技術
は、他の場所に開示されている（Pease;Southern）。
２、３の）固相支持体上で合成され得、プライマーで均
一に被膜化されたアレイの領域を形成する。すなわち、
このようなアレイにおける各領域内で、同じプライマー
が合成される。このようなアレイを合成するための技術
は、他の場所に開示されている（Pease;Southern）。
プライマーが別々に合成され、そして続いて使用のた
めに固相支持体に結合される場合、プライマーは共有結
合または非共有結合を介して支持体に結合され得る。プ
ライマーが非共有結合を介して固体支持体に結合される
場合、プライマーは特異的な結合対の一方のメンバー
（例えば、ビオチン）を含み、対の他方のメンバー（例
えば、アビジン）は固体支持体に結合される。いくつか
の方法（例えば、5'−アミノポリヌクレオチドとイソチ
オシアネート機能化ガラス支持体（Guo）との反応を介
して）が、固体支持体へのポリヌクレオチドの共有結合
に利用可能である。プライマーを、共有的または非共有
的のいずれかで固体支持体に結合するための広範な例示
的な結合部分は、他の場所に開示されている（Pon;Web
b;Barany;Damha;Beattie;MaskosおよびSouthern）。
めに固相支持体に結合される場合、プライマーは共有結
合または非共有結合を介して支持体に結合され得る。プ
ライマーが非共有結合を介して固体支持体に結合される
場合、プライマーは特異的な結合対の一方のメンバー
（例えば、ビオチン）を含み、対の他方のメンバー（例
えば、アビジン）は固体支持体に結合される。いくつか
の方法（例えば、5'−アミノポリヌクレオチドとイソチ
オシアネート機能化ガラス支持体（Guo）との反応を介
して）が、固体支持体へのポリヌクレオチドの共有結合
に利用可能である。プライマーを、共有的または非共有
的のいずれかで固体支持体に結合するための広範な例示
的な結合部分は、他の場所に開示されている（Pon;Web
b;Barany;Damha;Beattie;MaskosおよびSouthern）。
プライマー−テンプレートハイブリッドの結合がテン
プレート核酸を介し、そしてテンプレート核酸がPCRア
ンプリコンである場合、共有結合または非共有結合のた
めの手段は、PCRを担うために使用されるPCRプライマー
に取り込まれ得る。従って、PCRプライマーは、特異的
な結合対のメンバー（例えば、ビオチン）、または共有
結合を形成するための機能化された固体支持体と反応し
得る反応性部分（例えば、イソチオシアネート機能化ガ
ラス支持体と反応する5'−アミノ基）を含み得る。
プレート核酸を介し、そしてテンプレート核酸がPCRア
ンプリコンである場合、共有結合または非共有結合のた
めの手段は、PCRを担うために使用されるPCRプライマー
に取り込まれ得る。従って、PCRプライマーは、特異的
な結合対のメンバー（例えば、ビオチン）、または共有
結合を形成するための機能化された固体支持体と反応し
得る反応性部分（例えば、イソチオシアネート機能化ガ
ラス支持体と反応する5'−アミノ基）を含み得る。
D.標識化ヌクレオチド
本発明の方法において、１つ以上の伸長可能なヌクレ
オチドおよび／またはヌクレオチドターミネーターは、
標識を含む。標識は、標識がプライマー伸長反応におい
て標識化ヌクレオチドのポリメラーゼ媒介性取り込みを
実質的に妨害しない様式で、ヌクレオチドに結合する。
多くの代替的な方法が、本発明での使用に適した様式
で、ヌクレオチドを標識化するために利用可能である
（Kricka）。標識化方法の好ましいクラスにおいて、ヌ
クレオチドのヌクレオシド塩基（すなわち、プリン塩基
のＮ−６位またはピリミジン塩基のＣ−５位）は、標識
を含むように改変される。標識化ヌクレオチドの特に好
ましいクラスは、プロパルギルエトキシアミノヌクレオ
チドである（Khan）。
オチドおよび／またはヌクレオチドターミネーターは、
標識を含む。標識は、標識がプライマー伸長反応におい
て標識化ヌクレオチドのポリメラーゼ媒介性取り込みを
実質的に妨害しない様式で、ヌクレオチドに結合する。
多くの代替的な方法が、本発明での使用に適した様式
で、ヌクレオチドを標識化するために利用可能である
（Kricka）。標識化方法の好ましいクラスにおいて、ヌ
クレオチドのヌクレオシド塩基（すなわち、プリン塩基
のＮ−６位またはピリミジン塩基のＣ−５位）は、標識
を含むように改変される。標識化ヌクレオチドの特に好
ましいクラスは、プロパルギルエトキシアミノヌクレオ
チドである（Khan）。
本発明の１つの好ましい実施態様において、標識され
た伸長可能なヌクレオチドは、例えば、適切な試薬また
は電磁放射を用いて処理した場合に、検出不能にされ得
る。この実施態様において、標識された伸長可能なヌク
レオチドは、ヌクレオチドから標識を除去するか、また
は標識のシグナル生成特性を破壊するかのいずれかによ
って検出不能にされ得る。
た伸長可能なヌクレオチドは、例えば、適切な試薬また
は電磁放射を用いて処理した場合に、検出不能にされ得
る。この実施態様において、標識された伸長可能なヌク
レオチドは、ヌクレオチドから標識を除去するか、また
は標識のシグナル生成特性を破壊するかのいずれかによ
って検出不能にされ得る。
いくつかの方法が、伸長可能なヌクレオチドに、標識
が容易に除去され得るように標識を結合するために利用
可能である。標識をヌクレオチドに結合するための例示
的な切断可能なリンカーには、Ｎ−［４−（ｐ−アジド
サリチルアミド）ブチル］−3'−［2'−ピリジルジチ
オ］プロピオンアミド（APDP）、ビス［２−（スクシン
イミドオキシカルボニルオキシル）エチル］スルホン
（BSOCOES）、ジスクシンイミジル（disuccininimdyl）
タータレート（DST）、およびエチレングリコビス−
［スクシンイミジルスクシネート］（EGS）などが含ま
れるが、これらに限定されない（Pierce Catalog）。
