JP2003535568A - 核酸検出のための多重法 - Google Patents

核酸検出のための多重法

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JP2003535568A
JP2003535568A JP2000599904A JP2000599904A JP2003535568A JP 2003535568 A JP2003535568 A JP 2003535568A JP 2000599904 A JP2000599904 A JP 2000599904A JP 2000599904 A JP2000599904 A JP 2000599904A JP 2003535568 A JP2003535568 A JP 2003535568A
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ケパート，ダニエル
ローズ，リチャード・ビー
シュルツ，ジョン・ダブリュー
ライペ，ドナ
マンドレカー，ミッシェル
アンドリュース，クリスティーン・アン
ハートネット，ジェームズ・アール
グ，トレント
オルソン，ライアン・ジェイ
ウッド，キース・ヴイ
ウェルチ，ロイ
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プロメガ・コーポレーション
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    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers

Abstract

(57)【要約】 多重アッセイ形式を使用して、あらかじめ決定された核酸標的配列の存在について定性的および定量的に解析するための、核酸ハイブリッドの脱重合化を用いるプロセスが開示される。これらのプロセスの適用としては、単一の核酸の多型の検出、単一の塩基の変化の同定、種形成、遺伝子型決定、医薬マーカー診断などが挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 技術分野 本発明は、核酸の検出に関する。より具体的には、本発明は、核酸標的／プロ
ーブハイブリッドにおける複数の標的化され、あらかじめ決定された核酸配列の
存在または不在の検出、およびそれらの検出の種々の適用に関する。
【０００２】 発明の背景 核酸を検出するための方法、および特異的な核酸を検出するための方法は、大
きくおよび迅速に成長する分子生物学の分野が構築される基盤を提供する。代替
の方法および生成物についての不断の必要がある。別の方法よりもある方法を選
択するための理由は様々であり、そして放射活性物質を回避する希望、技術を使
用する資格の欠如、試薬もしくは装置の費用または利用可能性、費やす時間およ
び工程の数を最小にする希望、ある適用についての正確さもしくは感度、解析の
容易さ、１つのサンプルにおいて複数の核酸を検出する必要性、またはプロセス
を自動化する能力が挙げられる。
【０００３】 核酸または特異的な核酸の検出は、しばしば、それ自身が目的ではなくプロセ
スの一部分である。当該分野において核酸の検出の多くの適用があり、および新
規な適用が常に開発されている。核酸を検出し、そして定量する能力は、微生物
、ウイルス、および生物学的分子を検出するにおいて有用であり、ならびに従っ
てヒトおよび獣医の医薬、食品加工、および環境調査を含む、多くの分野に影響
する。さらに、生物学的サンプル（例えば、組織、痰、尿、血液、精液、唾液）
からの特異的な生体分子の検出および／または定量は、犯罪の容疑者を同定およ
び排除するような、法廷科学、父権調査、ならびに医学的診断における適用を有
する。
【０００４】 核酸を検出するためのいくつかの一般的な方法は、核酸配列の前もった知見に
基づかない。配列特異的でないが、ＲＮＡ特異的である核酸検出方法が、米国特
許第４,７３５，８９７号において記載され、ここではＲＮＡは、リン酸の存在
下ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）を使用して、またはリボヌクレア
ーゼを使用して、脱重合化される。ＰＮＰは、２本鎖ＲＮＡセグメントにて、ま
たはその近くで脱重合化を停止する。時折、２本鎖ＲＮＡは、リボソームＲＮＡ
、トランスファーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、およびｍＲＮＡのメッセージ部分に
おいて一般的であるように、二次構造ＲＮＡのタイプとして生じ得る。無機リン
酸の存在下でのｍＲＮＡのポリアデニル化されたテイルのＰＮＰ脱重合化は、Ａ
ＤＰを形成する。あるいは、リボヌクレアーゼを使用する脱重合化はＡＭＰを形
成する。形成されたＡＭＰは、ミオキナーゼでＡＤＰに変換され、そしてＡＤＰ
はピルビン酸キナーゼまたはクレアチンホスホキナーゼによってＡＴＰに変換さ
れる。有機リン酸同時反応物（ピルビン酸またはクレアチン）からのＡＴＰまた
は副産物のいずれかは、ｍＲＮＡを検出する間接的な方法として検出される。
【０００５】 米国特許第４,７３５，８９７号において、ＡＴＰはルシフェラーゼ検出系に
よって検出される。ＡＴＰおよび酸素の存在下、ルシフェラーゼはルシフェリン
の酸化を触媒し、光を生成し、これは次いでルミノメーターを使用して定量され
得る。反応のさらなる産物はＡＭＰ、ピロリン酸、およびオキシルシフェリンで
ある。
【０００６】 ２本鎖ＤＮＡは、臭化エチジウムのようなインターカレーティング色素を使用
して検出され得る。このような色素はまた、ハイブリッド形成を検出するために
使用される。
【０００７】 核酸を検出するためのハイブリダイゼーション法は、核酸配列の知見に依存す
る。多くの公知の核酸検出技術は、オリゴヌクレオチドプローブがサンプル中の
またはブロット上の核酸にハイブリダイズされるかまたはアニールされる特異的
な核酸ハイブリダイゼーションに依存し、そしてハイブリダイズされたプローブ
が検出される。
【０００８】 ハイブリダイズされた核酸の検出のためのプロセスの伝統的なタイプは、核酸
サンプルにハイブリダイズするために、標識された核酸プローブを使用する。例
えば、サザンブロット技術において、核酸サンプルは大きさに基づいてアガロー
スゲル中で分離され、そして膜に固定され、変性され、そしてハイブリダイズす
る条件下で標識された核酸プローブに曝露される。標識された核酸プローブが、
ブロット上の核酸とハイブリッドを形成する場合、標識は膜に結合される。サザ
ンブロットにおいて使用されるプローブは、放射活性、蛍光色素、ジゴキシゲニ
ン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびアクリジニ
ウムエステルで標識されている ハイブリダイズされた核酸の検出のための別のタイプのプロセスは、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する。ＰＣＲプロセスは当該分野において周知で
ある（米国特許第４,６８３，１９５号、同第４,６８３，２０２号、および同第
４,８００，１５９号）。ＰＣＲを簡潔にまとめるために、核酸増幅の標的配列
の反対の鎖に相補的な、核酸プライマーが、変性されたサンプルにアニールする
ことを許容される。ＤＮＡポリメラーゼ（典型的に熱安定性）は、ハイブリダイ
ズされたプライマーからＤＮＡ２本鎖を伸長する。プロセスは、核酸標的を増幅
するために反復される。核酸プライマーがサンプルにハイブリダイズしない場合
、対応する増幅されたＰＣＲ産物は何もない。この場合において、ＰＣＲプライ
マーはハイブリダイゼーションプローブとして作用する。ＰＣＲベースの方法は
、未知の配列の核酸の検出については使用が制限される。
【０００９】 ＰＣＲ法において、増幅された核酸産物は、多くの方法、例えば、標識された
プライマーを使用することによる増幅された鎖への標識されたヌクレオチドの取
り込みにおいて、検出され得る。ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは、放射
活性、蛍光色素、ジゴキシゲニン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、アクリジニウムエステル、ビオチン、およびタチナタマメのウレア
ーゼで標識されている。未標識のプライマーを用いて作製されたＰＣＲ産物は、
電気泳動ゲル分離、その後の色素ベースの可視化のような、他の方法において検
出され得る。
【００１０】 多重ＰＣＲアッセイは、当該分野において周知である。例えば、米国特許第５
，５８２，９８９号は、多重の公知のＤＮＡ配列の欠失の同時の検出を開示する
。そこに開示される技術は、標的にハイブリダイズする第１のセットのプローブ
を使用する。これらのプローブは、標的が存在する場合に伸長される。伸長産物
は、ＰＣＲを使用して増幅される。
【００１１】 蛍光技術はまた、核酸ハイブリッドの検出について公知であり、米国特許第５
，６９１，１４６号は、蛍光クエンチングされる蛍光ハイブリダイゼーションプ
ローブの、それらが標的核酸配列にハイブリダイズしない限りの使用を記載する
。米国特許第５，７２３，５９１号は、蛍光クエンチングされる蛍光ハイブリダ
イゼーションプローブを、それらが標的核酸配列にハイブリダイズされるまで、
またはプローブが消化されるまで、開示する。このような技術はハイブリダイゼ
ーションについての情報を提供し、および配列における単一の塩基の変異の検出
について種々の程度に有用である。いくつかの蛍光技術は、ＴａｑＭａｎ（Ｐｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；米国特許第５，６９１，１４６号および同第５，８７６
，９３０号）のような蛍光クエンチャーの近位から蛍光シグナルを放出するため
に、５'→３'方向における核酸ハイブリッドの消化を含む。
【００１２】 いくつかの３'→５'脱重合化活性が報告されている温度特異的ポリメラーゼ活
性を有する酵素としては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｕｔｓｃｈ
ｅｒおよびＫｏｒｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４４（１１）：３
０１９‐２８（１９６９）、Ｔ７ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｗｏｎｇら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：５２６-３７（１９９１）；ＴａｂｏｒおよびＲｉ
ｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８３２２-２８（１９９
０））、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡ ポリメラーゼ（Ｒｏｚｏｖｓｋａｙａら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２４：６４５-５０（１９９４）、ＡＭＶおよびＲＬＶ逆転
写酵素（ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＭｏｄａｋ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
５５：２０００-４（１９８０））、ならびにＨＩＶ逆転写酵素（Ｚｉｎｎｅｎ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２４１９５-２０２（１９９４））が挙
げられる。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性がＤＮＡハイブリッドのミスマッチ
される末端に対して報告されている温度依存性のポリメラーゼは、ファージ２９
ＤＮＡポリメラーゼである（ｄｅ Ｖｅｇａ、Ｍ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１５：
１１８２-１１９２、１９９６）。
【００１３】 多様な方法論が、ゲノムＤＮＡに存在する単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）
の検出のために現在存在する。ＳＮＰは、集団中に測定可能な頻度にて存在する
ＤＮＡの点変異または挿入／欠失である。ＳＮＰは、ゲノムにおいて最も共通の
変異である。ＳＮＰは、ゲノム内の規定された位置にて生じ、そして遺伝子マッ
ピングのために使用され得、集団の構造を規定し、および機能的な研究を行う。
ＳＮＰは、多くの公知の遺伝子疾患が点変異および挿入／欠失によって引き起こ
されるので、マーカーとして有用である。いくつかのＳＮＰは、それらが同時分
離をすることが知られているので他の疾患の遺伝子のマーカーとして有用である
。
【００１４】 ＳＮＰが偶発的に制限酵素認識配列を変化するまれな場合において、切断に対
する増幅されたＤＮＡの特異的な感度が、ＳＮＰ検出のために使用され得る。こ
の技術は、制限エンドヌクレアーゼによる特異的な認識のために、適切な配列の
情況において適切な制限酵素部位が存在するか、または導入されることを必要と
する。増幅後、産物は適切な認識エンドヌクレアーゼによって切断され、そして
産物は、ゲル電気泳動およびその後の染色によって解析される。サンプルがプロ
セシング、ゲル解析、およびデータの有意な解釈を、ＳＮＰが正確に決定され得
る前に必要とするので、この技術による解析の処理量は制限される。
【００１５】 一本鎖配座多型（ＳＳＣＰ）は、増幅されたＤＮＡセグメントに存在するＳＮ
Ｐを検出し得る第２の技術である（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ９
：７３−７９、１９９２）。この方法において、２本鎖の増幅された産物は変性
され、そして次いで両方の鎖は、非変性ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳
動の間に再アニールさせられる。分離された鎖は、分子内塩基対号に基づく特異
的な折り畳まれた配座を推定する。各鎖の電気泳動特性は、折り畳まれた配座に
依存する。配列における単一のヌクレオチドの変化の存在は、野生型サンプルに
比較した増幅されたサンプルの配座および電気泳動移動度における検出可能な変
化を引き起こし得、ＳＮＰが同定されることを許容する。ゲルベースの技術によ
り可能な制限される処理量に加えて、SSCPベースの実験の設計および解釈は困難
であり得る。同じＳＳＣＰ反応におけるいくつかのサンプルの多重解析は極めて
疑問である。変異検出および解析において必要とされる感度は、大部分の研究者
らを、放射活性に標識されたＰＣＲ産物をこの技術のために使用させる。
【００１６】 増幅不応性変異系（ＡＲＭＳ、対立遺伝子特異的ＰＣＲまたはＡＳＰＣＲとし
てもまた知られる）において、２つの増幅反応系が、ＳＮＰがＤＮＡサンプルに
存在するか否かを決定するために使用される（Ｎｅｗｔｏｎら、Ｎｕｃｌ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ １７：２５０３、１９８９；Ｗｕら、ＰＮＡＳ ８６：２７５
７、１９８９）。両方の増幅反応は、目的の標的についての共通のプライマーを
含む。第１の反応は、野生型遺伝子がサンプルに存在する場合にＰＣＲ産物を生
じる野生型産物に特異的な第２のプライマーを含む。第２のＰＣＲ反応は、ＤＮ
Ａの変異された形態に存在する塩基の変化を示す３'末端にてまたはその近くで
単一のヌクレオチド変異を有するプライマーを含む。第２のプライマーは、共通
のプライマーと組み合わせて、ゲノムＤＮＡの変異された形態を含むゲノムＤＮ
Ａが存在する場合にＰＣＲにのみ機能する。この技術は重複される増幅反応が行
われること、そして遺伝子の変異された形態が存在するか否かを確認するために
ゲル電気泳動によって解析されることを必要とする。さらに、データは手動で解
釈されなくてはならない。
【００１７】 単一塩基の伸長（ＧＢＡ（登録商標））は、捕獲されたＤＮＡ標的に１本鎖Ｄ
ＮＡプローブをハイブリダイズすることによってＳＮＰの検出を許容する（Ｎｉ
ｋｉｆｏｒｏｖ、Ｔ．ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：４１６７−４
１７５）。一旦ハイブリダイズされると、１本鎖のプローブは標識されたジデオ
キシヌクレオチドで１塩基伸長される。標識され、伸長された産物は次いで、比
色計または蛍光方法論を使用して検出される。
【００１８】 実時間（または動力学的）ＰＣＲに関する多様な技術がＳＮＰ検出を行うため
に適合されてきた。これらの系の多くは、プラットフォームベースであり、なら
びに特殊化された装置、複雑なプライマー設計、およびＳＮＰ検出のための高価
な支持物質を必要とする。対照的に本発明のプロセスは、末端使用者の処理量の
必要性に適応する多様な装置を使用し得るモジュール式の技術として設計された
。さらに、ルシフェラーゼ検出感度と、標準的なオリゴヌクレオチド化学および
十分に確立された酵素学との結びつけは、柔軟なおよび自由な系の構成を提供す
る。質量分析、ＨＰＬＣ、および蛍光検出法のような代替の解析的な検出法はま
た、本発明のプロセスにおいて使用され得、さらなるアッセイの柔軟性を提供す
る。
【００１９】 実時間増幅を使用するＳＮＰ検出は、核酸の増幅されたセグメントを、それら
の増幅反応の間にあるので、検出する能力に依存する。３つの基本的な実時間Ｓ
ＮＰ検出方法論が存在する：（ｉ）２本鎖ＤＮＡ特異的色素結合の増加される蛍
光、（ｉｉ）増幅の間の蛍光の減少されるクエンチング、および（ｉｉｉ）増幅
の間の増加される蛍光エネルギー転移（Ｗｉｔｔｗｅｒ、Ｃ．ら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１３０−１３８、１９９７）。これらの技術の全ては、
非ゲルベースであり、および各ストラテジーは簡潔に考察される。
【００２０】 多様な色素が、２本鎖化されたＤＮＡの結合に応答して増加される蛍光を示す
ことが知られる。この特性は、ＳＮＰの存在を検出するための上記の増幅不応性
変異系と組み合わせて利用される。野生型または変異を含有するＰＣＲ産物の生
成は、臭化エチジウムまたはＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎのような色素が集積される
ＰＣＲ産物に結合するので、これらの増加される蛍光によって継続的にモニター
される。色素結合はＰＣＲ産物の配列に選択性でないこと、およびこの技術を用
いて、高い非特異的バックグラウンドは偽シグナルを生じ得ることに注意のこと
。
【００２１】 実時間ＰＣＲの第２の検出技術は、エキソヌクレアーゼプライマー（ＴａｑＭ
ａｎ（登録商標）プローブ）として一般に公知であり、増幅反応に存在する２重
標識されたプローブを切断するためにＴａｑのような熱安定性のポリメラーゼの
５'エキソヌクレアーゼ活性を利用する（Ｗｉｔｔｗｅｒ、Ｃ．ら、Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１３０−１３８、１９９７；Ｈｏｌｌａｎｄ、Ｐら、
ＰＮＡＳ ８８：７２７６−７２８０、１９９１）。ＰＣＲ産物に相補的である
が、このアッセイにおいて使用されるプローブは、ＰＣＲプライマーとは異なり
、および蛍光し得る分子および蛍光をクエンチングし得る分子の両方で２重に標
識される。プローブが無傷である場合、ＤＮＡプローブ内の蛍光シグナルの分子
内クエンチングは、小さなシグナルを導く。蛍光分子が、増幅の間にＴａｑのエ
キソヌクレアーゼ活性によって遊離される場合、クエンチングは非常に減少され
て、増加された蛍光シグナルを導く。
【００２２】 実時間ＰＣＲのさらなる形態はまた、束縛されたクエンチング部分の使用によ
る蛍光部分の分子内クエンチングに利用される。分子標識の技術は、蛍光が目的
のＤＮＡ標的への結合によって回復される内部的にクエンチングされる蛍光団と
ともに、ヘアピンの形状の分子を利用する（Ｋｒａｍｅｒ、Ｒ．ら．Ｎａｔ．Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３‐３０８、１９９６）。蓄積されるＰＣＲ産
物への分子標識プローブの増加される結合は、ゲノムＤＮＡに存在するＳＮＰを
特異的に検出するために使用され得る。
【００２３】 実時間におけるＳＮＰの検出のために使用される最後の、一般的な蛍光検出ス
トラテジーは、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）（Ｗｉｔｔｗｅｒ、Ｃ．ら
、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１３０‐１３８、１９９７；Ｂｅｒｎａ
ｒｄ、Ｐ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３：１０５５‐１０６１、１９９
８）として知られる公知のプロセスと組み合わせて、ハイブリダイゼーションの
プローブとして公知の合成ＤＮＡセグメントを利用する。この技術は、標的配列
への標識されたＤＮＡプローブの独立した結合に依存する。標的配列への２つの
プローブの密接な接近が、一方のプローブから他方への共鳴エネルギー伝達を増
加し、独特の蛍光シグナルを導く。プローブのいずれかの結合を破壊するＳＮＰ
によって引き起こされるミスマッチは、ＤＮＡサンプルに存在する変異体配列を
検出するために使用され得る。
【００２４】 単一のサンプルにおける複数の核酸ハイブリッドの検出のための代替の方法に
ついての必要がある。非常に感度の高いこのような方法についての要求がある。
例えば、身体、組織、体液、または他の生物学的サンプルに存在する１０コピー
程度のウイルスを信頼性をもって検出することができる、単一のサンプルにおけ
る複数のウイルスのウイルス負荷を決定するための方法が、非常に要求される。
そうでなければ存在するかもしれない配列からわずかに異なる核酸配列の存在ま
たは不在を決定するための方法について非常な要求がある。サンプルにおいて特
定の種に独特の配列の存在または不在を決定するための方法についての非常な要
求がある。また、公知の方法よりも非常に感度が高い、定量的な、非常に再現可
能な、および自動化できる方法についての非常な要求がある。
【００２５】 必要な、あらかじめ決定された標的ヌクレオチド配列または対立遺伝子または
ポリヌクレオチド改変体の存在を検出するための別の方法が利用可能である場合
、これは有益である。このような方法が、マイクログラムからピコグラムの規模
のサンプルの大きさを使用して操作可能である場合、これはまた有益である。上
述で列挙される種々の方法が単一のアッセイにおいて複数の解析を提供し得る場
合（多重解析）、これはさらに有益である。続く開示は、１つのこのような方法
を提供する。
【００２６】 発明の簡単な要旨 本発明の方法は、核酸サンプルにおいて複数のあらかじめ決定された（公知の
）核酸標的配列の存在または不在を決定するために使用される。このような方法
は、核酸標的配列にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドプローブの３'−
末端を脱重合化し得る酵素を利用して、１つ以上のアイデンティファイアーヌク
レオチドを放出し、次いで、その存在または不在が決定され得る。
【００２７】 本発明の１つの実施態様は、核酸サンプルにおいて複数のあらかじめ決定され
た核酸標的配列の存在または不在を決定するための方法を意図する。従って、少
なくとも２つのあらかじめ決定された核酸標的配列の存在または不在が、決定さ
れたために探索される。この実施態様は以下の工程を包含する。
【００２８】 処理されたサンプルは、３'−末端領域においてアイデンティファイアーヌク
レオチドを含むそれらのそれぞれの核酸プローブとハイブリダイズされる複数の
あらかじめ決定された核酸標的配列を含む。処理されたサンプルは、その活性が
ハイブリダイズされた核酸プローブの３'‐末端から１つ以上のアイデンティフ
ァイアーヌクレオチドを放出する、脱重合化する量の酵素と混合され、処理され
た反応混合物を形成する。処理された反応混合物は、脱重合化条件下で酵素が、
ハイブリダイズされた核酸を脱重合化し、そしてアイデンティファイアーヌクレ
オチドをそこから放出することを許容するのに十分な期間、維持される。
【００２９】 解析的な出力結果は、放出されたアイデンティファイアーヌクレオチドの存在
または不在について解析することによって得られ、それによって、好ましくは、
ヌクレオチドが放出されたプローブは区別可能である。解析的な出力結果は、核
酸標的のあらかじめ決定された領域にてヌクレオチドの存在または不在を、およ
びそれによって、核酸標的の存在または不在を示す。
【００３０】 本発明の方法の解析的な出力結果は、多様な方法によって得られることが意図
される。解析的な出力結果は、発光によって確認され得る。いくつかの好ましい
実施態様において、放出された３'‐末端領域アイデンティファイアーヌクレオ
チドについての解析は、ルシフェラーゼ検出系（発光）またはＮＡＤＨ検出系（
吸光度分析）のいずれかによる、ＡＴＰの検出を包含する。特に好ましい実施態
様において、ＡＴＰ分子は、ＡＤＰの存在下で、例えば、ＮＤＰＫ（ヌクレオチ
ド二リン酸キナーゼ）のような酵素を使用する、リン酸転移工程による脱重合化
工程によって放出されるヌクレオチド三リン酸から形成される。いくつかの実施
態様において、ＡＴＰは、複数のＡＴＰ分子を形成するように増幅される。ＡＴ
Ｐ検出の実施態様において、典型的に、ヌクレオチドを転換し、ＡＤＰをＡＴＰ
に付加するための酵素（ＮＤＰＫ）が脱重合化反応に存在し、従ってこれらは「
ワンポット」法として示される。
【００３１】 代替の実施態様において、解析的な出力結果は蛍光分光法によって得られる。
広範に多様な蛍光検出法の使用が意図される。１つの例示的に意図される方法に
おいて、アイデンティファイアーヌクレオチドは蛍光標識を含む。核酸標的配列
が存在すること、および不在することを区別することが所望される多重解析にお
いて、複数のタイプの標識が使用され得る。アイデンティファイアーヌクレオチ
ドは、アイデンティファイアーヌクレオチドの放出の前にまたは後に、蛍光的に
標識され得る。放出されるアイデンティファイアーヌクレオチドはその他に蛍光
タグを含むことがまた意図される。このような実施態様において、本発明のプロ
セスにおけるヌクレオチドの放出は、例えば、プローブの５'末端にて、または
３'末端領域以外の領域において、蛍光タグによって画像化されるキャピラリー
電気泳動によって、ポリヌクレオチドプローブの長さにおける差異の検出により
確認される。
【００３２】 代替の実施態様において、解析的な出力結果は、質量分析によって得られる。
本明細書において、アイデンティファイアーヌクレオチドは、ヌクレオチドアナ
ログまたは標識されたヌクレオチドであり、およびそのヌクレオチドの通常の形
態の質量とは異なる分子質量を有することが好ましいが、質量における差異は必
要とされない。蛍光標識されたアイデンティファイアーヌクレオチドを用いて、
解析的な出力結果はまた、質量分析によって得られ得ることが注記される。放出
されるヌクレオチドの解析は、本発明のプロセスの脱重合化の工程の後にプロー
ブの質量における差異を確認することによって行われることがまた、意図される
。
【００３３】 別の代替の実施態様において、解析的な出力結果は、吸光度分析によって得ら
れる。このような解析は、紫外線およびスペクトルの可視領域における光の吸光
度をモニターして、吸収する種の存在を検出する。このようなプロセスの１つの
局面において、放出されるヌクレオチドは、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰ
ＬＣもしくはＧＣ）または電気泳動（例えば、ＰＡＧＥもしくはキャピラリー電
気泳動）によって、ハイブリダイズされた核酸および他のポリヌクレオチドから
分離される。放出されたアイデンティファイアーヌクレオチドまたは残りのプロ
ーブのいずれかが、本発明のプロセスにおいてアイデンティファイアーヌクレオ
チドの放出を確認するために解析され得る。このようなプロセスの別の局面にお
いて、標識は解析された核酸中に取り込まれ得る。
【００３４】 別の意図される実施態様において、アッセイされるサンプルはハイブリダイゼ
ーション組成物を形成するためにハイブリダイズする条件下で２つ以上の核酸プ
ローブとともに混合される。３'‐末端領域の核酸プローブは、核酸標的配列に
、この配列がサンプルにおいて存在する場合、部分的なまたは全体的な相補性を
伴って、ハイブリダイズする。核酸プローブの３'‐末端領域は、アイデンティ
ファイアーヌクレオチドを含む。
【００３５】 ハイブリダイゼーション組成物は、核酸プローブとハイブリダイズされた当該
あらかじめ決定された核酸標的配列を含み得る処理されたサンプル形成するのに
十分な期間、ハイブリダイズする条件下で維持される。処理されたサンプルは、
その活性がハイブリダイズされた核酸プローブの３'‐末端から１つ以上のヌク
レオチドを放出する、脱重合化する量の酵素と混合され、処理された反応混合物
を形成する。処理された反応混合物は、酵素が、ハイブリダイズされた核酸を脱
重合化し、そしてアイデンティファイアーヌクレオチドをそこから放出すること
を許容するのに十分な期間、脱重合化条件の下に維持される。
【００３６】 放出されたアイデンティファイアーヌクレオチドの存在は、解析的な出力結果
を得るために解析され、解析的な出力結果は核酸標的配列の存在または不在を示
す。解析的な出力結果は、上述で考察されるように種々の技術によって得られ得
る。
【００３７】 本発明の１つの方法は、アッセイされるサンプルにおけるそれらの核酸標的配
列における特異的な塩基の存在または不在を疑問にすることを意図し、以下の工
程を含む。ここで、ハイブリダイゼーション組成物は、ハイブリダイズする条件
下で、アッセイされるサンプルと、複数の核酸プローブとを混合することによっ
て形成される。アッセイされるべきサンプルは、疑問にされる核酸標的配列を含
み得る。核酸標的は、その存在または不在が同定される少なくとも１つの塩基を
含む。ハイブリダイゼーション組成物は、目的の核酸標的配列に各実質的に相補
的である複数の核酸プローブを含み、そして各プローブは、疑問の部位にて少な
くとも１つのあらかじめ決定されたヌクレオチド、および３'‐末端領域におい
てアイデンティファイアーのヌクレオチドを含む。
【００３８】 処理されたサンプルは、疑問の位置においてプローブヌクレオチドがその標的
配列において同定される塩基とアラインメントされる場合、全てのプローブにつ
いて塩基対合が生じるのに十分な期間、ハイブリダイズする条件下でハイブリダ
イゼーション組成物を維持することによって、形成される。処理される反応混合
物は、その活性がハイブリダイズされた核酸プローブの３'‐末端から１つ以上
のアイデンティファイアヌクレオチドを放出してハイブリッドを脱重合化する酵
素とを混合することによって形成される。この反応において使用され得る酵素は
さらに、本明細書中で考察される。処置される反応混合物は、酵素が、ハイブリ
ダイズされた核酸を脱重合化し、そしてアイデンティファイアーヌクレオチドを
そこから放出することを許容するのに十分な期間、脱重合化する条件下で維持さ
れる。
【００３９】 解析的な出力結果は、放出されたアイデンティファイアーヌクレオチドの存在
について解析することによって得られる。解析的な出力結果は、特異的な塩基ま
たは同定される塩基の存在または不在を示す。解析的な出力結果は、本明細書に
おいてさらに記載されるように、種々の技術によって得られる。好ましくは、ア
イデンティファイアーヌクレオチドは、疑問の領域にある。１つの好ましい実施
態様において、少なくとも複数の標的の１つがサンプルにおいて存在するか否か
を決定し得る。代替の好ましい実施態様において、複数の標的が存在することお
よび不在であることを決定し得る。
【００４０】 疑問の位置での特定の塩基の存在を同定する方法は、必要に応じて第１のプロ
ーブ、第２のプローブ、第３のプローブ、および第４のプローブを含む。第１の
プローブの疑問の位置は、デオキシアデノシンまたはアデノシン残基である核酸
残基を含む。第２のプローブの疑問の位置は、デオキシチミジンウリジン残基で
ある核酸残基を含む。第３のプローブの疑問の位置は、デオキシグアノシンまた
はグアノシン残基である核酸残基を含む。第４の核酸プローブの疑問の位置は、
デオキシシトシンまたはシトシン残基である核酸残基を含む。好ましくは、全て
の４つのプローブは、単一の脱重合化反応において使用され得、そしてそれらの
放出されるアイデンティファイアーヌクレオチドは区別可能である。
【００４１】 本発明の別の実施態様において、複数の標的核酸配列を含むサンプルは、複数
の核酸プローブと混合される。いくつかの解析的な出力結果はこのような多重化
されるアッセイから得られ得る。第１の実施態様において、少なくとも１つの核
酸プローブが、１つの標的核酸配列に部分的な相補性を伴ってハイブリダイズさ
れる場合に得られる解析的な出力結果は、全ての核酸プローブがそれらのそれぞ
れの核酸標的配列に全体的な相補性を伴ってハイブリダイズする場合の解析的な
出力結果よりも大きい。第２の実施態様において、少なくとも１つの核酸プロー
ブが、１つの標的核酸配列に部分的な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合
に得られる解析的な出力結果は、全ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸
標的配列に全体的な相補性を伴ってハイブリダイズする場合の解析的な出力結果
よりも小さい。第３の実施態様において、少なくとも１つの核酸プローブが、１
つの標的核酸配列に全体的な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られ
る解析的な出力結果は、全ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列
に部分的な相補性を伴ってハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも大
きい。第４の実施態様において、少なくとも１つの核酸プローブが、１つの標的
核酸配列に全体的な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られる解析的
な出力結果は、全ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列に部分的
相補性を伴ってハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも小さい。これ
らの４つの実施態様における使用のための脱重合化酵素は、本明細書中に記載さ
れる。
【００４２】 本発明のなお別の実施態様は、第１の核酸標的の存在または不在を、この標的
を含むか、または実質的に同一な第２の標的を含む核酸サンプルにおいて、決定
するための方法を意図する。例えば、第２の標的は、第１の核酸標的に比較して
