BRPI0710601A2 - seqüências de oligonucleotìdeo especìficas de neisseria gonorrhoeae - Google Patents

Abstract

<B>SEQüêNCIAS DE OLIGONUCLEOTìDEO ESPECìFICAS DE NEISSERIA GONORRHOEAE.<D> A presente invenção refere-se a seqúências de oligonucleotideos para iniciadores de amplificação e sondas de detecção e seus usos nos métodos de amplificação de ácido nucléico para a detecção seletiva e específica de Neisseria gonorrhoeae em amostras biológicas. A invenção também proporciona grupos de iniciadores de oligonucleotídeos e grupos de iniciador/sonda na forma de kits para a detecção e diagnóstico de infecção gonocócica. Os iniciadores e sondas de oligonucleotídeos da invenção também podem ser usados juntamente com outros iniciadores e sondas de ohgonucleotídeo específicos para a detecção simultânea de Neisseria gonorrhoeae e outros organismos alvos, tal como Chlamydia trachomatis.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SEQÜÊN-CIAS DE OLIGONUCLEOTÍDEO ESPECÍFICAS DE NEISSERIA GONOR-RHOEAE"

Pedidos de patente relacionados

Esse pedido reivindica prioridade do Pedido de patente Provisó-rio U.S.S.N. 60/790.197, requerido em 7 de abril de 2006, e intitulado "Neis-seria Gonorrhoeae Specific Oligonucleotide Sequences". O pedido de paten-te provisória é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

Antecedentes da invenção

Gonorréia é uma doença sexualmente transmitida (DST) causa-da pelo patógeno humano, Neisseria gonorrhoeae (gonococo), um diplococoaeróbico intracelular e gram-negativo que pode crescer e se multiplicar rapi-damente nas membranas mucosas. Infecções por gonococos permanecemcomo um problema de saúde global principal com mais de sessenta milhõesde casos reportados anualmente em todo o mundo (A.C. Gerbase et al.,Lancet, 1998, 351 (Suppl. 3): 2-4). De acordo com o Centro de Controle ePrevenção de Doenças (Centers for Disease Control and Prevention) (CDC),gonorréia é a segunda DST mais freqüentemente reportada nos EstadosUnidos, com quase 400.000 novos casos reportados a cada ano (CDC,"Summary of Notifiable Disease - United States. 2001", Morb. Mortal. WklyRep., 2001, 50: 1-108; CDC, "Sexually Transmitted Disease Surveillance,2001", U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, GA, 2002;CDC, "Sexually Transmitted Disease Surveillance, 2002", U.S. Departmentof Health and Human Services, Atlanta, GA, 2003). Como a clamídia, a bac-téria de DST mais prevalente nos Estados Unidos, gonorréia é substancial-mente sub-reportada, e é estimado que aproximadamente duas vezes maisinfecções ocorram a cada ano do que é reportado (H. Weinstock et al.,Persp. Sex. Reprod. Health, 2004, 36: 6-10). O sub-relato é substancial, pelomenos em parte, porque a gonorréia é assintomática em 30 a 60% das mu-lheres infectadas e até 10% dos homens infectados. Não-reconhecida e não-tratada, Neisseria gonorrhoeae pode permanecer infecciosa no hospedeiropor vários meses, o que pode facilitar sua disseminação e promover um re-servatório de infecção.

Quando elas estão presentes, os sintomas iniciais de infecçãogonocócica nas mulheres incluem disúria, descarga vaginal, sangramentovaginal entre os períodos e dor abdominal. Permanecendo não-tratada, asmulheres com gonorréia ficam em risco de desenvolver sérias complicaçõesda infecção, independentemente da presença ou severidade dos sintomas.Particularmente, gonorréia pode levar a uma infecção pélvica dolorosa e se-vera com inflamação das trompas de falópio e ovários chamada de doençainflamatória pélvica (PID) (E.W. Hook Ill e H.H. Handsfield, em "SexuallyTransmitted Diseases", K.K. Holmes et al. (Eds.), 35 Ed., 1999, pp. 451-466,McGraw-HiII: Nova Iorque, NY). PID pode causar danos permanentes àstrompas de falópio, útero e tecidos ao redor, o que pode levar à dor pélvicacrônica, infertilidade e gravidez ectópica potencialmente fatal (W. Cates Jr. etal, Am. J. Obstet. Gynecol., 1991, 164: 1771-1781; J. Coste et al, Fértil. Ste-ril., 1994, 62: 289-295; L. Westrom e P. Wolner-Hansen, Genitourin. Med.,1993, 69: 9-17). Nos homens, os sintomas iniciais mais comuns são disúria edescarga purulenta da uretra. A incubação média para a gonorréia é de a-proximadamente de 2 a 5 dias após o contato sexual com um parceiro infec-tado; entretanto, os sintomas podem aparecer até 30 dias depois. Neisseriagonorrhoeae pode se espalhar da uretra para outras porções do trato repro-dutivo masculino causando epididimite, prostatite e várias outras condições,tais como abscesso periuretral. Gonorréia não-tratada pode levar à constri-ção uretral, o que pode resultar em um fluxo reduzido de urina, no esvazia-mento incompleto da bexiga, infecção no trato urinário e, em última instân-cia, à falência renal. Raramente (em 1 a 3% das mulheres infectadas e umaporcentagem mais baixa de homens infectados) as bactérias se disseminamatravés do sangue causando artrite, bacteremia ou endocardite (E.W. HookIll e H.H. Handsfield, em "Sexually Transmitted Diseases", K.K. Holmes et al.(Eds.), 3~ Ed., 1999, pp. 451-466, McGraw-HiII: Nova Iorque, NY). Emboragonorréia seja conhecida primariamente como uma infecção sexualmentetransmitida, ela também pode ser transmitida a recém-nascidos durante adistribuição através de um canal do parto infectado. Isso pode causar ce-gueira, infecção nas juntas ou uma infecção sangüínea de risco de vida aobebê.

Embora os pacientes com qualquer doença sexualmente trans-mitida estejam em risco aumentado de co-infecção com outra DST, a co-infecção de clamídia e gonorréia é mais comum (até 40% das mulheres eaté 20% dos homens com gonorréia também são infectados com clamídia).Estudos epidemiológicos e biológicos proporcionam fortes evidências de queinfecções gonocócicas proporcionam uma suscetibilidade aumentada e facili-tam a transmissão do vírus da imunodeficiência humana (HIV) tanto em ho-mens quanto em mulheres (M.S. Cohen et al, Lancet1 1997, 349: 1868-1873;D.T. Fleming e J.N. Wasserheit1 Sex. Transm. Infect1 1999, 75: 3-17; K.A.Workowski e W.C. Levine1 Morb. Mortal. Wkly Rep., 2002, 51 (RR06): 1-80;T.A. Farley et al, J. Acquir. Immun. Defic. Syndr., 2003, 33: 642-648).

A detecção precoce é um componente essencial de programasde saúde pública para controlar a infecção gonocócica. As metas da detec-ção precoce e do tratamento precoce incluem a interrupção da cadeia detransmissão, a prevenção de seqüelas de longa duração e a redução da du-ração da infecciosidade para limitar o risco de co-infecção. A detecção pre-coce também pode prevenir o tratamento excessivo, o que é uma grandepreocupação devido à resistência ao antibiótico de N. gonorrhoeae difundida(CDC, "Fluoroquinolone-resistance in Neisseria gonorrhoeae, Hawaii, 1999,e decreased susceptibility to azithromycin in N. gonorrhoeae, Missouri,1999", Morb. Mortal. Wkly Rep., 2000, 49: 833-837; CDC, "Increases in fluo-roquinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae — Hawaii and Califórnia, 2001",Morb. Mortal. Wkly Rep., 2002, 51:1041-1044; CDC, "Increases in fluoroqui-nolone-resistant Neisseria gonorrhoeae among men who have sex with men— United States, 2003, e revised recommendations for gonorrhea treatment,2004", Morb. Mortal. Wkly Rep., 2004, 53: 335-338).

O isolamento de Neisseria gonorrhoeae em uma cultura celulartem sido o método tradicional para diagnóstico em laboratório e tem perma-necido como o método de escolha para modelos médico-legais devido à suaespecificidade. Entretanto, esse método requer condições de transporte es-tringentes para preservar a viabilidade da espécie e tem um tempo de rever-são de 2 a 3 dias. Em muitas colocações, a cultura celular tem sido substitu-ída por testes mais rápidos baseados na detecção de antígeno por rotulaçãocom anticorpo fluorescente direta, imunoensaios enzimáticos e ensaios deimunossorvência ligados à enzima (ELISA), os quais têm menos requerimen-tos de demanda por transporte e podem proporcionar resultados no mesmodia. Entretanto, esses métodos ainda são trabalhosos e gastam tempo e, demodo mais importante, não têm sensibilidade como ensaios de varredura,especialmente para pacientes assintomáticos.

Mais recentemente, testes de sonda de hibridização baseadosem ácido nucléico foram desenvolvidos para detecção direta de Neisseriagonorrhoeae. Esses testes oferecem uma maior especificidade, porém semmelhoria substancial na sensibilidade. Além disso, a maioria desses testessão efetuados em modelos endocervicais ou uretrais, os quais são obtidosusando procedimentos de amostragem invasivos. Ensaios de amplificaçãode ácido nucléico baseados na tecnologia de reação em cadeia da polimera-se (PCR), reação em cadeia da Iigase (LGR), amplificação de deslocamentode filamento (SDA) ou amplificação mediada por transcrição (TMA) são ago-ra disponíveis. Além do oferecimento de todas as vantagens de testes quenão são de cultura em termos de transporte de exemplares ambientes, au-tomação de lote e rápido tempo de processamento, esses ensaios propor-cionam uma maior especificidade e uma sensibilidade que se aproxima de100%. Além disso, eles podem ser efetuados em espécimes clínicos menosinvasivos, tal como urina. Todas essas vantagens tornam ensaios de amplifi-cação de ácidos nucléicos particularmente adequados para a detecção deinfecção gonocócica assintomática e como uma ferramenta de varredura.

Entretanto, os ensaios de amplificação de ácidos nucléicos exis-tentes para detecção de gonorréia ainda exibem certas desvantagens e limi-tações. As preocupações primárias envolvem resultados falso-negativoscausados pela presença de inibidores de amplificação em certos espécimese resultados falso-positivos devido à contaminação cruzada caso procedi-mentos de controle de qualidade rigorosos não sejam aplicados. Claramen-te, o desenvolvimento de ensaios de amplificação de ácido nucléico melho-rados para a detecção de infecção gonocócica permanece altamente dese-jável.

Sumário da invenção

A presente invenção é direcionada aos sistemas e métodos paraa detecção rápida, seletiva e específica de Neisseria gonorrhoeae em amos-tras biológicas. Particularmente, a invenção engloba reagentes que podemser usados para desenvolver testes de amplificação de ácido nucléico para adetecção e diagnose de infecção gonocócica. Mais especificamente, a in-venção proporciona seqüências de oligonucleotídeos que podem ser usadoscomo iniciadores de amplificação e/ou sondas de detecção para a detecçãoou de filamentos de seqüências de ácido nucléico-alvo no gene da estruturade leitura aberta - 1 (ORF1), o gene da citosina metiltransferase (dcmG) e ogene homólogo da proteína inversora de pilina (pivNG) de Neisseria gonor-rhoeae.

Mais especificamente, a presente invenção proporciona oligonu-cleotídeos isolados compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos se-lecionados do grupo consistindo das SEQ ID Nos: 1 a 52 (vide Tabela 1),quaisquer fragmentos ativos seus e quaisquer combinações suas.

Em certas modalidades, as seqüências de oligonucleotídeo dainvenção são fornecidas como grupos de iniciadores ou grupos de inicia-dor/sonda que podem ser usados em qualquer um dos vários ensaios deamplificação de ácidos nucléicos incluindo aqueles envolvendo detecção emtempo real e/ou multíplex.

A presente invenção também proporciona métodos para detectar

Neisseria gonorrhoeae em uma amostra de teste biológica. Geralmente, taismétodos compreendem o contato de uma amostra de teste suspeita de con-ter um ácido nucléico de Neisseria gonorrhoeae com pelo menos um oligo-nucleotídeo da invenção, de modo que o oligonucleotídeo pode hibridizar aoácido nucléico de Neisseria gonorrhoeae, caso presente na amostra; e a de-tecção de qualquer oligonucleotídeo hibridizado no ácido nucléico de Neisse-ria gonorrhoeae. A detecção da hibridização do oligonucleotídeo no ácidonucléico de Neisseria gonorrhoeae indica a presença de Neisseria gonorrho-eae na amostra.

Outros métodos da presente invenção compreendem o contatode uma amostra de teste suspeita de entrar em contato com um ácido nu-cléico de Neisseria gonorrhoeae com pelo menos um grupo de iniciadoresou grupo de iniciador/sonda aqui descrito e reagentes e reação de amplifica-ção para formar uma mistura reacional. A mistura reacional é, a seguir, colo-cada sob condições de amplificação de modo a amplificar toda ou uma por-ção do ácido nucléico de Neisseria gonorrhoeae, caso presente na amostrade teste, usando iniciadores do grupo de iniciadores ou grupo de inicia-dor/sonda para gerar amplicons de Neisseria gonorrhoeae. Os ampliconsresultantes de Neisseria gonorrhoeae podem ser detectados usando qual-quer uma de uma variedade de tecnologias de detecção. Em certas modali-dades, um híbrido é formado entre um amplicon de Neisseria gonorrhoeae euma sonda de detecção do grupo iniciador/sonda e detectado como umaindicação da presença de Neisseria gonorrhoeae na amostra de teste.

As seqüências de oligonucleotídeos da invenção podem ser u-sadas juntamente com outros iniciadores específicos e sondas em um for-mato de amplificação de ácido nucléico para a detecção simultânea de Neis-seria gonorrhoeae e outros organismo-alvo. Em certas modalidades, os ini-ciadores de amplificação e sondas de detecção da presente invenção sãousados juntamente com iniciadores e sondas específicos de Chlamydia tra-chomatis para a detecção simultânea de Neisseria gonorrhoeae e Chlamydiatrachomatis em amostras biológicas.

A presente invenção também proporciona kits compreendendoiniciadores de amplificação, sondas de detecção, grupos de iniciadores ougrupos de iniciador/sonda, conforme aqui descrito e, opcionalmente, reagen-tes de reação por amplificação.

Esses e outros objetos, vantagens e características da presenteinvenção se tornarão aparentes para as pessoas normalmente versadas natécnica tendo lido a descrição detalhada a seguir.Breve descrição dos desenhos

Tabela 1 (partes 1 e 2) mostra exemplos de seqüências do oli-gonucleotídeo específico da invenção derivados do gene de estrutura deleitura aberta 1 (ORF1) , seqüências do gene da citosina metiltransferase(dcmG) e do gene homólogo de proteína inversora de pilina (pivNG) deNeisseria gonorrhoeae. As posições no mapa e a No. da SEQ ID de cadaoligonucleotídeo são indicados na tabela.

Tabela 2 mostra os resultados de um ensaio de PCR "TaqMansingle-plex" usando nove grupos de iniciadores de amplificação e sondas dedetecção descritas na Tabela 1. Todos os grupos de iniciador/sonda foramconsiderados como sendo eficientes na detecção de Neisseria gonorrhoeae(GC), e não apresentaram reação cruzada com o DNA-alvo de Chiamydiatrachomatis (CT).

Tabela 3 é uma lista de 74 organismos intimamente relaciona-dos com Neisseria gonorrhoeae, que foram usados para testar a reatividadecruzada de alguns grupos iniciador/sonda da invenção.