が容易に除去され得るように標識を結合するために利用
可能である。標識をヌクレオチドに結合するための例示
的な切断可能なリンカーには、Ｎ−［４−（ｐ−アジド
サリチルアミド）ブチル］−3'−［2'−ピリジルジチ
オ］プロピオンアミド（APDP）、ビス［２−（スクシン
イミドオキシカルボニルオキシル）エチル］スルホン
（BSOCOES）、ジスクシンイミジル（disuccininimdyl）
タータレート（DST）、およびエチレングリコビス−
［スクシンイミジルスクシネート］（EGS）などが含ま
れるが、これらに限定されない（Pierce Catalog）。
シグナル生成特性が、適切な試薬または電磁放射で処
理した場合に破壊され得る好ましい標識には、（蛍光特
性が、高強度の光への暴露を介する光分解によって、ま
たは酸化化学物質（例えば、酸素、次亜塩素酸ナトリウ
ム、過マンガン酸塩（permanginate）など）での処理に
よる化学的分解によって、破壊され得る蛍光標識が含ま
れる。標識の代替的な好ましいクラスには、不可逆的な
酵素インヒビターとの反応によって、または変性によっ
て検出不能にされ得る酵素、および単一な光生成変換の
みを受け得、従って自己破壊性である化学発光標識が含
まれる。
理した場合に破壊され得る好ましい標識には、（蛍光特
性が、高強度の光への暴露を介する光分解によって、ま
たは酸化化学物質（例えば、酸素、次亜塩素酸ナトリウ
ム、過マンガン酸塩（permanginate）など）での処理に
よる化学的分解によって、破壊され得る蛍光標識が含ま
れる。標識の代替的な好ましいクラスには、不可逆的な
酵素インヒビターとの反応によって、または変性によっ
て検出不能にされ得る酵素、および単一な光生成変換の
みを受け得、従って自己破壊性である化学発光標識が含
まれる。
E.第１および第２のプライマー伸長試薬
本発明には、本発明の方法に従って使用される場合、
プライマーの伸長を単一反復単位の不連続な増加におい
て進行させ得る（すなわち、プライマーは不連続なプラ
イマー伸長反応１サイクルあたり１つの反復単位によっ
てのみ伸長される）、第１および第２のプライマー伸長
試薬が含まれる。
プライマーの伸長を単一反復単位の不連続な増加におい
て進行させ得る（すなわち、プライマーは不連続なプラ
イマー伸長反応１サイクルあたり１つの反復単位によっ
てのみ伸長される）、第１および第２のプライマー伸長
試薬が含まれる。
本発明の第１のプライマー伸長試薬は、プライマー伸
長反応を、プライマーが完全な反復単位よりも少ない量
によって伸長される程度までのみ進行させ得る、１セッ
トの伸長可能なヌクレオチドを含む。従って、反復単位
の特定の配列に依存して、第１のプライマー伸長試薬は
種々の可能な伸長可能なヌクレオチドの組み合わせを含
み得る。例えば、反復単位の配列がAGCTである場合、第
１のプライマー伸長試薬は、伸長可能なヌクレオチドで
あるＴ（Ａと相補的である）、ＴおよびＣ（ＡおよびＧ
と相補的である）、またはＴおよびＣおよびＧ（Ａおよ
びＧおよびＣと相補的である）を含み得る。しかし、非
制御性の連続的なプライマー伸長を妨害するために、第
１のプライマー伸長試薬は全ての伸長可能なヌクレオチ
ドＴおよびＣおよびＧおよびＡを含んではならない。
長反応を、プライマーが完全な反復単位よりも少ない量
によって伸長される程度までのみ進行させ得る、１セッ
トの伸長可能なヌクレオチドを含む。従って、反復単位
の特定の配列に依存して、第１のプライマー伸長試薬は
種々の可能な伸長可能なヌクレオチドの組み合わせを含
み得る。例えば、反復単位の配列がAGCTである場合、第
１のプライマー伸長試薬は、伸長可能なヌクレオチドで
あるＴ（Ａと相補的である）、ＴおよびＣ（ＡおよびＧ
と相補的である）、またはＴおよびＣおよびＧ（Ａおよ
びＧおよびＣと相補的である）を含み得る。しかし、非
制御性の連続的なプライマー伸長を妨害するために、第
１のプライマー伸長試薬は全ての伸長可能なヌクレオチ
ドＴおよびＣおよびＧおよびＡを含んではならない。
特定の状況において、第１のプライマー伸長試薬を、
各サブ試薬が、反復配列のサブ部分が形成される程度ま
でのみプライマーが伸長され得るに十分な伸長可能なヌ
クレオチドを含むように、別々のサブ試薬にサブ分割す
ることが望ましい。例えば、反復単位がATGCCGTである
場合、第１のプライマー伸長試薬の１つのサブ試薬は、
伸長可能なヌクレオチドＴ、Ａ、およびＣを含み得、一
方、第１のプライマー伸長試薬の別のサブ試薬は伸長可
能なヌクレオチドＧおよびＣを含み得る。
各サブ試薬が、反復配列のサブ部分が形成される程度ま
でのみプライマーが伸長され得るに十分な伸長可能なヌ
クレオチドを含むように、別々のサブ試薬にサブ分割す
ることが望ましい。例えば、反復単位がATGCCGTである
場合、第１のプライマー伸長試薬の１つのサブ試薬は、
伸長可能なヌクレオチドＴ、Ａ、およびＣを含み得、一
方、第１のプライマー伸長試薬の別のサブ試薬は伸長可
能なヌクレオチドＧおよびＣを含み得る。
本発明の第２のプライマー伸長試薬は、プライマー伸
長反応を、第１のプライマー伸長試薬によって合成され
ない反復単位の部分が合成される程度までのみ進行させ
得る、１セットの伸長可能なヌクレオチドを含む。従っ
て、反復単位の特定の配列および第１のプライマー試薬
の組成に依存して、第２のプライマー伸長試薬は、種々
の可能なヌクレオチド組み合わせを含み得る。上記の実
施例を継続して、反復単位の配列がAGCTであり、そして
第１のプライマー伸長試薬が伸長可能なヌクレオチドＴ
およびＣを含む場合、第２のプライマー伸長試薬は伸長
可能なヌクレオチドＧおよびＡを含み得る。
長反応を、第１のプライマー伸長試薬によって合成され
ない反復単位の部分が合成される程度までのみ進行させ
得る、１セットの伸長可能なヌクレオチドを含む。従っ
て、反復単位の特定の配列および第１のプライマー試薬