、単一の塩基置換、欠失、または付加を有し得る。この実施態様は以下の工程を
包含する。
【００４３】 アッセイされるサンプルは、ハイブリダイズされる条件下で複数の核酸プロー
ブと混合されて、ハイブリダイゼーション組成物を形成する。第１および第２の
核酸標的は、あらかじめ決定された位置にて標的間で異なる少なくとも単一のヌ
クレオチド以外は配列同一性の領域をそれぞれ含む。核酸プローブのそれぞれは
、配列同一性の核酸標的領域に、実質的に相補的であり、および少なくとも１つ
のアイデンティファイアーヌクレオチドを疑問の位置にて含む。プローブの疑問
の位置は、標的とプローブとがハイブリダイズされる場合に標的のあらかじめ決
定された位置とアラインされる。各プローブはまた、３'‐末端領域においてア
イデンティファイアーヌクレオチドを含む。
【００４４】 ハイブリダイゼーション組成物は、処理されたサンプルを形成するのに十分な
時間、ハイブリダイズする条件下で維持され、ここでプローブの疑問の位置での
ヌクレオチドは、標的の同一性の領域においてあらかじめ決定された位置にてヌ
クレオチドとアラインされる。
【００４５】 処理された反応混合物は、その活性がハイブリダイズされた核酸プローブの３
'‐末端から１つ以上のヌクレオチドを放出することである酵素の脱重合化する
量とともに処理されたサンプルと混合することによって、形成される。反応混合
物は、酵素がハイブリダイズされた核酸プローブを脱重合化し、そしてアイデン
ティファイアーヌクレオチドを放出することを許容するのに十分な期間、脱重合
化の条件の下に維持される。
【００４６】 解析的な出力結果は、ハイブリダイズされたプローブの３'末端から放出され
たアイデンティファイアーヌクレオチドの存在または不在について解析すること
によって得られる。解析的な出力結果は、あらかじめ決定された領域にて放出さ
れたアイデンティファイアヌクレオチドの存在または不在、ならびに、それによ
って対応する核酸標的の存在または不在を示す。
【００４７】 上述の方法の１つの局面は、同じハイブリダイゼーション組成物における第１
のプローブおよび第２のプローブから構成される。第１のプローブは、あらかじ
め決定された位置にて第１の核酸標的に相補的であるヌクレオチドを疑問の位置
にて含む。第２のプローブは、あらかじめ決定された位置にて第２の核酸標的に
相補的であるヌクレオチドを疑問の位置にて含む。
【００４８】 上述の方法の別の局面の、第１および第２の標的から異なる、第３の核酸標的
の存在または不在は、第３の標的に実質的に同一である第４の標的をさらに含み
得る同じサンプルにおいてアッセイされる。
【００４９】 本発明のプロセスの１つの局面において、脱重合化酵素は、その活性がヌクレ
オチドを放出し、温度依存性のポリメラーゼであり、その活性は、３'−末端ヌ
クレオチドがマッチされるハイブリダイズされた核酸をピロリン酸イオンの存在
下３'から５'の方向に脱重合化して、１つ以上のヌクレオチドを放出する。従っ
て、酵素の活性は、脱重合化する条件下で、ハイブリダイズされた核酸を脱重合
して、アイデンティファイアーヌクレオチドを放出することである。好ましくは
、この酵素は、プローブの３'‐末端領域における塩基が、核酸標的の対応する
塩基と全体的な相補性を伴ってマッチされる、ハイブリダイズされた核酸を脱重
合化する。酵素は、３'‐末端領域から正確に対合される塩基を放出し続け、そ
してミスマッチされる塩基に到達する位置にて、またはその近くで停止する。
【００５０】 プロセスの代替の局面において、脱重合化酵素は、その活性はヌクレオチドを
放出し、ハイブリダイズされたプローブの３'‐末端にて１つ以上のミスマッチ
される塩基を有するハイブリダイズされた核酸が脱重合される３'から５'へのエ
キソヌクレアーゼ活性を示す。従って、酵素の活性は、脱重合化する条件下で、
ハイブリダイズされた核酸を脱重合して、ヌクレオチドを放出することである。
この実施態様において、ハイブリッドは、酵素処理のまえに遊離プローブから分
離され得る。いくかの実施態様において、過剰な標的が、酵素反応における遊離
プローブの濃度を極めて低くするために使用され得る。
【００５１】 なお別の本発明のプロセスの代替の局面において、脱重合化酵素が、ハイブリ
ッドの３'末端にて１つ以上のマッチされる塩基を有する２本鎖ＤＮＡ基質に対
して、３'から５'へのエキソヌクレアーゼ活性を示す。酵素の活性は、脱重合化
する条件下で、ハイブリダイズされた核酸を脱重合して、５'リン酸を含有する
ヌクレオチドを放出することである。
【００５２】 本発明のさらに別の局面において、アッセイされるべき核酸サンプルは、固体
または液体である生物学的サンプルから得られる。例示的な固体の生物学的サン
プルとしては、バイオプシーまたは死後により得られる組織のような動物組織、
および葉、根、茎、果実、および種子のような植物組織が挙げられる。例示的な
液体サンプルとしては、動物の痰、尿、血液、精液、および唾液のような体液、
または樹液もしくは植物組織が切断されるかまたは植物細胞が溶解または破壊さ
れる場合に得られる他の液体が挙げられる。
【００５３】 方法の１つの局面において、あらかじめ決定された核酸標的配列は、微生物ま
たはウイルスの核酸であり、および核酸プローブは、これらの微生物またはウイ
ルスの核酸配列に相補的な配列を含む。
【００５４】 本発明の別の局面において、あらかじめ決定された核酸標的配列はゲノムタイ
ピングに有用である遺伝子または遺伝子の領域である。例示的な標的配列として
は、Ｌｅｉｄｅｎ Ｖ変異、変異体β‐グロビン遺伝子、ΔＦ５０８対立遺伝子
の領域における嚢胞性線維症関連性遺伝子、プロトロンビン遺伝子における変異
、先天的な副腎過形成関連性遺伝子、ａｂ１遺伝子のセグメントの関与を伴うｂ
ｃｒ遺伝子の領域において生じる転座、ならびにあるガンおよびまた対立遺伝子
トリソミーにおいて見出されるようなある対立遺伝子の遺伝子座のヘテロ接合性
の喪失が挙げられる。
【００５５】 ゲノムタイピングはまた、イネ、ダイズ、またはトウモロコシのような植物の
ゲノム、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ
、Ｅ.ｃｏｌｉ ＯＨ１５７のような微生物のゲノム、およびサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなウイルスのゲノ
ムをアッセイするために使用され得る。
【００５６】 本発明のなおさらなる実施態様は、核酸サンプルにおいて、複数のあらかじめ
決定された核酸標的配列の存在または不在を決定するために、脱重合化酵素とし
て熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する方法を意図し、および以下の工程を包
含する。
【００５７】 ３'‐末端領域がそれらのあらかじめ決定された核酸標的配列に相補的であり
、および３'‐末端領域においてアイデンティファイアーヌクレオチドを含むそ
れらのそれぞれの核酸プローブにハイブリダイズする、複数のあらかじめ決定さ
れた核酸標的配列を含み得る処理されたサンプルが提供される。処理された脱重
合化反応混合物は、その活性がハイブリダイズされた核酸プローブの３'‐末端
からアイデンティファイアーヌクレオチドを放出することである酵素の脱重合化
量と処理されたサンプルを混合することによって、形成される。好ましいワンポ
ットの実施態様において、脱重合化酵素は熱安定性であり、およびより好ましく
は、処理された反応混合物はまた、（ｉ）アデノシン５'二リン酸、（ｉｉ）ピ
ロリン酸、および（ｉｉｉ）熱安定性のヌクレオシド二リン酸キナーゼを含む（
ＮＤＰＫ）。
【００５８】 処理されたサンプルは、脱重合化酵素がハイブリダイズされた核酸プローブを
脱重合化し、そしてアイデンティファイアーヌクレオチドをヌクレオシド三リン
酸として放出することを許容するのに十分な期間、約４℃〜約９０℃の温度にて
、より好ましくは、約２０℃〜約９０℃の温度にて、および最も好ましくは約２
５℃〜約８０℃の温度にて、脱重合化の条件下で維持される。好ましいワンポッ
トの反応において、期間はまた、ＮＤＰＫ酵素が放出されたヌクレオシド三リン
酸からリン酸を添加されるＡＤＰに転移し、それによってＡＴＰを形成すること
を許容するのに十分である。核酸標的配列の存在または不在は、ＡＴＰを使用し
て得られる解析的な出力結果から決定された。本発明の好ましい方法において、
解析的な出力結果は、発光分光法によって得られる。
【００５９】 核酸サンプルにおいてあらかじめ決定された核酸標的配列の存在または不在を
決定するための熱安定性酵素のワンポット方法の別の局面において、処理された
サンプルは以下のさらなる工程によって形成される。ハイブリダイゼーション組
成物は、ハイブリダイズする条件下で、アッセイされるサンプルと、複数の核酸
プローブとを混合することによって形成される。核酸プローブの３'‐末端領域
は、（ｉ）核酸標的配列に、その配列がサンプル中に存在する場合、部分的なま
たは全体的な相補性を伴ってハイブリダイズし、および（ｉｉ）アイデンティフ
ァイアーヌクレオチドを含む。処理されたサンプルは、あらかじめ決定された核
酸標的配列が核酸プローブとハイブリダイズするのに十分な期間、ハイブリダイ
ズする条件下でハイブリダイゼーション組成物を維持することによって形成され
る。
【００６０】 好ましくは、熱安定性酵素の方法について、脱重合化酵素は、Ｔｎｅ３重変異
体ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Ａｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｖｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、およびＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを含む好熱性ＤＮＡポリ
メラーゼの群より選択される。方法の別の局面において、ＮＤＰＫは、好熱細菌
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）によってコードされる。
【００６１】 本発明のなおさらなる実施態様は、複数の空間的な核酸プローブを使用して、
核酸サンプルにおける複数の核酸標的配列の存在または不在を決定することを意
図する。これらの空間的なプローブは標的核酸にハイブリダイズし、次いで、ヘ
アピン構造を形成し得るように修飾される。この実施態様は以下の工程を包含す
る。
【００６２】 それぞれが疑問の位置を有し、およびそれぞれが、そのそれぞれの核酸プロー
ブとハイブリダイズされ、複数の核酸標的配列を含み得る核酸サンプルを含む処
理されたサンプルが提供される。プローブは少なくとも２つの部分から構成され
る。第１の部分は、プローブの３'‐末端に約１０〜約３０ヌクレオチドを含む
。これらのヌクレオチドは疑問の位置の約１〜約３０ヌクレオチド下流で始まる
位置にて標的鎖配列に相補的である。プローブの第２の部分は、プローブの５'
‐末端領域に位置し、および標的配列の約１０〜約２０ヌクレオチドを含む。こ
の配列は、疑問の位置での、またはちょうど上流（５'）の核酸から、プローブ
の３'‐末端ヌクレオチドが標的にアニールするちょうど上流のヌクレオチドま
での、標的における領域におよぶ。ゼロ〜約５０の、好ましくは約ゼロ〜約２０
のヌクレオチドの長さであり、ならびに第１の部分および第２の部分のいずれと
もハイブリダイズしない配列を含む、プローブの必要に応じた第３の部分は、プ
ローブの第１の部分と第２の部分との間に位置される。
【００６３】 処理されたサンプルのハイブリダイズされたプローブは、温度依存性の様式に
おいて、ｄＮＴＰおよび温度依存性のポリメラーゼとの混合によるように、少な
くとも疑問の位置を介して伸長され、それによって伸長されたプローブ／標的ハ
イブリッドを形成する。好ましい実施態様において、プローブ伸長の長さは、疑
問の位置の上流に存在する標的配列のヌクレオチドに相補的なｄＮＴＰの伸長反
応からの省略、および疑問の位置の３'−末端に相補的なヌクレオチド間の不在
によって制限される。
【００６４】 伸長されたプローブ／標的ハイブリッドは、任意の未反応のｄＮＴＰから分離
される。伸長されたプローブ／標的ハイブリッドは変性されて、鎖に分離される
。伸長されたプローブ鎖はヘアピン構造を形成することを許容される。
【００６５】 処理された反応混合物は、ヘアピン構造を含有する組成物と、その活性が１つ
以上のヌクレオチドを伸長されたプローブのヘアピン構造の３'−末端から放出
することである酵素の、脱重合化する量とを混合することによって形成される。
反応混合物は、脱重合化酵素が、３'−末端ヌクレオチドを放出することを許容
するのに十分な期間、脱重合化条件の下に維持され、次いで、放出されたアイデ
ンティファイアーヌクレオチドの存在について解析される。解析的な出力結果は
、核酸標的配列の存在または不在を示す。好ましい実施態様において、種々の標
的についての解析的な出力結果は区別可能である。
【００６６】 ＲＥＡＰＥＲ(商標)と称される、本発明のなおさらなる実施態様はまた、ヘア
ピン構造を利用する。この方法は、核酸サンプルにおいて、複数の核酸標的配列
または標的内の特定の塩基の存在または不在を決定することを意図し、および以
下の工程を包含する。それらのそれぞれの第１の核酸プローブ鎖とハイブリダイ
ズされる複数の核酸標的配列を含み得る核酸サンプルを含む、処理されたサンプ
ルが提供される。
【００６７】 ハイブリッドは、第１のハイブリッドと称される。第１のプローブは少なくと
も２つの部分から構成される。第１の部分は、標的の疑問の位置の下流の約５〜
約３０ヌクレオチドで開始される位置にて標的核酸配列に相補的であるプローブ
の３'末端の約１０〜約３０ヌクレオチドを含む。第１のプローブの第２の部分
は、疑問の位置から疑問の位置の約１０〜約３０ヌクレオチド下流までの標的配
列の反復である約５〜約３０ヌクレオチドを含み、およびプローブの第１の部分
にハイブリダイズしない。必要に応じたブローブの第３の部分は、プローブの第
１の部分と第２の部分との間に位置され、ゼロ〜約５０の、好ましくは約２０ま
での、ヌクレオチドの長さであり、ならびに第１の部分および第２の部分のいず
れともハイブリダイズしない配列を含む。
【００６８】 処理されたサンプルにおける第１のハイブリッドは、第１のプローブの３'‐
末端で伸長され、それによって疑問の位置を通り過ぎる第１のプローブを伸長し
、そして配列が疑問の部分を含む伸長された第１のハイブリッドを形成する。伸
長された第１のハイブリッドは、元来の標的核酸および伸長された第１のプロー
ブから構成される。次いで、伸長された第１のハイブリッドは水性組成物中で変
性されて、ハイブリダイズされた２本鎖の２つの核酸鎖を分離し、そして分離さ
れた標的核酸および分離された伸長された第１のプローブを含む水性溶液を形成
する。
【００６９】 第２のプローブは約１０〜約２０００、好ましくは約１０〜約２００、最も好
ましくは約１０〜約３０のヌクレオチドの長さであり、および伸長された第１の
プローブにおける疑問の位置の下流の、約５〜約２０００、好ましくは約５〜約
２００のヌクレオチドで開始する位置にて伸長された第１のプローブに相補的で
ある、第２のプローブは、伸長された第１のプローブにアニールされ、それによ
って第２のハイブリッドを形成する。第２のハイブリッドは、その伸長が伸長さ
れた第１のプローブの５'−末端に達するまで第２のプローブの３'−末端で伸長
され、それによってその３'‐領域がアイデンティファイアーヌクレオチドを含
む第２の伸長されたハイブリッドを形成する。好ましい実施態様において、両方
の伸長に対して伸長するポリメラーゼは、鋳型における対応する相補的なヌクレ
オチドを有しない３'にヌクレオチドを付加しない。
【００７０】 伸長された第２のハイブリッドの水性組成物は変性されて２つの核酸鎖に分離
される。そのようにして形成される水性組成物は冷却されて、分離された伸長さ
れた第２のプローブから、そのそれぞれの標的配列が元来の核酸サンプルに存在
する場合、「ヘアピン構造」を形成する。
【００７１】 処置された反応混合物は、ヘアピン構造を含有する組成物と、その活性が１つ
以上のヌクレオチドを核酸ハイブリッドの３'‐末端から放出することである酵
素の、脱重合化する量とを混合することによって形成される。反応混合物は、３
'‐末端領域アイデンティファイアーヌクレオチドを放出するのに十分な期間、
脱重合化する条件の下に維持され、次いで、放出されたアイデンティファイアー
ヌクレオチドの存在について解析される。解析的な出力結果は、種々の核酸標的
配列の存在または不在を示す。
【００７２】 本発明は、多くの利益および利点を有し、それらのいくつかが以下に列挙され
る。 本発明の１つの利益は、いくつかの実施態様において、複数の核酸ハイブリッ
ドが、放射性化学物質および電気泳動についての必要性を伴わないで、非常に高
いレベルの感度を伴って検出され得ることである。
【００７３】 本発明の利点は、複数の標的核酸の存在または不在が、信頼性をもって、再現
可能に、および優れた感度を伴って検出され得ることである。 本発明のさらなる利益は、定量的な情報が、サンプルに存在する標的核酸配列
の量について得られ得ることである。
【００７４】 本発明のさらなる利点は、核酸配列における、単一のヌクレオチド多型（ＳＮ
Ｐ）を含む非常にわずかな差異が検出可能であることである、 なお別の本発明の利益は、多くの標的核酸配列の存在または不在が、同じアッ
セイにおいて決定され得ることである。
【００７５】 本発明のなお別の利点は、標的核酸の存在または不在が、少数の試薬および操
作を伴って決定され得ることである。 本発明の別の利益は、プロセスがそれ自身を自動化させることである。
【００７６】 本発明のなお別の利益は、核酸における変異、転座、およびＳＮＰの検出（遺
伝病と関連されるものを含む）、ウイルス負荷の決定、種の同定、サンプル混入
、ならびに法医学的なサンプルの解析を含むがこれらに制限されない、多くの異
なるタイプの適用およびアッセイにおける使用のその柔軟性である。
【００７７】 本発明のなおさらなる利益および利点は、以下の明細書および請求の範囲から
明白になる。 定義 本発明を理解することを容易にするために、多くの用語が以下に定義される。
【００７８】 本明細書中で使用されるように、「ヌクレオシド」は、ペントースに共有結合
的に連結されるプリン［グアニン（Ｇ）もしくはアデニン（Ａ）］またはピリミ
ジン［チミン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、もしくはシチジン（Ｃ）］塩基から構成
される化合物をいうのに対して、「ヌクレオチド」は、そのペントースのヒドロ
キシル基の１つでリン酸化されるヌクレオシドをいう。「ＸＴＰ」、「ＸＤＰ」
、および「ＸＭＰ」はリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドについ
ての一般的な名称であり、ここで当該分野における標準的な用法に従って、「Ｔ
Ｐ」は三リン酸を示し、「ＤＰ」は二リン酸を示し、および「ＭＰ」は一リン酸
を示す。リボヌクレオチドの亜属的な名称は、「ＮＭＰ」、「ＮＤＰ」、または
「ＮＴＰ」であり、およびデオキシリボヌクレオチドについての亜属的な名称は
、「ｄＮＭＰ」、「ｄＮＤＰ」、または「ｄＮＴＰ」である。また本明細書中で
使用されるように、「ヌクレオシド」として含まれるものは、一般に上述のヌク
レオシドについての置換体として使用される物質であり、例えば、これらの塩基
の修飾された形態（例えば、メチルグアニン）、またはイノシンのような当該分
野でこのような使用において周知の合成物質である。
【００７９】 本明細書中で使用されるように、「核酸」は、１つのヌクレオチドのペントー
スの３'位が、リン酸ジエステル基によって次のペントースの５'位に結合され、
およびヌクレオチド残基（塩基）が、特異的な配列、すなわち、ヌクレオチドの
線形の順に連結される、ヌクレオチドの共有結合的に連結される配列である。本
明細書中で使用されるように「ポリヌクレオチド」は、約１００ヌクレオチドの
長さよりも大きい配列を含む核酸である。本明細書中で使用されるように、「オ
リゴヌクレオチド」は、短いポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部分
である。オリゴヌクレオチドは典型的に、約２〜１００塩基の配列を含む。用語
「オリゴ」は、用語「オリゴヌクレオチド」の代わりに時折使用される。
【００８０】 本明細書中で使用されるように塩基の「位置」は、核酸内の所与の塩基または
ヌクレオチド残基の位置をいう。 本明細書中で使用されるように、「目的の核酸」は、サンプルにおいて研究す
ることを所望する任意の特定の核酸である。
【００８１】 核酸またはタンパク質に関して使用される場合の用語「単離された」は、同定
され、およびその天然の供給源においてこれが通常関連される少なくとも１つの
混入物（それぞれ核酸またはタンパク質）から分離される核酸配列またはタンパ
ク質をいう。単離された核酸またはタンパク質は、これが天然において見出され
る形態とは異なる形態または設定において存在する。対照的に単離されない核酸
またはタンパク質は、それらが天然において存在する状態において見出される。
【００８２】 本明細書中で使用されるように、用語「精製された」または「精製する」は、
タンパク質または核酸など目的の成分からいくつかの混入物を除去する任意のプ
ロセスの結果を意味する。精製された成分のパーセントは、それによってサンプ
ルにおいて増加される。
【００８３】 本明細書中で使用されるように、用語「野生型」は、集団において最も頻繁に
観察される遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物をい
い、従って遺伝子の「正常な」または「野生型」の形態と恣意的に名称される。
対照的に、本明細書中で使用されるように、用語「修飾された」または「変異体
」は、野生型の遺伝子または遺伝子産物に比較される場合、配列および／または
機能的な特性における改変（すなわち、変化された特徴）を示す遺伝子または遺
伝子産物をいう。
【００８４】 核酸は、異なるタイプの変異を含むことが公知である。本明細書中で使用され
るように、「点」変異は、単一の塩基の位置でのヌクレオチドの配列における変
化をいう。本明細書中で使用されるように、「傷害」は、１つ以上の塩基が欠失
または挿入によって変異され、それによって核酸配列は野生型配列とは異なる核
酸内の部位をいう。
【００８５】 本明細書中で使用されるように、「単一のヌクレオチド多型」あるいはＳＮＰ
は、特定の核酸の位置にて最も頻繁に生じる塩基からの変化である。 異なる種からの相同な遺伝子または対立遺伝子はまた、配列において変化する
ことが知られる。異なる種からの相同な遺伝子または対立遺伝子の領域は、本質
的に配列において同一であり得る。このような領域は、本明細書中で「同一性の
領域」といわれる。本明細書中で、「実質的な同一性の領域」は、いくつかの「
ミスマッチ」を含むことが意図され、ここで同一性の領域における同じ位置での
塩基が異なる。この塩基の位置は本明細書中で「ミスマッチな位置」といわれる
。
【００８６】 ＤＮＡ分子は、核酸リン酸ジエステル結合が、置換体モノヌクレオチドのペン
トース環の５'炭素および３'炭素に生じるので、「５'末端」（５'末端）および
３'末端（３'末端）を有するといわれる。新しい結合が５'炭素に対してである
ポリヌクレオチドの末端は、その５'末端ヌクレオチドである。新しい結合が３'
炭素に対してであるポリヌクレオチドの末端は、その３'末端ヌクレオチドであ
る。本明細書中で使用されるように、末端ヌクレオチドは、３'‐または５'‐末
端の末端の位置でのヌクレオチドである。本明細書中で使用されるように、核酸
配列は、より大きなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの内部に生じる
場合であっても、５'‐および３'‐末端を有するといわれ得る。例えば、より大
きな染色体配列内に位置される遺伝子配列は、５'‐および３'‐末端を有すると
なおいわれ得る。
【００８７】 本明細書中で使用されるように、核酸プローブの３'‐末端領域は、３'‐末端
の位置から約１０残基以内のヌクレオチドを含むプローブの領域をいう。 直鎖状または環状のいずれかのＤＮＡ分子において、不連続なエレメントは、
それらがそのエレメントの５'‐末端に結合されるかまたは結合されるかもしれ
ない場合、エレメントに関して「上流」または「５'」であるといわれる。同様
に、不連続なエレメントは、それらがそのエレメントの３'‐末端に結合される
かまたは結合されるかもしれない場合、エレメントに関して「下流」または「３
'」であるといわれる。転写は、ＤＮＡ鎖に沿って、５'〜３'の様式において進
行する。これはＲＮＡが、伸長する鎖の３'‐末端へのリボヌクレオチド‐５'‐
三リン酸の連続的な付加によって作製される（ピロリン酸の排除を伴う）ことを
意味する。
【００８８】 本明細書中で使用されるように、用語「標的核酸」または「核酸標的」は、目
的の特定の核酸配列をいう。従って、「標的」は、他の核酸分子の存在下、また
はより大きな核酸分子内に存在し得る。
【００８９】 本明細書中で使用されるように、用語「核酸プローブ」は、目的の別の核酸に
ハイブリダイズし得る、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいう。核
酸プローブは、精製された制限消化におけるように天然に生じ得るか、または合
成的に、組換え的に、またはＰＣＲ増幅によって生成され得る。本明細書中で使
用されるように、用語「核酸プローブ」は、本発明の方法において使用されるオ
リゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいう。その同じオリゴヌクレオチド
はまた、例えば、ＰＣＲ法において重合化のためのプライマーとして使用され得
るが、本明細書中で使用されるように、次いでそのオリゴヌクレオチドは、「プ
ライマー」といわれる。本明細書中で、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオ
チドは、ホスホロチオネート結合のようないくつかの修飾された結合を含み得る
。
【００９０】 本明細書中で使用されるように、用語「相補的な」または「相補性」は、Ａが
Ｔと対合し、およびＣがＧと対合する周知の塩基対合の法則によって関連される
核酸（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関して使用される。例えば、配列５'
‐Ａ‐Ｇ‐Ｔ‐３'は、配列３'‐Ｔ−Ｃ−Ａ−５'に相補的である。相補性は「
部分的」であり得、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合の法則に従ってマッチさ
れる。他方、「完全な」または「全体的な」相補性が、全ての塩基が塩基対合の
法則に従って適合される場合に、核酸鎖間にあり得る。核酸鎖間の相補性の程度
は、当該分野において周知であるように、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの
効力および強度に対して有意な効果を有する。これは、本発明の方法のような、
核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。用語「実質的に相補
的な」は、以下に記載されるような低いストリンジェンシーの条件の下、または
好ましくは９５℃に加熱され、次いで室温に冷却されたポリメラーゼ反応緩衝液
（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ１９５Ａ）において、標的核酸配列のいずれかのまたは両
方の鎖にハイブリダイズし得る任意のプローブをいう。本明細書中で使用される
ように、核酸プローブが標的核酸に部分的にまたは全体的に相補的であるとして
いわれる場合、これはプローブの３'−末端領域（すなわち、３'‐末端ヌクレオ
チドの位置の約１０ヌクレオチド以内）をいう。
【００９１】 本明細書中で使用されるように、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的
な核酸鎖の対合に関して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダ
イゼーションの強度（すなわち、核酸鎖間の会合の強度）は、核酸鎖間の相補性
の程度、塩の濃度、形成されるハイブリッドのＴm（融点）、他の成分の存在（
例えば、ポリエチレングリコールの存在または不在）、ハイブリダイズする鎖の
モル濃度、および核酸鎖のＧ：Ｃ含量のような条件によって関与され影響される
条件のストリンジェンシーを含む、当該分野において周知の多くの因子によって
、影響される。
【００９２】 本明細書中で使用されるように、用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブ
リダイゼーションが行われる、温度、イオン強度、および他の化合物の存在に関
して使用される。「高いストリンジェンシー」の条件を用いて、核酸塩基対合は
、高い頻度の相補的な塩基配列を有する核酸フラグメント間でのみ生じる。従っ
て、「弱い」または「低い」ストリンジェンシーの条件は、しばしば、他方の核
酸に完全に相補的でない核酸が、共にハイブリダイズまたはアニールされること
が所望される場合に必要とされる。当該分野は、多数の等価な条件が低いストリ
ンジェンシーの条件を含むために用いられ得ることを十分に知っている。
【００９３】 本明細書中で使用されるように、用語「Ｔm」は、「融点」に関して使用され
る。融点は、２本鎖化された核酸分子の５０％の集団が１本鎖に解離されるよう
になる温度である。核酸のＴmを算定するための式は、当該分野において周知で
ある。ハイブリッド核酸のＴmはしばしば、１Ｍの塩におけるハイブリダイゼー
ションアッセイから採用され、および一般的に、ＰＣＲプライマーについてのＴm を算定するために使用される式：Ｔｍ＝［（Ａ＋Ｔの数）×２℃＋（Ｇ＋Ｃの
数）×４℃］を用いて見積もられる。Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎら、ＰＣＲ、第２版
、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ‐Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９７）、第２４頁
。この式は、２０ヌクレオチドよりも長いプライマーについて不正確であること
が見出された。Ｉｄ．他のより精巧化された計算が当該分野に存在し、これはＴm の算定に構造特徴および配列特徴を考慮する。算定されたＴmは単に推定であり
；至適な温度は一般に、経験的に決定される。
【００９４】 本明細書中で使用されるように、用語「相同性」は、相補性の程度をいう。部
分的な相同性および完全な相同性（すなわち、同一）があり得る。少なくとも部
分的に完全な相補的な配列が標的核酸にハイブリダイズすることを妨げる部分的
に相補的な配列は、機能的な用語「実質的に相同な」を使用していわれる。
【００９５】 ｃＤＮＡまたはゲノムクローンのような２本鎖核酸配列に関して使用される場
合、本明細書中で使用されるように、用語「実質的に相同な」は、低いストリン
ジェンシーの条件下で２本鎖核酸配列の鎖にハイブリダイズし得るプローブをい
う。
【００９６】 １本鎖核酸配列に関して使用される場合、本明細書中で使用されるように、用
語「実質的に相同な」は、低いストリンジェンシーの条件下で１本鎖核酸鋳型配
列にハイブリダイズし得る（すなわち、これと相補的である）プローブをいう。
【００９７】 本明細書中で使用されるように、用語「疑問の位置」は、核酸プローブ内の目
的の所与の塩基の位置をいう。例えば、ＳＮＰの解析において、プローブにおけ
る「疑問の位置」は、野生型から変化され得る標的の単一のヌクレオチドに相補
的である位置にある。本発明の方法からの解析的な出力結果は、プローブの疑問
の位置に相補的である標的核酸の核酸残基についての情報を提供する。疑問の位
置は、核酸プローブの実際の３'‐末端ヌクレオチドの約１０塩基内にあるが、
３'‐末端ヌクレオチドの位置に必ずしもある必要はない。標的およびプローブ
核酸がハイブリダイズされる場合、標的核酸配列の疑問の位置は、プローブの疑
問の位置の向かい側にある。
【００９８】 本明細書中で使用されるように、用語「アイデンティファイアーヌクレオチド
」は、脱重合化反応か生じたことを同定するために、本発明のプロセスにおいて
その存在が検出されるヌクレオチドをいう。本発明の方法の特定の適用は、どの
残基がアイデンティファイアーヌクレオチドと考慮されるかを影響する。ＡＴＰ
検出を使用する方法について（例えば、ルシフェラーゼ／ルシフェリンまたはＮ
ＡＤＨ）、ここで、解析の間、脱重合化において放出された全てのヌクレオチド
は、ＮＤＰＫのような酵素でＡＴＰに「変換され」、放出された全てのヌクレオ
チドがアイデンティファイアーヌクレオチドである。同様に、ヌクレオチド間を
区別しない吸光度検出を使用する方法について、全ての放出されたヌクレオチド
がアイデンティファイアーヌクレオチドである。全ての放出されたヌクレオチド
が解析される質量分析検出について、全ての放出されたヌクレオチドがアイデン
ティファイアーヌクレオチドであるか；あるいは特定のヌクレオチド（例えば、
異なる質量を有するヌクレオチドアナログ）が検出され得る。蛍光検出について
、蛍光的に標識されたヌクレオチドは、アイデンティファイアーヌクレオチドで
ある。ヌクレオチドは核酸からの放出の前にまたは後に標識され得る。Ｘ線像検
出について、放射活性に標識されたヌクレオチドがアイデンティファイアーヌク
レオチドである。いくつかの場合において、アイデンティファイアーヌクレオチ
ドの放出は、本発明の脱重合化工程の後にプローブの残りを解析することによっ
て推定される。このような解析は一般的に、残りのプローブの大きさまたは質量
の検出により、および任意の記載される解析的な方法（例えば、その分子量をモ
ニターし、続いてキャピラリー電気泳動するためのプローブの５'‐末端におけ
る蛍光タグ）により得る。
【００９９】 本明細書中で使用されるように、用語「サンプル」は、その広い意味において
使用される。核酸を含有することが疑われるサンプルは、細胞、細胞から単離さ
れた染色体（例えば、分裂期染色体の展開）、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ
などを含み得る。
【０１００】 本明細書中で使用されるように、用語「検出」は、サンプル内のヌクレオチド
または核酸を定量的にまたは定性的に同定することをいう。 本明細書中で使用されるように、用語「脱重合化」は、核酸の３'末端からの
ヌクレオチドの除去をいう。
【０１０１】 本明細書中で使用されるように、用語「対立遺伝子」は、遺伝子の代替の形態
をいい、および本明細書中で使用されるように、用語「遺伝子座」は、核酸分子
における特定の位置をいう。
【０１０２】 発明の詳細な説明 本発明の多重法は、核酸サンプルにおいて複数のあらかじめ決定された（公知
