JP2002509694A - 特異的かつ高感度な核酸検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 核酸の検出方法であって、一方が、該核酸の結合配列（Ａ）に結合することができ、かつもう一方が、Ａの３’方向に位置し、Ａと重複しない配列Ｃと相補的である結合配列Ｃ’に結合することができる、２つのプライマーの助けにより該核酸の一部の多数の増幅物を作製する工程、配列Ａと配列Ｃとの間に位置する配列Ｂまたはその相補体に結合することができる結合配列Ｄを有するプローブと増幅物を接触させる工程、ならびに増幅物とプローブのハイブリッドの形成を検出する工程を含み、結合配列Ａと結合配列Ｃとの間に位置する配列がプローブの結合配列Ｄまたはその相補体Ｄ’に属さないヌクレオチドを含まない、核酸の検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は核酸の検出方法に関する。この方法において、複数の核酸の一部が増
幅され、それによって、この一部はその塩基配列に関していくつかの条件を満た
さなければならない。本発明はまた、このような一部を規定する２つのプライマ
ーおよび１つのプローブを含有する試薬キットに関する。

【０００２】 核酸を検出するために最も頻繁に用いられている分子生物学的方法の１つは、
相同的な核酸配列を検出するための配列特異的なプローブによるハイブリダイゼ
ーションである。核酸配列の検出は、基本的な研究のためには重要であるが、様
々な適用分野で、例えば、医学的診断、法廷診断、食品診断、環境診断、植物診
断および獣医学の分野で特に重要である。

【０００３】 オリゴヌクレオチド（短いＤＮＡまたはＲＮＡ）あるいはポリヌクレオチド（
それよりも長いＤＮＡまたはＲＮＡ）が、このためのプローブとして使用されて
いる。より短いプローブの利点は、それよりも長いプローブと比較した場合、短
いプローブは、ハイブリダイゼーション領域がより短いために、より良好な配列
選択性を有することである。しかし、短いプローブは、感度が低いという欠点を
有する。感度および配列選択性は、ＰＮＡプローブ（ペプチド核酸、例えば、国
際公開第９２／２０７０２号パンフレット）によって改善される：このようなプ
ローブは、核酸に対してより大きな結合親和性（より大きなＴｍ）を有し、そし
てより大きな塩基識別（ΔＴｍ）を特徴とするからである。さらに、プローブは
、プローブと検出対象の核酸とのハイブリッド複合体の捕獲および／または検出
のいずれかに好適な核酸検出用マーカー基を有することができる。

【０００４】 ハイブリダイゼーションによって核酸を検出するために、１つまたは複数のプ
ローブが、溶液中でのハイブリダイゼーションあるいは固体支持体上でのハイブ
リダイゼーションのために使用されている。溶液中での核酸の試験は均一型試験
形式と呼ばれているが、固体支持体上での試験および／または固体支持体によっ
て媒介される試験は不均一型試験形式と呼ばれている。不均一型試験形式（例え
ば、ドットブロット）において、検出対象の核酸は固体支持体に予め結合させる
ことができる。ハイブリダイゼーションは、プローブを含有する溶液と接触させ
ることによって行われる。逆に、プローブを固体支持体に予め結合させることが
できる（例えば、リバースドットブロット）。ハイブリダイゼーションは、結合
したプローブを、検出対象の核酸を含有する溶液と接触させることによって行わ
れる。あるいは、検出対象の核酸とプローブとの複合体を最初に溶液中で形成さ
せ、その後、固体支持体に結合させることができる。均一型試験形式においては
、例えば、エネルギー転移基を末端に有し、そして検出対象の核酸に同時にハイ
ブリダイゼーションさせることによる直接的な接触が行われ、従ってシグナルを
生成するプローブ対が使用される。あるいは、検出対象の核酸に結合させた後、
溶液中の５’ヌクレアーゼ酵素活性によって消光状態から非消光状態に変化され
るプローブもまた使用することができる。

【０００５】 プローブハイブリダイゼーションのみによる核酸の検出は、限られた感度を有
するだけである。従って、³²Ｐ、ジゴキシゲニン、ビオチン、フルオレセイン、
ルテニウムキレート、フルオレセイン、ローダミンまたはＡＭＣＡなどの高感度
な検出マーカー基を使用した場合でも、ｐｇからｆｇの範囲の感度が得られるに
過ぎない。しかし、ａｇ範囲の感度および大きな試験特異性が、特に医学的な診
断分野における高感度な核酸試験に求められている。これは、例えば、感染性病
原体の形態で外因性核酸を検出することに当てはまり、そして内因性核酸の存在
の有無またはその変化を検出することに当てはまる。しかし、大きな試験感度お
よび試験特異性はまた、他の上記の適用分野においても非常に重要である。

【０００６】 従って、いくつかの感染性病原体（例えば、ＨＣＶ、ＨＩＶおよびＨＢＶなど
）は、例えば、初期の薬物処置などによる時期を得た医学的介入を行うためには
、わずかに数コピーが存在するときにさえ検出されなければならない。病原体の
核酸配列の存在を検出することは、核酸増幅方法（核酸増大化方法）が利用可能
であるために高感度の検出が感染初期（潜伏期）において既に可能であるので、
病原体のそのような初期の試験に好都合である。検出され得るそのような媒介因
子（ａｇｅｎｔ）の特異的な増幅は、核酸の場合においてのみ可能であり、免疫
学的な検出方法の場合には不可能である。免疫学的な検出方法において、検出対
象の病原体に特異的な粒子の増大は、体液性の免疫応答および病原体に特異的な
対応する抗体の形成によって可能になるだけである。しかし、このような免疫応
答は潜伏期の後で生じるに過ぎず、病原体が感染した後での二次的な反応である
。従って、核酸ハイブリダイゼーションによる検出は、感染後において病原体を
非常に高感度に直接検出できるという利点を有する。

【０００７】 しかし、医学的介入の成功は、初期段階における病原体を高感度で検出できる
ことだけに依存するのではなく、特異性そのものにも依存する。従って、特異的
な処置を行うためには、様々な病原体（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩ
Ｖ、様々なヘルペスウイルス、ＨＰＶなど）を区別し、そしてＨＩＶ−１および
ＨＩＶ−２などの個々の亜型を区別することが重要である。これに関連して、量
的な情報および偽陽性または偽陰性でない結果が得られることもまた重要である
：そのような誤った結果は、特定の状況のもとでは、重大な治療結果をもたらし
得るからである。このことは、結果の正確性と大きな再現性とを必要とする。従
って、核酸検出は、非常に高感度であるだけでなく、非常に特異的かつ再現的で
なければならない。特異的で高感度な核酸試験はまた、特異的な処置が直ちに始
めることができるように迅速に行われなければならない。

【０００８】 多くの場合、例えば、血液銀行のスクリーニング試験の一部として、いくつか
の病原体（例えば、ＨＣＶ、ＨＩＶおよびＨＢＶなど）を同時に検出することも
また重要である。現在の核酸検出試験において、これは、検出対象の病原体を個
々に連続的に測定することによって行われる。このような試験の欠点は、いくつ
かの測定を次々に行わなければならないことである。これは、非常に多くの検体
をスクリーニングするときには特に不都合である。例えば、１つのサンプルで平
行していくつかの病原体の迅速で同時的な測定（多重測定）を可能にする高感度
で特異的な試験方法を得ることは、そのような核酸測定には望ましい。

【０００９】 特異的で高感度な核酸検出方法を得ることはまた、特定のゲノム座内における
内因性核酸の存在の有無および／またはその変化（例えば、遺伝的変異、自発的
変異または遺伝的変異および自発的変異の混在、欠失、逆位、転座、転位または
トリプレット伸長）を特異的な変化および／または多型的な変化の形態で検出す
るのに好都合である。しかし、特異的で高感度な核酸検出方法を得ることは、医
学的な面において非常に重要であるだけでなく、上記の他の適用分野においても
非常に重要である。

【００１０】 核酸の存在の有無を高感度で特異的に検出するための以前の検出手順は、核酸
増幅反応（核酸増大化）および核酸検出反応（検出）の組合せに基づいている。

【００１１】 この場合、検出対象の核酸は増幅反応に好適な形態で使用されている：例えば
、未処理のサンプル材料または処理したサンプル材料の形態、および／または、
例えば、未処理のサンプル材料または処理したサンプル材料を固体支持体の表面
に吸着させ、その後、この固体支持体から再吸収することによるサンプル材料の
濃縮物の形態で使用されている。そのような固体支持体は、例えば、ガラス含有
表面を有する固体支持体である。このような固体支持体は、検出対象の核酸の精
製および／または単離を実質的に行わず、サンプル材料を濃縮するだけであり、
そしてその後の核酸増幅反応および核酸検出反応の阻害剤を不活性化および／ま
たは除去することができる。このような固体支持体はまた、例えば、多重方法で
検出対象のいくつかの核酸を、核酸の増幅反応および検出反応に好適な形態で提
供することを可能にする。

【００１２】 他のサンプル調製方法は、検出対象の核酸を核酸特異的および／または配列特
異的に結合させるための特異的な処理工程を含み、例えば、核酸特異的な結合性
基および／または核酸捕捉プローブを有する固体支持体を使用して、核酸特異的
な結合を行い、そしてその後、結合性基および／またはキャリア結合捕捉プロー
ブと検出対象の核酸との間を解離させることによって検出対象の核酸を選択的に
結合させ、そして核酸を放出させることによって行われる。固体支持体の表面上
の核酸特異的な結合性基および／または核酸捕捉プローブはこのタイプの固体支
持体には必要である。従って、いくつかの検出対象の核酸を、例えば、多重方法
のために調製するためには、より複雑ないくつかの固体支持体を有することが必
要であり、あるいは１つもしくはいくつかの結合性基および／または多重型もし
くはいくつかの捕捉プローブを有する固体支持体を有することが必要である。多
重型捕捉プローブは、いくつかの検出対象の核酸に対するいくつかの結合配列を
含有する。しかし、いくつかの結合性基および／またはいくつかの捕捉プローブ
および／または多重型捕捉プローブを有するこのような固体支持体は、調製がよ
り複雑である。さらに、いくつかの検出対象の核酸を、いくつかの結合性基また
は／および捕捉プローブを含有する支持体に特異的に結合させるために、あるい
はいくつかのタイプの検出対象の核酸を、いくつかの相補的なハイブリダイゼー
ション配列を有する核酸特異的な結合性基または捕捉プローブに結合させるため
に反応条件を調節することはより困難である。

【００１３】 調製された検出対象の核酸の増幅および検出は、不均一型または均一型の核酸
増幅試験形式で行われる。核酸の増幅反応および検出反応は、連続的（不均一型
の試験方法）または同時（均一型の試験方法）のいずれかで行うことができる。
標的特異的な核酸増幅反応、標的依存的なシグナル−核酸増幅反応、またはシグ
ナル核酸増幅反応が増幅反応として使用される。増幅された核酸を検出するため
の検出システムは、ヌクレオチドの取り込みおよび／または標識プライマーもし
くは標識プローブの使用のいずれかに基づく。使用される検出システムは、直接
的または間接的な検出標識あるいは共役した二次検出成分および三次検出成分を
含有する。しかし、増幅された検出対象の核酸は、分光学的方法または物理的方
法によってもまた検出することができる。

【００１４】 統合化されたシグナル−核酸増幅反応を伴う以前の核酸増幅検出方法は、非指
数関数的なシグナル増幅のために感度がより低いという欠点、プローブ成分が非
常に多く、そして非特異的な検出シグナルが生成する結果としてバックグラウン
ドシグナルが生成する傾向がより強いために妨害に対して大きく影響されるとい
う欠点を有する。標的とは無関係に増幅されるのは検出対象の核酸ではないが、
それに結合するのは検出シグナルだけであるからである。例には、共役したシグ
ナルカスケード（例えば、ＳＥＬＦサイクル）、またはシグナル生成プローブツ
リー、またはブラシ構造（例えば、分枝状ＤＮＡ）がある。

【００１５】 統合化された標的依存的なシグナル−核酸増幅反応を伴う以前の核酸増幅検出
方法は、シグナルの指数関数的な増大のために純粋なシグナル−核酸増幅方法よ
りも高感度である。しかし、この方法は、逆に、非特異的な検出シグナルが生成
するという欠点を有する。標的配列と無関係な様式で酵素的に増幅されるのは検
出対象の核酸自体ではないが、検出シグナルは核酸レポーター分子の形態で最初
の標的依存的な一次反応において得られるだけであるからである。例には、Ｑβ
レポーター分子が酵素的に増幅されるＱβ複製反応、または核酸レポーター分子
の一部が配列と無関係な様式で酵素的に連結されるリガーゼ連鎖反応がある。

【００１６】 以前の最も大きな感度および特異性を有する指数関数的な標的特異的核酸増幅
反応〔例えば、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号明細書（ ＵＳ−Ａ−
４，６８３，２０２）または欧州特許第０ ２０２ ３６２号明細書（ＥＰ−Ｂ
−０ ２０２ ３６２））、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ（欧州特許出願
公開第０ ３２９ ８２２号明細書（ＥＰ−Ａ−０ ３２９ ８２２））または
ＴＡＭ（国際公開第９１／０１３８４号パンフレット）など〕によって得られる
核酸増幅産物は、反対方向に伸びるプライマーの標的配列依存的な温度サイクル
または等温の酵素的伸長によって得られる一本鎖または二本鎖の核酸増幅産物で
あった。このプライマーは、検出対象の核酸に対して配列特異的であり、そして
検出対象のデオキシリボ核酸またはリボ核酸の核酸増幅ユニット（アンプリコン
）の両末端あるいはその相補体に結合し、従って核酸増幅産物を制限する。４塩
基のすべての特異性はこれらの伸長反応に組み込まれる。

【００１７】 統合化された標的特異的核酸増幅反応を伴う前記の核酸増幅検出方法は、標的
配列に依存する酵素的核酸増幅サイクルであるために最も特異的である。線形的
な標的特異的核酸増幅反応（例えば、サイクリングプローブ反応など）は限られ
た感度をもたらすだけであるが、指数関数的な標的特異的核酸増幅反応（伸長に
基づく反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＤＡ）
など、または転写に基づく反応、例えば、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）
など、または転写媒介増幅（ＴＭＡ））は、以前には、最も大きな感度および特
異的なシグナルをもたらした。