Tabela 4 mostra os resultados de um ensaio kPCR TaqMan mul-tiplex, o qual foi usado para testar quinze (15) sorovariantes de Chlamydiatrachomatis (CT) e quarenta e seis (46) diferentes isolados de Neisseria go-norrhoeae (GC).

Definições

Através do relatório descritivo, vários termos são empregadosque são definidos nos parágrafos a seguir.

Os termos "individual", "indivíduo" e "paciente" são aqui utili-zados intercambiavelmente. Eles se referem a um indivíduo humano quetem sido hospedeiro de Neisseria gonorrhoeae, porém pode ou não estarinfectado com a bactéria. Os termos não denotam uma idade particular, edeste modo englobam adultos, crianças, recém-nascidos assim como fetos.

O termo "amostra de teste", conforme aqui utilizado, se refere aqualquer material líquido ou sólido suspeito de entrar em contato com ácidosnucléicos de Neisseria gonorrhoeae. Uma amostra de teste pode ser, ou po-de derivar de qualquer tecido ou fluido biológico que possa conter ácidosnucléicos de Neisseria gonorrhoeae. Freqüentemente a amostra será uma"amostra clínica", isto é, uma amostra obtida ou isolada de um paciente a sertestado quanto à infecção gonocócica. Tais amostras incluem, porém nãoestão limitadas, a fluidos corporais os quais contêm materiais celulares epodem ou não conter células, por exemplo, sangue, plasma, soro, urina, flui-do seminal, saliva, fluidos de cristalinos oculares, fluido linfático, fluido amni-ótico e similaress; amostras endocervicais, uretrais, retais, vaginais, vulvo-vaginais, nasofaríngeas e pulmonares; e amostras de arquivo com diagnós-tico conhecido. As amostras de teste também podem ser seções de tecidostais como seções congeladas. O termo "amostra de teste" também englobaqualquer material derivado pelo processamento de uma amostra biológica.Materiais derivados incluem, porém não estão limitados, a células (ou suasprogenias) isoladas da amostra, componentes celulares e moléculas de áci-do nucléico extraídas da amostra. O processamento de amostras biológicaspara obter uma amostra de teste pode envolver um ou mais de: filtração,destilação, centrifugação, extração, concentração, diluição, purificação, inati-vação de componentes interferentes, adição de reagentes e similaress.

Os termos "ácido nucléico", "molécula de ácido nucléico" e"polinucleotídeo" são aqui usados intercambiavelmente. Eles se referem aum polímero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo ou na forma defilamento único ou na forma de filamento duplo, e a não ser que seja estabe-lecido de outra forma, englobam análogos conhecidos de nucleotídeos natu-rais que possam funcionar de um modo similar aos nucleotídeos de ocorrên-cia natural. Os termos englobam estruturas tipo ácido nucléico com estrutu-ras sintéticas, assim como produtos de amplificação.

O termo "oligonucleotídeo", conforme aqui utilizado, se refere aum curto trecho de polímero de desoxirribonucleotídeo ou de ribonucleotí-deo. Oligonucleotídeos podem ser usados como iniciadores de amplificaçãoe/ou sondas de detecção. Tais trechos curtos de seqüências de ácido nu-cléico são geralmente quimicamente sintetizadas. Conforme será percebidopelas pessoas versadas na técnica, o comprimento de um oligonucleotídeo(isto é, a quantidade de nucleotídeos que ele contém) pode variar vastamen-te, geralmente dependendo de sua função de uso tencionada. Geralmente,oligonucleotídeos compreendem entre cerca de 5 e cerca de 150 nucleotí-deos, preferivelmente entre cerca de 15 e cerca de 100 nucleotídeos, maispreferivelmente entre cerca de 15 e cerca de 50 nucleotídeos.

O termo "isolado" ao se referir a um oligonucleotídeo, significaum oligonucleotídeo, o qual em virtude de sua origem de manipulação, éseparado de pelo menos alguns dos componentes com os quais ele estánaturalmente associado ou com o qual ele está associado quando inicial-mente obtido ou preparado. Por "isolado" se entende adicionalmente ou al-ternativamente que o oligonucleotídeo de interesse é produzido ou sintetiza-do pelas mãos do homem.

O termo "fragmento ativo", conforme aqui utilizado em referên-cia a um oligonucleotídeo (por exemplo, uma seqüência de oligonucleotídeoaqui fornecida) se refere a qualquer molécula de ácido nucléico compreen-dendo uma seqüência de nucleotídeos suficientemente homóloga a ou deri-vada da seqüência de nucleotídeo do oligonucleotídeo, a qual inclui menosnucleotídeos do que o oligonucleotídeo de comprimento total, e retém pelomenos uma propriedade biológica da seqüência inteira. Tipicamente, frag-mentos ativos compreendem uma seqüência com pelo menos uma atividadedo oligonucleotídeo de comprimento total. Um fragmento ativo ou porção deuma seqüência de oligonucleotídeo da presente invenção pode ser uma mo-lécula de ácido nucléico a qual é, por exemplo, de 10, 15, 20, 25, 30 ou maisnucleotídeos em comprimento e pode ser usada como um iniciador de ampli-ficação e/ou sonda de detecção para a detecção de Neisseria gonorrhoeaeem uma amostra biológica.

O termo "suficientemente homólogo", quando aqui utilizadoem referência a um fragmento ativo de um oligonucleotídeo, se refere a umamolécula de ácido nucléico que tem uma homologia de seqüência de pelomenos 35% em comparação com o oligonucleotídeo. em certas modalida-des, a homologia de seqüência é de pelo menos 40%, de pelo menos 60%,de pelo menos 80%, de pelo menos 90%, de pelo menos 95% ou mais.

Os termos "homologia" e "identidade" são aqui utilizados inter-cambiavelmente, e se referem à similaridade de seqüências entre duas mo-léculas de ácido nucléico. Os cálculos da identidade ou homologia porcentu-al de duas seqüências de ácidos nucléicos podem ser efetuados pelo ali-nhamento das duas seqüências para propósitos otimizados de comparação(por exemplo, intervalos podem ser introduzidos em um ou em ambas daprimeira e da segunda seqüência de ácidos nucléicos para alinhamento óti-mo e seqüências não-homólogas podem ser desconsideradas para propósi-tos de comparação). Em certas modalidades, o comprimento de uma se-qüência alinhada para propósitos de comparação é de pelo menos 30%, depelo menos 40%, de pelo menos 60%, de pelo menos 80%, de pelo menos90%, de pelo menos 95% ou 100% do comprimento da seqüência de refe-rência. Os nucleosídeos nas posições de nucleotídeos correspondentes são,a seguir, comparados. Quando uma posição na primeira seqüência é ocupa-da pelo menos nucleotídeo que a posição correspondente na segunda se-qüência, as moléculas são idênticas (ou homólogas) naquela posição. A i-dentidade porcentual entre as duas seqüências é uma função da quantidadede posições idênticas compartilhadas pelas seqüências, levando-se em con-sideração a quantidade de intervalos e o comprimento de cada intervalo, oqual necessita ser introduzido para um alinhamento ótimo das duas seqüên-cias.

A comparação das seqüências e a determinação da identidadeporcentual entre as duas seqüências pode ser efetuada usando um algorit-mo matemático. Por exemplo, a identidade porcentual entre duas seqüên-cias de nucleotídeos pode ser determinada usando o algoritmo de Meyers eMiller (CABIOS, 1989, 4: 11 - 17), o qual foi incorporado no programa A-LIGN (versão 2.0) usando uma tabela de resíduos de peso PAM120, umapenalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalode 4. A identidade porcentual entre duas seqüências de nucleotídeos pode,alternativamente, ser determinada usando o programa GAP no pacote deprogramas de computador GCG (disponível em HTTP://www.aca.com) u-sando uma matriz NWSgapdna.CMP.

O termo "hibridização" se refere à formação dos complexos en-tre as seqüências de nucleotídeos, as quais são suficientemente compie-mentares a formar complexos através do pareamento de base de Watson-Crick ou pareamento de base não-canônico. Quando um iniciador "hibridiza"com uma seqüência-alvo (molde), tais complexos (ou híbridos) são suficien-temente estáveis para servir à função iniciadora requerida, por exemplo, pelaDNA polimerase, para iniciar a síntese de DNA. Será percebido que as se-qüências hibridizantes não precisam ter complementaridade perfeita paraproporcionar híbridos estáveis. Em muitas situações, híbridos estáveis serãoformados onde menos do que cerca de 10% das bases são mausempare-lhamentos. Conseqüentemente, conforme aqui utilizado, o termo "comple-mentaridade" se refere a um oligonucleotídeo que forma um dúplex estávelcom seu complemento sob as condições de ensaio, geralmente onde hácerca de 90% ou mais de homologia. As pessoas versadas na técnica en-tendem como estimar e ajustar as condições de estringência ou hibridização,de modo que as seqüências com um nível pelo menos desejável de com-plementaridade irão hibridizar estavelmente, enquanto que aquelas com umamenor complementaridade não irão. Para exemplos de condições e parâme-tros de hibridização vide, por exemplo, J. Sambrook et al., "Molecular Clo-ning: A Laboratory Manual", 1989, Segunda Edição, Cold Spring HarborPress; Plainview, NY; F.M. Ausubel, "Current Protocols in Molecular Bio-logy", 1994, John Wiley & Sons: Secaucus, NJ.

Conforme aqui utilizado, o termo "amplificação" se refere a ummétodo ou processo que aumenta a representação de uma população deseqüências de ácido nucléico específicas em uma amostra. Métodos de am-plificação (tais como de reação em cadeia da polimerase ou PCR) são co-nhecidos na técnica e são discutidos em maiores detalhes abaixo.

Os termos "seqüência-alvo" e "ácido nucléico-alvo" são aquiutilizados intercambiavelmente. Eles se referem a uma seqüência de ácidosnucléicos, à presença ou ausência do qual sendo desejável para ser detec-tada. No contexto da presente invenção, uma seqüência-alvo preferivelmen-te inclui uma seqüência de ácido nucléico à qual os iniciadores de oligonu-cleotídeos irão complexar. A seqüência-alvo pode também incluir uma regiãohibridizante de sonda com a qual uma sonda irá formar um híbrido estávelsob as condições desejadas. Conforme será reconhecido por uma pessoanormalmente versada na técnica, uma seqüência-alvo pode ser de filamentoúnico ou de filamento duplo. No contexto da presente invenção, as seqüên-cias-alvo de interesse estão localizadas no gene de estrutura de leitura aber-ta 1 (0RF1), no gene da citosina metiltransferase (dcmG) ou no gene homó-logo de proteína inversora de pilina (pivNG) de Neisseria gonorrhoeae.

Os termos "iniciador" e "iniciador de amplificação" são aquiutilizados intercambiavelmente. Eles se referem a um oligonucleotídeo oqual é capaz de agir como um ponto de iniciação da síntese de um produtode extensão de iniciador que é um filamento complementar de DNA1 quandocolocado sob condições adequadas (por exemplo, tampão, salinidade, tem-peratura e pH) na presença de nucleotídeos e de um agente para a polimeri-zação de ácido nucléico (por exemplo, uma polimerase dependente de DNAou dependente de RNA). O iniciador é preferivelmente de filamento únicopara a eficiência máxima de amplificação, porém pode ser alternativamentede filamento duplo. Sendo de filamento duplo, o iniciador pode ser primeira-mente tratado (por exemplo, desnaturado) para permitir a separação de seusfilamentos antes de ser usado para preparar produtos estendidos. Tal passode desnaturação é tipicamente efetuado usando o calor, porém pode seralternativamente executado usando álcali, seguido por neutralização. Uminiciador típico contém cerca de 10 até cerca de 35 nucleotídeos de compri-mento de uma seqüência substancialmente complementar à seqüência-alvo.Entretanto, um iniciador também pode conter seqüências adicionais. Por e-xemplo, iniciadores de amplificação usados na Amplificação de Deslocamen-to de Filamento (SDA) preferivelmente incluem um reconhecimento de en-donuclease de restrição no sítio 5' da seqüência de ligação-alvo (vide, porexemplo, as Patentes Americanas Nos. 5.270.184 e 5.455.166). Amplifica-ção baseada em Seqüência de Ácido Nucléico (NASBA) e iniciadores deAmplificação Mediada por Transcrição (TMA) preferivelmente incluem umpromotor da RNA polimerase ligado à seqüência de ligação-alvo do iniciador.Os métodos para a ligação de tais seqüências especializadas a uma se-qüência-alvo de ligação para uso em uma reação de amplificação seleciona-da são bem-conhecidos na técnica.

Os termos "iniciador "forward"" e "iniciador de amplificação"forward"" são usados aqui intercambiavelmente, e se referem a um inicia-dor que hibridiza (ou anela) com o alvo (filamento molde). Os termos "inici-ador reverso" e "iniciador de amplificação reversa" são aqui utilizadosintercambiavelmente, e se referem a um iniciador que hibridiza (ou anela)com a filamento alvo complementar. O iniciador "forward" hibridiza com aseqüência-alvo 5' em relação ao iniciador reverso.

O termo "condições de amplificação", conforme aqui utilizadose refere às condições que promovem o anelamento e/ou a extensão dasseqüências do iniciador. Tais condições são bem-conhecidas na técnica edependem do método de amplificação selecionado. Deste modo, por exem-plo, em uma reação de PCR, as condições de amplificação geralmente com-preendem a ciclização térmica, isto é, a ciclização da mistura reacional entreduas ou mais temperaturas. Nas reações de amplificação isotérmica, a am-plificação ocorre sem a ciclização térmica, embora um aumento da tempera-tura inicial possa ser requerido para iniciar a reação. As condições de ampli-ficação englobam todas as condições reacionais incluindo, porém não selimitam, à temperatura e à ciclização da temperatura, tampão, sal, força iôni-ca, pH e similares.

Conforme aqui utilizado, o termo "reagentes reacionais de am-plificação" se refere aos reagentes usados em reações de amplificação deácido nucléico e pode incluir, porém não está limitado, a tampões, reagen-tes, enzimas com transcriptase reversa e/ou atividade da polimerase ou ati-vidade da exonuclease; cofatores enzimáticos, tais como magnésio ou man-ganês; sais; e trifosfatos de desoxinucleotídeo (dNTPs) tais como trifosfatode desoxiadenosina (dATP), trifosfato de desoxiguanosina (dGTP), trifosfatode desoxicitidina (dCTP), trifosfato de desoxitimidina (dTTP) e trifosfato dedesoxiuridina (dUTP). Reagentes de reações de amplificação podem serprontamente selecionados por uma pessoa versada na técnica dependendodo método de amplificação utilizado.Os termos "sonda" e "sonda de detecção" são aqui utilizadosintercambiavelmente e se referem a um oligonucleotídeo capaz de hibridizarseletivamente a pelo menos uma porção de uma seqüência-alvo sob condi-ções apropriadas (por exemplo, uma porção de uma seqüência-alvo que te-nha sido amplificada). Em geral, uma seqüência de sonda é identificada co-mo sendo ou "complementar" (isto é, complementar à filamento codificado-ra ou de sentido (+)) ou "complementar reverso" (isto é, complementar àfilamento anti-sentido (-)). Em certas modalidades, uma sonda de detecção émarcada com uma porção detectável.

Os termos "marcado" e "marcado com um agente detectável(ou porção)" são usados intercambiavelmente aqui para especificar queuma entidade (por exemplo, uma sonda de detecção de oligonucleotídeo)pode ser visualizada, por exemplo, seguindo a ligação a outra entidade (porexemplo, um amplicon ou produto reacional de amplificação). Preferivelmen-te, a porção ou agente detectável é selecionado de forma que ele gere umsinal o qual pode ser medido e cuja intensidade esteja relacionada com (porexemplo, proporcional) a quantidade de entidade ligada. Uma ampla varie-dade de sistemas para marcar e/ou detectar moléculas de ácido nucléicosão bem-conhecidas na técnica. Ácidos nucléicos marcados podem ser pre-parados pela incorporação de, ou conjugação a um rotulado que é direta-mente ou indiretamente detectável por meios espectroscópicos, fotoquími-cos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, óticos, químicos ou outros. A-gentes detectáveis adequados incluem, porém não estão limitados, a radio-nuclídeos, fluoróforos, agentes quimiluminescentes, micropartículas, enzi-mas, rotulados colorimétricos, rotulados magnéticos, haptenos, balizas mo-leculares e balizas de aptâmero.