の組成に依存して、第２のプライマー伸長試薬は、種々
の可能なヌクレオチド組み合わせを含み得る。上記の実
施例を継続して、反復単位の配列がAGCTであり、そして
第１のプライマー伸長試薬が伸長可能なヌクレオチドＴ
およびＣを含む場合、第２のプライマー伸長試薬は伸長
可能なヌクレオチドＧおよびＡを含み得る。
F.プライマー停止試薬
本発明は、一旦、プライマー伸長産物がプライマー停
止試薬と反応した場合、さらなるプライマー伸長が達成
され得ないように、プライマー伸長の終結を引き起こす
ためのプライマー停止試薬を含む。
止試薬と反応した場合、さらなるプライマー伸長が達成
され得ないように、プライマー伸長の終結を引き起こす
ためのプライマー停止試薬を含む。
本発明のプライマー停止試薬は、１つ以上のヌクレオ
チドターミネーターを含み、そして必要に応じて、プラ
イマー伸長反応を、プライマーがプライマー伸長反応に
おいて完全な反復単位よりも少ない量にまで伸長される
程度までのみ進行させる、１セットの伸長可能なヌクレ
オチドを含む。従って、反復単位の特定の配列、標的核
酸の3'隣接部分の配列、ならびに第１および第２のプラ
イマー伸長試薬の組成に依存して、プライマー停止試薬
は、種々の可能な伸長可能なヌクレオチドおよびヌクレ
オチドターミネーターの組み合わせを含み得る。例え
ば、反復単位の配列がAGCTであり、および3'隣接部分の
第１のヌクレオチドがＧであり、および第１ならびに第
２のプライマー伸長試薬が伸長可能なヌクレオチドＴ、
Ｃ、Ｇ、およびＡを含む場合、プライマー停止試薬はヌ
クレオチドターミネーターＣのみを含む（このようなヌ
クレオチドターミネーターは3'隣接部分に位置するＧと
相補的である）。あるいは、第１および第２のプライマ
ー伸長試薬が伸長可能なヌクレオチドＴおよびＣのみを
含む場合、プライマー停止試薬は伸長可能なヌクレオチ
ドＧおよびＡならびにヌクレオチドターミネーターＣを
含む。
チドターミネーターを含み、そして必要に応じて、プラ
イマー伸長反応を、プライマーがプライマー伸長反応に
おいて完全な反復単位よりも少ない量にまで伸長される
程度までのみ進行させる、１セットの伸長可能なヌクレ
オチドを含む。従って、反復単位の特定の配列、標的核
酸の3'隣接部分の配列、ならびに第１および第２のプラ
イマー伸長試薬の組成に依存して、プライマー停止試薬
は、種々の可能な伸長可能なヌクレオチドおよびヌクレ
オチドターミネーターの組み合わせを含み得る。例え
ば、反復単位の配列がAGCTであり、および3'隣接部分の
第１のヌクレオチドがＧであり、および第１ならびに第
２のプライマー伸長試薬が伸長可能なヌクレオチドＴ、
Ｃ、Ｇ、およびＡを含む場合、プライマー停止試薬はヌ
クレオチドターミネーターＣのみを含む（このようなヌ
クレオチドターミネーターは3'隣接部分に位置するＧと
相補的である）。あるいは、第１および第２のプライマ
ー伸長試薬が伸長可能なヌクレオチドＴおよびＣのみを
含む場合、プライマー停止試薬は伸長可能なヌクレオチ
ドＧおよびＡならびにヌクレオチドターミネーターＣを
含む。
本発明の特定の局面において、プライマー停止試薬
は、標識化ヌクレオチドターミネーターを含む。ヌクレ
オチドターミネーターの標識化は、本質的に、上記のＤ
節に記載されるように達成される。
は、標識化ヌクレオチドターミネーターを含む。ヌクレ
オチドターミネーターの標識化は、本質的に、上記のＤ
節に記載されるように達成される。
III.方法
本発明の方法の第１の局面の好ましい実施態様は、図
2A〜Ｃに模式的に示される。図において、本発明の方法
は、配列「AC」を有する２コピーの２塩基反復および反
復領域に隣接するＧヌクレオチドを有する3'隣接部分25
から成る反復領域20を有する標的核酸５に適用される。
第１の局面のこの好ましい実施態様において、プライマ
ー200は標的核酸５のプライマー相補的部分15にアニー
ルし、それによって標的−プライマーハイブリッドを形
成する。次いで標的−プライマーハイブリッドを、標識
化伸長可能なヌクレオチドＴを含む第１のプライマー伸
長試薬と反応させ、プライマー伸長産物210の3'末端に
標識化Ｔヌクレオチドを取り込ませる。第１のプライマ
ー伸長試薬との反応に続いて、第１のプライマー伸長試
薬を標的−プライマーハイブリッドから分離し、そして
標的−プライマーハイブリッドを、伸長可能なＧヌクレ
オチドを含む第２のプライマー伸長試薬と反応させ、プ
ライマー伸長産物215の3'末端にＧヌクレオチドを付加
させる。次いで、未反応の第２のプライマー伸長試薬を
標的−プライマーハイブリッドから分離し、そしてプラ
イマー伸長産物に取り込まれた標識化伸長可能なヌクレ
オチドの量を決定するための測定を行う。図のヒストグ
ラムによって示されるように、プロセスのこの時点にお
いて、大きなシグナルが検出され、このことは、取り込
まれた標識化Ｔヌクレオチドの存在を示す。最後に、続
いての不連続なプライマー伸長反応サイクルのための標
的−プライマーハイブリッドを調製するために、取り込
まれた伸長可能なヌクレオチドに結合した標識を検出不
能にする。実施例において、上記のプロセス工程を、図
2Bおよび2Cに示されように、さらに２回繰り返す。図2C
における第３のサイクルにおいて、測定されたシグナル
の強度は、第１の２つのサイクルにおいて見られるシグ
ナル強度と比較した場合、実質的に減少する。なぜな
ら、標識化伸長可能なヌクレオチドＴは、この時点でプ
ライマー伸長産物に取り込まれ得ないからである。従っ
て、第３のサイクルにおいて見られる測定されたシグナ
ルにおけるこの減少は、反復領域がAC反復単位の２コピ
ーのみを含むことを示す。
2A〜Ｃに模式的に示される。図において、本発明の方法
は、配列「AC」を有する２コピーの２塩基反復および反
復領域に隣接するＧヌクレオチドを有する3'隣接部分25
から成る反復領域20を有する標的核酸５に適用される。
