JP5319281B2 - エキノカンジン系薬物に対する耐性の分析法並びに同分析法のためのオリゴヌクレオチド・セット及び試薬キット - Google Patents
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Description
本発明は、カンジダ属のような酵母およびアスペルギルス属のようなカビなどの真菌における、カスポファンギン、ミカファンギンおよびアニデュラファンギンを含むエキノカンジン系薬物に対する耐性を付与する突然変異を検出する核酸分析法を含む。該分析法は、真菌を含むかまたは真菌を含む疑いのある任意のサンプル、限定するものではないがヒトから得たサンプル、例えば血液、尿、または組織サンプルに適している。カンジダ属菌種としては、C.アルビカンス(C.albicans)、C.クルセイ(C.krusei)、C.ギリモンディ(C.guillermondii)、C.グラブラータ(C.glabatra)、C.トロピカリス(C.tropicalis)およびC.パラプシローシス(C.parapsilosis)が挙げられる。アスペルギルス属菌種には、A.フミガーツス(A.fumigatus)、A.フラバス(A.flavus)、A.ニガー(A.niger)、A.ニデュランス(A.nidulans)およびA.テレウス(A.terreus)が挙げられる。該分析法の標的は、FKS1pファミリータンパク質中の2つの保存された領域のうち一方、または好ましくは両方に対応する核酸(DNA、RNA)配列である。本発明者らが第1領域またはHS1と呼ぶ領域は、アミノ酸配列CaFks1pのPhe641〜Pro649に相当する。本発明の分析法の標的核酸配列はその保存領域に相当するが、各々の保存領域の一端または両端の1個、2個または数個、最大5個の追加アミノ酸に相当する場合もある。本発明者らが第2領域またはHS2と呼ぶ領域は、アミノ酸配列CaFks1pのAsp1357〜Leu1364に相当する。本発明の分析法の標的核酸配列はその保存領域に相当するが、両端の追加アミノ酸、CaFks1pのアミノ酸1345からLeu1364を越えて1個、2個または最大5個のアミノ酸まで(例えばアミノ酸1345−1369)に相当する場合もある。実験室株および臨床分離株を使用して、本発明者らはエキノカンジン耐性を付与するいくつかの突然変異を上記領域中に同定した。本発明者らが使用した実験室株の中には、CAI4およびM70(実施例2を参照)ならびに本発明者らが作製した実験室突然変異株(本明細書では「NR」株(例えばNR2)とする)がある。この実験室株および臨床分離株から、本発明者らは、耐性を与えるいくつかの単一アミノ酸の変化、例えばF641L、F641S、S645P、S645Y、S645F、D648Y、P649H、R1361HおよびR1361Gなど、ならびに該アミノ酸の変化の原因であるいくつかのSNPを同定した。
GSはグルカン・シンターゼの略語である。
Fks1pは、現在β(1−3)−グルカン形成を担うグルカン・シンターゼ複合体の触媒サブユニットとされているFks1タンパク質の略語である。
CaFks1pはC.アルビカンスのFks1タンパク質である。
CaFKS1はC.アルビカンスのFKS1遺伝子である。
CCATTTGGTTGTTACAATATTGC−3’
CCAATGGAATGAAAGAAATGAAG−3’
を有する。
野生型プローブ:
本発明のいくつかの実施形態について説明してきた。しかしながら、本発明の思想および範囲から逸脱することなく様々な改変がなされうることは理解されるだろう。例えば、PCR以外の増幅方法、例えばNASBAを使用することも可能であり、また、分子ビーコンプローブ以外の対立遺伝子識別プローブを使用することもできる。従って、他の実施形態は特許請求の範囲の範囲内にある。
Claims (19)
- エキノカンジン系薬物に対して感受性で、かつ1−3β−D−グルカン・シンターゼのサブユニットFks1pに対応するFKS1遺伝子を含む真菌における、エキノカンジン系薬物に対する耐性を付与する突然変異を検出するための核酸分析法であって、
増幅された第1の標的配列を生成するためにCaFks1pアミノ酸636〜654の少なくとも一部分であってアミノ酸641〜649を含む部分に対応するFKS1遺伝子の第1の核酸標的配列を増幅する増幅工程と、
前記増幅した第1の標的配列をCaFks1pのS645P、S645Y、およびS645Fからなる群より選択されるアミノ酸突然変異に対して特異的な標識したハイブリダイゼーションプローブと接触させる接触工程と、
前記増幅した第1の標的配列における突然変異の存在を検出する検出工程と、からなる分析法。 - 真菌はカンジダ属真菌である、請求項1に記載の分析法。