Os termos "fluoróforo", "porção fluorescente" e "corante fluo-rescente" são usados intercambiavelmente aqui. Eles se referem a uma mo-lécula que absorve uma quantidade de radiação eletromagnética em umcomprimento de onda e que emite um ou mais fótons em um comprimentode onda diferente, tipicamente mais longo, como resposta. Vários corantesfluorescentes de uma ampla variedade de estruturas e características sãoadequados para uso na prática da invenção. Métodos e materiais são co-nhecidos para moléculas de ácido nucléico marcadoras fluorescentes (vide,por exemplo, R.P. Haugland, "Molecular Probes: Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals 1992-1994", 5§ Ed., 1994, Molecular Pro-bes, Inc.). Preferivelmente, uma porção fluorescente absorve e emite luzcom alta eficiência (isto é, tem um coeficiente de absorção molar no compri-mento de onda de excitação usado, e um alto rendimento quântico de fluo-rescência) e é foto estável (isto é, não sofre degradação significativa na exci-tação de luz dentro do tempo necessário para efetuar a análise). Ao invésdeles próprios serem diretamente detectáveis, alguns corantes fluorescentestransferem energia para outro corante fluorescente em um processo chama-do de transferência de energia de ressonância fluorescente (FRET), e o se-gundo corante produz o sinal detectado. Tais pares de corante fluorescenteFRET também são englobados pelo termo "porção fluorescente". O uso deporção repórter/supressora fluorescente quimicamente ligada também estádentro do escopo da presente invenção. Nessas modalidades quando a por-ção repórter e supressora fluorescente são mantidas em grande proximida-de, tal como nas extremidades de uma sonda de ácido nucléico, a porçãosupressora previne a detecção de um sinal fluorescente a partir da porçãorepórter. Quando as duas porções são fisicamente separadas, tal como, porexemplo, depois da clivagem por uma DNA polimerase, o sinal fluorescenteda porção repórter se torna detectável.

O termo "diretamente detectável", quando aqui utilizado emreferência a um rotulado ou porção detectável, significa que o rotulado ouporção detectável não requer manipulação ou reação adicional para ser de-tectável. Por exemplo, uma porção fluorescente é diretamente detectável pormétodos de espectroscopia de fluorescência. O termo "indiretamente de-tectável", quando aqui utilizado em referência a um rotulado ou porção de-tectável, significa que o rotulado ou porção detectável se torna detectáveldepois de manipulação ou reação adicional. Por exemplo, um hapteno setorna detectável depois da reação com um anticorpo apropriado ligado a umrepórter, tal como um corante fluorescente.Descrição detalhada de certas modalidades preferidas

Conforme mencionado acima, a presente invenção se refere aosmétodos e reagentes para detectar Neisseria gonorrhoeae em amostras bio-lógicas. Em certas modalidades, os métodos da invenção usam seqüênciasde oligonucleotídeos específicas para Neisseria gonorrhoeae e técnicas ba-seadas em amplificação de ácidos nucléicos sensível que permitem a detec-ção de Neisseria gonorrhoeae em amostras contendo mesmo pequenasquantidades de células bacterianas.

I- Seqüências de oligonucleotídeos para iniciadores de amplificação esondas de detecção

Seqüências de oligonucleotídeo da invenção

Em um aspecto, a presente invenção proporciona seqüências deoligonucleotídeos que podem ser usadas em testes de amplificação de ácidonucléico para a detecção específica ou de filamentos de seqüências-alvo nogene de estrutura de leitura aberta 1 (ORF1), gene da citosina metiltransfe-rase (dcmG) ou gene homólogo de proteína inversora de pilina (pivNG) deNeisseria gonorrhoeae.

O gene ORF1 foi descrito como uma região genômica que con-tém seqüências que podem ser usadas para discriminar Neisseria gonorrho-eae de outras espécies de Neisseria (CG. Miyada e T. L. Born, Mol. CellProbes, 1991, 5: 327-335). O gene ORF1 de Neisseria gonorrhoeae tambémtem sido reportado como tendo homologia significativa em relação às citosi-na DNA metiltansferases (C. G. Miyada e T. L. Born, Mol. Cell Probes, 1991,5: 327-335), tal como o gene da citosina metil transferase (dcmG) (J.F.Dempsey et al., J. Bacteriol., 1991, 173: 5476-5486; J.A.F. Dempsey e J.G.Cannon, J. Bacteriol., 1994, 176: 2055-2060). O gene pivNG é encontradoem várias cópias no cromossomo de Neisseria gonorrhoeae. A análise desílica do genoma completamente seqüenciado da cepa de Neisseria gonor-rhoeae FA1090 e análises de Southern blot adicionais demonstraram queexistem oito cópias do gene aglomeradas em três regiões separadas docromossomo de Neisseria gonorrhoeae (E.P. Skaar et al, J. Bacteriol., 2005,187: 1276-1286). Essas múltiplas cópias foram chamadas de genes relacio-nados com a invertase (irg1, NCBI Iocuslink ED: 3282015; irg2, NCBI Iocus-Iink ID: 3282236; irg3, NCBI Ioeuslink ID: 3281824; irg4, NCBI Iocuslink ID:3281830; irg5, NCBI Ioeuslink ID: 3281859; irg6, NCBI Ioeuslink ID: 3281314;irg7, NCBI Ioeuslink ID: 3281292; irg8, NCBI Ioeuslink ID: 3282553). O genepivNG tem sido reportado como contendo seqüências que podem ser usa-das para discriminar Neisseria gonorrhoeae de outras espécies de Neisseria(C.S. Carrick et al., Gene, 1998, 220: 21-29).

Conforme mencionado acima, a presente invenção proporcionaseqüências de oligonucleotídeos que reconhecem regiões no gene 0RF1,no gene dcmG e no gene pivNG de Neisseria gonorrhoeae. Seqüências deoligonucleotídeos exemplares da presente invenção estão apresentadas naTabela 1 (SEQ ID Nos: 1 a 52), juntamente com suas posições no mapa cor-respondentes. Essas seqüências foram identificadas pelos presentes Reque-rentes pelo alinhamento de seqüência com a seqüência de gene 0RF1, aseqüência do gene dcmG e a seqüência do gene pivNG usando o vetor NTI(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), pela expressão do iniciador ABI (AppliedBiosystems, Foster City, CA), e pelos programas de computador de análisedo iniciador Oligo6 (Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CA).

Conforme será percebido por uma pessoa versada na técnica,qualquer uma das seqüências de oligonucleotídeo (ou seus fragmentos ati-vos) aqui reveladas para amplificação, detecção ou quantificação de Neisse-ria gonorrhoeae pode ser empregada como uma sonda de detecção ou inici-ador de amplificação, dependendo do uso tencionado e/ou formato de en-saio. Por exemplo, uma seqüência de oligonucleotídeo da invenção usadacomo um iniciador de amplificação em um ensaio pode ser usada como umasonda de detecção em um ensaio diferente. Uma dada seqüência de oligo-nucleotídeo da invenção pode ser modificada, por exemplo, pela ligação àseqüência de uma seqüência especializada (por exemplo, uma seqüênciapromotora) requerida pelo método de amplificação selecionado, ou pela Iiga-ção de um rotulado (por exemplo, um corante fluorescente) para facilitar adetecção. Deste modo, é para ser entendido que um oligonucleotídeo deacordo com a presente invenção pode incluir uma ou mais seqüências, asquais podem servir como espaçadores, ligantes, seqüências para marcar ouse ligar à uma enzima, o que pode conferir estabilidade ou suscetibilidadeadicionada ao processo de degradação ou outra propriedade desejável aooligonucleotídeo.

Baseando-se nas seqüências de oligonucleotídeo fornecidaspela presente invenção, um ou mais análogos de oligonucleotídeos pode serpreparado (vide abaixo). Tais análogos podem conter estruturas alternativastais como ácidos nucléicos de peptídeos ou "PNAs" (isto é, moléculas comuma estrutura tipo peptídeo ao invés da estrutura de açúcar e fosfato dosácidos nucléicos de ocorrência natural) e similaress. Essas estruturas alter-nativas, representando a seqüência da presente invenção, são do mesmomodo parte da presente invenção. Similarmente, é entendido que os oligo-nucleotídeos consistindo das seqüências da presente invenção podem con-ter anulações, adições e/ou substituições de bases de ácido nucléico, até aextensão de que tais alterações não afetam negativamente as propriedadesdas moléculas de ácido nucléico. Particularmente, as alterações não devemresultar em um decréscimo significativo das propriedades hibridizantes dosoligonucleotídeos.

Grupos de iniciadores e grupos de iniciador/sonda

Em outro aspecto, a presente invenção se refere às combina-ções de seqüências de oligonucleotídeo aqui reveladas para a detecção deNeisseria gonorrhoeae em amostras biológicas. Mais especificamente, apresente invenção proporciona grupos de iniciadores e grupos de inicia-dor/sonda.

Conforme aqui utilizado, o termo "grupo de iniciadof se referea dois ou mais iniciadores os quais juntos são capazes de iniciar a amplifica-ção de uma seqüência de nucleotídeos de interesse (por exemplo, uma se-qüência-alvo no gene OFR1, o gene dcmG ou o gene pivNG de Neisseriagonorrhoeae). Em certas modalidades, o termo "grupo de iniciador" se referea um par de iniciadores incluindo um iniciador 5' (a montante) (ou iniciador"forward') que hibridiza com a extremidade 5' da seqüência de ácido nucléi-co a ser amplificada e um iniciador 3' (a jusante) (ou iniciador reverso) quehibridiza com o complemento da seqüência a ser amplificada. Tais grupos deiniciadores ou pares de iniciadores são particularmente úteis em reações deamplificação de PCR.

Exemplos de grupos de iniciadores compreendendo uma ampli-ficação "forward" e um iniciador de amplificação reversa incluem:

Grupo de iniciador 1, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 1 (5'-GCGGATTCCCTTGTCAAGATT-3') ouqualquer fragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo a SEQID NO: 2 (5'-GCCGCGCTCACCCTCTA-3') ou qualquer fragmento ativo seu;

Grupo de iniciador 2, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 5 (51-AGTACGTTTGGATACAGGATTTGATTT-3') ou qualquer fragmento ativoseu, e um iniciador reverso compreendendo a SEQ ID NO: 6 (5'-AGCCGTTTTCGCCAGTTTC-3') ou qualquer fragmento ativo seu;

Grupo de iniciador 3, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 8 (5'-GGAACGAGCCATCAAAAACAA-3') ouqualquer fragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo a SEQID NO: 9 (5'-GCGGTTCAGGGAAGTGATAGC-3') ou qualquer fragmentoativo seu;

Grupo de iniciador 4, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a

SEQ ID NO: 12 (5'-AAGGTATGATTAGCCACGTTTATCG-3') ou qualquerfragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo a SEQ ID NO:13 (5'-CGCCACCTGCTGCAATAATT-3') ou qualquer fragmento ativo seu;

Grupo de iniciador 5, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a seq id no: 15 (Si-GccttttttcctttcGGGatt-S') ouqualquer fragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo a seqid no: 16 (5'-gtacataagaaaggcggagattacg-3') ou qualquer frag-mento ativo seu;

Grupo de iniciador 6, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 19 (5'-GACGCTTCACGCCTTCCTT-3') ouqualquer fragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo a SEQID NO: 20 (5'-CCATGAATGAACAGCTTGAAGTTT-3') ou qualquer fragmen-to ativo seu;

Grupo de iniciador 7, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 22 (5'-GCATCCTGTTTGTCTGTTTTGG-3')ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo aSEQ ID NO: 23 (5'-TTACGTAGTGAATCCGCTGAAAATA-3') ou qualquerfragmento ativo seu;

Grupo de iniciador 8, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 25 (5'-CCGAATGCTCCGTTTTGC-3') ouqualquer fragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo a SEQID NO: 26 (5'-GTAACGCCGTAGGATTGGATATATC-3') ou qualquer frag-mento ativo seu;

Grupo de iniciador 9, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a

SEQ ID NO: 29 (5'-TGATCTAAACCTTTTGAATCGTTGTC-3') ou qualquerfragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo a SEQ ID NO:(5'-AACGCATCCGCCATGGT-3*) ou qualquer fragmento ativo seu;

Grupo de iniciador 10, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 32 (5'-GACGCTTCACGCCTTCCTT-3') ouqualquer fragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo a SEQID NO: 33 (5'-CCATGAATGAACAGCTTGAAGTTT-3') ou qualquer fragmen-to ativo seu;

Grupo de iniciador 11, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 35 (5'-TCTGCCTATTGCCGGTATGGT-3') ouqualquer fragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo a SEQID NO: 36 (5'-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3') ou qualquer fragmento ati-vo seu;

Grupo de iniciador 12, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 38 (5'-ATTGCCGGTATGGTTTCAA-3') ouqualquer fragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo a SEQID NO: 39 (5'-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3') ou qualquer fragmento νseu;Grupo de iniciador 13, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 41 (5'-GTCATTCTGCCTATTGCCGGT-3') ouqualquer fragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo a SEQID NO: 42 (5'-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3') ou qualquer fragmento νseu;

Grupo de iniciador 14, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 44 (5'-TCTGCCTATTGCCGGTATGGT-3') ouqualquer fragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo a SEQID NO: 45 (5'-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3') ou qualquer fragmento ati-vo seu;

Grupo de iniciador 15, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 47 (5'-TCTGCCTATTGCCGGTATGGT-3') ouqualquer fragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo a SEQID NO: 48 (5'-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3') ou qualquer fragmento ati-vo seu; e

Grupo de iniciador 16, o qual compreende um iniciador "forward"compreendendo a

SEQ ID NO: 50 (5'-TGATCTAAACCTTTTGAATCGTTGTC-3') ou qualquerfragmento ativo seu, e um iniciador reverso compreendendo a SEQ ID NO:51 (5'-GTAACGCCGTAGGATTGGATATATC-3') ou qualquer fragmento ativoseu.

Esses grupos de iniciadores podem ser usados de acordo comqualquer técnica de amplificação de ácido nucléico que empregue dois oumais oligonucleotídeos para amplificar uma seqüência-alvo (conforme discu-tido abaixo). Os produtos de amplificação produzidos usando um grupo deiniciadores da invenção pode ser detectado usando qualquer um dentre umavariedade de métodos de detecção bem-conhecidos na técnica. Por exem-plo, produtos de amplificação podem ser detectados usando eletroforese emgel de agarose e visualização por rotulação com brometo de etídio e exposi-ção à luz ultravioleta (UV) ou por análise de seqüência do produto de ampli-ficação por confirmação de identidade de Neisseria gonorrhoeae.Alternativamente, as seqüências de sonda podem ser emprega-das usando uma variedade de metodologias homogêneas ou heterogêneaspara detectar os produtos de amplificação. Geralmente em tais métodos, asonda hibridiza em um filamento de produto de amplificação (ou amplicon)para formar um híbrido de produto/sonda de amplificação. O híbrido pode, aseguir, ser diretamente ou indiretamente detectado, por exemplo, usandosondas, rotulados ou tanto sondas quanto rotulados.