第１の局面のこの好ましい実施態様において、プライマ
ー200は標的核酸５のプライマー相補的部分15にアニー
ルし、それによって標的−プライマーハイブリッドを形
成する。次いで標的−プライマーハイブリッドを、標識
化伸長可能なヌクレオチドＴを含む第１のプライマー伸
長試薬と反応させ、プライマー伸長産物210の3'末端に
標識化Ｔヌクレオチドを取り込ませる。第１のプライマ
ー伸長試薬との反応に続いて、第１のプライマー伸長試
薬を標的−プライマーハイブリッドから分離し、そして
標的−プライマーハイブリッドを、伸長可能なＧヌクレ
オチドを含む第２のプライマー伸長試薬と反応させ、プ
ライマー伸長産物215の3'末端にＧヌクレオチドを付加
させる。次いで、未反応の第２のプライマー伸長試薬を
標的−プライマーハイブリッドから分離し、そしてプラ
イマー伸長産物に取り込まれた標識化伸長可能なヌクレ
オチドの量を決定するための測定を行う。図のヒストグ
ラムによって示されるように、プロセスのこの時点にお
いて、大きなシグナルが検出され、このことは、取り込
まれた標識化Ｔヌクレオチドの存在を示す。最後に、続
いての不連続なプライマー伸長反応サイクルのための標
的−プライマーハイブリッドを調製するために、取り込
まれた伸長可能なヌクレオチドに結合した標識を検出不
能にする。実施例において、上記のプロセス工程を、図
2Bおよび2Cに示されように、さらに２回繰り返す。図2C
における第３のサイクルにおいて、測定されたシグナル
の強度は、第１の２つのサイクルにおいて見られるシグ
ナル強度と比較した場合、実質的に減少する。なぜな
ら、標識化伸長可能なヌクレオチドＴは、この時点でプ
ライマー伸長産物に取り込まれ得ないからである。従っ
て、第３のサイクルにおいて見られる測定されたシグナ
ルにおけるこの減少は、反復領域がAC反復単位の２コピ
ーのみを含むことを示す。
本発明の方法の第二の局面の好ましい実施態様は、図
3A〜Ｂに示される。以前と同様に、この方法は、配列
「AC」を有する２塩基反復の２コピーおよび反復領域に
隣接するＧヌクレオチドを有する3'隣接部分からなる反
復領域を有する標的核酸に適用される。第二の局面のこ
の好ましい実施態様において、以前と同様に、プライマ
ー200は、標的核酸５のプライマー相補的部分15にアニ
ーリングし、それにより標的プライマーハイブリッドを
形成する。次いで、標的プライマーハイブリッドを、非
標識伸長可能ヌクレオチドＴを含む第一のプライマー伸
長試薬と反応させ、非標識Ｔヌクレオチドをプライマー
伸長産物310の3'末端に組み込ませる。第一のプライマ
ー伸長試薬との反応に続いて、第一のプライマー伸長試
薬は、標的プライマーハイブリッドから分離され、そし
て標的プライマーハイブリッドを、伸長可能Ｇヌクレオ
チドを含む第二のプライマー伸長試薬および標識化Ｃヌ
クレオチドターミネーターを含むプライマー停止試薬と
反応させ、その結果、Ｇ伸長可能ヌクレオチドのみがプ
ライマー伸長産物315の3'末端に付加される。次に、未
反応の第二のプライマー伸長試薬およびプライマー停止
試薬を標的プライマーハイブリッドから分離し、そして
測定を行ってプライマー伸長産物に組み込まれた標識ヌ
クレオチドターミネーターの量を決定する。図に示され
るように、プロセスのこの時点で、シグナルは、検出さ
れず、これは、標識されたヌクレオチドターミネーター
が、プロセスのこのサイクルの間にプライマー伸長産物
に組み込まれていないことを示す。図3Bにおいて、上記
のプロセス工程が反復される。図3Bに示されるこの第二
のサイクルにおいて、測定されたシグナルの強度は、プ
ロセスの第一の工程において観察された名目上ゼロのシ
グナル強度に比較して、実質的に増加している。なぜな
ら、第二の工程の間に、標識されたヌクレオチドＣター
ミネーターは、プライマー伸長産物中に組み込まれるか
らである。
3A〜Ｂに示される。以前と同様に、この方法は、配列
「AC」を有する２塩基反復の２コピーおよび反復領域に
隣接するＧヌクレオチドを有する3'隣接部分からなる反
復領域を有する標的核酸に適用される。第二の局面のこ
の好ましい実施態様において、以前と同様に、プライマ
ー200は、標的核酸５のプライマー相補的部分15にアニ
ーリングし、それにより標的プライマーハイブリッドを
形成する。次いで、標的プライマーハイブリッドを、非
標識伸長可能ヌクレオチドＴを含む第一のプライマー伸
長試薬と反応させ、非標識Ｔヌクレオチドをプライマー
伸長産物310の3'末端に組み込ませる。第一のプライマ
ー伸長試薬との反応に続いて、第一のプライマー伸長試
薬は、標的プライマーハイブリッドから分離され、そし
て標的プライマーハイブリッドを、伸長可能Ｇヌクレオ
チドを含む第二のプライマー伸長試薬および標識化Ｃヌ
クレオチドターミネーターを含むプライマー停止試薬と
反応させ、その結果、Ｇ伸長可能ヌクレオチドのみがプ
ライマー伸長産物315の3'末端に付加される。次に、未
反応の第二のプライマー伸長試薬およびプライマー停止
試薬を標的プライマーハイブリッドから分離し、そして
測定を行ってプライマー伸長産物に組み込まれた標識ヌ
クレオチドターミネーターの量を決定する。図に示され
るように、プロセスのこの時点で、シグナルは、検出さ
れず、これは、標識されたヌクレオチドターミネーター
が、プロセスのこのサイクルの間にプライマー伸長産物
に組み込まれていないことを示す。図3Bにおいて、上記
のプロセス工程が反復される。図3Bに示されるこの第二
のサイクルにおいて、測定されたシグナルの強度は、プ
ロセスの第一の工程において観察された名目上ゼロのシ
グナル強度に比較して、実質的に増加している。なぜな
ら、第二の工程の間に、標識されたヌクレオチドＣター
ミネーターは、プライマー伸長産物中に組み込まれるか
らである。
以下の考察は、本発明の第一および第二の局面の上記
の方法工程のより詳細な記載を提供する。
の方法工程のより詳細な記載を提供する。