の）核酸標的配列の存在または不在を決定するために使用される。核酸標的は、
その配列がその標的とハイブリダイズするプローブを設計するために知られてい
なければならないという点で「あらかじめ決定された」。しかし、核酸標的配列
は、本発明のプロセスに関して使用されるように、その存在が決定されたことが
望まれる、異なる核酸の存在をシグナルするためのレポーターとして単に作用さ
れ得ることに注意されるべきである。目的の別の核酸は、あらかじめ決定された
配列を有する必要はない。さらに、本発明のプロセスは、プローブの３'‐末端
領域にて、部分的な相補性を伴って標的にハイブリダイズするプローブを設計す
るために十分な配列のみが知られる標的内の塩基の同一性を同定するにおいて有
用である。
【０１０３】 このような方法は、次いでその存在または不在が標的配列の存在または不在を
示す解析的な出力結果として決定され得る１つ以上のアイデンティファイアーヌ
クレオチドを放出するために、核酸標的配列にハイブリダイズされるオリゴヌク
レオチドプローブの３'‐末端を脱重合化し得る酵素を利用する。
【０１０４】 核酸標的配列は、核酸プローブが核酸標的配列に部分的にまたは全体的に相補
的であるように提供される点であらかじめ決定される。核酸標的配列は、その標
的配列がサンプルに存在する場合プローブがハイブリダイズする核酸サンプルの
一部分である。
【０１０５】 方法の第１の工程は、アッセイされるサンプルと、複数の核酸プローブとを混
合する工程である。第１の工程の混合する工程は、典型的に、ハイブリダイゼー
ション組成物を形成するために低いストリンジェンシーのハイブリダイズする条
件下で行われる。このようなハイブリダイゼーション組成物において、核酸プロ
ーブの３'‐末端領域は、（ｉ）サンプルに存在し得る核酸標的配列に部分的な
または全体的な相補性を伴ってハイブリダイズし、および（ｉｉ）３'‐末端領
域においてアイデンティファイアーヌクレオチドを含む。
【０１０６】 好ましくは、核酸プローブは、標的核酸へのプローブの３'‐末端領域のハイ
ブリダイゼーションを妨げるような方法において、ヘアピン構造を形成するため
に、それ自身とハイブリダイズしないように設計される。プローブ設計を導くパ
ラメーターは、当該分野において周知である。
【０１０７】 ハイブリダイゼーション組成物は、それらのそれぞれの核酸プローブとハイブ
リダイズされる複数のあらかじめ決定された核酸標的配列を含み得る処置された
サンプルを形成するのに十分な期間、ハイブリダイズする条件下で維持される。
【０１０８】 アッセイされるサンプルが、プローブがハイブリダイズする標的配列を含まな
いという事象において、そのプローブについてのハイブリダイゼーションは起こ
らない。本発明の方法が、特定の標的配列がアッセイされるサンプルに存在する
かまたは不在であるかを決定するために使用される場合、得られる処理されるサ
ンプルは本発明の酵素についての基質を含まなくてもよい。結果として、３'末
端領域のアイデンティファイアーヌクレオチドは放出されず、そして解析的な出
力結果はバックグラウンドレベルであるかまたはこれに近い。
【０１０９】 意図される方法は、複数のプローブが１つ以上の複数のあらかじめ決定された
核酸標的配列がサンプルにおいて存在するかまたは不在であるかを決定するため
に利用される多重アッセイである。このような多重アッセイについて特に有用な
領域は、通常の解析的な出力結果が必要とされる核酸が不在であることを示すス
クリーニングアッセイにおいてである。
【０１１０】 １つの説明的な実施態様において、核酸サンプルは、複数のあらかじめ決定さ
れた変異体核酸の存在についてスクリーニングされる。この実施態様において、
変異体は、通常は存在せず、および解析的な出力結果は、例えば、変異体が存在
する場合を除いてほぼバックグラウンドレベルである。別の実施態様において、
複数のサンプルは、微生物特異的核酸の存在または不在について試験される。こ
こでは、また、健常な個体、動物、またはおそらく無菌の食品の集団がサンプリ
ングされ、必要とされる核酸の不在がほぼバックグラウンドレベルである解析的
な出力結果を提供し、そしてまれな例においてのみ、バックグラウンドの出力結
果よりも大きく現れる。
【０１１１】 上述のプロセスの多重化される実施態様において、サンプルは複数の異なる核
酸プローブと、好ましくは必要とされるような複数の核酸標的の増幅の後に混合
される。本発明のこの実施態様において、プローブの１つでのある結果について
の解析的な出力結果は、全てのプローブでの向かい合う結果からの解析的な出力
結果と区別可能である。
【０１１２】 好ましい実施態様において、ＡＤＰの存在下、放出されたヌクレオチドのＮＤ
ＰＫ変換を介して生成されるＡＴＰは、ルシフェラーゼ検出系またはＮＡＤＨ検
出系によって検出される。本発明のなお別の実施態様において、ピロリン酸転移
工程およびリン酸転移工程が、シングルポットの反応において行われる。別の好
ましい実施態様において、増加される感度が必要とされる場合、ＡＴＰ分子は増
幅され得る。
【０１１３】 意図される多重の実施態様において、複数の核酸標的配列の存在または不在に
ついての情報は、サンプルと、種々の核酸標的についての複数の核酸プローブと
を混合することによって、単一の核酸サンプルに対して本発明のプロセスを使用
して決定される。
【０１１４】 本発明の第１の多重の実施態様において、少なくとも１つの核酸プローブがそ
の標的核酸配列に部分的な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られる
解析的な出力結果は、全ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列に
全体的な相補性を伴ってハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも大き
い。好ましくは、このような実施態様において、その活性がヌクレオチドを放出
するためにハイブリダイズされた核酸を脱重合化することである酵素は、３'→
５'−エキソヌクレアーゼ活性を示し、ハイブリダイズされたプローブの３'−末
端で１つ以上のミスマッチされる塩基を有するハイブリダイズされた核酸を脱重
合化する。
【０１１５】 本発明の第２の多重の実施態様において、少なくとも１つの当該核酸プローブ
がその標的核酸配列に部分的な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得ら
れる解析的な出力結果は、全ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配
列に全体的な相補性を伴ってハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも
小さい。好ましくは、このような実施態様において、その活性がヌクレオチドを
放出するためにハイブリダイズされた核酸を脱重合化することである酵素は、温
度依存性のポリメラーゼである。
【０１１６】 本発明の第３の多重の実施態様において、少なくとも１つの当該核酸プローブ
がその標的核酸配列に全体的な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得ら
れる解析的な出力結果は、全ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配
列に部分的な相補性を伴ってハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも
大きい。好ましくは、このような実施態様において、その活性がヌクレオチドを
放出するためにハイブリダイズされた核酸を脱重合化することである酵素は、温
度依存性のポリメラーゼである。
【０１１７】 本発明の第４の多重の実施態様において、少なくとも１つの当該核酸プローブ
がその標的核酸配列に全体的な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得ら
れる解析的な出力結果は、全ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配
列に部分的な相補性を伴ってハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも
小さい。好ましくは、このような実施態様において、その活性がヌクレオチドを
放出するためにハイブリダイズされた核酸を脱重合化することである酵素は、３
'→５'−エキソヌクレアーゼ活性を示し、ハイブリダイズされたプローブの３'
−末端で１つ以上のミスマッチされる塩基を有するハイブリダイズされた核酸を
脱重合化する。
【０１１８】 処理されたサンプルは、脱重合化反応混合物を形成するために、その活性が核
酸標的にハイブリダイズされるプローブの３'‐末端から１つ以上のアイデンテ
ィファイアーヌクレオチドを放出することである、脱重合化する量の酵素と共に
混合される。プロセスにおいて使用される酵素の選択は、３'‐末端ヌクレオチ
ドでのマッチまたはミスマッチが３'‐末端ヌクレオチドの放出を生じる場合に
決定される。特異的な酵素反応条件に関するさらなる情報は、本明細書中以後に
詳細に考察される。
【０１１９】 脱重合化反応混合物は、酵素がハイブリダイズされた核酸を脱重合し、そして
そこからアイデンティファイアーヌクレオチドを放出して、処理された反応混合
物を形成することを許容するのに十分な期間、脱重合化する条件下で維持される
。
【０１２０】 次いで、放出されたアイデンティファイアーヌクレオチドの存在または不在が
解析的な出力結果を得るために決定される。解析的な出力結果はサンプルにおけ
る核酸標的配列の存在または不在を示す。
【０１２１】 本発明のプロセスはまた、プローブの３'‐末端領域への標的のハイブリダイ
ゼーションの程度と関係され得る。本明細書中以後の実施例は、マッチされる塩
基とミスマッチされる塩基との間の区別は、単一のミスマッチが、３'‐末端領
域の位置からさらなる上流の位置にあるので、ほとんど著しくないことを示す。
単一のミスマッチが、３'‐末端ヌクレオチドの位置から１０〜１２残基である
場合、マッチとミスマッチとの間の非常に小さな区別があり、一方非常に大きな
区別が、単一のミスマッチが３'‐末端である場合に観察される。それゆえ、標
的核酸配列にハイブリダイズされる核酸プローブの相補性の程度（部分的または
全体的な相補性）は、アイデンティファイアーヌクレオチドに関して本明細書中
でいわれる場合、これは３'‐末端領域内、３'‐末端の位置の約１０残基までを
いわれることが理解される。
【０１２２】 本発明の特定の実施態様において、プローブの３'‐末端領域においてまたは
その近くで不安定化するミスマッチを含むことが所望される。このような実施態
様の１つの例において、目的は、疑問の位置でのヌクレオチドが標的と、マッチ
またはミスマッチであるかを決定することである。疑問の位置でのマッチとミス
マッチとの間のより良好な区別が、意図的なミスマッチが疑問の位置から約２〜
約１０ヌクレオチド、または好ましくは疑問の位置から約２〜約６ヌクレオチド
に導入される場合に観察される。
【０１２３】 ３'‐末端領域内でミスマッチされる１つよりも多い塩基がある場合のマッチ
されるヌクレオチドとミスマッチされるヌクレオチドとの間の解析的な出力結果
の区別は、ミスマッチが末端から１０を超える位置、例えば３'‐末端ヌクレオ
チドの１１〜１２位上流である場合であっても、明らかであり得る。従って、句
「約１０」および「３'‐末端領域」は上述で使用される。それゆえ、３'‐末端
領域は、核酸の３'‐末端ヌクレオチド（３'末端）の位置から約１０残基を含む
。
【０１２４】 ハイブリダイゼーション条件は、種々の期間、ｐＨ値、温度、核酸プローブ/
標的の組み合わせなどについて、コントロールサンプルについて経験的に確認さ
れ得る。例示的な維持時間および条件は、本明細書中以後の特定の例において提
供され、および典型的に低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を
反映する。実施において、一旦ハイブリダイゼーション条件および維持期間の適
切なセットがプローブの所与のセットについて公知となった場合、これらの条件
を使用するアッセイは、核酸標的配列が存在するか否かの正確な結果を提供する
。典型的な維持時間は、約５〜約６０分間である。
【０１２５】 本発明の１つの意図される実施態様において、その活性がプローブの３'‐末
端からヌクレオチドを放出するためにハイブリダイズされた核酸を脱重合化する
ことである酵素は、温度依存性のポリメラーゼである。このような実施態様にお
いて、ポリメラーゼ反応の逆が、核酸プローブを脱重合化するために使用され、
そしてアイデンティファイアーヌクレオチドは、核酸プローブの３'‐末端ヌク
レオチドがその核酸標的配列に全体的な相補性を伴ってハイブリダイズされる場
合に放出される。シグナルは、本発明のプロセスによって検出される核酸プロー
ブに有意に相補的な配列を有する核酸標的配列の存在を確認する。
【０１２６】 クレノウまたはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼのような（しかし、これらの２つの
酵素に制限されない）ポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を使用す
る実施態様において、核酸プローブの３'‐末端残基がミスマッチされ、それゆ
え核酸プローブの３'‐末端の、その核酸標的配列に対する部分的な相補性のみ
が存在する場合、核酸プローブを脱重合化するためにアイデンティファイアーヌ
クレオチドが放出される。この実施態様において、バックグラウンドを最小化す
るために、ハイブリッドは典型的に、酵素反応の前にアニールされない核酸から
精製され、これはアイデンティファイアーヌクレオチドを放出する。シグナルは
、核酸プローブに全体的に相補的でない核酸標的配列の存在を確認する。
【０１２７】 核酸プローブを脱重合化するためにＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩの３'→
５'エキソヌクレアーゼ活性を使用する実施態様において、アイデンティファイ
アーヌクレオチドは、核酸プローブの３'‐末端残基が標的核酸にマッチされる
場合に放出される。シグナルは、放出されたアイデンティファイアーヌクレオチ
ドで相補的である核酸標的の存在を確認する。
【０１２８】 従って、ハイブリダイゼーションおよび脱重合化は、プローブ：標的ハイブリ
ッドが３'‐末端領域にてマッチされるかまたはミスマッチされるかに依存して
、アイデンティファイアーヌクレオチドの放出、またはこのようなヌクレオチド
のわずかな放出もしくは放出なしを導き得る。これはまた、使用される酵素のタ
イプ、および酵素が脱重合化活性のために必要とされる目的の、マッチされるか
またはミスマッチされるかの、タイプに依存する。
【０１２９】 規定された条件下での意図される解析的な出力結果の規模は、放出されるヌク
レオチドの量に依存する。アイデンティファイアーヌクレオチドが放出される場
合、バックグラウンドよりも大きい値を有する解析的な出力結果が提供され得る
。標的配列が元来のサンプルに存在しなかったので、もしくは選択されたプロー
ブおよび脱重合化酵素が、標的が存在する場合に３'‐末端ヌクレオチドの放出
を提供しないので、アイデンティファイアーヌクレオチドが放出されない場合、
または３'‐末端ヌクレオチドのマッチ／ミスマッチ状態が３'‐末端ヌクレオチ
ドを放出するために使用される酵素について必要とされる状態にマッチしなかっ
た場合、解析的な出力結果は実質的にバックグラウンドレベルである。
【０１３０】 このような反応において有用な脱重合化反応および酵素は、本明細書中以前に
引用されおよび本明細書中に参考として援用される親出願において、より詳細に
考察される。
【０１３１】 加ピロリン酸分解し得る温度依存性の核酸ポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリ
メラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメ
ラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｎｅ３重変異ポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラー
ゼ、Ｔｖｕポリメラーゼ、Ａｔｈポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｅ.ｃｏ
ｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｋｌｅｎｏｗ エキ
ソマイナス（ｅｘｏ-）、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＭＭ
ＬＶ逆転写酵素が挙げられるが、これらに制限されない。最も好ましくは、Ｋｌ
ｅｎｏｗエキソマイナス（Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ-）またはＴｎｅ３重変異体ポ
リメラーゼが、５'オーバーハングＤＮＡ末端のそれらの効果的な利用のために
、ＤＮＡ加ピロリン酸分解反応について利用される。
【０１３２】 ポリメラーゼ活性の逆の場合（加ピロリン酸分解）における好ましい実施態様
において、好ましい基質は、その３'‐末端で全体的な相補性を伴って核酸標的
配列にハイブリダイズされるＤＮＡプローブであり、３'‐末端領域でアイデン
ティファイアー残基を含む。
【０１３３】 ＮＴＰの不在下バクテリオファージＴ４ポリメラーゼによって触媒され得る脱
重合化反応は、ミスマッチされるハイブリッドを脱重合化する。好ましい実施態
様において、放出されたヌクレオチド、ＸＭＰは、ヌクレアーゼ消化によって生
成される。
【０１３４】 ヌクレアーゼ消化は、Ｓ１ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ ＢＡＬ ３１、ヤエ
ナリヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、およびリボヌクレアーゼＨを含
む、５'リン酸を有するヌクレオチドを放出する多様なヌクレアーゼによって達
成され得る。ヌクレアーゼ消化条件および緩衝液は、当該分野において公知であ
る。それらの使用のためのヌクレアーゼおよび緩衝液は、市販の供給源から入手
可能である。
【０１３５】 酵素の活性が３'→５'エキソヌクレアーゼ活性である場合の本発明の実施態様
において、ハイブリダイズされた核酸プローブは、その３'‐末端ヌクレオチド
から脱重合化される。ポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性の場合に
おける好ましい実施態様において、好ましい基質は、その３'‐末端領域で部分
的な相補性を伴って、最も好ましくはその３'−末端残基でアイデンティファイ
アーヌクレオチドであるミスマッチを有する核酸標的配列にハイブリダイズされ
る核酸プローブである。
【０１３６】 脱重合化についての好ましい反応混合物は、各酵素について適切な緩衝液を含
み、親特許出願および実施例においてより詳細に記載される。典型的に、これら
の条件下で、十分なＮＴＰまたはｄＮＴＰが、極めて低い量（例えば、約５〜１
０００ピコグラム）の核酸を正確に検出またはアッセイするために放出される。
【０１３７】 いくつかの好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブは典型的
に、２０μＬの脱重合化反応あたり約１００ｎｇ〜約1μｇで利用される。この
量は、約２００：１〜約１，０００：１のプローブ対標的の重量比を提供する。
【０１３８】 本発明の好ましい実施態様において、核酸ポリメラーゼおよびピロリン酸（Ｐ
Ｐi）またはそのアナログは、約１００μｇ未満の標的核酸〜約１０ｐｇ未満の
核酸を含有するハイブリダイズされたサンプルに添加される。典型的な標的核酸
は、アッセイされるサンプルにおいて、約１〜約５ｎｇで存在し、約３０〜約１
０００ｂｐの標的核酸の長さが好ましい。
【０１３９】 脱重合化する酵素は、好ましくは、ハイブリダイズされた標的：プローブを脱
重合化するのに十分な量で存在する。この量は、当該分野において周知であるよ
うに、使用される酵素、脱重合化温度、緩衝液などと共に変化する。２０μＬの
容量において行われる典型的な反応について、Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ-のような
約０．２５〜約１単位（Ｕ）の酵素が使用される。約１〜約５Ｕの熱安定性の酵
素が、上昇された温度にて脱重合化のために使用される。
【０１４０】 脱重合化反応を影響する別の条件は、本明細書中上述で引用される親出願にお
いて考察され、これは参考として援用される。 解析的な出力結果 解析的な出力結果は、放出されたヌクレオチドまたはプローブの残りのいずれ
かの、放出されたアイデンティファイアー産物の検出によって得られる。例示的
な検出系としては、光発光ルシフェラーゼ検出系、ＮＡＤＨ光吸着検出系（ＮＡ
ＤＨ検出系）、蛍光発光、および質量分析が挙げられる。これらの検出系は、本
明細書中以下に考察される。
【０１４１】 ヌクレオチドが放出されたという事実（定性的な決定）、またはさらに放出さ
れたヌクレオチドの数（定量的な決定）が、脱重合化後のプローブの試験を介し
て推定され得る。オリゴヌクレオチドの大きさの決定は、当該分野において周知
である。例えば、ゲル分離およびクロマトグラフィー分離が周知である。ゲル画
像化技術は、蛍光および吸光度分光法、ならびにＸ線像方法を利用する。オリゴ
ヌクレオチドの質量分析はまた、より一般的になる。
【０１４２】 以下に続く実施例において説明されるように、上昇された温度、例えば、約５
０℃〜約９０℃にて意図される方法を行うことは有益であり得る。Ｔｎｅ３重変
異体ＤＮＡポリメラーゼは、ＷＯ９６/４１０１４においてより詳細に記載され
、その開示は参考として援用され、およびその６１０残基のアミノ酸配列が、そ
の書類の配列番号３５として提供される。この酵素は、Ｔｎｅ Ｍ２８４（Ｄ３
２３Ａ、Ｄ３８９Ａ）としてＷＯ９６/４１０１４においていわれる。
【０１４３】 簡潔には、この酵素は、好熱性真正細菌のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏ
ｌｉｔａｎａ（ＡＴＣＣ ４９０４９）によってコードされるポリメラーゼの３
重変異体である。ネイティブな配列のアミノ末端２８３残基が欠失され、そして
ネイティブな配列の３２３および３８９位でのアスパラギン酸残基は、この組換
え酵素においてアラニン残基によって置き換えられる。従って、この組換え酵素
は、ネイティブな酵素の欠失および置換変異体である。
【０１４４】 アミノ末端配列の欠失は、ネイティブな酵素の５'エキソヌクレアーゼ活性を
除去するが、２つのアスパラギン酸残基の置き換えは、その存在がエキソヌクレ
アーゼ活性を促進するマグネシウム結合部位を除去し、そしてこの３重変異体は
また、組換えのネイティブな酵素に比較して、３'エキソヌクレアーゼ活性を示
さない。この三重変異酵素は、９７．５℃にて６６分間の半減期を、その温度に
て５分間のみの半減期を示した完全長の組換え酵素に比較して示す。
【０１４５】 Ａ．ＡＴＰの検出 ルシフェラーゼ検出系は、ＡＴＰを検出するために特に有用である。ＡＴＰお
よび酸素の存在下、ルシフェラーゼはルシフェリンの酸化を触媒し、次いでルミ
ノメーターを使用して定量され得る光を生成する。反応のさらなる産物は、ＡＭ
Ｐ、ピロリン酸、およびオキシルシフェリンである。
【０１４６】 特に好ましい実施態様において、Ｌ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＦＦ２０２１
）といわれるＡＴＰ検出緩衝液が利用される。好ましくは、約５〜１０ｎｇのル
シフェラーゼが反応において使用される。本発明がルシフェラーゼの特定の濃度
に制限されることは意図されないが、より多くの量のルシフェラーゼは非特異的
なバックグラウンドを増加する蛍光を有する。
【０１４７】 いくつかの実施態様において、加ピロリン酸またはヌクレアーゼ消化によって
産生されるｄＮＴＰまたはＮＴＰは、ＸＴＰに変換され、これは次いで、ルシフ
ェラーゼについての基質として直接的に使用され、核酸の検出を許容する。しか
し、ＭｏｙｅｒおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３
１：１８７‐８９（１９８３）によって実証されるように、ルシフェラーゼにつ
いての好ましい基質は、ＡＴＰである。ＤＮＡが最初の基質である場合、ＮＤＰ
Ｋは、以下の一般的な反応： 反応４： ｄＮＴＰ★＋ＡＤＰ→ｄＮＤＰ＋ＡＴＰ★ によってＡＴＰへのｄＮＴＰの変換を触媒するために簡便に使用され、ここでは
ｄＮＴＰはデオキシリボヌクレオシド三リン酸の混合物であり、およびｄＮＤＰ
はデオキシリボヌクレオシド二リン酸に対応する。反応４において、ｄＮＴＰの
末端の５'‐三リン酸（Ｐ★）はＡＤＰに転移されて、ＡＴＰを形成する。
【０１４８】 この反応を触媒する酵素は、一般にヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＰＫ
）として知られる。ＮＤＰＫは偏在的であり、比較的非特異的な酵素である。Ｎ
ＤＰＫの概説について、ＰａｒｋｓおよびＡｇａｒｗａｌ、Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍ
ｅｓ、第８巻、Ｐ．Ｂｏｙｅｒ編（１９７３）を参照のこと。
【０１４９】 ＮＤＰＫによるＡＴＰへのＮＴＰまたはｄＮＴＰの変換は好ましくは、ＮＤＰ
Ｋ、および加ピロリン酸分解またはヌクレアーゼ消化によって、続いてＰＲＰＰ
合成酵素によるピロリン酸化によって生成されることが予測される、ＮＴＰまた
はｄＮＴＰの量よりもモル過剰のＡＤＰを添加することによって達成される。Ａ
ＤＰの利用は、添加されるＡＤＰの量の至適化を必要とする。多すぎるＡＤＰは
、高いバックグラウンドレベルを生じる。
【０１５０】 いくつかの生物学的供給源からのＮＤＰＫ（ＥＣ ２.７.４.６）調製物は、
いくつかの供給元から市販されている。例えば酵母ＮＤＰＫはＳｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能であり、一方ウシ
ＮＤＰＫは、ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｓｔａ Ｍｅ
ｓａ、ＣＡから利用可能である。本明細書中に記載される大部分の使用のために
選択される特定のＮＤＰＫは典型的に、選択の事柄である。酵母、ウシ、または
別のＮＤＰＫが、これらの反応において使用され得るが、約５０℃〜約９０℃の
反応温度を伴って、Ｔｎｅ３重変異体ＤＮＡポリメラーゼ（以下に考察される）
、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼ、およびＴｖｕ ＤＮＡ ポリメラーゼのような熱安定性の脱重
合化酵素とともにＰｆｕ ＮＤＰＫのような熱安定性のＮＤＰＫを利用すること
が好ましい。上述の温度でのこれらの熱安定性酵素の使用は、方法の感度を増強
し得る。Ｔｎｅ３重変異体ＤＮＡポリメラーゼは、ＷＯ９６／４１０１４におい
て詳細に記載され、この開示は参考として援用され、およびその６１０残基のア
ミノ酸配列は、この書類の配列番号３５として提供される。この酵素は、ＷＯ９
６／４１０１４においてＴｎｅ Ｍ２８４（Ｄ３２３Ａ、Ｄ３８９Ａ）といわれ
る。
【０１５１】 Ｂ．質量分析的な解析 本発明の１つの方法において、放出されたヌクレオチドの存在は、質量分析を
介して解析される。質量分析を使用する方法の実施態様において、処理される反
応混合物の全ての成分が、放出されるアイデンティファイアーヌクレオチドの分
子量の範囲において測定されるように、反応混合物はイオン化される。分子量に
おける非常に小さな差異が、質量分析法を使用して検出され得（同じ原子の異な
る同位体が検出可能である）、従って、アイデンティファイアーヌクレオチドに
おける単一の原子の置換（例えば、水素原子の代わりのフッ素または重水素原子
による水素の置換）を含む、天然の核酸からの任意の変化が検出可能な差異を生
じる。本発明の方法において使用される核酸アナログは、核酸プローブのハイブ
リダイゼーションおよびハイブリダイズされるプローブの脱重合化のいずれも妨
げるべきではない。
【０１５２】 さらに、質量分析は個々のヌクレオチドまたはヌクレオシド間を区別し得る。
例えば、本発明において使用される３'‐アイデンティファイアーヌクレオチド
は、Ｇヌクレオチドであり、質量分析は、本発明の方法においてそのＧヌクレオ
チドの放出を検出するために使用され得る。同様に質量分析は、Ａ、Ｔ、または
Ｃヌクレオチドの放出を検出し得、これらの化合物の原子量における差異に基づ
く。従って、本発明の多重化する実施態様において、質量分析は、１つ以上のこ
れらの３'‐アイデンティファイアーヌクレオチドの存在を解明するために使用
され得る。
【０１５３】 この実施態様の特に有用な局面において、特殊化された多孔性のシリコンサン
プルウェルを備えられる市販の質量分光器を使用して、ピコグラムまたはアタグ
ラム（ａｔｔａｇｒａｍ）の量に対して、１つまたは複数のアッセイを正確に行
い得るＤＩＯＳ（シリコンに対する脱離／イオン化）といわれる質量分析技術が
近年、Ｗｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３９９：２４３（１９９９）によって報告され
た。より古い、周知のＭＡＬＤＩ質量分光アッセイ技術がまた利用され得る。
【０１５４】 質量分析を使用する多重法の実施態様において、複数の異なるアイデンティフ
ァイアーヌクレオチドが、種々の核酸プローブにおいて使用され得る。このよう
な技術を使用して、異なるアイデンティファイアーヌクレオチドの存在は、核酸
標的配列の存在の直接的な証拠である。
【０１５５】 Ｃ．蛍光分光解析 広範に多様な蛍光検出法が本明細書中で使用され得る。１つの例示的に意図さ
れる方法において、アイデンティファイアーヌクレオチドは、蛍光標識を含む。
アイデンティファイアーヌクレオチドは、アイデンティファイアーヌクレオチド
の放出の前に、または後に、蛍光的に標識され得る。ヌクレオチドが蛍光的に標
識される代替の実施態様において、解析的な出力結果は質量分析によって得られ
る。
【０１５６】 本発明の好ましい実施態様において、蛍光標識は、ヌクレオチドの蛍光アナロ
グの部分である。蛍光ヌクレオチドアナログは広範に知られ、およびいくつかの
供給元から市販されている。例示的な供給元は、ＭＥＮ（商標） Ｌｉｆｅ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
）であり、これは、フルオレセイン、クマリン、テトラメチルローダミン、ネフ
トフルオレセイン、ピレン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）、およびＬｉｓｓ
ａｍｉｎｅ（商標）で標識されるジデオキシ‐、デオキシ‐、およびリボヌクレ
オチドアナログを提供する。他の供給元としては、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ；Ｐｉｓｃａｔａ
ｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）およびＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｉｎｃ．
（Ａｍｈｅｒｓｔ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）が挙げられる。
【０１５７】 蛍光標識および蛍光分光解析を使用する利点は、複数の異なる標識があること
である。このような異なる標識は、本発明の多重の実施態様において特に有用で
ある。異なる蛍光標識は、異なるプローブにおいて使用され、それによって放出
されるアイデンティファイアーヌクレオチドとしての特定の蛍光標識されるヌク
レオチドアナログの検出は、どの核酸標的が存在するかを推定するために使用さ
れ得る。
【０１５８】 例えば、フルオレセインは４８８ｎｍの励起および５２０ｎｍ発光波長を有し
、一方ローダミン（テトラメチルローダミンの形態において）は、５５０ｎｍ励
起および５７５ｎＭ発光波長を有する。蛍光検出器は、励起供給源および発光検
出器を提供する。５２０ｎｍおよび５７５ｎＭの発光波長は、蛍光分光法を使用
して、容易に区別可能である。
【０１５９】 分子基準あたりにおいて、蛍光分光法は、吸光分光法よりも約１０倍感度が高
い。非常に広範に多様な蛍光分光法ベースの検出器が、特に、単一のチューブ、
フローセル、およびマルチウェルプレートの蛍光値を読み取るために市販されて
いる。例えば、マイクロプレート読み取り器のＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔ
ｉｓｋａｎ型は、４００〜７５０ｎｍのスペクトル範囲、および３４０、４０５
、４１４、４５０、４９２、５４０、６２０、および６９０ｎｍのフィルターを
備え、広範に利用可能である（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、
Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）。
【０１６０】 放出されるアイデンティファイアーヌクレオチドは、脱重合化の前または後に
、市販の試薬を用いて当該分野において周知である架橋化学を使用して標識され
得る。例えば、フルオレセインイソチオシアネートおよびローダミンＢイソチオ
シアネートは、両方ともにＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ
（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から入手可能である。生物学的分
子を標識するにおけるフルオレセインイソチオシアネートの使用に対する参考文
献としては、Ｎａｔｕｒｅ、１９３：１６７（１９６２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．２６：２８（１９７２）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５７：
２２７（１９７４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．、７
２：４５９（１９７５）が挙げられる。
【０１６１】 本発明の多くの実施態様について、放出される蛍光アイデンティファイアーヌ
クレオチドを、プローブのようなオリゴヌクレオチドに結合されるそれらから分
離することが有用であることが意図される。従って、当該分野において周知のお
よび上述で考察される分離技術は、蛍光検出器を備え付けられるＨＰＬＣを含む
このような実施態様で有用である。他の分光技術に比較して、蛍光の増強された