【００１８】 標的依存的なシグナル核酸増幅および標的に特異的な核酸増幅を組み合わせた
形態、例えば、ギャップフィリングリガーゼ連鎖反応（ギャップフィリングＬＣ
Ｒ、国際公開第９０／０１０６９号パンフレット）などは、非改変型ＬＣＲと比
較して、標的依存的な反応工程を有する。しかし、これは、１塩基または２塩基
の特異性から構成されるだけであり、従って限られた標的特異性を有する限られ
た配列部分に制限される。

【００１９】 様々な方法を、形成された核酸を検出するために利用することができる。フラ
グメントまたは配列のゲル分析による生成した核酸増幅産物の検出は、時間がか
かり、非定量的である。キャリア結合型のドット法、スロット法またはリバース
ドットブロット法による検出もまた、時間がかかり、非定量的である。

【００２０】 検出対象の核酸の高感度で特異的な定量的測定は、以前から、伸長によって生
成された配列部分の一部に核酸増幅産物が捕捉される不均一型または均一型の標
的特異的な指数関数的核酸増幅反応形式において、組み込まれた標識により、あ
るいは検出対象の核酸またはその相補体の特異的なプローブとのハイブリダイゼ
ーションにより可能である。核酸と結合する色素のインターカレーションが行わ
れる指数関数的核酸増幅反応形式もまた高感度であるが、配列特異的ではない。

【００２１】 不均一型の反応形式において、核酸増幅産物は、例えば、プライマー捕捉修飾
によって、あるいは核酸増幅産物の内部配列部分に相補的な固定化された捕捉プ
ローブによって固体支持体に結合され、そして検出標識ヌクレオチドが取り込ま
れる結果として、核酸増幅産物の内部配列部分に相補的な検出標識プローブとの
ハイブリダイゼーションによって、またはプライマー検出修飾によって検出され
る。均一型の反応形式において、検出は、以前には、例えば、核酸増幅産物の内
部配列部分に相補的であり、消光された蛍光性標識を有するプローブのハイブリ
ダイゼーション（この場合、消光の標的配列依存的な酵素的解除が、消光された
蛍光性の標識ヌクレオチドがプライマー伸長に依存して放出される：国際公開第
９２／０２６３８号パンフレット）によって、あるいは検出可能な分子または検
出可能な基の結合および／または挿入によって行われる。

【００２２】 核酸増幅ユニット（アンプリコン）は、以前の定量的な高感度で特異的な不均
一型または均一型の標的特異的な指数関数的核酸増幅反応形式のすべてで使用さ
れている。かかるアンプリコンでは、様々な長さのさらなる配列が、特異的なプ
ライマー結合配列およびプローブ結合配列に加えて、隣接するプライマー結合配
列と内部のプローブ結合配列との間に含まれる。このような５成分アンプリコン
構造は、２つの隣接するプライマーの配列長さと好ましくは１００塩基（対）〜
１０００塩基（対）の間である内部のプローブの配列長さとの合計よりも大きい
アンプリコンの長さをもたらした。酵素混合物の改善による核酸増幅反応の最適
化は、以前は、主として、より長い核酸増幅産物に向けられていた。

【００２３】 長さがより短いアンプリコンは、以前は、例えば、トリプレット伸長などにお
ける特別な配列を検出するために、加齢研究の一部としての非常にフラグメント
化した核酸のインシチュウ（ｉｎ ｓｉｔｕ）での試験または検出のために作製
されているだけであった。しかし、このような長さが短いアンプリコンは、感度
が良くないことおよび／または定量性がないことを特徴とする時間がかかるゲル
形式またはインシチュウ形式で検出されていた。他の特別な短い配列（短い重複
反復、点在する短い反復エレメント、マイクロサテライト配列またはＨＬＡ特異
的配列など）は、以前には、プライマー結合配列またはプローブ結合配列として
、あるいは他の配列との組合せで使用されているだけであった。

【００２４】 ５成分の核酸増幅産物は、プローブおよびプライマーと結合する特異的な配列
に加えて、アンプリコンを広げ、特異性をもたらすプライマー結合反応およびプ
ローブ結合反応に関して全体的な特異性を低下させる、さらなる配列を有すると
いう欠点を有する。

【００２５】 以前から使用されているより長い５成分の核酸増幅産物は、プライマー伸長時
間がより長く、従って全体の試験時間がより長いというさらなる欠点を有する。
感度もまた、長いアンプリコンを用いるほど早く到達する、関与する酵素および
基質のプラトー効果によって制限される。より長い核酸増幅産物のさらなる欠点
は、アンプリコンに相補的な鎖と検出体または捕捉プローブとの競合が大きくな
ることであり、従って感度の低下をもたらすことである。さらなる欠点は、増大
したバックグラウンド、従ってより低い感度（より低いシグナル−ノイズ比）を
もたらすさらなる配列のために、非特異的な結合の機会が増大することである。
核酸増幅産物がキャリア結合捕捉プローブに結合するときのさらなる欠点は、よ
り長い核酸分子の立体的で速度論的な障害である；従って、前者の長さの核酸増
幅産物は、捕捉プローブに結合する前に、好ましくはフラグメント化される。さ
らなる欠点は、アンプリコン配列内でのフラグメント化、従って核酸増幅ユニッ
トの分解に対する感受性が増大することである；これは再現性の低下をもたらす
。さらなる欠点は、長い核酸増幅産物ほど、融解温度に対してより大きな差が存
在するために、従来の核酸分析装置において用いられる低い試験温度（例えば、
３７℃）でのハイブリダイゼーションの特異性が低くなることである。いくつか
の異なる核酸増幅産物を検出するときの５成分核酸増幅産物のさらなる欠点は、
多重試験の実施をより困難にする、異なる長さの核酸増幅を生じることである。

【００２６】 本発明の目的は、上記の方法を上まわる利点を有する、別の核酸検出方法を提
供することであった。

【００２７】 本発明の特別な目的は、１つまたは複数の一本鎖核酸または二本鎖核酸を非常
に高感度かつ非常に特異的に、そして再現的かつ定量的に検出するための標的依
存的な指数関数的核酸増幅方法を提供することであった。この方法は、特に、１
つまたはいくつかの前記の欠点を回避する。

【００２８】 本発明のさらなる目的は、全体の特異性を保持しながら、好ましくは部分的に
同一であるプライマー配列またはプローブ配列を使用する標準化された反応形式
で検出対象のいくつかの異なる核酸を検出することが可能であるようにプライマ
ー配列およびプローブ配列の選択を柔軟にすることであった。

【００２９】 本発明は、２つのプライマーによってこの核酸の一部の複数の増幅物を作製す
るための方法に関する。一方のプライマーは、核酸の一方の鎖の第１の結合配列
（Ａ）に結合することができる。もう一方のプライマーは、Ａの３’方向に位置
し、そしてＡと重複しない配列Ｃに相補的な第２の結合配列（Ｃ’）に結合する
ことができる。この方法は、増幅物を、配列Ａおよび配列Ｃの間に位置する第３
の配列（Ｂ）またはその相補体（Ｂ’）に結合することができる結合配列Ｄを有
するプローブと接触させる工程、および増幅物とプローブとのハイブリッドの形
成を検出する工程を含む。ただし、結合配列Ａおよび結合配列Ｃの間に位置する
第３の配列（Ｂ）またはその相補体（Ｂ’）は、プローブの結合配列Ｄから形成
される配列部分Ｅおよびそれに結合する増幅物の配列の一部でないヌクレオチド
を含有しない。

【００３０】 本発明はまた、本発明の方法を行うための試薬キットに関する。

【００３１】 本発明による方法を用いて検出することができる核酸は、任意の起源であり得
る。例えば、ウイロイド起源、ウイルス起源、細菌起源または細胞起源の核酸、
あるいは酵母または真菌から得られる核酸であり得る。検出対象の核酸配列また
はその相補体を含有するサンプル（検体）は、例えば、ヒト、動物、細菌または
植物の液体、あるいは酵母または真菌から得られる液体、排出物、塗抹標本、細
胞懸濁物、培養物または組織、細胞または液体生検物である。核酸は、好ましく
は溶液中に存在する。本発明による方法の完全な利点を実現させるために、検出
対象の核酸は少なくとも４０ｂｐのサイズを有するときに好都合であることが明
らかにされている。核酸はまた、クローニング、増幅、あるいはインビトロ複製
またはインビボ複製によって調製される核酸であり得る。

【００３２】 検出対象の核酸は、一本鎖（特に、ＲＮＡの場合）あるいは二本鎖（特に、Ｄ
ＮＡの場合）であり得る。二本鎖核酸の場合、両方の鎖またはその一方のみをを
増幅することができる。一本鎖または二本鎖の増幅物は両方のタイプの核酸から
得ることができ、そしてその一方または両方をその後の検出に使用することがで
きる。１つまたは複数のプローブの配列はそれに従って選択される。

【００３３】 検出対象の核酸に対して同一的に処理された陽性または陰性の対照核酸または
定量標準物をサンプルまたは対照サンプルに加えることができる。好適な標準物
は、例えば、プライマー結合配列に相同的であるか、または検出対象の核酸の配
列に対して異種であるプローブ結合配列を含有する内部または外部の異種または
相同的なＤＮＡ標準物またはＲＮＡ標準物である。逆に、特に３’プライミング
（ｐｒｉｍｉｎｇ）領域において異種であり、かつプローブ結合配列において相
同的であるプライマー結合配列を使用することも可能である。検出対象の核酸ま
たはその相補体を含有しない類似的な検体は、好ましくは、陰性対照として使用
される。

【００３４】 サンプルは、好ましくは、検出対象の核酸を増幅され得る形態に変換するため
に、増幅する前に１つまたはいくつかの前処理工程に供される。任意の第１の工
程において、検出対象の核酸が前処理サンプルが増幅に好適な形態に変換される
のに好適な形態に変換できる形態となるようにサンプル（検体）を前処理する（
例えば、サンプルからの妨害成分の分離）。

【００３５】 サンプル前処理のタイプは、サンプルのタイプおよびサンプルにおける生物学
的物質の複雑さに依存する。例えば、ヒト血液などのヒト体液の場合、血液細胞
は、血漿、血清または血液細胞の濃縮物を得るために好ましい態様において最初
に分けられる。このような分離工程およびサンプルの前処理は、検出対象の核酸
を実質的に単離することなく得られる画分における生物学的サンプル材料の複雑
さを著しく減らす。痰または塗抹標本の場合、サンプルは、例えば、痰または塗
抹標本を液体に懸濁することによって前処理される。すなわち尿の場合は、例え
ば、遠心分離し、得られる画分を加工することによって前処理される。組織生検
物の場合、検体は、例えば、懸濁し、そして細胞構成物を溶解する薬剤で処理す
ることによって前処理される。脳脊髄液のサンプルは、例えば、遠心分離し、得
られる画分を加工することによって前処理される。これらの場合、サンプルの前
処理はまた、生物学的サンプル材料の複雑さを減らす。

【００３６】 前処理を行った後、前処理されたサンプル由来の検出対象の核酸を増幅に好適
な形態に変換する工程を行うことができる。既知の方法が、好ましくはこのため
に使用される。好ましい態様において、前処理されたサンプルは、最初の反応工
程において、検出対象の核酸を遊離させるために、例えば、高温でのプロテイナ
ーゼＫ処理によって、あるいはデオキシリボ核酸の場合にはアルカリによって溶
解される。第２の工程では、溶解により前処理したサンプルを、固体支持体の表
面に結合し、その後、カオトロピー剤（例えば、グアニジウム塩酸塩または尿素
など）を水溶性アルコール（例えば、イソプロパノールなど）の存在下または非
存在下で加えた後にこの固体支持体から再吸収することによって濃縮される。そ
のような固体支持体は、例えば、ガラス含有表面を有する固体支持体である（例
えば、磁気粒子、ガラス含有表面を有するガラスフリース、粒子、マイクロタイ
タープレート、反応容器、浸漬スティック、または順に統合化された反応チップ
の一部でもあり得る小型化された反応チャンバーなど）。これらの固体支持体は
、好ましくは、配列特異的な精製をもたらさない。すなわち、検出対象の核酸は
他の核酸から実質的に単離されないが、サンプル材料（核酸）の濃縮、ならびに
必要に応じて、その後の核酸の増幅反応および検出反応の阻害剤を不活性化およ
び／または除去するだけである。これらの固体支持体はまた、例えば、多重方法
の一部として核酸の増幅反応および検出反応に好適な形態で、いくつかの核酸を
提供することを可能にする。

【００３７】 別の態様において、前処理されたサンプル由来の検出対象の核酸は、例えば、
高温でのプロテイナーゼＫ処理によるか、あるいはデオキシリボ核酸の場合には
アルカリにより、最初の工程において核酸を遊離させた後で変換することができ
る。第２の工程で、溶解して前処理されたサンプルは、検出対象の核酸と選択的
に結合させるために、核酸に特異的な結合性基および／または捕捉プローブで特
異的に改変された固体支持体と接触させられる。そしてその後、結合した検出対
象の核酸は、結合性基および／またはキャリア結合捕捉プローブと、検出対象の
核酸との間の解離によって再度溶出される。核酸に特異的な結合性基の例は、Ｐ
ＮＡホモピリミジンオリゴマー（例えば、（Ｔ）₇ −ＰＮＡなど）、または核酸
結合性の低分子量の物質〔例えば、核酸インターカレーター、大きな溝結合剤（
ｍａｊｏｒ ｇｒｏｏｖｅ−ｂｉｎｄｅｒｓ）または微小溝結合剤（ｍｉｎｏｒ
ｇｒｏｏｖｅ−ｂｉｎｄｅｒｓ）など〕である。検出対象の核酸に特異的な捕
捉プローブの例は、１つまたは複数の検出対象の核酸に関する結合配列を有する
核酸オリゴマーまたは核酸ポリマーである。検出対象の核酸に特異的な捕捉プロ
ーブの別の例は、１つまたは複数の検出対象の核酸に関する結合配列を有するＰ
ＮＡオリゴマーである。核酸に特異的な結合性基または捕捉プローブは、中間ス
ペーサーを用いて、あるいは中間スペーサーを用いることなく、共有結合的に、
あるいは、例えば、ビオチン：ストレプトアビジンまたはＮｉ：キレートなどの
結合対によって固体支持体に結合させることができる。