A.プライマーアニーリング
アニーリング反応を、配列特異性を保証するのに十分
であり、なお許容し得る割合で安定なハイブリッドを形
成させるのに十分に許容可能なストリンジェントな条件
下で行う。プライマーアニーリングに要求される温度お
よび時間の長さは、塩基の組成、プライマーの長さおよ
び濃度、ならびに使用される溶媒の性質（例えば、DMS
O、ホルムアミド、またはグリセロールのような共溶媒
およびマグネシウムのような対イオンの濃度）を含むい
くつかの因子に依存する。代表的には、合成ポリヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーションは、アニーリング溶
媒における標的プライマーハイブリッドの融解温度より
約５〜10℃低い温度で行われる。好ましくは、アニーリ
ング温度は、55〜75℃の範囲であり、そしてプライマー
濃度は、約0.2μＭである。これらの好ましい条件下
で、アニーリング反応は、わずか数秒で完了する。
であり、なお許容し得る割合で安定なハイブリッドを形
成させるのに十分に許容可能なストリンジェントな条件
下で行う。プライマーアニーリングに要求される温度お
よび時間の長さは、塩基の組成、プライマーの長さおよ
び濃度、ならびに使用される溶媒の性質（例えば、DMS
O、ホルムアミド、またはグリセロールのような共溶媒
およびマグネシウムのような対イオンの濃度）を含むい
くつかの因子に依存する。代表的には、合成ポリヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーションは、アニーリング溶
媒における標的プライマーハイブリッドの融解温度より
約５〜10℃低い温度で行われる。好ましくは、アニーリ
ング温度は、55〜75℃の範囲であり、そしてプライマー
濃度は、約0.2μＭである。これらの好ましい条件下
で、アニーリング反応は、わずか数秒で完了する。
B.プライマー伸長反応
プライマー伸長反応をもたらすのに必要とされる時間
は、標的配列の長さおよび濃度に、ならびに反応温度に
依存する。代表的な条件下でのヌクレオチド付加の速度
についての見積もりは、緩衝液、pH、塩濃度、ポリメラ
ーゼ酵素、およびDNAテンプレートの性質に依存して、
１秒あたり35〜100ヌクレオチドまで変化する。
は、標的配列の長さおよび濃度に、ならびに反応温度に
依存する。代表的な条件下でのヌクレオチド付加の速度
についての見積もりは、緩衝液、pH、塩濃度、ポリメラ
ーゼ酵素、およびDNAテンプレートの性質に依存して、
１秒あたり35〜100ヌクレオチドまで変化する。
単一反復単位の不連続な増分にて進行するプライマー
伸長反応を達成するために、本発明の方法に従って、プ
ライマー伸長反応は、２つの独立な工程：第一のプライ
マー伸長反応および第二のプライマー伸長反応、に分け
られる。第一のプライマー伸長反応において、プライマ
ーは、単一反復単位の長さよりも短い量だけ伸長し、こ
こでプライマー伸長の程度の制御は、第一のプライマー
伸長試薬の組成によってもたらされる。第二のプライマ
ー伸長反応において、プライマーは、第一のプライマー
伸長反応との組み合わせにおいて、プライマーが単一の
反復単位の長さに等しい量だけ伸長するような量だけ伸
長する。
伸長反応を達成するために、本発明の方法に従って、プ
ライマー伸長反応は、２つの独立な工程：第一のプライ
マー伸長反応および第二のプライマー伸長反応、に分け
られる。第一のプライマー伸長反応において、プライマ
ーは、単一反復単位の長さよりも短い量だけ伸長し、こ
こでプライマー伸長の程度の制御は、第一のプライマー
伸長試薬の組成によってもたらされる。第二のプライマ
ー伸長反応において、プライマーは、第一のプライマー
伸長反応との組み合わせにおいて、プライマーが単一の
反復単位の長さに等しい量だけ伸長するような量だけ伸
長する。
本発明の方法の第一の局面に従って、第一または第二
のプライマー伸長試薬の１つは、標識された伸長可能な
ヌクレオチドを含む。
のプライマー伸長試薬の１つは、標識された伸長可能な
ヌクレオチドを含む。
また、本発明の方法の第一の局面に従って、上記の２
工程不連続プライマー伸長反応の改変において、第二の
プライマー伸長試薬は、プライマー停止試薬を含む。従
って、第二のプライマー伸長反応の後に、プライマーが
標的核酸の反復領域の末端まで伸長されている場合、ヌ
クレオチドターミネーターは、プライマー伸長産物中に
組み込まれ、このようにして、そのプライマー伸長産物
のいかなるさらなる伸長も防止している。これは、標的
核酸の反復領域を越えて任意の偽プライマー伸長が起こ
る可能性を除去するので有利である。。本発明のこの実
施態様は、反復配列の２つの対立遺伝子が同時に調査さ
れる場合に特に好ましい。
工程不連続プライマー伸長反応の改変において、第二の
プライマー伸長試薬は、プライマー停止試薬を含む。従
って、第二のプライマー伸長反応の後に、プライマーが
標的核酸の反復領域の末端まで伸長されている場合、ヌ
クレオチドターミネーターは、プライマー伸長産物中に
組み込まれ、このようにして、そのプライマー伸長産物
のいかなるさらなる伸長も防止している。これは、標的
核酸の反復領域を越えて任意の偽プライマー伸長が起こ
る可能性を除去するので有利である。。本発明のこの実
施態様は、反復配列の２つの対立遺伝子が同時に調査さ
れる場合に特に好ましい。
本発明の第二の局面に従って、標識化ヌクレオチドタ
ーミネーターを含むプライマー停止試薬は、第二のプラ
イマー伸長反応に含まれる。好ましくは、標識されたヌ
クレオチドターミネーターは、標的核酸の3'隣接部分の
3'末端でのヌクレオチド（このような標的核酸の反復領
域に隣接する）に相補的であるように選択される。
ーミネーターを含むプライマー停止試薬は、第二のプラ
イマー伸長反応に含まれる。好ましくは、標識されたヌ
クレオチドターミネーターは、標的核酸の3'隣接部分の