感度が、本発明の検出または定量プロセスの感度を増加するために使用され得る
。
【０１６２】 ＮＡＤＨ検出系において、２つの酵素、ホスホグリセレートキナーゼおよびグ
リセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼの組み合わせが、ＡＴＰの存在下での
、ＮＡＤＨからのＮＡＤの形成を触媒するために使用される。ＮＡＤＨは蛍光で
あるが、一方ＮＡＤは蛍光ではないので、ＡＴＰは蛍光強度の喪失として測定さ
れる。ＮＡＤＨベースのＡＴＰアッセイの例は、米国特許第４，７３５，８９７
号、同第４，５９５，６５５号、同第４，４４６，２３１号、および同第４，７
４３，５６１号、および英国特許出願第ＧＢ ２，０５５，２００号において開
示され、これらの全ては本明細書中に参考として援用される。
【０１６３】 Ｄ．吸光度分光解析 吸光分光解析の工程が、解析的な出力結果を提供し、それによって放出された
アイデンティファイアーヌクレオチドの存在または不在を提供し、および当該核
酸標的配列の存在または不在を示すために意図される。この実施態様は、その活
性が、ハイブリダイズされた核酸の３'‐末端から１つ以上のヌクレオチドを放
出することである酵素の脱重合化する量で処理された反応混合物のクロマトグラ
フィー分離を意図する。
【０１６４】 例示的な実施態様において、サンプルにおけるいくつかの異なる核酸標的配列
の存在について多重化されるアッセイは、吸光度分光法によって解析される。種
々の核酸標的配列に対するいくつかの標識されるプローブが、核酸サンプルに添
加される。プローブに対する標識は、種々のヌクレオチドアナログ、各プローブ
について異なるアナログであり得る。Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ-のような脱重合化
酵素が添加され、３'-末端ヌクレオチドがマッチされる場合に標的配列にハイブ
リダイズされるプローブの３'-末端から、標識されたヌクレオチドおよび他のヌ
クレオチドを放出する。
【０１６５】 反応溶液は、あらかじめ平衡化された高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）カラム上に負荷され、そして天然のヌクレオチドからヌクレオチドアナログを
分離する条件下で溶出される。ヌクレオチド、塩基、およびヌクレオシドのクロ
マトグラフィー分離についての有用な媒体としては、ＴｏｓｏＨａａｓ（Ｍｏｎ
ｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）による逆相Ｃ１８カラ
ムもしくはＯＤＳ-８０Ｔ（商標）もしくはＯＤＳ-１２０Ｔ ＴＳＫ-ＧＥＬの
ような逆相媒体ＴｏｓｏＨａａｓ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｐｅｎｎ
ｓｙｌｖａｎｉａ）によるＤＥＡＥ-２５ＳＷもしくはＳＰ-２５Ｗ ＴＳＫ-Ｇ
ＥＬのようなアニオン交換媒体、またはＴｏｓｏＨａａｓ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒ
ｙｖｉｌｌｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）によるＢｏｒｏｎａｔｅ-5ＰＷ Ｔ
ＳＫ-ＧＥＬのようなアフィニティー媒体が挙げられる。実施例５は、ＨＰＬＣ
を使用する本発明の実施態様を説明する。
【０１６６】 ＨＰＬＣカラムは、カラム浸出をモニターするために吸光度検出器を備え付け
られる。従って、このタイプの解析について「吸光度分光法」。ヌクレオチドの
ＨＰＬＣ検出をモニターするための典型的な波長は、２５０ｎｍ、２６０ｎｍ、
および２８０ｎｍである。ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログのこのよう
な分離は、当該分野において周知である。Ｒｅｖｉｃｈら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐｈｙ、３１７：２８３‐３００（１９８４）、およびＰｅｒｒｏｎｅ
＆ Ｂｒｏｗｎ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、３１７：３０１‐３１
０（１９８４）は、ｄＮＴＰのＨＰＬＣ分離の例を提供する。
【０１６７】 分離されたヌクレオチドアナログの同定は、同じ条件下で同じＨＰＬＣカラム
において分離されたヌクレオアナログの標準の保有時間の比較（種々の時間での
浸出の吸光度によってモニターされる）によって達成され得る。あるいは、別々
のフラクション中に回収されたヌクレオチドアナログの同定（カラム浸出の吸光
度を連続的にモニターすることによって決定される）は、核磁性共鳴または原子
解析（Ｈ、Ｃ、Ｎ）のような他の標準的な解析方法によって決定され得る。
【０１６８】 Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ-での脱重合化を使用するこの例示的な例において、特
定のプローブからの放出されたアイデンティファイアーヌクレオチドの存在は、
そのプローブにハイブリダイズする標的配列の存在を示す。
【０１６９】 代替の実施態様において、脱重合化反応混合物から放出されたヌクレオチドは
、カラム浸出をモニターするために、吸光度検出器を備え付けられたガスクロマ
トグラフィーにおいて分離される。
【０１７０】 プローブ媒介性の特異的核酸検出 脱重合化反応は、核酸における特異的な塩基の同定を疑問にするために使用さ
れ得る。例えば、核酸における単一塩基の点変異、欠失、または挿入の同定は、
以下のように同定され得る。
【０１７１】 １つの実施態様において、合成された各核酸プローブは点変異を含むか、また
は含むことが疑われる標的核酸に実質的に相補的である。ハイブリダイゼーショ
ンが生じるストリンジェンシーを変えるために、種々のハイブリダイゼーション
条件が使用され得ることが認識される。従って、利用される系に依存して、プロ
ーブの相補性は変化し得る。プローブの長さ、ＧＣ含量、およびハイブリダイゼ
ーション条件のストリンジェンシーに依存して、プローブは標的核酸と１０塩基
程度のミスマッチ、および好ましくは５未満のミスマッチを有し得る。最も好ま
しくは、プローブは、標的核酸と１塩基のみのミスマッチを有するか、または標
的核酸に完全に相補的である。
【０１７２】 核酸プローブは、１本鎖核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。プロー
ブは、種々の長さ、好ましくは約１０〜１００塩基、最も好ましくは約１０〜３
０塩基であり得る。特に好ましい実施態様において、プローブは疑問の位置と、
核酸プローブの３'末端との間の全ての塩基にて、標的に相補的である。
【０１７３】 好ましい実施態様において、プローブは疑問の位置にてあらかじめ決定された
ヌクレオチドを有するように設計される。相補的なプローブ塩基が、標的配列に
対合またはハイブリダイズする場合、疑問の位置での塩基は、核酸標的における
塩基とアラインされ、その同一性は塩基対合が生じ得るような条件下で決定され
る。疑問の位置はプローブ内で変化し得ることが意図される。例えば、いくつか
の好ましい実施態様において、疑問の位置は好ましくは核酸プローブの３'末端
の１０塩基以内である。なお他の好ましい実施態様において、疑問の位置は核酸
プローブの３'末端の６塩基以内である。特に好ましい実施態様において、疑問
の位置は核酸プローブの３'末端での最後の塩基の隣にあるか、または最後の塩
基である。
【０１７４】 疑問の位置での塩基の同一性が所望される疑問の実施態様において、好ましく
は長さの等しい４つの異なるプローブが合成され、それぞれ疑問の位置で異なる
ヌクレオチドを有する。従って、いくつかの実施態様において、ＤＮＡプローブ
のセットは、疑問の位置でデオキシアデノシン残基を有する第１のプローブ、疑
問の位置でデオキシチミジン残基を有する第２のプローブ、疑問の位置でデオキ
シグアノシン残基を有する第３のプローブ、および疑問の位置でデオキシシトシ
ン残基を有する第４のプローブを含む。
【０１７５】 同様に、ＲＮＡプローブのセットは、疑問の位置でアデノシン残基を有する第
１のプローブ、疑問の位置でウリジン残基を有する第２のプローブ、疑問の位置
でグアノシン残基を有する第３のプローブ、および疑問の位置でシトシン残基を
有する第４のプローブを含むことが意図される。
【０１７６】 この疑問の実施態様の次の工程において、プローブは標的核酸にハイブリダイ
ズされ、サンプルにおいて標的核酸が存在する場合、それによってプローブ核酸
‐標的核酸複合体が形成される。ハイブリダイゼーション条件は、プローブの長
さおよび塩基組成に依存して変化し得ることが意図される。プローブ‐標的核酸
複合体おいて、疑問の位置でのヌクレオチドは、核酸において同定される特定の
塩基とアラインされる。意図される多重の実施態様において、プローブのセット
は同時に使用され得る。プローブは疑問の位置で異なるので、１つのプローブの
みが疑問位置とアラインされる標的核酸における特異的な塩基に相補的である。
好ましくは、プローブは区別可能であり、最も好ましくはアイデンティファイア
ーヌクレオチドは４つのプローブ間で異なり、例えば質量分析または異なる蛍光
標識を使用する。
【０１７７】 疑問の実施態様の次の工程において、核酸プローブ‐標的核酸複合体は、プロ
ーブの脱重合化を許容する条件下で反応される。脱重合化についての好ましい反
応条件は、親出願においておよび以下の実施例において記載される。次いで、放
出されるヌクレオチドが検出される。
【０１７８】 特に好ましい実施態様において、特異的な塩基の同一性は、各プローブから生
成されるシグナルの量を比較することによって決定される。ハイブリダイズされ
るプローブの脱重合化は、その３'末端から進行する。疑問の位置での塩基が核
酸における特異的な塩基に相補的でない場合、シグナルはほとんどまたは全く生
成されない。
【０１７９】 なお別の好ましい実施態様において、本発明のプローブ媒介性の特異的な核酸
検出法は、目的の核酸を単に同定または検出するために使用され得る。この方法
について、核酸プローブ（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が利用され、このそれ
ぞれは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得るそのそれぞれの標的核酸に実質的に相補
的である。特に好ましい実施態様において、各核酸プローブは、その標的核酸に
完全に相補的である。核酸プローブは１本鎖核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ
）を含み得る。プローブは、種々の長さであり得、好ましくは約１０〜１０００
塩基、最も好ましくは約１０〜１００塩基であり得る。
【０１８０】 検出は上記のように行われる。核酸プローブ‐核酸標的複合体は、プローブの
脱重合化を許容する条件に曝露され、これはＸＴＰの生成を生じる。目的の核酸
の検出は、コントロールサンプル反応に比較される場合に生成されるＸＴＰによ
って産生されるシグナルにおける差異によって特徴づけられる。マッチされるア
イデンティファイアーヌクレオチドを除去する脱重合化酵素の存在下での、それ
らの標的核酸に完全に相補的なプローブについて、バックグラウンドよりも大き
なシグナルは元来のサンプルにおける少なくとも１つの標的核酸の存在を示す。
好ましい実施態様において各プローブは、区別するアイデンティファイアーヌク
レオチドを含み、そして標的／プローブハイブリッドから放出されるアイデンテ
ィファイアーヌクレオチドの検出は、元来のサンプルにおける特異的な標的核酸
の存在を決定する。
【０１８１】 核酸における特異的な塩基の同定を調べる能力はまた、異なる種からの、また
はさらに異なる対立遺伝子からの核酸間の区別を許容する。関連されるまたは未
関連の種の核酸間を区別および検出する能力はまた、所与の核酸を含有するサン
プル内に含まれる種の同定を許容する。例えば、方法は、いくつかの関連される
細菌またはウイルスのどの種がサンプル（例えば、臨床学的サンプル、環境サン
プル、食品サンプル、または非ヒト動物からのサンプル）内に含まれるのかを決
定するために使用され得る。
【０１８２】 この方法の好ましい実施態様において、少なくとも２つの種または対立遺伝子
からの、実質的に同一な配列を有する核酸が検出される。同一性の領域（標的核
酸配列）は、少なくとも１つのあらかじめ決定された位置における種または対立
遺伝子間の少なくとも単一のヌクレオチドミスマッチを含み、およびまた、同定
される各種に独特の核酸配列の３'末端および５'末端または同定を含む。
【０１８３】 次に、いくつかの実施態様において、同一性の領域に実質的に相補的であるＲ
ＮＡまたはＤＮＡプローブが合成される。プローブは、種々の長さ、好ましくは
約１０〜１０００塩基、最も好ましくは約１０〜１００塩基であり得る。上述の
ように、相補的なプローブは、疑問の位置を含む。
【０１８４】 疑問の位置は、プローブ内で変化し得る。例えば、疑問の位置は、好ましくは
核酸プローブの３'末端の１０塩基以内である。より好ましくは、疑問の位置は
核酸プローブの３'末端の６塩基以内である。最も好ましくは、疑問の位置は核
酸プローブの３'末端での最後の塩基の隣にあるか、または最後の塩基である。
【０１８５】 核酸プローブは、疑問の位置での塩基が、一方の種または対立遺伝子のあらか
じめ決定された位置でのヌクレオチドに相補的であるが、ミスマッチに起因して
他方には相補的でないように設計される。同様に、第２の種または対立遺伝子の
あらかじめ決定された位置でのヌクレオチドに、疑問の位置にて相補的である第
２のプローブが合成され得る。
【０１８６】 意図される手順は、所与のサンプル内の複数の種の存在または不在を同定する
ために用いられる。これらの実施態様において、塩基ミスマッチを含む種間の実
質的に同一な配列の同定、または同定される各種に独特の核酸配列の同定のみが
必要とされる。
【０１８７】 本発明によって意図される方法は、核酸をアッセイするにおいて広範な適用可
能性を有する。いくつかの局面において、内因性核酸が、特定のネイティブなま
たは変異体の配列が存在するか否かを決定するためにアッセイされる。核酸サン
プルが得られる対象の遺伝子構成が決定されるので、このタイプの解析は、時折
、遺伝子型決定といわれる。種形成、ヒト、イヌ、トリ、ウシなどの同定ような
生物体の同定は、チトクロムＢをコードする遺伝子の選択される領域に対するプ
ローブのような種特異的核酸プローブの使用によって決定され得る。
【０１８８】 意図される方法を使用して、ヒト患者が、例えば、Ｌｅｉｄｅｎ Ｖ変異、変
異体β‐グロブリン遺伝子、Δ５０８対立遺伝子の領域における嚢胞性線維症関
連性遺伝子、プロトロンビン遺伝子における変異、先天的な副腎過形成、ａｂｌ
遺伝子のセグメントの関与とともにｂｃｒ遺伝子の領域において生じる転座、Ｔ
ＨＯ１対立遺伝子またはＴＰＯＸ対立遺伝子に存在するような遺伝子における反
復配列の数、ならびにあるガンおよびまた対立遺伝子トリソミーにおいて見出さ
れるようなある対立遺伝子の遺伝子座のヘテロ接合性の喪失を有するか否かを例
示的に決定する。ゲノムタイピングはまた、イネ、ダイズ、またはトウモロコシ
のような植物ゲノムを、これらがネイティブでない配列を含むか否かをアッセイ
するために使用され得る。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｌｉｓ
ｔｅｒｉａ、Ｅ.ｃｏｌｉ ＯＨ１５７のような微生物のゲノムのサンプルにお
ける存在または不在が決定され得、そしてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）また
はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなウイルスのゲノムは、薬物耐性種が
サンプルに存在するか否かを決定するために解析され得る。
【０１８９】 意図される方法はまた、サンプルの供給源に外因性である核酸の存在または不
在をアッセイするために利用され得る。例えば、意図される方法は、Ｃ型肝炎（
ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
のようなウイルスの存在についてアッセイするために、ならびにヒトまたは植物
のような、疾患を伴う生物体におけるウイルス負荷を決定するために、使用され
得る。意図される方法はまた、トウモロコシ、ダイズ、またはイネのような植物
における外因性核酸配列の存在を同定するために使用され得る。意図される方法
はまた、肉、乳製品、および果汁のような食料品におけるＬｉｓｔｅｒｉａ ｍ
ｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、またはＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅ０１５７を含む）のような微生物の存在
についてアッセイするために使用され得る。
【０１９０】 本発明の方法における使用のために核酸プローブを設計するために有用な適切
な核酸標的配列の検出は、当業者の範囲内である。Ｇｅｎｂａｎｋのような遺伝
子配列のデータベースが、選択された核酸標的の独特性を確認するために使用さ
れ得る。ＰＣＲプライマーを設計するための市販のソフトウェアが、本発明にお
ける使用のためにプローブの設計において補助するために使用され得る。
【０１９１】 １つの説明的な実施態様において、あらかじめ決定された核酸標的配列は、血
液凝固と関連され、そして核酸プローブは血液凝固と関連される核酸配列に相補
的な配列を含む。血液凝固に関連される例示的な配列は、（ａ）Ｌｅｉｄｅｎ変
異の領域における第Ｖ因子または第Ｖ因子の対応する野生型配列の少なくとも１
０個のヌクレオチドの配列；ならびに（ｂ）プロトロンビン遺伝子の少なくとも
１０個のヌクレオチドの配列を含む。好ましい例示的な配列は、配列番号１４、
配列番号１５、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配
列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号４７、配列
番号４４、配列番号４５、および配列番号４６、ならびにそれらの相補的な配列
からなる群より選択される。 FV5 5' CTGCTGCCCTCTGTATTCCTCG 3' 配列番号１４ FV6 5' CTGCTGCCCTCTGTATTCCTTG 3' 配列番号１５ PT7 5' GTGACTCTCAGCG 3' 配列番号８７ PT8 5' GTGACTCTCAGCA 3' 配列番号８８ PT9 5' GTGATTCTCAGCG 3' 配列番号８９ PT10 5' GTGATTCTCAGCA 3' 配列番号９０ FV7 5' GACAAAATACCTGTATTCCTCG 3' 配列番号９１ FV8 5' GACAAAATACCTGTATTCCTTG 3' 配列番号９２ PT3 5' GGAGCATTGAGGCTCG 3' 配列番号９３ PT4 5' GGAGCATTGAGGCTTG 3' 配列番号９４ 11432 5' GACAAAATACCTGTATTCCTTG 3' 配列番号４７ 11265 5' GTGATTCTCAGCA 3' 配列番号４４ 11266 5' GTGATTCTCAGCG 3' 配列番号４５ 9919 5' GACAAAATACCTGTATTCCTCG 3' 配列番号４６ 別の意図される実施態様において、核酸サンプルの種形成は、単一のアッセイ
において一組の種プローブを使用して決定される。このようなアッセイのための
プローブを含むキットがまた意図される。ヒトミトコンドリアＤＮＡに特異的で
あることが示される例示的なプローブは、配列番号５０および１１５８３（配列
番号５１）である。例示的な共通のプローブは、１１５８２（配列番号５２）で
あり、ウシ、トリ、イヌ、およびヒトとのポジティブな反応を与える。例示的な
トリ特異的プローブ、１１５７７（配列番号５３）は、トリミトコンドリアＤＮ
Ａに特異的であるが、別のトリ特異的プローブ、１１５８４（配列番号５４）は
、トリゲノムＤＮＡに加えてウシおよびヒトとのシグナルを与える。例示的なウ
シ特異的プローブ、１１５８８（配列番号５５）は、ウシ標的ＤＮＡとの強力な
シグナルを提供するが、ヒト、トリ、およびイヌの核酸とのシグナルもまた与え
る。例示的なイヌ特異的プローブ、１１５８６（配列番号５６）は、ウシＤＮＡ
とのシグナルを提供するよりも強力な、イヌＤＮＡとのシグナルを提供する。以
下に列挙されるプローブに相補的な配列はまた、プローブ配列として意図される
。 11576 huzoo1 5' CCAGACGCCTCA 3' 配列番号５０ 11583 huzoo2 5' ACCTTCACGCCA 3' 配列番号５１ 11582 comzoo 5' TGCCGAGACGT 3' 配列番号５２ 11577 chzoo1 5' GCAGACACATCC 3' 配列番号５３ 11584 chzoo2 5' GGAATCTCCACG 3' 配列番号５４ 11588 cozoo2 5' ACATACACGCAA 3' 配列番号５５ 11586 dozoo2 5' ATATGCACGCAA 3' 配列番号５６ さらなる実施態様において、核酸サンプルにおける標的配列についての遺伝子
スクリーニングが、単一のアッセイにおいて種々の標的に対する複数のプローブ
を使用して意図される。このような遺伝子試験のためのプローブを含有するきっ
ともまた意図される。例示的な実施態様において、ステロイド２１‐ヒドロキシ
ラーゼ遺伝子が、先天的な副腎過形成（ＣＡＨ）のような集合的に公知の常染色
体劣性疾患の群と関連される変異についてスクリーニングされる。本発明に従う
方法およびキットにおける使用のための例示的なＣＡＨプローブが以下に列挙さ
れる。以下に列挙されるプローブに相補的な配列もまた、プローブ配列として意
図される。 11143 5' CGGAGCCTCCACCTCCCG 配列番号２３ 変異部位１についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ６（野生型） 11085 5' CACCCTCCAGCCCCCAGC 3' 配列番号２４ 変異部位２についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ２（偽遺伝子／変異体） 11084 5' CGGAGCCTCCACCTCCTG 3' 配列番号２５ 変異部位１についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ１（偽遺伝子／変異体） 11086 5' CCTCACCTGCAGCATCAAC 3' 配列番号２６ 変異部位３についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ３（偽遺伝子／変異体） 11144 5' CACCCTCCAGCCCCCAAC 3' 配列番号２７ 変異部位２についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ７（野生型） 11145 5' CCTCACCTGCAGCATCATC 3' 配列番号２８ 変異部位３についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ８（野生型） 11087 5' CCTGGAAGGGCACTT 3' 配列番号２９ 変異部位４についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ４（偽遺伝子／変異体） 11146 5' CCTGGAAGGGCACGT 3' 配列番号３０ 変異部位４についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ９（野生型） 11088 5' GATTCAGCAGCGACTGTA 3' 配列番号３１ 変異部位５についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ５（偽遺伝子／変異体） 11147 5' GATTCAGCAGCGACTGCA 3' 配列番号３２ 変異部位５についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ１０（野生型） 11287 5' CGAGGTGCTGCGCCTGCG 3' 配列番号３３ 変異部位６についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ１１（野生型） 11288 5'CGAGGTGCTGCGCCTGTG 3' 配列番号３４ 変異部位６についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ１２（偽遺伝子／変異体） 11641 5'GGGATCACATCGTGGAGATG 3' 配列番号３５ 変異部位７についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ２３（野生型） 11642 5'GGGATCACAACGAGGAGAAG 3' 配列番号３６ 変異部位７についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ２４（偽遺伝子／変異体） 好ましくは、本発明の多重法を使用するゲノムもしくはミトコンドリアの、ま
たはそうでなければ大きな、複雑な核酸サンプル供給源のアッセイにおいて、ゲ
ノムまたはミトコンドリアの核酸からの核酸のセグメントは、本発明に従うハイ
ブリダイゼーションアッセイを行うためのサンプルを作製するために、増幅され
るかまたはそうでなければ単離される。あるいは、１９９９年７月２１日に出願
された、同時係属出願の米国特許出願第０９／３５８，９７２号において考察さ
れるような単一の標的分子の存在下で、複数の脱重合化可能なハイブリッドを生
じる本発明の方法が好ましく、例えば、アッセイはヘアピンを形成する（例えば
ＲＥＡＰＥＲ（商標））か、または自己アニーリングプライマーを使用する。（
この出願は、米国特許出願第０９／３５８，９７２号の一部継続出願であり、そ
の開示は本明細書中に参考として援用され、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅ
ｇａ．ｃｏｍ／ｐｔ／ｐｅｎｄ／０９３５８９７２．ｐｄｆ．）にてインターネ
ット上で公開される。
【０１９２】 別の例示的な多重の実施態様において、あらかじめ決定された核酸標的配列は
、嚢胞性線維症と関連され、および核酸プローブは嚢胞性線維症と関連される核
酸配列に相補的な配列を含む。この局面の１つの実施態様において、標的および
プローブは、嚢胞性線維症ΔＦ５０８変異と関連される。特に好ましい例示的な
嚢胞性線維症関連性の配列は、配列番号９５または配列番号９６、およびそれら
の相補的な配列である。 CF3 5' CATCATAGGAAACACCAAG 3' 配列番号９５ CF4 5' CATCATAGGAAACACCAAT 3' 配列番号９６ 情報は、種々の種または疾患と関連されるある核酸配列に関して、現在利用可
能であり、およびこの特許の存続時間の間、利用可能にされ続ける。任意のこれ
らの核酸配列が、本発明の方法において有用であること、および種々の標的に対
するプローブの組み合わせが、本発明に従う多重キットにおいて有用であること
が意図される。
【０１９３】 １９９９年７月２１日に出願された、親特許出願の米国特許出願第０９／３５
８，９７２号においてより詳細に考察される例示的なガン関連性の核酸配列は、
他のプローブとともに多重の遺伝子スクリーニングキットおよび方法における使
用のために意図される。核酸プローブＢＡ３（配列番号９７）およびＢＡ４（配
列番号９８）は、ｂｃｒ遺伝子の領域、および転座と関連されるａｂｌ遺伝子の
セグメントにおいて生じる特定の転座を検出するために有用である。 BA3 5' TGGATTTAAGCAGAGTTCAAGT 3' 配列番号９７ BA4 5' TGGATTTAAGCAGAGTTCAAAA 3' 配列番号９８ サンプル標的または検出標的の増幅 標的核酸配列は典型的に、意図される方法の前に増幅される。しかし、ヒトＡ
ｌｕ配列またはＥ．ｃｏｌｉ ｒｅｐ配列におけるように、十分な数の反復され
るヌクレオチド配列が、ネイティブなサンプルに存在する場合、増幅はしばしば
、意図される方法が行われる前に必要とされない。
【０１９４】 ＤＮＡの領域を増幅するためのいくつかの方法が当該分野において公知である
。これらとしては、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、修復連鎖反応、
転写産物の増幅、自己維持配列複製（３ＳＲ）、ライゲーション活性化転写（Ｌ
ＡＴ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および回転するサークル複製が挙げられる。本
発明のプロセスは、サンプルにおける核酸標的の存在を検出するために請求の範
囲のプロセスを実施する時点で当該分野において公知の任意の増幅方法を使用す
る、核酸サンプルの前処理を意図する。
【０１９５】 ヘアピン構造を使用する多重アッセイ プローブはヘアピン構造がないように構築されることが好ましいが、ヘアピン
構造が構築されるアッセイはまた、有用である。本発明の実施態様は、標的にハ
イブリダイズして、次いでヘアピン構造を形成し得るように修飾されるプローブ
を用いて、核酸サンプルにおける複数の核酸標的配列の存在または不在を決定す
るための、ヘアピン構造の使用を意図する。この実施態様は、以下の工程を包含
する。
【０１９６】 疑問の位置を有する複数の核酸標的配列を含有し得る核酸サンプルを含む処理
されたサンプルが提供される。標的配列が、核酸サンプルに存在する場合、それ
らのそれぞれの核酸プローブとハイブリダイズする。プローブは、少なくとも２
つの部分を含む。第１の部分は、プローブの３'‐末端の約１０〜約３０ヌクレ
オチドを含む。これらのヌクレオチドは疑問の位置の約１〜約３０ヌクレオチド
下流で始まる位置にて標的鎖配列に相補的である。プローブの第２の部分は、プ
ローブの５'‐末端領域に位置し、および標的配列の約１０〜約２０ヌクレオチ
ドを含む。それゆえ、この同じ配列は、同じ５'〜３'方向において、標的および
プローブの両方に存在する。この配列は、疑問の位置での、またはちょうど上流
（５'）のヌクレオチドから、プローブの３'‐末端ヌクレオチドが標的にアニー
ルするちょうど上流のヌクレオチドまでの、標的における領域におよぶ。ゼロ〜
約５０の、好ましくはゼロ〜約２０のヌクレオチドの長さであり、ならびに第１
の部分および第２の部分のいずれともハイブリダイズしない配列を含む、プロー
ブの必要に応じた第３の部分は、プローブの第１の部分と第２の部分との間に位
置される。
【０１９７】 処理されるサンプルのハイブリダイズされるプローブは、温度依存性の様式に
おいて、ｄＮＴＰおよび温度依存性のポリメラーゼとの混合によるように、少な
くとも疑問の位置を介して伸長され、それによって伸長されたプローブ／標的ハ
イブリッドを形成する。好ましい実施態様において、プローブ伸長の長さは、疑
問の位置の上流に存在する標的配列のヌクレオチドに相補的なｄＮＴＰの伸長反
応からの省略、および疑問の位置の３'−末端に相補的なヌクレオチド間の不在
によって制限される。
【０１９８】 伸長されたプローブ／標的ハイブリッドは、任意の未反応のｄＮＴＰから分離
され、すなわち、サンプルにおける疑問の領域の存在もしくは不在、または疑問
の位置での塩基の同定を決定するために伸長されたプローブ鎖を使用するのに必
要とされる程度に少なくとも精製される。伸長されたプローブ／標的ハイブリッ
ドは変性されて、鎖に分離される。伸長されたプローブ鎖はヘアピン構造を形成
することを許容される。
【０１９９】 伸長反応について利用されるポリメラーゼ酵素が、温度非特異的様式において
３'‐末端デオキシアデノシンを付加する活性がない温度依存性のポリメラーゼ
であることが好ましい。従って、意図される伸長のために、Ｔａｑのようなポリ
メラーゼ以外を使用することが好ましい。
【０２００】 処理された反応混合物は、ヘアピン構造を含有する組成物と、その活性が伸長
されたプローブのヘアピン構造の３'‐末端から１つ以上のヌクレオチドを放出
することである酵素の、脱重合化する量とを混合することによって形成される。
反応混合物は、脱重合化酵素が、３'‐末端ヌクレオチドを放出するのに十分な
期間、脱重合化する条件の下に維持され、次いで、放出されたアイデンティファ
イアーヌクレオチドの存在について解析される。解析的な出力結果は、核酸標的
配列の存在または不在を示す。解析的な出力結果は、本明細書中の他の場所で考
察されるように決定され得る。
【０２０１】 ＲＥＡＰＥＲ（商標）と称され、および実施例８９および図２において実証さ
れるような本発明のさらなる実施態様はまた、核酸サンプルにおける、核酸標的
配列の存在もしくは不在、または標的配列内の特異的な塩基を決定するにおける
ヘアピン構造の使用を意図し、以下の工程を包含する。そのそれぞれの第１の核
酸プローブ鎖とハイブリダイズされる複数の核酸標的配列を含み得る核酸サンプ
ルを含む、処理されたサンプルが提供される（図２Ａ）。
【０２０２】 ハイブリッドは第１のハイブリッドと呼ばれる。第１のプローブは少なくとも
２つの部分から構成される。第１の部分は、標的の疑問の位置の下流に約５〜約
３０ヌクレオチドで始まる位置で標的核酸配列に相補的であるプローブの３'−
末端の約１０〜約３０ヌクレオチドを含む。第１のプローブの第２の部分は、疑
問の位置から、疑問の位置の約１０〜約３０ヌクレオチド下流までの標的配列の
反復である約５〜約３０ヌクレオチドを含み、およびプローブの第１の部分にハ
イブリダイズしない。すなわち、第２の配列は、疑問の位置の下流から、第１の
プローブの３'‐末端ヌクレオチドが標的とアラインする位置までの、標的配列
における領域の反復である。必要に応じたプローブの第３の部分は、プローブの
第１の部分と第２の部分との間に位置し、ゼロ〜約５０の、好ましくは約２０ま
での、ヌクレオチドの長さであり、第１の部分および第２の部分のいずれともハ
イブリダイズしない配列を含む。
【０２０３】 処理されたサンプルにおける第１のハイブリッドは、第１のプローブの３'‐
末端で伸長され、それによって疑問の位置を通り過ぎる第１のプローブを伸長し
、そして配列が疑問の部分を含む伸長された第１のハイブリッドを形成する（図
２Ｂ）。伸長された第１のハイブリッドは、元来の標的核酸および伸長された第
１のプローブから構成される。次いで、伸長された第１のハイブリッドは水性組
成物中で変性されて、ハイブリダイズされた２本鎖の２つの核酸鎖を分離し、そ
して分離された標的核酸および分離された伸長された第１のプローブを含む水性
溶液を形成する。
【０２０４】 約１０〜約２０００、好ましくは約１０〜約２００、最も好ましくは約１０〜
約３０のヌクレオチドの長さであり、および伸長された第１のプローブにおける
疑問の位置の下流の、約５〜約２０００、好ましくは約５〜約２００のヌクレオ