【００３８】 増幅するために使用される核酸配列は、線状または環状であり得るし、そして
配列修飾および／または他の修飾、例えば、天然もしくは人工的なヌクレオチド
アナログまたはその均等物あるいは塩基アナログまたはその均等物などを含むこ
とができ、あるいはメチル化、キャップ化、ポリアデニル化、または他の方法で
修飾され得る。増幅するために使用される核酸またはその相補体は天然起源であ
り得る。あるいは、増幅するために使用される核酸またはその相補体は、フラグ
メント化され、修飾され、または例えば、ウラシルデグリコシラーゼ（ＵＮＧ）
酵素により酵素的に、もしくは物理的に前処理され、予備増幅され、または例え
ば、化学的なオリゴヌクレオチド合成もしくはインビトロ複製、インビトロ逆転
写もしくはインビトロ転写によって、化学的、光化学的もしくは酵素的に作製す
ることができる。

【００３９】 本発明による方法の第１の必須工程において、検出対象の核酸セグメントが増
幅される。このセグメントはまた、下記においてはアンプリコンと呼ばれる。セ
グメントは、結合配列Ａおよび結合配列Ｃ’の外側の末端間、またはプライマー
（プライマー結合領域）のその相補体の外側の末端間に配列領域を含有し、そし
てプローブまたはその相補体の結合領域Ｅを含有することは必須である。本発明
により、アンプリコン（好ましくは、領域Ａ、ＢおよびＣの配列の全長）は、好
ましくは、１００ヌクレオチドよりも短く、特に好ましくは６０ヌクレオチドよ
りも短いが、好ましくは４０ヌクレオチドよりも長い。しかし、このことは、例
えば、プライマーがさらなるヌクレオチドを有するときに、増幅物の全長をより
長くすることができないことを意味していない。検出対象の核酸またはその相補
体の増幅を可能にし、そして３成分のミニ核酸増幅産物が得られる増幅方法が使
用される〔ミニ連鎖反応（ＭＣＲ）〕。原理的には、先行技術において知られて
いるすべての核酸増幅方法をこのために使用することができる。標的特異的な核
酸増幅反応が好ましくは使用される。理論的に指数関数的な標的特異的核酸増幅
反応が特に好ましく使用され、この反応において、検出対象の核酸またはその相
補体の反平行的な複製が行われる。例えば、伸長に基づく反応（ポリメラーゼ連
鎖反応（デオキシリボ核酸に関するＰＣＲ、リボ核酸に関するＲＴ−ＰＣＲ）な
ど）、または転写に基づく反応（例えば、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）
など）、または転写媒介増幅（ＴＭＡ）。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応などの
温度サイクルによる指数関数的な伸長型核酸増幅反応が特に好ましい。増幅する
ために使用される、検出対象の核酸またはその相補体は、一本鎖または二本鎖の
デオキシリボ核酸またはリボ核酸の形態で存在し得る。増幅反応（増幅）の目的
は、検出対象の核酸セグメントの無数の増幅物を作製することである。従って、
増幅物は、核酸の配列情報を使用することによって作製される任意の分子種とし
て理解される。特に、この用語は核酸をいう。用語「増幅物」には、一本鎖なら
びに二本鎖の核酸が含まれる。元となる核酸（アンプリコン）の配列情報を含有
する領域に加えて、増幅物はまた、増幅され得る核酸の配列に直接的には関連せ
ず、互いに反対方向を向いているプライマー結合部位の末端の外側に位置するさ
らなる領域を含有することができる。１５ヌクレオチドよりも長いそのような配
列は、好ましくは、検出対象の核酸またはその相補体には存在せず、そして直接
的な塩基対形成によってそれとハイブリダイズすることができない。従って、増
幅物は、検出対象の核酸自身またはその相補体のいずれかとハイブリダイズする
ことができる。増幅物はまた、例えば、非対称的な増幅による産物である。すな
わち、そのような増幅において、（例えば、異なる量のプライマーを使用するこ
とによって）２つの鎖が異なる量で形成され、あるいは２つの鎖の一方が（例え
ば、ＲＮアーゼによって）その後分解される。

【００４０】 本発明の意味におけるプライマーは、核酸Ｔまたはその相補体に対する塩基対
形成によって結合することができ、そして好ましくは酵素的に伸長することがで
きる分子として理解される。検出対象の核酸またはその相補体をテンプレート核
酸として使用して、その３’末端から伸長することができるオリゴヌクレオチド
が好ましい。核酸に依存した伸長を可能にする１価または多価あるいはモノ官能
性または多官能性の媒介因子をプライマーとして使用することができる。このよ
うな媒介因子はまた様々なタイプの分子から構成され得る。例えば、ＰＮＡおよ
びヌクレオチドのキメラ、またはタンパク質／ペプチドおよびヌクレオチドのキ
メラ。好ましいプライマーは、検出対象の核酸Ｔまたはその相補体に反平行的に
結合し、そして検出対象の核酸またはその相補体の酵素的な複製のためのいくつ
かの反応パートナーの１つとして作用する９ｎｔ〜３０ｎｔの間の結合長さを有
し、特に好ましくは１１ｎｔ〜２２ｎｔの間の結合長さを有するオリゴマーまた
はポリマーである。オリゴマーは、検出対象の核酸またはその相補体の一方の鎖
または両鎖の制御された複製を開始させるプライマーとして特に好ましく使用さ
れ、かかる複製は、増幅試薬を加えた後に、検出対象の核酸またはその相補体に
プライマーの少なくとも一部を結合させることによって行われる。特に好ましい
プライマーの例は、遊離の３’ヒドロキシル末端を有するオリゴヌクレオチドで
ある。

【００４１】 プライマーとして使用される媒介因子は、１つまたは複数の検出対象の核酸ま
たはその相補体に関する１つまたは複数の結合配列を含有することができ、そし
て配列修飾、末端および／または内部の配列伸長、および／または他の修飾、例
えば、天然または人工的なヌクレオチドアナログまたはその均等物、非機能的な
ヌクレオチドアナログまたはその均等物、塩基アナログまたはその均等物などを
含むことができ、あるいはメチル化、キャップ化またはポリアデニル化、または
他の方法で修飾することができる。そのような媒介因子は、検出対象の核酸また
はその相補体対する必要な結合特性を有し、そして伸長され得ることが必要であ
る。好ましいヌクレオチド均等物は、正電荷および／または負電荷を骨格および
／またはスペーサーに有するか、あるいはそのような電荷を有さないＰＮＡモノ
マーまたはＰＮＡオリゴマーである（国際公開第９２／２０７０２号パンフレッ
ト）。プライマーとして使用される媒介因子は、検出および／または固体支持体
への結合に直接適するか、あるいはさらなる結合対を介して間接的に適する修飾
を有することができる。

【００４２】 好ましいプライマー修飾は、蛍光性色素（例えば、フルオレセイン、ローダミ
ン、ＡＭＣＡ、またはその誘導体）、結合対（ビオチン：（ストレプト）アビジ
ン、ジゴキシゲニン：抗ジゴキシゲニン、ジゴキシゲニン：抗ジゴキシゲニン結
合エクオリン、フルオレセイン：抗フルオレセインまたはルテニウムまたはレニ
ウムキレートまたはエクオリン）のいずれかにおける一方のパートナーである。
特に好ましいプライマー修飾は、捕捉修飾または検出修飾としてのビオチンであ
る。プライマーは、さらなる配列領域Ｙを、特にその５’末端に含有することが
できる（図２）。この場合、５’−３’結合ならびに５’−５’結合および／ま
たは５’−２’結合が可能である。さらに、プライマーは、スペーサー、固定可
能な基または分子の溶解性媒介部分などのさらなる構造成分を有することができ
る。あるいは、プライマーは、プライミング活性に関して、ＡＰ部位などの活性
化され得る領域を有することができる。

【００４３】 プローブは、塩基−塩基の相互作用の結果として核酸とハイブリダイズするこ
とができる分子として理解される。従って、好ましいプローブは、オリゴヌクレ
オチドおよび塩基含有核酸擬似物〔ペプチド核酸（ＰＮＡ）など〕である。結合
配列Ｄに関するプローブの長さは、好ましくは９塩基〜３０塩基の間である。

【００４４】 正電荷または負電荷を骨格および／またはスペーサーに有するか、あるいはそ
のような電荷を有さないＰＮＡオリゴマープローブは、異なる骨格構造およびＨ
末端またはＮＨ₂ 末端の異なる構造のためにヌクレアーゼまたはプロテアーゼに
よる分解に耐性であり、そして核酸とＰＮＡとの結合複合体において、２つの核
酸分子との間の場合よりも高い融解温度を有し、従ってハイブリッド複合体はよ
り安定であるというさらなる利点を有する。そのようなオリゴマープローブは、
低い塩濃度で使用することができ、ミスマッチの場合に融解温度の大きな差が存
在し、従ってより良好なミスマッチの識別が可能であり、二次構造を有する配列
を低い塩濃度でより容易に認めることができ、アンプリコンと反対の鎖とプロー
ブとの競合が低い塩濃度でより低くなり、従ってより大きなシグナルの生成が達
成され、そしてアンプリコン変性工程を低塩濃度では除くことができると考えら
れる。

【００４５】 増幅に依存した伸長産物および／または増幅された核酸配列の結合を可能にす
る１価または多価の媒介因子は、プローブとして使用することができる。検出対
象の核酸に反平行的に結合するオリゴマーまたはポリマーは、好ましくは、プロ
ーブとして使用することができる。検出対象の核酸またはその相補体にプローブ
の少なくとも一部が結合する結果として、その後の反応において、検出対象の核
酸またはその相補体の一方の鎖または両鎖に対する安定な結合をもたらすオリゴ
マーは、プローブとして特に好ましく使用される。オリゴマーは、５’−３’結
合ならびに５’−５’結合および／または５’−２’結合、あるいはスペーサー
または分子の溶解性媒介部分などのさらなる構造成分を有することができる。

【００４６】 結合配列は、好ましくは、塩基−塩基の相互作用を介して、特定の核酸、プラ
イマーまたはプローブに結合する、特定の核酸、プライマーまたはプローブの最
も外側の塩基間に位置する塩基の配列（この最も外側の塩基を含む）として理解
される。

【００４７】 プローブとして使用される媒介因子は、１つまたは複数の検出対象の核酸また
はその相補体に関して、特に増幅物の一方の鎖に関して、１つまたは複数の結合
配列Ｄを含有することができ、そして配列修飾、末端および／または内部の配列
伸長、および／または他の修飾、例えば、天然または人工的なヌクレオチドアナ
ログまたはその均等物、非機能的なヌクレオチドアナログまたはその均等物、あ
るいは塩基アナログまたはその均等物などを含むことができる。そのような媒介
因子は、増幅物の一方の鎖に対する結合が可能である場合に、メチル化、キャッ
プ化またはポリアデニル化、または他の方法で修飾することができる。好ましい
ヌクレオチド均等物は、正電荷および／または負電荷を骨格および／またはスペ
ーサーに有するか、あるいはそのような電荷を有さないＰＮＡモノマーまたはＰ
ＮＡオリゴマーである。プローブとして使用される媒介因子は、検出および／ま
たは固体支持体への結合に直接適するか、あるいはさらなる結合対を介して間接
的に適する修飾を有することができる。好ましいプローブ修飾（検出可能な基Ｌ
、固定可能な基Ｉ）は、蛍光性色素（例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ａ
ＭＣＡ、またはその誘導体）、結合対（ビオチン：（ストレプト）アビジン、ジ
ゴキシゲニン：抗ジゴキシゲニン、ジゴキシゲニン：抗ジゴキシゲニン結合エク
オリン、フルオレセイン：抗フルオレセインまたはルテニウムキレートまたはエ
クオリン）である。特に好ましいプローブ修飾は、捕捉修飾または検出修飾とし
てのビオチン、検出修飾としてのジゴキシゲニン、ルテニウムまたはルテニウム
キレートまたはエクオリンである。

【００４８】 本発明において、複数の増幅物を作製することが目的とされる核酸セグメント
は、領域Ａ、ＢおよびＣの３つが含有されるように選択される。領域Ａおよび領
域Ｃは、１つのプライマーがその結合配列として配列Ａを使用することができ、
そして領域Ｃの相補体がもう一つのプライマーの結合配列として作用し得るよう
に選択される領域である。本発明の意味において相補体は、特定の他の核酸、例
えば、増幅物の配列領域または検出対象の核酸の配列領域に対して本質的に相補
的である核酸または核酸配列として理解される。

【００４９】 本質的に相補的とは、塩基対が、（別の核酸、例えば、プローブまたはプライ
マーとのハイブリダイゼーションの場合）ハイブリダイゼーションが試験条件の
もとで依然として生じ得るように、あるいは（使用されるテンプレートに関する
プライマーの伸長産物の場合）対応する核酸を使用するプライマー伸長反応によ
って核酸を生成させることが可能であるように選択されることを意味する。従っ
て、本質的に相補的とは、多くの場合、問題とする核酸または配列の９０％を超
える塩基が、ストリンジェントな条件のもとで特定の核酸または配列と塩基対を
形成することができることを意味する。

【００５０】 領域Ａおよび領域Ｃは、好ましくは、本発明に従って十分な長さであり、対応
する長さのプライマーがこれらの領域内の塩基とハイブリダイズすることができ
る条件を見出すことができる。従って、そのような領域は、好ましくは８ヌクレ
オチドよりも長く、特に好ましくは１２ヌクレオチドよりも長い。領域Ａおよび
領域Ｃの長さの上限に関して、本発明の意味において好ましい範囲もまた存在す
る。領域Ａおよび領域Ｃは、それぞれ、好ましくは３０ヌクレオチドよりも短か
く、特に好ましくは２０ヌクレオチドよりも短い。本発明の特別な局面において
、そのような領域の上限の長さは、プライマーが、検出対象の核酸に関して非特
異的な様式でそのような領域にハイブリダイゼーションし得るという事実によっ
て制限される。従って、結合配列ＡおよびＣの特に好ましい長さは、１２ヌクレ
オチド〜２０ヌクレオチドである。領域Ａおよび領域Ｃは、検出対象の核酸にお
いて重複しない。本発明の目的のために、（アンプリコンに対応する）検出対象
の核酸セグメント、および従って、これから形成される増幅物は、領域Ａおよび
領域Ｃの間に位置する配列Ｂを含有する（図１〜図３）。この配列は、１ヌクレ
オチドまたは数ヌクレオチドの長さ、好ましくは４ヌクレオチドよりも長い長さ
、特に好ましくは８ヌクレオチドよりも長い長さを有する。配列Ｂの最大の長さ
は、プローブの結合配列に属するヌクレオチドが存在してはならないという要求
によって、そして本発明の特定の態様においてはプローブの所望の非特異性によ
って制限される。従って、配列Ｂは、好ましくは３０ヌクレオチドよりも小さく
、特に１５ヌクレオチドよりも小さい。配列Ｂは、好ましくは、４ヌクレオチド
〜３０ヌクレオチドの間の長さを有する。配列Ｂの長さは、特に好ましくは、８
ヌクレオチド〜１５ヌクレオチドの間である。この配列またはその相補体はまた
、本発明の目的のためのプローブと結合するように作用する。プローブの長さは
、増幅物とのハイブリダイゼーションが可能であるように選択される。プローブ
の配列は、アンプリコンとの塩基−塩基相互作用を形成するプローブのヌクレオ
チドによって、特に、アンプリコンの最も外側の対応する塩基との塩基相互作用
を有するプローブのヌクレオチドによって規定される結合配列Ｄが含まれるよう
に選択される。プローブは、増幅物の結合配列Ｅのヌクレオチドに対して本質的
に相補的である。結合配列Ｄまたはその相補体Ｄ’は、増幅物に対して１００％
相補的であり得るが、結合配列の外側端の間でのミスマッチをも有し得る。結合
配列に加えて、プローブは、さらなる基または残基または核酸結合領域を含有す
ることができる（図３、Ｖ、ＶＩ）。