3'末端でのヌクレオチド（このような標的核酸の反復領
域に隣接する）に相補的であるように選択される。
C.プライマーの分離およびプライマー伸長試薬
第一と第二のプライマー伸長反応との間において、分
離工程が、第一および第二のプライマー伸長試薬の混合
を防止し、それにより制御されないプライマー伸長を予
防するために行われる。分離工程をもたらすために使用
される手段は、標的プライマーハイブリッドを第一およ
び／または第二のプライマー伸長試薬から分離し得る任
意の手段であり得る。例示的な分離方法には、HPLC、電
気泳動、液体−液体抽出、固体−液体抽出、吸着などが
含まれるがこれらに限定されない。
離工程が、第一および第二のプライマー伸長試薬の混合
を防止し、それにより制御されないプライマー伸長を予
防するために行われる。分離工程をもたらすために使用
される手段は、標的プライマーハイブリッドを第一およ
び／または第二のプライマー伸長試薬から分離し得る任
意の手段であり得る。例示的な分離方法には、HPLC、電
気泳動、液体−液体抽出、固体−液体抽出、吸着などが
含まれるがこれらに限定されない。
好ましい実施態様において、標的プライマーハイブリ
ッドは、プライマー伸長試薬が、単に固体支持体を洗浄
することによって標的プライマーハイブリッドから分離
され得るように、分離工程の間に固体支持体に結合され
る。この実施態様に従って、プライマーは、第一のプラ
イマー伸長反応を行う前および後に固体支持体に結合さ
れ得る。洗浄条件は、標的プライマーハイブリッドが実
質的に破壊され、そしてプライマー伸長試薬の非特異的
な吸着が最小化されるようなものである。
ッドは、プライマー伸長試薬が、単に固体支持体を洗浄
することによって標的プライマーハイブリッドから分離
され得るように、分離工程の間に固体支持体に結合され
る。この実施態様に従って、プライマーは、第一のプラ
イマー伸長反応を行う前および後に固体支持体に結合さ
れ得る。洗浄条件は、標的プライマーハイブリッドが実
質的に破壊され、そしてプライマー伸長試薬の非特異的
な吸着が最小化されるようなものである。
D.シグナルの測定
第一または第二のプライマー伸長反応のいずれかの後
に、検出工程が行われ、ここで、プライマー伸長産物中
に組み込まれたインタクトな標識の量が決定される。利
用される標識のタイプにとって適切な任意の検出方法が
使用され得る。従って、可能な検出方法には、放射能検
出、光学吸収検出（例えば、UV可視吸収検出）、光学発
光検出（例えば、蛍光または化学発光）が含まれる。
に、検出工程が行われ、ここで、プライマー伸長産物中
に組み込まれたインタクトな標識の量が決定される。利
用される標識のタイプにとって適切な任意の検出方法が
使用され得る。従って、可能な検出方法には、放射能検
出、光学吸収検出（例えば、UV可視吸収検出）、光学発
光検出（例えば、蛍光または化学発光）が含まれる。
測定工程は、実施される本発明の局面、ならびに第一
および第二のプライマー伸長試薬の組成に依存して、プ
ロセスにおける種々の時点で起こり得る。第一の局面に
おいて、好ましくは、測定工程は、標識された伸長可能
なヌクレオチドを含むプライマー伸長試薬が標的プライ
マーハイブリッドと反応し、そしてそれから分離した後
に起こる。第二の局面において、測定工程は、標識され
たヌクレオチドターミネーターを含むプライマー伸長試
薬が標的プライマーハイブリッドと反応し、そしてそれ
から分離した後に起こる。
および第二のプライマー伸長試薬の組成に依存して、プ
ロセスにおける種々の時点で起こり得る。第一の局面に
おいて、好ましくは、測定工程は、標識された伸長可能
なヌクレオチドを含むプライマー伸長試薬が標的プライ
マーハイブリッドと反応し、そしてそれから分離した後
に起こる。第二の局面において、測定工程は、標識され
たヌクレオチドターミネーターを含むプライマー伸長試
薬が標的プライマーハイブリッドと反応し、そしてそれ
から分離した後に起こる。
E.標識を検出不能にする
本発明の第一の局面に従って、一旦標識からのシグナ
ルが、引き続く不連続プライマー伸長のサイクルを行う
前に検出されると、その標識は、検出不能になる。
ルが、引き続く不連続プライマー伸長のサイクルを行う
前に検出されると、その標識は、検出不能になる。
１つの好ましい実施態様において、標識は、プライマ
ー伸長産物に組み込まれた標識された伸長可能なヌクレ
オチドから標識を切除することによって検出不能にされ
る。ヌクレオチドからの標識の切断のために使用される
方法は、標識とヌクレオチドとを結合するために使用さ
れた切断可能な結合のタイプに依存する。上記を参照の
こと。例示的な切断試薬には、チオール、塩基、過ヨウ
素酸塩、ヒドロキシルアミンなどが含まれる。１つの好
ましい方法において、標識は、ウリシルヌクレオチドの
塩基部分に結合され、そして検出に続いて、標識は、標
識された伸長可能なヌクレオチドから、酵素ウリシルＮ
−グリコシラーゼ（UNG）での処置によって切除され
る。
ー伸長産物に組み込まれた標識された伸長可能なヌクレ
オチドから標識を切除することによって検出不能にされ
る。ヌクレオチドからの標識の切断のために使用される
方法は、標識とヌクレオチドとを結合するために使用さ
れた切断可能な結合のタイプに依存する。上記を参照の
こと。例示的な切断試薬には、チオール、塩基、過ヨウ
素酸塩、ヒドロキシルアミンなどが含まれる。１つの好
ましい方法において、標識は、ウリシルヌクレオチドの
塩基部分に結合され、そして検出に続いて、標識は、標
識された伸長可能なヌクレオチドから、酵素ウリシルＮ
−グリコシラーゼ（UNG）での処置によって切除され
る。
第二の好ましい実施態様において、標識は、標識自体
のシグナル生成特性を破壊することによって検出不能に
される。使用された標識のタイプに依存して、標識のシ
グナル生成特性を破壊するために使用され得るいくつか