Conseqüentemente, a presente invenção proporciona grupos deiniciador/sonda para a detecção de Neisseria gonorrhoeae em amostras bio-lógicas. Conforme aqui utilizado, o termo "grupo de iniciador/sonda" serefere a uma combinação compreendendo dois ou mais iniciadores, os quaisjuntos são capazes de iniciar a amplificação de uma seqüência de nucleotí-deo de interesse (por exemplo, uma seqüência-alvo no gene OFR1, o genedcmG ou o gene pivNG de Neisseria gonorrhoeae) e pelo menos uma sondaa qual possa detectar a seqüência-alvo. A sonda geralmente hibridiza em umfilamento de um produto de amplificação (ou amplicon) para formar um híbri-do produto/sonda de amplificação, o qual pode ser detectado.

A presente invenção proporciona grupos de iniciador/sonda quepodem ser usados de acordo com procedimentos de amplificação de ácidonucléico para amplificar especificamente e detectar seqüências-alvo deNeisseria gonorrhoeae nas amostras de teste. Os grupos de iniciador/sondada invenção geralmente compreendem um grupo iniciador, conforme descri-to acima, e pelo menos uma sonda de detecção, a qual hibridiza ao amplicongerado pelo grupo iniciador. A sonda de detecção pode compreender umaporção detectável. Em certas modalidades, a sonda de detecção compreen-de uma porção fluorescente ligada na extremidade 5' e uma porção supres-sora ligada na extremidade 3' (vide abaixo).

Exemplos dos grupos iniciador/sonda incluem:

Grupo iniciador/sonda 1, o qual compreende um iniciador "for-ward" compreendendo a SEQ ID NO: 1 (5'-GCGGATTCCCTTGTCAAGATT-3') ou um fragmento ativo seu, um iniciador reverso compreendendo a SEQID NO: 2 (5'-GCCGCGCTCACCCTCTA-3') ou um fragmento ativo seu; umasonda de detecção de complementaridade SEQ ID NO: 3 (5'-TTCCATGATTTGGAAACAGCCGGG-3') ou um fragmento ativo seu; e umasonda de detecção de complementaridade reversa compreendendo a SEQID NO: 4 (5'-CCCGGCTGTTTCCAAATCATGGAA-3') ou um fragmento ativoseu;

Grupo iniciador/sonda 2, o qual compreende um iniciador "for-ward" compreendendo a

SEQ ID NO: 5 (5'-AGTACGTTTGGATACAGGATTTGATTT-3') ou um frag-mento ativo seu, um iniciador reverso compreendendo a SEQ ID NO: 6 (5'-AGCCGTTTTCGCCAGTTTC-3') ou um fragmento ativo seu; e uma sondade detecção de complementaridade compreendendo a SEQ ID NO: 7 (51-CCATCCGGAACCGACGCACAA-3') ou um fragmento ativo seu;

Grupo iniciador/sonda 3, o qual compreende um iniciador "for-ward" compreendendo a SEQ ID NO: 8 (5'-GGAACGAGCCATCAAAAACAA-3') ou um fragmento ativo seu; um iniciador reverso compreendendo a SEQID NO: 9 (5'-GCGGTTCAGGGAAGTGATAGC-3') ou um fragmento ativoseu; uma sonda de detecção de complementaridade SEQ ID NO: 10 (5'-TTGCAGCAGGTGGCGGTGGTACTT-3') ou um fragmento ativo seu; e umasonda de detecção de complementaridade reversa compreendendo a SEQID NO: 11 (5'-AAGTACCACCGCCACCTGCTGCAA-3') ou um fragmento ati-vo seu;

Grupo iniciador/sonda 4, o qual compreende um iniciador "for-ward" compreendendo a

SEQ ID NO: 12 (5'-AAGGTATGATTAGCCACGTTTATCG-3') ou um frag-mento ativo seu; um iniciador reverso compreendendo a SEQ ID NO: 13 (51-CGCCACCTGCTGCAATAATT-3') ou um fragmento ativo seu; e uma sondade detecção de complementaridade compreendendo a SEQ ID NO: 14 (5'-CGTATGCATCGGAACGAGCCATCAAA-3') ou um fragmento ativo seu;

Grupo iniciador/sonda 5, o qual compreende um iniciador "for-ward" compreendendo a SEQ ID NO: 15 (5'-GCCTTTTTTCCTTTCGGGATT-3') ou um fragmento ativo seu; um iniciador reverso compreendendo a SEQID NO: 16 (5'-GTACATAAGAAAGGCGGAGATTACG-3') ou um fragmentoativo seu; uma sonda de detecção de complementaridade SEQ ID NO: 17(5'-ACGCCGATTTGTAACGCGATGGA-3') ou um fragmento ativo seu; euma sonda de detecção de complementaridade reversa compreendendo aSEQ ID NO: 18 (5'-TCCATCGCGTTACAAATCGGCGT-3') ou um fragmentoativo seu;

Grupo iniciador/sonda 6, o qual compreende um iniciador "for-ward" compreendendo a SEQ ID NO: 19 (5'-GACGCTTCACGCCTTCCTT-3')ou um fragmento ativo seu; um iniciador reverso compreendendo a SEQ IDNO: 20 (5'-CCATGAATGAACAGCTTGAAGTTT-3') ou um fragmento ativoseu; e uma sonda de detecção de complementaridade compreendendo aSEQ ID NO: 21 (5'-AGGCTTCTCCGTCTGCTCTTTTATCTTCTCCTT-3') ouum fragmento ativo seu; Grupo iniciador/sonda 7, o qual compreende uminiciador "forward" compreendendo a SEQ iD NO: 22 (5'-GCATCCTGTTTGTCTGTTTTGG-3') ou um fragmento ativo seu; um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 23 (5'-TT ACGTAGTGA-ATCCGCTGAAAATA-3') ou um fragmento ativo seu; e uma sonda de detec-ção de complementaridade

SEQ ID NO: 24 (5'-CGCTTGAACCTGCTTTCTGCATACTTGC-3') ou umfragmento ativo seu;

Grupo iniciador/sonda 8, o qual compreende um iniciador "for-ward" compreendendo a SEQ ID NO: 25 (5'-CCGAATGCTCCGTTTTGC-3')ou um fragmento ativo seu; um iniciador reverso compreendendo a SEQ IDNO: 26 (5'-GTAACGCCGTAGGATTGGATATATC-3') ou um fragmento ativoseu; uma sonda de detecção de complementaridade SEQ ID NO: 27 (5'-CCATGGCGGATGCGTTAAAGGTCAG-3') ou um fragmento ativo seu; euma sonda de detecção de complementaridade reversa compreendendo aSEQ ID NO: 28 (5'-CTGACCTTTAACGCATCCGCCATGG-3') ou um frag-mento ativo seu;

Grupo iniciador/sonda 9, o qual compreende um iniciador "for-ward" compreendendo a

SEQ ID NO: 29 (5'-TGATCTAAACCTTTTGAATCGTTGTC-3') ou um frag-mento ativo seu; um iniciador reverso compreendendo a SEQ ID NO: 30 (51-AACGCATCCGCCATGGT-3') ou um fragmento ativo seu; e uma sonda dedetecção de complementaridade SEQ ID NO: 31 (51-AACTTTGCCGAATGCTCCGTTTTGC-3') ou um fragmento ativo seu;

Grupo iniciador/sonda 10, o qual compreende um iniciador "for-ward" compreendendo a SEQ ID NO: 32 (5'-GACGCTTCACGCCTTCCTT-3')ou um fragmento ativo seu; um iniciador reverso compreendendo a SEQ IDNO: 33 (5'-CCATGAATGAACAGCTTGAAGTTT-3') ou um fragmento ativoseu; e uma sonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 34 (5'-AGGCTTCTCCGTCTGCTCT-3') ou um fragmento ativo seu;

Grupo iniciador/sonda 11, o qual compreende um iniciador "for-ward" compreendendo a

SEQ ID NO: 35 (5'-TCTGCCTATTGCCGGTATGGT-3') ou um fragmentoativo seu; um iniciador reverso compreendendo a SEQ iD NO: 36 (5'-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3') ou um fragmento ativo seu; e uma sondade detecção compreendendo a

SEQ ID NO: 37 (5'-AGGCTTCTCCGTCTGCTCT-3') ou um fragmento ativoseu;

Grupo iniciador/sonda 12, o qual compreende um iniciador "for-ward" compreendendo a SEQ ID NO: 38 (5'-ATTGCCGGTATGGTTTCAA-3')ou um fragmento ativo seu; um iniciador reverso compreendendo a SEQ IDNO: 39 (5'-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3') ou um fragmento ativo seu; euma sonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 40 (51-AGGCTTCTCCGTCTGCTCT-3') ou um fragmento ativo seu;

Grupo iniciador/sonda 13, o qual compreende um iniciador "for-ward" compreendendo a

SEQ ID NO: 41 (5'-GTCATTCTGCCTATTGCCGGT-3') ou um fragmento ati-vo seu; um iniciador reverso compreendendo a SEQ ID NO: 42 (5'-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3') ou um fragmento ativo seu; e uma sondade detecção compreendendo a

SEQ ID NO: 43 (5'-TGCATCCAATCAGATTTCCTTTCG-3') ou um fragmentoativo seu;

Grupo iniciador/sonda 14, o qual compreende um iniciador "for-ward" compreendendo a

SEQ ID NO: 44 (5'-TCTGCCTATTGCCGGTATGGT-3') ou um fragmentoativo seu; um iniciador reverso compreendendo a SEQ ID NO: 45 (51-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3') ou um fragmento ativo seu; e uma sondade detecção compreendendo a

SEQ ID NO: 46 (5'-GCTTCACGCCTTCCTTGCAGTTA-3') ou um fragmentoativo seu;

Grupo iniciador/sonda 15, o qual compreende um iniciador "for-ward" compreendendo a

SEQ ID NO: 47 (5'-TCTGCCTATTGCCGGTATGGT-3') ou um fragmentoativo seu; um iniciador reverso compreendendo a SEQ ID NO: 48 (51-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3') ou um fragmento ativo seu; e uma sondade detecção compreendendo a

SEQ ID NO: 49 (5'-TCACGCCTTCCTTGCAGTTA-3') ou um fragmento ativoseu; e

Grupo iniciador/sonda 16, o qual compreende um iniciador "for-waraf" compreendendo a

SEQ ID NO: 50 (5'-TGATCTAAACCTTTTGAATCGTTGTC-3') ou um frag-mento ativo seu; um iniciador reverso compreendendo a SEQ ID NO: 51 (51-GTAACGCCGTAGGATTGGATATATC-3') ou um fragmento ativo seu; e umasonda de detecção compreendendo a

SEQ ID NO: 52 (5'-CCATGGCGGATGCGTTAAAGGTCAG-3') ou um frag-mento ativo seu.

Preparação de oligonucleotídeo

Os oligonucleotídeos da invenção podem ser preparados porqualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica (vide, porexemplo, J. Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 1989,2- Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: Nova Iorque, NY; "PCR Pro-tocols: A Guide to Methods and Applications", 1990, M. A. Innis (Ed.), Aca-demic Press: Nova Iorque, NY; P. Tijssen "Hybridization with Nucleic AcidProbes — Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology(Partes I e Il)", 1993, Elsevier Science; "PCR Strategies", 1995, M. A. Innis(Ed.), Academic Press: Nova Iorque, NY; e "Short Protocols in Molecular Bio-logy", 2002, F. M. Ausubel (Ed.), 5§ Ed., John Wiley & Sons: Secaucus, NJ).Por exemplo, oligonucleotídeos podem ser preparados pela síntese químicae polimerização baseando-se em um molde conforme descrito, por exemplo,em S. A. Narang et al, Meth. Enzymol. 1979, 68: 90-98; E. L. Brown et al,Meth. Enzymol. 1979, 68: 109-151; E. S. Belousov et al, Nucleic Acids Res.1997, 25: 3440-3444; D. Guschin et al, Anal. Biochem. 1997, 250: 203-211;M. J. Blommers et al, Biochemistry, 1994, 33: 7886-7896; e K. Frenkel el al,Free Radie. Biol. Med. 1995, 19: 373-380; e Patente U.S. No. 4.458.066).

Por exemplo, os oligonucleotídeos podem ser preparados usan-do um procedimento automatizado em fase sólida baseando-se em uma a-bordagem de fosforamidita. Em tal método, cada nucleotídeo é individual-mente adicionado à extremidade 5' de uma cadeia de oligonucleotídeo emcrescimento, a qual está ligada na extremidade 3' a um suporte sólido. Osnucleotídeos adicionados estão na forma de 3'-fosforoaniditas trivalentesque são protegidas por um grupo dimetoxitritila (ou DMT) na posição 5'). De-pois do acoplamento de fosforoamidita induzido por base, a oxidação brandapara produzir um intermediário fosfotriéster pentavalente e a remoção doDMT proporciona um novo sítio para o alongamento do oligonucleotídeo. Osoligonucleotídeos são, a seguir, removidos por clivagem do suporte sólido, eo fosfodiéster e os grupos amino exocíclicos são desprotegidos com hidróxi-do de amônio. Essas sínteses podem ser efetuadas em oligossintetizadores,tais como aqueles comercialmente disponíveis da Perkin Elmer/Applied Bi-osystems, Inc. (Foster City, CA), DuPont (Wilmington, DE) ou Milligen (Bed-ford, MA). Alternativamente, oligonucleotídeos podem ser feitos sob enco-menda e ordenados a partir de uma variedade de fontes comerciais bem-conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, Midland Certified ReagentCompany (Midland, TX), ExpressGen, Inc. (Chicago, IL), Operon Technolo-gies, Inc. (Huntsville, AL), BioSearch Technologies, Inc. (Novato, CA) e mui-tas outras.

A purificação dos oligonucleotídeos da invenção, quando neces-sário ou desejado, pode ser efetuada por qualquer um dentre a variedadedos métodos bem-conhecidos na técnica. A purificação dos oligonucleotí-deos é tipicamente efetuada ou por eletroforese em gel de acrilamida genuí-na, por HPLC de troca iônica conforme descrito, por exemplo, por J. D. Pe-arson e F. E. Regnier (J. Chrom., 1983, 255: 137-149) ou por HPLC de fasereversa (G. D. McFarIand e P. N. Borer, Nucleic Acids Res., 1979, 7: 1067-1080).

A seqüência dos oligonucleotídeos pode ser verificada usandoqualquer método de seqüenciamento adequado incluindo, porém sem selimitar, a degradação química (A. M. Maxam e W. Gilbert, Methods of Enzy-mology, 1980, 65: 499-560), Espectrometria de massa por tempo de vôo pordessorção-ionização de laser em matriz (MALDI-TOF) (U. Pieles et al., Nu-cleic Acids Res., 1993, 21: 3191-3196), espectrometria de massa após umacombinação de digestões por fosfatase alcalina e exonuclease (H. Wu e H.Aboleneen, Anal. Biochem., 2001, 290: 347-352), e similaress.

Conforme já mencionado acima, os oligonucleotídeos modifica-dos podem ser preparados usando qualquer um dos meios conhecidos natécnica. Exemplos não-limitativos de tais modificações incluem metilação,"caps", substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência naturalcom um análogo, e modificações internucleotídeo tais como, por exemplo,aquelas com ligações descarregadas (por exemplo, metilfosfonatos, fosfotri-ésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) ou ligações carregadas (por e-xemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Oligonucleotídeos podem con-ter uma ou mais porções adicionais covalentemente ligadas, tais como, porexemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeosde sinal, poli-L-lisina, etc.), intercaladores (por exemplo, acridina, psoralen,etc.), quelantes (por exemplo, para quelar metais, metais radioativos, metasoxidativos, etc.) e alquilantes. Oligonucleotídeos também podem ser deriva-dos pela formação de um metil- ou etilfosfotriéster ou de uma ligação alquil-fosforoamidato. Além disso, as seqüências de oligonucleotídeo da presenteinvenção podem também ser modificadas com um rotulado.