【００５１】 様々な例を、領域Ｂの長さおよび結合配列Ｄまたは結合配列Ｄ’の長さに依存
して構築することができる。第１の例において、結合配列Ｄまたは結合配列Ｄ’
は、アンプリコンの領域Ｂまたは領域Ｂ’よりも長い。この場合、結合配列Ｄま
たは結合配列Ｄ’は、アンプリコンの領域Ａまたは領域Ａ’および領域Ｃまたは
領域Ｃ’の一方または両方にまで広がる。これらの例を図３のＩＩ〜ＩＶに示す
。これらの場合、増幅物は、互いに反対方向を向く、結合配列Ｅまたはプライマ
ーの結合配列に属さないヌクレオチドを領域Ａおよび領域Ｃの末端の間に含まな
い。図３のＩＩおよびＩＩＩにおいて、プローブの結合配列Ｄは、プライマーの
２つの結合配列の一方と重複する。

【００５２】 さらなる例において、領域Ｂの長さは、プローブの結合配列がプライマーの結
合配列と重複しないように領域Ｄの長さに対応する。

【００５３】 好ましい態様において、本発明による方法は、３成分のミニアンプリコン〔三
成分ミニアンプリコン（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｍｉｎｉ−ａｍｐｌｉｃｏｎ）
〕の形成を含む。このミニアンプリコンは、プライマーおよびプローブと結合す
る配列以外に、さらなる配列を有さず、従って、より長い核酸増幅産物が形成す
るという欠点が避けられ、その一方で、全体的な増幅形式の特異性が、プライマ
ーが結合することによって、プローブが結合することによって、そしてすべての
４ヌクレオチドまたは塩基の特異性あるいは天然または人工的なアナログ、異性
体またはその均等物による標的依存的な酵素的伸長反応が行われることによって
確保される。従って、本発明による増幅方法はまた、ミニ連鎖反応（ＭＣＲ）と
呼ばれる。

【００５４】 下記において別途言及されない場合、検出対象の核酸配列またはその相補体の
増幅は、当業者に知られている反応工程および反応条件を使用して行われる。従
来の方法との１つの相違点は、３成分ミニアンプリコンの形成および増幅を可能
にする特別に選択されたプライマー配列およびプローブ配列を使用することであ
る。本発明の必要不可欠な特徴は、検出対象の核酸または３成分ミニアンプリコ
ンのプライマー結合配列またはその相補体に結合する１つまたは複数のプライマ
ーを加えることである。

【００５５】 増幅を可能にする増幅試薬を加えることは一般的である。酵素的に活性成分（
例えば、酵素）は、伸長基質および適切な補助試薬（緩衝液など）との組合せで
、好ましくは、増幅試薬として使用することができる。好ましい伸長基質は、核
酸構成成分あるいはその天然または人工のアナログまたは異性体またはそれらの
均等物である。検出対象の核酸の相補鎖を構築するのに好適な薬剤は伸長基質と
して使用される。ヌクレオチドは、好ましくは、伸長基質として使用される。好
ましいヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよび／また
はｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、ｉｓｏ−ｄＧＴＰ、ｉｓｏ−ｄＣＴＰ、ｄｅａｚａ−ｄ
ＧＴＰ、ならびにＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよび／またはＩＴＰ、ｄｅ
ａｚａＧＴＰ、ｉｓｏ−ＧＴＰ、ｉｓｏ−ＣＴＰである。均等物は、正電荷およ
び／または負電荷を骨格および／またはスペーサーに有するか、あるいはそのよ
うな電荷を有さないＰＮＡモノマーまたはＰＮＡオリゴマーである。上記のよう
に、伸長基質はまた修飾を有することができる。

【００５６】 ＰＣＲの場合、特に好ましい核酸増幅試薬は、準安定性または熱安定性の酵素
ＤＮＡポリメラーゼ活性の混合物、ならびにデオキシリボヌクレオチドおよび／
またはリボヌクレオチドおよび適切な補助試薬の混合物であり、例えば、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよび／またはｄＵＴＰおよび補助試薬（例
えば、塩および任意の界面活性剤など）との組合せのＴａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼである。ＲＴ−ＰＣＲの場合において特に好ましく使用される増幅試薬は、熱
安定性酵素の逆転写酵素活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性の混合物、複合体ま
たはドメイン、ならびにデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドおよ
び適切な補助試薬の混合物であり、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＴＴＰおよび／またはｄＴＵＰおよびＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよび補
助試薬（例えば、塩および任意の界面活性剤など）との組合せのＡＭＶ逆転写酵
素またはＭｏ−ＭＬＶ逆転写酵素あるいはＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼである。

【００５７】 ２相サイクルまたは３相サイクル（好ましくは、２相サイクル）が、温度サイ
クル増幅反応（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）のために行われる。２相サイク
ルにおいて、核酸増幅産物の鎖の分離は、高い温度で、好ましくは８５℃〜９５
℃で行われる。一般的なプライマーアニーリングおよびプライマー伸長は、プラ
イマーと伸長鎖との融解温度に近い温度で、好ましくは５２℃〜７５℃の間の温
度で行われる。鎖の分離は、エネルギーを供給することおよび／または酵素的に
行われ、好ましくは、加温、マイクロ波、または微小電極による電位を加えるこ
とによって行われ、特に好ましくは、加温によって行われる。６０回までの温度
サイクルが行われるが、好ましくは３２回〜４２回である。等温増幅反応（例え
ば、ＳＤＡ）の場合、連続的なインキュベーションが、平均温度が３０℃〜７０
℃の間で、好ましくは３７℃〜４５℃で、酵素の混合物、複合体またはドメイン
を用いて、あるいは６０℃〜６５℃で中度高温安定性酵素の混合物、複合体また
はドメインを用いて行われる：ＳＤＡの場合、例えば、バチルス ステアロサー
モフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から
得られる中度高温安定性の制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ（
例えば、ＢｓｏＢＩ／ＢｓｔＤＮＡ−Ｐｏｌ ｅｘｏ）を用いて行われる；別の
酵素としてはＡｖａＩおよびＢｃａＤＮＡ−Ｐｏｌ ｅｘｏである。インキュベ
ーションは２時間まで行われ、好ましくは３０分〜６０分である。増幅反応は、
反応容器、キャピラリー、または統合された反応チップの一部でもあり得る小型
化された反応チャンバーで行うことができる。

【００５８】 ｄＵＴＰがｄＴＴＰの代わりに使用されるか、あるいはｄＴＴＰに加えて使用
される場合、ｄＵＭＰが、ｄＴＭＰの代わりに、ＤＮＡポリメラーゼ活性によっ
て、増幅された核酸配列またはその相補体に取り込まれる。これによって、増幅
産物のフラグメント化が可能になり、従って、核酸増幅ユニットとしてのその特
性のフラグメント化が、ウラシルデグリコシラーゼの酵素活性を用いることによ
って、好ましくは、酵素活性の再生が熱変性の後でよりゆっくり生じる熱安定型
の酵素活性を用いることによって可能になる。ＵＭＰを含有する増幅産物のイン
キュベーションを、核酸の増幅反応および検出反応の後（滅菌）、および／また
は新しい核酸増幅反応の前（持ち込み防止）に行うことができる。

【００５９】 あるいは、ソラレン類および／またはイソソラレン類およびその誘導体は、Ｕ
Ｖ光による照射と一緒に使用して、核酸増幅産物を機能的に不活性化することが
できる。

【００６０】 ＮＡＳＢＡおよびＴＭＡの場合、酵素活性の逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ
、ＲＮアーゼＨおよびＲＮＡポリメラーゼの混合物、複合体またはドメイン、な
らびにデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドおよび適切な補助試薬
の混合物は、好ましくは、核酸増幅試薬として使用することができる。例えば、
ＡＭＶ逆転写酵素またはＭｏ−ＭＬＶ逆転写酵素、任意の大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼ、任意の大腸菌ＲＮアーゼＨ、およびＴ７、Ｔ３またはＳＰ６をコードする
ＲＮＡポリメラーゼ、あるいはＭｏ−ＭＬＶ逆転写酵素およびＴ７、Ｔ３または
ＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼ、または例えば、バチルス ステアロサーモフィラ
スから得られる適切な中度高温安定性酵素と、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＴＴＰおよび／またはｄＵＴＰおよびＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよび
補助試薬（例えば、塩および任意の界面活性剤など）との組合せ。ＮＡＳＢＡお
よびＴＭＡの場合における増幅反応は等温的に進行する。

【００６１】 増幅物の形成は、アンプリコンの結合配列Ｂに結合してハイブリッドを形成す
るプローブを用いて検出される。プローブは、捕捉プローブまたは検出プローブ
として作用することができる。プローブの結合配列の末端は、プライマー結合配
列の外側端の間である。従って、プローブは、増幅物の一方の鎖とハイブリダイ
ゼーションすることができる。

【００６２】 既知の条件をプローブ結合のために利用することができる。本発明による方法
は、核酸診断の分野の当業者に概略が知られているいわゆるハイブリダイゼーシ
ョン試験の特別な態様であるからである。実験の詳細は下記には詳しく記載され
ていないが、完全な参照は、「ヌクレイック アシッド ハイブリダイゼーショ
ン（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」（Ｂ．Ｄ．Ｈ
ａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年、
例えば、第１章（ハイブリダイゼーション法）、第３章（溶液ハイブリダイゼー
ションの定量的分析）および第４章（定量的なフィルターハイブリダイゼーショ
ン））、カレントプロトコルズ イン モレキュラーバイオロジー（Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｆ
．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ、１９８７年）、
およびモレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（Ｊ
．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、ＣＳＨ、１９８９年）になされる。知られている方法
には、修飾オリゴヌクレオチドおよび非修飾オリゴヌクレオチドの化学的合成、
ならびに特に、ハイブリダイゼーションし得る核酸間の相同性の程度、それらの
ＧＣ含量およびそれらの長さに依存する特異性が達成され得るハイブリダイゼー
ション条件の選択もまた含まれる。

【００６３】 この目的のために、（保護された形態の）捕捉プローブが既に前もって加えら
れていない場合、プローブは、増幅反応の後で、好ましくは溶液の形態で反応混
合物に加えられる。試薬条件は、プローブと増幅物とのハイブリダイゼーション
が可能であるように調整される。

【００６４】 アンプリコンの増幅された核酸配列および／またはその相補体とプローブとの
結合は、好ましくは、２０℃〜７５℃の間の一定温度で行われ、好ましくは結合
複合体の融解温度よりも約０℃〜３０℃低い温度で、特に好ましくは約０℃〜１
５℃低い温度で行われる。インキュベーション時間は４時間までであり、好まし
くは１５分〜１２０分であり、特に好ましくは３０分〜６０分である。増幅物お
よび／またはその相補体に対する結合は、先行技術の変性工程を用いて、あるい
は先行技術の変性工程を用いることなく行われる。先行技術の変性工程を伴わな
い反応手順は、好ましくは、負電荷および／または正電荷を骨格および／または
スペーサーに有するＰＮＡオリゴマーまたはそのような電荷を有さないＰＮＡオ
リゴマーに関して、低い塩濃度にて使用される。

【００６５】 いくつかのプローブ、または多官能性プローブ、または様々な検出対象の核酸
の増幅物もしくはその相補体のいくつかの結合配列を有するプローブが使用され
る場合、いくつかの異なる増幅物またはその相補体を結合させることが可能であ
る。この場合、好ましくは、類似する長さの３成分ミニアンプリコンの形成、特
に好ましくは同じ長さの３成分ミニアンプリコンの形成は、一様なインキュベー
ション条件を、様々な結合複合体を形成させるための核酸増幅において設定する
ことができる。これは、いくつかの核酸配列の多重方法での同時検出および／ま
たは連続的な検出を可能にする。多重増幅方法は、通常、核酸上の異なる配列（
例えば、遺伝子の異なる領域）、または例えば、異なる生物（例えば、異なるウ
イルス）に由来する異なる核酸での異なる配列のいずれかが１つの増幅混合物に
おいて同時に増幅される方法として理解されている。そのような方法は、反応条
件に対する大きな条件を必要とする。様々な配列の増幅は、信頼できる分析のた
めには類似する増幅効率を有しなければならないからである。本発明の主題は、
効率のばらつきをもたらす要因の１つを除くことである。この目的のために、ア
ンプリコンの長さは、好ましくは２０％を超えて異なることはなく、特に好まし
くは５ヌクレオチド以下である。

【００６６】 本発明による多重方法の特別な態様において、様々な配列のアンプリコンが調
製され、その後、形成されたアンプリコンのすべてが決定される。１つの標識を
すべての検出のために使用することができる検出方法が、好ましくは、このため
に使用される；従って、例えば、個々の増幅物に関するすべてのプローブは、例
えば、同じルテニウム複合体を用いて同一的に標識することができる。この手順
は血液銀行のサンプルを試験するのに特に好都合である。献血に関してサンプル
の可否を決定するのは感染タイプではなく、むしろ何らかの試験された感染（例
えば、ＨＩＶまたはＨＢＶ）が存在する場合には、サンプルが献血用材として既
に不適格とされているからである。