の方法が存在する。例えば、標識が蛍光色素である場
合、標識は、酸素が豊富な環境下で、強力な光源を使用
する色素の光脱色によって検出不能にされ得る。標識が
酵素である場合、標識は、酵素をシグナル生成反応を触
媒不能にする不可逆的酵素インヒビターと標識とを反応
させることによって、検出不能にされ得る。標識が、単
一光産生変換のみを経験し得る化学蛍光剤である場合、
標識は、自己破壊的（autodistructing）であり、従っ
て標識を検出不能にする別々の反応を必要としない（Br
onstein）。
のシグナル生成特性を破壊することによって検出不能に
される。使用された標識のタイプに依存して、標識のシ
グナル生成特性を破壊するために使用され得るいくつか
の方法が存在する。例えば、標識が蛍光色素である場
合、標識は、酸素が豊富な環境下で、強力な光源を使用
する色素の光脱色によって検出不能にされ得る。標識が
酵素である場合、標識は、酵素をシグナル生成反応を触
媒不能にする不可逆的酵素インヒビターと標識とを反応
させることによって、検出不能にされ得る。標識が、単
一光産生変換のみを経験し得る化学蛍光剤である場合、
標識は、自己破壊的（autodistructing）であり、従っ
て標識を検出不能にする別々の反応を必要としない（Br
onstein）。
IV.方法の実施のためのキット
本発明には、本発明の方法の種々の局面および実施態
様を行うためのキットが含まれる。第一の局面におい
て、本発明のキットは、プライマー、第一のプライマー
伸長試薬、および第二のプライマー伸長試薬を含み、こ
こで少なくとも１つの第一または第二のプライマー伸長
試薬には、結合した標識を有する伸長可能なヌクレオチ
ドが含まれる。好ましくは、伸長可能なヌクレオチドに
結合した標識は、標識をプライマー伸長産物から切除す
るために、および／または標識のシグナル生成特性を破
壊するために有効な処置工程の後に検出不能にされ得
る。好ましくは、プライマーは、固体支持体に結合され
るか、または特定の結合対を介して、または共有結合部
分を介して固体支持体に結合され得る。別の好ましい実
施態様において、本発明のこの局面は、プライマーまた
は標的核酸を介した標的プライマーハイブリッドの結合
のための固相支持体を含む。任意的に、本発明のこの第
一の局面のキットは、プライマー停止試薬を含む。
様を行うためのキットが含まれる。第一の局面におい
て、本発明のキットは、プライマー、第一のプライマー
伸長試薬、および第二のプライマー伸長試薬を含み、こ
こで少なくとも１つの第一または第二のプライマー伸長
試薬には、結合した標識を有する伸長可能なヌクレオチ
ドが含まれる。好ましくは、伸長可能なヌクレオチドに
結合した標識は、標識をプライマー伸長産物から切除す
るために、および／または標識のシグナル生成特性を破
壊するために有効な処置工程の後に検出不能にされ得
る。好ましくは、プライマーは、固体支持体に結合され
るか、または特定の結合対を介して、または共有結合部
分を介して固体支持体に結合され得る。別の好ましい実
施態様において、本発明のこの局面は、プライマーまた
は標的核酸を介した標的プライマーハイブリッドの結合
のための固相支持体を含む。任意的に、本発明のこの第
一の局面のキットは、プライマー停止試薬を含む。
第二の局面において、本発明のキットは、プライマ
ー、第一の伸長試薬、第二のプライマー伸長試薬、およ
びプライマー停止試薬を含み、ここでプライマー停止試
薬には、結合した標識を有するヌクレオチドターミネー
ターが含まれる。第二のプライマー伸長試薬およびプラ
イマー停止試薬は、別々にかまたは混合物として一緒に
かのいずれかでパッケージングされ得る。好ましくは、
プライマーは、固体支持体に結合されるているか、ある
いは特定の結合対を介してか、または共有結合部分を介
して固体支持体に結合され得る。別の好ましい実施態様
において、本発明のこの局面は、プライマーまたは標的
核酸を介する標的プライマーハイブリッドの結合のため
の固相支持体を含む。
ー、第一の伸長試薬、第二のプライマー伸長試薬、およ
びプライマー停止試薬を含み、ここでプライマー停止試
薬には、結合した標識を有するヌクレオチドターミネー
ターが含まれる。第二のプライマー伸長試薬およびプラ
イマー停止試薬は、別々にかまたは混合物として一緒に
かのいずれかでパッケージングされ得る。好ましくは、
プライマーは、固体支持体に結合されるているか、ある
いは特定の結合対を介してか、または共有結合部分を介
して固体支持体に結合され得る。別の好ましい実施態様
において、本発明のこの局面は、プライマーまたは標的
核酸を介する標的プライマーハイブリッドの結合のため
の固相支持体を含む。
本開示において言及されるすべての刊行物および特許
出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が、特別に
そして個々に参考として援用されることが示される場合
と同程度に本明細書中に参考として援用される。
出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が、特別に
そして個々に参考として援用されることが示される場合
と同程度に本明細書中に参考として援用される。
いくつかの実施態様のみが上記に詳細に記載された
が、分子生物学分野の当業者は、好ましい実施態様にお
いて、その教示から逸脱することなく、多くの改変が可
能であることを明確に理解する。従って、すべてのこの
ような改変が以下の請求の範囲に含まれることが意図さ
れる。
が、分子生物学分野の当業者は、好ましい実施態様にお
いて、その教示から逸脱することなく、多くの改変が可
能であることを明確に理解する。従って、すべてのこの
ような改変が以下の請求の範囲に含まれることが意図さ
れる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ブラスバンド，アンドリュー ジェイ.