チドで開始する位置にて伸長された第１のプローブに相補的である、第２のプロ
ーブは、伸長された第１のプローブにアニールされ、それによって第２のハイブ
リッドを形成する（図２Ｃ）。第２のハイブリッドは、その伸長が伸長された第
１のプローブの５'−末端に達するまで第２のプローブの３'−末端で伸長され、
それによってその３'‐領域がアイデンティファイアーヌクレオチドを含む第２
の伸長されたハイブリッドを形成する（図２Ｄ）。
【０２０５】 伸長された第２のハイブリッドの水性組成物は変性されて２つの核酸鎖；すな
わち、伸長された第２のプローブおよび伸長された第１のプローブに分離される
。そのようにして形成される水性組成物は冷却されて、分離された伸長された第
２のプローブから、標的配列が元来の核酸サンプルに存在する場合、「ヘアピン
構造」を形成する（図２Ｅ）。従って、標的配列が元来の核酸サンプルに存在す
る場合、第２の伸長されたハイブリッドにおける第２の伸長されたプローブの３
'‐末端配列は、疑問の位置、および元来の（第１に命名される）プローブの３'
‐末端ヌクレオチドが元来の標的にアニールされたヌクレオチドの位置に対する
第２の伸長されたプローブの疑問の位置から下流のヌクレオチドを含む領域から
の第２の伸長されたプローブの配列とハイブリダイズする。
【０２０６】 処置された反応混合物は、ヘアピン構造を含有する組成物と、その活性が１つ
以上のヌクレオチドを核酸ハイブリッドの３'‐末端から放出することである酵
素の、脱重合化する量とを混合することによって形成される。反応混合物は、３
'‐末端領域アイデンティファイアーヌクレオチドを放出するのに十分な期間、
脱重合化する条件の下に維持され、次いで、放出されたアイデンティファイアー
ヌクレオチドの存在について解析される。解析的な出力結果は、種々の核酸標的
配列の存在または不在を示す。また、解析的な出力結果は、本明細書中の他の場
所で考察されるいくつかの方法の１つによって決定され得る。この多重のヘアピ
ンを形成するプローブ法の１つの実施態様において、種々の核酸標的配列からの
解析的な出力結果は区別可能である。
【０２０７】 以前の実施態様における場合のように、ｄＮＴＰは、伸長反応において利用さ
れる。アイデンティファイアーヌクレオチドについての解析を増強するために、
ヘアピン構造は、脱重合化の前にｄＮＴＰから分離されることが好ましい。
【０２０８】 キット 本発明の他の実施態様は、核酸サンプルにおける複数のあらかじめ決定された
核酸標的配列の存在または不在を決定するためのキットを意図する。このような
キットは、その活性がハイブリダイズされた核酸プローブの３'‐末端から１つ
以上のヌクレオチドを放出することである酵素、および少なくとも１つの核酸プ
ローブを含み、当該核酸プローブは核酸標的配列に相補的である。
【０２０９】 好ましくは、その活性がキットにおいてヌクレオチドを放出することである酵
素が、ピロリン酸イオンの存在下、その３'‐末端領域における塩基が全体的な
相補性を伴ってマッチされるハイブリダイズされた核酸を脱重合化する、温度依
存性のポリメラーゼである。あるいは、その活性が、ヌクレオチドを放出するこ
とである、キットにおける酵素は、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を示し、ハ
イブリダイズされたプローブの３'末端で１つ以上のミスマッチされた塩基を有
するハイブリダイズされた核酸を脱重合化する。
【０２１０】 好ましい実施態様において、加ピロリン酸分解を触媒し得る酵素は、Ｔａｑポ
リメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｎｅ３重変異体ポリメラーゼ、Ｔｔｈポリ
メラーゼ、Ｔｖｕポリメラーゼ、Ａｔｈポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラー
ゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ‐、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、またはポリ（Ａ）
ポリメラーゼであるが、これらに制限されない。別の好ましい実施態様において
、キットは、Ｓ１ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ ＢＡＬ ３１、ヤエナリヌクレ
アーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、およびリボヌクレアーゼＨのようなエキソ
ヌクレアーゼを含む。
【０２１１】 上述の酵素のタイプのいずれかが、脱重合化する効果的な量において、意図さ
れる方法において利用される。すなわち、酵素は、アイデンティファイアーヌク
レオチドを放出するためにハイブリッドプローブを脱重合化する量において使用
される。この量は、使用される酵素とともに、およびまた脱重合化が行われる温
度とともに変化し得る。キットの酵素は典型的に、反応あたり約０．１〜１００
Ｕの分配を簡便に許容する量において存在し；特に好ましい実施態様において、
濃度は約０．５Ｕ／反応である。少なくとも１つのアッセイを行うために十分な
量の酸素が、そのコントロールとともに提供される。
【０２１２】 代替の好ましい実施態様において、ピロリン酸の存在下におけるその活性が、
アイデンティファイアーヌクレオチドを放出することである酵素は、熱安定性の
ポリメラーゼである。好ましい熱安定性のポリメラーゼは、Ｔｎｅ３重変異体Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−、Ｋｌｅｎｏｗ、Ｔ４ ＤＮＡポリ
メラーゼ、Ａｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、および
Ｔｖｕ ＤＮＡポリメラーゼであり、Ｔｎｅ３重変異体ＤＮＡポリメラーゼ、お
よびＴｖｕ ＤＮＡポリメラーゼは特に好ましい。
【０２１３】 このようなキットは、本発明の任意の方法について有用であることが理解され
るべきである。特定の成分の選択は、特定の方法に依存し、キットが行われるよ
うに設計される。さらなる成分は、アイデンティファイアーヌクレオチドの放出
によって、または脱重合化後の残りのプローブの検出によって測定されるように
、解析的な出力結果の検出のために提供される。
【０２１４】 １つの実施態様において、キットは蛍光標識を含む核酸プローブを有する。こ
のようなキットを使用する方法において、放出されたアイデンティファイアーヌ
クレオチドまたは残りのプローブのいずれかが、蛍光分光法を使用して決定され
、プローブ内の蛍光標識の位置に依存する。代替の実施態様において、放出され
たヌクレオチドは、脱重合化されたプローブから分離され、そして残りのプロー
ブまたは放出されたヌクレオチドが蛍光的に標識される。このような実施態様は
、蛍光標識および／または磁性核酸分離媒体の提供を意図する。上述の蛍光の実
施態様は、蛍光標識が区別可能であることを意図する。
【０２１５】 別の実施態様において、キットは、アイデンティファイアーヌクレオチドとし
て非天然のヌクレオチドアナログを含む核酸プローブを有する。このようなキッ
トを使用する意図される方法において、脱重合化は質量分析を使用するためにア
ッセイされる。
【０２１６】 キットは必要に応じてさらに、脱重合化により当該核酸を検出するための指示
書を含む。このようなキットに存在する指示書は、本発明の種々の方法を行うた
めのキットの成分をどのように使用するかに対して、使用者を指示する。これら
の指示書は、本発明の検出方法の記載を含み得、発光分光法、質量分析、蛍光分
光法、および吸光度分光法を含む。
【０２１７】 １つの実施態様において、本発明は、核酸サンプルにおいて複数のあらかじめ
決定された核酸標的配列の存在または不在を決定するためのキットを意図し、以
下の成分：その活性が、ピロリン酸の存在下で、ハイブリダイズされた核酸プロ
ーブからヌクレオシド三リン酸としてアイデンティファイアーヌクレオチドを放
出することである酵素；ピロリン酸；および複数の核酸プローブを含み、ここで
は核酸プローブはそれらのそれぞれのあらかじめ決定された核酸標的配列に相補
的である。
【０２１８】 その活性が、ピロリン酸の存在下で、ハイブリダイズされた核酸プローブから
アイデンティファイアーヌクレオチドを放出することである酵素は、本明細書中
上述の通りようである。好ましくは、複数の核酸プローブは、有用なおよび簡便
な多重アッセイについての関連される適用のためである。例えば、いくつかの遺
伝子疾患マーカー（例えば、第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎおよびプロトロンビン）の検
出、一組のヒト同一性スクリーニング、一連の有害な微生物（例えば、あるＥ．
ｃｏｌｉ株、Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、およびＳａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ、またはＨＩＶ-Ｉ、ＨＩＶ-ＩＩ、薬物抵抗性ＨＩＶ-Ｉ、Ｃ型肝炎
、およびＢ型肝炎）の検出、または一連の核酸について植物を確認するため。こ
のようなプローブのいくつかの例は、本明細書中上述に考察される。
【０２１９】 多重化されるプローブ媒介性の、特異的な核酸の検出のために意図されるキッ
トにおいて、キットは目的の核酸標的についての複数の核酸プローブを含む。好
ましくはキットが複数のプローブを含む場合、プローブのそれぞれは、異なる標
的ＤＮＡ配列を疑問にするように設計される。
【０２２０】 本発明はまた、疑問の位置にて異なる塩基を有する複数のプローブおよび区別
可能なプローブを使用して、核酸標的内の特異的な塩基の同定を疑問にするにお
いて使用するための指示書を含む。本発明はまた、それぞれの標的について区別
可能なプローブを提供することによって、１つ以上の塩基対が異なる２つの相同
な核酸標的間を同時に区別するにおいて使用するための指示書を含む。あるいは
、本発明は、区別可能なプローブを使用して１つ以上の塩基対が、相同な核酸標
的から異なる一組の核酸標的間の同時の区別における使用のための指示書を含む
キットを意図する。本発明はさらに、サンプルが、欠失または挿入変異を有する
複数の核酸標的を含むか否かを決定するにおける使用のための指示書を含むキッ
トを意図する。キットにおいて含まれ得る核酸プローブのタイプおよびそれらの
使用は、以下により詳細に記載される。
【０２２１】 実施例１：１つの疑問の部位での対立遺伝子の多重解析 広範に多様な遺伝子異常について、非常に小さなパーセントのサンプルのみが
、任意の１つの部位にて特定の単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を有する。こ
の理由のために、変異体対立遺伝子の群の存在についてスクリーニングすること
、および変異体部位を検出するために設計された任意のプローブについてポジテ
ィブなシグナルがある場合にのみ単一のプローブ試験を二次的に行うことは、こ
れらの場合において非常により効果的であり得る。多重解析のこのような形態が
、本実施例において行われる。
【０２２２】 ＣＭＶゲノムにおける遺伝子の変異体の形態を検出するために設計された複数
のプローブが、１つの反応において使用され、そしてこの反応からのシグナルが
変異されていない配列に特異的であるプローブからのシグナルと比較される。本
実施例において、ＳＮＰ部位は、１塩基のみによって分離され、および対立遺伝
子は純粋な核酸標的種として提供される。
【０２２３】 オリゴヌクレオチドＣＶ１９（配列番号１）およびＣＶ２０（配列番号２）は
、ウイルスゲノムの１７８４位の周囲のＣＭＶゲノムのセグメントをコードし、
およびこれらのプローブは遺伝子の非変異体形態をコードする。オリゴヌクレオ
チドＣＶ２１（配列番号３）およびＣＶ２２（配列番号４）は、ＣＶ１９および
ＣＶ２０と同じゲノムセグメントをコードするが、コードされるタンパク質にお
いてＬｅｕコドンがＳｅｒコドンをコードするように変化される遺伝子の形態を
コードする。
【０２２４】 オリゴヌクレオチドＣＶ２３（配列番号５）およびＣＶ２４（配列番号６）は
また、ＣＶ１９およびＣＶ２０と同じゲノムセグメントをコードするが、これら
のオリゴヌクレオチドは、ＣＶ２１およびＣＶ２２において変異される同じＬｅ
ｕコドンが、Ｐｈｅコドンに変化されるゲノムの形態をコードする。これらのオ
リゴヌクレオチドは、本実施例における疑問のために標的核酸としてここで使用
される。
【０２２５】 オリゴヌクレオチドプローブＣＶ２５（配列番号７）は、ＣＶ１９の領域に正
確にマッチし、および遺伝子の変異されない形態を検出するように設計される。
オリゴヌクレオチドプローブＣＶ２６（配列番号８）は、ＣＶ２１内のセグメン
トに正確にマッチし、およびＬｅｕコドンがＳｅｒコドンに変異された遺伝子の
バージョンを検出するように設計される。オリゴヌクレオチドプローブＣＶ２７
（配列番号９）は、ＣＶ２４内のセグメントに正確にマッチし、およびＬｅｕコ
ドンがＰｈｅコドンに変異された標的のバージョンを検出するように設計される
。
【０２２６】 標的核酸対のＣＶ１９およびＣＶ２０、ＣＶ２１およびＣＶ２２、ならびにＣ
Ｖ２３およびＣＶ２４を、水中で１ｍｇ/ｍＬに溶解し、９５℃にて５分間加熱
することによってアニーリングし、そして室温に１０分間、冷却させた。続いて
、溶液を３．３μｇ／ｍＬに水で希釈した。プローブＣＶ２５、ＣＶ２６、およ
びＣＶ２７を、水中で１ｍｇ／ｍＬに溶解した。
【０２２７】 以下の溶液をアセンブリした。
【０２２８】
【表１】 これらの溶液を９５℃で３分間加熱し、次いで室温で１０分間冷却した。
【０２２９】 以下のマスターミックスをアセンブリし、そして混合した。
【０２３０】
【表２】 溶液１〜１２を室温で冷却した後、２０μＬのこのマスターミックスを各溶液
に添加し、そして溶液を３７℃で１５分間加熱した。この加熱工程後、各溶液の
４μＬのサンプルを１００μＬ Ｌ/Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆ２０２Ａ）に
添加し、そして得られる反応によって生成される光を、Ｔｕｒｎｅｒ（登録商標
）ＴＤ２０／２０ルミノメーターを使用して即座に読み取った。以下の結果が得
られた。
【０２３１】
【表３】 ２連の溶液からのこれらの結果を平均し、および以下の表に示す。
【０２３２】
【表４】 ★比率は野生型プローブからのシグナルを多重化された変異体プローブからのシ
グナルで割ることによって決定された。
【０２３３】 これらのデータは、１つの反応における両方の変異体プローブの使用が、適切
な標的が反応に付加される場合、いずれかのプローブがシグナルを与えることを
許容することを示す。いずれかのプローブが標的をマッチする場合に変異体標的
を検出するように設計されるプローブによって生成されるシグナルの比率は、野
生型プローブとともに野生型標的が使用される場合からよりも有意に異なる。従
って、上記のようなシグナルの比較は、変異が疑問の位置のいずれかで試験され
る標的に存在することを、使用者が知るのを許容する。 CV19 5'CTCTTTAAGCACGCCGGCGCGGCCTGCCGCGCGTTGGAGAACGGCAAGCTCACGCA 3' 配列番号
１ CV20 5'CAGCAGTGCGTGAGCTTGCCGTTCTCCAACGCGCGGCAGGCCGCGCCGGCGTGCTT 3' 配列番号
２ CV21 5'CTCTTTAAGCACGCCGGCGCGGCCTGCCGCGCGTCGGAGAACGGCAAGCTCACGCA 3' 配列番号
３ CV22 5'CAGCAGTGCGTGAGCTTGCCGTTCTCCGCGCGCGGCAGGCCGCGCCGGCGTGCTT 3' 配列番号４ CV23 5'CTCTTTAAGCACGCCGGCGCGGCCTGCCGCGCGTTTGAGAACGGCAAGCTCACGCA 3' 配列番号
５ CV24 5'CAGCAGTGCGTGAGCTTGCCGTTCTCAAACGCGCGGCAGGCCGCGCCGGCGTGCTT 3' 配列番号
６ CV25 5' GGCGCGGCCTGCCGCGCGTTG 3' 配列番号７ CV26 5' GGCGCGGCCTGCCGCGCGTCG 3' 配列番号８ CV27 5' GCGTGAGCTTGCCGTTCTCCG 3' 配列番号９ 実施例２：複数の鋳型に対する多重化されるゲノム解析 広範に多様な遺伝子異常について、非常に小さなパーセントのサンプルのみが
、任意の１つの部位にて特定の単一のヌクレオチド多型を示す。この理由のため
に、変異体対立遺伝子の群の存在についてスクリーニングすること、および変異
体部位を検出するために設計された任意のプローブについてポジティブなシグナ
ルがある場合にのみ単一のプローブ試験を二次的に行うことは、これらの場合に
おいて非常により効果的であり得る。多重解析のこのような形態が、本実施例に
おいて行われる。
【０２３４】 ２つの異なる標的遺伝子の変異体の形態を検出するために設計された複数のプ
ローブが、１つの反応において使用され、そしてこの反応からのシグナルが変異
されていない配列の１つに特異的であるプローブからのシグナルと比較される。
従って、本実施例において、複数の標的における複数のＳＮＰ部位は、１つの反
応において疑問にされる。
【０２３５】 本研究において使用された標的およびプローブは：ＦＶ（１＋２）（それぞれ
、配列番号１０および配列番号１１）、ＦＶ（３＋４）（それぞれ、配列番号１
２および配列番号１３）、ＦＶ５（配列番号１４）、ＦＶ６（配列番号１５）、
９１６２（配列番号１６）、９１６５（配列番号１７）、９１６３（配列番号１
８）、９１６６（配列番号１９）、およびＣＶ２（配列番号２０）である。第Ｖ
因子遺伝子の合成的な第１の核酸標的は、ＦＶ１（配列番号１０）の３２位でＧ
を含む野生型配列を有するように設計された。相補的な鎖、ＦＶ２、（配列番号
１１）は、その３'末端で４つのさらなる塩基を有する。第Ｖ因子の第２の合成
的な核酸標的は、Ｌｅｉｄｅｎ変異、ＦＶ３の３２位でＡ残基を有するように設
計された。変異体の相補的な鎖のＦＶ４はまた、その３'末端で４つのさらなる
塩基を有した。核酸標的オリゴヌクレオチドの、ＦＶ１〜ＦＶ４を、水中で別々
に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。オリゴヌクレオチドの９１６２および９１６
３は、相補的であり、および野生型ＣＭＶゲノムのセグメントを有する。オリゴ
ヌクレオチド９１６３および９１６６は相補的であり、ウイルスゲノムの同じセ
グメントを有するが、これらはウイルスの公知の薬物耐性の形態に存在する単一
の塩基の変化を含む。等容量の１ｍｇ／ｍＬの９１６２および９１６５を合わせ
、ＣＭＶについての変異体標的として作用した。等容量の１ｍｇ／ｍＬの９１６
３および９１６６を合わせ、ＣＭＶについての変異体標的として作用した。オリ
ゴヌクレオチドＣＶ２は、ＣＭＶ配列の薬物耐性を検出するように設計されたオ
リゴヌクレオチドを示す。
【０２３６】 全ての標的ＤＮＡ［ＦＶ（１＋２）、ＦＶ（３＋４）、９１６２＋９１６５、
９１６３＋９１６６］を、水で０．３μｇ/ｍＬに希釈した。他のオリゴヌクレ
オチドを、水で１ｍｇ/ｍＬに溶解した。これらの組成物を使用して、以下の溶
液をアセンブリした。
【０２３７】
【表５】 これらの２１個の溶液を、３連で、９２℃に１１分間加熱し、次いで約１時間
室温で冷却した。
【０２３８】 以下のマスターミックスをアセンブリし、そして混合した。
【０２３９】
【表６】 室温で冷却した後、２０μＬのマスターミックスを、２１個の溶液それぞれに
３連で添加し、そしてそれらを３７(Ｃで１５分間加熱し、次いで氷上に置いた
。
【０２４０】 溶液の５μＬサンプルを、各溶液の５μLのサンプルが、３連で、各プレート
内に存在するようにマイクロタイタープレートのウェルに置き、そして３つのこ
のようなプレートを調製した。プレートを、ルミノメーターを読み取るＬｕｍｉ
ｎｏｓｋａｎ（登録商標）マイクロタイタープレートに置き、そしてこの装置を
、各ウェルに１００μＬのＬ/Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆ１２０Ｂ）を添加し
、そしてウェル中の反応によって生成される光を即座に読み取るようにプログラ
ムした。各プレート内の各溶液についての個々の読み取り値を平均し、そしてこ
れらの平均を以下に与える。
【０２４１】
【表７】 反応についての光の値は、平均のＤＮＡなしのシグナル値および標的単独の平
均およびプローブ単独の値を、種々の標的およびプローブの組み合わせについて
測定された全ての光の値から減算することによって平均されたプレートの値から
調節した。標的／プローブの組み合わせを含む反応をさらに適切に調節されたプ
ローブ単独および標的単独の値を減算することによって補正して、正味の光の値
を得た。得られた結果は、以下の表において示される。
【０２４２】
【表８】 以前の実施例におけるように、非常に異なるシグナルパターンが、研究された
種々の標的の組み合わせで見られた。このことは、多重の様式において複数の変
異体プローブを使用することは、変異部位がサンプル内に存在する場合、決定す
るために必要とされる反応の数を減少し得ることを示す。このアッセイ系につい
てのこれらのデータは、変異体プローブ反応からのシグナルが、対応する野生型
プローブで見られるシグナルに接近するか、またはこれよりも大きい場合に、サ
ンプルが少なくとも１つの部位において変異を伴う標的を含むことを示す。さら
に、野生型（ＷＴ）プローブについてのシグナルが多重化された変異体プローブ
についてのシグナルよりもはるかに低い場合、野生型プローブによって疑問にさ
れる標的が少なくとも、変異体の形態にあるようである。 FV1 5'CTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAGGAATACAGAGGGCAGCAGACATCGAAGAGCT 3'
配列番号１０ FV2 5'AGCTCTTCGATGTCTGCTGCCCTCTGTATTCCTCGCCTGTCCAGGGATCTGCTCTTACAGATTAGAGCT
3' 配列番号１１ FV3 5'CTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCAAGGAATACAGAGGGCAGCAGACATCGAAGAGCT 3'
配列番号１２ FV4 5'AGCTCTTCGATGTCTGCTGCCCTCTGTATTCCTTGCCTGTCCAGGGATCTGCTCTTACAGATTAGAGCT
3' 配列番号１３ FV5 5' CTGCTGCCCTCTGTATTCCTCG 3' 配列番号１４ FV6 5' CTGCTGCCCTCTGTATTCCTTG 3' 配列番号１５ 9162 5' CGTGTATGCCACTTTGATATTACACCCATGAACGTG CTCATCGACGTCAACCCGCACAACGAGCT 3' 配列番号１６ 9165 5' CGTTGTGCGGGTTCACGTCGATGAGCACGTTCATGG GTGTAATATCAAAGTGGCATACACGAGCT 3' 配列番号１７ 9163 5' CGTGTATGCCACTTTGATATTACACCCGTGAACGTG CTCATCGACGTCAACCCGCACAACGAGCT 3' 配列番号１８ 9166 5'CGTTGTGCGGGTTCACGTCGATGAGCACGTTCACGG GTGTAATATCAAAGTGGCATACACGAGCT 3' 配列番号１９ CV2 5' CACTTTGATATTACACCCGTG 3' 配列番号２０ 実施例３：ＲＮＡの特異的検出：添加される外来の標的ＲＮＡを伴うかまたは 伴わない反応においてプローブ配列をマッチするＲＮＡ種からのシグナルの比較 特異的な標的配列を検出するために使用されるＲＮＡ配列をマッチするＤＮＡ
プローブを使用する加ピロリン酸分解反応について、系は、外来のＲＮＡの存在
下および不在下で非常に類似のシグナルを与えるべきである。本実施例において
、大量の酵母ＲＮＡ存在下、標的グロブリンｍＲＮＡを検出するように設計され
たプローブのシグナルの強度が、添加される酵母ＲＮＡの不在下で見られるシグ
ナルに比較される。
【０２４３】 種々のレベルの酵母ＲＮＡ、プローブ６（配列番号２１）またはプローブ８（
配列番号２２）、および標的グロブリンｍＲＮＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、１８１
０３−０２８）を含有するハイブリダイゼーション溶液を、５μＬの４０ｎｇ／
μＬの標的グロブリンｍＲＮＡの溶液および１×ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中の１０μＬ酵母ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．Ｒ３６２９）に、５μＬの５００ｎｇ／μＬのプローブ６またはプロ
ーブ８のいずれかの溶液を添加することによって、アセンブリして、０、２、２
０、２００、４００、および８００ｎｇの酵母ＲＮＡの総量を含有する溶液を生
成した。溶液を、５０℃で１５分間加熱し、次いで１５分間、室温に冷却させた
。
【０２４４】 以下のマスター反応混合物をアセンブリした：
【０２４５】
【表９】 上述の溶液を混合し、そして１８μＬのミックスを１８個のチューブに置いた
。１５分間の冷却後、プローブ６を含有する２μＬの種々のハイブリダイゼーシ
ョン溶液をチューブに添加し、そしてチューブを３７℃の加熱ブロックに置いた
。
【０２４６】 反応マスターミックスとのハイブリダイゼーション混合物の１５分間のインキ
ュベーション後、２０μＬの溶液を、１００μＬのＬ/Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ
、Ｆ２０２Ａ）に添加し、そして得られる反応の光の出力結果をＴｕｒｎｅｒ（
登録商標）ＴＤ-２０／２０ルミノメーターを使用して測定した。
【０２４７】 プローブ６のデータを回収した後、プローブ８を含有するハイブリダイゼーシ
ョン溶液を使用して、同一のセットの反応を行った。 以下のデータが得られた：
【０２４８】
【表１０】
【０２４９】
【表１１】 これらのデータは、ハイブリダイゼーション反応への非常に大量の酵母ＲＮＡ
の添加は、特異的な標的ＲＮＡ種についてのハイブリダイズされたプローブから
のシグナルをそれほど大きくは低下させなかったことを示す。
【０２５０】
【表１２】 実施例４：先天的な副腎過形成（ＣＡＨ）遺伝子の多重解析 ＣＡＨ遺伝子を疑問にするための熱安定性酵素の使用は、１つの反応内におい
て６つまでの複数の部位の疑問を許容する。本実施例において使用される方法は
、スクリーニング実験室において行われる日常的な研究の説明であり、有用な結
果が、ほとんど全てのサンプルにおける予期される遺伝子の存在（または変異体
遺伝子の不在）を示し、およびまれにのみ、変異体遺伝子の存在を示す。本実施
例で説明される場合において、定量的な結果が提供され、そこから正確な変異体
の存在が、その後のアッセイにおいて決定され得る。
【０２５１】 先天的な副腎過形成（ＣＡＨ）は、１０個のエクソンを含むステロイド２１‐
水酸化酵素（ＣＹＰ２１）遺伝子における広範囲な変異から生じる常染色体劣性
疾患の群である。
【０２５２】 ＣＹＰ２１、機能的な遺伝子と、ＣＹＰ２１Ｐ、非機能的な偽遺伝子との間に
、高いレベルの核酸相同性（エクソンにおいて９８％、イントロンにおいて９６
％）がある。疾患に導き得るこの遺伝子における変異の多くのタイプとしては、
完全な遺伝子欠失、大きな遺伝子変換、単一の点変異、および小さな８ｂｐ欠失
が挙げられる［Ｗｈｉｔｅら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．、３：３７３‐３７８、（
１９９４）を参照のこと］。
【０２５３】 大多数のＣＡＨ疾患を引き起こす変異は、発現されないＣＹＰ２１Ｐ偽遺伝子
に存在し、そしてＣＹＰ２１ＰとＣＹＰ２１との間の組換えを介して、ＣＹＰ２
１遺伝子中に生じる。従って、１つの変異欠失のストラテジーは、ＣＹＰ２１遺
伝子を特異的に検出し、そしてＣＹＰ２１Ｐ偽遺伝子を検出しない。集団におけ
る疾患を引き起こす対立遺伝子の頻度は、５０個中の約１個である。野生型ＣＡ
Ｈ ＰＣＲ産物、変異体合成標的、およびクローン化されたＣＹＰ２１Ｐ偽遺伝
子から増幅された偽遺伝子ＰＣＲ産物の両方が、このアッセイにおいて標的とし
て利用された。これらを以下に列挙する。
【０２５４】 ＰＣＲ増幅において使用されたプライマー対、および得られる産物は以下のよ
うである。
【０２５５】
【表１３】 利用された合成標的および疑問のオリゴを以下に列挙する。
【０２５６】 ＰＣＲ反応をアセンブリして、未消化のヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、
Ｇ3０４１）を標的として使用して（反応あたり２５ｎｇ）、４つの異なるプロ
ーブセットを用いてＣＡＨ遺伝子の領域を増幅した。偽遺伝子の増幅のために、
ヒトゲノムＤＮＡを、正方向ＰＣＲプローブの上流のＣＹＰ２１遺伝子を特異的
に切断する制限酵素ＢｃｌＩであらかじめ消化し、従って、ＣＹＰ２１Ｐの増幅
のみを許容した［Ｋｒｏｎｅ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．４４（１０）：２
０７５‐２０８２（１９８８）］。
【０２５７】 ２６８０ｂｐのＰＣＲ産物を５０ｎｇの消化されたＤＮＡから増幅し、そして
続いて製造業者のプロトコルに従って、プラスミドベクターｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａ
ｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ１３８０）にクローン化した。クローンを選択肢そし
て配列決定して（ＵＳＢ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅキット、ＵＳ７０７７０）、これ
が実際に偽遺伝子であることを確認した。ｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙベクターにお
けるクローン化されたＣＹＰ２１Ｐ遺伝子を、その後の増幅において使用して、
変異疑問解析のための純粋な偽遺伝子ＰＣＲ産物を得た（ＰＣＲ反応あたり１０
０ｐｇのプラスミド）。
【０２５８】 全ての５０μＬの増幅反応は、以下の試薬を含んだ：ゲノムＤＮＡ（上記され
るように）、１×反応緩衝液（Ｍ１９０１）、１．０〜１．５ｍＭ塩化マグネシ
ウム（１．５ｍＭのＭｇＣｌ2を含んだ、偽遺伝子についての１０９１２＋１０
９１１のプローブ対以外は、全て１．０ｍＭで；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ３５１１）
、２００μＭの各ｄＮＴＰ（Ｃ１１４１）、５０ピコモルの各プローブ、および
２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ１６６５）。
【０２５９】 以下のサイクリングプロフィールを全ての増幅に利用した：９５℃で５分間；
４０サイクルの９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃でｋｂｐの産物あた
り１分間；６８℃で８分間；４℃での浸漬。産物を１％アガロースゲルにおいて
解析し、そしてＤＮＡ分子量標準に比較して、産物の大きさが正しいことを確認
した。次いで、各ＰＣＲ反応のアリコート（２５μＬ）を５０単位のＴ７ ＧＥ
ＮＥ ６エキソヌクレアーゼ（ＵＳＢ、Ｅ７００２５Ｙ）で１５分間、３７℃に
て処理し、続いて、３×１ｍＬ ８０％イソプロパノール洗浄を伴って、Ｗｉｚ
ａｒｄ（商標）ＰＣＲ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓ
ｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ７１７０）を使用して精製した。エキソヌクレアー
ゼ処理されたＤＮＡを、１００μＬのヌクレアーゼ非含有水中に溶出した。
【０２６０】 等容量のＣＡＨ野生型（ＷＴ）９１８ｂｐおよび１４９６ｂｐＰＣＲ産物を合
わせ（従って、全ＣＡＨ遺伝子に及ぶ）、そして各変異部位で別々に、または多
重化された群としてのいずれかで疑問にした。
【０２６１】 各疑問アッセイ（２０μＬの全容量）は、４μＬの精製されたＰＣＲ産物また
は５ｎｇの合成標的、および１μｇの疑問のオリゴプローブ（またはオリゴなし
のバックグラウンドコントロールについては水）を含んだ。反応を９５℃で３分
間インキュベートし、続いてＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−については３７℃で、また
はＴｎｅポリメラーゼについては５５℃で、１０分間、インキュベートした。２
０μＬのマスターミックス（２ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．２μＭ ＡＤＰ
、２×ポリメラーゼ緩衝液（ＫｌｅｎｏｗについてはＭ１９５Ａ、またはＴｎｅ
についてはＭ１９０１）を添加し、（Ｔｎｅについてのみ５ｍＭ 塩化マグネシ
ウム、１〜２ＵのＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−、および０．２Ｕの酵母ＮＤＰＫまた
は１ＵのＴｎｅ３重変異体ポリメラーゼ、および０．１ＵのＰｆｕ ＮＤＰＫ）
、そして反応を１５分間、３７℃（Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−）または５５℃（Ｔ
ｎｅ）でインキュベートした。次いで、全反応を１００μＬのＬ/Ｌ試薬（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ ＦＦ２０２Ａ）に添加し、そして光出力結果を、Ｔｕｒｎｅｒ（登
録商標） ＴＤ２０／２０ルミノメーターにおいて読み取った。
【０２６２】 識別比は、組み合わせたＰＣＲ産物についての別々の反応、および多重化され
た反応の両方において良好であった。ＣＡＨ野生型ＰＣＲ産物および６つの野生
型の疑問のオリゴプローブまたは６つの変異体の疑問のオリゴプローブのいずれ
かを使用する多重化された反応を、等モル量の合成標的（各変異部位についての
変異体合成標的；０．２ピコモルのＰＣＲ産物または合成標的のいずれか）とあ
わせて、ヘテロ接合体サンプルを模擬実験した。
【０２６３】
【表１４】 大きなサイズのＣＡＨ遺伝子および存在し得る多数の異なる変異体のために、
熱安定性の酵素の使用、および従って検出手順の増加されたストリンジェンシー
は、この複雑な標的で非常に有利であることが見出された。３７℃でＫｌｅｎｏ
ｗ ｅｘｏ−および酵母ＮＤＰＫを使用して不十分に問題にされた変異部位は、
上昇された温度でＴｎｅ３重変異体ポリメラーゼおよびＰｆｕ ＮＤＰＫを使用
する場合、より首尾よく問題にされた。さらに、熱安定性の酵素の使用は、存在
し得る変異についての迅速なスクリーニングを得るために、同じ疑問アッセイに