【００６７】 多重増幅方法では、本来の多重方法とそうでない多重方法とは区別される。本
来の方法とは異なる多重方法では、プライマーは、被検物である核酸の強く保存
された領域から、検出対象のすべての核酸配列が１組の（２個の）プライマーに
よって増幅されるように選択される。本来の多重方法では、３個以上のプライマ
ーの混合物が使用され、その内の少なくとも２個は異なる選択性を有する。その
ようなプライマーの１つまたはいくつかは、検出対象の核酸のすべてまたはその
一部に対して特異的であり得る。この方法は、関連性があまりない配列を同時に
増幅することを目的とする場合には特に好ましい。

【００６８】 検出対象の核酸配列（例えば、様々な属または種のウイルスまたは細菌の異な
る亜型）の非常に多くの組合せを多重方法で同時に増幅することができる。

【００６９】 増幅物とプローブとの間で形成される結合複合体は、特に様々な態様において
当業者に知られている方法、すなわち、例えば、分光学的方法または物理的方法
などの直接的な検出方法によって、配列決定することによって、あるいは不均一
型または均一型の試験形式によって検出することができる。

【００７０】 直接的な分光学的方法または物理的方法は、例えば、融解温度の測定、インタ
ーカレーション性または核酸結合性の色素または金属原子または粒子の結合、質
量分析、表面プラズモン共鳴または蛍光共役表面プラズモン共鳴またはＥ波測定
である。

【００７１】 結合した３成分ミニアンプリコンは、サンガーに従って、プライマーを結合さ
せ、その後、酵素的な配列決定を行うことによって配列決定することができる。
プライマーまたは鎖停止試薬のいずれかが、好ましくは、配列決定産物を検出す
るために標識される。配列決定産物はまた、質量分析によって検出することがで
きる。限られたヌクレオチドタイプのみが、プライマー端で隣接するヌクレオチ
ドに対応して加えられている場合には、多型の分析に特に好都合なミニ配列決定
を行うことができる。

【００７２】 不均一型の検出方法においては、プローブを、行われた修飾に依存する捕捉プ
ローブあるいは検出体プローブとして使用することができる。いくつかのプロー
ブが使用される場合、多重形式を行うことができる。

【００７３】 プローブが捕捉プローブとして使用される場合、プローブは、固体支持体に共
有結合的に予め結合させることができ、あるいは結合対によって予め結合させる
ことができ、そして増幅物とプローブとの結合複合体が固体支持体の表面で形成
される。この態様において、１つのタイプのプローブのみを含有する固体支持体
に加えて、いくつかのタイプまたは多数のタイプのプローブを含有する支持体を
使用することも可能である：例えば、プローブビーズまたはプローブ粒子（いわ
ゆる、ビーズ）、プローブ試験片、順に統合された反応チップの成分でもあり得
る固体支持体または小型化されたチップでのプローブパネルまたはプローブ配列
など。これらの担体結合型検出システムは多重形式に特に好適である。好ましい
態様においては、増幅物と捕捉プローブとの複合体は溶液中で最初に予め形成さ
れ、その後、固体支持体に結合させられる。この目的のために、アンプリコンは
、好ましくは、固相面に存在する基Ｒに結合し得る固定化可能な基Ｉを含有する
。

【００７４】 固相のタイプは、固定化を可能にする基Ｉに依存する。固相は、好ましくは、
結合する様式でＩと相互作用し得る固定化基Ｒを有する。固定化可能な基が、例
えば、ハプテンである場合、このハプテンに対する抗体をその表面に有する固相
を使用することができる。固定化可能な基がビオチンなどのビタミンである場合
、固相は、アビジンまたはストレプトアビジンなどの固定化された結合性タンパ
ク質を含有することができる。ビオチンおよびストレプトアビジンは、特に好ま
しい残基ＩおよびＲである。修飾された核酸における基による固定化は、固定化
が、例えば、ハイブリダイゼーション反応の場合よりも穏和な条件のもとで達成
され得るために特に好都合である。形成された核酸を固定化するために、反応混
合物を、核酸ハイブリッドの生成前、その生成途中またはその生成後のいずれか
において、容器の表面が固定化可能な基と相互作用することができる容器に入れ
ることは好ましい。固相は、反応混合物を適用することができる膜、織物または
フリースなどの多孔性材料の形態で使用することができる。ビーズ（例えば、磁
気粒子またはラテックス粒子）を使用することもできる。容器は、好ましくは、
キュベット、試験管またはマイクロタイタープレートである。固相は、プローブ
の固定化可能な基に関して、少なくとも、核酸ハイブリッド（従って、検出対象
の核酸）が存在するのと同じくらいの結合部位を有し得る。好ましい固相の製造
は、欧州特許出願公開第０ ３４４ ５７８号公報（ＥＰ−Ａ−０ ３４４ ５
７８）に記載されている（その内容のすべては本明細書で参照される）。

【００７５】 不均一型の検出反応の場合、液相は、固定化反応が生じたインキュベーション
期間の後に、容器、多孔性材料またはペレット化ビーズから除かれる。この固相
は、固相に対するハイブリッドの結合が非常に効率的であるので、続いて適切な
緩衝液で洗浄することができる。結合した結合複合体の検出は、核酸配列増幅反
応の途中でプライマーおよび／またはヌクレオチドおよび／またはプローブに取
り込まれた検出修飾による先行技術に従い、このような修飾に対する既知の直接
的または間接的なタイプの検出の助けによって行うことができる。

【００７６】 検出可能な基が蛍光標識などの基である場合、標識の量は、蛍光測定によって
測定することができる。検出可能な基が間接的に検出することができる場合、例
えば、ハプテン、修飾型核酸は、好ましくは、欧州特許出願公開第０ ３２４
４７４号公報（ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ４７４）に類似的に記載されているよう
に、ハプテンに対する標識抗体と反応する。抗体に対する標識は、例えば、発色
標識または蛍光標識または好ましくは酵素標識（β−ガラクトシダーゼ、アルカ
リホスファターゼまたはペルオキシダーゼなど）であり得る。酵素標識の場合、
核酸の量は、酵素の発色性基質、化学発光性基質または蛍光性基質との反応を、
通常は、光度的、化学発光測定的または蛍光測定的にモニターすることによって
測定される。測定されるシグナルは、最初から存在していた検出対象の核酸の量
、従って、例えば、検出対象の生物の量を示す。

【００７７】 好ましい態様において、増幅された３成分ミニアンプリコンは、マイクロタイ
タープレートまたは磁気粒子に共有結合的に固定化された核酸捕捉プローブまた
はＰＮＡ捕捉プローブによって結合される。この好ましい態様において、検出は
、結合複合体の形成および洗浄の後、増幅物における一方または両方のプライマ
ーに対するビオチン修飾により、アビジン・西洋ワサビペルオキシダーゼとＴＭ
Ｂ／ＴＭＦの発色基質混合物との結合によって行われる。

【００７８】 さらに好ましい態様において、ジゴキシゲニンの検出標識が、核酸増幅反応の
ヌクレオチドの１つを介して取り込まれる。増幅物とビオチン標識の核酸捕捉プ
ローブまたはＰＮＡ捕捉プローブとの結合複合体は、ストレプトアビジンがコー
ティングされた反応容器の表面に結合する。洗浄後、抗ジゴキシゲニン−西洋ワ
サビペルオキシダーゼ抗体の結合体を結合させて、発色試験が発色基質ＡＢＴＳ
を用いて行われる。

【００７９】 さらに好ましい態様において、１つまたはいくつかの増幅物は、共有結合（例
えば、アントラキノン：ＵＶ光結合、または金表面：ＳＨ結合）または配位結合
（例えば、ビオチン：ストレプトアビジン）による１つまたはいくつかの異なる
捕捉プローブを使用して結合させた後で、洗浄し、そして一次光によって、ある
いは表面プラズモン共鳴またはＥ波によって直接的に励起させられた蛍光シグナ
ルまたは化学発光シグナルを、例えば、ＣＣＤカメラまたは共焦点蛍光スキャナ
ーの助けにより検出することによって検出される。

【００８０】 プローブが検出プローブとして使用される場合、プローブは、増幅物が固相に
結合するのと同時、またはその前、またはその後のいずれかで固相に結合させる
ことができる。この場合、増幅物は、プライマーの一方または両方を介して、あ
るいは取り込まれたヌクレオチドを介して取り込まれた修飾によって固相に結合
する。洗浄および検出が続いて行われる。

【００８１】 さらなる態様において、増幅物と検出プローブとの複合体が最初に溶液中で予
め形成され、その後、固体支持体に結合され、そして洗浄される。増幅物と検出
プローブとの固相に結合した結合複合体は、プローブの検出修飾によって、これ
らの修飾に関する既知の直接的または間接的なタイプの検出の助けにより先行技
術に従って検出される。

【００８２】 好ましい態様において、ルテニウムキレートを含有する検出プローブは、プラ
イマーの一方または両方を介してビオチン修飾を含有する増幅物に結合する。検
出プローブは、ルテニウム標識されたオリゴヌクレオチドまたはルテニウム標識
されたＰＮＡオリゴマーのいずれかである。ルテニウム標識された検出プローブ
とビオチン標識された増幅物との結合複合体を形成させた後、複合体は、ストレ
プトアビジンがコーティングされた磁気粒子に結合させ、測定セルに移され、そ
して測定セル内の電極につけられる。電気化学的発光シグナルを発生させて測定
する。

【００８３】 検出プローブは、別の好ましい態様においてはジゴキシゲニンによって標識さ
れる。ジゴキシゲニン標識された検出プローブとビオチン標識された増幅物との
結合複合体を形成させた後、複合体は、マイクロタイタープレートまたは磁気粒
子に共有結合的に固定化された捕捉プローブによって結合する。結合複合体の形
成および洗浄の後、検出が、この好ましい態様においては、３成分ミニアンプリ
コンにおける一方または両方のプライマーのビオチン修飾により、アビジン・西
洋ワサビペルオキシダーゼとＴＭＢ／ＴＭＦの発色基質混合物との結合よって行
われる。

【００８４】 均一型反応形式が使用される場合、消光された蛍光標識、二本鎖複合体で活性
化可能な蛍光色素を伴う内部塩基置換、あるいは（隣接するプライマー端または
Ｅ−プローブ端：エネルギー転移複合体での適切なエネルギー供与体またはエネ
ルギー受容体との組合せでの）末端のエネルギー供与体またはエネルギー受容体
のいずれかを有する検出プローブが使用される。この場合、検出プローブは、核
酸増幅の途中で既に加えられている。消光された蛍光標識の場合、蛍光的活性化
が、検出プローブを、形成された３成分ミニアンプリコンに結合させ、そして蛍
光色素で修飾されたヌクレオチドをエキソヌクレオチド鎖分解して放出させた後
で脱消光することによって行われる。内部塩基置換の場合、蛍光シグナルは、検
出プローブと生成した３成分ミニアンプリコンとの結合複合体を形成させること
によって生じる。エネルギー転移複合体の場合、蛍光シグナルは、標識されたプ
ライマーおよび標識されたプローブが隣接して結合することによって生じる。得
られる蛍光シグナルは、それぞれの場合、好ましくは、リアルタイム測定によっ
て測定される。

【００８５】 好ましい態様においては、フルオレセインおよびローダミンまたはその誘導体
が、消光された検出体プローブの場合の蛍光成分および消光剤成分として使用さ
れる。さらなる態様において、ルテニウムまたはルテニウムキレートおよびキノ
ンまたはその誘導体であり、消光された検出体プローブにおける電気化学的発光
成分および消光剤成分として使用される。さらに好ましい態様において、アント
ラキノン（ａｎｔｈｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）またはその誘導体が検出体プローブの
内部塩基置換基として使用される。さらなる態様において、Ｃｙ−５およびフル
オレセインまたはその誘導体がエネルギー転移成分として使用される。特別な態
様においては、シアニン色素（例えば、ＳＹＢＲグリーンなど）またはアクリジ
ン色素が使用される。

【００８６】 プライマーおよびプローブの結合配列の少なくとも１つが検出対象の核酸に対
して特異的でない態様は、本発明のこの第１の態様の意味において特に好ましい
。配列は、その配列が、核酸塩基の連続した配列の結果として、原理的には、ス
トリンジェントな条件のもとで、検出対象の核酸における１つの配列にだけ結合
することができるが、検出され得ない他の生物または生物種もしくは生物群の核
酸には結合することができない場合には、本発明の意味において特異的である。
配列は、好ましくは、その配列が、試験を行うために使用される条件のもとで他
の核酸とハイブリダイゼーションすることができる場合には、配列に対して特異
的ではない。

【００８７】 本発明の前記の第１の態様とは関係なく、本発明の非常に重要な課題は、核酸
の特異的な検出方法である。この方法は、少なくとも２個のプライマーの助けに
よってこの核酸セグメントの複数の増幅物を作製する工程、この増幅物を、この
増幅物に結合することができるプローブと接触させる工程、および増幅物の鎖お
よびプローブから形成されたハイブリッドを検出する工程を含む：ただし、プラ
イマーの少なくとも１個は、検出対象の核酸に対して特異的ではない。この場合
、領域Ｂは、結合配列Ｅに含まれないヌクレオチドを含有することができる。し
かし、この場合、プライマーおよびプローブの結合配列が重複することもまた可
能である。

【００８８】 他のゲノム（配列）に対する相同性は、１つの規定された最初の配列によって
同定することができる。例えば、「ＢＬＡＳＴ」（ｂａｓｉｓ ｌｏｃａｌ ａ
ｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）という名の検索エンジンを使用す
ることができる。これは、インターネットを介して誰でもアクセスすることがで
きる（ホームページアドレス：＞ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎ
ｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／＜）。

【００８９】 これにより、様々な他の配列データバンクおよびタンパク質データバンクに対
するアクセスが可能になる。最も重要なデータバンクは： ｇｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＪＢ、ＰＤＢ、ＰＩＲおよびＳｗｉｓｓ−Ｐｒ
ｏｔである。

【００９０】 ＵＷＧＣＧ検索方法を使用するＡｌｔｓｃｈｕｌらによるＢＬＡＳＴＮ法〔１
９９０、ジャーナル オブ モレキュラーバイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．）２１５：４０３〜４１０〕も使用される。

【００９１】 検索手順はまた、例えば、ＥＭＢＬ配列データバンクなどの配列データバンク
に対して使用され、そして好ましくは、例えば、ｅｍ−ｖｒｌなどのウイルス配
列データバンクに対しても使用される。