- CaFks1pのF641L、F641S、D648Y、およびP649Hからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸突然変異を検出する工程を更に含む、請求項1または請求項2に記載の分析法。
- 前記増幅工程は、1−3−β−D−グルカン・シンターゼのサブユニットFks1pに対応し、CaFks1pアミノ酸1345〜1369の少なくとも一部分であってアミノ酸1357〜1364を含む部分に対応する、FKS1遺伝子の第2の核酸標的配列を増幅することを含み、かつ前記検出工程が、増幅した第2の標的配列における突然変異の存在を検出することを含む、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の分析法。
- CaFks1pのR1361HおよびR1361Gからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸の変化を検出することができる、請求項4に記載の分析法。
- 第1の標的配列および第2の標的配列の増幅は同一の反応液中で実施される、請求項4または5に記載の分析法。
- 前記検出工程は塩基配列決定法を更に含む、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の分析法。
- 前記検出工程は、増幅した第1および第2の標的配列を、標識したハイブリダイゼーションプローブと接触させることを含む、請求項4乃至6のいずれか1項に記載の分析法。
- 検出は、均一系の終点検出またはリアルタイム検出である、請求項8に記載の分析法。
- 前記分析法はリアルタイム分析法である、請求項9に記載の分析法。
- 前記増幅工程は、PCR、NASBAおよびTMAからなる群から選択される増幅方法を含む、請求項1乃至10のいずれか1項に記載の分析法。
- 1−3−β−D−グルカン・シンターゼのサブユニットFks1pに対応し、CaFks1pアミノ酸636〜654の少なくとも一部分であってアミノ酸641〜649を含む部分に対応するFKS1遺伝子の第1の標的配列を増幅するための、順方向プライマーおよび逆方向プライマーの第1の対と、T1933C、C1934A、およびC1934Tからなる群より選択される少なくとも1つの突然変異に対して選択的にハイブリダイズする、対立遺伝子を識別可能な標識したハイブリダイゼーションプローブと、を含む、オリゴヌクレオチド・セット。
- 1−3−β−D−グルカン・シンターゼのサブユニットFks1pに対応し、CaFks1pアミノ酸1345〜1369の少なくとも一部分であってアミノ酸1357〜1364を含む部分に対応するFKS1遺伝子の第2の標的配列を増幅するための、順方向プライマーおよび逆方向プライマーの第2の対を含む、請求項12に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
- 順方向プライマーおよび逆方向プライマーの第1の対が、CaFks1pアミノ酸1357〜1364に対応する核酸領域も増幅する、請求項12に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
- CaFKS1のT1921C、T1922C、G1932T、C1934G、C1942T、およびC1946Aからなる群から選択される少なくとも1つの突然変異に選択的にハイブリダイズする、対立遺伝子を識別可能な標識したハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、請求項12乃至14のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
- CaFKS1のC4081GおよびG4082Aからなる群から選択される少なくとも1つの突然変異に選択的にハイブリダイズする、対立遺伝子を識別可能な標識したハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、請求項13乃至15のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
- 前記順方向プライマーおよび逆方向プライマーにより規定された増幅生成物の塩基配列決定を行うための塩基配列決定用プライマーをさらに含んでなる、請求項12に記載のオリゴヌクレオチド・セット。
- 請求項12乃至17のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド・セットを含む、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の分析法を実施するための試薬キット。
- サンプル調製およびDNA抽出のための試薬をさらに含む、請求項18に記載の試薬キット。
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