おける多数の野生型または変異体の疑問のオリゴの多重化を許容した。
【０２６４】 利用されたＰＣＲプライマー： 10909 5' CCAGAGCAGGGAGTAGTCTC 3' 配列番号６６ ＣＡＨ逆方向プライマー；５'大部分３連鎖ホスホロチオエート（ＣＹＰ２１の
み） 10912 5' GCATATAGAGCATGGCTGTG 3' 配列番号６７ ＣＡＨ正方向プライマー 10910 5' CCTGTCCTTGGGAGACTAC 3' 配列番号６８ ＣＡＨ正方向プライマー（ＣＹＰ２１のみ） 10911 5' CCCAGTTCGTGGTCTAGC 3' 配列番号６９ ＣＡＨ逆方向プライマー；５'大部分３連鎖ホスホロチオエート 11286 5' TCCTCACTCATCCCCAAC 3' 配列番号７０ ＣＡＨ逆プライマー；５'大部分３連鎖ホスホロチオエート 11461 5'GAAATACGGACGTCCCAAGGC 配列番号７１ ＣＡＨ正方向プライマー 11480 5'CTTTCCAGAGCAGGGAGTAG 配列番号７２ ＣＡＨ逆方向プライマー；５'大部分３連鎖ホスホロチオエート（ＣＹＰ２１の
み） 11535 5'CCGGACCTGTCCTTGGGAGA 配列番号７３ ＣＡＨ正方向プライマー（ＣＹＰ２１のみ） 利用した合成標的： 11293 5' AGAAGCCCGGGGCAAGAGGCAGGAGGTGGAGGCTCCGGAG 3' 配列番号７４ 疑問因子オリゴ１（偽遺伝子／変異体‐エクソン１）についてのＣＡＨ合成標
的１、変異部位１ 11294 5' AGCTTGTCTGCAGGAGGAGCTGGGGGCTGGAGGGTGGGAA 3' 配列番号７５ 疑問因子オリゴ２（偽遺伝子／変異体‐イントロン２）についてのＣＡＨ合成
標的２、変異部位２ 11295 5' TCCGAAGGTGAGGTAACAGTTGATGCTGCAGGTGAGGAGA 3' 配列番号７６ 疑問因子オリゴ３（偽遺伝子／変異体‐エクソン４）についてのＣＡＨ合成標
的３、変異部位３ 11296 5' TCCACTGCAGCCATGTGCAAGTGCCCTTCCAGGAGCTGTC 3' 配列番号７７ 疑問因子オリゴ４（偽遺伝子／変異体‐エクソン７）についてのＣＡＨ合成標
的４、変異部位４ 11297 5' TCGTGGTCTAGCTCCTCCTACAGTCGCTGCTGAATCTGGG 3' 配列番号７８ 疑問因子オリゴ５（偽遺伝子／変異体‐エクソン８）についてのＣＡＨ合成標
的５、変異部位５ 11298 5' GCTAAGGGCACAACGGGCCACAGGCGCAGCACCTCGGCGA 3' 配列番号７９ 疑問因子オリゴ１２（偽遺伝子／変異体‐エクソン８）についてのＣＡＨ合成
標的６、変異部位６ 11484 5'CAGCTTGTCTGCAGGAGGAGTTGGGGGCTGGAGGGTGGGA 3' 配列番号８０ 疑問因子オリゴ７（野生型‐イントロン２）についてのＣＡＨ合成標的７、変
異部位２ 11485 5'GGCTAAGGGCACAACGGGCCGCAGGCGCAGCACCTCGGCG 3' 配列番号８１ 疑問因子オリゴ１１（野生型‐エクソン８）についてのＣＡＨ合成標的８、変
異部位６ 利用した疑問のオリゴプローブ： 11143 5' CGGAGCCTCCACCTCCCG 配列番号２３ 変異部位１についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ６（野生型） 11085 5' CACCCTCCAGCCCCCAGC 3' 配列番号２４ 変異部位２についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ２（偽遺伝子／変異体） 11084 5' CGGAGCCTCCACCTCCTG 3' 配列番号２５ 変異部位１についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ１（偽遺伝子／変異体） 11086 5' CCTCACCTGCAGCATCAAC 3' 配列番号２６ 変異部位３についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ３（偽遺伝子／変異体） 11144 5' CACCCTCCAGCCCCCAAC 3' 配列番号２７ 変異部位２についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ７（野生型） 11145 5' CCTCACCTGCAGCATCATC 3' 配列番号２８ 変異部位３についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ８（野生型） 11087 5' CCTGGAAGGGCACTT 3' 配列番号２９ 変異部位４についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ４（偽遺伝子／変異体） 11146 5' CCTGGAAGGGCACGT 3' 配列番号３０ 変異部位４についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ９（野生型） 11088 5' GATTCAGCAGCGACTGTA 3' 配列番号３１ 変異部位５についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ５（偽遺伝子／変異体） 11147 5' GATTCAGCAGCGACTGCA 3' 配列番号３２ 変異部位５についてのＣＡＨ疑問因子オリゴ１０（野生型） 11287 5' CGAGGTGCTGCGCCTGCG 3' 配列番号３３ 変異部位６についてのＣＡＨ疑問のオリゴ１１（野生型） 11288 5'CGAGGTGCTGCGCCTGTG 3' 配列番号３４ 変異部位６についてのＣＡＨ疑問のオリゴ１２（偽遺伝子／変異体） 11641 5'GGGATCACATCGTGGAGATG 3' 配列番号３５ 変異部位７についてのＣＡＨ疑問のオリゴ２３（野生型） 11642 5'GGGATCACAACGAGGAGAAG 3' 配列番号３６ 変異部位７についてのＣＡＨ疑問のオリゴ２４（偽遺伝子／変異体） 実施例５：疑問のアッセイ後であるが、リン酸転移および光生成前のｄＮＴＰ のＨＰＬＣ分離 大容量の加ピロリン酸分解アッセイを、マッチされるおよびミスマッチされる
プローブ／標的ハイブリッドに対して行った。放出されたヌクレオチドを、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分離し、そしてそれらの画分を回
収した。ＮＤＰＫ末端リン酸転移反応を、これらの濃縮されたフラクションに対
して行い、そしてルシフェラーアッセイゼを行って、元来のマッチされるおよび
ミスマッチされるハイブリッドの処理されたサンプル間の区別を説明した。
【０２６５】 標的／プローブハイブリッドを、３１５ｎｇの合成野生型ＣＭＶ標的オリゴヌ
クレオチドと、マッチされるハイブリッドについては１０.５μｇの野生型ＣＭ
Ｖプローブ、またはミスマッチされるハイブリッドについては１０.５μｇの変
異体ＣＭＶプローブのいずれかとを合わせ、そして水を２００μＬの最終容量に
添加することによって形成した。オリゴヌクレオチドは、ＣＶ１２（配列番号３
７）、ＣＶ１５（配列番号３８）、およびＣＶ１６（配列番号３９）であった。
ＣＶ１２（配列番号３７）は、薬物ガンシクロビルに対して感受性の形態におけ
るサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のゲノムの１本鎖ＤＮＡセグメントである。
ＣＶ１５（配列番号３８）は、非抵抗性ＣＭＶに、全体的な相補性を伴って、ハ
イブリダイズされるプローブである。ＣＶ１６（配列番号３９）は、ＣＶ１５（
配列番号３８）に同一であるが、ウイルスに対する薬物抵抗性を付与するＳＮＰ
の部位でＣＶ１５から１塩基の変化を含む。これらの溶液を、９５℃で少なくと
も５分間加熱し、次いで室温で少なくとも１０分間冷却した。
【０２６６】 以下のマスターミックスを調製した。 ３３７．５μＬ ナノピュア水（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＡＡ３９９） ９０．０μＬ １０×ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ１９５
Ａ） １１．２５μＬ ４０ｍＭ ＮａＰＰｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃ１１３） マスターミックス（２１０μＬ）を、上述のハイブリッド溶液のそれぞれに添
加し、そして５．８単位のＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−（Ｐｒｏｇｅｍａ、Ｍ２１８
Ａ）をそれぞれに添加した。次いで、溶液を３７℃で１５分間インキュベートし
、そして氷上で保存した。ｄＮＴＰのＨＰＬＣ分離を行った。
【０２６７】 ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＴＴＰのＨＰＬＣ分離を、Ｐｈｅｎｏ
ｍｅｎｅｘからの１００×４．６ｍｍ、３μ Ｌｕｎａ Ｃ１８カラムに対して
行った［ＰｅｒｒｏｎｅおよびＢｒｏｗｎ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
、３１７：３０１‐３１０（１９８４）］。カラムを１２分間にわたって、９７
％の緩衝液Ａ（１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７）〜９２％の緩
衝液Ａの線形勾配で溶出した。緩衝液Ｂの組成は、８０：２０のアセトニトリル
：３５ｍＭ 酢酸トリエチルアンモニウムである。検出を２５０、２６０、およ
び２８０ｎｍでの吸光度によってモニターした。これらの条件下、ｄＣＴＰが４
分と４．５分との間で溶出され、ＴＴＰおよびｄＧＴＰは、７分と７．５分との
間の２つのピークとして溶出され、ならびにｄＡＴＰは９分から９．５分に溶出
されることが見出された。
【０２６８】 遊離ｄＮＴＰを含有する画分を回収し、そして凍結乾燥した。画分１はｄＣＴ
Ｐ含み、画分２はｄＧＴＰおよびＴＴＰを含み、ならびに画分３はｄＡＴＰを含
んだ。
【０２６９】 各画分を１００μＬのナノピュア水中で再構成した。１０μＬの各画分、また
はコントロールとして１０μＬの水を、水、１０×ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、
ＡＤＰの１０μＬ混合物に、最終濃度が１×ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液および０
．１μＭ ＡＤＰになるように、添加した。ＮＤＰＫ（０．００５単位）をチュ
ーブの一方のセットにおいて各チューブに添加し、そして等量の水を他方のセッ
トのチューブにおいて各チューブに添加した。サンプルおよびコントロールを３
７℃で１５分間インキュベートし、１０μＬを１００μＬのＬ/Ｌ試薬に添加し
、そして光出力結果をＴｕｒｎｅｒ（登録商標） ＴＤ１０／２０ルミノメータ
ー上で測定した。得られた相対的な光単位（ｒｌｕ）の結果を以下に示す：
【０２７０】
【表１５】 上述のデータから見られるように、画分１はマッチ：ミスマッチの比率が２．
１であり、画分２はマッチ：ミスマッチの比率が２．２、および画分３はマッチ
：ミスマッチの比率が２．８である。それゆえ、データは、個々のヌクレオチド
のＨＰＬＣ分離、続くルシフェラーゼの好ましい基質のＡＴＰへのＮＤＰＫの変
換を使用する有用性を実証する。画分３は、ヌクレオチドＨＰＬＣ画分における
ｄＡＴＰの存在に起因して、わずかにより高いマッチ：ミスマッチの比率を提供
する。それにもかかわらず、アイデンティファイアーヌクレオチドのＨＰＬＣ分
離は、本発明の疑問のアッセイにおいて有用である。 CV12 5'CCAACAGACGCTCCACGTTCTTTCTGACGTATTCGTGCAGCATGGTCTGCGAGCATTCGTGGTAGAAGCG
AGCT 3' 配列番号３７ CV15 5' CTACCACGAATGCTCGCAGAC 3' 配列番号３８ CV16 5' CTACCACGAATGCTCGCAGAT 3' 配列番号３９ 実施例６：同じサンプルにおける第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎと、およびプロトロン ビンＳＮＰと関連するヌクレオチド配列の多重決定 ヒトＤＮＡサンプルが第Ｖ因子遺伝子のＬｅｉｄｅｎ変異、および特定のプロ
トロンビンの単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含むか否かを決定するために
本実施例においてアッセイを行った。これらの２つの特徴についてのアッセイを
、同じ反応において同時に行った。
【０２７１】 プローブＰＴ５（配列番号４０）およびＰＴ６（配列番号４１）を、プロトロ
ンビン遺伝子をコードする約５００塩基対にわたるヒトゲノムＤＮＡの領域をＰ
ＣＲ増幅するために使用した。プローブ１０８６１（配列番号４２）および９８
２８（配列番号４３）を、第Ｖ因子遺伝子をコードする約３００塩基対にわたる
ヒトゲノムＤＮＡの領域をＰＣＲ増幅するために使用した。プローブＰＴ５およ
び１０８６１は、５'末端での初めの５塩基の間にホスホロチオエート結合を有
する。第Ｖ因子およびプロトロンビンフラグメントを、以下の条件下で１つのＰ
ＣＲ反応において同時増幅した： ５μＬ １０×ＰＣＲ緩衝液 ５μＬ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １μＬ １０ｍＭ ｄＮＴＰ １μＬ プローブＰＴ５（５０ｐｍｏｌ） １μＬ プローブＰＴ６（５０ｐｍｏｌ） １μＬ プローブ１０８６１（５０ｐｍｏｌ） １μＬ プローブ９８２８（５０ｐｍｏｌ） １μＬ ヒトゲノムＤＮＡ（４０ｎｇ） ３６μＬ 水 １．２５Ｕ Ｔａｑ。
【０２７２】 ＰＣＲサイクリングパラメーターは以下のようであった：９４℃、２分間；（
９４℃、３０秒間；６０℃、１分間；７０℃、１分間）×４０；７０℃、５分間
。１５単位のＴ７遺伝子 ６ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＵＳＢ Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）を２５μＬのＰＣＲ反応に添加し、そして溶液を３０分間３７℃でインキ
ュベートした。磁性シリカ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ１３３０）を使用して、遊離ヌ
クレオチドを溶液から除去し、そして残存するＤＮＡを１００μＬの水で溶出し
た。
【０２７３】 使用したプロトロンビンの疑問のプローブは、変異体プロトロンビン配列をマ
ッチする１１２６５（配列番号４４）、および野生型プロトロンビン配列をマッ
チする１１２６６（配列番号４５）である。これらのプローブのそれぞれは、３
'末端から８塩基の不安定化する変異を有する。使用した第Ｖ因子の疑問のプロ
ーブは、野生型第Ｖ因子配列をマッチする９９１９（配列番号４６）、および第
Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ異変配列をマッチする１１４３２（配列番号４７）である。
【０２７４】 ４μＬの溶出したＤＮＡを、各疑問のプローブで独立して、ならびにまた、第
Ｖ因子およびプロトロンビン変異体プローブと１つの反応において組み合わせて
、疑問にした。疑問の反応は、以下のようにアセンブリした。
【０２７５】 ４μＬ ＤＮＡ（ＰＣＲ産物、Ｅｘｏ６処理され、そして精製された） １５０ｐｍｏｌ 各疑問のオリゴ 水 ２０μＬの最終容量に添加した 反応を、９５℃で３分間、次いで３７℃で１０分間インキュベートした。次い
で、２０μＬの標準マスターミックスを添加し、そして反応を、３７℃で１５分
間インキュベートした。次いで、１００μＬのＬ/Ｌ試薬を添加し、そして光出
力結果をＴｕｒｎｅｒ（登録商標） ＴＤ２０/２０ルミノメーターにおいて測
定した。マスターミックスは以下を含んだ。
【０２７６】 ７１μＬ 水 ２０μＬ １０×ＤＮＡプール緩衝液 ５μＬ ４０ｍＭ ＮａＰＰｉ ２μＬ １０μＭ ＡＤＰ １μＬ １単位／μＬ ＮＤＰＫ １ １０単位／μＬ Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−。
【０２７７】 光出力結果は以下のようであった：
【０２７８】
【表１６】 これらのデータは、個体からの両方のゲノムＤＮＡが、第Ｖ因子について野生
型およびプロトロンビンについて野生型であることを示す。
【０２７９】 さらなる９６個の臨床学的なゲノムＤＮＡサンプルを、上記のように疑問にし
た。全てのデータが、遺伝子型を表すための以下の等式に適合する。
【０２８０】 両方の野生型のプローブのｒｌｕ ＞０．７５ 両方の野生型のｒｌｕ＋両方の変異体のプローブのｒｌｕ この等式は両方の野生型プローブからの解析的な出力結果および両方の変異体
プローブからの解析的な出力結果を加算したものによって割った両方の野生型プ
ローブを含む疑問からの解析的な出力結果である。この値が０．７５よりも大き
い場合、サンプルは両方の遺伝子座でホモ接合体の野生型である。この値が０．
７５よりも小さい場合、少なくとも１つの遺伝子座で少なくとも１つの対立遺伝
子が変異体である良好な傾向があり、そしてサンプルは、各遺伝子座について別
々に遺伝子型についてさらに解析されるべきである。 PT5 5' ATAGCACTGGGAGCATTGAGGC 3' 配列番号４０ PT6 5' GCACAGACGGCTGTTCTCTT 3' 配列番号４１ 10861 5' TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA 3' 配列番号４２ 9828 5' TGTTATCACACTGGTGCTAA 3' 配列番号４３ 11265 5' GTGATTCTCAGCA 3' 配列番号４４ 11266 5' GTGATTCTCAGCG 3' 配列番号４５ 9919 5' GACAAAATACCTGTATTCCTCG 3' 配列番号４６ 11432 5' GACAAAATACCTGTATTCCTTG 3' 配列番号４７ 実施例７：第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎおよびプロトロンビン変異についての多重の 疑問：質量分析解析 本実施例は、本発明のプロセスによる多重反応においてハイブリダイズされる
プローブの３'‐末端から放出されるヌクレオチドが、質量分析によって検出さ
れ得、それによって変異体対立遺伝子が研究される遺伝子座の１つで存在するか
否かを決定し得ることを実証する。
【０２８１】 プロトロンビン遺伝子をコードする約５００塩基対にわたるヒトゲノムＤＮＡ
の領域をＰＣＲ増幅するために、プローブＰＴ５（配列番号４０）およびＰＴ６
（配列番号４１）を使用する。第Ｖ因子遺伝子をコードする約３００塩基対にわ
たるヒトゲノムＤＮＡの領域をＰＣＲ増幅するために、プローブ１０８６１（配
列番号４２）および９８２８（配列番号４３）を使用する。これらのプローブお
よびＰＣＲ反応条件は、実施例６において詳述される。プローブＰＴ５および１
０８６１は、５'末端での初めの５塩基の間にホスホロチオエート結合を有する
。ＰＣＲ産物をＴ７遺伝子６ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＵＳＢ Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）で処理し、そして実施例６において記載されるように遊離ヌクレオチドか
ら分離する。
【０２８２】 プロトロンビンの疑問のプローブ、１１２６５（配列番号４４）は、変異体プ
ロトロンビン配列のセグメントに全体的に相補的である。第Ｖ因子の疑問のプロ
ーブ、１１４３２（配列番号４７）は、変異体第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ変異配列の
セグメントに全体的に相補的である。これらのプローブのそれぞれは、３'‐末
端から８塩基の不安定化変異を有する。
【０２８３】 ＰＣＲ産物を、実施例６において記載されるように、合成し、Ｅｘｏ６処理し
、そして精製する。疑問の反応を４０μＬの各ＰＣＲ産物および１．５ｎｍｏｌ
の各疑問のプローブでアセンブリする。水を１００μＬの最終容量に添加する。
これらの反応を２連でアセンブリし、それによって一方は３７℃にてＫｌｅｎｏ
ｗ ｅｘｏ−ポリメラーゼおよび酵母ＮＤＰＫでアッセイされ得るのに対して、
他方は７０℃にてＴｎｅ３重変異体ポリメラーゼおよびＰｆｕ ＮＤＰＫでアッ
セイされる。
【０２８４】 これらのアセンブリされる反応を、９５℃で３分間、次いで３７℃で１０分間
インキュベートする。アセンブリされる反応は、容量を減少するために凍結乾燥
され得る。２つの異なるマスターミックスをアセンブリする。両方のマスターミ
ックスは、２ｍＭピロリン酸ナトリウムおよび０．２μＭ ＡＤＰを有する。一
方は、１〜２ＵのＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−および０．２Ｕの酵母ＮＤＰＫ、およ
び２×ポリメラーゼ緩衝液（Ｍ１９５Ａ）を有し；他方は、１ＵのＴｎｅ３重変
異体ポリメラーゼおよび０．１Ｕ Ｐｆｕ ＮＤＰＫ、２×ポリメラーゼ緩衝液
（Ｍ１９０１）、および５ｍＭ塩化マグネシウムを有する。等容量の各マスター
ミックスを、上記の反応溶液に別々に添加する。次いで、ポリメラーゼとしてＫ
ｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−を含有する溶液を３７℃で１５分間インキュベートするの
に対して、Ｔｎｅ３重変異体ポリメラーゼを含有する溶液は、５５℃〜７０℃の
間でインキュベートする。
【０２８５】 放出されたヌクレオチドの存在、または不在、ＡＴＰへの変換を、シリコン脱
着イオン化質量分析（Ｗｅｉ、Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．３９９：２４３‐２４６
、１９９９）によって解析する。この方法は、解析物のフェントモルおよびアト
モルのレベルに感受性である。サンプルをこの論文において記載されるように調
製する。本質的に、解析物を、典型的に０．００１〜１０．０μＭにわたる濃度
で脱イオン水／メタノール混合液（１：１）中に溶解する。溶液のアリコート（
少なくとも０．５〜１．０μＬ、少なくとも０．５フェントモル〜１００ピコモ
ル解析物に対応する）を多孔性の表面に析出させ、そして質量分析解析の前に乾
燥させる。これらの実験を、３３７ｎｍで操作されるパルス化窒素レーザー（Ｌ
ａｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ-ＳＴＲ、ｔｉｍ
ｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ質量分析器（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）において行う。一旦形成されると、イオンは、２０ｋＶの電圧を伴ってｔ
ｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ質量分析器に加速される。他の液体クロマトグラフ
ィー‐質量分析（ＬＣ-ＭＳ）装置がまた、解析のために使用され得る（Ｎｉｅ
ｓｓｅｎ Ｗ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ Ａ ７９４：（４０７‐４３５、
１９９８）。
【０２８６】 バックグラウンドよりも高いレベルで２つの変異体プローブを含有する反応の
いずれかから放出されたヌクレオチドの観察は、アッセイされたゲノムＤＮＡサ
ンプルにおける少なくとも１つの変異体プロトロンビンまたは第Ｖ因子Ｌｅｉｄ
ｅｎ対立遺伝子の存在を示す。 10861 5' TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA 3' 配列番号４２ 9828 5' TGTTATCACACTGGTGCTAA 3' 配列番号４３ PT5 5' ATAGCACTGGGAGCATTGAGGC 3' 配列番号４０ PT6 5' GCACAGACGGCTGTTCTCTT 3' 配列番号４１ 11265 5' GTGATTCTCAGCA 3' 配列番号４４ 11432 5' GACAAAATACCTGTATTCCTTG 3' 配列番号４７ 実施例８：蛍光標識を使用する多重調査 本実施例は、本発明のプロセスによって、それぞれ目的の標的核酸にハイブリ
ダイズされる、多重プローブの３'−末端から放出されるヌクレオチドが、質量
分析によって、または蛍光定量的なＨＰＬＣによって検出され得、それによって
核酸サンプルにおける標的核酸の、または標的の疑問の部位での特異的な塩基の
、存在もしくは不在の証拠を提供し得ることを実証する。
【０２８７】 各疑問のプローブを、標識が脱重合化酵素がプローブからヌクレオチドを除去
する能力を妨げないような様式において、３'‐末端ヌクレオチドに付着される
、異なる蛍光標識を有するように設計する。フルオレセインまたはローダミンの
ようなこのような蛍光タグは、少なくとも６つの炭素のリンカー（Ｇｌｅｎ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ）を用いてホスホラミダイトヌクレオチドに付着される蛍光分子
とともに、合成の間にプローブに取り込まれ得る。
【０２８８】 プロトロンビン遺伝子をコードする約５００塩基対にわたるヒトゲノムＤＮＡ
の領域をＰＣＲ増幅するために、プローブＰＴ５（配列番号４０）およびＰＴ６
（配列番号４１）を使用する。第Ｖ因子遺伝子をコードする約３００塩基対にわ
たるヒトゲノムＤＮＡの領域をＰＣＲ増幅するために、プローブ１０８６１（配
列番号４２）および９８２８（配列番号４３）を使用する。これらのプローブ及
びＰＣＲ反応条件は実施例６に詳細にのべられているＰＣＲ産物をＴ７遺伝子６
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＵＳＢ Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理し、そして実施
例６において記載されるように遊離ヌクレオチドから分離した。
【０２８９】 プロトロンビンの疑問のプローブは、変異体プロトロンビン配列のセグメント
に全体的に相補的である１１２６５（配列番号４４）、および野生型プロトロン
ビン倍列のセグメントに全体的に相補的である１１２６６（配列番号４５）は、
である。これらのプローブのそれぞれは、３'末端から８塩基の不安定化する変
異を有する。また、これらのプローブのぞれぞれは、３'末端のヌクレオチドの
位置で蛍光ヌクレオチドアナログを用いて合成される。プロトロンビンプローブ
は、フルオレセインでタグされ；第Ｖ因子プローブは、ローダミンでタグされる
。
【０２９０】 精製されたＰＣＲ産物を、両方の野生型プローブまたは両方の変異体プローブ
のいずれかを用いて、別々の反応において疑問にする。疑問の反応を以下のよう
にアセンブリする： ４０μＬ ２つのそれぞれのＰＣＲ産物 １．５ｎｍｏｌ 野生型のそれぞれの、または変異体のそれぞれの、標識され
た疑問のオリゴ 水を、１００μＬの最終容量に添加する。
【０２９１】 反応を、９５℃で３分間、次いで３７℃で１５分間インキュベートする。次い
で反応を２０μＬの最終容量に凍結乾燥する。 次いで、２０μＬのマスターミックスを添加する。Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−を
含有するマスターミックスの組成は、ＡＤＰおよびＮＤＰＫがないこと以外は実
施例４において記載される。次いで、反応を３７℃で１５分間進行する。
【０２９２】 次いで、溶液を半分に分け、そして２つの異なる方法を使用して解析する。一
方の方法において、溶液における放出されたヌクレオチドの存在または不在をシ
リコン脱着イオン化質量分光法（Ｗｅｉ、Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．３９９：２４
３‐２４６、１９９９）によって解析する。この方法は、解析物のフェントモル
およびアトモルのレベルに感受性である。サンプルをこの論文において記載され
るように分光測定のために調製する。本質的に、解析物は、典型的に０．００１
〜１０．０μＭにわたる濃度で脱イオン水／メタノール混合物（１：１）中に溶
解される。溶液のアリコート（少なくとも０．５〜１．０μＬ、少なくとも０．
５フェントモル〜１００ピコモル解析物に対応する）を多孔性の表面に析出させ
、そして質量分析解析の前に乾燥させる。
【０２９３】 これらの研究を、３３７ｎｍで操作されるパルスされた窒素レーザー（Ｌａｓ
ｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ-ＳＴＲ、ｔｉｍｅ−
ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ質量分析器（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）において行う。一旦形成されると、イオンは、２０ｋＶの電圧を伴ってｔｉｍ
ｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ質量解析器に加速される。他の液体クロマトグラフィー
‐質量分析（ＬＣ-ＭＳ）装置がまた、解析のために使用され得る（Ｎｉｅｓｓ
ｅｎ Ｗ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ Ａ ７９４：（４０７‐４３５、１９
９８）。
【０２９４】 第２の方法において、溶液における放出されたヌクレオチドの存在または不在
が、Ｊａｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２
００：１２３９‐１２４４、１９９４またはＬｅｖｉｔｔ、Ｂ．ら、Ａｎａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍ １３７：９３‐１００、１９８４において記載されるように蛍
光検出器を使用するＨＰＬＣによって解析される。
【０２９５】 バックグラウンド（酵素を含まないコントロール反応）よりも高いレベルで、
変異体プローブを含有する反応から放出されるヌクレオチドの観察は、アッセイ
されたゲノムＤＮＡサンプルにおける少なくとも１つの変異体プロトロンビンま
たは第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ対立遺伝子の存在の指標である。バックグラウンドよ
りも高いレベルで、野生型プローブを含有する反応から放出されたヌクレオチド
の観察は、アッセイされたゲノムＤＮＡサンプルにおける少なくとも１つの野生
型プロトロンビンまたは第Ｖ因子対立遺伝子の存在の指標である。 PT5 5' ATAGCACTGGGAGCATTGAGGC 3' 配列番号４０ PT6 5' GCACAGACGGCTGTTCTCTT 3' 配列番号４１ 10861 5' TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA 3' 配列番号４２ 9828 5' TGTTATCACACTGGTGCTAA 3' 配列番号４３ 実施例９：種々の動物に特異的なミトコンドリアＤＮＡの特定‐検出 本実施例において、チトクロームＢ遺伝子のセグメントを含有するミトコンド
リアＤＮＡのセグメントを、ＰＣＲプライマー１１５９０（配列番号４８）およ
び１１５８９（配列番号４９）（ＰＮＡＳ ８６：６１９６‐６２００）を使用
して、多様な動物種から増幅した。これらのＰＣＲプライマーを、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ、ｐＨ７．５に、０．２２μｇ／μＬの最終濃度に希釈した。使用したゲ
ノムＤＮＡは、ウシ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、６８５０‐１）、トリ（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ、６８５２‐１）、イヌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、６９５０‐１）、およびヒト
（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１５２１）であった。
【０２９６】 ＰＣＲ反応を、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有する５μＬの１０×緩衝液（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ、Ｍ１８８Ｊ）、１μＬのｄＮＴＰ １０ｍＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃ
１４４Ｇ）、２μＬのプライマー１１５９０、２μＬのプライマー１１５８９、
０．５μＬのＴａｑポリメラーゼ ５Ｕ／μＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ１８６Ｅ）
、および３８．５μＬの水を含むようにアセンブリした。次いで、各チューブに
１μＬ（１００ｎｇ）のゲノムＤＮＡを添加した。ＰＣＲのサイクリングパラメ
ーターは（１５秒間、９４℃；１５秒間、５５℃；３０秒間、７２℃）×３０で
あった。ＰＣＲ産物の大きさを、アガロースゲルにおいてアリコートを泳動し、
そして臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色で可視化することによって確認した。次
いで、ＰＣＲ産物を遊離ヌクレオチド（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ７１７０）から分離
し、そしてアリコートを、アガロースゲル上で泳動した。全てのサンプルは、同
じ大きさのＰＣＲ産物を生成した。
【０２９７】 次いで、各ＰＣＲ ＤＮＡを、これが種特異的プローブを用いて特異的に同定
され得るか否かを決定するためのアッセイにおいて使用した。１μＬの疑問のプ
ローブ（１μｇ／μＬ）および１７μＬの水を２μＬの適切なＰＣＲ産物と共に
あわせ、そして９１℃で３分間加熱し、次いで室温に１５分間冷却した。２０μ
Ｌのマスターミックス（下記される）を各チューブに添加し、そしてそれぞれを
さらに、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、４μＬの溶液を１００
μＬ Ｌ/Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆ１２０Ｂ）に添加し、そして相対的な光
出力結果（ｒｌｕ）を、Ｔｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメータ
ーにおいて測定した。２つの反応からのｒｌｕの平均値を、ＤＮＡバックグラウ
ンド値から減算し、標準偏差値とともに以下に列挙される。
【０２９８】 マスターミックス： ３１２μＬ １０×ＤＮＡ ｐｏｌ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ１９５Ａ） ３９μＬ ＮａＰＰｉ ４０ｍＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ３５０Ｂ） ３９μＬ Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ１２８Ｂ） １５．６μＬ ＮＤＰＫ １Ｕ／μＬ ３１．２μＬ ＡＤＰ １０μＭ（Ｓｉｇｍａ） １１２３μＬ 水（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＡＡ３９９）
【０２９９】
【表１７】 データは、プライマーがミトコンドリアＰＣＲ産物を検出することを実証する
。ヒト特異的プローブ１１５７６（配列番号５０）および１１５８３（配列番号
５１）の両方が、ヒトミトコンドリアＤＮＡに特異的であることが示された。共
通のプローブの、１１５８２（配列番号５２）は、全ての種を検出したが、トリ
ＤＮＡではあまり効果的でなかった。トリ特異的プローブの１１５７７（配列番
号５３）は、トリミトコンドリアＤＮＡに特異的であったが、他のトリ特異的プ
ローブの１１５８４（配列番号５４）は、イヌ以外の全ての種を検出した。ウシ
特異的プローブの１１５８８（配列番号５５）は、ウシＤＮＡについて最も良好
な検出シグナルを与えたが、他の種もまた検出した。イヌ特異的プローブの１１
５８６（配列番号５６）は、イヌおよびウシＤＮＡのみでアッセイしたが、ウシ
ＤＮＡよりもイヌＤＮＡを良好に検出した。より清浄なＰＣＲ産物は、バックグ
ラウンドがより少ないＤＮＡを提供する。 11590 zooamp2 5' AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA 3' 配列番号４８ 11589 zooamp1 5' AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA 3' 配列番号４９ 11576 huzoo1 5' CCAGACGCCTCA 3' 配列番号５０ 11583 huzoo2 5' ACCTTCACGCCA 3' 配列番号５１ 11582 comzoo 5' TGCCGAGACGT 3' 配列番号５２ 11577 chzoo1 5' GCAGACACATCC 3' 配列番号５３ 11584 chzoo2 5' GGAATCTCCACG 3' 配列番号５４ 11588 cozoo2 5' ACATACACGCAA 3' 配列番号５５ 11586 dozoo2 5' ATATGCACGCAA 3' 配列番号５６ 実施例１０：自己アニーリングする疑問のプローブ 本実施例は、本発明の疑問の技術においてヘアピン構造を形成するために用い
られる、異なるタイプのオリゴヌクレオチドプローブの使用を説明する。本研究
は、疑問の反応に疑問の部位に特異的なプローブを添加する必要性を排除するた
めの方法を実証する。
【０３００】 本実施例で、オリゴヌクレオチドプローブは標的鎖における疑問の位置の下流
（これに対して３'）の標的鎖にアニールする。オリゴヌクレオチドは、その５'
末端にアニールしない領域のヌクレオチド、続いて標的鎖における疑問の領域に
同一である約５〜約２０ヌクレオチドを有する。アニールされた３'末端のオリ
ゴヌクレオチドは、次いで、標的鎖の疑問の位置を介して伸長されて、伸長され
たプローブといわれるものを作製する。ハイブリッドは変性され、そしてヘアピ
ン構造が、伸長されたプローブ鎖とオリゴヌクレオチドプローブの５'末端との
間で形成される。次いで、この領域はミスマッチが存在するか否かを決定するた
めに、標準的な疑問の反応においてアッセイされる。
【０３０１】
【化１】 ４つのプローブを、伸長されたプローブ鎖を推定し得るヘアピン構造の異なる
タイプを示すように設計した、これらのプローブは、１０２０７（配列番号５７
）、１０２０８（配列番号５８）、１０２０９（配列番号５９）、および１０２
１２（配列番号６０）である。
【０３０２】 これらのプローブは、自己アニールさせられる場合、以下の自己ハイブリダイ
ズされる二次構造を形成することが予測される： ４つのプローブのそれぞれの５μＬ（５μｇ）アリコートを、ナノピュア水で
１００μＬに希釈した。次いで、これらを１：１０〜１：１００,０００の最終
的な希釈率に希釈した。２０μＬの希釈されたプローブを、別々のチューブにお
いて、９５℃で３分間加熱し、そして室温で１０分間冷却して、自己アニーリン
グを許容した。以下のマスターミックスをアセンブリし、そして混合した。
【０３０３】
【表１８】 次いで、２０μＬの上述のマスターミックスを、各チューブに添加し、そして
チューブを３７℃で１５分間インキュベートした。１０μＬの溶液を１００μＬ
のＬ/Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆ２０２Ａ）に添加して、そして相対的な光単
位をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターで即座に測定した
。プローブなしのコントロールは、５７．２４の相対的な光単位を生じ、そして
残りのプローブの結果は、以下に相対的な光単位（ｒｌｕ）として報告される。
【０３０４】
【表１９】 プローブ１０２０７は、予測されるように疑問について効果的な標的として作
用し、プローブ１０２０８は、予期されたネガティブな結果を提供した。プロー
ブ１０２１２は、３塩基のマッチのみを有し、そのため伸長されないかもしれず
、従って低い値が得られる。プローブ１０２０９は、ヘアピンが３'末端から３
番目のヌクレオチドでのミスマッチに起因して形成される場合、アニールされな
い３'末端ヌクレオチドを有するようである。このようなアニールされない３'末
端ヌクレオチドは、低いｒｌｕ値を説明する。 10207 5' ATGAACGTACGTCGGATGAGCACGTTCAT 3' 配列番号５７ 10208 5' GTGAACGTACGTCGGATGAGCACGTTCAT 3' 配列番号５８ 10209 5' ATAAACGTACGTCGGATGAGCACGTTCAT 3' 配列番号５９ 10212 5' ATAAACGTACGTCGGATGAGCACG 3' 配列番号６０ 実施例１１：自己アニーリングプライマーIIを用いる疑問 本実施例および図２は、本発明のプロセスにおける異なるタイプのオリゴヌク
レオチドプローブ、「ＲＥＡＰＥＲ（商標）」プローブの使用を説明する。本実
施例は、疑問の反応に疑問の部位に特異的なプローブを添加する必要性を排除す
るための方法を実証する。
【０３０５】 本実施例で、オリゴヌクレオチドの第１のプローブ（配列番号６２）は、その
３'−末端で、標的鎖における問題の位置の下流（これに対して３'）の位置にて
、標的鎖（配列番号６１）にアニールする（図２Ａ）。プローブは、疑問の位置
を含む標的鎖における領域に同一であるその約５〜約２０ヌクレオチドを含む、
５'−末端でアニールされないヌクレオチドの領域を有する。同一性のこの領域
は、標的鎖およびプローブ鎖の両方において、同じ方向に存在する。
【０３０６】 次いで、プローブのアニールされた３'‐末端は、標的鎖の疑問の位置を介し
て伸長され、図２Ｂにおいて説明されるような（配列番号６３）、第１の伸長さ
れたプローブおよび伸長された第１のハイブリッドといわれるものを形成する。
伸長されたフ第１のハイブリッドは変性され、そして第２のプローブ（配列番号
６４）が第１の伸長されたプローブにハイブリダイズして、第２のハイブリッド
を形成する。この第２のプローブは第１の位置の伸長されたプローブ鎖において
疑問の位置の下流の領域で第１の伸長されたプローブ鎖に相補的である（図２Ｃ
）。
【０３０７】 次いで、第２のプローブは伸長され、そして第２の伸長されたハイブリッドが
、図２Ｄにおいて説明されるように形成される。第２の伸長されたハイブリッド
は、第１の伸長されたプローブおよび第２の伸長されたプローブ（配列番号６５
）から構成される。
【０３０８】 第２の伸長されたハイブリッドの鎖は変性され、そしてヘアピン構造を形成す
るように再生することを許容される。ヘアピン形成の際に、第１の伸長されたプ
ローブは、３'オーバーハングを有するヘアピン構造を形成し、一方、第２の伸
長されたプローブは、脱重合化についての基質を提供する５'オーバーハングを
含むヘアピン構造を形成する。次いで、第２の伸長されたプローブ鎖は脱重合化
され、そして解析的な出力結果が本明細書中の他の場所において記載されるよう
に得られる。解析的な出力結果は、本明細書中他の場所でまた考察されるように
、元来の標的鎖の、または元来の標的鎖における特定の塩基の、存在または不在
を決定する。
【０３０９】 配列番号６１オリゴヌクレオチドを、水中で１ｍｇ／ｍＬに希釈する。この溶
液を、２８６とラベルする。配列番号６２オリゴヌクレオチドを、水中で１ｍｇ
／ｍＬに希釈し、そしてこの溶液を２８７とラベルする。１μＬの各溶液２８６
および２８７を１８μＬの水と合わせる。溶液を、９５℃に５分間加熱し、次い
で、室温で１０分間冷却して、配列番号６１および６２がアニールすることを許
容する。
【０３１０】 この溶液に、各ｄＮＴＰについて０．２５ｍＭの最終濃度にｄＮＴＰ混合物を
、１×の最終濃度に１０×Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液を、および５単位のＫｌｅｎｏｗ
酵素を添加する。これらの成分を有するチューブを３７℃で３０分間インキュベ
ートする。このように形成された伸長された第１ハイブリッドＤＮＡ（配列番号
６３を含む）を精製し（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）、そし
て５０μｌの水に溶出した。
【０３１１】 精製された伸長された第１のハイブリッドの溶液に、１μｌの配列番号６４オ
リゴヌクレオチド（１ｍｇ/ｍＬ）を第２のプローブとして添加する。次いで、
溶液を９５℃に５分間加熱し、そして室温で冷却して、図２Ｃにおいて説明され
るように、２８９および２８８がアニーリングすることを許容して、第２のハイ
ブリッドを形成する。この溶液に、各ｄＮＴＰについて０．２５ｍＭの最終濃度
にｄＮＴＰ混合物を、１×の最終濃度に１０×Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液を、および５
単位のＫｌｅｎｏｗ酵素を添加する。これらの成分を有するチューブを３７℃で
３０分間インキュベートして、第２の伸長されたプローブ（オリゴヌクレオチド
配列番号６５）を含有する第２の伸長されたハイブリッドを形成する。
【０３１２】 形成された配列番号６５／６３の第２の伸長されたハイブリッドＤＮＡ（図２
Ｄ）を精製して（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍｅｒｍａｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）、未反応のｄ
ＮＴＰから伸長されたハイブリッドを分離し、そして５０μｌの水に溶出する。
（あるいは、元来の２８７オリゴをその５'‐末端でビオチン処理し、次いでこ
のビオチンはまた、配列番号６３の鎖に存在する。このビオチン処理された鎖２
８８を鎖２９０から変性し、製造業者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｚ５４８１）に
従ってストレプトアビジンでコートされた磁性粒子を用いて溶液から除去し、そ
して２９０ヘアピン構造を以下のように形成させる）。
【０３１３】 次いで、このハイブリッド溶液を９５℃に５分間加熱し、水で１００μｌに希
釈し、そして氷上で１０分間冷却して、ヘアピン構造形成を許容する。 マスターミックスを以下の表に従ってアセンブリし、そして混合する。
【０３１４】
【表２０】 ２０μｌのこのマスターミックスを、冷却後、２０μＬの上述のヘアピンを含
有する溶液に添加し、そして得られる混合物を３７℃で１５分間加熱する。この
インキュベーション後、溶液の２連の４μＬのサンプルを取り出し、１００μＬ
のＬ/Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆ２０２Ａ）に添加し、そして反応によって生
成される光を、Ｔｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターを使用
して即座に測定する。バックグラウンド（酵素なし）を上回るレベルでのポジテ
ィブな解析的な出力結果は、マッチされた塩基が、ヘアピン構造の３'末端に存
在したことを示し、そしてこれはさらに標的鎖の存在を示し、そしてこの特定の
実施例について、これはまた、標的の疑問の位置でのＧ塩基の存在を示す。 5'CCCGGAGAGACCTCCTTAAGGGGCCATATTATTTCGTCGATTCCAGTGTTGGCCAAACGGAT 3' 配
列番号６１ 5' GGGGCCATATTATTTCGCCGTTTGGCCAACACTGGAATCGA 3' 配列番号６２ 5'GGGGCCATATTATTTCGCCGTTTGGCCAACACTGGAATCGACGAAATAATATGGCCCCTTAAGGAGGTCT
CTCCGGG 3' 配列番号６３ 5' CCCGGAGAGACCTCCT 3' 配列番号６４ 5'CCCGGAGAGACCTCCTTAAGGGGCCATATTATTTCGTCGATTCCAGTGTTGGCCAAACGGCGAAATAATA
TGGCCCC 3' 配列番号６５ 上述から、多数の改変および変化が、本発明の真の精神および範囲から逸脱す
ることなく達成され得ることが観察される。示される特定の実施例に関する制限
は何も意図されず、また解釈されるべきでないことが理解される。開示は、請求
の範囲内にあるので、添付される請求の範囲の修正を含むことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の開示の一部を形成する図面において、図１は、図１Ａおよび図１Ｂと
してそれぞれ、回転するサイクルの増幅において利用された、１０８７０野生型
オリゴヌクレオチド（配列番号８３）および１０９９４変異体オリゴヌクレオチ
ド（配列番号８４）への、１０８６５オリゴヌクレオチド（配列番号８２）のア
ニーリングを説明する。また、それぞれ増幅された配列へのそれらのプローブの
結合の代表として、オリゴヌクレオチド１０８６５へのオリゴヌクレオチド１０
８６６のアニーリング（ハイブリダイゼーション）、ならびにオリゴヌクレオチ
ド１０８７０へのオリゴヌクレオチドプローブ１０８６９（配列番号８５）のハ
イブリダイゼーション、およびオリゴヌクレオチド１０９９４へのオリゴヌクレ
オチドプローブ１０９８９（配列番号８６）のハイブリダイゼーションが示され
る。オリゴヌクレオチド１０８６５における弓状の線は、オリゴヌクレオチド１
０８６５がオリゴヌクレオチド１０８７０または１０９９４のいずれかとハイブ
リダイズし得る場合に推定され得る形状を説明することを補助するために使用さ
れる。
【図２】 図２は、実施例８９において説明されるようにＲｅａｐｅｒ（商標）アッセイ
を説明する。図２Ａは、第１のプローブ配列番号６２（６２）への核酸標的配列
番号６１（６１）のアニーリングによって形成される第１のハイブリッドを説明
する。矢印は、２８６における疑問の位置を指す。 図２Ｂは、伸長された６２への６１のアニーリングにより形成される第１の伸
長されたハイブリッドを説明する。伸長された２８７は第１の伸長されたプロー
ブ配列番号６３(６３)である。 図２Ｃは、配列番号６４(６４)で示される第２のプローブへの図２Ｂにおいて
示される変性された核酸分子からの６３のアニーリングによって形成される第２
のハイブリッドを説明する。矢印は、６３における疑問の位置を指す。 図２Ｄは、６３と、配列番号６５（６５）で示される伸長された６４鎖のアニ
ーリングによって形成される、伸長された第２ハイブリッドを説明する。 図２Ｅは、図２Ｄから変性され、ヘアピン構造を形成する６５鎖を説明する。
矢印は、ハイブリッドの３'−末端での疑問の位置を指す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ０９／３５８，９７２ (32)優先日 平成11年７月27日(1999．7．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４０６，０６４ (32)優先日 平成11年９月27日(1999．9．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＭ，ＥＥ，Ｇ Ｄ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＡ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ (72)発明者 ローズ，リチャード・ビー アメリカ合衆国ウィスコンシン州53703， マディソン，ウエスト・ウィルソン・スト リート 444，ナンバー207 (72)発明者 シュルツ，ジョン・ダブリュー アメリカ合衆国ウィスコンシン州53593， ヴェローナ，メロディ・レイン 407 (72)発明者 ライペ，ドナ アメリカ合衆国ウィスコンシン州53562， ミドルトン，プレザント・ビュー・ロード 1110，ナンバー103 (72)発明者 マンドレカー，ミッシェル アメリカ合衆国ウィスコンシン州53575， オレゴン，アシュ・ストリート 525 (72)発明者 アンドリュース，クリスティーン・アン アメリカ合衆国ウィスコンシン州53527， カティッジ・グローヴ，ウィスパリング・ ウェイ 800 (72)発明者 ハートネット，ジェームズ・アール アメリカ合衆国ウィスコンシン州53719， マディソン，チェサピーク・ドライブ 2590 (72)発明者 グ，トレント アメリカ合衆国ウィスコンシン州53715， マディソン，ノース・ウィングラ・ドライ ブ 1329 (72)発明者 オルソン，ライアン・ジェイ アメリカ合衆国ウィスコンシン州53705， マディソン，ノース・アレン・ストリート 340，ナンバー ８ (72)発明者 ウッド，キース・ヴイ アメリカ合衆国ウィスコンシン州53711― 5399，マディソン，コットケ・ドライブ 902，ナンバー ５ (72)発明者 ウェルチ，ロイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94306， パロ・アルト，マグノリア・ドライブ 3868 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA35 CA25 CB01 CB03 CB07 CB08 CB14 CB21 CB30 DA12 DA13 DA14 FB02 FB06 FB07 FB12 FB13 GC10 GC15 JA20 4B024 AA11 CA04 CA09 GA30 HA14 4B050 CC07 DD02 KK01 KK11 KK13 LL03 4B063 QA01 QA13 QQ42 QR07 QR08 QR32 QR55 QR62 QS02 QS25 QS34 QS36 QX02 QX04

Claims (102)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸サンプルにおいて複数のあらかじめ決定された核酸標的
    配列の存在または不在を決定するための方法であって、以下の工程： （Ａ）それらのそれぞれの核酸プローブとハイブリダイズされる該複数のあらか
    じめ決定された核酸標的配列を含み得る処理されたサンプルを提供する工程であ
    って、該プローブはそれぞれ、３'‐末端領域においてアイデンティファイアー
    ヌクレオチドを含む工程； （Ｂ）処理されたサンプルと、その活性がハイブリダイズされた核酸プローブの
    ３'‐末端から１つ以上のヌクレオチドを放出する、脱重合化する量の酵素とを
    、混合して、処理された反応混合物を形成する工程； （Ｃ）酵素が、ハイブリダイズされた核酸を脱重合し、そしてアイデンティファ
    イアーヌクレオチドをそこから放出することを許容するのに十分な期間、処理さ
    れた反応混合物を維持する工程；および （Ｄ）放出されたアイデンティファイアーヌクレオチドの存在について解析し、
    解析的な出力結果を得る工程であって、解析的な出力結果は、該核酸標的配列の
    存在または不在を示す、工程を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記解析的な出力結果が発光分光法によって得られる、請求
    項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記解析的な出力結果が蛍光分光法によって得られる、請求
    項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記解析的な出力結果が質量分析法によって得られる、請求
    項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記解析的な出力結果が吸光度分光法によって得られる、請
    求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記あらかじめ決定された核酸標的配列が血液凝固と関連さ
    れる、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記核酸プローブが複数の以下の配列： 5' CTGCTGCCCTCTGTATTCCTCG 3' 配列番号１４； 5' CTGCTGCCCTCTGTATTCCTTG 3' 配列番号１５； 5' GTGACTCTCAGCG 3' 配列番号８７； 5' GTGACTCTCAGCA 3' 配列番号８８； 5' GTGATTCTCAGCG 3' 配列番号８９； 5' GTGATTCTCAGCA 3' 配列番号９０； 5' GACAAAATACCTGTATTCCTCG 3' 配列番号９１； 5' GACAAAATACCTGTATTCCTTG 3' 配列番号９２； 5' GGAGCATTGAGGCTCG 3' 配列番号９３； 5' GGAGCATTGAGGCTTG 3' 配列番号９４； 5' GACAAAATACCTGTATTCCTTG 3' 配列番号４７； 5' GTGATTCTCAGCA 3' 配列番号４４； 5' GTGATTCTCAGCG 3' 配列番号４５；および 5' GACAAAATACCTGTATTCCTCG 3' 配列番号４６ を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記あらかじめ決定された核酸標的配列が特定化のために有
    用である、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記核酸プローブが、複数の以下の配列： 5' CCAGACGCCTCA 3' 配列番号５０； 5' ACCTTCACGCCA 3' 配列番号５１； 5' TGCCGAGACGT 3' 配列番号５２； 5' GCAGACACATCC 3' 配列番号５３； 5' GGAATCTCCACG 3' 配列番号５４； 5' ACATACACGCAA 3' 配列番号５５；および 5' ATATGCACGCAA 3' 配列番号５６ を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記あらかじめ決定された核酸標的配列が先天的な副腎過
    形成と関連される、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記核酸プローブが、複数の以下の配列： 5' CGGAGCCTCCACCTCCCG 配列番号２３； 5' CACCCTCCAGCCCCCAGC 3' 配列番号２４； 5' CGGAGCCTCCACCTCCTG 3' 配列番号２５； 5' CCTCACCTGCAGCATCAAC 3' 配列番号２６； 5' CACCCTCCAGCCCCCAAC 3' 配列番号２７； 5' CCTCACCTGCAGCATCATC 3' 配列番号２８； 5' CCTGGAAGGGCACTT 3' 配列番号２９； 5' CCTGGAAGGGCACGT 3' 配列番号３０； 5' GATTCAGCAGCGACTGTA 3' 配列番号３１； 5' GATTCAGCAGCGACTGCA 3' 配列番号３２； 5' CGAGGTGCTGCGCCTGCG 3' 配列番号３３； 5'CGAGGTGCTGCGCCTGTG 3' 配列番号３４； 5'GGGATCACATCGTGGAGATG 3' 配列番号３５；および 5'GGGATCACAACGAGGAGAAG 3' 配列番号３６ を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 以下 （ａ）複数の核酸プローブと、アッセイされるサンプルとを混合してハイブリダ
    イゼーション組成物を形成する工程であって、ここで該核酸プローブのそれぞれ
    の３'‐末端領域が、（ｉ）該核酸標的配列に、その配列がサンプル中に存在す
    る場合、部分的なまたは全体的な相補性を伴ってハイブリダイズし、および（ｉ
    ｉ）アイデンティファイアーヌクレオチドを含む、工程； （ｂ）それらのそれぞれの核酸プローブとハイブリダイズされる該あらかじめ決
    定された核酸標的配列を含み得る処理されたサンプルを形成するのに十分な時間
    、該ハイブリダイゼーション組成物を維持する工程によって、該処理されたサン
    プルを形成する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 核酸サンプルが生物学的サンプルから得られる、請求項１
    に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 あらかじめ決定された核酸標的配列が、微生物またはウイ
    ルスの核酸である、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 核酸サンプルにおいて複数のあらかじめ決定された核酸標
    的配列の存在または不在を決定するための方法であって、以下の工程： （Ａ）アッセイされるサンプルと、複数の核酸プローブとを混合して、ハイブリ
    ダイゼーション組成物を形成する工程であって、ここで該核酸プローブのそれぞ
    れの３'‐末端領域が、（ｉ）少なくとも１つの該あらかじめ決定されている核
    酸標的配列に、その配列がサンプル中に存在する場合、部分的なまたは全体的な
    相補性を伴ってハイブリダイズし、および（ｉｉ）アイデンティファイアーヌク
    レオチドを含む、工程； （Ｂ）核酸プローブとハイブリダイズされる該あらかじめ決定された核酸標的配
    列を含み得る処理されたサンプルを形成するのに十分な時間、該ハイブリダイゼ
    ーション組成物を維持する工程； （Ｃ）処理されたサンプルと、その活性がハイブリダイズされた核酸プローブの
    ３'‐末端から１つ以上のヌクレオチドを放出する、脱重合化する量の酵素とを
    、混合して、処理された反応混合物を形成する工程； （Ｄ）酵素が、ハイブリダイズされた核酸を脱重合し、そしてアイデンティファ
    イアーヌクレオチドをそこから放出することを許容するのに十分な期間、処理さ
    れた反応混合物を維持する工程；ならびに （Ｅ）放出されたアイデンティファイアーヌクレオチドの存在について解析し、
    解析的な出力結果を得る工程であって、解析的な出力結果は、該複数の核酸標的
    配列の少なくとも１つの存在または不在を示す、工程を包含する、方法。
  16. 【請求項１６】 前記解析的な出力結果が発光分光法によって得られる、請
    求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記解析的な出力結果が蛍光分光法によって得られる、請
    求項１５に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記解析的な出力結果が、質量分析法によって得られる、
    請求項１５に記載の。
  19. 【請求項１９】 前記解析的な出力結果が、吸光度分光法によって得られる
    、請求項１５に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記核酸プローブの１つが、1つの標的核酸配列に部分的
    な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られる解析的な出力結果が、全
    ての核酸配列プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列に全体的な相補性を伴
    ってハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも大きい、請求項１５に記
    載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記核酸プローブの１つが、１つの標的核酸配列に部分的
    な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られる解析的な出力結果が、全
    ての核酸配列プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列に全体的な相補性を伴
    ってハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも小さい、請求項１５に記
    載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記核酸プローブの１つが、１つの核酸標的配列に全体的
    な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られる解析的な出力結果が、全
    ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列に部分的な相補性を伴って
    ハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも大きい、請求項１５に記載の
    方法。
  23. 【請求項２３】 前記核酸プローブの１つが、１つの標的核酸配列に全体的
    な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られる解析的な出力結果が、全
    ての配列核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列に部分的な相補性を伴
    ってハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも小さい、請求項１５に記
    載の方法。
  24. 【請求項２４】 その活性がヌクレオチドを放出することである前記酵素は
    、ピロリン酸イオンの存在下、３'‐末端領域における塩基が全体的な相補性を
    伴ってマッチされるハイブリダイズされた核酸を脱重合化する温度依存性のポリ
    メラーゼである、請求項１５に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 その活性がヌクレオチドを放出することである前記酵素が
    、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を示し、ハイブリダイズされたプローブの３
    '‐末端領域において１つ以上のミスマッチされる塩基を有するハイブリダイズ
    された核酸を脱重合化する、請求項１５に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記核酸プローブが、血液凝固と関連される核酸配列に相
    補的な配列を含む、請求項１５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 血液凝固と関連される前記核酸配列が、 （ａ）第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ変異の少なくとも１０個のヌクレオチドの配列；お
    よび （ｂ）プロトロンビンの少なくとも１０個のヌクレオチドの配列 を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 血液凝固と関連される前記核酸配列が、配列番号１４、配
    列番号１５、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列
    番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号４７、配列番
    号４４、配列番号４５、および配列番号４６からなる群より選択される、請求項
    ２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記核酸プローブが、嚢胞性線維症と関連される核酸配列
    に相補的な配列を含む、請求項１５に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記核酸プローブが、嚢胞性線維症ΔＦ５０８変異と関連
    される核酸配列に相補的な配列を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記核酸プローブが、配列番号９５または９６である、請
    求項２９に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 サンプルにおいて核酸標的配列中の特異的な塩基の存在ま
    たは不在を決定するための方法であって、以下の工程： （Ａ）アッセイされるサンプルと、複数の核酸プローブとを混合して、ハイブリ
    ダイゼーション組成物を形成する工程であって、ここで該核酸プローブの少なく
    とも１つの３'‐末端領域が、（ｉ）該核酸標的配列に、実質的に相補的であり
    および少なくとも１つのあらかじめ決定されたヌクレオチドを疑問の位置にて含
    み、ならびに（ｉｉ）アイデンティファイアーヌクレオチドを含み、そしてここ
    で該核酸標的配列がその存在または不在が決定された少なくとも１つの特異的な
    塩基を含む、工程； （Ｂ）処理されたサンプルを形成するのに十分な時間、該ハイブリダイゼーショ
    ン組成物を維持する工程であって、ここでプローブの該疑問の位置は、該標的配
    列において同定される該特異的な塩基と、存在する場合、アラインされ、それに
    よって塩基対が生じるヌクレオチドである、工程； （Ｃ）処理されたサンプルと、その活性がハイブリダイズされた核酸プローブの