【００９２】 Ｂｌａｓｔプログラムは、個々の検索が実施できるように多数の適応を使用者
に提供する。すなわち、１つまたはいくつかの被検物に対して特異的な配列また
は特異的でない配列を同定することができ、あるいは他の生物にも存在する配列
または他の生物には存在しない配列を同定することができる。これに関連して、
Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．、Ｗａｒｒｅｎ Ｇｉｓｈ、Ｗｅｂｂ
Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｍｙｅｒｓ、Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａ
ｎ（１９９０）、基本的な局所的配列検索ツール、ジャーナル オブ モレキュ
ラーバイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）４０３〜４１０もまた参照される
。驚くべきことに、検出方法の選択性は、特異的な標的に対する個々のプライマ
ーの選択性から得られるだけでなく、むしろシステム全体の累積的な選択性から
得られる。従って、２個のプライマーまたは２個のプライマーおよびプローブは
、個々に完全に非選択的であり得る：すなわち、多数の標的と個々にハイブリダ
イゼーションすることができる。しかし、個々のプライマーおよびプローブの選
択性は検出対象の核酸の中に付け加えられる（だけである）ので、これにより全
体的な特異性が得られる。しかし、プライマーの選択性は、増幅および検出対象
の核酸を選択するときにはそれほど厳密に定められていないので、その長さが完
全または実質的（すなわち、９５％を超えて）一致する種々の標的に対する短い
アンプリコンの位置を明らかにすることはかなり容易である。このことは、（核
酸プローブアレイの場合などにおける）同時に行われる増幅およびハイブリダイ
ゼーションがより容易になり、そしてより容易に再現されるようになる。

【００９３】 本発明はまた、本発明の方法を行うための試薬キットに関する。このキットは
複数のプライマーを含有し、そして好ましくは１個の検出プローブも含有する。
しかし、キットはまた、緩衝液および酵素（例えば、ポリメラーゼ）等のさらな
る試薬を含有することができる。

【００９４】 さらなる態様において、プライマーは、さらなる配列をその５’末端に有する
。このような配列は、１ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの長さであり、特に
好ましくは５ヌクレオチド〜８０ヌクレオチドの長さである。以前には、４０ｎ
ｔを超える長さのオリゴヌクレオチドをプライマーとして選択することは一般的
ではなかった。１つの態様において、このような配列は、検出対象の核酸におけ
るプライマー結合部位で核酸とちょうどハイブリダイゼーションすることができ
ないが、検出され得ない別の核酸とハイブリダイゼーションすることができるよ
うに選択される。このような配列は、これらの配列が、検出され得ない核酸にお
ける同じプライマーの結合部位に隣接する配列に相補的であるように選択するこ
とさえ可能である。従って、プライマーがヒトのゲノムに結合し得る場合、その
ような配列もまたヒトであり得る。プライマーの一方または両方さえも対応する
ように改変することができる。さらなる配列は、プライマーが、検出対象の核酸
（例えば、ＨＣＶゲノム）における結合配列とハイブリダイズすることが妨げら
れるような長さではない。さらなる配列はまた、プライマー結合部位における他
の配列よりも、プライマー結合部位におけるプライマーの短い部分配列と強固に
ハイブリダイゼーションするように選択することができる。従って、プライマー
における二次構造を解くことができ、そして検出対象の核酸に対するプライマー
の結合能は改善され得る。

【００９５】 プライマーおよびプローブを特異的に非選択的にする別の方法は、縮重する塩
基を配列内に使用することである。このためには、標的核酸がプライマーまたは
プローブとハイブリダイゼーションし得る領域を、標的配列と（例えば、別の微
生物の）検出対象の配列ではない別の配列との差が比較的ほとんどないように選
択することが適切である。残存する差は、縮重する塩基を異なる塩基位置で使用
することによって大部分は相殺することができる。従って、プライマー内の差（
ＡまたはＧ）は、塩基Ｐ〔６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロ−ピリミド［９，５−
Ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン、例えば、ヌクレイック アシッズ リサ
ーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ｖｏｌ．１７、２４
、１９８９、１０３７３頁〜１０３８３頁〕を取り込むことによって相殺するこ
とができる。これはピリミジンに適用される：この場合には、塩基Ｋが使用され
る〔ヌクレオライズ アンド ヌクレオタイズ（Ｎｕｃｌｅｏｒｉｄｅｓ＆Ｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、１６（７−９）、１５０７〜１５１１（１９９７）〕。
さらにより強い縮重が、イノシンは４塩基のすべてと塩基対形成が可能であるの
で、イノシンを使用することによって可能になる〔米国特許第５，５８５，４７
７号明細書（ＵＳ−Ａ−５，５８５，４７７）；米国特許第５，６９１，１３４
号明細書（ＵＳ−Ａ−５，６９１，１３４）；米国特許第５，５７８，４６７号
明細書（ＵＳ−Ａ−５，５７８，４６７）；ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６０，５、２６０５〜２６０８，
１９８５；ヌクレイック アシッズ リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．）１９９５、２３、１３、２４９９〜２５０５〕。

【００９６】 非相補的な塩基を使用するさらなる方法は、ＡをＤ（ジアミノプリン）と置換
すること、または／およびＣをＭ（メチルシトシン）と置換することである。

【００９７】 さらなる態様において、１つのプライマーの５’末端が、もう一方のプライマ
ーの５’末端に共有結合される。

【００９８】 ２つの異なる態様がこれに関して考えられる。１つの態様において、フォワー
ドプライマーおよびリバースプライマーが、同じ被検物を増幅するために一緒に
結合される。従って、増幅によって、２つの異なる増幅物の鎖がともに共有結合
された多数の構築物が得られる。２つのプライマー（部分）の一方のみが伸長し
た生成物が副産物として形成されるが、このような生成物もまた試験の基礎であ
り得る。

【００９９】 第２の態様において、２つの結合したプライマーを使用して、種々の検出対象
の核酸が増幅される（例えば、一方がＨＢＶに関し、もう一方がＨＧＶに関する
）。その場合、対応するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを増幅
のために加えなければならない。この場合、これらのプライマー配列の５’末端
は一緒に直接的に連結することができ、あるいはリンカーを介して連結すること
ができる。任意のタイプの分子をリンカーとして使用することができる：検出対
象の核酸における塩基間を特定の距離で維持することは重要でないからである。
しかし、リンカーは、好ましくは、結合体の溶解性に対して悪影響を有するほど
の疎水性を有さない。リンカーは、好ましくは、検出対象の核酸（１つまたは複
数）における対応する配列または他の配列と直接的には相補的でない１つまたは
いくつかのヌクレオチド配列を含有する。少なくとも１つの配列は、上記の（モ
ノ官能性）プライマーのさらなる配列に関する条件を満たす配列であることが特
に好ましい。

【０１００】 従って、これらの（二官能性）プライマー結合体はまた、被検物核酸の多重（
少なくとも二重）測定に好適である。原理的には、これらの結合体は既知の方法
で調製することができるが、好ましくは、まだ保護されていない個々の配列が最
初に化学合成され、次いで、個々の配列の末端の一方が活性化され、そしてそれ
以外の個々の末端の一方が脱保護される。カップリング反応は、活性化基の結果
として比較的自動的に進行し得るし、あるいは活性化試薬によって促進させるこ
とができる。

【０１０１】 しかし、結合体は、特に好ましくは、固相での連続的な逐次伸長によって、固
相から一時的に脱離することなく化学合成される。このために、最初の部分配列
は、３’−ホスホラミダイトを使用する通常の方法によって合成することができ
る。５’−ホスホラミダイトが、結合部位（５’−５’結合）から先の３’−ホ
スホラミダイトの代わりに使用される。これにより、結合体内での極性は反転す
る。一連の反応を例として図５に示す。この反応に必要な試薬を図６に示す。

【０１０２】 プライマーは、好ましくは、上記のように、結合配列Ａまたは結合配列Ｃ’に
結合する。プローブは、好ましくは、結合配列Ａおよび結合配列Ｃ’の末端の間
に位置する領域Ｂまたはその相補体に結合する。

【０１０３】 ２つのプライマーおよびプローブの３つの結合配列の中の少なくとも１つの配
列が、検出対象の核酸に対して特異的でないとしても、検出方法の全体の特異性
は保たれている。プライマー配列の１つが、検出対象の核酸に対して特異的では
ないが、他の核酸にも結合する場合、この核酸における第２のプライマー結合配
列が存在しないために、特異的な核酸増幅産物はそのような他の核酸に対して形
成され得ない。非特異的な核酸増幅産物は、プローブに対する特異的な結合配列
が存在しない場合にはそのような他の核酸について検出されない。第２のプライ
マー配列もまた、検出対象の核酸に対して特異的でない場合、特異的な核酸増幅
産物は、両方のプライマー結合配列が同じ核酸増幅ユニットに存在する場合に、
そのような他の核酸について形成されるだけである。この核酸増幅産物はまた、
プローブに対する特異的な結合配列が存在しないために検出されない。プローブ
配列が、検出対象の核酸に対して特異的ではなく、両方のプライマーが特異的で
ある場合には、そのような他の核酸の核酸増幅産物は形成されない。プローブ配
列に加えて、２つのプライマー配列の一方もまた検出対象の核酸に対して特異的
でない場合には、再度ではあるが、そのような他の核酸の核酸増幅産物は形成さ
れない。形成され得るそのような他の核酸の非特異的な核酸増幅産物は、他の配
列をプローブ結合領域に含有し、従って検出されない。２つのプライマーおよび
プローブに対する３つのすべての結合配列が、検出対象の核酸に対して特異的で
ない場合、２つのプライマー配列の少なくとも１つがそのような他の核酸の核酸
増幅ユニットに位置しない場合には核酸増幅産物は形成されない。プローブ配列
がそのような他の核酸に関して２つのプライマー配列の核酸増幅ユニットに存在
しない場合には、そのような他の核酸の特異的な核酸増幅産物が実際に形成され
得るが、これは検出することができない。そのような他の核酸の特異的な核酸増
幅産物が形成され、そして検出され得る唯一の場合は、３つのすべての配列が核
酸増幅領域内に存在するときである。しかし、これは、核酸増幅ユニットの配列
を適切に選択することによって、例えば、検出され得ない同じ生物の同じ座から
プライマーのハイブリダイゼーション部位をも選択しないことによって避けるこ
とができる。

【０１０４】 さらなる態様において、増幅物は、ヌクレオチドを使用して、特に好ましくは
、それぞれが、Ａ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴに相補的なモノヌクレオチドを使用
して得られる。検出対象の核酸の領域Ｂまたは領域Ｂ’は、好ましくは、４個の
すべての天然型核酸塩基を含有する。

【０１０５】 新規な方法のさらなる態様において、様々なプライマー−プローブの組合せの
部分成分（プライマーまたはプローブ）は、様々な検出対象の核酸に関して同一
にすることができる。これにより、１つの増幅反応物（多重増幅）を使用して、
例えば、ＨＢＶ、ＨＩＶおよびＨＣＶなどの異なるウイルスに対するいくつかの
核酸標的の測定が可能になる。本発明による方法の技術的な利点は、サンプルの
多数の測定において、測定値の大きな一致度が得られることである。

【０１０６】 下記に、本発明の２つの態様を、ＨＣＶ試験に基づいて記載する。ＨＣＶの核
酸配列は、例えば、欧州特許第０ ３１８ ２１６号明細書（ＥＰ−Ｂ−０ ３
１８ ２１６）に記載されている。その成分の配列を図４に示す。本発明による
方法によって、例えば、試験あたりのコピー数が１０コピーのＨＣＶゲノムの５
’非翻訳領域に由来するＨＣＶ−ＲＮＡなどのウイルス核酸の非常に特異的でか
つ非常に高感度な検出が、改善されたシグナル−ノイズ比による１０⁵ の作動範
囲で可能になる。これは驚くべきことである：プライマーおよびプローブが、当
業者により好まれるプライマー／プローブの設計を有しない試験において使用す
ることができるからである。すなわち、プライマーおよびプローブが、プライマ
ーの二量体または３’末端付近での塩基ミスマッチを形成しやすい配列部分を有
するからである。短いプローブは試験温度に近い融解温度を有し、従って、当業
者は、核酸増幅産物に対するプローブの安定な結合を予想していなかった。より
長い５成分の核酸増幅産物を使用する前記の試験においては、プライマー−プロ
ーブ配列は短くされ、かつ／またはシグナル生成成分を有する核酸増幅産物は短
くされるが、むしろそれらを伸ばすことによって特異性および感度を増大させる
ことは以前には試みられていなかった。

【０１０７】 驚くべきことに、ＨＣＶ陽性の血漿サンプルでＨＣＶ−ＲＮＡを特異的かつ再
現性良く検出することができる：この場合、ＨＣＶ−ＲＮＡは配列特異的に予備
精製されていないが、検出対象の核酸の短い増幅配列にもかかわらず、ガラス表
面によって濃縮された溶解血漿サンプルから直接使用された。ＨＣＶ陰性の血漿
サンプルはシグナルをもたらさない。これは驚くべきことである：ＨＣＶ−ＲＮ
Ａゲノムは血漿溶解物においてはフラグメント化を非常に受けやすいからである
。使用したプライマーおよびプローブはまた、例えば、ガラス表面によって同様
に濃縮されたＨＩＶ血漿サンプル、ＨＢＶ血清サンプル、尿から得られたクラミ
ジアサンプル、または全血から得られたヒトＤＮＡサンプルについてはシグナル
をもたらさない。

【０１０８】 本発明による方法を使用して、先行技術に関して記載されている欠点の１つま
たはいくつかを回避することができ、あるいは下記の利点の１つまたはいくつを
実現することができる。ＰＣＲサイクルをさらに一層短くすることができる。従
って、検出方法に要する全体的な時間をより短くすることができる。アンプリコ
ンの短い相補鎖と検出プローブとの競合／脱離がほとんど起こり得ないので試験
の感度を高めることができる。内部の検出体領域の相対的な割合がアンプリコン
全体に関して増大しているために試験の特異性は増大している。亜型間の識別能
を高めることができる。短いアンプリコンは非特異的なハイブリダイゼーション
に対する可能性がほとんどないので試験のバックグラウンドを低下させることが
できる。従って、シグナル−ノイズ比を大きくすることができる。ＲＮＡゲノム
における標的領域が小さいほど、ＲＮＡ分解に対する感度が小さくなるので結果
の再現性を大きくすることができる。二次構造を形成する可能性が低下する。