Rotulação das seqüências de oligonucleotídeos

Em certas modalidades, as sondas de detecção ou iniciadoresde amplificação ou tanto sondas quanto iniciadores são rotulados com umagente ou porção detectável antes de serem usadas em ensaios de amplifi-cação/detecção. Em algumas modalidades, as sondas de detecção são rotu-ladas com um agente detectável. O papel de um agente detectável é permitira visualização e a detecção de seqüências-alvo amplificadas (amplicons).Preferivelmente, o agente detectável é selecionado de modo que ele gereum sinal o qual possa ser medido e cuja intensidade está relacionada (porexemplo, proporcional) com a quantidade dos produtos de amplificação naamostra sendo analisada.

A associação entre um oligonucleotídeo (por exemplo, sonda dedetecção) e o agente detectável pode ser covalente ou não-covalente. Assondas de detecção marcadas podem ser preparadas pela incorporação de,ou conjugação a uma porção detectável. Os rotulados podem ser ligadosdiretamente à seqüência de ácido nucléico ou indiretamente (por exemplo,através de um ligante). Ligantes ou braços espaçadores de vários compri-mentos são conhecidos na técnica e são comercialmente disponíveis, e po-dem ser selecionados para reduzir o impedimento estéreo, ou para conferiroutras propriedades úteis ou desejadas nas moléculas marcadas resultantes(vide, por exemplo, E. S. Mansfield et al, Mol. Cell Probes, 1995, 9: 145-156).

Métodos para a rotulação de moléculas de ácido nucléico sãobem-conhecidas na técnica. Para uma revisão dos protocolos de rotulação,técnicas de detecção de rotulados e recentes desenvolvimentos no campo,vide, por exemplo, L. J. Kricka, Ann. Clin. Biochem. 2002, 39: 114-129; R. P.van Gijlswijk et al, Expert Rev. Mol. Diagn. 2001, 1: 81 -91; e S. Joos et al, J.Biotechnol. 1994, 35: 135-153. Métodos-padrão de rotulação de ácidos nu-cléicos incluem: incorporação de agentes radioativos, ligações diretas decorantes fluorescentes (L. M. Smith et al., Nucl. Acids Res., 1985, 13: 2399-2412) ou de enzimas (B. A. Connoly e O. Rider, Nucl. Acids. Res., 1985, 13:4485-4502); modificações químicas de moléculas de ácido nucléico tornan-do-as detectáveis imunoquimicamente ou por outras reações de afinidade(T. R. Broker et al., Nucl. Acids Res. 1978, 5: 363-384; E. A. Bayer et al, Me-thods of Biochem. Analysis, 1980, 26: 1-45; R. Langer et al, Proc. Natl. Acad.Sei. USA, 1981, 78: 6633-6637; R. W. Richardson et al, Nucl. Acids Res.1983, 11: 6167-6184; D. J. Brigati et al, Virol. 1983, 126: 32-50; P. Tehen etal, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 1984, 81 : 3466-3470; J. E. Landegent et al,Exp. Cell Res. 1984, 15: 61-72; e A. H. Hopman et al, Exp. Cell Res. 1987,169: 357-368); e métodos de rotulação mediados por enzima, tais como ini-ciação aleatória, tradução por cortes, PCR e terminação do DNA com trans-ferase terminal (para uma revisão na rotulação enzimática vide, por exemplo,J. Temsamani e S. Agrawal, Mol. Biotechnol. 1996, 5: 223-232). Sistemas derotulação de ácido nucléico mais recentemente desenvolvidos incluem, po-rém não estão limitados, ao ULS (Sistema de Ligação Universal), o qual ébaseado na reação de derivados de cisplatina monorreativos com a posiçãoN7 de porções de guanina em DNA (R. J. Heetebrij et al, Cytogenet. Cell.Genet. 1999, 87: 47-52), psoralen-biotina, o qual intercala em ácidos nucléi-cos e na irradiação de UV se torna covalentemente ligado às bases de nu-cleotídeo (C. Levenson et al, Methods Enzymol. 1990, 184: 577-583; e C.Pfannschmidt et al, Nucleic Acids Res. 1996, 24: 1702-1709), derivados deazido fotorreativos (C. Neves et al., Bioconjugate Chem. 2000, 11: 51-55) eagentes alquilantes de DNA (M. G. Sebestyen et al, Nat. Biotechnol. 1998,16:568-576).

Qualquer um de uma variedade de agentes detectáveis pode serusado na prática da presente invenção. Agentes detectáveis adequados in-cluem, porém não estão limitados, a vários ligantes, radionuclídeos (tais co-mo, por exemplo, 32P, 35S, 3H, 14C, 125I1 131I e similaress); corantes fluores-centes (para corantes fluorescentes exemplares específicos vide abaixo);agentes quimiluminescentes (tais como, por exemplo, ésteres de acridínio,dioxetanos estabilizados e similaress); nanocristais semicondutores fluores-centes inorgânicos espectralmente resolvíveis (isto é, pontos de quantum),nanopartículas metálicas (por exemplo ouro, prata, cobre e platina) ou nano-clusters', enzimas (tais como, por exemplo, aquelas usadas em um ELISA,isto é, peroxidase de rábano silvestre, beta-galactosidase, luciferase, fosfa-tase alcalina); rotulados colorimétricos (tais como, por exemplo, corantes,ouro coloidal e similaress); rotuladores magnéticos (tais como, por exemplo,Dynabeads®); e biotina, dioxigenina ou outros haptenos e proteínas paraanti-soro ou anticorpos monoclonais são disponíveis.

Em certas modalidades, as sondas de detecção da invenção sãofluorescentemente marcadas. Várias porções de rotulação fluorescentes co-nhecidas de uma ampla variedade de estruturas químicas e característicasfísicas são adequadas para

o uso na prática dessa invenção. Corantes fluorescentes adequados inclu-em, porém não estão limitados, a fluoresceína e corantes de fluoresceína(por exemplo, fluoresceína isotiocianina ou FITC, naftofluoresceína, 4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína, 6-carboxifluoresceína ou FAM), carbocia-nina, merocianina, corantes estirila, corantes oxonol, ficoeritrina, eritrosina,eosina, corantes rodamina (por exemplo, carboxitetrametilrodamina ou TA-MRA1 carboxirrodamina 6G, carbóxi-X-rodamina (ROX), Iissamina rodaminaB, rodamina 6G, verde rodamina, rodamina, tetrametilrodamina ou TMR),cumarina e corantes de cumarina (por exemplo, metoxicumarina, dialquila-minocumarina, hidroxicumarina e aminometilcumarina ou AMCA), corantesverde Oregon (por exemplo, verde Oregon 488, verde Oregon 500, verdeOregon 514), Vermelho Texas, Vermelho-X Texas, Spectrum Red®, Spec-trum Green®, corantes de cianina (por exemplo, Cy-3®, Cy-5®, Cy-3,5®,Cy-5,5®), corantes Alexa Fluor (por exemplo, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, A-Iexa Fluor 633, Alexa Fluor 660 e Alexa Fluor 680), corantes BODIPY (porexemplo, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY TR, BODIPY530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665), IRDyes (por exemplo, IRD40,IRD 700, IRD 800) e similaress. Para mais exemplos de corantes fluorescen-tes adequados e métodos para ligação ou incorporação de corantes fluores-centes em moléculas de ácido nucléico vide, por exemplo, "The Handbook ofFluorescent Probes and Research Products", 9ê Ed., Molecular Probes, Inc.,Eugene, OR. Corantes fluorescentes, assim como kits de rotulação são co-mercialmente disponíveis, por exemplo, da Amersham Biosciences, Inc.(Piscataway, NJ), Molecular Probes Inc. (Eugene, OR) e New England Bio-Iabs Inc. (Berverly, MA).

Ao invés de serem por si só diretamente detectáveis, algunsgrupos fluorescentes (doadores) transferem energia para outro grupo fluo-rescente (aceptor) em um processo de transferência de energia ressonantefluorescente (FRET)1 e o segundo grupo produz o sinal fluorescente detectá-vel. Nessas modalidades, a sonda de detecção de oligonucleotídeo pode,por exemplo, se tornar detectável quando hibridizada para uma seqüência-alvo amplificada. Exemplos de pares aceptor/doador FRET adequados parauso na presente invenção incluem, porém não estão limitados, a fluoresceí-na/tetrametilrodamina, IAEDANS/FITC, IAEDANS/5-(iodoacetamido)fluores-ceína, B-ficoeritrina/Cy-5 e EDANS/Dabcyl.

O uso de pares de molécula repórter/supressora fluorescentefisicamente ligados também está dentro do escopo da invenção. O uso detais sistemas em ensaios TaqMan® (conforme descrito, por exemplo, nasPatentes Americanas Nos. 5.210.015; 5.804.375; 5.487.792 e 6.214.979) oucomo balizas moleculares (conforme descrito, por exemplo, em S. Tyagi e F.R. Kramer, Nature Biotechnol. 1996, 14: 303-308; S. Tyagi et al, Nature Bio-technol. 1998, 16: 49-53; L. G. Kostrikis et al, Science, 1998, 279: 1228-1229; D. L. Sokol et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998, 95: 11538-11543;S. A. Marras et al, Genet. Anal. 1999, 14: 151-156; e Patentes AmericanasNos. 5.846.726, 5.925.517, 6.277.581 e 6.235.504) é bem-conhecido na téc-nica.

Com o formato de ensaio TaqMan®, os produtos da reação deamplificação podem ser detectados conforme eles são formados de um mo-do chamado "em tempo real". Como resultado, os híbridos produto/sonda deamplificação são formados e detectados enquanto a mistura reacional estásob condições de amplificação.

Em algumas modalidades da presente invenção, as sondas dedetecção por PCR são sondas tipo TaqMan™ que são marcadas na extre-midade 5' com uma porção fluorescente e na extremidade 3' com uma por-ção sequestrante. Fluoróforos e seqüestrantes adequados para uso comsondas tipo TaqMan® são descritos nas Patentes Americanas Nos.5.210.015; 5.804.375; 5.487.792; e 6.214.979; e WO 01/86001 (cada umadas quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade). Exemplos deseqüestrantes incluem, porém não estão limitados, ao éster DABCYL (isto é,ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)-benzóico) succinimidílico, ácido diarilroda-minocarboxílico, éster succinimidílico (ou QSY-7) e ácido 4',5'-dinitrofluoresceincarboxílico, éster succinimidílico (ou QSY-33) (todos dispo-níveis, por exemplo, da Molecular Probes), supressor 1 (Q1; disponível daEpoch Biosciences, Bothell1 WA) ou "Black Hole Quenchers", BHQ-1, BHQ-2 e BHQ-3 (disponíveis da BioSearch Technologies, Inc., Novato, CA). Emcertas modalidades, as sondas de detecção por PCR são sondas tipo Taq-Man® que são marcadas na extremidade 5' com FAM e na extremidade 3'com Black Hole Quencher.

Uma "cauda" de nucleotídeos normais ou modificados tambémpode ser adicionada nas sondas de nucleotídeos para propósitos de detec-ção. Uma segunda hibridização com ácido nucléico complementar à cauda econtendo um ou mais rotulados detectáveis (tais como, por exemplo, fluoró-foros, enzimas ou bases que foram radioativamente marcadas) permite avisualização dos híbridos amplicon/sonda (vide, por exemplo, o sistema co- mercialmente disponível da Enzo Biochem. Inc., Nova Iorque, NY). Outroexemplo de um ensaio com o qual os oligonucleotídeos da invenção são Ci-teis é um método de amplificação de sinal tal como aquele descrito na Pa-tente U.S. No. 5.124.246 (a qual é aqui incorporada por referência na suatotalidade). Naquele método, o sinal é amplificado através do uso de multí-meros de amplificação, polinucleotídeos os quais são construídos de modo aconter um primeiro segmento que hibridize especificamente com a "cauda"adicionada nas sondas de oligonucleotídeos, e uma multiplicidade de se-gundos segmentos idênticos que hibridizam especialmente com uma sondamarcada. O grau de amplificação é teoricamente proporcional à quantidadede repetições do segundo segmento. Os multímeros podem ser ou linearesou ramificados. Multímeros ramificados podem estar na forma de um garfoou pente.A seleção de uma técnica de rotulação de ácido nucléico particu-lar irá depender da situação e será governada por vários fatores, tais como afacilidade e custo do método de rotulação, a qualidade da rotulação da a-mostra desejada, os efeitos da porção detectável na reação de hibridização(por exemplo, na taxa e/ou eficiência do processo de hibridização), a nature-za do método de amplificação utilizado, a natureza do sistema de detecção,a natureza e intensidade do sinal gerado pelo rotulado detectável e similaress.

Amplificação das seqüências-alvo de Neisseria gonorrhoeaeusando iniciadores da invenção

O uso de seqüências de oligonucleotídeos da presente invençãopara amplificar seqüências-alvo de Neisseria gonorrhoeae em amostras deteste não está limitado a qualquer técnica de amplificação de ácido nucléicoparticular ou a qualquer modificação particular sua. De fato, as seqüênciasde oligonucleotídeos da presente invenção podem ser empregadas em qual-quer uma de uma variedade de métodos de amplificação de ácidos nucléicosbem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, A. R. Kimmel e S. L. Berger,Methods Enzymol. 1987, 152: 307-316; J. Sambrook et al, "Molecular Clo-ning: A Laboratory Manual", 1989, 2- Ed., Cold Spring Harbour LaboratoryPress: Nova Iorque, NY; "Short Protocols in Molecular Biology", F.M. Ausub-el (Ed.), 2002, 5ã Ed., John Wiley & Sons: Secaucus, NJ).

Tais métodos de amplificação de ácido nucléico incluem, porémnão estão limitados, a Reação em Cadeia da Polimerase (ou PCR, descrito,por exemplo, em "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications",M.A. Innis (Ed.), 1990, Academic Press: Nova Iorque; "PCR Strategies", M.A. Innis (Ed.), 1995, Academic Press: Nova Iorque; "Polymerase chain reac-tion: basic principies and automation in PCR: A Practical Approach", Mc-Pherson et al. (Eds.), 1991, IRL Press: Oxford; Saiki et al, Nature, 1986, 324:163; e Patentes Americanas Nos.. 4.683.195, 4.683.202 e 4.889.818, cadauma das quais sendo aqui incorporada por referência na sua totalidade); evariações suas incluindo ensaios baseados em TaqMan® (Holland et al,Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, 88: 7276-7280), e na reação em cadeia da po-limerase da transcriptase reversa (ou RT-PCR1 descrito, por exemplo, nasPatentes Americanas Nos. 5.322.770 e 5.310.652, cada uma das quais sen-do aqui incorporadas por referência na sua totalidade).

Em PCR1 um par de iniciadores é empregado em excesso parahibridizar as filamentos complementares do ácido nucléico-alvo. Os iniciado-res são cada um deles estendidos por uma DNA polimerase usando a se-qüência-alvo como um molde. Os produtos de extensão de tornam alvos porsi próprios depois da dissociação (desnaturação) da filamento alvo original.Novos iniciadores são, então, hibridizados e estendidos pela polimerase, e ociclo é repetido até aumentar exponencialmente a quantidade de cópias deamplicons. Exemplos de DNA polimerases capazes de produzir produtos deextensão de iniciadores em reações de PCR incluem, porém não estão limi-tados, a: DNA poiimerase de E. coii, fragmento Kienow de DNA polimerase I,T4 DNA polimerase, DNA polimerases termoestáveis isoladas de Thermusaquaticus (Taq), disponível de uma variedade de fontes (por exemplo, PerkinElmer), Thermus thermophilus (United States Biochemicals), Bacillus stereo-thermophilus (Bio-Rad) ou Thermococcus Iitoralis ("Vent" polimerase, NewEngland Biolabs). Seqüências de DNA-alvo podem ser amplificadas pelatranscrição reversa do RNAm em DNAc, e a seguir efetuando-se PCR (RT-PCR) conforme descrito acima. Alternativamente, uma única enzima podeser usada para ambas as etapas conforme descrito na Patente U.S. No.5.322.770 (a qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade).