    ３'‐末端から１つ以上のヌクレオチドを放出する酵素とを、混合して、ハイブ
    リッドを脱重合化し、そして処理された反応混合物を形成する、工程； （Ｄ）処理された反応混合物を、アイデンティファイアーヌクレオチドをそこか
    ら放出するのに十分な期間、維持する工程；ならびに （Ｅ）放出されたアイデンティファイアーヌクレオチドの存在または不在につい
    て解析し、同定される該特異的塩基の存在または不在を示す解析的な出力結果を
    得る工程、を包含する方法。
  33. 【請求項３３】 アイデンティファイアーヌクレオチドが疑問の位置にある
    、請求項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記解析的な出力結果が発光分光法によって得られる、請
    求項３２に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記解析的な出力結果が蛍光分光法によって得られる、請
    求項３２に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記解析的な出力結果が質量分析法によって得られる、請
    求項３２に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記核酸標的配列がデオキシリボ核酸およびリボ核酸から
    なる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 第１のプローブ、第２のプローブ、第３のプローブ、およ
    び第４のプローブをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記第１のプローブの前記疑問の位置が、デオキシアデノ
    シンまたはアデノシン残基である核酸残基を含み、前記第２のプローブの該疑問
    の位置が、デオキシチミジンまたはウリジン残基である核酸残基を含み、前記第
    ３のプローブの該疑問の位置がデオキシグアノシンまたはグアノシン残基である
    核酸残基を含み、および前記第４の核酸プローブがデオキシシトシンまたはシト
    シン残基である核酸残基を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記核酸プローブの１つが、１つの標的核酸配列に部分的
    な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られる解析的な出力結果が、全
    ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列に全体的な相補性を伴って
    ハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも大きい、請求項３２に記載の
    方法。
  41. 【請求項４１】 前記核酸プローブの１つが、１つの標的核酸配列に部分的
    な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られる解析的な出力結果が、全
    ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列に全体的な相補性を伴って
    ハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも小さい、請求項３２に記載の
    方法。
  42. 【請求項４２】 前記核酸プローブの１つが、１つの核酸標的配列に全体的
    な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られる解析的な出力結果が、全
    ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列に部分的な相補性を伴って
    ハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも大きい、請求項３２に記載の
    方法。
  43. 【請求項４３】 前記核酸プローブの１つが、１つの標的核酸配列に全体的
    な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られる解析的な出力結果が、全
    ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列に部分的な相補性を伴って
    ハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも小さい、請求項３２に記載の
    方法。
  44. 【請求項４４】 その活性がヌクレオチドを放出することである前記酵素は
    、ピロリン酸イオンの存在下、プローブの３'‐末端領域において塩基が全体的
    な相補性を伴ってマッチされるハイブリダイズされた核酸を脱重合化する温度依
    存性のポリメラーゼである、請求項３２に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 その活性がヌクレオチドを放出することである前記酵素が
    、３'から５'へのエキソヌクレアーゼ活性を示し、ハイブリダイズされたプロー
    ブの３'‐末端で１つ以上のミスマッチされる塩基を有するハイブリダイズされ
    た核酸を脱重合化する、請求項３２に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 複数の第１の核酸標的の存在または不在を、これらの標的
    を含むか、または複数の実質的に同一な第２の標的を含む核酸サンプルにおいて
    、決定するための方法であって、以下の工程： （Ａ）アッセイされる前記サンプルと、１つ以上の核酸プローブとを混合して、
    ハイブリダイゼーション組成物を形成する工程であって、ここで該第１および第
    ２の核酸標的が、あらかじめ決定された位置にて標的間で異なる少なくとも単一
    のヌクレオチド以外は配列同一性の領域を含み、そしてここで該核酸プローブが
    、（ｉ）配列同一性の該核酸標的領域に、実質的に相補的でありおよび少なくと
    も１つのヌクレオチドを疑問の位置にて含み、プローブの該疑問の位置は、標的
    とプローブとがハイブリダイズされる場合に標的の該あらかじめ決定された位置
    とアラインされ、ならびに（ｉｉ）３'‐末端領域においてアイデンティファイ
    アーヌクレオチドを含む、工程； （Ｂ）処理されたサンプルを形成するのに十分な時間、該ハイブリダイゼーショ
    ン組成物を維持する工程であって、ここで該プローブの該疑問の位置でのヌクレ
    オチドは該同一性の領域において該標的の該あらかじめ決定された位置にてヌク
    レオチドとアラインされる、工程； （Ｃ）処理されたサンプルと、その活性がハイブリダイズされた核酸プローブの
    ３'‐末端から１つ以上のヌクレオチドを放出することである酵素の脱重合化す
    る量とを、混合して、処理された反応混合物を形成する、工程； （Ｄ）処理された反応混合物を、アイデンティファイアーヌクレオチドを放出し
    、そして該ハイブリダイズされた核酸プローブを脱重合化するのに十分な期間、
    維持する工程；ならびに （Ｅ）放出されたアイデンティファイアーヌクレオチドの存在について解析し、
    解析的な出力結果を得る工程であって、該解析的な出力結果は、該あらかじめ決
    定された領域にて該ヌクレオチドの存在または不在、それによって第１および第
    ２の核酸標的の存在または不在を示す、工程、を包含する、方法。
  47. 【請求項４７】 前記解析的な出力結果が蛍光分光法によって得られる、請
    求項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記解析的な出力結果が質量分析法によって得られる、請
    求項４６に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記核酸標的配列が、デオキシリボ核酸およびリボ核酸か
    らなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記第１のプローブが、前記あらかじめ決定された位置で
    の第１の標的核酸に相補的である前記疑問の位置でのヌクレオチドを含み、およ
    び前記第２のプローブが、該あらかじめ決定された位置での第２の標的核酸に相
    補的である前記疑問の位置でのヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記核酸プローブの１つが、１つの標的核酸配列に部分的
    な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られる解析的な出力結果が、全
    ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列に全体的な相補性を伴って
    ハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも大きい、請求項４６に記載の
    方法。
  52. 【請求項５２】 前記核酸プローブの１つが、１つの標的核酸配列に部分的
    な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られる解析的な出力結果が、全
    ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列に全体的な相補性を伴って
    ハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも小さい、請求項４６に記載の
    方法。
  53. 【請求項５３】 前記核酸プローブの１つが、１つの核酸標的配列に全体的
    な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られる解析的な出力結果が、全
    ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列に部分的な相補性を伴って
    ハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも大きい、請求項４６に記載の
    方法。
  54. 【請求項５４】 前記核酸プローブの１つが、１つの標的核酸配列に全体的
    な相補性を伴ってハイブリダイズされる場合に得られる解析的な出力結果が、全
    ての核酸プローブがそれらのそれぞれの核酸標的配列に部分的な相補性を伴って
    ハイブリダイズする場合の解析的な出力結果よりも小さい、請求項４６に記載の
    方法。
  55. 【請求項５５】 その活性がヌクレオチドを放出することである前記酵素は
    、ピロリン酸イオンの存在下、３'‐末端領域において塩基が全体的な相補性を
    伴ってマッチされるハイブリダイズされた核酸を脱重合化する温度依存性のポリ
    メラーゼである、請求項４６に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 その活性がヌクレオチドを放出することである前記酵素が
    、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を示し、ハイブリダイズされたプローブの３
    '‐末端領域において１つ以上のミスマッチされる塩基を有するハイブリダイズ
    された核酸を脱重合化する、請求項４６に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 核酸サンプルにおいて複数のあらかじめ決定された核酸標
    的配列の存在または不在を決定するためのキットであって、以下： （Ａ）その活性がハイブリダイズされた核酸プローブの３'末端から１つ以上の
    ヌクレオチドを放出する、酵素；および （Ｂ）複数の核酸プローブであって、該核酸プローブのそれぞれが核酸標的配列
    に相補的である、プローブ、を含む、キット。
  58. 【請求項５８】 核酸サンプルにおいて複数のあらかじめ決定された核酸標
    的配列の存在または不在を決定するためのキットであって、以下： （Ａ）その活性がハイブリダイズされた核酸プローブからヌクレオシド三リン酸
    としてアイデンティファイアーヌクレオチドを放出する、酵素； （Ｂ）ピロリン酸； （Ｃ）複数の核酸プローブであって、該核酸プローブのそれぞれが該あらかじめ
    決定された核酸標的配列に相補的である、プローブ、を含む、キット。
  59. 【請求項５９】 前記核酸プローブが血液凝固と関連される核酸配列に相補
    的な配列を含む、請求項５８に記載のキット。
  60. 【請求項６０】 血液凝固と関連される前記核酸配列が、 （ａ）第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ変異の少なくとも１０個のヌクレオチドの配列；お
    よび （ｂ）プロトロンビンの少なくとも１０個のヌクレオチドの配列、を含む、請求
    項５９に記載のキット。
  61. 【請求項６１】 血液凝固に関連される前記核酸配列が、配列番号１４、配
    列番号１５、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列
    番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番
    号４４、配列番号４５、および配列番号４６からなる群より選択される、請求項
    ６０に記載のキット。
  62. 【請求項６２】 前記核酸プローブが、嚢胞性線維症と関連される核酸配列
    に相補的な配列を含む、請求項５８に記載のキット。
  63. 【請求項６３】 前記核酸プローブが、嚢胞性線維症ΔＦ５０８変異と関連
    される核酸配列に相補的な配列を含む、請求項６２に記載のキット。
  64. 【請求項６４】 前記核酸プローブが、配列番号９５または配列番号９６で
    ある、請求項６３に記載のキット。
  65. 【請求項６５】 核酸サンプルにおいて複数のあらかじめ決定された核酸標
    的配列の存在または不在を決定するためのキットであって、以下： （Ａ）その活性がハイブリダイズされた核酸プローブの３'末端から１つ以上の
    ヌクレオチドを放出する、酵素；および （Ｂ）使用のための指示、を含む、キット。
  66. 【請求項６６】 核酸サンプルにおいて複数のあらかじめ決定された核酸標
    的配列の存在または不在を決定するための組成物であって、以下： （Ａ）その活性がハイブリダイズされた核酸プローブの３'末端から１つ以上の
    ヌクレオチドを放出する、精製されおよび単離された酵素；ならびに （Ｂ）複数の核酸プローブであって、該核酸プローブのそれぞれが該あらかじめ
    決定された核酸標的配列に相補的である、プローブ、を含有する水溶液を含む、
    組成物。
  67. 【請求項６７】 核酸サンプルにおいて、それぞれが疑問の位置を含む複数
    の核酸標的配列の存在または不在を決定するための方法であって、以下の工程： （Ａ）それらのそれぞれの核酸プローブとハイブリダイズされる該核酸標的配列
    を含み得る核酸サンプルを含む処置されたサンプルを提供する工程であって、各
    プローブは、３つの部分、（ｉ）標的配列の該疑問の位置の約１〜約３０核酸下
    流で始まる位置にてその核酸標的配列に相補的であるプローブの３'−末端の約
    １０〜約３０ヌクレオチドを含む、第１の部分、（ｉｉ）約１０〜約２００核酸
    の長さの、および該核酸標的配列の同一な配列を有する５'末端領域、および（
    ｉｉｉ）該核酸サンプルに相補的でないゼロ〜約５０核酸を含む必要に応じた第
    ３の部分から構成される、工程、 （Ｂ）３'方向において該核酸プローブを伸長し、第２のハイブリッドとして核
    酸サンプルにハイブリダイズされる第２のプローブを形成する、工程； （Ｄ）該第２のハイブリッドを変性して該核酸標的配列から該第２のプローブを
    分離する、工程； （Ｅ）該水性組成物を再生して、該第２のプローブからヘアピン構造を形成する
    、工程； （Ｆ）ヘアピン構造を含有する組成物と、その活性が核酸ハイブリッドの３'−
    末端から１つ以上のヌクレオチドを放出する、脱重合化する量の酵素とを混合し
    て、処理された反応混合物を形成する、工程； （Ｇ）酵素が、ハイブリダイズされた核酸を脱重合し、そして１つ以上のヌクレ
    オチドをそこから３'−末端から放出することを許容するのに十分な期間、処理
    された反応混合物を維持する工程；ならびに （Ｈ）放出されたアイデンティファイアーヌクレオチドの存在について解析して
    、解析的な出力結果を得る工程であって、解析的な出力結果は、該核酸標的配列
    の存在または不在を示す、工程、を包含する、方法。
  68. 【請求項６８】 核酸サンプルにおいて、複数の核酸標的配列、または標的
    配列内の特異的な塩基の存在もしくは不在を決定するための方法であって、以下
    の工程： （Ａ）第１のハイブリッドとして、それらのそれぞれの第１の核酸プローブとハ
    イブリダイズされる複数の核酸標的配列を含み得る核酸サンプルを含む処置され
    たサンプルを提供する工程であって、該第１のプローブは、それぞれ、少なくと
    も２つの部分、標的の疑問の位置の約５〜約３０ヌクレオチド下流で始まる位置
    にて標的核酸配列に相補的であるプローブの３'−末端の約１０〜約３０ヌクレ
    オチドを含む、第１の部分、プローブの該第１の部分にハイブリダイズしない、
    疑問の位置から疑問の位置の約１０〜３０ヌクレオチド下流までの標的配列の反
    復である、約５〜約３０ヌクレオチドを含む第１のプローブの第２の部分、なら
    びにゼロ〜約５０ヌクレオチドの長さであり、プローブの第１の部分および第２
    の部分のいずれともハイブリダイズしない配列を含むプローブの第１の部分と第
    ２の部分との間に位置されるプローブの必要に応じた第３の部分から構成される
    、工程； （Ｂ）処理されたサンプルにおいて、第１のプローブの３'−末端にて第１のハ
    イブリッドを伸長する工程であって、それによって第１のプローブを疑問の位置
    を過ぎて伸長し、そして疑問の位置を含む、伸長された第１のハイブリッドを形
    成する、工程； （Ｃ）伸長された第１のハイブリッドの水性組成物を変性して、２つの核酸鎖を
    分離し、分離された標的核酸および分離された伸長された第１のプローブを含む
    水性組成物を形成する、工程； （Ｄ）約１０〜約３０ヌクレオチドの長さであり、および伸長された第１のプロ
    ーブにおいて疑問の位置の約５〜約２０００ヌクレオチド下流で開始する位置に
    て、伸長された第１のプローブに相補的である、第１のプローブ、及び第２のプ
    ローブのそれぞれをアニーリングし、それによって第２のハイブリッドを形成す
    る、工程； （Ｅ）伸長が、伸長された第１のプローブの５'−末端に達するまで、第２のプ
    ローブの３'−末端にて第２のハイブリッドを伸長し、それによって３'−領域が
    アイデンティファイアーヌクレオチドを含む第２の伸長されたプローブを含む、
    第２の伸長されたハイブリッドを形成する、工程； （Ｆ）伸長された第２のハイブリッドの水性組成物を変性して、核酸鎖を分離し
    、分離された伸長された第１および第２のプローブを含む水性組成物を形成する
    、工程； （Ｇ）水性組成物を冷却して、分離された伸長された第２のプローブからヘアピ
    ン構造を形成して、ヘアピン構造を含有する組成物を形成する、工程、 （Ｈ）ヘアピン構造を含有する組成物と、その活性が核酸ハイブリッドの３'‐
    末端から１つ以上のヌクレオチドを放出する、脱重合化する量の酵素とを混合し
    て、処理された反応混合物を形成する、工程； （Ｉ）３'‐末端領域のアイデンティファイアーヌクレオチドを放出するのに十
    分な期間、反応混合物を維持する工程；ならびに （Ｊ）放出されたアイデンティファイアーヌクレオチドの存在について解析して
    、解析的な出力結果を得る工程であって、解析的な出力結果は、該あらかじめ決
    定された核酸標的配列または標的配列内の特異的な塩基の、存在もしくは不在を
    示す、工程、を包含する、方法。
  69. 【請求項６９】 前記解析的な出力結果が発光分光法によって得られる、請
    求項６８に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 前記解析的な出力結果が蛍光分光法によって得られる、請
    求項６８に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 前記解析的な出力結果が質量分析法によって得られる、請
    求項６８に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 前記解析的な出力結果が吸光度分光法によって得られる、
    請求項６８に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 核酸サンプルにおいて、疑問の位置を含む複数の核酸標的
    配列の存在または不在を決定するための方法であって、以下の工程： （Ａ）それらのそれぞれの核酸プローブとそれぞれハイブリダイズされる該複数
    の核酸標的配列を含み得る核酸サンプルを含む処理されたサンプルを提供する工
    程であって、プローブは、３つの部分、（ｉ）標的配列の該疑問の位置の約１〜
    約３０ヌクレオチド下流で始まる位置にて核酸標的配列に相補的であるプローブ
    の３'末端の約１０〜約３０ヌクレオチドを含む、第１の部分、（ｉｉ）約１０
    〜約２００核酸の長さの、および該核酸標的配列の同一な配列を有する５'−末
    端領域、ならびに（ｉｉｉ）該核酸サンプルに相補的でないゼロ〜約５０核酸を
    含む必要に応じた第３の部分から構成される、工程、 （Ｂ）３'方向において該核酸プローブを伸長し、第２のハイブリッドとして核
    酸サンプルにハイブリダイズされる第２のプローブを形成する、工程； （Ｄ）該第２のハイブリッドを変性して該核酸標的配列から該第２のプローブを
    分離する、工程； （Ｅ）該水性組成物を再生して、該第２のプローブからヘアピン構造を形成する
    、工程； （Ｆ）ヘアピン構造を含有する組成物と、その活性が核酸ハイブリッドの３'‐
    末端から１つ以上のヌクレオチドを放出する、脱重合化する量の酵素とを混合し
    て、処理された反応混合物を形成する、工程； （Ｇ）酵素が、ハイブリダイズされた核酸を脱重合化し、そして１つ以上のヌク
    レオチドをそこから３'‐末端から放出することを許容するのに十分な期間、処
    理された反応混合物を維持する工程；ならびに （Ｈ）放出されたアイデンティファイアーヌクレオチドの存在について解析して
    、解析的な出力結果を得る工程であって、解析的な出力結果は、該核酸標的配列
    の存在または不在を示す、工程、を包含する、方法。
  74. 【請求項７４】 前記解析的な出力結果が発光分光法によって得られる、請
    求項７３に記載の方法。
  75. 【請求項７５】 前記解析的な出力結果が蛍光分光法によって得られる、請
    求項７３に記載の方法。
  76. 【請求項７６】 前記解析的な出力結果が質量分析法によって得られる、請
    求項７３に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 前記解析的な出力結果が吸光度分光法によって得られる、
    請求項７３に記載の方法。
  78. 【請求項７８】 解析的な出力結果が異なる核酸標的配列について区別する
    ことができる、請求項７３に記載の方法。
  79. 【請求項７９】 核酸サンプルにおいて、複数の核酸標的配列、または標的
    配列内の特異的な塩基の存在または不在を決定するための方法であって、以下の
    工程： （Ａ）第１のハイブリッドとして、それらのそれぞれの第１の核酸プローブとハ
    イブリダイズされる複数の核酸標的配列を含み得る核酸サンプルを含む処置され
    たサンプルを提供する工程であって、該第１のプローブは少なくとも２つの部分
    、標的の疑問の位置の約５〜約３０ヌクレオチド下流で始まる位置にて標的核酸
    配列に相補的であるプローブの３'−末端の約１０〜約３０ヌクレオチドを含む
    、第１の部分、プローブの該第１の部分にハイブリダイズしない、疑問の位置か
    ら疑問の位置の約１０〜３０ヌクレオチド下流までの標的配列の反復である、約
    ５〜約３０ヌクレオチドを含む第１のプローブの第２の部分、ならびにゼロ〜約
    ５０ヌクレオチドの長さであり、およびプローブの第１の部分および第２の部分
    のいずれともハイブリダイズしない配列を含む、プローブの第１の部分と第２の
    部分との間に位置されるプローブの必要に応じた第３の部分から構成される、工
    程； （Ｂ）処理されたサンプルにおいて、第１のプローブの３'−末端にて第１のハ
    イブリッドを伸長する工程であって、それによって第１のプローブを疑問の位置
    を過ぎて伸長し、そして疑問の位置を含む、伸長された第１のハイブリッドを形
    成する、工程； （Ｃ）伸長された第１のハイブリッドの水性組成物を変性して、２つの核酸鎖を
    分離し、分離された標的核酸および分離された伸長された第１のプローブを含む
    水性組成物を形成する、工程； （Ｄ）伸長された第１のプローブに、約１０〜約３０ヌクレオチドの長さであり
    、および伸長された第１のプローブにおいて疑問の位置の約５〜約２０００ヌク
    レオチド下流で開始する位置にて、伸長された第１のプローブに相補的である、
    第２のプローブをアニーリングし、それによって第２のハイブリッドを形成する
    、工程； （Ｅ）伸長が、伸長された第１のプローブの５'−末端に達するまで、第２のプ
    ローブの３'末端にて第２のハイブリッドを伸長し、それによって３'‐領域がア
    イデンティファイアーヌクレオチドを含む第２の伸長されたプローブを含む、第
    ２の伸長されたハイブリッドを形成する、工程： （Ｆ）伸長された第２のハイブリッドの水性組成物を変性して、２つの核酸鎖を
    分離して、分離された伸長された第１および第２のプローブを含む水性組成物を
    形成する、工程； （Ｇ）水性組成物を冷却して、分離された伸長された第２のプローブからヘアピ
    ン構造を形成して、ヘアピン構造を含有する組成物を形成する、工程； （Ｈ）ヘアピン構造を含有する組成物と、その活性が核酸ハイブリッドの３'−
    末端から１つ以上のヌクレオチドを放出する、脱重合化する量の酵素とを混合し
    て、処理された反応混合物を形成する、工程； （Ｉ）３'‐末端領域のアイデンティファイアーヌクレオチドを放出するのに十
    分な期間、反応混合物を維持する工程；ならびに （Ｊ）放出されたアイデンティファイアーヌクレオチドの存在について解析して
    、解析的な出力結果を得る工程であって、解析的な出力結果は、該あらかじめ決
    定された核酸標的配列または標的配列内の特異的な塩基の存在または不在を示す
    、工程、を包含する、方法。
  80. 【請求項８０】 前記解析的な出力結果が発光分光法によって得られる、請
    求項７９に記載の方法。
  81. 【請求項８１】 前記解析的な出力結果が蛍光分光法によって得られる、請
    求項７９に記載の方法。
  82. 【請求項８２】 前記解析的な出力結果が質量分析法によって得られる、請
    求項７９に記載の方法。
  83. 【請求項８３】 前記解析的な出力結果が吸光度分光法によって得られる、
    請求項７９に記載の方法。
  84. 【請求項８４】 前記解析的な出力結果が種々のあらかじめ決定された核酸
    標的配列について区別可能である、請求項７９に記載の方法。
  85. 【請求項８５】 核酸サンプルにおいて複数のあらかじめ決定された核酸標
    的配列の存在または不在を決定するためのキットであって、以下： （Ａ）その活性がハイブリダイズされた核酸プローブの３'末端から１つ以上の
    ヌクレオチドを放出する、精製されおよび単離された酵素；ならびに （Ｂ）複数の核酸プローブであって、該核酸プローブのそれぞれが核酸標的配列
    に相補的である、プローブ、を含む、キット。
  86. 【請求項８６】 あらかじめ決定された核酸標的配列が血液凝固と関連され
    る、請求項８５に記載のキット。
  87. 【請求項８７】 核酸プローブが複数の以下の核酸配列またはそれらの相補
    的な配列： 5' CTGCTGCCCTCTGTATTCCTCG 3' 配列番号１４； 5' CTGCTGCCCTCTGTATTCCTTG 3' 配列番号１５； 5' GTGACTCTCAGCG 3' 配列番号８７； 5' GTGACTCTCAGCA 3' 配列番号８８； 5' GTGATTCTCAGCG 3' 配列番号８９； 5' GTGATTCTCAGCA 3' 配列番号９０； 5' GACAAAATACCTGTATTCCTCG 3' 配列番号９１； 5' GACAAAATACCTGTATTCCTTG 3' 配列番号９２； 5' GGAGCATTGAGGCTCG 3' 配列番号９３； 5' GGAGCATTGAGGCTTG 3' 配列番号９４； 5' GACAAAATACCTGTATTCCTTG 3' 配列番号４７； 5' GTGATTCTCAGCA 3' 配列番号４４； 5' GTGATTCTCAGCG 3' 配列番号４５；および 5' GACAAAATACCTGTATTCCTCG 3' 配列番号４６ を含む、請求項８６に記載のキット。
  88. 【請求項８８】 あらかじめ決定された核酸標的配列が、特定のために有用
    である、請求項８７に記載のキット。
  89. 【請求項８９】 核酸プローブが、複数の以下の核酸配列またはそれらの相
    補的な配列： 5' CCAGACGCCTCA 3' 配列番号５０； 5' ACCTTCACGCCA 3' 配列番号５１； 5' TGCCGAGACGT 3' 配列番号５２； 5' GCAGACACATCC 3' 配列番号５３； 5' GGAATCTCCACG 3' 配列番号５４； 5' ACATACACGCAA 3' 配列番号５５；および 5' ATATGCACGCAA 3' 配列番号５６ を含む、請求項８８に記載のキット。
  90. 【請求項９０】 あらかじめ決定された核酸標的配列が、先天的な副腎過形
    成と関連される、請求項８５に記載のキット。
  91. 【請求項９１】 核酸プローブが複数の以下の核酸配列またはそれらの相補
    的な配列： 5' CGGAGCCTCCACCTCCCG 配列番号２３； 5' CACCCTCCAGCCCCCAGC 3' 配列番号２４； 5' CGGAGCCTCCACCTCCTG 3' 配列番号２５； 5' CCTCACCTGCAGCATCAAC 3' 配列番号２６； 5' CACCCTCCAGCCCCCAAC 3' 配列番号２７； 5' CCTCACCTGCAGCATCATC 3' 配列番号２８； 5' CCTGGAAGGGCACTT 3' 配列番号２９； 5' CCTGGAAGGGCACGT 3' 配列番号３０； 5' GATTCAGCAGCGACTGTA 3' 配列番号３１； 5' GATTCAGCAGCGACTGCA 3' 配列番号３２； 5' CGAGGTGCTGCGCCTGCG 3' 配列番号３３； 5'CGAGGTGCTGCGCCTGTG 3' 配列番号３４； 5'GGGATCACATCGTGGAGATG 3' 配列番号３５；および 5'GGGATCACAACGAGGAGAAG 3' 配列番号３６ を含む、請求項９０に記載のキット。
  92. 【請求項９２】 前記核酸プローブが蛍光標識を含む、請求項８５に記載の
    キット。
  93. 【請求項９３】 前記核酸プローブが非天然のヌクレオチドアナログを含む
    、請求項８５に記載のキット。
  94. 【請求項９４】 ピロリン酸をさらに含む、請求項８５に記載のキット。
  95. 【請求項９５】 ヌクレオチド二リン酸キナーゼをさらに含む、請求項８５
    に記載のキット。
  96. 【請求項９６】 前記ヌクレオシド二リン酸キナーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃ
    ｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓによってコードされる、請求項９５に記載の組成物。
  97. 【請求項９７】 ＰＲＰＰ合成酵素をさらに含む、請求項９５に記載のキッ
    ト。
  98. 【請求項９８】 ＡＤＰをさらに含む、請求項９５に記載のキット。
  99. 【請求項９９】 核酸サンプルにおいて複数のあらかじめ決定された核酸標
    的配列の存在または不在を決定するための組成物であって、以下： （Ａ）その活性がハイブリダイズされた核酸プローブの３'末端から１つ以上の
    ヌクレオチドを放出する、精製されおよび単離された酵素；ならびに （Ｂ）複数の核酸プローブであって、該核酸プローブのそれぞれがあらかじめ決
    定された核酸標的配列に相補的である、プローブ、を含有する水性溶液を含む、
    組成物。
  100. 【請求項１００】 核酸サンプルにおいて複数のあらかじめ決定された核酸
    標的配列の存在または不在を決定するための物質の組成であって、以下： （Ａ）ピロリン酸の存在下でその活性がハイブリダイズされた核酸プローブから
    ヌクレオシド三リン酸としてアイデンティファイアーヌクレオチドを放出する、
    精製されおよび単離された酵素； （Ｂ）アデノシン５'二リン酸； （Ｃ）ピロリン酸； （Ｄ）精製および単離されたヌクレオシド二リン酸キナーゼ；ならびに （Ｅ）複数の核酸プローブであって、該核酸プローブのそれぞれがそのそれぞれ
    のあらかじめ決定された核酸標的配列に相補的である、核酸プローブ、を含有す
    る水性溶液を含む、組成物。
  101. 【請求項１０１】 ピロリン酸の存在下でその活性がアイデンティファイア
    ーヌクレオチドを放出する前記精製および単離された酵素が、熱安定性のポリメ
    ラーゼである、請求項１００に記載の組成物。
  102. 【請求項１０２】 前記精製および単離されたヌクレオシド二リン酸キナー
    ゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓによってコードされるキナーゼ
    である、請求項１０１に記載の組成物。
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