【０１０９】 本発明を、下記の実施例によって、より詳細に説明する。

【０１１０】 概略 使用したすべてのオリゴヌクレオチドは直鎖状で一本鎖である。

【０１１１】 実施例１ ヒト血液からのＨＣＶの検出 ａ）サンプルの調製： ＲＮＡを、下記のサンプル調製プロトコルを使用して血漿から単離した： １．血漿（４２０μｌ）を８０μｌのプロテイナーゼＫ（２５ｍｇ／ｍｌ）と混 合し、数秒間ボルテックスにかける。 ２．５００μｌの溶解緩衝液（１μｇのキャリアＲＮＡ（ポリＡ）／ｍｌ：５． ４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム；１０ｍＭの尿素；１０ｍＭのＴｒｉｓ −ＨＣｌ；２０％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む；ｐＨ４．４）を加える 。 ３．ボルテックスにかけ、次いで室温で１０分間振盪する。 ４．５００μｌのイソプロパノール−ＭＧＰ（イソプロパノール中の６ｍｇの磁 気ガラス粒子）を加える。 ５．ボルテックスにかけ、次いで室温で２０分間振盪する。 ６．ＭＧＰを磁石によって分離する。 ７．上清を除いて捨てる。 ８．７５０μｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ ｌ（ｐＨ７．５）；７０％のエタノール）を加える。 ９．ＭＧＰをボルテックスミキサーで再懸濁し、再度、磁石によって分離する。 １０．洗浄操作を５回（合計）繰り返す。 １１．１００μｌのＤＥＭＣ水を加えて溶出する。 １２．８０℃で１５分間振盪する。 １３．磁石によって分離する。 １４．１０μｌの溶出液をＲＴ−ＰＣＲにおいて使用する。

【０１１２】 ｂ）ＲＮＡ標準品のクローニングおよび調製： 野生型標準品の「ｐＨＣＶ−ｗｔ」を、プライマーＫＹ８０（５’−ｇｃａｇ
ａａａｇｃｇｔｃｔａｇｃｃａｔｇｇｃｇｔ−３’、配列番号：１）およびプラ
イマーＫＹ７８（５’−ｃｔｃｇｃａａｇｃａｃｃｃｔａｔｃａｇｇｃａｇｔ―
３’、配列番号：２）を使用してＨＣＶゲノムの一部を増幅することによって最
初に得た。続いて、アンプリコンを、いわゆる平滑末端クローニングによってベ
クターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋にクローニングした。細菌細胞を増殖させ
た後にプラスミドを単離し、制限酵素消化によって線状化し、そして対応するＲ
ＮＡフラグメントをインビトロ転写によって調製し精製した。

【０１１３】 該ＲＮＡを２６０ｎｍの吸光度を光度計で測定することによって定量した。

【０１１４】 本明細書に記載されているすべての分子生物学的方法は、関連する方法書籍〔
例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら；オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）
ら〕から採用することができる。

【０１１５】 ｃ）ＲＴ−ＰＣＲアッセイ 増幅を前記試薬及びサイクラープロトコルを用いて行った：

【０１１６】

【表１】

【０１１７】 増幅を下記のサイクラープロトコルに従って行った： １０分 ３７℃ ＵＮＧによる夾雑物除去 ３０分 ６０℃ 逆転写 １分 ９５℃ 変性

【０１１８】

【表２】

【０１１９】 ｄ）検出： 完全な検出反応を全自動的にＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）１０１０アナライザ
ー（ベーリンガーマンハイム ゲーエムベーハー社）で行った。概略を下記に示
す： １．１０μｌの増幅物および３５μｌの変性液（ＢＭ−Ｉｄ−Ｎｏ．１４６９０ ５３）を抜き取る。 ２．反応容器において３７℃で５分間インキュベーションする。 ３．２５ｎｇ／ｍｌのルテニウム標識プローブを含有する１３０μｌのハイブリ ダイゼーション液（ＢＭ−Ｉｄ−Ｎｏ．１４６９０４５）を加える。 ４．３７℃で３０分間インキュベーションする。 ５．３５μｌのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ＳＡ磁気ビーズ液（ＢＭ−Ｉｄ−Ｎ ｏ．１７１９５５６）を加える。 ６．３７℃で１０分間インキュベーションする。 ７．１２０μｌの反応混合物の電気化学的発光をＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）１ ０１０測定セルにおいて測定する。

【０１２０】 ２つの異なるルテニウム標識プローブをハイブリダイゼーションのために使用
した： ＰＮＡプローブ：Ｒｕ−（Ｓｅｒ）₂ −ＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ ＤＮＡプローブ：５’−Ｒｕ−ＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣ−３’、配列番号：５

【０１２１】 実施例２ ＲＮＡ標準品の稀釈系列に基づく分析感度の測定 １０¹ コピー、１０² コピー、１０³ コピー、１０⁴ コピーおよび１０⁵ コピ
ーのＨＣＶ−ＲＮＡ標準品を二連測定で増幅した。ＨＣＶ陰性の血漿、（サンプ
ル調製後の）ＨＣＶ陽性の血漿および水を対照として使用した。すべてのプロー
ブを増幅後に測定した（ＥＣＬ検出、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）１０１０）。

【０１２２】

【表３】

【０１２３】 ・プライマーＨＣ２Ｆ／ＨＣ１Ｆ−ｂｉｏの使用により、シグナルレベルで測定 すると、ＲＴ−ＰＣＲで非常に良好な増幅が得られた：Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録 商標）の全検出範囲を用いた（約５ｌｏｇステップ）。 ・希釈系列内でシグナルの非常に良好なグラデーションが得られる。 ・ＨＣＶ−陰性血漿及び水で測定したバックグラウンドが比較的低い。 ・ＰＮＡ並びにＤＮＡをプローブとして用い得る。

【０１２４】 実施例３ ＨＣＶアッセイの特異性試験 種々の出発核酸（ヒトゲノムＤＮＡ；ＨＩＶ−ＲＮＡ；ＨＢＶ−ＤＮＡ；クラ
ミジアＤＮＡ）を、上記のプライマーおよびプローブを使用して試験した。ＨＣ
Ｖ血漿を陽性対照として用い、ＨＣＶ陰性血漿および水を陰性対照として用いた
。

【０１２５】

【表４】

【０１２６】 ・両プローブ（ＰＮＡ、ＤＮＡ）のみが、対応する被検物によるＥＣＬ測定でシ グナルをもたらした。これは、使用するプライマー及びプローブによる非特異 的な増幅が検出されないことを意味する。

【０１２７】 実施例４ プローブの特異性試験 他の被検物の種々の増幅物を、この実験のために、それぞれの特異的なプライ
マーを使用して調製し、次いで上記のＰＮＡプローブおよびＤＮＡプローブを用
いてハイブリダイゼーションした。対応する被検物プローブをそれぞれの場合に
使用して、増幅物を調べた。

【０１２８】

【表５】

【０１２９】 ・対照反応（ＨＩＶ、ＨＢＶ、クラミジア）では、対応するプローブによる明確 な増幅物の検出を示した。 ・使用されたＰＮＡ及びＤＮＡプローブのみがＨＣＶとの特異的なシグナルを与 えた。 ・ＰＮＡ／ＤＮＡプローブは、他の増幅物との非特異的なハイブリダイゼーショ ンを起こさなかった。

【０１３０】 実施例５ ５’−５’結合オリゴヌクレオチド（３’−（プライマー−１）−５’−５’−
（プライマー−２）−３’）の合成 ５’−５’結合のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機モデル３９４Ａ（アプ
ライド バイオシステムズ社）において、アプライド バイオシステムズ社が推
奨する標準的な１μｍｏｌ合成サイクルを使用して合成する。下記の合成カラム
を使用する：対応する５’−Ｏ−ＤＭＴ保護初発ヌクレオシドで官能基化された
１μｍｏｌの支持体材料（１）（アプライド バイオシステムズ社から入手可能
）、及びプライマー１の配列に対する５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−ホスホラミダイ
ト（２）（アプライド バイオシステムズ社から入手可能）、及びプライマー２
の配列に対する３’−Ｏ−ＤＭＴ−５’−ホスホラミダイト（３）〔ユーロジェ
ンテック／グレン リサーチ社（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ／Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ）から入手可能〕を含有する合成カラム。この合成機には、ＡＢＩのマニ
ュアルで推奨される下記の合成試薬が取り付けられた（ボトル＃１〜＃４＝５’
−Ｏ−ＤＭＴ−３’−ホスホラミダイト２（０．１ＭのＭｅＣＮ溶液）、ボトル
＃５〜＃８＝３’−Ｏ−ＤＭＴ−５’−ホスホラミダイト３（０．１ＭのＭｅＣ
Ｎ溶液）、ボトル＃９活性化剤：テトラゾール（０．５ＭのＭｅＣＮ溶液）、ボ
トル＃１０濃アンモニア水、ボトル＃１１ｃａｐＡ：Ａｃ₂ Ｏ／ピリジン／ＴＨ
Ｆ、ボトル＃１２ｃａｐＢ：Ｎ−メチル−イミダゾール／ＴＨＦ、ボトル＃１４
、ＴＣＡのＤＣＭ溶液（２％）、ボトル＃１５酸化剤：Ｉ₂ ／Ｈ₂ Ｏ／ピリジン
／ＴＨＦ、ボトル＃１８ＭｅＣＮ、ボトル＃１９ＤＣＭ）（すべての試薬はアプ
ライドバイオシステムズ社から入手可能である）。合成の進行は合成機での定期
的なトリチル価測定により調べられる（自動分析）。合成サイクルが完了した後
、続いて、濃アンモニアを使用する支持体からの自動的な切断が行われる。切断
溶液を合成機での特別な切断容器に入れる。次いで、すべての保護基を切断する
ために５６℃の水浴で５時間加熱する。冷却後、溶液をロータリーエバポレータ
ーで濃縮する。オリゴヌクレオチドを、２５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭの
ＥＤＴＡ、０〜０．６ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５を溶出緩衝液として使用するタ
ンパク質Ｐａｋ ＤＥＡＥ ８ＨＲ（１０×１００ｍｍ）カラム（ウォータース
社）での調製用アニオン交換ＨＰＬＣにより精製する。オリゴヌクレオチドをＧ
ｅｎＰａｋ ＦＡＸ（１．６×１００ｍｍ）アニオン交換ＨＰＬＣカラム（ウォ
ータース社）で分析した。生成物画分を透析によって脱塩する〔ＭＷＣＯ １０
００、スペクトラポア社（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒｅ Ｃｏ．）〕。脱塩されたオ
リゴヌクレオチド溶液をロータリーエバポレーターで乾固して、滅菌水に溶解し
て、滅菌した０．２μｍフィルターでろ過する。濃度を２６０ｎｍにおけるＵＶ
分光法によって測定する。収量：７５ＯＤ。

【０１３１】 実施例６ 別のプライマーおよびプローブの組合せ 別法として、下記のプライマー領域およびプローブ領域に由来するプライマー
およびプローブを使用することができる： フォワードプライマー：３９０位〜４１７位の間の配列から選択される、 リバースプライマー：４２１位〜４４８位の間の配列から選択される、 プローブ：３９１位〜４４０位の間の配列から選択される；これらは、ＨＧＢＶ
−Ｂ配列に関して、ＥＭＢＬデータバンクｅｍ−ｖｒｌから得ることができる配
列ＨＧ２２３０４またはプロシーディング オブ ナショナルアカデミー オブ
サイエンス ユウエスエイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）
、１９９５、９２、３４０１〜３４０５および／またはジャーナル オブ バイ
ロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）６９：５６２１〜５６３０から得られる。図７に
示す配列はこの配列の３９０位〜４４８位に対応し、その結果、プライマーおよ
びプローブの位置は直接変換することができる。

【０１３２】 すなわち、好ましいプライマー／プローブの組み合わせは以下のようである：
以下の配列の１つから選ばれるフォワードプライマー：３９０〜４０６、３９０
〜４０８、３９１〜４０６、３９１〜４０８、３９２〜４０６、及び３９２〜４
０８、 以下の配列の１つから選ばれるリバースプライマー：４２７〜４４８、４２７〜
４４７、４２７〜４４６、４２８〜４４８、４２８〜４４７、４２８〜４４６、
４２９〜４４８及び４２９〜４４７、 以下の配列の１つから選ばれるプライマー：４０２〜４１２、４０１〜４１３、
４００〜４１４、３９９〜４１５、３９８〜４１５、３９７〜４１５、３９６〜
４１５、３９５〜４１５、３９４〜４１５、３９３〜４１５、３９２〜４１５、
３９１〜４１５、４０８〜４３６、４０８〜４３５、４０８〜４３４、４０８〜
４３３、４０８〜４３２、４０８〜４３１、４０８〜４３０、４０８〜４２９、
４０８〜４２８、４０９〜４３６、４０９〜４３５、４０９〜４３４、４０９〜
４３３、４０９〜４３２、４０９〜４３１、４０９〜４３０、４０９〜４２９、
４０９〜４２８、４１０〜４３６、４１０〜４３５、４１０〜４３４、４１０〜
４３３、４１０〜４３２、４１０〜４３１、４１０〜４３０、４１０〜４２９、
及び４１０〜４２８、又は好ましくは

【０１３３】 フォワードプライマー：３９０〜４０６、３９０〜４０８、３９１〜４０６、３
９１〜４０８、３９２〜４０６、及び３９２〜４０８由来の配列、 リバースプライマー：以下の配列の１つから選ばれる：４２３〜４４８、４２３
〜４４７、４２３〜４４６、４２３〜４４５、４２３〜４４４、 プローブ：以下の配列の１つから選ばれる：４０２〜４１２、４０１〜４１３、
４００〜４１４、３９９〜４１５、３９８〜４１５、３９７〜４１５、３９６〜
４１５、３９５〜４１５、３９４〜４１５、３９３〜４１５、３９２〜４１５、
３９１〜４１５、４０９〜４３３、４０９〜４３２、４０９〜４３１、４１０〜
４３３、４１０〜４３２、４１０〜４３１、４１０〜４３０、４１０〜４２９、
４１０〜４２８、４０９〜４３０、４０９〜４２９、４０９〜４２８、４０８〜
４３３、４０８〜４３２、４０８〜４３１、４０８〜４３０、４０８〜４２９、
及び４０８〜４２８又は特に好ましくは：