アメリカ合衆国 カリフォルニア
94061，レッドウッド シティ，ルビー
ストリート 1035
(56)参考文献 西独国特許出願公開4141178（ＤＥ,
Ａ１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
C12N 15/09
ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／Ｗ
ＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (22)
- 【請求項１】標的核酸の反復領域における反復単位数を
決定するための方法であって： （ａ）該標的核酸のプライマー相補性部分をプライマー
にアニーリングさせる工程であって、それによって標的
−プライマーハイブリッドを形成する、工程； （ｂ）第１のプライマー伸長試薬を使用して第１のプラ
イマー伸長反応を行う工程； （ｃ）該標的−プライマーハイブリッドと未反応の該第
１のプライマー伸長試薬を分離する工程； （ｄ）第２のプライマー伸長試薬を使用して第２のプラ
イマー伸長反応を行う工程であって、ここで該第１また
は第２のプライマー伸長試薬の少なくとも１つが、ヌク
レオチドに結合された標識を有する伸長可能なヌクレオ
チドを含む、工程； （ｅ）該標的−プライマーハイブリッドを未反応の該第
２のプライマー伸長試薬から分離する工程； （ｆ）該標識によって生成されるシグナルを測定する工
程； （ｇ）該標識を検出不能にさせるように、該標識を処理
する工程； （ｈ）該シグナルが前回のサイクルにおいて検出される
シグナルより少なくなるまで該工程（ａ）〜（ｇ）のサ
イクルを反復する工程；ならびに （ｉ）該標的核酸の反復領域における反復単位数を決定
する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２】前記工程（ｄ）が、前記標的−プライマー
ハイブリッドとプライマー停止試薬とを反応させる工程
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記標的−プライマーハイブリッドが固体
支持体に結合されている、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】前記プライマーが固体支持体に結合されて
いる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】前記標的核酸が固体支持体に結合されてい
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】前記標識が、蛍光分子および化学発光分子
からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】前記標識が、切断可能なリンカーを介して
伸長可能なヌクレオチドに結合されている、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項８】前記標的核酸が分析の前に増幅されてい
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】前記増幅がPCRを使用して達成される、請
求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】前記標識を検出不能にさせるように、該
標識を処理する工程が、前記標識された伸長可能なヌク
レオチドから該標識を切断することを包含する、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項１１】前記標識を検出不能にさせるように、該
標識を処理する工程が、該標識のシグナル生成特性を破
壊することを包含する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】標的核酸の反復領域における反復単位数
を決定するための方法であって： （ａ）該標的核酸のプライマー相補性部分をプライマー
にアニーリングさせる工程であって、それによって標的
−プライマーハイブリッドを形成する、工程； （ｂ）第１のプライマー伸長試薬を使用して第１のプラ
イマー伸長反応を行う工程； （ｃ）該標的−プライマーハイブリッドを未反応の該第
１のプライマー伸長試薬から分離する工程； （ｄ）第２のプライマー伸長試薬を使用しておよびプラ
イマー停止試薬とともに、第２のプライマー伸長反応を
行う工程であって、該プライマー停止試薬は、ヌクレオ
チドターミネーターに結合された標識を有するヌクレオ
チドターミネーターを含む、工程； （ｅ）該標的−プライマーハイブリッドを未反応の該第
２のプライマー伸長試薬および未反応の該プライマー停
止試薬から分離する工程； （ｆ）該標識によって生成されるシグナルを測定する工
程；ならびに （ｇ）該ヌクレオチドターミネーターの組み込みを示す
シグナルが検出されるまで該工程（ａ）〜（ｆ）のサイ
クルを反復する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項１３】前記標的−プライマーハイブリッドが固
体支持体に結合されている、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１４】前記プライマーが固体支持体に結合され
ている、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１５】前記標的核酸が固体支持体に結合されて
いる、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１６】前記標識が、蛍光分子および化学発光分
子からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１７】前記標的核酸が分析の前に増幅されてい
る、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１８】前記増幅がPCRを使用して達成される、
請求項17に記載の方法。 - 【請求項１９】標的核酸の反復領域における反復単位数
を決定するために有用なキットであって： 該標的核酸のプライマー相補性部分に配列相補性を有す
るプライマー； 第１のプライマー伸長試薬；および 第２のプライマー伸長試薬、 を含み、ここで該第１または第２のプライマー伸長試薬
の少なくとも１つは、ヌクレオチドに結合した標識を有
する伸長可能なヌクレオチドを含む、キット。 - 【請求項２０】前記プライマーが固体支持体に結合され
ている、請求項19に記載のキット。 - 【請求項２１】前記標識が、蛍光分子および化学発光分
子からなる群より選択される、請求項19に記載のキッ
ト。 - 【請求項２２】前記標識が、切断可能なリンカーを介し
て前記伸長可能なヌクレオチドに結合されている、請求
項19に記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/863,437 | 1997-05-27 | ||
| US08/863,437 US5945284A (en) | 1997-05-27 | 1997-05-27 | Length determination of nucleic acid repeat sequences by discontinuous primer extension |
| PCT/US1998/009657 WO1998054362A1 (en) | 1997-05-27 | 1998-05-11 | Length determination of nucleic acid repeat sequences by discontinuous primer extension |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000513587A JP2000513587A (ja) | 2000-10-17 |
| JP3509025B2 true JP3509025B2 (ja) | 2004-03-22 |
Family
ID=25341092
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50071099A Expired - Fee Related JP3509025B2 (ja) | 1997-05-27 | 1998-05-11 | 不連続プライマー伸長による核酸の反復配列長の決定 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5945284A (ja) |
| EP (1) | EP0983383B1 (ja) |
| JP (1) | JP3509025B2 (ja) |
| AU (1) | AU744027B2 (ja) |
| CA (1) | CA2291440C (ja) |
| DE (1) | DE69837255T2 (ja) |
| WO (1) | WO1998054362A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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