Além dos métodos de amplificação térmica enzimática descritosacima, as reações de amplificação enzimática isotérmica podem ser empre-gadas para amplificar seqüências-alvo de Neisseria gonorrhoeae usandoiniciadores de oligonucleotídeo da presente invenção (S. C. Andras et al,Mol. Biotechnol., 2001, 19: 29-44). Esses métodos incluem, porém não estãolimitados, à Amplificação Mediada por Transcrição (ou TMA, descrito, porexemplo, em D. Y. Kwoh et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989, 86: 1173-1177; C. Giachetti et al, J. Clin. Microbiol., 2002, 40: 2408-2419; e PatenteU.S. No. 5.399.491); Replicação de Seqüências auto-sustentada (ou 3SR,descrita por exemplo em, J. C. Guatelli et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA,1990, 87: 1874-1848; e Ε. Fahy et al, PCR Methods and Applications, 1991,1: 25-33); Amplificação baseada na Seqüência de Ácidos Nucléicos (ouNASBA, descrito por exemplo em T. Kievits et al, J. Virol., Methods, 1991,35: 273-286; e na Patente U.S. No. 5.130.238) e Amplificação de Desloca-mento de Filamento (ou DAS, descrito por exemplo em G. T. Walker et al,PNAS1 1992, 89: 392-396; EP O 500 224 A2). Cada uma das referências ci-tadas neste parágrafo é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

A Amplificação de Deslocamento de Filamento (SDA) combina acapacidade de uma endonuclease de restrição cortar o seu DNA-alvo e aação de uma DNA polimerase deficiente de exonuclease para estender aextremidade 3' no corte e deslocar o filamento de DNA à jusante em umatemperatura fixa (G. T. Walker et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1992, 89:392-396). Os iniciadores usados no DAS incluem o reconhecimento de umaendonuclease de restrição no sítio 5' à seqüência de ligação-alvo (PatentesAmericanas Nos. 5.270.184 e 5.344.166, cada uma das quais sendo incor-poradas aqui por referência na sua totalidade).

A Amplificação Baseada na Seqüencia de Ácidos Nucléicos(NASBA) usa três enzimas (por exemplo, a RNAse H, a transcriptase rever-sa do vírus da mieloblastose aviária (AMV) e a T7 RNA polimerase) funcio-nando em combinação em uma baixa temperatura isotérmica, geralmente 41qC (J. Compton, Nature, 1991, 350: 91-92; A.B. Chan e J.D. Fox, Rev. Med.Microbiol., 1999, 10: 185-196). O produto de uma reação NASBA é princi-palmente o RNA de filamento único. A reação de Replicação de SeqüênciaAuto-Sustentada (3SR) é um método muito eficiente para a amplificação iso-térmica de seqüências de RNA ou DNA-alvo. Um sistema 3SR envolve asatividades coletivas da AMV transcriptase reversa, da RNAse H de E. coli eda RNA polimerase dependente de DNA (por exemplo, a T7 RNA polimera-se). A Amplificação Mediada por Transcrição (TMA) usa uma RNA polimera-se para fazer RNA a partir de um promotor projetado na região do iniciador,uma transcriptase reversa para produzir DNA complementar de moldes deRNA e RNAse H para remover o RNA do DNAc (J. C. Guatelli et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87: 1874-1878).Iniciadores NASBA, 3SR e TMA e o promotor da RNA polimera-se ligado à seqüência de ligação-alvo do iniciador. Os promotores ou as se-qüências promotoras para a incorporação nos iniciadores são seqüências deácido nucléico (seja de ocorrência natural, produzidas sinteticamente ou umproduto de digestão de restrição) que são especificamente reconhecidos poruma RNA polimerase que reconhece e se liga àquela seqüência e inicia oprocesso de transcrição, por meio do qual os transcritos de RNA são gera-dos. Exemplos de promotores úteis incluem aqueles os quais são reconheci-dos por certas polimerases de bacteriófagos tais como aquelas do bacterió-fago T3, T7 ou SP6 ou um promotor de E. coli.

Detecção de seqüências-alvo de Neisseria gonorrhoeae am-plificadas

Em certas modalidades da presente invenção, seqüências desonda de oligonucleotídeos são usadas para detectar produtos de amplifica-ção gerados pela reação de amplificação (isto é, seqüência-alvo de Neisse-ria gonorrhoeae amplificada). As seqüências de sonda da invenção podemser empregadas usando uma variedade de metodologias homogêneas ouheterogêneas bem-conhecidas.

Métodos de detecção homogêneos incluem, porém não estãolimitados, ao uso de rotulados FRET que estejam ligados a sondas e queemitem um sinal na presença da seqüência-alvo, balizas moleculares (S.Tyagi e F. R. Kramer, Nature Biotechnol. 1996, 14: 303-308; S. Tyagi et al,Nature Biotechnol. 1998, 16: 49-53; L. G. Kostrikis et al, Science, 1998, 279:1228-1229; D. L. Sokol et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998, 95: 11538-11543; S. A. Marras et al, Genet. Anal. 1999, 14: 151-156; e Patentes Ame-ricanas Nos. 5.846.726, 5.925.517, 6.277.581 e 6.235.504), e os chamadosensaios TaqMan® (Patentes Americanas Nos. 5.210.015; 5.804.375;5.487.792 e 6.214.979 e WO 01/86001). Usando essas técnicas de detec-ção, os produtos da reação de amplificação podem ser detectados conformeeles são formados, isto é, de um modo chamado em tempo real. Como re-sultado, híbridos de produto/sonda de amplificação são formados e detecta-dos enquanto a mistura reacional está sob as condições de amplificação.Em certas modalidades, as sondas de detecção da presente in-venção são usadas em um ensaio TaqMan®. Um ensaio TaqMan®, tambémconhecido como um ensaio fluorogênico da 5' nuclease, é um sistema dedetecção baseado em PCR poderoso e versátil para alvos de ácido nucléico.

A análise é efetuada juntamente com a ciclização térmica pelo monitoramen-to da geração de sinais de fluorescência. O sistema de ensaio tem a capaci-dade de gerar dados quantitativos permitindo a determinação dos númerosde cópia-alvos. Por exemplo, curvas-padrão podem ser geradas usando dilu-ições em série de suspensões anteriormente quantificadas de Neisseria go-norrhoeae contra as quais amostras desconhecidas podem ser comparadas.O ensaio TaqMan® é convenientemente efetuado usando, por exemplo,DNA polimerase AmpIiTaq Gold®, a qual tem atividade da 5' nuclease endó-gena para digerir uma sonda de oiigonucleotídeo marcada tanto com umcorante-repórter fluorescente quanto com uma porção supressora, conformedescrito acima. Os resultados do ensaio são obtidos pela medição das alte-rações na fluorescência que ocorre durante o ciclo de amplificação conformea sonda é digerida, o desacoplamento das porções fluorescente e supresso-ra e a efetuação de um aumento no sinal de fluorescência que é proporcio-nal à amplificação da seqüência-alvo.

Outros exemplos de métodos de detecção homogêneos incluemos ensaios de proteção por hibridização (ΗΡΑ). Em tais ensaios, as sondassão marcadas com éster acridínio (AE), uma molécula altamente quimilumi-nescente (Weeks et ai., Clin. Chem., 1983, 29: 1474-1479; Berry et al, Clin.Chem., 1988, 34: 2087-2090) usando uma química de braço Iigante baseadaem não-nucleotídeos (Patentes Americanas Nos. 5.585.481 e 5.185.439). Aquimiluminescência é disparada pela hidrólise de AE com peróxido de hidro-gênio alcalino, o que produz uma N-metilacridona excitada que desativasubstancialmente com a emissão de um fóton. Na ausência de uma seqüên-cia-alvo, a hidrólise de AE é rápida. Entretanto, a taxa de hidrólise AE é mui-to reduzida quando a sonda está ligada à seqüência-alvo. Deste modo, assondas marcadas com AE hibridizadas e não-hibridizadas podem ser detec-tadas diretamente em solução sem a necessidade de separação física.Sistemas de detecção heterogêneos são bem-conhecidos natécnica e geralmente empregam um agente de captura para separar se-qüências amplificadas de outros materiais na mistura reacional. Agentes decaptura tipicamente compreendem um material em suporte sólido (por e-xemplo, cavidades de microtitulação, pérolas, chips e similaress) revestidoscom uma ou mais seqüências de ligação específicas. Uma seqüência Iigantepode ser complementar a uma seqüência de cauda adicionada em sondasde oligonucleotídeo da invenção. Alternativamente, uma seqüência Iigantepode ser complementar a uma seqüência de oligonucleotídeo de captura, elaprópria compreendendo uma seqüência complementar a uma seqüência decauda de uma sonda de oligonucleotídeo da invenção. Depois da separaçãodos híbridos produto/sonda de amplificação ligados aos agentes de capturada mistura reacionai remanescente, os híbridos produto/sonda de amplifica-ção podem ser detectados usando quaisquer métodos de detecção, tais co-mo aqueles aqui descritos.

II - Métodos de detecção de Neisseria gonorrhoeae em amostras deteste

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona métodospara detectar a presença de Neisseria gonorrhoeae em uma amostra de tes-te. Os métodos da invenção podem ser usados para testar pacientes osquais podem ou não exibir os sintomas de infecção gonocócica ou suas se-qüelas, e/ou varrer populações de risco.

Tipicamente, os métodos da invenção compreendem as etapasde: fornecer uma amostra de teste suspeita de conter um ácido nucléico deNeisseria gonorrhoeae (por exemplo, um ácido nucléico compreendendouma seqüência no gene de estrutura de leitura aberta 1 (ORF1), o gene dacitosina metiltransferase (dcmG) e o gene homólogo de proteína inversorade pilina (pivNG) de Neisseria gonorrhoeae)·, o contato da amostra de testecom pelo menos um oligonucleotídeo aqui descreve, de modo que o oligo-nucleotídeo possa hibridizar no ácido nucléico de Neisseria gonorrhoeae,caso presente na amostra de teste; e a detecção de qualquer oligonucleotí-deo hibridizado no ácido nucléico de Neisseria gonorrhoeae, em que a de-tecção da hibridização do oligonucleotídeo no ácido nucléico de Neisseriagonorrhoeae indica a presença de Neisseria gonorrhoeae na amostra deteste.

Outros métodos da presente invenção compreendem o contatode uma amostra de teste suspeita de conter um ácido nucléico de Neisseriagonorrhoeae com pelo menos um grupo iniciador ou grupo iniciador/sondaaqui descreve e reagentes de reação de amplificação para formar uma mis-tura reacional. A mistura reacional é, a seguir, colocada sob condições deamplificação de modo a amplificar o ácido nucléico de Neisseria gonorrhoe-ae, caso presente na amostra de teste, e gerar um produto de amplificação.O produto de amplificação resultante pode ser detectado usando uma varie-dade de tecnologias de detecção. Em certas modalidades, um híbrido produ-to de amplificação/sonda é formado usando uma sonda de detecção da pre-sente invenção, e a detecção de tal híbrido indica a presença de Neisseriagonorrhoeae na amostra de teste.

Separação de amostra

De acordo com os métodos da presente invenção, a presençade Neisseria gonorrhoeae em uma amostra de teste pode ser determinadapela detecção de qualquer ácido nucléico de Neisseria gonorrhoeae com-preendendo uma seqüência dentro do gene de estrutura de leitura aberta 1(ORF1), do gene da citosina metiltransferase (dcmG) ou do gene homólogode proteína inversora de pilina (pivNG) de Neisseria gonorrhoeae. Destemodo, qualquer material líquido ou sólido biológico suspeito de compreendertais seqüências-alvo de Neisseria gonorrhoeae pode ser uma amostra deteste adequada. Em certas modalidades, as amostras de teste preferidasincluem amostras de urina (por exemplo, primeiro jato de urina), fluido semi-nal, saliva, fluido do cristalino oculares, fluido linfático, endocervical, uretral,retal, vaginal, vulvo-vaginal e nasofaríngeas. Outras amostras de teste prefe-ridas incluem espécimes de esfregaço PAPS.

As amostras de teste serão comumente obtidas ou isoladas depacientes suspeitos de estarem infectados com Neisseria gonorrhoeae. Con-forme já mencionado, uma amostra de teste pode ser usada sem tratamentoadicional depois do isolamento ou, alternativamente, ela pode ser processa-da antes da análise. Por exemplo, uma amostra de teste pode ser tratada demodo a liberar os ácidos nucléicos de Neisseria gonorrhoeae das célulasque os contêm. Os métodos de extração de ácidos nucléicos são bem-conhecidos na técnica e incluem métodos químicos, métodos de temperatu-ra e métodos mecânicos (vide, por exemplo, J. Sambrook et al, "MolecularCloning: A Laboratory Manual", 1989, 2- Ed., Cold Spring Harbour Labora-tory Press: Nova Iorque, NY). Também há vários kits diferentes e versáteisque podem ser usados para extrair ácidos nucléicos de amostras biológicasque são comercialmente disponíveis, por exemplo, da Amersham Bioscien-ces (Piscataway, NJ), BD Biosciences Clontech (Paio Alto, CA), EpicentreTechnologies (Madison, Wl), Gentra Systems, Inc. (Minneapolis, MN), Mi-croProbe Corp. (Bothell, WA), Organon Teknika (Durham, NC) e Qiagen Inc.(Valencia, CA). Os Guias do Usuário que descrevem em grandes detalhes oprotocolo a ser seguido são geralmente incluídos em todos esses kits. Asensibilidade, o tempo de processamento e o custo podem ser diferentes deum kit em relação ao outro. Uma pessoa normalmente versada na técnicapode selecionar facilmente o(s) kit(s) mais apropriado(s) para uma situaçãoparticular.

Antes da extração, as células contendo ácidos nucléicos deNeisseria gonorrhoeae podem ser purificadas, concentradas ou, de outromodo, separadas de outros componentes da amostra biológica original, porexemplo, por filtração ou centrifugação.

Análise de amostra

Conforme será percebido por uma pessoa versada na técnica, aamplificação das seqüências-alvo de Neisseria gonorrhoeae e a detecçãodos ácidos nucléicos de Neisseria gonorrhoeae amplificados aos métodos dainvenção podem ser efetuados usando quaisquer metodologias de amplifica-ção/detecção, tais como aquelas aqui descritas. Em certas modalidades, adetecção de Neisseria gonorrhoeae em uma amostra de teste é efetuadausando um ensaio TaqMan®, e a formação dos produtos de amplificação émonitorada de modo em tempo real por fluorescência. Nessas modalidades,as sondas serão usadas que são marcadas com um repórter fluorescente naextremidade 5' e uma porção supressora na extremidade 3', conforme aquidescrito. A otimização das condições de amplificação e a seleção dos rea-gentes da reação de amplificação adequados para um formato de ensaioTaqMan® estão dentro das habilidades da técnica.

Em certas modalidades, um controle interno ou um padrão inter-no é adicionado à amostra biológica (ou aos ácidos nucléicos purificadosextraídos da amostra biológica) para servir como um controle para extraçãoe/ou amplificação - alvo). O controle interno geralmente inclui uma seqüênciaque difere da(s) seqüência(s)-alvo e que é capaz de efetuar a amplificaçãopelos iniciadores usados para amplificar o(s) ácido(s) nucléico(s) de Neisse-ria gonorrhoeae-alvo. O uso de um controle interno permite o monitoramentodo processo de extração, reação de amplificação e detecção, e controle dedesempenho do ensaio. O controle amplificado e o alvo amplificado são tipi-camente distintos na etapa de detecção pelo uso de diferentes sondas (porexemplo, marcadas com diferentes agentes detectáveis) para a detecção docontrole e do alvo.