【０１３４】 フォワードプライマー：３９０〜４０６、３９１〜４０６、及び３９２〜４０６
由来の配列、 リバースプライマー：以下の配列の１つから選ばれる：４２３〜４４８、４２３
〜４４７、４２３〜４４６、４２３〜４４５、４２３〜４４４、 プローブ：以下の配列の１つから選ばれる：４０２〜４１２、４０１〜４１３、
４００〜４１４、３９９〜４１５、３９８〜４１５、３９８〜４１５、３９７〜
４１５、３９６〜４１５、３９５〜４１５、３９４〜４１５、３９３〜４１５、
３９２〜４１５、３９１〜４１５、４０９〜４３３、４０９〜４３２、４０９〜
４３１、４１０〜４３３、４１０〜４３２、４１０〜４３１、４１０〜４３０、
４１０〜４２９、４１０〜４２８、４０９〜４３０、４０９〜４２９、４０９〜
４２８、４０８〜４３３、４０８〜４３２、４０８〜４３１、４０８〜４３０、
４０８〜４２９、及び４０８〜４２８。

【０１３５】 これら全ての配列は、ＨＧＢＶ−Ｂゲノムから入手され、それゆえ、ＨＣＶと
選択的にはハイブリダイズしない。

【０１３６】 実施例７ ＨＩＶの検出 初期濃度が１ｍｌあたり１５０００ゲノム当量（ｇｅｑ）のＨＩＶを有するＨ
ＩＶ陽性血漿を出発材料として用いた。この血漿を陰性血漿で連続的に１０倍づ
づ稀釈した。サンプル調製を行った後、対応するプライマー対を用いてそれぞれ
を二連測定で増幅した。ＨＩＶ陰性血漿および水を対照として用いた。ＨＢＶ陽
性血漿およびＨＣＶ陽性血漿も処理して特異性を測定した。増幅後、すべてのプ
ローブを測定した（ＥＣＬ検出、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）１０１０）。

【０１３７】

【表６】

【０１３８】 注：ＳＫ及びＲＡＲはそれぞれＲｏｃｈｅプライマー／プローブで公表されてい る。ＧＨ−Ａ１からＧＨ−Ａ６はＨＩＶゲノムのｐｏｌ領域由来の新規なＭ ＣＲプライマーである。

【０１３９】増幅混合物及びサーモサイクラープロトコル マスターミックス：

【０１４０】

【表７】

【０１４１】 ＰＣＲ−サイクル： １０分 ３７℃ ＵＮＧ夾雑物除去 ３０分 ６０℃ 逆転写 ３０秒 ９５℃ 変性 ５サイクル １５秒 ９５℃ 変性 ２０秒 ５０℃ アニーリング／伸長 ３０サイクル １５秒 ９４℃ 変性 ２０秒 ６０℃ アニーリング／伸長 ７分 ７２℃ 伸長 ５０℃

【０１４２】

【表８】

【０１４３】 ・希釈系列内で非常に良好なシグナルのグラデーションが得られる。

【０１４４】 実施例８： ＨＢＶの検出 １０⁰ 、１０¹ 、１０² 、１０³ 、１０⁴ および１０⁵ のゲノム当量（ｇｅｑ
）のＨＢＶを二連測定で増幅した。ＨＢＶ陰性血漿および水を対照として用いた
。すべてのプローブを増幅後に測定した（ＥＣＬ検出、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商
標）１０１０）。

【０１４５】 ＨＢＶ陽性血漿のサンプル調製は、ＨＣＶに関して記載されたサンプル調製と
同様に行った。

【０１４６】

【表９】

【０１４７】 注：Ｒｅｆ．は参照プライマーであり、数字１〜５は新規なＭＣＲ−ＨＢＶプ ライマーである。

【０１４８】増幅混合物およびサーモサイクラープロトコル マスターミックス：

【０１４９】

【表１０】

【０１５０】 ＰＣＲ−サイクル： １０分 ３７℃ ＵＮＧ夾雑物除去 １０秒 ９５℃ 変性 ５サイクル １０秒 ５５℃ アニーリング １０秒 ７２℃ 伸長 １０秒 ９０℃ 変性 ３０サイクル １０秒 ６０℃ アニーリング １０秒 ７２℃ 伸長 ５０℃

【０１５１】 検出は、ＨＣＶに関して記載された検出と同様に行った。

【０１５２】

【表１１】

【０１５３】 ・ＭＣＲプライマーのシグナルは、参照と比較してかなり改善された挙動を示す 。 ・希釈系列内で非常に良好なシグナルのグラデーションが得られる。 ・ＨＢＶ陰性血漿及び水で測定したバックグラウンドは比較的低い。

【０１５４】

【配列表】

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー （Ｂ）ストリート：ザントホーフエルストラーセ １１６ （Ｃ）市：マンハイム （Ｅ）国：ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便番号：６８３０５ （Ｇ）電話番号：０６２１ ７５９ ４３４８ （Ｈ）テレファックス：０６２１ ７５９ ４４５７ （ｉｉ）発明の名称: 特異的かつ高感度な核酸検出方法 （ｉｉｉ）配列の数 : ５ （ｉｖ）コンピュータ可読フォーム : （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ 互換機 （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース ＃１．０， バージョン ＃１．３０（ＥＰＡ）

【０１５５】 （２）配列番号：１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４ 塩基対 （Ｂ）配列の型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）特徴を表わす記号：／ｄｅｓｃ＝「オリゴデオキシリボヌクレオ
チド」 （ｘｉ）配列：配列番号：１ GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGT 24

【０１５６】 （２）配列番号：２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）特徴を表わす記号：／ｄｅｓｃ＝「オリゴデオキシリボヌクレオ
チド」 （ｘｉ）配列：配列番号：２ CTCGCAAGCA CCCTATCAGG CAGT 24

【０１５７】 （２）配列番号：３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）特徴を表わす記号：／ｄｅｓｃ＝「オリゴデオキシリボヌクレオ
チド」 （ｘｉ）配列：配列番号：３ AGTTATGTGT GTCGTGCAGC C 21

【０１５８】 （２）配列番号：４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１８塩基対 （Ｂ）配列の型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）特徴を表わす記号：／ｄｅｓｃ＝「オリゴデオキシリボヌクレオ
チド」 （ｘｉ）配列：配列番号：４ TGGCTCTCCC GGGAGTGG 18

【０１５９】 （２）配列番号：５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１２塩基対 （Ｂ）配列の型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （Ａ）特徴を表わす記号：／ｄｅｓｃ＝「オリゴデオキシリボヌクレオ
チド」 （ｘｉ）配列：配列番号：５ CTCCAGGACC CC 12

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、検出対象の核酸における領域に関して、本発明の説明において使用さ
れている表記を概略的に示す。

【図２】 図２は、中間物として形成されるプライマー伸長産物ならびに増幅物（アンプ
リコン）に関する対応する表記を示す。図２はまた、検出対象の核酸から得られ
る配列の情報を含有する領域の外側に位置する１つまたはいくつかのさらなる領
域Ｙを、増幅物が有し得ることを示す。

【図３】 図３は、本発明におけるプライマーおよびプローブの結合配列の配置を概略的
に示す。結合配列が重複するかどうか、および結合配列がどのように重複するか
に依存して、様々な変法I 〜VIが存在する。増幅物の一方の鎖のみがそれぞれの
場合において示されている。同じ配置（相補的のみ）を増幅物の第２の鎖に関し
て構築することができる。中間物として形成される伸長産物に関する状況は類似
している。事例V および事例VIは、結合配列Ｄに加えて、プローブは、同じまた
は異なり得るが、増幅物との塩基対を形成しないさらなる領域Ｘを含有すること
を示す。先行技術の事例を比較のためにVII として示す、配列Ｚは５成分アンプ
リコンのさらなる配列を表す。

【図４】 図４は、利用される領域、すなわち、Ａ’、ＢおよびＣの配列を示す。

【図５】 図５は、５’−５−結合プライマーの合成を概略的に示す。

【図６】 図６は、図５で使用される化合物を示す。

【図７】 図７は、本発明による方法を行うためのＨＣＶゲノムの特に好適な領域、なら
びにプライマー配列およびプローブ配列が好ましく選択される配列を示す。この
第２の配列は、非ヒトの病原性ウイルスＨＧＢＶ−Ｂに由来する。従って、選択
されたプライマー配列およびプローブ配列は、ＨＣＶに関して特異的でない配列
である〔エム．メッド．バイロル．（Ｍ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．）４８、６０〜
６７〕。

【図８】 図８は、ＨＣＶ試験のプライマーおよびプローブに好ましい配列を示す。

【図９】 図９は、ＨＣＶ試験のプライマーおよびプローブに好ましい配列を示す。

【図１０】 図１０は、ＨＣＶ試験のプライマーおよびプローブに好ましい配列を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年１２月２２日（１９９９．１２．２２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 １９８ １４ ８２８．３ (32)優先日 平成10年４月２日(1998．4．2) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＵＳ (72)発明者 バルトル，クヌート ドイツ連邦共和国 ヴィーレンバッハ デ ー−82407 アム ヴェストエント ６ (72)発明者 オルム，ヘンリック デンマーク国 ヴォルロース デーカー− 3500 ヴィルドロスヴェイ ３ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA14 CA01 CA09 CA11 CA20 DA20 HA11 HA14 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ10 QQ42 QQ52 QR31 QR55 QR56 QR62 QR66 QS02 QS25 QS34

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸の検出方法であって、 一方が、該核酸の一方の鎖の結合配列（Ａ）に結合することができ、かつもう一
   方が、Ａの３’方向に位置し、Ａと重複しない配列Ｃと本質的に相補的である結
   合配列Ｃ’に結合することができる、２つのプライマーの助けにより該核酸の一
   部の多数の増幅物を作製する工程、 配列Ａと配列Ｃとの間に位置する配列Ｂまたはその相補体に結合することができ
   る結合配列Ｄを有するプローブと増幅物を接触させる工程、 増幅物とプローブのハイブリッドの形成を検出する工程、 を含み、 結合配列Ａと結合配列Ｃとの間に位置する配列が、プローブの結合配列Ｄおよび
   それに結合する増幅物の配列から形成される配列領域Ｅに属さないヌクレオチド
   を含まないものである、核酸の検出方法。
2. 【請求項２】 プローブの結合配列Ｄがプライマーの１つの又は両方の結合
   配列と重複するものである請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 プライマーの少なくとも１つが、検出対象の核酸またはその
   相補体と直接ハイブリダイズしない伸長不可能な部分にヌクレオチドを有するも
   のである、前記請求項の１つに記載の方法。
4. 【請求項４】 結合配列の少なくとも１つが検出対象の核酸に特異的ではな
   いものである、前記請求項の１つに記載の方法。
5. 【請求項５】 プローブの結合配列と反対向きである一方のプライマーの結
   合配列の一部から、やはりプローブの結合配列と反対向きであるもう一方のプラ
   イマーの一部までの結合配列の全長が１００ヌクレオチド未満である、前記請求
   項の１つに記載の方法。
6. 【請求項６】 プライマーの少なくとも１つが固定可能に標識されるもので
   あり、かつプローブが検出可能に標識されるものである、前記請求項の１つに記
   載の方法。
7. 【請求項７】 プライマーの少なくとも１つが検出可能に標識されるもので
   あり、かつプローブが固定可能に標識されるかまたは固定化されるものである、
   前記請求項の１つに記載の方法。
8. 【請求項８】 プローブが蛍光消光剤ならびに蛍光性色素により標識される
   ものである、前記請求項の１つに記載の方法。
9. 【請求項９】 プライマーの１つが第１のエネルギー転移成分により標識さ
   れるものであり、かつプローブが第１のエネルギー転移成分とは異なる第２のエ
   ネルギー転移成分により標識されるものである、前記請求項の１つに記載の方法
   。
10. 【請求項１０】 増幅物が物理的方法および／または分光学的方法により検
    出される、前記請求項の１つに記載の方法。
11. 【請求項１１】 プライマーの少なくとも１つが検出対象の核酸に特異的で
    ないものである、前記請求項の１つに記載の方法。
12. 【請求項１２】 ２つのプライマーが検出対象の核酸に特異的でないもので
    ある、請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 プローブが検出対象の核酸に特異的でないものである、請
    求項１１および１２の１つに記載の方法。
14. 【請求項１４】 それぞれＡ、Ｇ、ＣおよびＴに相補的なヌクレオチドを増
    幅に使用する、前記請求項の１つに記載の方法。
15. 【請求項１５】 核酸の検出方法であって、 一方が、該核酸の結合配列Ａに結合することができ、かつもう一方が、Ａの３’
    方向に位置し、Ａと重複しない配列Ｃと相補的である結合配列Ｃ’に結合するこ
    とができる、２つのプライマーの助けにより該核酸の一部の多数の増幅物を作製
    する工程を含み、かつ増幅物を質量分析により検出する、核酸の検出方法。
16. 【請求項１６】 核酸の特異的検出方法であって、 少なくとも２つのプライマーの助けにより該核酸の一部の多数の増幅物を作製す
    る工程、 増幅物に結合することができるプローブと増幅物を接触させる工程、ならびに 増幅物とプローブとのハイブリッドの形成を検出する工程、 を含み、プライマーの少なくとも１つが検出対象の核酸に特異的でないものであ
    る、核酸の特異的検出方法。
17. 【請求項１７】 ２つのプライマーが検出対象の核酸に特異的でないもので
    ある、請求項１６記載の方法。
18. 【請求項１８】 プローブが検出対象の核酸に特異的でないものである、請
    求項１６および１７の１つに記載の方法。
19. 【請求項１９】 それぞれＡ、Ｇ、ＣおよびＴに相補的なヌクレオチドを増
    幅に使用する、請求項１６〜１８の１つに記載の方法。
20. 【請求項２０】 核酸の一部の増幅物の同時作製方法であって、異なる配列
    を有するこれらの一部の増幅を可能にするプライマーを使用し、該プライマーが
    、形成される増幅物が長さで２０％を超えて異なることなく、かつ１００ヌクレ
    オチドを超えない長さであるように選択される、核酸の一部の増幅物の同時作製
    方法。
21. 【請求項２１】 ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶの増幅物および核酸が同時に
    作製される、請求項２０記載の方法。
22. 【請求項２２】 その配列が、図７のＨＧＢＶ配列の連続塩基の配列、それ
    に相補的な配列またはこれらの配列に８０％以上の同一性を有する配列に由来す
    る、プライマーおよびプローブを使用する、ＨＣＶの検出方法。