A presença de Neisseria gonorrhoeae em uma amostra de testepode ser confirmada pela repetição de um ensaio de acordo com a presenteinvenção usando uma alíquota diferente da mesma amostra de teste biológi-ca ou usando uma diferente amostra de teste (por exemplo, um swab endo-cervical se a primeira amostra analisada for uma amostra de urina, ou umaamostra de urina coletada em um momento diferente). Os testes confirmató-rios também podem ser efetuados pelo direciona de uma região diferente docromossomo de Neisseria gonorrhoeae usando um diferente grupo dos inici-adores da invenção. Alternativamente ou adicionalmente, a presença deNeisseria gonorrhoeae em uma amostra de teste pode ser confirmada pelaefetuação de um ensaio diferente (isto é, um ensaio baseado em uma meto-dologia diferente). Por exemplo, se a primeira análise for efetuada usandoum ensaio TaqMan®, uma segunda análise pode ser executada usando umareação de amplificação mediada por transcrição (TMA).

Alternativamente ou adicionalmente, a presença de Neisseriagonorrhoeae em uma amostra de teste pode ser confirmada por um ensaiodiferente (por exemplo, isolamento de cultura celular).

Ill - Ensaios múltiplex para a detecção simultânea de Neis-sería gonorrhoeae e outros organismos

Conforme já mencionado, os grupos iniciador/sonda da presenteinvenção são específicos para Neisseria gonorrhoeae. Concordantemente, apresente invenção também proporciona métodos para detectar simultanea-mente a presença de Neisseria gonorrhoeae e outros organismos em umaamostra de teste usando uma combinação de pelo menos dois grupos deiniciadores ou grupos de iniciador/sonda (isto é, um selecionado dos gruposespecíficos de Neisseria gonorrhoeae aqui descritos e outro selecionado dosgrupos específicos para o outro organismo a ser testado).

Outros organismos que podem ser detectados simultaneamentecom Neisseria gonorrhoeae incluem, porém não estão limitados, a qualquerum dos organismos listados na Tabela 4. Em certas modalidades, o outroorganismo a ser testado simultaneamente com Neisseria gonorrhoeae é C-hlamydia trachomatis.

Particularmente, a presente invenção proporciona um métodopara a detecção de Neisseria gonorrhoeae e/ou Chiamydia trachomatis emuma amostra de teste, a qual compreende as etapas de: proporcionar umaamostra de teste suspeita de conter ácido nucléico de Neisseria gonorrhoe-ae e/ou ácido nucléico de Chiamydia trachomatis: o contato da amostra deteste com um grupo iniciador/sonda aqui descrito sob condições para ampli-ficar todo ou parte do ácido nucléico de Neisseria gonorrhoeae, caso presen-te na amostra, para produzir amplicons de Neisseria gonorrhoeae; o contatoda amostra de teste com pelo menos um grupo iniciador/sonda específicopara Chiamydia trachomatis sob condições para amplificar todo ou parte doácido nucléico de Chiamydia trachomatis, caso presente na amostra, paraproduzir amplicons de Chiamydia trachomatis; e a detecção de quaisqueramplicons de Neisseria gonorrhoeae e quaisquer amplicons de Chiamydiatrachomatis, em que a detecção de amplicons de Neisseria gonorrhoeae in-dica a presença de Neisseria gonorrhoeae na amostra de teste, e em que adetecção de amplicons de Chlamydia trachomatis indica a presença de C-hlamydia trachomatis na amostra de teste.

Em certas modalidades preferidas, o grupo iniciador/sonda es-pecífico para Chlamydia trachomatis é um descrito no Pedido InternacionalNo. PCT/US2006/43394 (da Siemens Medicai Solutions Diagnostics) (o qualé aqui incorporado por referência na sua totalidade).

IV - Kits

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona kits compre-endendo materiais úteis para a detecção de infecção gonocócica de acordocom os métodos aqui descritos. Os kits da invenção podem ser usados emlaboratórios de diagnóstico, em laboratórios experimentais ou por profissio-nais liberais.

Reagentes e material básico necessário para a detecção deNeisseria gonorrhoeae de acordo com a presente invenção podem ser mon-tados juntos em um kit. Em certas modalidades, os kits compreendem pelomenos um grupo de iniciador da invenção ou grupo iniciador/sonda e, opcio-nalmente, reagentes de reação de amplicon. Cada kit preferivelmente com-preende os reagentes os quais conferem o procedimento específico. Destemodo, um kit adaptado para uso com NASBA preferivelmente contém inicia-dores com um promotor da RNA polimerase ligado à seqüência de ligação-alvo, enquanto que um kit adaptado para uso com DAS preferivelmente con-tém iniciadores incluindo um sítio de reconhecimento de endonuclease derestrição 5' à seqüência de ligação-alvo. Semelhantemente, quando o kit éadaptado para uso em um ensaio de nuclease 5', tal como o ensaio Taq-Man®, as sondas de detecção preferivelmente contêm pelo menos uma por-ção-repórter fluorescente e pelo menos uma porção supressora.

Reagentes de reação de amplificação adequados incluem, porexemplo, um ou mais de: tampões, reagentes, enzimas com atividade depolimerase e/ou transcriptase reversa ou atividade de exonuclease, co-fatores enzimáticos tais como magnésio ou manganês; sais; trifosfatos dedesoxinucleotídeo (dNTPs) tais como trifosfato de desoxiadenosina (dATP),trifosfato de desoxiguanosina (dGTP), trifosfato de desoxicitidina (dCTP),trifosfato de desoxitimidina (dTTP) e trifosfato de desoxiuridina (dUTP) ade-quados para efetuar a reação de amplificação. Por exemplo, um kit, adapta-do para uso com NASBA, pode conter quantidades adequadas de transcrip-tase reversa, RNAse H e T7 RNA polimerase. Em kits adaptados para rea-ção de amplificação de transcrição, tais como NASBA, tampões podem serincluídos que contêm, por exemplo, DMSO, o qual é conhecido por intensifi-car a reação de amplificação.

Dependendo do procedimento, kits podem ainda compreenderum ou mais dentre: tampões de lavagem e/ou reagentes, tampões de hibri-dização e/ou reagentes, tampões de rotulação e/ou reagentes e meios dedetecção. Os tampões e/ou reagentes são preferivelmente otimizados para atécnica de amplificação/detecção particular para a qual o kit é tencionado.Os protocolos para uso desses tampões e reagentes para efetuar diferentespassos do procedimento podem também estar incluídos no kit.

Além disso, os kits podem ser fornecidos com um controle inter-no como uma verificação do procedimento de amplificação e para prevenir aocorrência de resultados de teste falso negativo devido a falhas no procedi-mento de amplificação. Uma seqüência de controle ótima é selecionada detal forma que ela não irá competir com a seqüência de ácido nucléico-alvona reação de amplificação (conforme descrito acima).

Os kits também podem conter reagentes para o isolamento deácidos nucléicos de espécimes biológicas antes da amplificação e/ou purifi-cação ou separação de células de Neisseria gonorrhoeae antes da extraçãodo ácido nucléico.

Os reagentes podem ser fornecidos em uma forma sólida (porexemplo, liofilizada) ou líquida. Os kits da presente invenção podem com-preender opcionalmente diferentes recipientes (por exemplo frascos, ampo-las, tubos de ensaio, frascos ou garrafas) para cada tampão e/ou reagenteindividual. Cada componente irá ser geralmente apropriado conforme aliquo-tado no seu respectivo recipiente ou fornecido em uma forma concentrada.Outros recipientes adequados para efetuar certos passos do ensaio de am-plificação/detecção também podem ser fornecidos. Os recipientes individuaissão preferivelmente mantidos em confinamento fechado para venda comercial.

Os kits podem também compreender instruções para uso dosreagentes da reação de amplificação e dos grupos de iniciadores ou inicia-dor/sonda aqui descritos. As instruções para o uso de kits de acordo com umou mais métodos da invenção podem compreender instruções para proces-sar a amostra biológica, a extração de moléculas de ácido nucléico e/ou aefetuação do teste; as instruções para interpretar os resultados obtidos, as-sim como uma observação na forma prescrita por uma agência governamen-tal (por exemplo, FDA) regulando a fabricação, uso ou venda de produtosfarmacêuticos ou biológicos.

Exemplos

O seguinte exemplo descreve alguns dos modos preferidos defazer e praticar a presente invenção. Entretanto, deve ser entendido que es-se exemplo é somente para propósitos ilustrativos e não é tencionado a limi-tar o escopo da invenção. Além disso, a não ser que a descrição em um E-xemplo seja apresentada no tempo passado, o texto, assim como o resto darelatório descritivo, não é tencionado a sugerir que os experimentos foramefetivamente efetuados os dados foram de fato obtidos.

Exemplo 1: Especificidade do ensaio multiplex de Chlamy-dia trachomatislNeisseria gonorrhoeae

Um ensaio kPCR TaqMan multiplex foi usado para testar quinze(15) diferentes sorovariantes de Chlamydia trachomatis (CT) (isto é, A, B,Ba, G, D, E, F, G, Η, I, J, K, LI, L2 e L3) e quarenta e seis (46) diferentes iso-lados de Neisseria gonorrhoeae (GC).

A amplificação e detecção em um único poço reacional fechadoforam realizadas usando o sistema de PCR em tempo real Mx3000P™ daStratagene (Stratagene Inc., San Diego, CA). A mistura mestre do ensaiousada nesses experimentos continha Taq DNA polimerase, tampão, corantede referência (ROX) e MgCI2, AmpErase™ UNG (1 unidade/μL) da AppliedBiosystems (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA) ou QIAGEN(Hilden, Alemanha); iniciadores e sondas de oligonucleotídeo TaqMan® dainvenção foram sintetizados in-house ou comprados da BioSearch Inc. Amistura reacional kPCR foi compreendida de 25 μL de mistura mestre e 25μL de DNA purificado.

Os resultados obtidos, os quais estão reportados na Tabela 4,mostram que o ensaio multiplex CT/GC pode detectar uma ampla faixa desorovariantes CT e isolados de GC.

A mistura mestre PCR multiplex CT/GC também foi desafiadacom 107 cópias de DNA genômico de 74 organismos intimamente relaciona-dos (listados na Tabela 3), e não demonstraram reatividade cruzada.Outras modalidades

Outras modalidades da invenção serão aparentes para as pes-soas versadas na técnica a partir de uma consideração da relatório descriti-vo ou prática da invenção aqui revelada. É planejado que a relatório descriti-vo e os exemplos sejam somente considerados como exemplares, com overdadeiro escopo da invenção sendo indicado pelas seguintes reivindica-ções.Listagem de seqüência

110> Ku1 etal.

<120> Seqüências de oligonucleotídeo específicas de neisseria gonorrhoeae<130> 2007674-0046<140> 11/784,502<141 > 2007-04-06<160> 52

<170> Patentln versão 3.2<210> 1<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 1

gcggattccc ttgtcaagat t 21

<210> 2<211> 17<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Oligonucleotide sequenc<400> 2

gccgcgctca ccctcta 17

<210> 3<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 3

ttccatgatt tggaaacagc cggg 24<210> 4<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 4

cccggctgtt tccaaatcat ggaa 24

<210> 5<211> 27<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 5

agtacgtttg gatacaggat ttgattt 27

<210> 6<211> 19<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 6

agccgttttc gccagtttc 19

<210> 7<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 7

ccatccggaa ccgacgcaca a 21<210> 8<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 8

ggaacgagcc atcaaaaaca a 21

<210> 9<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 9

gcggttcagg gaagtgatag c 21

<210> 10<211> 24<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 10

ttgcagcagg tggcggtggt actt 24

<210> 11<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 11

aagtaccacc gccacctgct gcaa 24<210> 12<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 12

aaggtatgat tagccacgtt tatcg 25

<210> 13<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 13

cgccacctgc tgcaataatt 20

<210> 14<211> 26<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 14

cgtatgcatc ggaacgagcc atcaaa 26

<210> 15<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 15

gccttttttc ctttcgggat t 21<210> 16<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 16

gtacataaga aaggcggaga ttacg 25

<210> 17<211> 23<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 17

acgccgattt gtaacgcgat gga 23

<210> 18<211> 23<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 18

tccatcgcgt tacaaatcgg cgt 23

<210> 19<211> 19<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 19

gacgcttcac gccttcctt 19<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo

<400> 20

ccatgaatga acagcttgaa gttt 24

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo

<400> 21

aggcttctcc gtctgctctt ttatcttctc ctt 33

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo

<400> 22

gcatcctgtt tgtctgtttt gg 22

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo

<400> 23

ttacgtagtg aatccgctga aaata 25<210> 24<211> 28<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 24

Cys Gly Cys Thr Thr Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly Cys Thr Thr Thr15 10 15

Cys Thr Gly Cys Ala Thr Ala Cys Thr Thr Gly Cys20 25

<210> 25<211> 18<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 25

ccgaatgctc cgttttgc 18

<210> 26<211 >-25<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 26

gtaacgccgt aggattggat atatc 25

<210> 27<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220><223> Seqüência de oligonucleotídeo

<400> 27

ccatggcgga tgcgttaaag gtcag 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo

<400> 28

ctgaccttta acgcatccgc catgg 25

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo

<400> 29

tgatctaaac cttttgaatc gttgtc 26

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo

<400> 30

aacgcatccg ccatggt 17

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220><223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 31

aactttgccg aatgctccgt tttgc 25

<210> 32<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo

<400> 32

gacgcttcac gccttcctt 19

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo

<400> 33

ccatgaatga acagcttgaa gttt 24

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo

<400> 34

aggcttctcc gtctgctct 19

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220><223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 35

tctgcctatt gccggtatgg t 21

<210> 36<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 36

gaagcggcca aagcatatgc 20

<210> 37<211> 19<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 37

aggcttctcc gtctgctct 19

<210> 38<211> 19<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 38

attgccggta tggtttcaa 19

<210> 39<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220><223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 39

gaagcggcca aagcatatgc 20

<210> 40<211> 19<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 40

aggcttctcc gtctgctct 19

<210> 41<211> 21<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 41

gtcattctgc ctattgccgg t 21

<210> 42<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 42

gaagcggcca aagcatatgc 20

<210> 43<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220><223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 43

tgcatccaat cagatttcct ttcg 24

<210> 44<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 44

tctgcctatt gccggtatgg t 21

<210> 45<211> 20<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 45

gaagcggcca aagcatatgc 20

<210> 46<211> 23<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 46

gcttcacgcc ttccttgcag tta 23

<210> 47<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220><223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 47

tctgcctatt gccggtatgg t 21

<210> 48<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 48

gaagcggcca aagcatatgc 20

<210> 49<211> 20<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 49

tcacgccttc cttgcagtta 20

<210> 50<211> 26<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 50

tgatctaaac cttttgaatc gttgtc 26

<210> 51<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220><223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 51

gtaacgccgt aggattggat atatc<210> 52<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência de oligonucleotídeo<400> 52

ccatggcgga tgcgttaaag gtcag

Claims (31)

1. Oligonucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência deácido nucléico selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOS: 1 a 52,seus fragmentos ativos e suas combinações.

2. Oligonucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1,compreendendo ainda um rotulado detectável.

3. Oligonucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 2,em que o rotulado detectável compreende uma porção fluorescente ligadana extremidade 5' do oligonucleotídeo.

4. Oligonucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 3,em que o referido oligonucleotídeo ainda compreende uma porção supresso-ra ligada na sua extremidade 3'.

5. Oligonucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 4,em que a porção fluorescente compreende 6-carboxifluoresceína e a porçãosupressora compreende um Black Hole Quencher.

6. Coleção de iniciadores para detectar Neisseria gonorrhoeaeem uma amostra de teste, a coleção compreendendo pelo menos um grupode iniciador selecionado do grupo consistindo no Grupo do Iniciador 1, doGrupo do Iniciador 2, Grupo do Iniciador 3, Grupo do Iniciador 4, Grupo doIniciador 5, Grupo do Iniciador 6, Grupo do Iniciador 7, Grupo do Iniciador 8,Grupo do Iniciador 9, Grupo do Iniciador 10, Grupo do Iniciador 11, Grupo doIniciador 12, Grupo do Iniciador 13, Grupo do Iniciador 14, Grupo do Inicia-dor 15 e Grupo do Iniciador 16, em que:O Grupo Iniciador 1 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 1 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 2 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 2 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 5 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 6 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 3 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 8 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 9 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 4 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 12 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 13 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 5 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 15 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 16 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 6 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 19 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 20 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 7 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 22 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 23 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 8 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 25 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 26 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 9 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 29 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 30 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 10 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 32 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 33 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 11 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 35 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 36 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 12 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 38 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 39 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 13 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 41 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 42 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 14 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 44 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 45 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 15 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 47 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 48 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 16 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 50 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 51 ou qualquer fragmento ativoseu.

7. Coleção de oligonucleotídeos para detectar Neisseria gonor-rhoeae em uma amostra de teste, a coleção compreendendo pelo menos umgrupo iniciador/sonda selecionado do grupo consistindo no Grupo IniciadorSonda 1, Grupo Iniciador Sonda 2, Grupo Iniciador Sonda 3, Grupo IniciadorSonda 4, Grupo Iniciador Sonda 5, Grupo Iniciador Sonda 6, Grupo IniciadorSonda 7, Grupo Iniciador Sonda 8, Grupo Iniciador Sonda 9, Grupo IniciadorSonda 10, Grupo Iniciador Sonda 11, Grupo Iniciador Sonda 12, Grupo Inici-ador Sonda 13, Grupo Iniciador Sonda 14, Grupo Iniciador Sonda 15 e Gru-po Iniciador Sonda 16, em que:O grupo iniciador/sonda 1 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 3 ou umfragmento ativo seu, e uma sonda de detecção complementar reversa com-preendendo a SEQ ID NO: 4 ou um fragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 2 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 5 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 6 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 7 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 3 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 8 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 9 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 10 ou umfragmento ativo seu. uma sonda de detecção complementar reversa com-preendendo a SEQ ID NO: 11 ou um fragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 4 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 12 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 13 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 14 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 5 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 15 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 16 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 17 ou umfragmento ativo seu, e uma sonda de detecção complementar reversa com-preendendo a SEQ ID NO: 18 ou um fragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 6 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 19 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 20 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 21 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 7 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 22 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 23 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 24 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 8 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 25 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 26 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 27 ou umfragmento ativo seu, e uma sonda de detecção complementar reversa com-preendendo a SEQ ID NO: 28 ou um fragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 9 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 29 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 30 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 31 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 10 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 32 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 33 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 34 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 11 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 35 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 36 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 37 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 12 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 38 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 39 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 40 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 13 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 41 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 42 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 43 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 14 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 44 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 45 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 46 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 15 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 47 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 48 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 49 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 16 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 50 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 51 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 52 ou um fragmento ativoseu.

8. Coleção de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação-7, em que pelo menos uma das sondas de detecção compreende um rotula-do detectável.

9. Coleção de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação-8, em que o rotulado detectável é diretamente ligado a pelo menos uma son-da de detecção.

10. Coleção de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação-8, em que o rotulado detectável é indiretamente ligado a pelo menos umasonda de detecção.

11. Coleção de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação-8, em que o rotulado detectável é diretamente detectável.

12. Coleção de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação-8, em que o rotulado detectável é indiretamente detectável.

13. Coleção de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação-8, em que o rotulado detectável compreende uma porção fluorescente ligadana extremidade 5' de pelo menos uma sonda de detecção.

14. Coleção de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação-13, em que pelo menos uma sonda de detecção anda compreende uma por-ção supressora ligada na sua extremidade 3'.

15. Coleção de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação-14, em que a porção fluorescente compreende 6-carboxifIuoresceína e aporção supressora compreende um Blach Hole Quencher.

16. Kit para detectar Neisseria gonorrhoeae em uma amostra deteste compreendendo:reagentes de reação de amplificação; epelo menos um grupo iniciador selecionado do grupo consistindode: Grupo do Iniciador 1, do Grupo do Iniciador 2, Grupo do Iniciador 3, Gru-po do Iniciador 4, Grupo do Iniciador 5, Grupo do Iniciador 6, Grupo do Inici-ador 7, Grupo do Iniciador 8, Grupo do Iniciador 9, Grupo do Iniciador 10,Grupo do Iniciador 11, Grupo do Iniciador 12, Grupo do Iniciador 13, Grupodo Iniciador 14, Grupo do Iniciador 15 e Grupo do Iniciador 16, em que:O Grupo Iniciador 1 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 1 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 2 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 2 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 5 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 6 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 3 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 8 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 9 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 4 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 12 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 13 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 5 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 15 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 16 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 6 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 19 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 20 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 7 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 22 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 23 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 8 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID N.O: 25 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 26 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 9 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 29 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 30 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 10 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 32 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 33 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 11 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 35 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 36 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 12 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 38 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 39 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 13 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 41 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 42 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 14 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 44 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 45 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 15 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 47 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 48 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 16 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 50 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 51 ou qualquer fragmento ativoseu.

17. Kit para detectar Neisseria gonorrhoeae em uma amostra deteste compreendendo:reagentes de reação de amplificação; epelo menos um grupo iniciador/sonda selecionado do grupoconsistindo no Grupo Iniciador Sonda 1, Grupo Iniciador Sonda 2, GrupoIniciador Sonda 3, Grupo Iniciador Sonda 4, Grupo Iniciador Sonda 5, GrupoIniciador Sonda 6, Grupo Iniciador Sonda 7, Grupo Iniciador Sonda 8, GrupoIniciador Sonda 9, Grupo Inieiador Sonda 10, Grupo Inieiador Sonda 11,Grupo Inieiador Sonda 12, Grupo Inieiador Sonda 13, Grupo Inieiador Sonda-14, Grupo Inieiador Sonda 15 e Grupo Inieiador Sonda 16, em que:O grupo iniciador/sonda 1 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 3 ou umfragmento ativo seu, e uma sonda de detecção complementar reversa com-preendendo a SEQ ID NO: 4 ou um fragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 2 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 5 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 6 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 7 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 3 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 8 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 9 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 10 ou umfragmento ativo seu. uma sonda de detecção complementar reversa com-preendendo a SEQ ID NO: 11 ou um fragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 4 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 12 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 13 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 14 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 5 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 15 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 16 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 17 ou umfragmento ativo seu, e uma sonda de detecção complementar reversa com-preendendo a SEQ ID NO: 18 ou um fragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 6 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 19 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 20 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 21 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 7 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 22 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 23 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 24 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 8 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 25 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 26 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 27 ou umfragmento ativo seu, e uma sonda de detecção complementar reversa com-preendendo a SEQ ID NO: 28 ou um fragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 9 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 29 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 30 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 31 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 10 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 32 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 33 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 34 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 11 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 35 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 36 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 37 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 12 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 38 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 39 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 40 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 13 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 41 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 42 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 43 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 14 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 44 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 45 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 46 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 15 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 47 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 48 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 49 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 16 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 50 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 51 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 52 ou um fragmento ativoseu.

18. Kit, de acordo com a reivindicação 17, em que pelo menosuma das sondas de detecção compreende um rotulado detectável.

19. Kit, de acordo com a reivindicação 18, em que o rotulado de-tectável é diretamente ligado a pelo menos uma sonda de detecção.

20. Kit, de acordo com a reivindicação 18, em que o rotulado de-tectável é indiretamente ligado a pelo menos uma sonda de detecção.

21. Kit, de acordo com a reivindicação 18, em que o rotulado de-tectável é diretamente detectável.

22. Kit, de acordo com a reivindicação 18, em que o rotulado de-tectável é indiretamente detectável.

23. Kit, de acordo com a reivindicação 18, em que o rotulado de-tectável compreende uma porção fluorescente ligada na extremidade 5' depelo menos uma sonda de detecção.

24. Kit, de acordo com a reivindicação 23, em que pelo menosuma sonda de detecção ainda compreende uma porção supressora ligadana sua extremidade 3'.

25. Kit, de acordo com a reivindicação 24, em que a porção fluo-rescente compreende 6-carboxifluoresceína e a porção supressora compre-ende um Blach Hole Quencher.

26. Método para detectar Neisseria gonorrhoeae em uma amos-tra de teste, o método compreendendo os passos de:proporcionar uma amostra de teste suspeita de conter um ácidonucléico de Neisseria gonorrhoeae;o contato da amostra de teste com pelo menos um oligonucleo-tídeo isolado de modo que pelo menos um oligonucleotídeo possa hibridizarcom o ácido nucléico de Neisseria gonorrhoeae, caso presente na amostrade teste; ea detecção de qualquer oligonucleotídeo hibridizado no ácidonucléico de Neisseria gonorrhoeae, onde a detecção de um oligonucleotídeohibridizado no ácido nucléico de Neisseria gonorrhoeae indica a presença deNeisseria gonorrhoeae na amostra de teste,em que o oligonucleotídeo isolado compreende uma seqüênciade ácidos nucléicos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID Nos: 1 a-52, seus fragmentos ativos e suas combinações.

27. Método para detectar Neisseria gonorrhoeae na amostra deteste, o método compreendendo os passos de:fornecer uma amostra de teste suspeita de conter um ácido nu-cléico de Neisseria gonorrhoeae;o contato da amostra de teste com pelo menos um grupo inicia-dor sob condições de modo que todo ou parte do ácido nucléico de Neisseriagonorrhoeae seja amplificado, caso presente na amostra de teste, gerandodessa forma amplicons de Neisseria gonorrhoeae; ea detecção de quaisquer amplicons de Neisseria gonorrhoeae,em que a detecção de amplicons de Neisseria gonorrhoeae indica a presen-ça de Neisseria gonorrhoeae na amostra de teste,em que pelo menos um grupo de iniciador é selecionado do gru-po consistindo de Grupo do Iniciador 1, do Grupo do Iniciador 2, Grupo doIniciador 3, Grupo do Iniciador 4, Grupo do Iniciador 5, Grupo do Iniciador 6,Grupo do Iniciador 7, Grupo do Iniciador 8, Grupo do Iniciador 9, Grupo doIniciador 10, Grupo do Iniciador 11, Grupo do Iniciador 12, Grupo do Inicia-dor 13, Grupo do Iniciador 14, Grupo do Iniciador 15 e Grupo do Iniciador 16,em que:O Grupo Iniciador 1 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 1 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 2 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 2 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 5 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 6 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 3 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 8 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 9 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 4 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 12 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 13 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 5 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 15 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ÍD NO: 16 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 6 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 19 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 20 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 7 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 22 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 23 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 8 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 25 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 26 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 9 compreende um iniciador "forward" compre-endendo a SEQ ID NO: 29 ou qualquer fragmento ativo seu, e um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 30 ou qualquer fragmento ativo seu.O Grupo Iniciador 10 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 32 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 33 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 11 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 35 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 36 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 12 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 38 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 39 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 13 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 41 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 42 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 14 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 44 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 45 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 15 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 47 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 48 ou qualquer fragmento ativoseu.O Grupo Iniciador 16 compreende um iniciador "forward" com-preendendo a SEQ ID NO: 50 ou qualquer fragmento ativo seu, e um inicia-dor reverso compreendendo a SEQ ID NO: 51 ou qualquer fragmento ativoseu.

28. Método para detectar Neisseria gonorrhoeae em uma amos-tra de teste, o método compreendendo os passos de:fornecer uma amostra de teste suspeita de conter ácido nucléicode Neisseria gonorrhoeae;colocar em contato a amostra teste com pelo menos um grupoiniciador/sonda sob condições de modo que todo ou parte do ácido nucléicode Neisseria gonorrhoeae seja amplificado, caso presente na amostra deteste, gerando deste modo amplicons de Neisseria gonorrhoeae; ea detecção de amplicons de Neisseria gonorrhoeae, em que adetecção dos amplicons de Neisseria gonorrhoeae indica a presença deNeisseria gonorrhoeae na amostra de teste,em que pelo menos um grupo iniciador/sonda é selecionado dogrupo consistindo no Grupo Iniciador Sonda 1, Grupo Iniciador Sonda 2,Grupo Iniciador Sonda 3, Grupo Iniciador Sonda 4, Grupo Iniciador Sonda 5,Grupo Iniciador Sonda 6, Grupo Iniciador Sonda 7, Grupo Iniciador Sonda 8,Grupo Iniciador Sonda 9, Grupo Iniciador Sonda 10, Grupo Iniciador Sonda-11, Grupo Iniciador Sonda 12, Grupo Iniciador Sonda 13, Grupo IniciadorSonda 14, Grupo Iniciador Sonda 15 e Grupo Iniciador Sonda 16, em que:O grupo iniciador/sonda 1 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 3 ou umfragmento ativo seu, e uma sonda de detecção complementar reversa com-preendendo a SEQ ID NO: 4 ou um fragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 2 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 5 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 6 ou um fragmento ativo seü, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 7 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 3 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 8 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 9 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 10 ou umfragmento ativo seu. uma sonda de detecção complementar reversa com-preendendo a SEQ iD NO: 11 ou um fragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 4 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 12 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 13 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 14 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 5 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 15 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 16 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 17 ou umfragmento ativo seu, e uma sonda de detecção complementar reversa com-preendendo a SEQ ID NO: 18 ou um fragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 6 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 19 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 20 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 21 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 7 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 22 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 23 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 24 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 8 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 25 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 26 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 27 ou umfragmento ativo seu, e uma sonda de detecção complementar reversa com-preendendo a SEQ ID NO: 28 ou um fragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 9 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 29 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 30 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção complementar compreendendo a SEQ ID NO: 31 ou umfragmento ativo seu.O grupo iniciador/sonda 10 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 32 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 33 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 34 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 11 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 35 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 36 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 37 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 12 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 38 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 39 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 40 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 13 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 41 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 42 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 43 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 14 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 44 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 45 ou um fragmento ativo seu, umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 46 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 15 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 47 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 48 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 49 ou um fragmento ativoseu.O grupo iniciador/sonda 16 compreende um iniciador "forward"compreendendo a SEQ ID NO: 50 ou um fragmento ativo seu, um iniciadorreverso compreendendo a SEQ ID NO: 51 ou um fragmento ativo seu e umasonda de detecção compreendendo a SEQ ID NO: 52 ou um fragmento ativoseu.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, em que ocontato da amostra de teste sob condições de modo que todo ou parte doácido nucléico de Neisseria gonorrhoeae seja amplificado compreende asubmissão da amostra de teste a uma reação de amplificação de ácido nu-cléico executada sob condições de amplificação adequadas e na presençade reagentes reacionais de amplificação adequados.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, em que a reaçãode amplificação é executada usando a reação em cadeia da polimerase (P-CR), PCR de transcriptase reversa (RT-PCR) ou um ensaio Taq-Man™.

31. Método, de acordo com as Reivindicações 26, 27 ou 28, emque a amostra de teste compreende um fluido corporal selecionado do grupoconsistindo de amostras de urina, fluido seminal, saliva, fluidos de cristalinosoculares, fluido linfático, endocervicais, uretrais, retais, vaginais, vulvo-vaginais e nasofaríngeas.